心筋前駆細胞の単離方法及び単離用デバイス
【課題】 心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの提供、並びに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス及び心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供。
【解決手段】 中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法、及び当該方法を用いるデバイス。
【解決手段】 中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法、及び当該方法を用いるデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋前駆細胞の同定に関する。より詳細には心筋前駆細胞を単離する方法、並びに単離する為のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスとしては、末梢血から造血幹細胞を含む単核球細胞分画を体外血液循環下で分離する血液分離装置と、さらに造血幹細胞を単離するための抗ＣＤ３４抗体カラム装着装置とが知られている。このような２段階の幹細胞純化操作で幹細胞が採取されているが、現在のところ血液幹細胞以外では心筋組織になりうる心筋幹細胞も含め生体組織幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスは存在していない。
【０００３】
心臓疾患の再生医療では、心筋幹細胞の選択的採取とそれに続く心筋幹細胞の患部への細胞移植が必要であり、心筋幹細胞を純化・採取するデバイスの開発が強く望まれている。しかしながらこのようなデバイスが存在しなかった理由としては、心筋幹細胞・心筋前駆細胞の分化過程の探索は、主に転写因子などの遺伝子やシグナル分子を心筋発生のマーカーとした場合、細胞膜を破壊して（いわば細胞を殺して）、それらの分子の挙動を検出しなければならなかったことが挙げられる。一方、生きたままの細胞を峻別するために細胞の表面抗原発現様式によって心筋幹細胞の分化・成熟度を峻別する方法があるが、現在まで心筋幹細胞・心筋前駆細胞の適切なマーカー、特に表面マーカーがなかったため、表面マーカーによる心筋幹細胞・心筋前駆細胞の同定の研究が進んでいなかった。
【０００４】
中胚葉はＥＳ細胞から分化誘導できる胚葉の中で最も研究されたものの一つであり、中でも心筋細胞は側部中胚葉に由来する細胞系列に含まれる。側部中胚葉に由来する細胞のうちＦｌｋ１陽性（以下、Ｆｌｋ１（＋）とも称す）として特徴付けられる細胞（Ｆｌｋ１（＋）細胞）から血管系細胞（血液細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）へ分化誘導が行われたという報告がある（非特許文献１）。
【非特許文献１】ヤマシタ ジェイ．（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．）ら，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，２０００年，第４０８巻，第６８０８号，ｐ．９２−９６
【非特許文献２】スーザン シー．（Ｓｕｓａｎ Ｃ．）ら，「セル アドヒージョン アンド コミュニケーション（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１９９５年，第３巻，ｐ．２１７−２３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの確立及び提供を目的とし、さらに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス並びに心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、表面マーカーの発現様式の検討に、マウスＥＳ細胞を用いた心筋分化過程を選定し、未分化細胞が心筋細胞に分化する過程を経時的に解析できる培養系を用いた。すなわちＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することにより拍動能を有する心筋様細胞に分化誘導し、表面マーカーの発現様式の変化を解析した。
結果、血管系細胞への分化を特徴づける表面マーカーとして報告されているＦｌｋ１が、心筋前駆細胞においても顕著に発現上昇していることが確認された。さらに、Ｆｌｋ１の発現量の増加という特徴に加え、ＥＳ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによってＣＤ４４においてもその発現に顕著な上昇傾向が確認された。これらの知見を得て、本発明者らは、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を効率的に単離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は下記の通りである。
（１）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
（２）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
（３）中胚葉細胞が幹細胞由来である、上記（１）記載の方法。
（４）幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記（３）記載の方法。
（５）中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである上記（１）記載の方法。
（６）ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、上記（５）記載の方法。
（７）中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、上記（５）記載の方法。
（８）中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、及び臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記（１）記載の方法。
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
（１０）ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記（１）記載の方法。
【０００８】
（１１）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、上記（１０）記載の方法。
（１２）Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記（１）記載の方法。
（１３）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、上記（１２）記載の方法。
（１４）上記（９）記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
（１５）（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＣＤ４４を発現している細胞集団から、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
（１６）（ａ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＦｌｋ１を発現している細胞集団から、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
（１７）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、上記（１５）又は（１６）記載のデバイス。
（１８）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、上記（１５）又は（１６）記載のデバイス。
（１９）中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、及び臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記（１５）〜（１８）のいずれかに記載のデバイス。
（２０）上記（１５）〜（１９）のいずれかに記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【０００９】
（２１）心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、上記（２０）記載のデバイス。
（２２）心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである上記（２０）記載のデバイス。
（２３）移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、上記（２２）記載のデバイス。
（２４）移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、上記（２２）記載のデバイス。
【発明の効果】
【００１０】
心筋前駆細胞特異的な表面マーカーを用いる本発明の方法あるいはデバイスは、治療現場において、中胚葉系組織より細胞ソースを単離し迅速に心筋前駆細胞を純化・採取することが可能となる。従って、移植細胞の培養、培養にかかるコスト、培養による他の細胞への分化誘導などの懸念が不必要になる。また、迅速な移植細胞の純化・採取により、一期的な手術が可能となり、患者への負担が軽減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において心筋前駆細胞とは、中胚葉由来（Ｆｌｋ１陽性）の細胞で分化すれば自己拍動し心筋特異的遺伝子発現を有するようになる（心筋細胞になる）性状を有した細胞集団のことを指す。
【００１２】
本発明において中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。
【００１３】
マウスＥＳ細胞としてはＥＢ５細胞が、ヒトＥＳ細胞としては、Ｈ９．２細胞(Kehat et at.JCI,2001 vol.108 p.407-414)、ＨＥＳ−２細胞(Mummery et al.Journal of Anatomy,2002 vol.200 p.233-242)、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９細胞(Xu et al. Circulation Research,2002 vol.91 p.501-508)等が知られている。これらのヒトＥＳ細胞においてはいずれも胚葉体からの分化誘導モデルが報告されている。
【００１４】
また供給源として臍帯血を用いる場合、以下のような利点がある。
