心血管系疾患を診断及び処置する方法
本発明は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのインビトロ又はインビボ診断の方法であって、ヒトサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド、又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸が測定される方法、並びに心血管系疾患を処置する薬剤の開発及び／又は製造のためにＡＲＫ２の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのインビトロ又はインビボ診断の方法であって、ヒトのサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド、又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定する方法、並びに心血管系疾患を処置する薬剤の開発及び／又は製造のためのＡＲＫ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーロラキナーゼは、多くの固形腫瘍で過剰発現される有糸分裂セリン／トレオニンキナーゼの発癌ファミリーである（Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉ，Ｈ．ら（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２、２８３−２９４）。最初に、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の自然発生型染色体分離欠損突然変異体が同定され、そしてオーロラと命名された（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら（１９９８）、２４４、２８５−２９２）。ヒトオーロラ１キナーゼはまた、ＡＵＲ１、ＡＲＫ２、Ａｌｋ２、ＡＩＭ−１及びＳＴＫ１２としても知られている。本明細書では、用語ＡＲＫ２を使用する。ＡＲＫ２は、有糸分裂において役割を果たすようであり、具体的には、有糸分裂の間に中央体に蓄積している（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら（１９９８）、前出）。ＡＲＫ２欠損細胞はまた、細胞質分裂欠損も示している（Ｄｅｓｃａｍｐｓ及びＰｒｉｇｅｎｔ（２００１）、Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ、１７３、１）。ＡＲＫ２遺伝子は、染色体１７ｐ１３．１に位置している。
【０００３】
ヒト疾患の発症及び進行においてＡＲＫ２が関係する可能性をより良く理解するために、参照番号ＮＭ＿００４２１７として公開されたＡＲＫ２参照配列の９５０位のＣからＴへの変異に関して、遺伝子型−表現型関連分析を、良く特徴付けられた患者群を用いて行った。この変異は、ＡＲＫ２タンパク質の対応する２９８位でのトレオニンからメチオニン（Ｔｈｒ→Ｍｅｔ）へのアミノ酸変化を導いている。ＡＲＫ２遺伝子の異なる遺伝子変異体は、すでにＳＮＰ（一塩基多型）として公知であり、そしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｌｏｃｕｓＩｄ＝９２１２； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｇｅｎｅｓｎｐｖｉｅｗ？ｄｂ＝＆ｇｅｎｅ＝ＥＮＳＧ０００００１７８９９９で公開されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
驚くべきことに、特にヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位でのシトシンからチミジンへの変異、又は対応するＡＲＫ２タンパク質の２９８位でのトレオニンからメチオニンへの変異が、心血管系疾患の発症と関連していることが見出された。
【０００５】
従って本発明の主題は、ヒト又は患者のサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２８９位のアミノ酸を決定する、心血管系疾患のインビトロ又はインビボ診断に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の好ましい実施態様において、心血管系疾患は、高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントである。
【０００７】
特に、９５０位のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡ上でチミジン若しくはｍＲＮＡ上でウラシルであると決定されるか、又は２９８位のアミノ酸がメチオニンであると決定される場合、高血圧及び／又は狭窄のリスクはより高くなる。
【０００８】
本発明において、用語「ＡＲＫ２−Ｃ９５０Ｃ」は、参照配列ＮＭ＿００４２１７のＡＲＫ２をコードする遺伝子の９５０位の両方の対立遺伝子上にシチジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でアミノ酸トレオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してホモ接合である。従って、用語「ＡＲＫ２−Ｃ９５０Ｔ」は、ＡＲＫ２をコードする遺伝子の一方の対立遺伝子上にシチジンを有し（これは、対応するタンパク質の２９８位でトレオニンを導く）、そしてＡＲＫ２をコードする遺伝子の他の対立遺伝子上にチミジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でメチオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してヘテロ接合である。本発明において、用語「ＡＲＫ２−Ｔ９５０Ｔ」は、参照配列ＮＭ＿００４２１７のＡＲＫ２をコードする遺伝子の９５０位の両方の対立遺伝子上にチミジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でアミノ酸メチオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してホモ接合である。
【０００９】
ヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする参照配列の核酸配列は、好ましくは、配列番号１の核酸配列を有し、そしてヒトＡＲＫ２タンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。しかし本発明はまた、この参照配列の９５０位に対応する位置でのシチジンからチミジンへのヌクレオチド変換及び／又はこの参照配列の２９８位に対応する位置でのトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変換が存在するという条件で、そしてさらに、対応するタンパク質が、セリントレオニンキナーゼ活性を有するという条件で、ヒトＡＲＫ２の他の変異体、及びその非ヒトホモログ（例えば、他の哺乳動物ＡＲＫ２ホモログ、又はショウジョウバエ、センチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、マウス若しくはラット由来のＡＲＫ２ホモログ）もまた含むものとする。この酵素活性は、当業者に公知かそして／又は本明細書に記載されるキナーゼアッセイによって決定できる。
【００１０】
一般に、９５０位の特定のヌクレオチドは、核酸シーケンス法、核酸の質量分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法によって測定できる。核酸シーケンス法の例は、ピロシーケンス法及び／又は放射標識性及び／又は蛍光標識性ヌクレオチドの助けをかりたシーケンス法である。ハイブリダイゼーション法の例は、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析及び／又はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション法である。増幅法の例は、ＴａｑＭａｎ分析、差異ＲＮＡ発現分析及び／又は発現量差異分析法である（Ｓｈｉ Ｍ．Ｍ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．、２（３）、１９７−２０５；Ｋｏｚｉａｎ及びＫｉｒｓｃｈｂａｕｍ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７（２）、７３−８）。
