心筋細胞移植実施プロセス
【課題】心筋細胞移植実施プロセスの提供。
【解決手段】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスであり、梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによりＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する第１段階と、Ｇ-ＣＳＦによる動員後に実施される細胞の採取の段階である第２段階と、細胞処理の段階であり、ｅｘ‐ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる第３段階と、最終的な所定量の自己血漿中で増幅された細胞産物を再懸濁する段階である第４段階と、包装の段階であり、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を患者に再注入する第５段階、を実行する。
【解決手段】急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスであり、梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによりＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する第１段階と、Ｇ-ＣＳＦによる動員後に実施される細胞の採取の段階である第２段階と、細胞処理の段階であり、ｅｘ‐ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる第３段階と、最終的な所定量の自己血漿中で増幅された細胞産物を再懸濁する段階である第４段階と、包装の段階であり、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を患者に再注入する第５段階、を実行する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスに関する。
【０００２】
自然疾患や損傷関連疾患の多くは、機能の適正さではなく、特定のタイプの細胞が原因である。これらの疾患に対する有効な治療法の選択肢は現在わずかしかないか、あるいはまったくなく、全世界で何百万人もの患者がワラにもすがる思いで治療を待っている。「再生医療」という新しい概念は、損傷を受けた組織または臓器の再生に幹細胞を使用することを提案しており、当面の問題を矯正し、なおかつ、正常な生理学的プロセスを回復して、その後の薬剤や同様の治療も不要であるような方法で患者を治療し得る。
【０００３】
再生医療の最善の候補は、当然ながら、理論上いかなるタイプのより成熟した細胞、組織、および臓器も生み出すことが可能な胚性幹細胞である。しかし、倫理上および技術上の多くの未解決問題により、近年中にこの胚性肝細胞を治療として使用することは幻想になってしまっている。
【０００４】
一方、細胞は授かった運命を変えることはできないという、長年にわたる生物学的定説についての研究が近年行われてきた。実際に最近の多くの実験論文により、種々の成人細胞由来の幹細胞を再プログラミングして、最終的に胎芽由来の幹細胞の多機能性に一致させ得ることが示唆された。これら「成体幹細胞」（ＡＳＣｓ）のなかで動物およびヒトにおいて単離されているのは、現時点では造血幹細胞（ＨＳＣｓ）のみである。造血幹細胞は通常骨髄に常在するが、一定条件下では、血流を介して他の組織へ移動することができる。最近の実験データによれば、器質性のストレスという特定の条件下で、造血幹細胞が造血性骨髄以外の組織に脱分化する、あるいは分化転換することが示唆された。
【０００５】
大型のＡＭＩと最もよく関連する慢性心不全（ＣＨＦ）が先進国において最も重要な健康問題であることは明らかである。欧州におけるＣＨＦの罹患率は実質的に総人口の２％にものぼり、高齢者において劇的に増加している。米国では毎年約５００万人が新たにＡＭＩと診断され、このうち約１０％が大型の梗塞後、急速にＣＨＦを発症している。このような条件下では、これらの患者の死亡率は極めて高く、年間の関連コストは２５０億ドルを超えている。しかも、最近の目覚しい治療的進歩にも関わらず、心筋の壊死病変の生存能、血管新生、および収縮機能を回復させ得る薬剤も外科的手技もない。このような患者の約３５％がＡＭＩ後１年以内に、５０％がＡＭＩ後４年以内に死亡する。ＡＭＩを死因とする米国人患者は年間２００，０００人にのぼる。さらに、早急に心臓移植を必要としている患者が当然のことながら急速に増加していても、ドナー不足ゆえに心臓移植から実際に利益を得られる患者数は減少していると考えられる。例えば、フランスでは心臓移植の待機患者数は毎年平均５００人、米国では４，０００人である。さらに、最近米国心臓協会が実施した試験によれば、体外式（人工心臓補助装置）または体内式（埋め込み型除細動器）のいずれかの心臓補助装置を必要とする心臓病患者数は米国で約１００，０００人であり、コストにして３０億ドルになる。
【０００６】
このような患者、とりわけＡＭＩ後ＣＨＦ患者は、まさに心筋細胞移植から利益を得られると考えられる。
【背景技術】
【０００７】
ＡＭＩ後の心筋機能を回復させるために胚性幹細胞を臨床使用することは、前述の通り、現時点では不可能である。
【０００８】
これに対し、最近ではＨＳＣｓが分化転換能（「細胞の柔軟性」）を有することを強く示唆する実験データを示す試験が増えている。Ｊａｃｋｓｏｎら（非特許文献１）によれば、あらかじめ致死量の放射線を照射され、一過性の冠動脈閉塞による虚血状態におかれたマウスに移植されたマウスＨＳＣｓの子孫が、移動して心筋細胞および内皮細胞に分化し、虚血下の心筋および血管になった。
【非特許文献１】Ｊａｃｋｓｏｎ Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｂｙ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１：１０７：１３９４‐５‐１４０２
【０００９】
Ｌａｇａｓｓｅら（非特許文献２）は、「精製された」マウスの骨髄（ＢＭ）ｃ‐ｋｉｔｈｌＴｈｙ１０Ｌｉｎ−Ｓｃａ‐１＋細胞を、致死性の遺伝性チロシン血症マウスの血流に注入した。このわずか５０個の細胞により造血系が回復したばかりでなく、さらに驚いたことには、チロシン血症関連間疾患も治癒したと考えられる。
【非特許文献２】Ｌａｇａｓｓｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０００；６：１２２９‐１２３４
【００１０】
Ｋｏｃｈｅｒら（非特許文献３）は、ヒト骨髄由来のＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞を精製し、さらに、実験的梗塞を施行してから４８時間後のＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに対し、これらの細胞を血流に注入した。一部の細胞（またはその細胞の子孫）が内皮細胞に分化転換して、さらなる血管新生および心筋の血管再生に寄与し、心筋機能の著明な改善も認められた。
【非特許文献３】Ｋｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ‐ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：４３０‐４３３
【００１１】
おそらく最も重要と考えられる試験において、Ｏｒｌｉｃら（非特許文献４）は、遺伝子導入雄マウスの骨髄由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ｃ‐ｋｉｔｈｌ）を精製し、さらに実験的に心筋に損傷を与えた雌マウスにこの造血幹細胞を直接注入して、未熟な心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞のマーカーおよび形態を呈する細胞を生じさせた（非特許文献４）。造血幹細胞を注入された心臓は機能が３５％改善し、損傷を受けた心筋領域への血管新生が認められた。
【非特許文献４】Ｏｒｌｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１０：７０１‐７０４
【００１２】
このように、損傷を受けた心臓への骨髄幹細胞注入は、新たな治療法となり得る。この実験的試験がきっかけとなって、心臓発作後の患者の損傷を受けた心臓に対し、これらの細胞を直接注入したときの効果について検討する多くの臨床試験が開始された。しかし、マウスにおける２件の試験（非特許文献５および非特許文献６）および２件の注解（非特許文献７および非特許文献８）は、Ｏｒｌｉｃらが提唱した骨髄細胞の筋細胞および冠動脈への分化能について異議を唱えており、Ｏｒｌｉｃらの研究の知見は人為的結果の寄せ集めだと主張した。さらに、骨髄細胞は、常在細胞と融合することによってのみ、血液系統とは異なる細胞表現型を獲得するとの主張もなされた（非特許文献９および非特許文献１０）。これらの報告は、骨髄由来の幹細胞を使用して心臓を再生することの実現可能性に関する重大な懸念を呼び起こすと考えられる。Ｂａｌｓａｍらは、「さらなる非臨床実験データがなければ、あらゆる臨床試験は時期尚早と言える。特に重要なことは、現に病人が危険にさらされていることだ！」と、極めて深刻な結論も出している（非特許文献６）。
【非特許文献５】Ｍｕｒｒｙ Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６６４‐６６８
【非特許文献６】Ｂａｌｓａｍ Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｄｏｐｔ ｍａｔｕｒｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆａｔｅｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６６８‐６７３
【非特許文献７】Ｃｈｉｅｎ ＫＲ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：訳漏れ。Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６０７‐６０８
【非特許文献８】著者名なし。幹細胞に関する統一見解なし。Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８‐５８７
【非特許文献９】Ｔｅｒａｄａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ａｄｏｐｔ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１６：５４２‐５４５
【非特許文献１０】Ｙｉｎｇ Ｑ．Ｌ．ｅｔ ａｌ。Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１６：５４５‐５４８
【００１３】
それでもＯｒｌｉｃと同じグループのＫａｊｓｔｕｒａらは、２００５年初頭に発表した論文において、この攻撃に反論した（非特許文献１１）。Ｋａｊｓｔｕｒａらは、遺伝子導入雄マウスから得たｃ‐ｋｉｔ＋骨髄細胞を、心臓を梗塞させた雌のレシピエントに移植した。ｃ‐ｋｉｔ＋細胞の子孫のマーカーとしてＧＦＰおよびＹ染色体を用いて、このグループは、移植細胞が、細胞融合とは関係なく効率的に、また生化学的かつ形態学的に４５０万個の筋細胞および冠動脈へ分化することを証明した。
【非特許文献１１】Ｋａｊｓｔｕｒａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００５；９６：１２７‐１３７
【００１４】
このように骨髄幹細胞の分化転換をめぐる活発な論議は終わることなく、現在進行中の臨床試験によっても説得力のある裏付けはなされていない。
【００１５】
２００２年以降、ＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）を用いた臨床試験が増加し続け、これらの細胞を心臓発作後の損傷を受けた心臓または梗塞関連動脈に直接注入することの効果についての検討が始まった。これらの臨床試験の大半は非ランダム化パイロット試験（非特許文献１２および非特許文献１３）であり、多くは現時点で完了しているが、依然として進行中の臨床試験もいくつかある。１件（非特許文献１４）を除いて、示されたすべての実現可能性および安全性は、程度の差はあるものの、心機能の回復を強調している。
【非特許文献１２】Ｓｔｒａｕｅｒ Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０６：１９１３‐１９１８
【非特許文献１３】Ｐｅｒｉｎ Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ ６ ａｎｄ １２ ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０（ｓｕｐｐｌ １）：II２１３‐II２１８
【非特許文献１４】Ｋｕｅｔｈｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｒａ‐ｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉａｌ ２００４；９７：１２３‐１２７
【００１６】
最近、いくつかのランダム化試験が報告され、矛盾する結果が示された（非特許文献１５および非特許文献１６）。例えば、あるランダム化オープン試験結果では、ＢＭ由来幹細胞移植後、左室の収縮機能は改善したが、左室のリモデリングは改善しなかったことが示された（非特許文献１７）。さらに、対照群は通常、細胞を移植された群の状態を正確に再現していなかった（非特許文献１８および非特許文献１７）。骨髄穿刺およびプラセボ冠動脈内注入を含めて、移植群を完全に再現する唯一の試験が、ごく最近発表された（非特許文献１６）。この周到に実施された二重盲検プラセボ対照試験では、梗塞期間中に自己ＢＭ由来細胞注入が実施され、本法の実現可能性および安全性が確認された。さらに、虚血、梗塞、および不整脈の増加は認められなかった。ＢＭＳＣ移植により、心筋梗塞の規模が著明に減少し、局所収縮機能の回復状況がより良好であった。しかし、心筋の潅流および代謝の増加については、全体として両群に差は認められなかった。しかし、Ｊａｎｓｓｅｎらが本試験に組入れた低リスク患者のうち右冠動脈に梗塞を有していたのは３８％で、平均ＬＶＥＦは約５５％であった。このように、低リスク患者の左室機能はおそらく十分に維持されなかったため、ＢＭＳＣ注入による著明な機能改善は期待できなかったと考えられる。Ｊａｎｓｓｅｎらは、この概念を裏付けるさらなるデータを提示した。すなわち、各群最大梗塞９例に限定したときの代謝活性は、対照群と比較して、治療群において実質的に増加した。同様に、対照群と比較して、治療群では壁運動指数改善の可能性が増加したのは、そのセグメントの壁内運動が７５％を越えたときであった。