現状では、骨髄移植への利用（臍帯血バンク）が普及しており、公的組織が既に構築されているため、臍帯血採取における倫理面、技術面、社会的認知性において基盤となる問題が克服されている。同種非血縁者間の移植において、移植片対宿主反応、いわゆるＧＶＨＤ(graft-versus-host disease)の発現が、頻度、強度とも、臍帯血では骨髄片移植に比し、少ないことが知られており、免疫的寛容が期待できる。新生児組織である臍帯血では、成人組織（骨髄等）に比して、細胞老化が少ないため、多分化能を有する未熟細胞の効率的な分離、増殖が期待できる。
【００１５】
ＥＳ細胞から中胚葉細胞への分化誘導は、通常当分野で実施されている手法を用いて行えばよい（Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747）。例えばマウスＥＢ５を用いた場合について記載する。ＥＢ５細胞はゼラチン（好ましくは０．１％程度）コートした培養皿で、培養液（例えば、１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養する。分化誘導条件としては、以下のようなプロトコルが挙げられるが、最終的にＦｌｋ１及び／又はＣＤ４４の有意な発現上昇が確認されれば、その詳細は特に限定されるものではない。また、細胞の状況等の要因によっても適宜変更され得る。
（分化誘導プロトコル）
１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養する。
【００１６】
中胚葉細胞への分化は細胞表面マーカーの発現様式を解析することによって確認することができる。すなわち、分化誘導前には検出されないか、あるいは検出されても僅かであって、分化誘導後に顕著にその発現量が増加する細胞表面抗原（細胞表面マーカー）であるＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。中胚葉細胞のソースとしてＥＳ細胞を用いる場合には、中胚葉分化誘導条件下で培養した後の細胞（細胞集団）における細胞表面マーカーの発現を測定し、Ｆｌｋ１及び／又はＣＤ４４を、好ましくはＦｌｋ１及びＣＤ４４を両方とも発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。中胚葉細胞のソースとして末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞を用いる場合には、当該細胞（細胞集団）におけるＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定し、Ｆｌｋ１及び／又はＣＤ４４を、好ましくはＦｌｋ１及びＣＤ４４を両方とも発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。
【００１７】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程及びＣＤ４４の発現を解析する工程は、細胞の表面マーカーであるこれらの蛋白質の発現が解析できれば特にその手法は限定されないが、一般的に免疫反応を用いた方法が簡便であり、また細胞を傷つけることなく好ましい。細胞を傷つけないという利点は心筋前駆細胞の体内導入という本願発明の目的において特に有利である。具体的にはＦｌｋ１に特異的親和性を有する物質、並びにＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行う。
【００１８】
Ｆｌｋ１は、血管内皮増殖因子受容体ＶＥＧＦの受容体として機能し、膜１回貫通型のチロシンキナ−ゼで、細胞外には７つの免疫グロブリン様構造をもち、細胞内にはキナーゼドメインとこれを二分するキナーゼインサートをもつことが特徴である（Developmental Biology S.F.Gilbert 7th Edition Chapter 15 Lateral Plate Mesoderm. Sinauer）。正常血管や腫瘍血管の新生、血管透過性に極めて重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。また、血管内皮前駆細胞のマーカー、中胚葉のマーカーと考えられている（Cortes et al 1999, Mech Dev. 83(1-2):161-4、Ogawa et al Blood 1999 93;(4):1168-77）
【００１９】
一方、ＣＤ４４は細胞接着機能をもつＩ型膜貫通糖蛋白質の１つで、ヒアルロン酸レセプターである。選択的スプライシングによってさまざまなアイソフォームが作り出され種々の分子サイズを有するＣＤ４４が特定の細胞に発現することが知られている。胎児性癌細胞（ＥＣ細胞）や胚幹細胞（ＥＳ細胞）の分化過程でその発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２）。
【００２０】
本発明はこれらの蛋白質が心筋前駆細胞においてその発現量が顕著に増加するという新たな知見に基づいている。本明細書中、「マーカー（又は表面マーカー）」とは特にことわりのない限り、上記した心筋前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、また特にＣＤ４４のように多彩なスプライシングにより幾つかのアイソフォームを有する場合がある。本発明においてはその心筋前駆細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。
【００２１】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００２２】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２３】
本発明の心筋前駆細胞を単離する方法はあるいはその為のデバイス、当該方法又はデバイスを用いる心筋前駆細胞投与用デバイスは、マーカー蛋白質、即ちＦｌｋ１及びＣＤ４４とそれぞれ特異的親和性を有する物質のうち１種、好ましくは２種を用いることを特徴とする。本発明の単離方法において、あるいはデバイスを用いて当該マーカー蛋白質の発現を解析する。かかる解析によりＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している（［ＣＤ４４発現，Ｆｌｋ１非発現］（［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１−］とも記載される）［ＣＤ４４非発現，Ｆｌｋ１発現］（［ＣＤ４４−，Ｆｌｋ１＋］とも記載される）、及び［ＣＤ４４発現，Ｆｌｋ１発現］（［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］とも記載される））細胞、好ましくはＣＤ４４及びＦｌｋ１を共に発現している［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞を単離し、回収することによって心筋前駆細胞を得ることができる。
【００２４】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー蛋白質を発現している細胞を単離、回収する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４４抗体を、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質として抗Ｆｌｋ１抗体を、それぞれ用いた場合の具体的手法について以下に述べるが、本願発明はかかる例示に何ら限定されるものではない。
【００２５】
（１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体並びに抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を調製する工程
抗ＣＤ４４抗体あるいは抗Ｆｌｋ１抗体を用いて通常当分野で実施されているような方法によって行う。具体的には固相担体を臭化シアン処理等によって活性化し、そこにアミノ基あるいはヒドロキシル基を有する抗体を結合させる方法等によって行う。抗ＣＤ４４抗体及び抗Ｆｌｋ１抗体は商業的に入手可能であり、また、上記したような手順によって適宜調製することもできる。本発明において用いられる固相担体は、その上で抗ＣＤ４４抗体とＣＤ４４抗原との抗原抗体反応（あるいは抗Ｆｌｋ１抗体とＦｌｋ１抗原との抗原抗体反応）が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用できる。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス等が用いられる。これらの固相担体は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後の工程等に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし得る。
【００２６】
（２）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＣＤ４４抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料、あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＣＤ４４抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳともいう）等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＣＤ４４抗原を加える等の処理によって抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＣＤ４４を発現している細胞集団（［ＣＤ４４＋］細胞）を回収する（［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液）。
【００２７】
（３）抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する工程。
まず、上記（１）で調製した抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体（以下、単に抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＦｌｋ１抗原を加える等の処理によって抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、Ｆｌｋ１を発現している細胞集団（［Ｆｌｋ１＋］細胞）を回収する（［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液）。
【００２８】