【００１１】
さらに、２９８位のアミノ酸配列は、特定のタンパク質の量を測定する方法及び／又は特定のタンパク質の活性を測定する方法によって測定され得る。特定のタンパク質の量を測定する方法の例は、ウエスタンブロット分析及び／又はＥＬＩＳＡである。特定のタンパク質の活性を測定する例は、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞を用いたインビトロ試験アッセイ及び／又はインビトロ全細胞試験アッセイであり、これらはすべて当業者に公知かそして／又は本願に記載されている。
【００１２】
それぞれの変異体を検出するためのサンプルの例は、細胞、組織又は体液、特に血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞である。好ましくはサンプルは、さらなる分析のためにサンプルの核酸又は染色体ＤＮＡ又はタンパク質を単離及び／又は精製するために、当業者に公知の慣用の方法によって前処理される。
【００１３】
任意のさらなる工程において、ヒトが心血管系疾患を患うリスクは、実施例に示されるように決定され得る。
【００１４】
別の任意のさらなる工程において、適切な医薬品が選択されるか、又は医薬品の投薬量が決定される。
【００１５】
一般に、ＡＲＫ２遺伝子において見出された遺伝子の変異は、ヒトのリスク評価、遺伝的特性解析若しくは分類のための、及び／又は心血管系疾患（「冠動脈心疾患」としても知られている）、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントの予防的処置のための、遺伝子マーカーとして、本発明に従って使用され得る。
【００１６】
さらにこの遺伝子の変異は、投薬量を適応させるため、又は一般にヒト若しくは患者（本明細書では以下「個人」ともいう）を処置するために有効な治療剤の有効性を増大させるための、及び／又は臨床試験研究下若しくは臨床試験研究のために選択された心血管系疾患、特に高血圧及び／若しくは狭窄のリスクが増大する個人を同定するための、遺伝子マーカーとして、本発明に従って使用され得る。この遺伝子の変異はまた、特定の個人のための薬学的に活性な物質の許容度、安全性及び有効性を評価するため、又はこの疾患の特定の処置に好適な個人を同定するために、本発明に従って使用され得る。
【００１７】
本発明はまた、処置又は助言されるべき個々の個人のために、この疾患のリスクファクターを同定するために使用できる。
【００１８】
一般に、好適な個人は、（ｉ）心血管系疾患の症状を示していない個人、（ii）心血管系疾患を生じるリスクがすでに検出されているが、この疾患の症状をまだ示していない個人、及び（iii）心血管系疾患を患っていると以前に診断された個人である。
【００１９】
本発明に従った心血管系疾患の好ましい診断方法は、次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者からサンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）サンプルから核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを単離すること；
（ｃ）プライマー、特に実施例で特定されるプライマーを利用して、ＡＲＫ２遺伝子の９５０位を含む特定の領域を増幅すること；
（ｄ）増幅された領域をシーケンスすること；
（ｅ）シーケンスされた領域を分析すること；及び
（ｆ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのリスクを評価すること
を含むものである。
【００２０】
本発明に従った心血管系疾患の別の診断方法は、次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者からサンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）サンプルからＡＲＫ２タンパク質を単離すること；
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定すること；及び
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのリスクを評価すること
を含むものである。
【００２１】
本発明は一般にまた、ヒトが心血管系疾患を患うリスクを決定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロ又はインビボで決定すること、及び
（ｂ）このヒトが心血管系疾患を発症するリスクを予測するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となるものである。
【００２２】
本発明の別の実施態様は一般に、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントを患うヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定する方法、又は心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントの治療処置の有効性を決定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで決定すること、及び
（ｂ）この人に対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定するか、又は治療処置の有効性を決定すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を有するヒトに対して、薬学的に活性な化合物が選択されるか及び／又は薬学的に活性な化合物の投薬量及び／又は治療処置の有効性が決定されるものである。
【００２３】
本発明のなお別の実施態様は一般に、心血管系疾患に対するリスクが増大したヒトを同定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロ又はインビボで決定すること、及び
（ｂ）このヒトを同定するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となるものである。
【００２４】
ＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型の決定は、当業者に公知の任意の方法、特に本明細書に記載される任意の方法によって実施され得る。
【００２５】
さらに、本明細書に記載されるＡＲＫ２及び／又はＡＲＫ２変異体は、心血管系疾患を処置する薬剤の製造のために、本発明に従って使用され得る。従って、本発明のさらなる実施態様は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置する薬剤を製造するための、配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、又はアミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸配列の使用に関する。特に変異体は、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である。特に、当業者に公知か及び／又は本明細書に記載されるキナーゼアッセイは、ＡＲＫ２タンパク質及び／又はＡＲＫ２変異体、特にＡＲＫ２−Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のモジュレーター、例えば活性化剤又は阻害剤を同定するために使用され得る。
【００２６】