【非特許文献１５】Ｓｃｈａｃｈｉｎｇｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌ ｏｎｅ‐ｅａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＰＣＡＲＥ‐ＡＭＩ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００４；４４：１６９０‐１６９９
【非特許文献１６】Ｊａｎｓｓｅｎｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＳＴ‐ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｉｎｄ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００６；３６７：１１３‐１２１
【非特許文献１７】Ｗｏｌｌｅｒｔ Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ＢＯＯＳＴ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６４：１４１‐１４８
【非特許文献１８】Ｓｃｈａｃｈｉｎｇｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌ ｏｎｅ−ｙｅａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＰＣＡＲＥ‐ＡＭＩ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００４；４４：１６９０‐１６９９
【００１７】
事実、報告されたほとんどの試験では、これまでに組入れられた患者は死亡およびうっ血性心不全発症のリスクが比較的低く、これは高リスク患者のみを組入れることにより慎重になり、恐らくより重大視していたと考えられる（非特許文献１９）。
【非特許文献１９】Ｐｅｎｎ Ｍ．Ｓ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｆｏｃｕｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｏｎ ｔｈｏｓｅ ａｔ ｒｉｓｋ．Ｌａｎｃｅｔ ２００６；３６７：２７‐８８
【００１８】
結局、心機能改善において再注入された細胞が果たすと考えられる役割の正確な評価は、様々な理由から、これらのパイロット試験またはランダム化試験からは得られないと考えられる。その理由とは、
【００１９】
―心筋生検および／または倫理的に承認された生物学的マーカーがなくてはヒトにおいて心筋再生を証明することは困難である。
【００２０】
―全試験において、バイパス手術または梗塞関連動脈再透過のいずれかによって梗塞部位が再灌流されたため、全体的に認められた新血管新生が再灌流と関連しているのか否か、あるいは実際には細胞関連の新血管新生機序と関連しているのか否か、確認することは困難である。
【００２１】
―採取されるＢＭ‐ＭＮＣｓは、実際には様々なタイプのＡＳＣ（「真」のＨＳＣｓ、間葉幹細胞、他の間質細胞等）を含む細胞の「スープ」である。そのため、どのタイプの細胞が実際に心筋再生および血管再生の可能性を秘めているのか判断するのは困難である。
【００２２】
―さらに、ほとんどの試験で認められた駆出率の改善が、ＢＭ‐ＭＮＣｓの送達に用いられた手技によるものか、あるいはＢＭ‐ＭＮＣｓそのものによるものかについて疑問が生じた。実際、細胞の再注入により心筋内に幹細胞の帰巣シグナルがさらに発現し、結果的に一時的な治癒反応を起こすことができた。
【００２３】
上述の見解に関して、様々な幹細胞の「るつぼ」を再注入するのではなく、選択した幹細胞を使用するほうが好ましい。そのほうが、あるとすればどのタイプの細胞に心臓を改善させる見込みが実際にあるのか、より優れた判断を下せる。
【００２４】
さらに、ＢＭ由来のＣＤ３４＋細胞ではなく、動員後のＣＤ３４＋細胞を採血することにはいくつかの利点がある。
【００２５】
白血球搬出産物にはより多くのＣＤ３４＋細胞が含まれ、結果的に正の選択が容易になり、生産性が高まる。
【００２６】
患者の苦痛が大幅に減少し、麻酔が不要になる。
【００２７】
２００３年以降、いくつかの論文により、ヒトＣＤ３４＋細胞が内皮細胞または心筋細胞のいずれかに分化転換する可能性が強く示唆された。ヒト血液由来の内皮前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞と、ラットの心筋細胞を共培養して、Ｂａｄｏｒｆｆら（非特許文献２０）は、これらの細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的に活性の心筋細胞へと分化転換し、α-サルコメアのアクチンおよび心筋トロポニンＩの発現によって同定されることを示した。この分化転換は、細胞融合ではなく、細胞と細胞の接触により媒介された。Ｐｅｓｃｅら（非特許文献２１）は、新たに分離したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を虚血下でマウスの内転筋に注入すると、内皮および（予想外に）骨格筋が生じることを証明した。治療された四肢では、細動脈の長密度および筋線維密度が強調された。われわれが今後何を提示するかについて考えた場合、より重要であるのは、内皮性および筋原性の分化能が、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅後のＣＤ３４＋において維持されたことである。Ｙｅｈらは、最初の試験において、成人のヒトＰＢ ＣＤ３４＋細胞がｉｎ ｖｉｖｏでヒトの心筋細胞、成熟した内皮細胞、および平滑筋細胞に分化転換し得るか否かについて検討した（非特許文献２２）。Ｙｅｈらはまず、ＳＣＩＤマウスにおいて左冠動脈前下行枝を閉塞させることにより心筋梗塞を作成し、次にヒトの成人ＰＢ ＣＤ３４＋細胞を尾静脈に注入した。注入から２ヵ月後、マウスの心臓の梗塞部位および梗塞部位周辺において、心筋細胞およびヒト白血球抗原をもつ内皮細胞が確認された。別の実験で、実験的心筋梗塞のないマウスに対しＣＤ３４＋細胞を脳室内に注入した。ＨＬＡ陽性筋細胞および平滑筋細胞は、殺処分されたこれらのマウスのうち１匹のみで確認された。このように、分化転換は局所組織の損傷に影響されると考えられる。
【非特許文献２０】Ｂａｄｏｒｆｆ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３；１０７：１０２４‐１０３２
【非特許文献２１】Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｙｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｌｉｍｂ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００３；９３：ｅ５１‐ｅ６２
【非特許文献２２】Ｙｅｈ Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ， ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３，１０８：２０７０‐２０７３
【００２８】
しかし、Ｙｅｈらは別の論文において、過去に出された結論について若干補強している（非特許文献２３）。Ｙｅｈらは、同一の実験条件で、ＨＬＡ＋およびトロポニン＋またはＮｋｘ‐２．５＋心筋細胞由来の核の７３％がヒトおよびマウスのＸ染色体を両方とも含み、ヒトＸ染色体のみを含んでいる核は２４％であることを効率的に確認した。これに対し、ＨＬＡ-、トロンポニンＴ＋細胞は、マウスＸ染色体のみを含む。さらに、ＣＤ３４＋細胞由来の内皮細胞の９４％はヒトＸ染色体のみを含む。このように、著者らは現在、細胞融合と分化転換のどちらも末梢血ＣＤ３４＋細胞の心筋細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ形質転換の原因であると結論付けている。
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｔｈ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４‐ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０：３８０３‐３８０７
【００２９】
もちろん、これらの結論は、本当の意味で幹細胞の柔軟性に関する論議を明らかにしているわけではない。
【００３０】
別の選択肢として、骨髄中にすでに存在していると考えられる未熟な内皮前駆細胞および筋前駆細胞がある。器質性のストレスの場合、これらの前駆細胞は循環血に動員され、損傷を受けた臓器、例えば心筋梗塞部位に戻る。
【００３１】
Ａｓａｈａｒａらは１９９７年、健康な志願者の循環血にＭＮＣｓが存在することを初めて示した。ＭＮＣはｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞様の表現型を獲得し、ｉｎ ｖｉｖｏで毛細血管に組み込むことができる（非特許文献２４）。このような細胞はＣＤ３４と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＲ‐２）の両方とも発現し、胚内皮前駆細胞とＨＳＣとが共有する。次にＡｓａｈａｒａは、このＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ‐２＋細胞が早期の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）であるとの仮説を立てたが、動物実験の条件ではあるが、Ｆｌａｍｍｅらが、ＣＤ３４とＶＥＧＦＲ‐２の両方が成熟した内皮細胞上にも発現されたことをすでに示していた（非特許文献２４）。最近、Ｐｅｉｃｈｅｖらが卓越した試験において、動員されたＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞の平均２％がＶＥＧＦＲ‐２であったことと、これらＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞の大半が造血幹細胞マーカーＡＣ１３３も発現することを証明した。このＡＣ１３３は未熟な造血細胞にも存在するが、成熟した内皮細胞や分化した造血細胞には存在しない（非特許文献２５）。このように、ＣＤ３４＋細胞上のＶＥＧＦＲ‐２とＡＣ１３３の共発現により、表現型的に独特なＥＰＣが同定されている。さらに、実質的にすべてのＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ‐２細胞がケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を発現し、間質細胞由来因子‐１（ＳＤＦ‐１）またはＶＥＧＦに反応して遊走する。ｉｎ ｖｉｖｏヒトモデルを用いてＰｅｉｃｈｅｖらは、左心補助人工心臓の表面上に形成された新生内膜が、ＡＣ１３３＋／ＶＥＧＦＲ‐２＋細胞と一緒に定着していることも確認した。このように、これら全てのデータが、ＶＥＧＦＲ‐２＋およびＡＣＣ１３３を発現する循環ＣＤ３４＋細胞が、新血管新生（血管芽細胞様細胞）に寄与すると考えられる、表現型的にも機能的にも異なる循環内皮前駆細胞群を構成していることを強く示唆している。
【非特許文献２４】Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７５：９６４‐９６７
【非特許文献２５】Ｐｅｉｃｈｅｖ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦＲ‐２ ａｎｄ ＡＣ１３３ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ ２０００；９５：９５２‐９５８
【００３２】
同じ方針で進めて、本発明の発明者は、癌患者において、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後の白血球搬出産物（ＬＫＰ）にＶＥＧＦＲ‐２とＡＣ１３３の両方を発現するＣＤ３４＋細胞の存在（平均０．６％、０．２１〜１．１６の範囲）を確認した（下の表１および図１参照）。
【００３３】
他のＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞のサブセットも筋および／または心筋マーカーを共発現する可能性はこれまでのところ示唆されていないため、依然として仮説のままである。例えば、本発明の発明者が、臍帯血またはＰＢ‐ＣＤ３４＋が心筋細胞に分化転換し得るか否かを検討した時点では（上記参照）、Ｐｅｓｃｅ（非特許文献２６）もＹｅｈ（非特許文献２２）も、再注入した全ＣＤ３４＋細胞内に、すでに分化した心筋細胞前駆体が実際にあらかじめ存在しているか否か、念のため検証することはなかった。このような事態は彼らの分化転換仮説には不都合である。ＥＰＣｓ評価に使用した同じＬＫＰｓ産物を周到にスクリーニングしたところ、動員された少量のＣＤ３４＋細胞が、Ｄｅｓｍｉｎ（筋マーカー）（平均で細胞の０．３９％、０．０１〜１．１６％の範囲）またはトロポニン‐Ｔ（心筋マーカー）（２ＬＫＰｓにおいて、それぞれ０．１７％および０．６９％）のいずれかを共発現することが最近示された（下の表２および図２Ａ・図２Ｂ参照）。
【非特許文献２６】Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｙｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｌｉｍｂ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００３；９３：ｅ５１‐ｅ６２）
【００３４】
しかし、この２つのマーカーの細胞内発現により、二重標識用フローサイトメトリーが適用できなくなるため、両マーカーが同一ＣＤ３４＋細胞によって共発現されるのか否かは確認できなかった。
【００３５】
さらに、同一ＬＫＰをＲＴ−ＰＣＲにかけたところ、ｅＮＯＳおよびＫＤＲ（内皮遺伝子）とＮｋｘ２‐５およびトロンポニン‐Ｔ（心筋細胞遺伝子）のいずれについても、毎回メッセンジャーＲＮＡが検出されたことから、早期に分化した心筋細胞前駆体が血中に動員されていることが確認された（表３参照）。