工程（３）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として上記（２）で調製された［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、上記（２）で抗ＣＤ４４抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［ＣＤ４４−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＣＤ４４−，Ｆｌｋ＋］細胞である。
【００２９】
工程（２）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として上記（３）で調製される［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、上記（３）で抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［Ｆｌｋ１−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１−］細胞である。
工程（２）と工程（３）は単独で行っても良く、また逐次的に行っても良い。逐次的に行う場合、工程（２）と工程（３）の実施の順番は特に限定されないが、好ましくは発現量の観点から、工程（３）→工程（２）の順で行う、即ち、Ｆｌｋ１を先にその後にＣＤ４４の精製を行うことが好ましい。
【００３０】
分離、回収には種々の公知の手段が適用できるが、膜を用いた濾過処理等が好ましい。例えば工程（２）あるいは工程（３）、もしくは工程（２）及び工程（３）を経て得られた各心筋前駆細胞の懸濁液を、例えば内部にフィルターを仕込んだシリンジ等を用いて、まずシリンジ内のフィルターに細胞をトラップさせ、次いでシリンジ内のプランジャーを押してフィルターから前駆細胞をはずして回収する。回収の為のデバイスの一例を図１に示すが、何ら限定されるものではない。
図１中、「試料」は中胚葉細胞を含有する細胞集団であり、抗体カラム１及び２は抗ＣＤ４４抗体固定化カラム及び抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム（順序は問わない）である。三方活栓を使用することにより所望の細胞画分を容易に得ることができる。
【００３１】
上記デバイスに、さらに得られた心筋前駆細胞を患者に投与するための手段を含めて心筋前駆細胞投与用デバイスを構築することができる。心筋前駆細胞を患者に投与するための手段としては、通常細胞を用いた治療に利用されるような手段、用具等が用いられ、例えばシリンジやカテーテル等が挙げられる。シリンジは図１で示した回収用のシリンジと同一のものであっても構わないし、回収した細胞を別の新しいシリンジに充填して患者に投与することもできる。同様にカテーテルも回収用に用いたものと同一のものであってもよいし、別途用意されるものであってもよい。
【００３２】
さらに、本発明の心筋前駆細胞を体外にて培養して、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織とした後そのシートを投与対象（患者）に移植してもよいし、又、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織を投与対象（患者）に移植してもよい。支持体は当分野で通常用いられるものが利用できるが、非生物由来の支持体としては（１）ポリグリコール酸（Ｐｏｌｙ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＧＡ））、（２）ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＡ））、（３）ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、（４）ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）等が、生物由来の支持体としては（１）界面活性剤、リボヌクレアーゼ等を用いて脱細胞化処理を施すことによって得た、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスからなる組織、（２）コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分を用いて人工的に構成した組織等が挙げられる。
【００３３】
本発明の心筋前駆細胞のヒトへの治療における適用は、例えば心筋梗塞亜急性期、あるいは心筋症慢性期患者への移植が想定される。治療評価としては、一般的な心不全治療に対する効果判定基準に、現在、既に実用化されている血液疾患領域における同種臍帯血幹細胞移植の治療評価基準（特に、ＧＶＨＤ等の有害副反応の評価基準）を加味したものが適当と考えられる。より具体的には、既に公開されている大規模臨床試験プロトコールの治療効果評価を参照することができる（例えばhttp://poppy.ac/j-chf/doc/jchfplot_ver2_030925.pdf等）。
【実施例】
【００３４】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋細胞からの心筋細胞への分化の検討
実験プロトコルを図２に示す。
ＥＳ細胞としてＥＢ５細胞を用いた。ＥＢ５細胞は０．１％ゼラチンコートした６ｃｍ培養皿で、培養液（１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養した。０．１％ゼラチンコートは、０．１％ゼラチン（Nakarai Japan）／蒸留水を培養皿上に積層し常温で固相化することによって行った。
【００３５】
分化誘導は、１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２ 雰囲気下で５日間培養することによって行った。分化誘導後、経時的にフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ解析）を行うことによってＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現を測定した（結果を図３に示す）。
Ｆｌｋ１抗体としてはマウスモノクローナル抗体「ＡＶＡＳ１２α１」（理化学研究所、西川氏より供与された）を用い、ビオチン標識した後、ＦＡＣＳ解析を行った。該解析は「ｃａｌｉｂｕｒ」及び「Ａｒｉａ」（ともにＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を使用して行った。ＣＤ４４抗体はＢＤバイオサイエンス社のＣｌｏｎｅ ＩＭ７を用いた。Ｆｌｋ１抗体についてはShin-Ichi Nishikawa et al. Development, 1998 vol. 125 p.1747-1757及びKataoka H et al. Dev Growth Differ. 1997 vol. 39, p.729-740等に詳述されている。
【００３６】
分化誘導５日目の細胞からＦｌｋ１＋細胞をソーティングした。得られたＦｌｋ１＋細胞をストローマ細胞ＯＰ９上で共培養した。
ストローマ細胞ＯＰ９と共培養することによりＥＳ細胞が血液細胞、神経細胞、リンパ球等へと分化誘導されることは既に知られており（Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747、Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Ogawa et al Blood 1999 93;(4):1168-77）、本実施例においても心筋細胞への分化を期待してストローマ細胞ＯＰ９との共培養を行った。尚、ＯＰ９細胞はＡＴＣＣ等の公的機関からも入手可能であり、本実施例においてはコダマ氏より供与された。
またコントロールとしてＦｌｋ１−細胞についても同様にストローマＯＰ９細胞との共培養を行い、心筋細胞への分化を検討した。
セルソーターにて分離した細胞群（３．６×１０4細胞ずつ）をＯＰ９と６ｃｍ培養皿上で分化培地（上述）にて７日間培養した。
ＯＰ９との共培養から７日経過した時点で心筋細胞の出現率（拍動細胞のコロニー数）について確認した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
さらに、７日目に拍動している細胞集団（コロニー）をカルチャーリング（ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｉｎｇ）にて採取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ−ＰＣＲ）解析に供し、Ｆｌｋ１＋細胞由来の拍動細胞コロニーについて心筋分化マーカーの発現を確認した。合成したプライマーは以下の通り。
・Ｎｋｘ２−５
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｇｇｇｃｇｇａｔａａａａａａｇａｇｃｔ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔ（配列番号２）
・ＧＡＴＡ４
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇａｃａｃｃｃｃａａｔｃｔｃｇａｔ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｇｃｃｃｃａｃａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ（配列番号４）
・αＭＨＣ：
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｃｔｇａｃａｇａｔｃｇｇｇａｇａａｔｃａｇ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｔｇｇｃａａａｇｔａｃｔｇｇａｔｇａｃａ（配列番号６）
・ＭＬＣ２ｖ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇａｃｃａｔｔｃｔｃａａｃｇｃａｔｔｃａａｇ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｔｃａｇｃａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃａｔａｇｔ（配列番号８）
・ＭＬＣ２ａ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃａｇｃｔｇｃａｔｔｇａｃｃａｇａａｃａ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃｔｇｇｇａａｔａｇｇｔｃｔｃｃｔｔ（配列番号１０）
・Ｔｂｘ５
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｇａａｃｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇａａ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｔｇｇｔｇａｔ（配列番号１２）