従って、本明細書に記載されるＡＲＫ２及び／又はＡＲＫ２変異体はまた、この疾患を処置するための薬学的に活性な化合物を検出及び評価するハイスループット−スクリーニングアッセイの一部として、本発明に従って使用され得る。そのために、本発明のさらなる実施態様は、心血管系疾患を処置するための薬学的に活性な因子をスクリーニングする方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、又はアミノ酸２９８位のＡＲＫ２変異体及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸を提供すること、
（ｂ）試験化合物を提供すること、
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体、又は対応する核酸に対する試験化合物の影響を決定又は検出すること、並びに
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントの処置に好適な化合物を単離すること
を含む。
【００２７】
特に変異体は、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である。一般に、ＡＲＫ２タンパク質、ＡＲＫ２変異体、又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸は、例えばアッセイ系で提供され、そして例えば化学化合物ライブラリの形態で試験化合物、特に生化学的又は化学的な試験化合物と直接又は間接的に接触させられる。次いで、ＡＲＫ２タンパク質、又はＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸に対する試験化合物の影響が決定又は検出される。その後、好適なモジュレーター、例えば活性化剤又は阻害剤が、分析及び／又は単離できる。化学化合物ライブラリのスクリーニングに関して、当業者に知られているか又は市販されているハイスループットアッセイを使用することが好ましい。
【００２８】
一般に、ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体、又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸、に対する試験化合物の影響は、タンパク質若しくは核酸。又はタンパク質若しくは核酸を含む細胞、に対する化合物のいかなる物理的、化学的又は表現型的な効果であって良く、これによって、タンパク質又は核酸を調節する化合物が同定される。本発明の場合、本明細書に記載されるＡＲＫ２タンパク質又はＡＲＫ２変異体のキナーゼ活性に対する試験化合物の影響を決定又は検出することが好ましい。
【００２９】
キナーゼアッセイの一般概念は、分析されるべきキナーゼ、ここではＡＲＫ２セリン／トレオニンキナーゼが、好ましくはＡＴＰが存在する好適な緩衝液中で、このキナーゼによってリン酸化され得るセリン又はトレオニン残基を含む好適な物質又はペプチドと接触させられることである。好ましくはこの物質は、色素で標識される物質、例えば蛍光色素で標識されるペプチド、例えばフルオレセインで標識されるペプチドである。セリン／トレオニンキナーゼアッセイは市販されており、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡからのＨｉｔＨｕｎｔｅｒTMセリン／トレオニンキナーゼアッセイ又はＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡからのＩＱTMセリン／トレオニンキナーゼアッセイがある。他のキナーゼアッセイは、以下にさらに詳細に記載される。
【００３０】
本発明において、用語「化学化合物ライブラリ」は、化学合成分子及び天然物を含むあらゆる多様な源から集められているか、又はコンビナトリアルケミストリー技術によって作製されている多数の化学化合物をいう。
【００３１】
一般に、ＡＲＫ２、ＡＲＫ２変異体又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイにおいて決定又は検出される。本明細書で使用されるヘテロジニアスアッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるのに対し、ホモジニアスアッセイにおいては、このような洗浄工程は必要ではない。試薬及び化合物は、単に混合され、そして測定される。
【００３２】
好適な機能アッセイは、ＡＲＫ２の遺伝子発現又はそのセリン／トレオニンキナーゼ活性に基づくものであり得る。一般に、市販のキナーゼアッセイ系は、基質に取り込まれるホスフェートの量を定量的に検出している。
【００３３】
ヘテロジニアスアッセイは、例えばＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＦＩＡ、ＳＰＡ及びフラッシュプレートアッセイである。
【００３４】
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）に基づくアッセイは、種々の会社によって提供されている。このアッセイは、ＡＲＫ２のようなキナーゼによってリン酸化され得るランダムペプチドを利用している。キナーゼを含むサンプルは、例えばＡＴＰ及び必要な陽イオンを含む反応緩衝液に通常希釈され、次いでプレートのウェルに添加される。反応は、混合物を単に除去することによって停止する。その後、プレートを洗浄する。反応は、例えばビオチン化基質をキナーゼに添加することによって開始される。反応後、特異的抗体が添加される。サンプルは、あらかじめブロッキングされたプロテインＧプレートに通常移され、そして洗浄後、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰが添加される。その後、非結合性のストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が除去され、ペルオキシダーゼの呈色反応が、ペルオキシダーゼ基質の添加によって開始され、そして吸光度が、好適な濃度計で測定される。
【００３５】
ＤＥＬＦＩＡ（分離強化型ランタニド蛍光免疫測定法）に基づくアッセイは、固相アッセイである。抗体は、通常ユーロピウム又は別のランタニドで標識され、そして非結合性のユーロピウム標識化抗体を洗い流した後に、ユーロピウム蛍光が検出される。
【００３６】
ＳＰＡ（シンチレーション近接度測定法）及びフラッシュプレートアッセイは、放射標識された基質を捕獲するためにビオチン／アビジン相互作用を通常利用する。一般に反応混合物は、キナーゼ、ビオチン化ペプチド基質及びγ−［Ｐ33］ＡＴＰを含んでいる。反応後、ビオチン化ペプチドが、ストレプトアビジンによって捕獲される。ＳＰＡ検出において、ストレプトアビジンは、シンチラント含有ビーズ上に結合するのに対し、フラッシュプレート検出においては、ストレプトアビジンは、シンチラント含有マイクロプレートのウェルの内部に結合する。一旦固定化されると、放射標識された基質は、シンチラントに発光を刺激するに十分なだけ近接する。
【００３７】
別のホモジニアスアッセイは、例えばＴＲ−ＦＲＥＴ、ＦＰ、ＡＬＰＨＡ及び遺伝子アッセイである。
【００３８】
ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移）に基づくアッセイは、ユーロピウムとＡＰＣ、修飾アロフィコシアニン又は重複するスペクトルを有する他の色素（例えば、Ｃｙ３／Ｃｙ５若しくはＣｙ５／Ｃｙ７）との間の蛍光共鳴エネルギー転移を通常利用するアッセイである（Ｓｃｈｏｂｅｌ，Ｕ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０、１１０７−１１１４）。例えば、３３７ｎｍの光でユーロピウムを励起した後、分子は６２０ｎｍで蛍光を発する。しかし、このフルオロフォアがＡＰＣに十分に近接する場合、ユーロピウムは、その励起エネルギーをＡＰＣに転移させ、６６５ｎｍで蛍光を発する。キナーゼ基質は、通常ビオチンで標識された基質である。キナーゼ反応後、ユーロピウムで標識された（Ｐ）−特異的抗体が、ストレプトアビジン−ＡＰＣとともに添加される。リン酸化ペプチドは、ユーロピウムで標識された抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣを近接して接触させる。ユーロピウムフルオロフォアとＡＰＣが近接することにより、ＡＰＣ蛍光が付与されると同時にユーロピウム蛍光の消光が引き起こされる（ＦＲＥＴ）。
【００３９】
蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイは、偏光を用いて溶液中で蛍光基質ペプチドを励起させるアッセイである。これらの蛍光ペプチドは、溶液中で遊離し、そして崩壊しており、放出光を脱偏光させる。しかし、基質ペプチドがより大きな分子、例えば（Ｐ）−Ｔｙｒに結合すると、その崩壊速度は極めて減少し、そして放出光は強く偏光したままである。キナーゼアッセイについては、一般に次の２つの選択肢がある：
（ａ）蛍光リンペプチドトレーサーが、（Ｐ）−特異的抗体に結合される。リン酸化産物は、抗体由来の蛍光リンペプチドと競合し、高から低への偏光変化をもたらす。
（ｂ）リン酸化基質ペプチドは、リン特異的抗体に結合し、低から高への偏光変化をもたらす。
【００４０】
ＡＬＰＨＡ（増幅型ルミネッセンス近接ホモジニアス）に基づくアッセイは、リン酸化ペプチドによって近接させられたドナービーズとアクセプタービーズとの間の一重項酸素の転移に基づくアッセイである。６８０ｎｍでの励起において、ドナービーズ中の光増感剤は、周囲の酸素を一重項状態の酸素に転換し、その酸素が２００ｎｍの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、エネルギーをビーズ内の蛍光アクセプターに転移させ、次いでおよそ６００ｎｍで光を放射する。
【００４１】
ＥＦＣ（酵素断片相補性）に基づくアッセイ又はそれと同等のアッセイは、特に化合物のハイスループットスクリーニングに使用され得る。ＥＦＣアッセイは、２つの断片、すなわち酵素アクセプター（ＥＡ）及び酵素ドナー（ＥＤ）からなる設計されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づいている。断片が分離すると、β−ガラクトシダーゼ活性が失われるが、断片が合わさると、それらは連携して（補完して）、活性酵素を形成する。ＥＦＣアッセイは、ＥＤ−分析物結合体を利用し、この場合、この分析物は、抗体又は受容体のような特異的結合タンパク質によって認識され得る。特異的結合タンパク質の非存在下では、ＥＤ−分析物結合体は、ＥＡを補完し、活性なβ−ガラクトシダーゼを形成することが可能であり、正の発光シグナルを産生する。ＥＤ−分析物結合体が、特異的結合タンパク質によって結合される場合、ＥＡとの相補性が阻害され、シグナルは生じない。遊離の分析物が（サンプル中に）提供される場合、その分析物は、特異的結合タンパク質との結合に関してＥＤ−分析物結合体と競合する。遊離の分析物は、ＥＡとの相補性のためにＥＤ−分析物結合体を遊離し、サンプル中に存在する遊離分析物の量に応じてシグナルを産生する。
【００４２】
遺伝子アッセイの別の例は、キナーゼの活性が、機能的な細胞性応答、例えば増殖、増殖停止、分化又はアポトーシスに転換される機能的アッセイである。このタイプのスクリーニングに関して、酵母は、特に好適なモデル系である。例えばＡＲＫ２−酵母の機能的アッセイにおいて、グルコース含有培地上で培養されると、例えばＡＲＫ２−酵母細胞は、正常な酵母細胞のように増殖する。しかし、ガラクトースに曝露されると、ＡＲＫ２の細胞内発現が誘導され、酵母細胞を死に至らしめる。ＡＲＫ２活性を阻害する化合物は、この場合細胞死を妨げる。
【００４３】
別のアッセイは、固相に結合したポリペプチド、例えばＡＲＫ２及び試験されるべき化合物との干渉に基づいている。従って試験化合物は、検出可能なマーカーを含んでおり、例えば、この化合物は、上記ですでに説明されたように、放射標識、蛍光標識又は発光標識され得るものである。さらに化合物は、タンパク質に結合され得るものであり、これにより、例えば、発色性基質を用いるペルオキシダーゼアッセイを利用した酵素的な触媒作用によるか、又は検出可能な抗体を結合させることによる間接的な検出が可能となる。別の可能性は、質量分析によって、固相に結合したタンパク質複合体を調べることである（ＳＥＬＤＩ）。試験物質との相互作用の結果としての、例えば本明細書に記載のＡＲＫ２又はＡＲＫ２変異体のコンフォメーション変化は、例えば、ポリペプチド中の内在性のトリプトファン残基の蛍光変化によって検出することができる。
【００４４】
固相に結合したポリペプチドはまた、アレイの一部となることも可能である。固相化学及び光解離性保護基を用いてこのようなアレイを製造する方法は、例えばＵＳ５，７４４，３０５に開示されている。これらのアレイはまた、試験化合物又は化合物ライブラリと接触させられ、そして相互作用、例えば結合又はコンフォメーション変化について試験され得る。アレイの好適なフォーマットは、一次スクリーニング及び二次スクリーニングの両方に対して、現在９６、３８４又は１，５３６のフォーマットである。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、この方法は、全細胞を用いて行われる。通常、マルチウェルプレートの底部で増殖する細胞は、固定、透過処理、ブロッキングが行われ、そして例えば目的の基質に対する一次（Ｐ）−特異的抗体とインキュベートされる。次いで、例えば上記のような特異的な化学発光物質又は比色物質と一緒になって、例えばユーロピウム標識されるか又はＨＲＰに結合体化した二次抗体が、シグナル産生に利用される。顕微鏡の使用と組み合わせて、（Ｐ）−特異的抗体量が、単細胞レベルで定量され得るだけではなく、リン酸化により誘導される基質の移行又は細胞の形態学的変化もまた定量され得る。
【００４６】
有利には、本発明の方法は、例えば微小流体制御技術（すなわち溝をつけた構造）を用いて、例えばロボット式プレーティング及びロボット式液体移動システムを含むロボットシステムで行われる。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利にはこのスクリーニング方法は、自動化及び小型化されており、特に、ロボットで制御された小型化したウェル及び微小流体制御技術を用いるものである。
【００４８】
上記の対象物を考慮して、本発明はまた、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置するための薬剤の製造方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）上記で説明されたスクリーニング方法を行うこと、及び
（ｂ）単離された化合物を、１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能なキャリア又は補助剤とともに製剤化すること
を含むものである。
【００４９】
上記の方法の工程（ｂ）に従って検出される試験化合物は、通常、投与の種類如何により１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能な添加剤又は補助剤、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、ε−アミノカプロン酸若しくはペプスタチンＡ、又は金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィン及び／又は黄ろうなどとともに処方される。
【００５０】
好適なさらなる添加剤は、例えば、界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はデオキシコール酸ナトリウム、さらにポリオール、例えばポリエチレングリコール又はグリセロール、糖類、例えばスクロース又はグルコース、両性イオン化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、又は特にタウリン若しくはベタイン、及び／又はタンパク質、例えばウシ若しくはヒトの血清アルブミンである。界面活性剤、ポリオール及び／又は両性イオン化合物が好ましい。
【００５１】
生理緩衝溶液は、好ましくは、およそ６.０〜８.０、特におよそ６.８〜７.８、特におよそ７.４のｐＨを有し、そして／又はおよそ２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくはおよそ２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの浸透圧モル濃度を有するものである。薬剤のｐＨは、一般的に、好適な有機又は無機の緩衝液を用いて、例えば好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］−エタンスルホン酸）、又はＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調整される。それぞれの緩衝液の選択は、一般的に、所望の緩衝液のモル濃度に左右される。例えばリン酸緩衝液は、注射溶液及び輸液に好適である。
