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心疾患診断マーカー
説明

心疾患診断マーカー

【課題】心疾患の診断に際し、被験者から採取される血液サンプルから調製される血清サンプルを利用する血液検査の一環として、該血清サンプル中に含有されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、有効に利用可能な診断マーカーを提供する。
【解決手段】MDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質のトリプシン消化により生成する一群のペプチド断片中、冠動脈病変枝数3と判定された患者群と、冠動脈病変枝数0と判定された健常者(非患者)群を比較した際、健常者(非患者)群において検出される量を基準として、患者群において検出される量は、「有意に高い」、または、「有意に低い」という、統計学的検定結果を示す「マーカー」として特定されたものを、診断マーカーとして利用する。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記(工程1)〜(工程6)の工程を有しており、
(工程1)
抗MDA−LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA−LDLを分取する工程;
(工程2)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;
(工程3)
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;
(工程4)
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量(Mpeptide)を、質量分析手段として、MALDI−TOF−MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点(pI)と質量(Mpeptide)に基づき、それぞれ、ペプチド断片(pI,Mpeptide)と特定し、各ペプチド断片(pI,Mpeptide)に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)を測定する工程;
(工程5)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群中から、下記の表1−1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表1−2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;
【表1−1】

【表1−2】

(工程6)
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredに基づき、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;
前記工程6において、酸化の進行度の評価は、
(サブ・ステップ6−1)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれる、総数Ntotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avを算出する工程;
(サブ・ステップ6−2)
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredと、算出されたピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avとを対比し、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;
(サブ・ステップ6−3)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;
上記、(サブ・ステップ6−1)〜(サブ・ステップ6−3)の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項2】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記(工程1)〜(工程6)の工程を有しており、
(工程1)
抗MDA−LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA−LDLを分取する工程;
(工程2)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;
(工程3)
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;
(工程4)
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量(Mpeptide)を、質量分析手段として、MALDI−TOF−MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点(pI)と質量(Mpeptide)に基づき、それぞれ、ペプチド断片(pI,Mpeptide)と特定し、各ペプチド断片(pI,Mpeptide)に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)を測定する工程;
(工程5)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群中から、下記の表2に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;
【表2】

(工程6)
選択されたペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredに基づき、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;
前記工程6において、酸化の進行度の評価は、
(サブ・ステップ6−1)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれる、総数Ntotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avを算出する工程;
(サブ・ステップ6−2)
選択されたペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredと、算出されたピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avとを対比し、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;
(サブ・ステップ6−3)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択されたペプチド断片をトリプシン消化により生成する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;
上記、(サブ・ステップ6−1)〜(サブ・ステップ6−3)の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項3】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法であって、
下記(工程1)〜(工程6)の工程を有しており、
(工程1)
抗MDA−LDLモノクローナル抗体を利用する免疫沈降法を適用して、被験者から採取される血液サンプル中から、MDA−LDLを分取する工程;
(工程2)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質に、トリプシンを作用させ、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を調製する工程;
(工程3)
等電点電気泳動法を適用し、トリプシン酵素消化された、該ApoB100タンパク質由来のペプチド断片の群を、各ペプチド断片の等電点に従って、所定の等電点の区分に分画し、等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群に分離する工程;
(工程4)
等電点に基づき分画された、複数のペプチド断片の部分群について、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片の質量(Mpeptide)を、質量分析手段として、MALDI−TOF−MS法を採用して測定し、各ペプチド断片の部分群中に含有されている、ペプチド断片を、その等電点(pI)と質量(Mpeptide)に基づき、それぞれ、ペプチド断片(pI,Mpeptide)と特定し、各ペプチド断片(pI,Mpeptide)に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)を測定する工程;
(工程5)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群中から、下記の表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表4に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表5に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表6に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する工程;
【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