・ｃＴｎＴ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｃｃｔｃａａａｇａｃａｇｇａｔｃｇａａ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔｔｃｔ（配列番号１４）
・Ｆｌｋ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｇａｇａｃａｇａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａａｃ（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａａａｃｔｇｇｔｇｔｇａｇｔｇａｔｔｃｇ（配列番号１６）
・ｃ−Ｋｉｔ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇｃｇｔｇａｃｔｃｇｔｔｔａｔｔｔｔｃ（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｇｃａｇａａｇｇｔｔ（配列番号１８）
いずれのマーカーの発現も他のコロニー群に比べて顕著に増加していた。
【００３９】
Ｆｌｋ１＋細胞をＯＰ９と共培養するとＦｌｋ１−細胞をＯＰ９と共培養したときよりも高頻度に拍動細胞が認められ。この拍動細胞は心筋マーカーを発現していることから、心筋細胞であることが確認できた。
【００４０】
以下さらに実施例を挙げて本発明を説明するが、細胞培養技術や細胞の単離技術等は特に言及しない限り実施例１に準じて行う。
【００４１】
実施例２：中胚葉分化誘導系における表面抗原の検討
Ｆｌｋ１の発現がピークになる分化誘導５日目の中胚葉系細胞の表面抗原の解析を行った。解析は各表面抗原に対する特異抗体を用い、免疫細胞染色を行った。１次抗体は各表面抗原に対する特異抗体（抗Ｆｌｋ１抗体以外は全てＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社より入手し、抗Ｆｌｋ１抗体は上述の通り、理化学研究所西川氏より供与されたマウスモノクローナル抗体ＡＶＡＳ１２を用いた）を抗Ｇｒ１抗体及び抗Ｍａｃ１抗体については４００倍希釈したものを、それ以外の抗体は２００倍希釈したものを用いて反応に供した。２次抗体としては、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７を４００倍希釈で使用した。
分化誘導は概ね実施例１と同様な手法に基づくが、実験プロトコルを図４に示す。
分化とともに発現が増加する表面抗原として、Ｆｌｋ１以外にＣＤ２４及びＣＤ４４抗原が、分化とともにその発現量を増強させた。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
次いで、Ｆｌｋ１＋細胞、Ｆｌｋ１−細胞におけるＣＤ２４、ＣＤ４４の発現を比較するとＣＤ２４の発現パターンは両細胞間で違いはなかったが、ＣＤ４４の発現においてはＦｌｋ１＋細胞の集団の方がより多くのＣＤ４４発現細胞を含んでいた。
【００４４】
実施例３：ＣＤ４４と心筋細胞出現率の関係の検討
Ｆｌｋ１＋細胞集団中のＣＤ４４＋細胞（Ｆｌｋ１＋／ＣＤ４４＋）及びＣＤ４４−細胞（Ｆｌｋ１＋／ＣＤ４４−）、Ｆｌｋ１−細胞集団中のＣＤ４４＋細胞（Ｆｌｋ１−／ＣＤ４４＋）及びＣＤ４４−細胞（Ｆｌｋ１−／ＣＤ４４−）をそれぞれソーティングし、心筋分化誘導（ＯＰ９細胞上での共培養）を行い、拍動コロニー出現率を比較した。結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
［Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋］の細胞集団からは高率に心筋細胞が誘導された。しかし［Ｆｌｋ１−，ＣＤ４４−］の細胞集団からは心筋細胞が誘導されなかった。
【００４７】
配列表フリーテキスト
配列番号１：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号７：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号８：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号９：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１０：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１１：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１２：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１３：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１４：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１５：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１７：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１８：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明の心筋前駆細胞単離用デバイスあるいは心筋前駆細胞投与用デバイスの一例を示す模式図である。
【図２】図２はＦｌｋ１＋／ＣＤ４４＋細胞からの心筋細胞への分化を検討する際の実験プロトコルを模式化したものである。
【図３】図３はＥＢ５細胞の分化誘導におけるＣＤ４４及びＦｌｋ１の経時的発現の結果を示す図である。。
【図４】図４はＥＢ５細胞の中胚葉分化誘導系における表面抗原を検討する際の実験プロトコルを模式化したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋前駆細胞の同定に関する。より詳細には心筋前駆細胞を単離する方法、並びに単離する為のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスとしては、末梢血から造血幹細胞を含む単核球細胞分画を体外血液循環下で分離する血液分離装置と、さらに造血幹細胞を単離するための抗ＣＤ３４抗体カラム装着装置とが知られている。このような２段階の幹細胞純化操作で幹細胞が採取されているが、現在のところ血液幹細胞以外では心筋組織になりうる心筋幹細胞も含め生体組織幹細胞を生体組織から純化・採取するデバイスは存在していない。
【０００３】
心臓疾患の再生医療では、心筋幹細胞の選択的採取とそれに続く心筋幹細胞の患部への細胞移植が必要であり、心筋幹細胞を純化・採取するデバイスの開発が強く望まれている。しかしながらこのようなデバイスが存在しなかった理由としては、心筋幹細胞・心筋前駆細胞の分化過程の探索は、主に転写因子などの遺伝子やシグナル分子を心筋発生のマーカーとした場合、細胞膜を破壊して（いわば細胞を殺して）、それらの分子の挙動を検出しなければならなかったことが挙げられる。一方、生きたままの細胞を峻別するために細胞の表面抗原発現様式によって心筋幹細胞の分化・成熟度を峻別する方法があるが、現在まで心筋幹細胞・心筋前駆細胞の適切なマーカー、特に表面マーカーがなかったため、表面マーカーによる心筋幹細胞・心筋前駆細胞の同定の研究が進んでいなかった。
【０００４】
中胚葉はＥＳ細胞から分化誘導できる胚葉の中で最も研究されたものの一つであり、中でも心筋細胞は側部中胚葉に由来する細胞系列に含まれる。側部中胚葉に由来する細胞のうちＦｌｋ１陽性（以下、Ｆｌｋ１（＋）とも称す）として特徴付けられる細胞（Ｆｌｋ１（＋）細胞）から血管系細胞（血液細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）へ分化誘導が行われたという報告がある（非特許文献１）。
【非特許文献１】ヤマシタ ジェイ．（Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．）ら，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，２０００年，第４０８巻，第６８０８号，ｐ．９２−９６
【非特許文献２】スーザン シー．（Ｓｕｓａｎ Ｃ．）ら，「セル アドヒージョン アンド コミュニケーション（Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１９９５年，第３巻，ｐ．２１７−２３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、心筋前駆細胞に特有な表面マーカーの確立及び提供を目的とし、さらに当該表面マーカーを用いた、心筋前駆細胞の単離方法及びその為のデバイス並びに心筋前駆細胞の体内導入用デバイスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み、表面マーカーの発現様式の検討に、マウスＥＳ細胞を用いた心筋分化過程を選定し、未分化細胞が心筋細胞に分化する過程を経時的に解析できる培養系を用いた。すなわちＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することにより拍動能を有する心筋様細胞に分化誘導し、表面マーカーの発現様式の変化を解析した。
結果、血管系細胞への分化を特徴づける表面マーカーとして報告されているＦｌｋ１が、心筋前駆細胞においても顕著に発現上昇していることが確認された。さらに、Ｆｌｋ１の発現量の増加という特徴に加え、ＥＳ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによってＣＤ４４においてもその発現に顕著な上昇傾向が確認された。これらの知見を得て、本発明者らは、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を効率的に単離する方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は下記の通りである。
（１）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
（２）中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、及びＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
（３）中胚葉細胞が幹細胞由来である、上記（１）記載の方法。
（４）幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、上記（３）記載の方法。
（５）中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである上記（１）記載の方法。
（６）ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、上記（５）記載の方法。
（７）中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、上記（５）記載の方法。