【００５２】
薬剤は、慣用の様式、本発明の薬剤を含む、例えば経口投薬形態、例えば錠剤又はカプセル剤によって、粘膜、例えば鼻又は口腔経由で、皮下に埋め込むデポ製剤（ｄｉｓｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）の形態で、注射、輸液又はゲルによって投与され得るものである。さらに、薬剤を一時的に制御して放出することを可能にする経皮治療システム（ＴＴＳ）によって処置を行うことができる。ＴＴＳは、例えばＥＰ ０ ９４４ ３９８ Ａ１、ＥＰ ０ ９１６ ３３６ Ａ１、ＥＰ ０ ８８９ ７２３ Ａ１又はＥＰ ０ ８５２ ４９３ Ａ１から公知である。
【００５３】
比較的少量の溶液又は懸濁液、例えばおよそ１ｍｌ〜およそ２０ｍｌのみが体に投与されるべき場合には、一般的に注射溶液が用いられる。より大量の溶液又は懸濁液、例えば１リットル以上が投与されるべき場合には、一般的に、輸液が用いられる。輸液とは対照的に、注射溶液の場合は数ミリリットルだけが投与されるため、注射の際の血液又は組織液のｐＨ及び浸透圧のわずかな差は、痛覚に関して、それ自体重要ではないか、又はそれ自体問題にならない程度の重要性しか有さない。従って一般的に、使用前に本発明の処方物を希釈する必要はない。しかし、比較的大量の投与の場合、本発明の処方物は、投与前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に簡単に希釈されるべきである。等張溶液の例は、０．９％強度の塩化ナトリウム溶液である。輸液の場合、希釈は、例えば滅菌水を用いて行い得るが、その一方、投与は、例えばいわゆるバイパスを介して行い得る。
【００５４】
より好ましい工程は、実施例で個々に又はまとめて述べられており、そして各工程に対する参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
以下の表、配列、実施例及び添付図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する。
【００５６】
配列表の説明
配列番号１は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有するヒトＡＲＫ２タンパク質の核酸配列を示している。
配列番号２は、番号ＡＣ１３５１７８を有するＡＲＫ２の染色体核酸配列の一部を示している。
配列番号３は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有する核酸配列に由来するヒトＡＲＫ２のアミノ酸配列を示している。
配列番号４は、第一のプライマー配列ＡＲＫ２−２９８Ｒを示している。
配列番号５は、相補配列の第二のプライマー配列ＡＲＫ２−２９８Ｆを示している。
配列番号６は、ヒトＡＲＫ２遺伝子のＴ９５０Ｔ変異体の核酸配列を示している。
配列番号７は、ヒトＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のアミノ酸配列を示している。
【実施例】
【００５７】
５’−ヌクレアーゼアッセイによるＳＮＰ検出（ＴＡＱＭＡＮTM）
増幅のためのオリゴヌクレオチド（プライマー）：
以下のプライマーを、参照番号ＮＭ＿００４２１７を有するＡＲＫ２配列の９５０位でのＣからＴへのヌクレオチド変換を検出するために使用した：
プライマー１：５’−ＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧ−３’（参照配列ＡＣ１３５１７８のヌクレオチド１７９６０５−１７９５８４；図１Ｂ；配列番号５）；
プライマー２：５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣ−３’（参照配列ＡＣ１３５１７８の塩基１７９５３２−１７９５５３の相補配列；図１Ｂ；配列番号４）。
【００５８】
増幅のためのＰＣＲプロトコル：
使用した試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）のものであった。ＰＣＲ反応を、ＳｕｐｅｒＨｏｔ−Ｍａｓｔｅｒ−Ｍｉｘ（Ｂｉｏｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）２.５μｌ、Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ−Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）０.１２５μｌ、Ｈ2Ｏ ０.３７５μｌ及びＤＮＡ ２μｌを含む総量５μｌで、Ｐｒｉｍｕｓ９６ｐｌｕｓサーマルサイクラー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。この反応混合物を、鉱油１５μｌで覆った。
【００５９】
ＰＣＲ反応の増幅プログラム：
９４℃で１分間×１サイクル
９２℃で１５秒間×４５サイクル
６０℃で１分間×１サイクル
【００６０】
ＰＣＲ産物の分析
蛍光を、ＦＡＭで標識したプローブ（２９８Ｔｈｒ対立遺伝子；ＡＲＫ２−２９８Ｍ１（Ｔｈｒ）ＦＡＭ−ＴＣＣＣＧＴＧＧＧＣＡＣＧ）については４８５ｎｍ／５２０ｎｍの、及びＶＩＣ標識されたプローブ（２９８Ｍｅｔ対立遺伝子；ＡＲＫ２−２９８Ｖ１（Ｍｅｔ）ＶＩＣ−ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧ）にについては５３０ｎｍ／５７２ｎｍの、励起／発光フィルタを用いて、ＶＩＣＴＯＲ蛍光プレートリーダー（ＨＶＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）で検出した。データを、ＭＳ−Ｅｘｃｅｌフォーマットでエクスポートし、そして散布図で分析した。
【００６１】
結果
ヒトのグループの特徴
表１は、研究されたヒトのグループの特徴を示している。
【表１】
【００６２】
ＡＲＫ２遺伝子の変異体の頻度及び分布
表２は、研究された患者群における参照配列ＮＭ＿００４２１７の９５０位でのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子変異体の頻度及び分布を示している。
【表２】
【００６３】
ＡＲＫ２の変異体Ｔｈｒ２９８Ｍｅｔの影響
表３は、研究された患者群における、高血圧、冠動脈心疾患（２０％を超える狭窄を伴う）、１を超える心筋梗塞の発生率、及び発作／ＴＩＡ／ＰＲＩＮＤ（ＴＩＡ＝一過性脳虚血発作；ＰＲＩＮＤ＝遷延性可逆性虚血性神経障害）の発生に対するＡＲＫ２の変異体Ｔｈｒ２９８Ｍｅｔの影響を示している。０.０５未満のｐ値は、統計上関連性を有していると考えられる。
【表３】
【００６４】
結果：
ＡＲＫ２−Ｔ９５０Ｔを有する患者は、この９５０位に異なるＡＲＫ２遺伝子型を有する患者と比較して、高血圧及び冠動脈心疾患の発生率、１を超える心筋梗塞、及び発作／ＴＩＡ／ＰＲＩＮＤの発生率が統計上より高いことを示した。
【００６５】
結論：
上記で示される、ＡＲＫ２をコードする遺伝子の遺伝子変異体及び／又はタンパク質ＡＲＫ２との間での統計上の有意な関連性は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントの発症において、この遺伝子変異体が関与することを明確に示している。従って、この遺伝子変異体は、例えば心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを予測するための生物学的マーカーである。本発見に基づく本発明のさらなる実施態様は、本明細書にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有するヒトＡＲＫ２遺伝子の核酸配列を示している。
【図１Ｂ】番号ＡＣ１３５１７８を有するＡＲＫ２の染色体核酸配列の一部を示している。参照配列ＮＭ＿００４２１７の９５０位に対応するＣからＴへの遺伝的変異を有する遺伝子の区分の増幅に使用されるプライマーに、太字で下線を付している。（ＡＲＫ２−２９８Ｒ＝ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣ；ＡＲＫ２−２９８Ｆ＝ＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧ）