【００３６】
このように、これらすべてのデータに基づけば、現在では、Ｇ‐ＣＳＦにより血中へ動員された全ＰＢ‐ＣＤ３４＋は、多くの「真」のＨＳＣsのほかに、内皮前駆細胞および成熟した内皮細胞、または筋／心筋前駆細胞のいずれかとして認識されている少量のサブセットも含むことを合理的に結論付けることができる。どちらのサブセットも、当然のことながら、さらなる心筋再生のために重要な役割を果たすと考えられる。
【００３７】
ＢＭ単核細胞の代わりに末梢血幹細胞を用いた（心筋）細胞移植の臨床的評価はもっと少ない。
【００３８】
本発明の発明者は、この異なるアプローチについて初めて実験を行い、２００３年７月に開催された国際実験血液学会（Ｈｅｎｏｎ Ｐｈ．Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｒｉｆｉｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．２００３年７月５〜８日にフランス・パリで開催された第３２回国際実験血液学会での個人発表）および２００３年１２月に開催された米国血液学会（非特許文献２７）で初めて予備的データを発表した。
【非特許文献２７】Ｈｅｎｏｎ Ｐｈ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｒｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ Ｇ‐ＣＳＦ ｃａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：１１，１２０８ａ
【００３９】
他の２グループが、やはりＧ‐ＣＳＦにより動員されたＰＢＳＣ（変異体であるが）を用いて、さらに同様のアプローチを策定した。Ｐｏｍｐｉｌｉｏらのグループは、Ｓｔａｍｍ（非特許文献２８）がＢＭ細胞で実施したように、積極的にＣＤ１３３亜集団を選択してその増殖能の高さと血管性分化を利用することを提案した。サイトカイン投与またはアフェレーシス法のいずれによっても有害作用は認められなかった。しかし、再灌流に改善が認められた場合は、左室の収縮性については著明な改善が得られなかった（非特許文献２９）。Ｋａｎｇらは、冠動脈ステント術を施行された心筋梗塞患者２７人を無作為に３群に分け、前向きに試験を行った。Ｇ‐ＣＳＦにより動員されたＰＢ細胞を冠動脈内へ再注入した群を第１群、Ｇ‐ＣＳＦのみを投与した群を第２群、対照群（ステント術のみを施行）を第３群とした（非特許文献３０）。運動能力、心筋潅流、および収縮機能は、細胞注入を受けた患者において著明に改善した。しかし、新生内膜過形成と関連して、Ｇ‐ＣＳＦの投与を受けた患者（第１群および第２群）において責任病変のステント内再狭窄率が予想外に高かった。この後期有害作用は、Ｇ‐ＣＳＦ投与によって、多くの好中球、単核細胞、および血小板を含有する非選択性の血球産物の再注入と、冠動脈内ステント術と、露出した金属ステントによる新生内膜増殖の加速とが組み合わさった結果と考えられる。このような組み合わせを回避することは恐らく可能であるが、動員目的でＧ‐ＣＳＦの投与のみを実施し、ステント術は施行しないという可能性は低い。
【非特許文献２８】Ｓｔａｍｍ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ ２００３；３６１：４５‐４６
【非特許文献２９】Ｐｏｍｐｉｌｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００４；７８：１８１２‐１８１３
【非特許文献３０】Ｋａｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒａ−ｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ‐ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｔｅｎｔｉｎｇ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ＭＡＧＩＣ ｃｅｌｌ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：７５１‐７５６
【００４０】
本発明は、先行技術の欠点を克服し、簡潔かつ効率的で、信頼のおける解決策を中程度のコストで提供し、革新的な心筋細胞移植プロセスの実施により慢性心不全の治療を可能にしようとするものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および本発明の血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスを特徴とし、以下の段階を実行する。
【００４２】
第１段階では、梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによるＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する、
【００４３】
第２段階は細胞採取の段階で、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後に実施する、
【００４４】
第３段階は細胞処理の段階で、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる、
【００４５】
第４段階は再懸濁の段階で、増幅された細胞産物を最終的な所定量の自己血漿中に入れる、
【００４６】
第５段階は包装の段階で、患者に再注入するため減菌シリンジに細胞懸濁液を入れる。
【００４７】
上記発明のプロセスを利用する好適な方法によれば、Ｇ‐ＣＳＦ投与は、ＡＭＩ後少なくとも３〜５日間中に実施する。
【００４８】
細胞の採取段階は、好ましくはＧ‐ＣＳＦによる動員から少なくとも６日目に実施する。
【００４９】
細胞の採取段階は、好ましくは全血の採血により実施し、最終的な総量は少なくとも２００ ｍｌとする。
【００５０】
細胞の採取段階は、好ましくは約１２時間以内に、数回連続する静脈穿刺により実行する。
【００５１】
細胞の採取段階は、好ましくは少なくとも３〜４回連続する静脈穿刺により実行する。
【００５２】
第３段階のＣＤ３４＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増幅は、好ましくは２週間のあいだに実施する。
【００５３】
再懸濁段階は、好ましくは血漿の最終的な所定量を５〜１５ ｍｌ、好ましくは１０ ｍｌとして実施する。
【００５４】
第５段階の再注入は、好ましくは包装から５〜１８時間以内、有利には約１２時間後に実施する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
予備的データを臨床的に構築するため、Ｇ‐ＣＳＦによる動員の実現可能性、安全性、および心機能への影響、自己血ＣＤ３４＋細胞の採取、選択、および心臓内再注入を評価するための第Ｉ相臨床試験を開始した。
【００５６】
以下の基準に従って、患者１０名を計画に入れた。２週間を超える壁内ＡＭＩ、同位体的左室駆出率（ＬＶＥＦ）≦３５％、左室壁において梗塞部位と一致する明確なアキネジア部位、冠状動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）候補者、年齢が７０歳未満、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類クラスＩＶの運動能力。
【００５７】
患者について、試験への組入れ前と左心カテーテル術後６ヵ月目に評価し、１８Ｆｌ‐ＦＤＧおよび２０１Ｔｉ‐Ｃｈｌｏｒｉｄｅの連続静注後の三次元心エコー検査、２０１タリウムシンチグラフィ、および陽電子放射断層法（ＰＥＴＳｃａｎ）により心筋の生存能と潅流の両方を評価した。
【００５８】
患者から同意文書を取得後、ＣＡＢＧ施行７日前に、Ｇ‐ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標）、Ｃｈｕｇａｉ Ｆｒａｎｃｅ提供）５ μｇ、１日２回、５日間連続皮下注射によりＣＤ３４＋細胞の動員を開始した。６日目の早朝に、ＣＤ３４をモニタリングするフローサイトメトリー（ＦＣＭ）用に採血を行った。モニタリングの結果が出たら直ちにＦｒｅｓｅｎｉｕｓ ＡＳ１０４ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒによりアフェレーシスを開始した。目標は、より満足できる細胞選択のために推奨される、少なくとも１００ｘ１０６個の細胞を採取することとした。アフェレーシス産物の内容物をＦＣＭにより速やかに評価し、期待通りにＣＤ３４＋を採取したことを確認した。ＣＤ３４＋の採取が期待通りでなかったときは、７日目の早朝に２回目のアフェレーシスを実施した。いずれにしても、６日目の細胞産物を含む袋は、ＣＤ３４＋選択まで４℃で保管した。患者は動員／採取の期間中、心臓病向け集中治療室に入院したままとし、このような特定カテゴリーの患者に起こりうる、いかなる予想外の副作用も速やかに矯正した。
【００５９】
ＣＤ３４選択に関して、全アフェレーシス産物とフェライトビーズに抱合された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）とを混ぜてインキュベートし、臨床用Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁気細胞分離装置（Ｂａｘｔｅｒ、フランス）にかけた。次いでビーズからＣＤ３４＋細胞を遊離させ、自己血漿中で再懸濁し、グラフトの最終量を１５〜２０ ｍｌとした。さらに５ ｍｌの試料を用いて、血管形成能を高めるためＡＣ１３３およびＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ）ＭｏＡｂｓで標識したときに認識される細胞または横紋筋中のＤｅｓｍｉｎと反応するＤ３３ ＭｏＡｂで標識した細胞、そしてトロポニンＴと反応する１Ｃ１１ ＭｏＡｂで標識した細胞のＣＭＦを定量化した（表４）。
【００６０】
図３で臨床プロトコルを要約し、実施例を用いて、動員され精製されたＣＤ３４＋細胞による虚血性心臓の修復プロセスに関連する本発明のプロセスの好適なプロトコルを模式図で示す。
【００６１】
図３によれば、第１ステップは５日間のサイトカイン投与に関する。第２ステップは、６日目に実施される、動員された血液幹細胞の採取に関する。第３ステップは、ＣＤ３４＋選択に関する。第４ステップは、７日目の、精製されたＣＤ３４＋細胞の獲得に関する。第５ステップは、ＣＤ３４＋サブセット（ＣＤ１３３＋；ＫＤＲ＋；心筋細胞）の内容物の評価と、手術を回避する患者の虚血領域への注入に関する。
【００６２】
本試験が承認されると、連続患者５人を本試験に組入れた。最初の３人は、現在、重大な３年間の追跡調査から利益を得ている。
【００６３】
この３人のデータは表６で詳述する。１人目の患者は、比較的若い（３９歳）ことから、同情的な理由で組入れたが、ＡＭＩの経験が８年前だったため、どちらかといえば陰性対照とみなした。２人目の患者は最も重症で、トリートロンキュラー閉塞が認められた。この閉塞は、手術および細胞再注入の６週間前に発症していた。予後不良のため、この患者についてはさらなる心臓移植を検討する必要があった。３人目の患者は、当初はそれほど重症ではなかったが、ＡＭＩ後３ヵ月目には、いずれ生命を脅かす深部うっ血性心不全へと徐々に進行した。
患者データ
【００６４】
術前および術後の期間中、３人の患者全員が細胞の動員および採取法に対し忍容性が高く、一過性の軽度の血小板減少症以外はいかなる副作用も認められなかった。患者２では、１回のアフェレーシスで十分な数のＣＤ３４＋細胞が得られ、他の２人ではアフェレーシスは２回必要であった。いずれの場合も、ＣＤ３４＋細胞懸濁液の純度および生存能は、どちらかと言えば良好であった。細胞グラフトを確実に入手したら直ちにＣＡＢＧを開始し、心臓の拍動時に実施した。すべての虚血部位から細胞懸濁液を注入し、１．５〜２ ｍｌずつ、縦方向および水平方向に８〜１０回注入した。操作はすぐに完了した。直ちに患者を中間治療室に移送し、最終的には退院して、通常通り、６〜８日後にリハビリテーションプログラムを行った。ＣＡＢＧ後、最大３年まで上室性不整脈は誰にも認められなかった。患者２は急激に重大な心嚢液貯留を発症したが、これは拍動している心臓の手術後にはさほどめずらしくはなく、後遺症を残さず容易に治療された。
【００６５】
以下の結果に関して、６ヵ月目および３年目に術後臨床評価を実施した。
【００６６】
６ヵ月目：
【００６７】
患者１は運動能が若干増加していて、その理由がＣＡＢＧのみであることは確かである。しかし、８年間梗塞状態であった領域は、細胞の再注入時には完全に石灰化していたため、心機能は実際には何も改善しなかったと考えられる。さらに、他の患者と比較して患者１が受けたＣＤ３４＋細胞およびサブセットの量は最も少なく、他の２人の患者に再注入されたＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１３３＋のサブセットは、それぞれ１．５倍および２倍であった。患者２の細胞グラフトは、最高量のＣＤ１１３＋ＫＤＲ＋およびＤｅｓｍｉｎ＋細胞も含んでいた。６ヵ月目のＰＥＴスキャン画像によれば、左前壁の収縮性、ＬＶＥＦ指数、および運動能力と相関して、以前は動かず、非手術的に再灌流させた虚血部位（図４）の生存能および灌流に目覚しい改善が認められなかった（図４）。程度は異なるが、患者３もこれらのパラメータのほとんどが驚くほど改善された。
【００６８】
３年目：
【００６９】
患者１の心機能は、その後さほど改善しなかった。左室腔は発症時と比較してさらに拡大しているくらいである（ＬＶＥＤＤ＝８４ ｍｌ）。測定回数によって、ＬＶＥＦは３６〜４６％のままである。これと関連して、前壁のほぼ前面、中隔‐心尖部、および心尖部が完全にアキネジアとなっている。ＣＡＢＧにより、側壁の動きのみ改善された。
【００７０】
反対に、患者２および患者３の心機能パラメータはさらに改善していた：
【００７１】
患者２では、測定回数によらず、ＬＶＥＤＤが５５ ｍｌに減少し、ＬＶＥＦは現在５３％（初期ベースラインより＋２３％）である。前壁および前壁‐中隔接合部の収縮性は極めて良好であり、心尖部の動きも現在著明に改善している。患者は今では呼吸困難を起こさずに少なくとも２ｋｍを早足で歩くことができるようになり、農場で一所懸命働いている。
【００７２】