（８）中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、及び臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記（１）記載の方法。
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
（１０）ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記（１）記載の方法。
【０００８】
（１１）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、上記（１０）記載の方法。
（１２）Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、上記（１）記載の方法。
（１３）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、上記（１２）記載の方法。
（１４）上記（９）記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
（１５）（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＣＤ４４を発現している細胞集団から、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
（１６）（ａ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＦｌｋ１を発現している細胞集団から、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
（１７）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、上記（１５）又は（１６）記載のデバイス。
（１８）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、上記（１５）又は（１６）記載のデバイス。
（１９）中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、及び臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、上記（１５）〜（１８）のいずれかに記載のデバイス。
（２０）上記（１５）〜（１９）のいずれかに記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【０００９】
（２１）心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、上記（２０）記載のデバイス。
（２２）心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである上記（２０）記載のデバイス。
（２３）移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、上記（２２）記載のデバイス。
（２４）移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、上記（２２）記載のデバイス。
【発明の効果】
【００１０】
心筋前駆細胞特異的な表面マーカーを用いる本発明の方法あるいはデバイスは、治療現場において、中胚葉系組織より細胞ソースを単離し迅速に心筋前駆細胞を純化・採取することが可能となる。従って、移植細胞の培養、培養にかかるコスト、培養による他の細胞への分化誘導などの懸念が不必要になる。また、迅速な移植細胞の純化・採取により、一期的な手術が可能となり、患者への負担が軽減される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において心筋前駆細胞とは、中胚葉由来（Ｆｌｋ１陽性）の細胞で分化すれば自己拍動し心筋特異的遺伝子発現を有するようになる（心筋細胞になる）性状を有した細胞集団のことを指す。
【００１２】
本発明において中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。
【００１３】
マウスＥＳ細胞としてはＥＢ５細胞が、ヒトＥＳ細胞としては、Ｈ９．２細胞(Kehat et at.JCI,2001 vol.108 p.407-414)、ＨＥＳ−２細胞(Mummery et al.Journal of Anatomy,2002 vol.200 p.233-242)、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９細胞(Xu et al. Circulation Research,2002 vol.91 p.501-508)等が知られている。これらのヒトＥＳ細胞においてはいずれも胚葉体からの分化誘導モデルが報告されている。
【００１４】
また供給源として臍帯血を用いる場合、以下のような利点がある。
現状では、骨髄移植への利用（臍帯血バンク）が普及しており、公的組織が既に構築されているため、臍帯血採取における倫理面、技術面、社会的認知性において基盤となる問題が克服されている。同種非血縁者間の移植において、移植片対宿主反応、いわゆるＧＶＨＤ(graft-versus-host disease)の発現が、頻度、強度とも、臍帯血では骨髄片移植に比し、少ないことが知られており、免疫的寛容が期待できる。新生児組織である臍帯血では、成人組織（骨髄等）に比して、細胞老化が少ないため、多分化能を有する未熟細胞の効率的な分離、増殖が期待できる。
【００１５】
ＥＳ細胞から中胚葉細胞への分化誘導は、通常当分野で実施されている手法を用いて行えばよい（Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747）。例えばマウスＥＢ５を用いた場合について記載する。ＥＢ５細胞はゼラチン（好ましくは０．１％程度）コートした培養皿で、培養液（例えば、１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養する。分化誘導条件としては、以下のようなプロトコルが挙げられるが、最終的にＦｌｋ１及び／又はＣＤ４４の有意な発現上昇が確認されれば、その詳細は特に限定されるものではない。また、細胞の状況等の要因によっても適宜変更され得る。
（分化誘導プロトコル）
１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養する。
【００１６】
中胚葉細胞への分化は細胞表面マーカーの発現様式を解析することによって確認することができる。すなわち、分化誘導前には検出されないか、あるいは検出されても僅かであって、分化誘導後に顕著にその発現量が増加する細胞表面抗原（細胞表面マーカー）であるＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。中胚葉細胞のソースとしてＥＳ細胞を用いる場合には、中胚葉分化誘導条件下で培養した後の細胞（細胞集団）における細胞表面マーカーの発現を測定し、Ｆｌｋ１及び／又はＣＤ４４を、好ましくはＦｌｋ１及びＣＤ４４を両方とも発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。中胚葉細胞のソースとして末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞を用いる場合には、当該細胞（細胞集団）におけるＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定し、Ｆｌｋ１及び／又はＣＤ４４を、好ましくはＦｌｋ１及びＣＤ４４を両方とも発現している細胞を回収することによって心筋前駆細胞を単離することができる。
【００１７】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程及びＣＤ４４の発現を解析する工程は、細胞の表面マーカーであるこれらの蛋白質の発現が解析できれば特にその手法は限定されないが、一般的に免疫反応を用いた方法が簡便であり、また細胞を傷つけることなく好ましい。細胞を傷つけないという利点は心筋前駆細胞の体内導入という本願発明の目的において特に有利である。具体的にはＦｌｋ１に特異的親和性を有する物質、並びにＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行う。
【００１８】
Ｆｌｋ１は、血管内皮増殖因子受容体ＶＥＧＦの受容体として機能し、膜１回貫通型のチロシンキナ−ゼで、細胞外には７つの免疫グロブリン様構造をもち、細胞内にはキナーゼドメインとこれを二分するキナーゼインサートをもつことが特徴である（Developmental Biology S.F.Gilbert 7th Edition Chapter 15 Lateral Plate Mesoderm. Sinauer）。正常血管や腫瘍血管の新生、血管透過性に極めて重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。また、血管内皮前駆細胞のマーカー、中胚葉のマーカーと考えられている（Cortes et al 1999, Mech Dev. 83(1-2):161-4、Ogawa et al Blood 1999 93;(4):1168-77）
【００１９】
一方、ＣＤ４４は細胞接着機能をもつＩ型膜貫通糖蛋白質の１つで、ヒアルロン酸レセプターである。選択的スプライシングによってさまざまなアイソフォームが作り出され種々の分子サイズを有するＣＤ４４が特定の細胞に発現することが知られている。胎児性癌細胞（ＥＣ細胞）や胚幹細胞（ＥＳ細胞）の分化過程でその発現が誘導されることが報告されている（非特許文献２）。
【００２０】
本発明はこれらの蛋白質が心筋前駆細胞においてその発現量が顕著に増加するという新たな知見に基づいている。本明細書中、「マーカー（又は表面マーカー）」とは特にことわりのない限り、上記した心筋前駆細胞に特有な発現様式を示す一連の蛋白質から構成される群の各々を意味する。かかるマーカー蛋白質は哺乳動物の種類等によってそのアミノ酸配列が異なる場合があり、また特にＣＤ４４のように多彩なスプライシングにより幾つかのアイソフォームを有する場合がある。本発明においてはその心筋前駆細胞における発現様式が同じである限り、そのような蛋白質もマーカー蛋白質として使用することができ、本発明の範囲内である。
【００２１】
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばマーカー蛋白質と特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該マーカー蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる（詳細な手順については後述する）。
【００２２】
マーカー蛋白質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２３】