【図２】ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有する核酸配列に由来するヒトＡＲＫ２のアミノ酸配列を示している。ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸に、太字で下線を付している。
【図３】ヒトＡＲＫ２遺伝子のＴ９５０Ｔ変異体の核酸配列を示している。
【図４】ヒトＡＲＫ２のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のアミノ酸配列を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのインビトロ又はインビボ診断の方法であって、ヒトのサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド、又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定する方法、並びに心血管系疾患を処置する薬剤の開発及び／又は製造のためのＡＲＫ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーロラキナーゼは、多くの固形腫瘍で過剰発現される有糸分裂セリン／トレオニンキナーゼの発癌ファミリーである（Ｖａｎｋａｙａｌａｐａｔｉ，Ｈ．ら（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２、２８３−２９４）。最初に、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の自然発生型染色体分離欠損突然変異体が同定され、そしてオーロラと命名された（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら（１９９８）、２４４、２８５−２９２）。ヒトオーロラ１キナーゼはまた、ＡＵＲ１、ＡＲＫ２、Ａｌｋ２、ＡＩＭ−１及びＳＴＫ１２としても知られている。本明細書では、用語ＡＲＫ２を使用する。ＡＲＫ２は、有糸分裂において役割を果たすようであり、具体的には、有糸分裂の間に中央体に蓄積している（Ｓｈｉｎｄｏ，Ｍ．ら（１９９８）、前出）。ＡＲＫ２欠損細胞はまた、細胞質分裂欠損も示している（Ｄｅｓｃａｍｐｓ及びＰｒｉｇｅｎｔ（２００１）、Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ、１７３、１）。ＡＲＫ２遺伝子は、染色体１７ｐ１３．１に位置している。
【０００３】
ヒト疾患の発症及び進行においてＡＲＫ２が関係する可能性をより良く理解するために、参照番号ＮＭ＿００４２１７として公開されたＡＲＫ２参照配列の９５０位のＣからＴへの変異に関して、遺伝子型−表現型関連分析を、良く特徴付けられた患者群を用いて行った。この変異は、ＡＲＫ２タンパク質の対応する２９８位でのトレオニンからメチオニン（Ｔｈｒ→Ｍｅｔ）へのアミノ酸変化を導いている。ＡＲＫ２遺伝子の異なる遺伝子変異体は、すでにＳＮＰ（一塩基多型）として公知であり、そしてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／ｓｎｐ＿ｒｅｆ．ｃｇｉ？ｌｏｃｕｓＩｄ＝９２１２； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｇｅｎｅｓｎｐｖｉｅｗ？ｄｂ＝＆ｇｅｎｅ＝ＥＮＳＧ０００００１７８９９９で公開されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
驚くべきことに、特にヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位でのシトシンからチミジンへの変異、又は対応するＡＲＫ２タンパク質の２９８位でのトレオニンからメチオニンへの変異が、心血管系疾患の発症と関連していることが見出された。
【０００５】
従って本発明の主題は、ヒト又は患者のサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２８９位のアミノ酸を決定する、心血管系疾患のインビトロ又はインビボ診断に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の好ましい実施態様において、心血管系疾患は、高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントである。
【０００７】
特に、９５０位のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡ上でチミジン若しくはｍＲＮＡ上でウラシルであると決定されるか、又は２９８位のアミノ酸がメチオニンであると決定される場合、高血圧及び／又は狭窄のリスクはより高くなる。
【０００８】
本発明において、用語「ＡＲＫ２−Ｃ９５０Ｃ」は、参照配列ＮＭ＿００４２１７のＡＲＫ２をコードする遺伝子の９５０位の両方の対立遺伝子上にシチジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でアミノ酸トレオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してホモ接合である。従って、用語「ＡＲＫ２−Ｃ９５０Ｔ」は、ＡＲＫ２をコードする遺伝子の一方の対立遺伝子上にシチジンを有し（これは、対応するタンパク質の２９８位でトレオニンを導く）、そしてＡＲＫ２をコードする遺伝子の他の対立遺伝子上にチミジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でメチオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してヘテロ接合である。本発明において、用語「ＡＲＫ２−Ｔ９５０Ｔ」は、参照配列ＮＭ＿００４２１７のＡＲＫ２をコードする遺伝子の９５０位の両方の対立遺伝子上にチミジンを有する（これは、対応するタンパク質の２９８位でアミノ酸メチオニンを導く）ヒトのグループをいう。これらのヒトは、このＡＲＫ２変異体に関してホモ接合である。
【０００９】
ヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする参照配列の核酸配列は、好ましくは、配列番号１の核酸配列を有し、そしてヒトＡＲＫ２タンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。しかし本発明はまた、この参照配列の９５０位に対応する位置でのシチジンからチミジンへのヌクレオチド変換及び／又はこの参照配列の２９８位に対応する位置でのトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変換が存在するという条件で、そしてさらに、対応するタンパク質が、セリントレオニンキナーゼ活性を有するという条件で、ヒトＡＲＫ２の他の変異体、及びその非ヒトホモログ（例えば、他の哺乳動物ＡＲＫ２ホモログ、又はショウジョウバエ、センチュウ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、マウス若しくはラット由来のＡＲＫ２ホモログ）もまた含むものとする。この酵素活性は、当業者に公知かそして／又は本明細書に記載されるキナーゼアッセイによって決定できる。
【００１０】
一般に、９５０位の特定のヌクレオチドは、核酸シーケンス法、核酸の質量分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法によって測定できる。核酸シーケンス法の例は、ピロシーケンス法及び／又は放射標識性及び／又は蛍光標識性ヌクレオチドの助けをかりたシーケンス法である。ハイブリダイゼーション法の例は、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析及び／又はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション法である。増幅法の例は、ＴａｑＭａｎ分析、差異ＲＮＡ発現分析及び／又は発現量差異分析法である（Ｓｈｉ Ｍ．Ｍ．（２００２）Ａｍ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．、２（３）、１９７−２０５；Ｋｏｚｉａｎ及びＫｉｒｓｃｈｂａｕｍ（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７（２）、７３−８）。