患者３でも左室機能が極めてよく改善し、ＬＶＥＦ６４％（＋３１％、ほぼ正常）、ＬＶＥＤＤ３１ ｍｌ、前壁‐心尖の接合部を３分したときの中央部と基部ならびに中隔の正常な動き、そして、前壁の軽度の運動不能が示された。尖端のみが完全にアキネジアのままである。この患者は普通に生活をしている。
【００７３】
したがって、これらの予備的データによれば、Ｇ‐ＣＳＦ投与、アフェレーシス法、および他著者らが提案したより大量の細胞懸濁液の心臓内再注入は実現可能であり、極めて重度のＡＭＩ患者において忍容性が高い。このことは最近組み入れられた新たな患者において確認された。「精製された」ＣＤ３４細胞は、血管新生または横膜筋再生のいずれかを促進し得る、すでに分化した細胞を様々な割合で含む。このように、再灌流されない、アキネジア状態の梗塞部位にこのような細胞を再注入すると、生存能、潅流、および収縮性の面で長期間、著明に改善される。このような改善がこれらの細胞由来であるか否かは不明であり、さらなる患者を用いてこれを確認する必要がある。しかし、このような梗塞部位の改善は、厳密には外科的再灌流のないＣＡＢＧ後にはまれである。ＡＭＩから細胞移植までの時間を短縮することと、大量の再注入細胞のサブセットは、恐らく心筋再生を成功させるのに必要不可欠である。
【００７４】
この極めて有望な第Ｉ相試験後、本発明によるより大規模なアプローチに着手する。
【００７５】
近い将来、心筋細胞移植が臨床現場で実施される機会が増加するとの見通しに対し、広範に対応するには、現行の細胞処理をいくつか改善する必要がある。より具体的には、この方法において白血球搬出法は、少なくとも以下の理由により、制限的要因であることは間違いない。
【００７６】
ａ）ＡＭＩ後、細胞の再注入が早いほど臨床結果はより良好になる。本プロトコルにより、ＡＭＩ後６〜１２週目にアフェレーシス法を実施したときの臨床的忍容性が高いことが示されているとしても、わずか８〜１０日前にＡＭＩを発症した患者には当てはまらない。
【００７７】
ｂ）一連のアフェレーシスを実施するには、承認と、十分な設備と、十分訓練されたチームとが必要である。現在このような要件を満たす医療施設はごくわずかであり、大半は現行の診療（血液学的目的でのＨＳＣ採取）ですでに負担がかかり過ぎている。１回のアフェレーシスに約３時間かかるため、回数を増やすことで新しい要望に対し、広範に、そして満足のいく対応をすることは困難である。
【００７８】
ｃ）別の制限的要因として冠動脈バイパス手術が示されている。現行の第Ｉ相試験においてこのような手術時に幹細胞を再注入しようとするのは、倫理上の理由による場合のみである。もちろん、心筋細胞移植を血管形成術および／またはステント術のように心臓療法の「通常」の技術として提案するためには、ＣＡＢＧを回避し、細胞の再注入のために低侵襲性の方法を用いることが不可欠である。
【００７９】
このように、細胞増殖プロセスを用いた新しいアプローチを実現し、比較的少量の血液試料から十分量のＣＤ３４＋細胞を得て、次いで白血球搬出を回避する必要がある。
【００８０】
最終的な目標を、ＡＭＩ後の虚血部位の生存能、再灌流、収縮性、その結果として患者の生活の質および生存率を引き続き改善することと規定したところ、２つの主な目的と、関連する複数の目的が確認された。
【００８１】
ａ）細胞増幅法を策定し、白血球搬出と同程度に多くの細胞を得られるようにして、この比較的侵襲的な手技を回避する。
【００８２】
ｂ）完全な心筋細胞移植法のコストを最低レベル、すなわち血管形成術および／またはステント術の平均コストと同程度に維持する。
【００８３】
さらには、
【００８４】
今後５〜６年間で、重度の心不全全体の約５％を治療することを意図するものである。
【００８５】
ｂ）長期の追跡調査に基づき、薬剤、検査、および罹患率低下の面で、心筋細胞移植による節減の可能性について評価し、正当化する。
【００８６】
ｃ）冠動脈バイパス手術を回避し、代わりに直接心室細胞再注入を導入する。
【００８７】
本発明は、簡潔かつ効率的で、信頼のおける解決策を中程度のコストで提供し、心筋細胞移植プロセスの実施により慢性心不全を治療しようとするものである。
【００８８】
したがって、本発明による方法は、上述の現行の第Ｉ相試験の通り、ＡＭＩ後のＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性と、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後の骨髄中ではなく、血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取とに基づく。この試験からの重要な修正点が４つある。
【００８９】
ａ）梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによるＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する。Ｇ‐ＣＳＦは、ＡＭＩ後３〜５日間に投与すべきことは明白である。
【００９０】
ｂ）細胞は、Ｇ‐ＣＳＦによる動員から６日目に、１２時間以内に３〜４回連続する静脈穿刺によって、最終的な総量２００ ｍｌの全血を採血して採取する。
【００９１】
ｃ）採決後、血液試料を集めて、同意している細胞処理検査室へ速やかに発送し、ｅｘ‐ ｖｉｖｏＣＤ３４＋細胞選択について調べてもらう。２週間以内に増幅させて、ＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる。
【００９２】
ｄ）増幅された細胞産物を最終量１０ ｍｌの自己血漿中で再懸濁し、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を包装して患者を担当する循環器センターへ発送し、包装後１２時間以内に再注入する。
【００９３】
全構想を図５に要約する。以下に手順を示す。
【００９４】
まず、５日間のＧＣＳＦ‐によるＣＤ３４＋細胞の動員で開始する。
【００９５】
動員から６日目に採血ステップ（総量２００ ｍｌ）を実施し、処理検査室へ発送する。
【００９６】
１５日間のＣＤ３４＋処理：バイオリアクターを用いて初回選択、増幅、および２回目の選択を行う。
【００９７】
グラフトを包装（１０ ｍｌ量）し、循環器センターへ発送する。
【００９８】
患者に対し細胞を再注入する。
【００９９】
この新たなアプローチは、現行の評価法と比較して大きな利点がある。その利点とは、
【０１００】
採血は痛みを伴わず、患者にとってストレスがない。全体として、ＡＭＩ直後に実施すると不快な副作用が発現する恐れのある白血球搬出を実施しなくて済む。さらに、看護師によりどこででも容易に実施することができる。
【０１０１】
白血球搬出法と比較して、採血のコストは極めて廉価であり、もう一つの細胞増幅処理による過剰コストとで均衡をとることができる。
【０１０２】
Ｇ‐ＣＳＦ投与から最終細胞産物までの全プロセスのスケジュールにより、ＡＭＩ後２４日目〜２６日目（図５）に心筋へ細胞を再注入できるようになる。この時点では、梗塞後の虚血性組織は依然として炎症性であり、心筋細胞内への拡散に都合がよい。反対に、明らかに瘢痕が形成されると、線維化組織の構造が細胞の拡散および心筋内への帰巣を妨げる（本試験に組入れた最初の患者に関するデータ参照）。このように、心筋を修復する際に再注入された細胞の効率は、本法の早成性により増大する。
【０１０３】
ＢＭ、ＰＢＳＣ、またはＣＢより生じた細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ３４＋細胞の増幅に関する極めて効率的な方法は、数年前に完成している。これは非常に未熟な幹細胞の大部分を増幅させることができる、これまでに発表された唯一の方法と考えられる。本法は２０００年に発表された（非特許文献３１）。全世界の特許がこの増幅法を保護している（特許文献１）。
【非特許文献３１】Ｋｏｂａｒｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｍｙｅｌｏｉｄ，Ｂ，ＮＫ ａｎｄ Ｔ
【特許文献１】仏国特許出願公開第００／０１３１１号（２０００年５月１６日）
【０１０４】
このように、本発明による臨床使用のため、この細胞増幅法を下記のとおり定義する：
【０１０５】
手短に言えば、ＣＤ３４＋細胞を免疫選択により精製後、長期無血清培地（ＬＴＣＭ）中で１０４個／ｍｌにて懸濁し、Ｆｌｔ３‐リガンド（ＦＬ，１００ｎｇ／ｍｌ、Ｖａｌｂｉｏｔｅｃｈ社）、幹細胞因子（ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ）、巨核球成長因子（ＭＧＤＦ，１００ｎｇ／ｍｌ），およびＧ‐ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６、およびＩＬ３を補充する。細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で１４日間インキュベートし、その後細胞を採取してアイエムディエム（ＩＭＤＭ、Ｓｅｒｏｍｅｄ‐Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中で洗浄して、トリパンブルー排除法により計数し、前駆細胞／幹細胞、免疫表現型、およびＮＯＤ‐ＳＣＩＤ腫大について解析した。
【０１０６】
培養法について、Ｊ．Ｂｅｎｄｅｒ（Ｎｅｘｅｌ、ＵＳＡ）提供のガス透過性ポリプロピレンバッグ（１１．２ｃｍx７．５ｃｍ、ＰＬ２４１７）で評価した。製造者の推奨事項に従って、選択した細胞を完全なＬＴＣＭ４ ｍｌに接種し、６日目にサイトカインを含有する新鮮な媒質１６ ｍｌを各バッグに添加する。以前の試験で決定した条件に従って、１４日目にシリンジを用いてこの細胞を除去し、ＩＭＤＭ中で洗浄後、解析を行った。
【０１０７】
細胞増幅は倍数で表す。それは１４日後の細胞、前駆体、およびＬＴＣ‐ＩＣのアウトプットの絶対数を、０日目の各インプット数で除することによって算出する。
【０１０８】
本法により総細胞数および前駆細胞数は高度に増幅する。中央値の範囲は、それぞれ総細胞数が１３０倍、ＣＤ３４＋細胞が１５〜２０倍、ＡＣ１３３＋細胞が２６倍、ＬＴＣ‐ＩＣが約１０倍である（図６）。さらに、増幅された細胞と増幅されていない細胞とでは、ＣＦＣおよびＬＴＣ‐ＩＣの前駆体の質はほぼ同じである。また、細胞の増殖能のマーカーとされているテロメアは平均で１５倍増幅したにもかかわらず、その長さは変化しなかった（図６参照）。
【０１０９】
さらに、増幅されたＣＤ３４＋細胞は、亜致死的に照射されたＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスへの定着能を有するとともに、長期造血および骨髄、Ｂリンパ球、ＮＫリンパ球、ならびにＴリンパ球への多能性分化にも役立つ。
【０１１０】
これら全てのデータが、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅ＣＤ３４＋細胞の臨床使用の強力な根拠をなす。
【０１１１】
最終グラフト産物中の予測細胞数：
【０１１２】
Ｇ‐ＣＳＦによる動員後、全血中に平均で３０個／μｌの細胞を予測するのが合理的である。全血２００ ｍｌの採血では、ＣＤ３４＋細胞の総収量は平均で６x１０６と考えられる。
【０１１３】
細胞増幅法によりＣＤ３４＋細胞は１５〜２０倍増加し、それによって計９x１０７〜１．２x１０８の範囲のＣＤ３４＋細胞が得られる。
【０１１４】
本法実施時には、２つの免疫選択ステップが必要となる。１つめは、増幅法の前に全血からＣＤ３４＋細胞を精製するステップ、２つめは増幅法後に生じるステップで、より成熟した増幅細胞の中から増幅したＣＤ３４＋細胞を選択する。この２つの免疫選択によってＣＤ３４＋細胞の約３０％が失われる。したがって、患者に投与されるグラフト産物に含まれるＣＤ３４＋細胞の最終数は、約６x１０７〜８x１０７個の範囲と考えられる。本プロトコルにおいて、平均約４x１０７個のＣＤ３４＋細胞を患者に再注入するとした場合、この予測された量は心筋を再生させるのに十分なはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本発明とその利点は、添付図に関する以下の好適な実施形態の説明によりさらに明白になり、非制限的な実施例を用いて提供される。
【０１１６】
【図１】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ）およびＣＤ１３３の発現
【図２Ａ】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるＤｅｓｍｉｎの発現
【図２Ｂ】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるトロポニンＴの発現
【図３】第１段階の臨床プロトコルの模式図
【図４】患者のＮo２ＰＥＴＳｃａｎ
【図５】本発明のプロセスの説明図
【図６】ＣＤ３４＋ＰＢＳＣ群のｅｘ ｖｉｖｏ増幅
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスに関する。
【０００２】
自然疾患や損傷関連疾患の多くは、機能の適正さではなく、特定のタイプの細胞が原因である。これらの疾患に対する有効な治療法の選択肢は現在わずかしかないか、あるいはまったくなく、全世界で何百万人もの患者がワラにもすがる思いで治療を待っている。「再生医療」という新しい概念は、損傷を受けた組織または臓器の再生に幹細胞を使用することを提案しており、当面の問題を矯正し、なおかつ、正常な生理学的プロセスを回復して、その後の薬剤や同様の治療も不要であるような方法で患者を治療し得る。
【０００３】
再生医療の最善の候補は、当然ながら、理論上いかなるタイプのより成熟した細胞、組織、および臓器も生み出すことが可能な胚性幹細胞である。しかし、倫理上および技術上の多くの未解決問題により、近年中にこの胚性肝細胞を治療として使用することは幻想になってしまっている。
【０００４】
一方、細胞は授かった運命を変えることはできないという、長年にわたる生物学的定説についての研究が近年行われてきた。実際に最近の多くの実験論文により、種々の成人細胞由来の幹細胞を再プログラミングして、最終的に胎芽由来の幹細胞の多機能性に一致させ得ることが示唆された。これら「成体幹細胞」（ＡＳＣｓ）のなかで動物およびヒトにおいて単離されているのは、現時点では造血幹細胞（ＨＳＣｓ）のみである。造血幹細胞は通常骨髄に常在するが、一定条件下では、血流を介して他の組織へ移動することができる。最近の実験データによれば、器質性のストレスという特定の条件下で、造血幹細胞が造血性骨髄以外の組織に脱分化する、あるいは分化転換することが示唆された。
【０００５】