本発明の心筋前駆細胞を単離する方法はあるいはその為のデバイス、当該方法又はデバイスを用いる心筋前駆細胞投与用デバイスは、マーカー蛋白質、即ちＦｌｋ１及びＣＤ４４とそれぞれ特異的親和性を有する物質のうち１種、好ましくは２種を用いることを特徴とする。本発明の単離方法において、あるいはデバイスを用いて当該マーカー蛋白質の発現を解析する。かかる解析によりＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している（［ＣＤ４４発現，Ｆｌｋ１非発現］（［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１−］とも記載される）［ＣＤ４４非発現，Ｆｌｋ１発現］（［ＣＤ４４−，Ｆｌｋ１＋］とも記載される）、及び［ＣＤ４４発現，Ｆｌｋ１発現］（［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］とも記載される））細胞、好ましくはＣＤ４４及びＦｌｋ１を共に発現している［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞を単離し、回収することによって心筋前駆細胞を得ることができる。
【００２４】
各特異的親和性を有する物質を用いて、それぞれのマーカー蛋白質を発現している細胞を単離、回収する方法は、通常、当分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質として抗ＣＤ４４抗体を、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質として抗Ｆｌｋ１抗体を、それぞれ用いた場合の具体的手法について以下に述べるが、本願発明はかかる例示に何ら限定されるものではない。
【００２５】
（１）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体並びに抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を調製する工程
抗ＣＤ４４抗体あるいは抗Ｆｌｋ１抗体を用いて通常当分野で実施されているような方法によって行う。具体的には固相担体を臭化シアン処理等によって活性化し、そこにアミノ基あるいはヒドロキシル基を有する抗体を結合させる方法等によって行う。抗ＣＤ４４抗体及び抗Ｆｌｋ１抗体は商業的に入手可能であり、また、上記したような手順によって適宜調製することもできる。本発明において用いられる固相担体は、その上で抗ＣＤ４４抗体とＣＤ４４抗原との抗原抗体反応（あるいは抗Ｆｌｋ１抗体とＦｌｋ１抗原との抗原抗体反応）が生じるものであれば特に限定されず、当分野で通常使用されるものが利用できる。材質としては、例えば、樹脂（ポリスチレン、メタクリレート系樹脂、ポリアクリルアミド等）、ガラス等が用いられる。これらの固相担体は、いかなる形状のものであってもよく、また上記した材質の種類や、その後の工程等に応じて適宜決定される。例えば板状、ビーズ状、薄膜状、糸状、コイル状等が挙げられるが、樹脂からなるビーズであればカラムに充填することによりその後の操作を簡便にし得る。
【００２６】
（２）抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する工程
まず、上記（１）で調製した抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体（以下、単に抗ＣＤ４４抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉系分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料、あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗ＣＤ４４抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳともいう）等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＣＤ４４抗原を加える等の処理によって抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、ＣＤ４４を発現している細胞集団（［ＣＤ４４＋］細胞）を回収する（［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液）。
【００２７】
（３）抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する工程。
まず、上記（１）で調製した抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体（以下、単に抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムともいう）と中胚葉細胞を含有する細胞集団とを接触させる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは上記したような、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織あるいは臍帯血などの組織由来のものであってもよいし未分化なＥＳ細胞、ＥＣ細胞あるいはＥＧ細胞を中胚葉分化誘導条件下で培養することによって得られるものであってもよい。組織を可溶化して得られた試料あるいは分化誘導後の細胞懸濁液を抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムに通す。試料を通したカラムを１回〜数回、好ましくは複数回、ＰＢＳ等の細胞に悪影響を与えない緩衝液で洗浄する。洗浄後のカラムを緩衝液の極性を変える、あるいは過剰のＦｌｋ１抗原を加える等の処理によって抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体に結合している細胞を固相担体から分離し、Ｆｌｋ１を発現している細胞集団（［Ｆｌｋ１＋］細胞）を回収する（［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液）。
【００２８】
工程（３）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として上記（２）で調製された［ＣＤ４４＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、上記（２）で抗ＣＤ４４抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［ＣＤ４４−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＣＤ４４−，Ｆｌｋ＋］細胞である。
【００２９】
工程（２）において、中胚葉細胞を含有する細胞集団として上記（３）で調製される［Ｆｌｋ１＋］細胞懸濁液を用いた場合、最終的に回収される細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１＋］細胞であり、上記（３）で抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラムを素通りした画分（即ち［Ｆｌｋ１−］細胞懸濁液）を用いた場合には得られる細胞は［ＣＤ４４＋，Ｆｌｋ１−］細胞である。
工程（２）と工程（３）は単独で行っても良く、また逐次的に行っても良い。逐次的に行う場合、工程（２）と工程（３）の実施の順番は特に限定されないが、好ましくは発現量の観点から、工程（３）→工程（２）の順で行う、即ち、Ｆｌｋ１を先にその後にＣＤ４４の精製を行うことが好ましい。
【００３０】
分離、回収には種々の公知の手段が適用できるが、膜を用いた濾過処理等が好ましい。例えば工程（２）あるいは工程（３）、もしくは工程（２）及び工程（３）を経て得られた各心筋前駆細胞の懸濁液を、例えば内部にフィルターを仕込んだシリンジ等を用いて、まずシリンジ内のフィルターに細胞をトラップさせ、次いでシリンジ内のプランジャーを押してフィルターから前駆細胞をはずして回収する。回収の為のデバイスの一例を図１に示すが、何ら限定されるものではない。
図１中、「試料」は中胚葉細胞を含有する細胞集団であり、抗体カラム１及び２は抗ＣＤ４４抗体固定化カラム及び抗Ｆｌｋ１抗体固定化カラム（順序は問わない）である。三方活栓を使用することにより所望の細胞画分を容易に得ることができる。
【００３１】
上記デバイスに、さらに得られた心筋前駆細胞を患者に投与するための手段を含めて心筋前駆細胞投与用デバイスを構築することができる。心筋前駆細胞を患者に投与するための手段としては、通常細胞を用いた治療に利用されるような手段、用具等が用いられ、例えばシリンジやカテーテル等が挙げられる。シリンジは図１で示した回収用のシリンジと同一のものであっても構わないし、回収した細胞を別の新しいシリンジに充填して患者に投与することもできる。同様にカテーテルも回収用に用いたものと同一のものであってもよいし、別途用意されるものであってもよい。
【００３２】
さらに、本発明の心筋前駆細胞を体外にて培養して、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織とした後そのシートを投与対象（患者）に移植してもよいし、又、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織を投与対象（患者）に移植してもよい。支持体は当分野で通常用いられるものが利用できるが、非生物由来の支持体としては（１）ポリグリコール酸（Ｐｏｌｙ ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＧＡ））、（２）ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＡ））、（３）ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、（４）ポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）等が、生物由来の支持体としては（１）界面活性剤、リボヌクレアーゼ等を用いて脱細胞化処理を施すことによって得た、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスからなる組織、（２）コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックス成分を用いて人工的に構成した組織等が挙げられる。
【００３３】
本発明の心筋前駆細胞のヒトへの治療における適用は、例えば心筋梗塞亜急性期、あるいは心筋症慢性期患者への移植が想定される。治療評価としては、一般的な心不全治療に対する効果判定基準に、現在、既に実用化されている血液疾患領域における同種臍帯血幹細胞移植の治療評価基準（特に、ＧＶＨＤ等の有害副反応の評価基準）を加味したものが適当と考えられる。より具体的には、既に公開されている大規模臨床試験プロトコールの治療効果評価を参照することができる（例えばhttp://poppy.ac/j-chf/doc/jchfplot_ver2_030925.pdf等）。