【００１１】
さらに、２９８位のアミノ酸配列は、特定のタンパク質の量を測定する方法及び／又は特定のタンパク質の活性を測定する方法によって測定され得る。特定のタンパク質の量を測定する方法の例は、ウエスタンブロット分析及び／又はＥＬＩＳＡである。特定のタンパク質の活性を測定する例は、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞を用いたインビトロ試験アッセイ及び／又はインビトロ全細胞試験アッセイであり、これらはすべて当業者に公知かそして／又は本願に記載されている。
【００１２】
それぞれの変異体を検出するためのサンプルの例は、細胞、組織又は体液、特に血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞である。好ましくはサンプルは、さらなる分析のためにサンプルの核酸又は染色体ＤＮＡ又はタンパク質を単離及び／又は精製するために、当業者に公知の慣用の方法によって前処理される。
【００１３】
任意のさらなる工程において、ヒトが心血管系疾患を患うリスクは、実施例に示されるように決定され得る。
【００１４】
別の任意のさらなる工程において、適切な医薬品が選択されるか、又は医薬品の投薬量が決定される。
【００１５】
一般に、ＡＲＫ２遺伝子において見出された遺伝子の変異は、ヒトのリスク評価、遺伝的特性解析若しくは分類のための、及び／又は心血管系疾患（「冠動脈心疾患」としても知られている）、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントの予防的処置のための、遺伝子マーカーとして、本発明に従って使用され得る。
【００１６】
さらにこの遺伝子の変異は、投薬量を適応させるため、又は一般にヒト若しくは患者（本明細書では以下「個人」ともいう）を処置するために有効な治療剤の有効性を増大させるための、及び／又は臨床試験研究下若しくは臨床試験研究のために選択された心血管系疾患、特に高血圧及び／若しくは狭窄のリスクが増大する個人を同定するための、遺伝子マーカーとして、本発明に従って使用され得る。この遺伝子の変異はまた、特定の個人のための薬学的に活性な物質の許容度、安全性及び有効性を評価するため、又はこの疾患の特定の処置に好適な個人を同定するために、本発明に従って使用され得る。
【００１７】
本発明はまた、処置又は助言されるべき個々の個人のために、この疾患のリスクファクターを同定するために使用できる。
【００１８】
一般に、好適な個人は、（ｉ）心血管系疾患の症状を示していない個人、（ii）心血管系疾患を生じるリスクがすでに検出されているが、この疾患の症状をまだ示していない個人、及び（iii）心血管系疾患を患っていると以前に診断された個人である。
【００１９】
本発明に従った心血管系疾患の好ましい診断方法は、次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者からサンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）サンプルから核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを単離すること；
（ｃ）プライマー、特に実施例で特定されるプライマーを利用して、ＡＲＫ２遺伝子の９５０位を含む特定の領域を増幅すること；
（ｄ）増幅された領域をシーケンスすること；
（ｅ）シーケンスされた領域を分析すること；及び
（ｆ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのリスクを評価すること
を含むものである。
【００２０】
本発明に従った心血管系疾患の別の診断方法は、次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者からサンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）サンプルからＡＲＫ２タンパク質を単離すること；
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定すること；及び
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントのリスクを評価すること
を含むものである。
【００２１】
本発明は一般にまた、ヒトが心血管系疾患を患うリスクを決定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロ又はインビボで決定すること、及び
（ｂ）このヒトが心血管系疾患を発症するリスクを予測するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となるものである。
【００２２】
本発明の別の実施態様は一般に、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントを患うヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定する方法、又は心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは他の血栓イベントの治療処置の有効性を決定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで決定すること、及び
（ｂ）この人に対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定するか、又は治療処置の有効性を決定すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を有するヒトに対して、薬学的に活性な化合物が選択されるか及び／又は薬学的に活性な化合物の投薬量及び／又は治療処置の有効性が決定されるものである。
【００２３】
本発明のなお別の実施態様は一般に、心血管系疾患に対するリスクが増大したヒトを同定する方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロ又はインビボで決定すること、及び
（ｂ）このヒトを同定するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、ここでＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となるものである。
【００２４】
ＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型の決定は、当業者に公知の任意の方法、特に本明細書に記載される任意の方法によって実施され得る。
【００２５】
さらに、本明細書に記載されるＡＲＫ２及び／又はＡＲＫ２変異体は、心血管系疾患を処置する薬剤の製造のために、本発明に従って使用され得る。従って、本発明のさらなる実施態様は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置する薬剤を製造するための、配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、又はアミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸配列の使用に関する。特に変異体は、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である。特に、当業者に公知か及び／又は本明細書に記載されるキナーゼアッセイは、ＡＲＫ２タンパク質及び／又はＡＲＫ２変異体、特にＡＲＫ２−Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のモジュレーター、例えば活性化剤又は阻害剤を同定するために使用され得る。
【００２６】