大型のＡＭＩと最もよく関連する慢性心不全（ＣＨＦ）が先進国において最も重要な健康問題であることは明らかである。欧州におけるＣＨＦの罹患率は実質的に総人口の２％にものぼり、高齢者において劇的に増加している。米国では毎年約５００万人が新たにＡＭＩと診断され、このうち約１０％が大型の梗塞後、急速にＣＨＦを発症している。このような条件下では、これらの患者の死亡率は極めて高く、年間の関連コストは２５０億ドルを超えている。しかも、最近の目覚しい治療的進歩にも関わらず、心筋の壊死病変の生存能、血管新生、および収縮機能を回復させ得る薬剤も外科的手技もない。このような患者の約３５％がＡＭＩ後１年以内に、５０％がＡＭＩ後４年以内に死亡する。ＡＭＩを死因とする米国人患者は年間２００，０００人にのぼる。さらに、早急に心臓移植を必要としている患者が当然のことながら急速に増加していても、ドナー不足ゆえに心臓移植から実際に利益を得られる患者数は減少していると考えられる。例えば、フランスでは心臓移植の待機患者数は毎年平均５００人、米国では４，０００人である。さらに、最近米国心臓協会が実施した試験によれば、体外式（人工心臓補助装置）または体内式（埋め込み型除細動器）のいずれかの心臓補助装置を必要とする心臓病患者数は米国で約１００，０００人であり、コストにして３０億ドルになる。
【０００６】
このような患者、とりわけＡＭＩ後ＣＨＦ患者は、まさに心筋細胞移植から利益を得られると考えられる。
【背景技術】
【０００７】
ＡＭＩ後の心筋機能を回復させるために胚性幹細胞を臨床使用することは、前述の通り、現時点では不可能である。
【０００８】
これに対し、最近ではＨＳＣｓが分化転換能（「細胞の柔軟性」）を有することを強く示唆する実験データを示す試験が増えている。Ｊａｃｋｓｏｎら（非特許文献１）によれば、あらかじめ致死量の放射線を照射され、一過性の冠動脈閉塞による虚血状態におかれたマウスに移植されたマウスＨＳＣｓの子孫が、移動して心筋細胞および内皮細胞に分化し、虚血下の心筋および血管になった。
【非特許文献１】Ｊａｃｋｓｏｎ Ｋ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｂｙ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００１：１０７：１３９４‐５‐１４０２
【０００９】
Ｌａｇａｓｓｅら（非特許文献２）は、「精製された」マウスの骨髄（ＢＭ）ｃ‐ｋｉｔｈｌＴｈｙ１０Ｌｉｎ−Ｓｃａ‐１＋細胞を、致死性の遺伝性チロシン血症マウスの血流に注入した。このわずか５０個の細胞により造血系が回復したばかりでなく、さらに驚いたことには、チロシン血症関連間疾患も治癒したと考えられる。
【非特許文献２】Ｌａｇａｓｓｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０００；６：１２２９‐１２３４
【００１０】
Ｋｏｃｈｅｒら（非特許文献３）は、ヒト骨髄由来のＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞を精製し、さらに、実験的梗塞を施行してから４８時間後のＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスに対し、これらの細胞を血流に注入した。一部の細胞（またはその細胞の子孫）が内皮細胞に分化転換して、さらなる血管新生および心筋の血管再生に寄与し、心筋機能の著明な改善も認められた。
【非特許文献３】Ｋｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ‐ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１；７：４３０‐４３３
【００１１】
おそらく最も重要と考えられる試験において、Ｏｒｌｉｃら（非特許文献４）は、遺伝子導入雄マウスの骨髄由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−ｃ‐ｋｉｔｈｌ）を精製し、さらに実験的に心筋に損傷を与えた雌マウスにこの造血幹細胞を直接注入して、未熟な心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞のマーカーおよび形態を呈する細胞を生じさせた（非特許文献４）。造血幹細胞を注入された心臓は機能が３５％改善し、損傷を受けた心筋領域への血管新生が認められた。
【非特許文献４】Ｏｒｌｉｃ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１０：７０１‐７０４
【００１２】
このように、損傷を受けた心臓への骨髄幹細胞注入は、新たな治療法となり得る。この実験的試験がきっかけとなって、心臓発作後の患者の損傷を受けた心臓に対し、これらの細胞を直接注入したときの効果について検討する多くの臨床試験が開始された。しかし、マウスにおける２件の試験（非特許文献５および非特許文献６）および２件の注解（非特許文献７および非特許文献８）は、Ｏｒｌｉｃらが提唱した骨髄細胞の筋細胞および冠動脈への分化能について異議を唱えており、Ｏｒｌｉｃらの研究の知見は人為的結果の寄せ集めだと主張した。さらに、骨髄細胞は、常在細胞と融合することによってのみ、血液系統とは異なる細胞表現型を獲得するとの主張もなされた（非特許文献９および非特許文献１０）。これらの報告は、骨髄由来の幹細胞を使用して心臓を再生することの実現可能性に関する重大な懸念を呼び起こすと考えられる。Ｂａｌｓａｍらは、「さらなる非臨床実験データがなければ、あらゆる臨床試験は時期尚早と言える。特に重要なことは、現に病人が危険にさらされていることだ！」と、極めて深刻な結論も出している（非特許文献６）。
【非特許文献５】Ｍｕｒｒｙ Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｏ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６６４‐６６８
【非特許文献６】Ｂａｌｓａｍ Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｄｏｐｔ ｍａｔｕｒｅ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｆａｔｅｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６６８‐６７３
【非特許文献７】Ｃｈｉｅｎ ＫＲ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：訳漏れ。Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８：６０７‐６０８
【非特許文献８】著者名なし。幹細胞に関する統一見解なし。Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４２８‐５８７
【非特許文献９】Ｔｅｒａｄａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ａｄｏｐｔ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１６：５４２‐５４５
【非特許文献１０】Ｙｉｎｇ Ｑ．Ｌ．ｅｔ ａｌ。Ｃｈａｎｇｉｎｇ ｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２；４１６：５４５‐５４８
【００１３】
それでもＯｒｌｉｃと同じグループのＫａｊｓｔｕｒａらは、２００５年初頭に発表した論文において、この攻撃に反論した（非特許文献１１）。Ｋａｊｓｔｕｒａらは、遺伝子導入雄マウスから得たｃ‐ｋｉｔ＋骨髄細胞を、心臓を梗塞させた雌のレシピエントに移植した。ｃ‐ｋｉｔ＋細胞の子孫のマーカーとしてＧＦＰおよびＹ染色体を用いて、このグループは、移植細胞が、細胞融合とは関係なく効率的に、また生化学的かつ形態学的に４５０万個の筋細胞および冠動脈へ分化することを証明した。
【非特許文献１１】Ｋａｊｓｔｕｒａ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００５；９６：１２７‐１３７
【００１４】
このように骨髄幹細胞の分化転換をめぐる活発な論議は終わることなく、現在進行中の臨床試験によっても説得力のある裏付けはなされていない。
【００１５】
２００２年以降、ＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）を用いた臨床試験が増加し続け、これらの細胞を心臓発作後の損傷を受けた心臓または梗塞関連動脈に直接注入することの効果についての検討が始まった。これらの臨床試験の大半は非ランダム化パイロット試験（非特許文献１２および非特許文献１３）であり、多くは現時点で完了しているが、依然として進行中の臨床試験もいくつかある。１件（非特許文献１４）を除いて、示されたすべての実現可能性および安全性は、程度の差はあるものの、心機能の回復を強調している。
【非特許文献１２】Ｓｔｒａｕｅｒ Ｂ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０６：１９１３‐１９１８
【非特許文献１３】Ｐｅｒｉｎ Ｅ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ ６ ａｎｄ １２ ｍｏｎｔｈｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０（ｓｕｐｐｌ １）：II２１３‐II２１８
【非特許文献１４】Ｋｕｅｔｈｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｂｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉｎｔｒａ‐ｃｏｒｏｎａｒｙ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉａｌ ２００４；９７：１２３‐１２７
【００１６】
最近、いくつかのランダム化試験が報告され、矛盾する結果が示された（非特許文献１５および非特許文献１６）。例えば、あるランダム化オープン試験結果では、ＢＭ由来幹細胞移植後、左室の収縮機能は改善したが、左室のリモデリングは改善しなかったことが示された（非特許文献１７）。さらに、対照群は通常、細胞を移植された群の状態を正確に再現していなかった（非特許文献１８および非特許文献１７）。骨髄穿刺およびプラセボ冠動脈内注入を含めて、移植群を完全に再現する唯一の試験が、ごく最近発表された（非特許文献１６）。この周到に実施された二重盲検プラセボ対照試験では、梗塞期間中に自己ＢＭ由来細胞注入が実施され、本法の実現可能性および安全性が確認された。さらに、虚血、梗塞、および不整脈の増加は認められなかった。ＢＭＳＣ移植により、心筋梗塞の規模が著明に減少し、局所収縮機能の回復状況がより良好であった。しかし、心筋の潅流および代謝の増加については、全体として両群に差は認められなかった。しかし、Ｊａｎｓｓｅｎらが本試験に組入れた低リスク患者のうち右冠動脈に梗塞を有していたのは３８％で、平均ＬＶＥＦは約５５％であった。このように、低リスク患者の左室機能はおそらく十分に維持されなかったため、ＢＭＳＣ注入による著明な機能改善は期待できなかったと考えられる。Ｊａｎｓｓｅｎらは、この概念を裏付けるさらなるデータを提示した。すなわち、各群最大梗塞９例に限定したときの代謝活性は、対照群と比較して、治療群において実質的に増加した。同様に、対照群と比較して、治療群では壁運動指数改善の可能性が増加したのは、そのセグメントの壁内運動が７５％を越えたときであった。
【非特許文献１５】Ｓｃｈａｃｈｉｎｇｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌ ｏｎｅ‐ｅａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＰＣＡＲＥ‐ＡＭＩ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００４；４４：１６９０‐１６９９
【非特許文献１６】Ｊａｎｓｓｅｎｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＳＴ‐ｓｅｇｍｅｎｔ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｉｎｄ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００６；３６７：１１３‐１２１
【非特許文献１７】Ｗｏｌｌｅｒｔ Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ＢＯＯＳＴ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６４：１４１‐１４８
【非特許文献１８】Ｓｃｈａｃｈｉｎｇｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｆｉｎａｌ ｏｎｅ−ｙｅａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＰＣＡＲＥ‐ＡＭＩ ｔｒｉａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００４；４４：１６９０‐１６９９
【００１７】
事実、報告されたほとんどの試験では、これまでに組入れられた患者は死亡およびうっ血性心不全発症のリスクが比較的低く、これは高リスク患者のみを組入れることにより慎重になり、恐らくより重大視していたと考えられる（非特許文献１９）。
【非特許文献１９】Ｐｅｎｎ Ｍ．Ｓ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｆｏｃｕｓ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｏｎ ｔｈｏｓｅ ａｔ ｒｉｓｋ．Ｌａｎｃｅｔ ２００６；３６７：２７‐８８
【００１８】
結局、心機能改善において再注入された細胞が果たすと考えられる役割の正確な評価は、様々な理由から、これらのパイロット試験またはランダム化試験からは得られないと考えられる。その理由とは、
【００１９】
―心筋生検および／または倫理的に承認された生物学的マーカーがなくてはヒトにおいて心筋再生を証明することは困難である。
【００２０】
―全試験において、バイパス手術または梗塞関連動脈再透過のいずれかによって梗塞部位が再灌流されたため、全体的に認められた新血管新生が再灌流と関連しているのか否か、あるいは実際には細胞関連の新血管新生機序と関連しているのか否か、確認することは困難である。