(工程6)
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredに基づき、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する工程;
前記工程6において、酸化の進行度の評価は、
(サブ・ステップ6−1)
特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれるペプチド断片の種類の総数をNtotal-peptideとし、特定されたペプチド断片(pI,Mpeptide)の一群に含まれる、総数Ntotal-peptide種類のペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値に基づき、平均化を行って、ピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avを算出する工程;
(サブ・ステップ6−2)
選択された酸化ペプチド断片に由来するイオン種[Mpeptide+H]+のピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の測定値、I(pI,[Mpeptide+H]+measuredと、算出されたピーク強度I(pI,[Mpeptide+H]+)の平均値、I(pI,[Mpeptide+H]+avとを対比し、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中において、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率を推定する工程;
(サブ・ステップ6−3)
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、選択された酸化ペプチド断片を内在する酸化ApoB100タンパク質の含有比率が高いほど、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度は高いと評価する工程;
上記、(サブ・ステップ6−1)〜(サブ・ステップ6−3)の工程に基づき、酸化の進行度の評価を行う
ことを特徴とする、評価方法。
【請求項4】
工程5において、選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表3に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択する
ことを特徴とする、請求項3に記載の評価方法。
【請求項5】
工程1における、免疫沈降法によるMDA−LDLの分取に利用される、抗MDA−LDLモノクローナル抗体は、MDA−LDL中に含まれる、MDA化を受けたApoB100タンパク質に特異的なモノクローナル抗体である
ことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項6】
また、工程3における、等電点電気泳動法を適用するペプチド断片の分画は、等電点タンパク質分離チップを利用して実施する
ことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項7】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Aと工程Bを含み
(工程A)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第一の態様にかかるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;
(工程B)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;
前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項8】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Aと工程Bを含み
(工程A)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第二の態様にかかるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;
(工程B)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;
前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項9】
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程の酸化ストレスの水準の高低を推定する方法であって、
下記の工程Aと工程Bを含み
(工程A)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価を、上記本発明の第一の形態の第三の態様にかかるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する方法を利用して行う工程;
(工程B)
被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度の評価結果に基づき、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準の高低を推定する工程;
前記工程Bにおいて、酸化ストレスの水準の推定は、
分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質中における、酸化の進行度が高いほど、該MDA−LDLがLDLから生成される過程において、該MDA−LDLの生成が進行した環境の酸化ストレスの水準は高いと推定する
ことを特徴とする、推定方法。
【請求項10】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表7−1に示すアミノ酸残基位置のLys残基、ならびに、表7−2に示すアミノ酸残基位置のMet残基からなる群より選択される、少なくとも一つのLys残基またはMet残基を含み、該Lys残基またはMet残基が酸化を受けている、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表7−1】

【表7−2】

ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項11】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来のペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表8に示すアミノ酸残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表8】

ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項12】
心疾患の診断に先立ち、被験者の病態を把握する目的で実施する、被験者から採取される血液サンプル中から、分取されるMDA−LDL中に含まれる、ApoB100タンパク質における、酸化の進行度を評価する際、該評価に利用するマーカーとして、該酸化の進行度の評価に適する、ApoB100タンパク質由来の酸化ペプチド断片を選択する方法であって、
前記評価に利用するマーカーとして、
下記の表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表10に示すDHP化Lys残基をその内部に含むペプチド断片、表11に示すMDA化Lys残基をそのC末端に含むペプチド断片、ならびに、表12に示す酸化されたMet残基を含むペプチド断片からなる群より選択される、少なくともLys残基またはMet残基が酸化を受けているペプチド断片に相当する酸化ペプチド断片を少なくとも一つ選択する
【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

ことを特徴とする、マーカーの選択方法。
【請求項13】
選択される酸化ペプチド断片の少なくとも一つは、
前記表9に示すMDA化Lys残基をその内部に含むペプチド断片の一群から選択する
ことを特徴とする、請求項12に記載のマーカーの選択方法。

【図1】
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【図2】
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【図9】
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【図10】
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【図11−1】
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【図11−2】
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【図11−3】
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【図11−4】
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【図11−5】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【公開番号】特開2013−40781(P2013−40781A)
【公開日】平成25年2月28日(2013.2.28)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−175982(P2011−175982)
【出願日】平成23年8月11日(2011.8.11)
【出願人】(000004237)日本電気株式会社 (19,353)
【出願人】(390037327)積水メディカル株式会社 (111)
【出願人】(504137912)国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Fターム(参考)】