【実施例】
【００３４】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋細胞からの心筋細胞への分化の検討
実験プロトコルを図２に示す。
ＥＳ細胞としてＥＢ５細胞を用いた。ＥＢ５細胞は０．１％ゼラチンコートした６ｃｍ培養皿で、培養液（１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１０％ノックアウト血清リプレースメント(GIBCO/BRL)、１％Ｌ−グルタミン(GIBCO/BRL)、１％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO)、１０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA）及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジン(FUNAKOSHI,Tokyo, Japan)を添加したＧｌａｓｇｏｗ最小必須培地（GIBCO/BRL, Long Island, NY等が例示される）中で培養した。０．１％ゼラチンコートは、０．１％ゼラチン（Nakarai Japan）／蒸留水を培養皿上に積層し常温で固相化することによって行った。
【００３５】
分化誘導は、１０ｃｍ培養皿（０．１％ゼラチンコート）あたり１×１０５個のＥＢ５細胞を分化培地（１０％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX)、１％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)及び１００μＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA)を添加した最小必須培地α培地(GIBCO/BRL)）中で３７℃、５％ＣＯ２ 雰囲気下で５日間培養することによって行った。分化誘導後、経時的にフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ解析）を行うことによってＦｌｋ１及びＣＤ４４の発現を測定した（結果を図３に示す）。
Ｆｌｋ１抗体としてはマウスモノクローナル抗体「ＡＶＡＳ１２α１」（理化学研究所、西川氏より供与された）を用い、ビオチン標識した後、ＦＡＣＳ解析を行った。該解析は「ｃａｌｉｂｕｒ」及び「Ａｒｉａ」（ともにＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社））を使用して行った。ＣＤ４４抗体はＢＤバイオサイエンス社のＣｌｏｎｅ ＩＭ７を用いた。Ｆｌｋ１抗体についてはShin-Ichi Nishikawa et al. Development, 1998 vol. 125 p.1747-1757及びKataoka H et al. Dev Growth Differ. 1997 vol. 39, p.729-740等に詳述されている。
【００３６】
分化誘導５日目の細胞からＦｌｋ１＋細胞をソーティングした。得られたＦｌｋ１＋細胞をストローマ細胞ＯＰ９上で共培養した。
ストローマ細胞ＯＰ９と共培養することによりＥＳ細胞が血液細胞、神経細胞、リンパ球等へと分化誘導されることは既に知られており（Nishikawa SI: Development 1998 125(9) 1747、Yamashita J: Nature 2000: 408(6808):92-6、Ogawa et al Blood 1999 93;(4):1168-77）、本実施例においても心筋細胞への分化を期待してストローマ細胞ＯＰ９との共培養を行った。尚、ＯＰ９細胞はＡＴＣＣ等の公的機関からも入手可能であり、本実施例においてはコダマ氏より供与された。
またコントロールとしてＦｌｋ１−細胞についても同様にストローマＯＰ９細胞との共培養を行い、心筋細胞への分化を検討した。
セルソーターにて分離した細胞群（３．６×１０4細胞ずつ）をＯＰ９と６ｃｍ培養皿上で分化培地（上述）にて７日間培養した。
ＯＰ９との共培養から７日経過した時点で心筋細胞の出現率（拍動細胞のコロニー数）について確認した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
さらに、７日目に拍動している細胞集団（コロニー）をカルチャーリング（ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｉｎｇ）にて採取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ−ＰＣＲ）解析に供し、Ｆｌｋ１＋細胞由来の拍動細胞コロニーについて心筋分化マーカーの発現を確認した。合成したプライマーは以下の通り。
・Ｎｋｘ２−５
Ｆｏｗａｒｄ：ｃｇｇｇｃｇｇａｔａａａａａａｇａｇｃｔ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｃａｔｃｃｇｔｃｔｃｇｇｃｔｔｔｇｔ（配列番号２）
・ＧＡＴＡ４
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇａｃａｃｃｃｃａａｔｃｔｃｇａｔ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｇｃｃｃｃａｃａａｔｔｇａｃａｃａｃｔ（配列番号４）
・αＭＨＣ：
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｃｔｇａｃａｇａｔｃｇｇｇａｇａａｔｃａｇ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｔｇｇｃａａａｇｔａｃｔｇｇａｔｇａｃａ（配列番号６）
・ＭＬＣ２ｖ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇａｃｃａｔｔｃｔｃａａｃｇｃａｔｔｃａａｇ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｔｃａｇｃａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃａｔａｇｔ（配列番号８）
・ＭＬＣ２ａ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃａｇｃｔｇｃａｔｔｇａｃｃａｇａａｃａ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｇａｇｃｔｇｇｇａａｔａｇｇｔｃｔｃｃｔｔ（配列番号１０）
・Ｔｂｘ５
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｇａａｃｇｔｇａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇａａ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｔｃｃｔｃｃｃｔｇｃｃｔｔｇｇｔｇａｔ（配列番号１２）
・ｃＴｎＴ
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｃｃｔｃａａａｇａｃａｇｇａｔｃｇａａ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｔｔｃｃｔｔｃｔ（配列番号１４）
・Ｆｌｋ１
Ｆｏｗａｒｄ：ｔｃｇａｇａｃａｇａａａｔａｃｇｔｔｇａｇａａｃ（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｇｃａａａｃｔｇｇｔｇｔｇａｇｔｇａｔｔｃｇ（配列番号１６）
・ｃ−Ｋｉｔ
Ｆｏｗａｒｄ：ｇｇａａｇｃｇｔｇａｃｔｃｇｔｔｔａｔｔｔｔｃ（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ｃｔｃｃｇｔｔｇａｇｔｇｃａｇａａｇｇｔｔ（配列番号１８）
いずれのマーカーの発現も他のコロニー群に比べて顕著に増加していた。
【００３９】
Ｆｌｋ１＋細胞をＯＰ９と共培養するとＦｌｋ１−細胞をＯＰ９と共培養したときよりも高頻度に拍動細胞が認められ。この拍動細胞は心筋マーカーを発現していることから、心筋細胞であることが確認できた。
【００４０】
以下さらに実施例を挙げて本発明を説明するが、細胞培養技術や細胞の単離技術等は特に言及しない限り実施例１に準じて行う。
【００４１】
実施例２：中胚葉分化誘導系における表面抗原の検討
Ｆｌｋ１の発現がピークになる分化誘導５日目の中胚葉系細胞の表面抗原の解析を行った。解析は各表面抗原に対する特異抗体を用い、免疫細胞染色を行った。１次抗体は各表面抗原に対する特異抗体（抗Ｆｌｋ１抗体以外は全てＢＤバイオサイエンス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社より入手し、抗Ｆｌｋ１抗体は上述の通り、理化学研究所西川氏より供与されたマウスモノクローナル抗体ＡＶＡＳ１２を用いた）を抗Ｇｒ１抗体及び抗Ｍａｃ１抗体については４００倍希釈したものを、それ以外の抗体は２００倍希釈したものを用いて反応に供した。２次抗体としては、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７を４００倍希釈で使用した。
分化誘導は概ね実施例１と同様な手法に基づくが、実験プロトコルを図４に示す。
分化とともに発現が増加する表面抗原として、Ｆｌｋ１以外にＣＤ２４及びＣＤ４４抗原が、分化とともにその発現量を増強させた。結果を表２に示す。
【００４２】
【表２】
【００４３】
次いで、Ｆｌｋ１＋細胞、Ｆｌｋ１−細胞におけるＣＤ２４、ＣＤ４４の発現を比較するとＣＤ２４の発現パターンは両細胞間で違いはなかったが、ＣＤ４４の発現においてはＦｌｋ１＋細胞の集団の方がより多くのＣＤ４４発現細胞を含んでいた。
【００４４】
実施例３：ＣＤ４４と心筋細胞出現率の関係の検討
Ｆｌｋ１＋細胞集団中のＣＤ４４＋細胞（Ｆｌｋ１＋／ＣＤ４４＋）及びＣＤ４４−細胞（Ｆｌｋ１＋／ＣＤ４４−）、Ｆｌｋ１−細胞集団中のＣＤ４４＋細胞（Ｆｌｋ１−／ＣＤ４４＋）及びＣＤ４４−細胞（Ｆｌｋ１−／ＣＤ４４−）をそれぞれソーティングし、心筋分化誘導（ＯＰ９細胞上での共培養）を行い、拍動コロニー出現率を比較した。結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
［Ｆｌｋ１＋，ＣＤ４４＋］の細胞集団からは高率に心筋細胞が誘導された。しかし［Ｆｌｋ１−，ＣＤ４４−］の細胞集団からは心筋細胞が誘導されなかった。
【００４７】
配列表フリーテキスト