【００２１】
―採取されるＢＭ‐ＭＮＣｓは、実際には様々なタイプのＡＳＣ（「真」のＨＳＣｓ、間葉幹細胞、他の間質細胞等）を含む細胞の「スープ」である。そのため、どのタイプの細胞が実際に心筋再生および血管再生の可能性を秘めているのか判断するのは困難である。
【００２２】
―さらに、ほとんどの試験で認められた駆出率の改善が、ＢＭ‐ＭＮＣｓの送達に用いられた手技によるものか、あるいはＢＭ‐ＭＮＣｓそのものによるものかについて疑問が生じた。実際、細胞の再注入により心筋内に幹細胞の帰巣シグナルがさらに発現し、結果的に一時的な治癒反応を起こすことができた。
【００２３】
上述の見解に関して、様々な幹細胞の「るつぼ」を再注入するのではなく、選択した幹細胞を使用するほうが好ましい。そのほうが、あるとすればどのタイプの細胞に心臓を改善させる見込みが実際にあるのか、より優れた判断を下せる。
【００２４】
さらに、ＢＭ由来のＣＤ３４＋細胞ではなく、動員後のＣＤ３４＋細胞を採血することにはいくつかの利点がある。
【００２５】
白血球搬出産物にはより多くのＣＤ３４＋細胞が含まれ、結果的に正の選択が容易になり、生産性が高まる。
【００２６】
患者の苦痛が大幅に減少し、麻酔が不要になる。
【００２７】
２００３年以降、いくつかの論文により、ヒトＣＤ３４＋細胞が内皮細胞または心筋細胞のいずれかに分化転換する可能性が強く示唆された。ヒト血液由来の内皮前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞と、ラットの心筋細胞を共培養して、Ｂａｄｏｒｆｆら（非特許文献２０）は、これらの細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的に活性の心筋細胞へと分化転換し、α-サルコメアのアクチンおよび心筋トロポニンＩの発現によって同定されることを示した。この分化転換は、細胞融合ではなく、細胞と細胞の接触により媒介された。Ｐｅｓｃｅら（非特許文献２１）は、新たに分離したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を虚血下でマウスの内転筋に注入すると、内皮および（予想外に）骨格筋が生じることを証明した。治療された四肢では、細動脈の長密度および筋線維密度が強調された。われわれが今後何を提示するかについて考えた場合、より重要であるのは、内皮性および筋原性の分化能が、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅後のＣＤ３４＋において維持されたことである。Ｙｅｈらは、最初の試験において、成人のヒトＰＢ ＣＤ３４＋細胞がｉｎ ｖｉｖｏでヒトの心筋細胞、成熟した内皮細胞、および平滑筋細胞に分化転換し得るか否かについて検討した（非特許文献２２）。Ｙｅｈらはまず、ＳＣＩＤマウスにおいて左冠動脈前下行枝を閉塞させることにより心筋梗塞を作成し、次にヒトの成人ＰＢ ＣＤ３４＋細胞を尾静脈に注入した。注入から２ヵ月後、マウスの心臓の梗塞部位および梗塞部位周辺において、心筋細胞およびヒト白血球抗原をもつ内皮細胞が確認された。別の実験で、実験的心筋梗塞のないマウスに対しＣＤ３４＋細胞を脳室内に注入した。ＨＬＡ陽性筋細胞および平滑筋細胞は、殺処分されたこれらのマウスのうち１匹のみで確認された。このように、分化転換は局所組織の損傷に影響されると考えられる。
【非特許文献２０】Ｂａｄｏｒｆｆ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３；１０７：１０２４‐１０３２
【非特許文献２１】Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｙｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｌｉｍｂ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００３；９３：ｅ５１‐ｅ６２
【非特許文献２２】Ｙｅｈ Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ， ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３，１０８：２０７０‐２０７３
【００２８】
しかし、Ｙｅｈらは別の論文において、過去に出された結論について若干補強している（非特許文献２３）。Ｙｅｈらは、同一の実験条件で、ＨＬＡ＋およびトロポニン＋またはＮｋｘ‐２．５＋心筋細胞由来の核の７３％がヒトおよびマウスのＸ染色体を両方とも含み、ヒトＸ染色体のみを含んでいる核は２４％であることを効率的に確認した。これに対し、ＨＬＡ-、トロンポニンＴ＋細胞は、マウスＸ染色体のみを含む。さらに、ＣＤ３４＋細胞由来の内皮細胞の９４％はヒトＸ染色体のみを含む。このように、著者らは現在、細胞融合と分化転換のどちらも末梢血ＣＤ３４＋細胞の心筋細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ形質転換の原因であると結論付けている。
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｏｔｈ Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４‐ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０：３８０３‐３８０７
【００２９】
もちろん、これらの結論は、本当の意味で幹細胞の柔軟性に関する論議を明らかにしているわけではない。
【００３０】
別の選択肢として、骨髄中にすでに存在していると考えられる未熟な内皮前駆細胞および筋前駆細胞がある。器質性のストレスの場合、これらの前駆細胞は循環血に動員され、損傷を受けた臓器、例えば心筋梗塞部位に戻る。
【００３１】
Ａｓａｈａｒａらは１９９７年、健康な志願者の循環血にＭＮＣｓが存在することを初めて示した。ＭＮＣはｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞様の表現型を獲得し、ｉｎ ｖｉｖｏで毛細血管に組み込むことができる（非特許文献２４）。このような細胞はＣＤ３４と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＲ‐２）の両方とも発現し、胚内皮前駆細胞とＨＳＣとが共有する。次にＡｓａｈａｒａは、このＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ‐２＋細胞が早期の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）であるとの仮説を立てたが、動物実験の条件ではあるが、Ｆｌａｍｍｅらが、ＣＤ３４とＶＥＧＦＲ‐２の両方が成熟した内皮細胞上にも発現されたことをすでに示していた（非特許文献２４）。最近、Ｐｅｉｃｈｅｖらが卓越した試験において、動員されたＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞の平均２％がＶＥＧＦＲ‐２であったことと、これらＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞の大半が造血幹細胞マーカーＡＣ１３３も発現することを証明した。このＡＣ１３３は未熟な造血細胞にも存在するが、成熟した内皮細胞や分化した造血細胞には存在しない（非特許文献２５）。このように、ＣＤ３４＋細胞上のＶＥＧＦＲ‐２とＡＣ１３３の共発現により、表現型的に独特なＥＰＣが同定されている。さらに、実質的にすべてのＣＤ３４＋／ＶＥＧＦＲ‐２細胞がケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を発現し、間質細胞由来因子‐１（ＳＤＦ‐１）またはＶＥＧＦに反応して遊走する。ｉｎ ｖｉｖｏヒトモデルを用いてＰｅｉｃｈｅｖらは、左心補助人工心臓の表面上に形成された新生内膜が、ＡＣ１３３＋／ＶＥＧＦＲ‐２＋細胞と一緒に定着していることも確認した。このように、これら全てのデータが、ＶＥＧＦＲ‐２＋およびＡＣＣ１３３を発現する循環ＣＤ３４＋細胞が、新血管新生（血管芽細胞様細胞）に寄与すると考えられる、表現型的にも機能的にも異なる循環内皮前駆細胞群を構成していることを強く示唆している。
【非特許文献２４】Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７５：９６４‐９６７
【非特許文献２５】Ｐｅｉｃｈｅｖ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦＲ‐２ ａｎｄ ＡＣ１３３ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｃｕｒｓｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ ２０００；９５：９５２‐９５８
【００３２】
同じ方針で進めて、本発明の発明者は、癌患者において、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後の白血球搬出産物（ＬＫＰ）にＶＥＧＦＲ‐２とＡＣ１３３の両方を発現するＣＤ３４＋細胞の存在（平均０．６％、０．２１〜１．１６の範囲）を確認した（下の表１および図１参照）。
【００３３】
他のＰＢ‐ＣＤ３４＋細胞のサブセットも筋および／または心筋マーカーを共発現する可能性はこれまでのところ示唆されていないため、依然として仮説のままである。例えば、本発明の発明者が、臍帯血またはＰＢ‐ＣＤ３４＋が心筋細胞に分化転換し得るか否かを検討した時点では（上記参照）、Ｐｅｓｃｅ（非特許文献２６）もＹｅｈ（非特許文献２２）も、再注入した全ＣＤ３４＋細胞内に、すでに分化した心筋細胞前駆体が実際にあらかじめ存在しているか否か、念のため検証することはなかった。このような事態は彼らの分化転換仮説には不都合である。ＥＰＣｓ評価に使用した同じＬＫＰｓ産物を周到にスクリーニングしたところ、動員された少量のＣＤ３４＋細胞が、Ｄｅｓｍｉｎ（筋マーカー）（平均で細胞の０．３９％、０．０１〜１．１６％の範囲）またはトロポニン‐Ｔ（心筋マーカー）（２ＬＫＰｓにおいて、それぞれ０．１７％および０．６９％）のいずれかを共発現することが最近示された（下の表２および図２Ａ・図２Ｂ参照）。
【非特許文献２６】Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｙｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｌｉｍｂ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００３；９３：ｅ５１‐ｅ６２）
【００３４】
しかし、この２つのマーカーの細胞内発現により、二重標識用フローサイトメトリーが適用できなくなるため、両マーカーが同一ＣＤ３４＋細胞によって共発現されるのか否かは確認できなかった。
【００３５】
さらに、同一ＬＫＰをＲＴ−ＰＣＲにかけたところ、ｅＮＯＳおよびＫＤＲ（内皮遺伝子）とＮｋｘ２‐５およびトロンポニン‐Ｔ（心筋細胞遺伝子）のいずれについても、毎回メッセンジャーＲＮＡが検出されたことから、早期に分化した心筋細胞前駆体が血中に動員されていることが確認された（表３参照）。
【００３６】
このように、これらすべてのデータに基づけば、現在では、Ｇ‐ＣＳＦにより血中へ動員された全ＰＢ‐ＣＤ３４＋は、多くの「真」のＨＳＣsのほかに、内皮前駆細胞および成熟した内皮細胞、または筋／心筋前駆細胞のいずれかとして認識されている少量のサブセットも含むことを合理的に結論付けることができる。どちらのサブセットも、当然のことながら、さらなる心筋再生のために重要な役割を果たすと考えられる。
【００３７】
ＢＭ単核細胞の代わりに末梢血幹細胞を用いた（心筋）細胞移植の臨床的評価はもっと少ない。
【００３８】
本発明の発明者は、この異なるアプローチについて初めて実験を行い、２００３年７月に開催された国際実験血液学会（Ｈｅｎｏｎ Ｐｈ．Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｒｉｆｉｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．２００３年７月５〜８日にフランス・パリで開催された第３２回国際実験血液学会での個人発表）および２００３年１２月に開催された米国血液学会（非特許文献２７）で初めて予備的データを発表した。
【非特許文献２７】Ｈｅｎｏｎ Ｐｈ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ ｒｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ Ｇ‐ＣＳＦ ｃａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：１１，１２０８ａ
【００３９】
他の２グループが、やはりＧ‐ＣＳＦにより動員されたＰＢＳＣ（変異体であるが）を用いて、さらに同様のアプローチを策定した。Ｐｏｍｐｉｌｉｏらのグループは、Ｓｔａｍｍ（非特許文献２８）がＢＭ細胞で実施したように、積極的にＣＤ１３３亜集団を選択してその増殖能の高さと血管性分化を利用することを提案した。サイトカイン投与またはアフェレーシス法のいずれによっても有害作用は認められなかった。しかし、再灌流に改善が認められた場合は、左室の収縮性については著明な改善が得られなかった（非特許文献２９）。Ｋａｎｇらは、冠動脈ステント術を施行された心筋梗塞患者２７人を無作為に３群に分け、前向きに試験を行った。Ｇ‐ＣＳＦにより動員されたＰＢ細胞を冠動脈内へ再注入した群を第１群、Ｇ‐ＣＳＦのみを投与した群を第２群、対照群（ステント術のみを施行）を第３群とした（非特許文献３０）。運動能力、心筋潅流、および収縮機能は、細胞注入を受けた患者において著明に改善した。しかし、新生内膜過形成と関連して、Ｇ‐ＣＳＦの投与を受けた患者（第１群および第２群）において責任病変のステント内再狭窄率が予想外に高かった。この後期有害作用は、Ｇ‐ＣＳＦ投与によって、多くの好中球、単核細胞、および血小板を含有する非選択性の血球産物の再注入と、冠動脈内ステント術と、露出した金属ステントによる新生内膜増殖の加速とが組み合わさった結果と考えられる。このような組み合わせを回避することは恐らく可能であるが、動員目的でＧ‐ＣＳＦの投与のみを実施し、ステント術は施行しないという可能性は低い。
【非特許文献２８】Ｓｔａｍｍ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ ２００３；３６１：４５‐４６
【非特許文献２９】Ｐｏｍｐｉｌｌｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２００４；７８：１８１２‐１８１３
【非特許文献３０】Ｋａｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｔｒａ−ｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｏ ｂｌｏｏｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ‐ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｓｔｅｎｔｉｎｇ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ＭＡＧＩＣ ｃｅｌｌ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：７５１‐７５６
【００４０】
本発明は、先行技術の欠点を克服し、簡潔かつ効率的で、信頼のおける解決策を中程度のコストで提供し、革新的な心筋細胞移植プロセスの実施により慢性心不全の治療を可能にしようとするものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４１】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および本発明の血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスを特徴とし、以下の段階を実行する。
【００４２】
第１段階では、梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによるＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する、
【００４３】
第２段階は細胞採取の段階で、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後に実施する、
【００４４】
第３段階は細胞処理の段階で、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる、
【００４５】
第４段階は再懸濁の段階で、増幅された細胞産物を最終的な所定量の自己血漿中に入れる、
【００４６】
第５段階は包装の段階で、患者に再注入するため減菌シリンジに細胞懸濁液を入れる。
【００４７】
上記発明のプロセスを利用する好適な方法によれば、Ｇ‐ＣＳＦ投与は、ＡＭＩ後少なくとも３〜５日間中に実施する。
【００４８】
細胞の採取段階は、好ましくはＧ‐ＣＳＦによる動員から少なくとも６日目に実施する。
【００４９】
細胞の採取段階は、好ましくは全血の採血により実施し、最終的な総量は少なくとも２００ ｍｌとする。
【００５０】
細胞の採取段階は、好ましくは約１２時間以内に、数回連続する静脈穿刺により実行する。
【００５１】
細胞の採取段階は、好ましくは少なくとも３〜４回連続する静脈穿刺により実行する。
【００５２】
第３段階のＣＤ３４＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増幅は、好ましくは２週間のあいだに実施する。
【００５３】
再懸濁段階は、好ましくは血漿の最終的な所定量を５〜１５ ｍｌ、好ましくは１０ ｍｌとして実施する。
【００５４】
第５段階の再注入は、好ましくは包装から５〜１８時間以内、有利には約１２時間後に実施する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
予備的データを臨床的に構築するため、Ｇ‐ＣＳＦによる動員の実現可能性、安全性、および心機能への影響、自己血ＣＤ３４＋細胞の採取、選択、および心臓内再注入を評価するための第Ｉ相臨床試験を開始した。
【００５６】
以下の基準に従って、患者１０名を計画に入れた。２週間を超える壁内ＡＭＩ、同位体的左室駆出率（ＬＶＥＦ）≦３５％、左室壁において梗塞部位と一致する明確なアキネジア部位、冠状動脈バイパス手術（ＣＡＢＧ）候補者、年齢が７０歳未満、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類クラスＩＶの運動能力。
【００５７】
患者について、試験への組入れ前と左心カテーテル術後６ヵ月目に評価し、１８Ｆｌ‐ＦＤＧおよび２０１Ｔｉ‐Ｃｈｌｏｒｉｄｅの連続静注後の三次元心エコー検査、２０１タリウムシンチグラフィ、および陽電子放射断層法（ＰＥＴＳｃａｎ）により心筋の生存能と潅流の両方を評価した。
【００５８】
患者から同意文書を取得後、ＣＡＢＧ施行７日前に、Ｇ‐ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標）、Ｃｈｕｇａｉ Ｆｒａｎｃｅ提供）５ μｇ、１日２回、５日間連続皮下注射によりＣＤ３４＋細胞の動員を開始した。６日目の早朝に、ＣＤ３４をモニタリングするフローサイトメトリー（ＦＣＭ）用に採血を行った。モニタリングの結果が出たら直ちにＦｒｅｓｅｎｉｕｓ ＡＳ１０４ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒによりアフェレーシスを開始した。目標は、より満足できる細胞選択のために推奨される、少なくとも１００ｘ１０６個の細胞を採取することとした。アフェレーシス産物の内容物をＦＣＭにより速やかに評価し、期待通りにＣＤ３４＋を採取したことを確認した。ＣＤ３４＋の採取が期待通りでなかったときは、７日目の早朝に２回目のアフェレーシスを実施した。いずれにしても、６日目の細胞産物を含む袋は、ＣＤ３４＋選択まで４℃で保管した。患者は動員／採取の期間中、心臓病向け集中治療室に入院したままとし、このような特定カテゴリーの患者に起こりうる、いかなる予想外の副作用も速やかに矯正した。
【００５９】
ＣＤ３４選択に関して、全アフェレーシス産物とフェライトビーズに抱合された抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）とを混ぜてインキュベートし、臨床用Ｉｓｏｌｅｘ ３００ｉ磁気細胞分離装置（Ｂａｘｔｅｒ、フランス）にかけた。次いでビーズからＣＤ３４＋細胞を遊離させ、自己血漿中で再懸濁し、グラフトの最終量を１５〜２０ ｍｌとした。さらに５ ｍｌの試料を用いて、血管形成能を高めるためＡＣ１３３およびＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ）ＭｏＡｂｓで標識したときに認識される細胞または横紋筋中のＤｅｓｍｉｎと反応するＤ３３ ＭｏＡｂで標識した細胞、そしてトロポニンＴと反応する１Ｃ１１ ＭｏＡｂで標識した細胞のＣＭＦを定量化した（表４）。
【００６０】
図３で臨床プロトコルを要約し、実施例を用いて、動員され精製されたＣＤ３４＋細胞による虚血性心臓の修復プロセスに関連する本発明のプロセスの好適なプロトコルを模式図で示す。
【００６１】
図３によれば、第１ステップは５日間のサイトカイン投与に関する。第２ステップは、６日目に実施される、動員された血液幹細胞の採取に関する。第３ステップは、ＣＤ３４＋選択に関する。第４ステップは、７日目の、精製されたＣＤ３４＋細胞の獲得に関する。第５ステップは、ＣＤ３４＋サブセット（ＣＤ１３３＋；ＫＤＲ＋；心筋細胞）の内容物の評価と、手術を回避する患者の虚血領域への注入に関する。
【００６２】
本試験が承認されると、連続患者５人を本試験に組入れた。最初の３人は、現在、重大な３年間の追跡調査から利益を得ている。
【００６３】
この３人のデータは表６で詳述する。１人目の患者は、比較的若い（３９歳）ことから、同情的な理由で組入れたが、ＡＭＩの経験が８年前だったため、どちらかといえば陰性対照とみなした。２人目の患者は最も重症で、トリートロンキュラー閉塞が認められた。この閉塞は、手術および細胞再注入の６週間前に発症していた。予後不良のため、この患者についてはさらなる心臓移植を検討する必要があった。３人目の患者は、当初はそれほど重症ではなかったが、ＡＭＩ後３ヵ月目には、いずれ生命を脅かす深部うっ血性心不全へと徐々に進行した。
患者データ
【００６４】
術前および術後の期間中、３人の患者全員が細胞の動員および採取法に対し忍容性が高く、一過性の軽度の血小板減少症以外はいかなる副作用も認められなかった。患者２では、１回のアフェレーシスで十分な数のＣＤ３４＋細胞が得られ、他の２人ではアフェレーシスは２回必要であった。いずれの場合も、ＣＤ３４＋細胞懸濁液の純度および生存能は、どちらかと言えば良好であった。細胞グラフトを確実に入手したら直ちにＣＡＢＧを開始し、心臓の拍動時に実施した。すべての虚血部位から細胞懸濁液を注入し、１．５〜２ ｍｌずつ、縦方向および水平方向に８〜１０回注入した。操作はすぐに完了した。直ちに患者を中間治療室に移送し、最終的には退院して、通常通り、６〜８日後にリハビリテーションプログラムを行った。ＣＡＢＧ後、最大３年まで上室性不整脈は誰にも認められなかった。患者２は急激に重大な心嚢液貯留を発症したが、これは拍動している心臓の手術後にはさほどめずらしくはなく、後遺症を残さず容易に治療された。
【００６５】
以下の結果に関して、６ヵ月目および３年目に術後臨床評価を実施した。
【００６６】
６ヵ月目：
【００６７】
患者１は運動能が若干増加していて、その理由がＣＡＢＧのみであることは確かである。しかし、８年間梗塞状態であった領域は、細胞の再注入時には完全に石灰化していたため、心機能は実際には何も改善しなかったと考えられる。さらに、他の患者と比較して患者１が受けたＣＤ３４＋細胞およびサブセットの量は最も少なく、他の２人の患者に再注入されたＣＤ３４＋細胞およびＣＤ１３３＋のサブセットは、それぞれ１．５倍および２倍であった。患者２の細胞グラフトは、最高量のＣＤ１１３＋ＫＤＲ＋およびＤｅｓｍｉｎ＋細胞も含んでいた。６ヵ月目のＰＥＴスキャン画像によれば、左前壁の収縮性、ＬＶＥＦ指数、および運動能力と相関して、以前は動かず、非手術的に再灌流させた虚血部位（図４）の生存能および灌流に目覚しい改善が認められなかった（図４）。程度は異なるが、患者３もこれらのパラメータのほとんどが驚くほど改善された。
【００６８】
３年目：
【００６９】
患者１の心機能は、その後さほど改善しなかった。左室腔は発症時と比較してさらに拡大しているくらいである（ＬＶＥＤＤ＝８４ ｍｌ）。測定回数によって、ＬＶＥＦは３６〜４６％のままである。これと関連して、前壁のほぼ前面、中隔‐心尖部、および心尖部が完全にアキネジアとなっている。ＣＡＢＧにより、側壁の動きのみ改善された。
【００７０】
反対に、患者２および患者３の心機能パラメータはさらに改善していた：
【００７１】
患者２では、測定回数によらず、ＬＶＥＤＤが５５ ｍｌに減少し、ＬＶＥＦは現在５３％（初期ベースラインより＋２３％）である。前壁および前壁‐中隔接合部の収縮性は極めて良好であり、心尖部の動きも現在著明に改善している。患者は今では呼吸困難を起こさずに少なくとも２ｋｍを早足で歩くことができるようになり、農場で一所懸命働いている。
【００７２】
患者３でも左室機能が極めてよく改善し、ＬＶＥＦ６４％（＋３１％、ほぼ正常）、ＬＶＥＤＤ３１ ｍｌ、前壁‐心尖の接合部を３分したときの中央部と基部ならびに中隔の正常な動き、そして、前壁の軽度の運動不能が示された。尖端のみが完全にアキネジアのままである。この患者は普通に生活をしている。
【００７３】
したがって、これらの予備的データによれば、Ｇ‐ＣＳＦ投与、アフェレーシス法、および他著者らが提案したより大量の細胞懸濁液の心臓内再注入は実現可能であり、極めて重度のＡＭＩ患者において忍容性が高い。このことは最近組み入れられた新たな患者において確認された。「精製された」ＣＤ３４細胞は、血管新生または横膜筋再生のいずれかを促進し得る、すでに分化した細胞を様々な割合で含む。このように、再灌流されない、アキネジア状態の梗塞部位にこのような細胞を再注入すると、生存能、潅流、および収縮性の面で長期間、著明に改善される。このような改善がこれらの細胞由来であるか否かは不明であり、さらなる患者を用いてこれを確認する必要がある。しかし、このような梗塞部位の改善は、厳密には外科的再灌流のないＣＡＢＧ後にはまれである。ＡＭＩから細胞移植までの時間を短縮することと、大量の再注入細胞のサブセットは、恐らく心筋再生を成功させるのに必要不可欠である。
【００７４】
この極めて有望な第Ｉ相試験後、本発明によるより大規模なアプローチに着手する。
【００７５】
近い将来、心筋細胞移植が臨床現場で実施される機会が増加するとの見通しに対し、広範に対応するには、現行の細胞処理をいくつか改善する必要がある。より具体的には、この方法において白血球搬出法は、少なくとも以下の理由により、制限的要因であることは間違いない。
【００７６】
ａ）ＡＭＩ後、細胞の再注入が早いほど臨床結果はより良好になる。本プロトコルにより、ＡＭＩ後６〜１２週目にアフェレーシス法を実施したときの臨床的忍容性が高いことが示されているとしても、わずか８〜１０日前にＡＭＩを発症した患者には当てはまらない。
【００７７】
ｂ）一連のアフェレーシスを実施するには、承認と、十分な設備と、十分訓練されたチームとが必要である。現在このような要件を満たす医療施設はごくわずかであり、大半は現行の診療（血液学的目的でのＨＳＣ採取）ですでに負担がかかり過ぎている。１回のアフェレーシスに約３時間かかるため、回数を増やすことで新しい要望に対し、広範に、そして満足のいく対応をすることは困難である。
【００７８】
ｃ）別の制限的要因として冠動脈バイパス手術が示されている。現行の第Ｉ相試験においてこのような手術時に幹細胞を再注入しようとするのは、倫理上の理由による場合のみである。もちろん、心筋細胞移植を血管形成術および／またはステント術のように心臓療法の「通常」の技術として提案するためには、ＣＡＢＧを回避し、細胞の再注入のために低侵襲性の方法を用いることが不可欠である。
【００７９】
このように、細胞増殖プロセスを用いた新しいアプローチを実現し、比較的少量の血液試料から十分量のＣＤ３４＋細胞を得て、次いで白血球搬出を回避する必要がある。
【００８０】
最終的な目標を、ＡＭＩ後の虚血部位の生存能、再灌流、収縮性、その結果として患者の生活の質および生存率を引き続き改善することと規定したところ、２つの主な目的と、関連する複数の目的が確認された。
【００８１】
ａ）細胞増幅法を策定し、白血球搬出と同程度に多くの細胞を得られるようにして、この比較的侵襲的な手技を回避する。
【００８２】
ｂ）完全な心筋細胞移植法のコストを最低レベル、すなわち血管形成術および／またはステント術の平均コストと同程度に維持する。
【００８３】