配列番号１：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号２：Ｎｋｘ２−５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号３：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号４：ＧＡＴＡ４のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号５：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号６：αＭＨＣのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号７：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号８：ＭＬＣ２ｖのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号９：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１０：ＭＬＣ２ａのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１１：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１２：Ｔｂｘ５のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１３：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１４：ｃＴｎＴのＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１５：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Ｆｌｋ１のＰＣＲ用プライマー（リバース）
配列番号１７：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（フォワード）
配列番号１８：ｃ−ＫｉｔのＰＣＲ用プライマー（リバース）
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本発明の心筋前駆細胞単離用デバイスあるいは心筋前駆細胞投与用デバイスの一例を示す模式図である。
【図２】図２はＦｌｋ１＋／ＣＤ４４＋細胞からの心筋細胞への分化を検討する際の実験プロトコルを模式化したものである。
【図３】図３はＥＢ５細胞の分化誘導におけるＣＤ４４及びＦｌｋ１の経時的発現の結果を示す図である。。
【図４】図４はＥＢ５細胞の中胚葉分化誘導系における表面抗原を検討する際の実験プロトコルを模式化したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、およびＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項２】
中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、およびＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項３】
中胚葉細胞が幹細胞由来である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
【請求項１０】
ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
【請求項１５】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＣＤ４４を発現している細胞集団から、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項１６】
（ａ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＦｌｋ１を発現している細胞集団から、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項１７】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、請求項１５または１６記載のデバイス。
【請求項１８】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、請求項１５または１６記載のデバイス。
【請求項１９】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【請求項２１】
心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２２】
心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである請求項２０記載のデバイス。
【請求項２３】
移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、請求項２２記載のデバイス。
【請求項２４】
移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、請求項２２記載のデバイス。
【請求項１】
中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、およびＣＤ４４及び／又はＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項２】
中胚葉細胞を含有する細胞集団についてＣＤ４４及びＦｌｋ１の発現を解析する工程、およびＣＤ４４及びＦｌｋ１を発現している細胞を回収する工程を含む、中胚葉細胞を含有する細胞集団から心筋前駆細胞を単離する方法。
【請求項３】
中胚葉細胞が幹細胞由来である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）又は組織幹細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
中胚葉細胞が、ＥＳ細胞を中胚葉系分化誘導することによって得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞がマウスＥＢ５細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
中胚葉系分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で培養することによって行われる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって単離された心筋前駆細胞。
【請求項１０】
ＣＤ４４の発現を解析する工程が、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質が抗ＣＤ４４抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｆｌｋ１の発現を解析する工程が、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて行うものである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質が抗Ｆｌｋ１抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の心筋前駆細胞をストローマ細胞と共培養することを特徴とする、インビトロで心筋細胞を産生する方法。
【請求項１５】
（ａ）ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＣＤ４４を発現している細胞集団から、Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項１６】
（ａ）Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いて中胚葉細胞を含有する細胞集団からＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段、（ｂ）（ａ）で得られたＦｌｋ１を発現している細胞集団から、ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段を少なくとも含む、心筋前駆細胞単離用デバイス。
【請求項１７】
Ｆｌｋ１に特異的親和性を有する物質を用いてＦｌｋ１を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗Ｆｌｋ１抗体固定化固相担体である、請求項１５または１６記載のデバイス。
【請求項１８】
ＣＤ４４に特異的親和性を有する物質を用いてＣＤ４４を発現している細胞集団を回収する為の手段が、抗ＣＤ４４抗体固定化固相担体である、請求項１５または１６記載のデバイス。
【請求項１９】
中胚葉細胞を含有する細胞集団が、骨格筋組織、脂肪組織、末梢血、骨髄組織、および臍帯血からなる群より選択される少なくとも１種の組織より得られるものである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のデバイスと、心筋前駆細胞を患者に投与するための手段とを含む、心筋前駆細胞投与用デバイス。
【請求項２１】
心筋前駆細胞を患者に投与するための手段がシリンジ又はカテーテルである、請求項２０記載のデバイス。
【請求項２２】
心筋前駆細胞の患者への投与が、移植によって行われるものである請求項２０記載のデバイス。
【請求項２３】
移植が、該細胞を体外にて培養して得られる、単層若しくは多層構造を有するシート状の組織の形態で行われるものである、請求項２２記載のデバイス。
【請求項２４】
移植が、該細胞を体外にて非生物由来若しくは生物由来の支持体の上で培養して得られるシート状の組織の形態で行われるものである、請求項２２記載のデバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−３４１９９（Ｐ２００６−３４１９９Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２０８２０（Ｐ２００４−２２０８２０）
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年２月１３日 大阪大学主催の「修士論文発表会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年（平成１６年）３月２４日 日本再生医療学会主催の「第３回 日本再生医療学会総会」において文書をもって発表
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年２月１３日 大阪大学主催の「修士論文発表会」において文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年（平成１６年）３月２４日 日本再生医療学会主催の「第３回 日本再生医療学会総会」において文書をもって発表
【出願人】（３０００６１８３５）財団法人先端医療振興財団 (28)
【Ｆターム（参考）】
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