さらには、
【００８４】
今後５〜６年間で、重度の心不全全体の約５％を治療することを意図するものである。
【００８５】
ｂ）長期の追跡調査に基づき、薬剤、検査、および罹患率低下の面で、心筋細胞移植による節減の可能性について評価し、正当化する。
【００８６】
ｃ）冠動脈バイパス手術を回避し、代わりに直接心室細胞再注入を導入する。
【００８７】
本発明は、簡潔かつ効率的で、信頼のおける解決策を中程度のコストで提供し、心筋細胞移植プロセスの実施により慢性心不全を治療しようとするものである。
【００８８】
したがって、本発明による方法は、上述の現行の第Ｉ相試験の通り、ＡＭＩ後のＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性と、Ｇ‐ＣＳＦによる動員後の骨髄中ではなく、血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取とに基づく。この試験からの重要な修正点が４つある。
【００８９】
ａ）梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによるＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する。Ｇ‐ＣＳＦは、ＡＭＩ後３〜５日間に投与すべきことは明白である。
【００９０】
ｂ）細胞は、Ｇ‐ＣＳＦによる動員から６日目に、１２時間以内に３〜４回連続する静脈穿刺によって、最終的な総量２００ ｍｌの全血を採血して採取する。
【００９１】
ｃ）採決後、血液試料を集めて、同意している細胞処理検査室へ速やかに発送し、ｅｘ‐ ｖｉｖｏＣＤ３４＋細胞選択について調べてもらう。２週間以内に増幅させて、ＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる。
【００９２】
ｄ）増幅された細胞産物を最終量１０ ｍｌの自己血漿中で再懸濁し、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を包装して患者を担当する循環器センターへ発送し、包装後１２時間以内に再注入する。
【００９３】
全構想を図５に要約する。以下に手順を示す。
【００９４】
まず、５日間のＧＣＳＦ‐によるＣＤ３４＋細胞の動員で開始する。
【００９５】
動員から６日目に採血ステップ（総量２００ ｍｌ）を実施し、処理検査室へ発送する。
【００９６】
１５日間のＣＤ３４＋処理：バイオリアクターを用いて初回選択、増幅、および２回目の選択を行う。
【００９７】
グラフトを包装（１０ ｍｌ量）し、循環器センターへ発送する。
【００９８】
患者に対し細胞を再注入する。
【００９９】
この新たなアプローチは、現行の評価法と比較して大きな利点がある。その利点とは、
【０１００】
採血は痛みを伴わず、患者にとってストレスがない。全体として、ＡＭＩ直後に実施すると不快な副作用が発現する恐れのある白血球搬出を実施しなくて済む。さらに、看護師によりどこででも容易に実施することができる。
【０１０１】
白血球搬出法と比較して、採血のコストは極めて廉価であり、もう一つの細胞増幅処理による過剰コストとで均衡をとることができる。
【０１０２】
Ｇ‐ＣＳＦ投与から最終細胞産物までの全プロセスのスケジュールにより、ＡＭＩ後２４日目〜２６日目（図５）に心筋へ細胞を再注入できるようになる。この時点では、梗塞後の虚血性組織は依然として炎症性であり、心筋細胞内への拡散に都合がよい。反対に、明らかに瘢痕が形成されると、線維化組織の構造が細胞の拡散および心筋内への帰巣を妨げる（本試験に組入れた最初の患者に関するデータ参照）。このように、心筋を修復する際に再注入された細胞の効率は、本法の早成性により増大する。
【０１０３】
ＢＭ、ＰＢＳＣ、またはＣＢより生じた細胞を用いたｅｘ ｖｉｖｏ ＣＤ３４＋細胞の増幅に関する極めて効率的な方法は、数年前に完成している。これは非常に未熟な幹細胞の大部分を増幅させることができる、これまでに発表された唯一の方法と考えられる。本法は２０００年に発表された（非特許文献３１）。全世界の特許がこの増幅法を保護している（特許文献１）。
【非特許文献３１】Ｋｏｂａｒｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｍｙｅｌｏｉｄ，Ｂ，ＮＫ ａｎｄ Ｔ
【特許文献１】仏国特許出願公開第００／０１３１１号（２０００年５月１６日）
【０１０４】
このように、本発明による臨床使用のため、この細胞増幅法を下記のとおり定義する：
【０１０５】
手短に言えば、ＣＤ３４＋細胞を免疫選択により精製後、長期無血清培地（ＬＴＣＭ）中で１０４個／ｍｌにて懸濁し、Ｆｌｔ３‐リガンド（ＦＬ，１００ｎｇ／ｍｌ、Ｖａｌｂｉｏｔｅｃｈ社）、幹細胞因子（ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ）、巨核球成長因子（ＭＧＤＦ，１００ｎｇ／ｍｌ），およびＧ‐ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６、およびＩＬ３を補充する。細胞懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で１４日間インキュベートし、その後細胞を採取してアイエムディエム（ＩＭＤＭ、Ｓｅｒｏｍｅｄ‐Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）中で洗浄して、トリパンブルー排除法により計数し、前駆細胞／幹細胞、免疫表現型、およびＮＯＤ‐ＳＣＩＤ腫大について解析した。
【０１０６】
培養法について、Ｊ．Ｂｅｎｄｅｒ（Ｎｅｘｅｌ、ＵＳＡ）提供のガス透過性ポリプロピレンバッグ（１１．２ｃｍx７．５ｃｍ、ＰＬ２４１７）で評価した。製造者の推奨事項に従って、選択した細胞を完全なＬＴＣＭ４ ｍｌに接種し、６日目にサイトカインを含有する新鮮な媒質１６ ｍｌを各バッグに添加する。以前の試験で決定した条件に従って、１４日目にシリンジを用いてこの細胞を除去し、ＩＭＤＭ中で洗浄後、解析を行った。
【０１０７】
細胞増幅は倍数で表す。それは１４日後の細胞、前駆体、およびＬＴＣ‐ＩＣのアウトプットの絶対数を、０日目の各インプット数で除することによって算出する。
【０１０８】
本法により総細胞数および前駆細胞数は高度に増幅する。中央値の範囲は、それぞれ総細胞数が１３０倍、ＣＤ３４＋細胞が１５〜２０倍、ＡＣ１３３＋細胞が２６倍、ＬＴＣ‐ＩＣが約１０倍である（図６）。さらに、増幅された細胞と増幅されていない細胞とでは、ＣＦＣおよびＬＴＣ‐ＩＣの前駆体の質はほぼ同じである。また、細胞の増殖能のマーカーとされているテロメアは平均で１５倍増幅したにもかかわらず、その長さは変化しなかった（図６参照）。
【０１０９】
さらに、増幅されたＣＤ３４＋細胞は、亜致死的に照射されたＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスへの定着能を有するとともに、長期造血および骨髄、Ｂリンパ球、ＮＫリンパ球、ならびにＴリンパ球への多能性分化にも役立つ。
【０１１０】
これら全てのデータが、ｅｘ ｖｉｖｏ増幅ＣＤ３４＋細胞の臨床使用の強力な根拠をなす。
【０１１１】
最終グラフト産物中の予測細胞数：
【０１１２】
Ｇ‐ＣＳＦによる動員後、全血中に平均で３０個／μｌの細胞を予測するのが合理的である。全血２００ ｍｌの採血では、ＣＤ３４＋細胞の総収量は平均で６x１０６と考えられる。
【０１１３】
細胞増幅法によりＣＤ３４＋細胞は１５〜２０倍増加し、それによって計９x１０７〜１．２x１０８の範囲のＣＤ３４＋細胞が得られる。
【０１１４】
本法実施時には、２つの免疫選択ステップが必要となる。１つめは、増幅法の前に全血からＣＤ３４＋細胞を精製するステップ、２つめは増幅法後に生じるステップで、より成熟した増幅細胞の中から増幅したＣＤ３４＋細胞を選択する。この２つの免疫選択によってＣＤ３４＋細胞の約３０％が失われる。したがって、患者に投与されるグラフト産物に含まれるＣＤ３４＋細胞の最終数は、約６x１０７〜８x１０７個の範囲と考えられる。本プロトコルにおいて、平均約４x１０７個のＣＤ３４＋細胞を患者に再注入するとした場合、この予測された量は心筋を再生させるのに十分なはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本発明とその利点は、添付図に関する以下の好適な実施形態の説明によりさらに明白になり、非制限的な実施例を用いて提供される。
【０１１６】
【図１】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるＶＥＧＦＲ‐２（ＫＤＲ）およびＣＤ１３３の発現
【図２Ａ】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるＤｅｓｍｉｎの発現
【図２Ｂ】フローサイトメトリー図。循環ヒトＣＤ３４＋細胞によるトロポニンＴの発現
【図３】第１段階の臨床プロトコルの模式図
【図４】患者のＮo２ＰＥＴＳｃａｎ
【図５】本発明のプロセスの説明図
【図６】ＣＤ３４＋ＰＢＳＣ群のｅｘ ｖｉｖｏ増幅
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスであり、
梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによりＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する第１段階と、
Ｇ-ＣＳＦによる動員後に実施される細胞の採取の段階である第２段階と、
細胞処理の段階であり、ｅｘ‐ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる第３段階と、
最終的な所定量の自己血漿中で増幅された細胞産物を再懸濁する段階である第４段階と、
包装の段階であり、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を患者に再注入する第５段階、
を実行する。
【請求項２】
前記Ｇ‐ＣＳＦ投与が、ＡＭＩ後少なくとも３〜５日間中に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記細胞の採取段階が、Ｇ‐ＣＳＦによる動員から少なくとも６日目に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記細胞の採取段階が、最終的総量２００ ｍｌの全血の採血により実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記細胞の採取段階が、１２時間以内に数回連続する静脈穿刺によって実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記細胞の採取段階が、少なくとも３〜４回連続する静脈穿刺によって実施される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
第３段階の前記ＣＤ３４＋細胞の前記ｉｎ ｖｉｖｏ増幅が２週間のあいだに実施される、請求項１のプロセス。
【請求項８】
前期再懸濁段階が、自己血漿の最終的な所定量を５〜１５ ｍｌ、好ましくは１０ ｍｌとして実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
第５段階の前記再注入が、包装後５〜１８時間以内、好ましくは約１２時間後に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１】
急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の、ＣＤ３４＋細胞の心筋再生能の可能性および血液におけるＣＤ３４＋細胞の採取に基づく心筋細胞移植プロセスであり、
梗塞が安定次第Ｇ‐ＣＳＦによりＣＤ３４＋細胞の動員を開始し、その心臓機能への影響を評価する第１段階と、
Ｇ-ＣＳＦによる動員後に実施される細胞の採取の段階である第２段階と、
細胞処理の段階であり、ｅｘ‐ｖｉｖｏでＣＤ３４＋細胞を選択し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅させてＣＤ３４＋細胞の総数を約２０倍増加させる第３段階と、
最終的な所定量の自己血漿中で増幅された細胞産物を再懸濁する段階である第４段階と、
包装の段階であり、減菌シリンジ中の細胞懸濁液を患者に再注入する第５段階、
を実行する。
【請求項２】
前記Ｇ‐ＣＳＦ投与が、ＡＭＩ後少なくとも３〜５日間中に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記細胞の採取段階が、Ｇ‐ＣＳＦによる動員から少なくとも６日目に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記細胞の採取段階が、最終的総量２００ ｍｌの全血の採血により実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記細胞の採取段階が、１２時間以内に数回連続する静脈穿刺によって実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記細胞の採取段階が、少なくとも３〜４回連続する静脈穿刺によって実施される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項７】
第３段階の前記ＣＤ３４＋細胞の前記ｉｎ ｖｉｖｏ増幅が２週間のあいだに実施される、請求項１のプロセス。
【請求項８】
前期再懸濁段階が、自己血漿の最終的な所定量を５〜１５ ｍｌ、好ましくは１０ ｍｌとして実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
第５段階の前記再注入が、包装後５〜１８時間以内、好ましくは約１２時間後に実施される、請求項１に記載のプロセス。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１２６０８７（Ｐ２００８−１２６０８７Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０２３５５（Ｐ２００７−３０２３５５）
【出願日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０７３８７９１８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５０７３８７９１８）
【Ｆターム（参考）】
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