従って、本明細書に記載されるＡＲＫ２及び／又はＡＲＫ２変異体はまた、この疾患を処置するための薬学的に活性な化合物を検出及び評価するハイスループット−スクリーニングアッセイの一部として、本発明に従って使用され得る。そのために、本発明のさらなる実施態様は、心血管系疾患を処置するための薬学的に活性な因子をスクリーニングする方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、又はアミノ酸２９８位のＡＲＫ２変異体及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸を提供すること、
（ｂ）試験化合物を提供すること、
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体、又は対応する核酸に対する試験化合物の影響を決定又は検出すること、並びに
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントの処置に好適な化合物を単離すること
を含む。
【００２７】
特に変異体は、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である。一般に、ＡＲＫ２タンパク質、ＡＲＫ２変異体、又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸は、例えばアッセイ系で提供され、そして例えば化学化合物ライブラリの形態で試験化合物、特に生化学的又は化学的な試験化合物と直接又は間接的に接触させられる。次いで、ＡＲＫ２タンパク質、又はＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸に対する試験化合物の影響が決定又は検出される。その後、好適なモジュレーター、例えば活性化剤又は阻害剤が、分析及び／又は単離できる。化学化合物ライブラリのスクリーニングに関して、当業者に知られているか又は市販されているハイスループットアッセイを使用することが好ましい。
【００２８】
一般に、ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体、又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸、に対する試験化合物の影響は、タンパク質若しくは核酸。又はタンパク質若しくは核酸を含む細胞、に対する化合物のいかなる物理的、化学的又は表現型的な効果であって良く、これによって、タンパク質又は核酸を調節する化合物が同定される。本発明の場合、本明細書に記載されるＡＲＫ２タンパク質又はＡＲＫ２変異体のキナーゼ活性に対する試験化合物の影響を決定又は検出することが好ましい。
【００２９】
キナーゼアッセイの一般概念は、分析されるべきキナーゼ、ここではＡＲＫ２セリン／トレオニンキナーゼが、好ましくはＡＴＰが存在する好適な緩衝液中で、このキナーゼによってリン酸化され得るセリン又はトレオニン残基を含む好適な物質又はペプチドと接触させられることである。好ましくはこの物質は、色素で標識される物質、例えば蛍光色素で標識されるペプチド、例えばフルオレセインで標識されるペプチドである。セリン／トレオニンキナーゼアッセイは市販されており、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡからのＨｉｔＨｕｎｔｅｒTMセリン／トレオニンキナーゼアッセイ又はＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡからのＩＱTMセリン／トレオニンキナーゼアッセイがある。他のキナーゼアッセイは、以下にさらに詳細に記載される。
【００３０】
本発明において、用語「化学化合物ライブラリ」は、化学合成分子及び天然物を含むあらゆる多様な源から集められているか、又はコンビナトリアルケミストリー技術によって作製されている多数の化学化合物をいう。
【００３１】
一般に、ＡＲＫ２、ＡＲＫ２変異体又はＡＲＫ２タンパク質若しくは変異体をコードする核酸に対する試験化合物の影響は、ヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイにおいて決定又は検出される。本明細書で使用されるヘテロジニアスアッセイは、１つ又はそれ以上の洗浄工程を含むアッセイであるのに対し、ホモジニアスアッセイにおいては、このような洗浄工程は必要ではない。試薬及び化合物は、単に混合され、そして測定される。
【００３２】
好適な機能アッセイは、ＡＲＫ２の遺伝子発現又はそのセリン／トレオニンキナーゼ活性に基づくものであり得る。一般に、市販のキナーゼアッセイ系は、基質に取り込まれるホスフェートの量を定量的に検出している。
【００３３】
ヘテロジニアスアッセイは、例えばＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＦＩＡ、ＳＰＡ及びフラッシュプレートアッセイである。
【００３４】
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）に基づくアッセイは、種々の会社によって提供されている。このアッセイは、ＡＲＫ２のようなキナーゼによってリン酸化され得るランダムペプチドを利用している。キナーゼを含むサンプルは、例えばＡＴＰ及び必要な陽イオンを含む反応緩衝液に通常希釈され、次いでプレートのウェルに添加される。反応は、混合物を単に除去することによって停止する。その後、プレートを洗浄する。反応は、例えばビオチン化基質をキナーゼに添加することによって開始される。反応後、特異的抗体が添加される。サンプルは、あらかじめブロッキングされたプロテインＧプレートに通常移され、そして洗浄後、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰが添加される。その後、非結合性のストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が除去され、ペルオキシダーゼの呈色反応が、ペルオキシダーゼ基質の添加によって開始され、そして吸光度が、好適な濃度計で測定される。
【００３５】
ＤＥＬＦＩＡ（分離強化型ランタニド蛍光免疫測定法）に基づくアッセイは、固相アッセイである。抗体は、通常ユーロピウム又は別のランタニドで標識され、そして非結合性のユーロピウム標識化抗体を洗い流した後に、ユーロピウム蛍光が検出される。
【００３６】
ＳＰＡ（シンチレーション近接度測定法）及びフラッシュプレートアッセイは、放射標識された基質を捕獲するためにビオチン／アビジン相互作用を通常利用する。一般に反応混合物は、キナーゼ、ビオチン化ペプチド基質及びγ−［Ｐ33］ＡＴＰを含んでいる。反応後、ビオチン化ペプチドが、ストレプトアビジンによって捕獲される。ＳＰＡ検出において、ストレプトアビジンは、シンチラント含有ビーズ上に結合するのに対し、フラッシュプレート検出においては、ストレプトアビジンは、シンチラント含有マイクロプレートのウェルの内部に結合する。一旦固定化されると、放射標識された基質は、シンチラントに発光を刺激するに十分なだけ近接する。
【００３７】
別のホモジニアスアッセイは、例えばＴＲ−ＦＲＥＴ、ＦＰ、ＡＬＰＨＡ及び遺伝子アッセイである。
【００３８】
ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移）に基づくアッセイは、ユーロピウムとＡＰＣ、修飾アロフィコシアニン又は重複するスペクトルを有する他の色素（例えば、Ｃｙ３／Ｃｙ５若しくはＣｙ５／Ｃｙ７）との間の蛍光共鳴エネルギー転移を通常利用するアッセイである（Ｓｃｈｏｂｅｌ，Ｕ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０、１１０７−１１１４）。例えば、３３７ｎｍの光でユーロピウムを励起した後、分子は６２０ｎｍで蛍光を発する。しかし、このフルオロフォアがＡＰＣに十分に近接する場合、ユーロピウムは、その励起エネルギーをＡＰＣに転移させ、６６５ｎｍで蛍光を発する。キナーゼ基質は、通常ビオチンで標識された基質である。キナーゼ反応後、ユーロピウムで標識された（Ｐ）−特異的抗体が、ストレプトアビジン−ＡＰＣとともに添加される。リン酸化ペプチドは、ユーロピウムで標識された抗体及びストレプトアビジン−ＡＰＣを近接して接触させる。ユーロピウムフルオロフォアとＡＰＣが近接することにより、ＡＰＣ蛍光が付与されると同時にユーロピウム蛍光の消光が引き起こされる（ＦＲＥＴ）。
【００３９】
蛍光偏光（ＦＰ）に基づくアッセイは、偏光を用いて溶液中で蛍光基質ペプチドを励起させるアッセイである。これらの蛍光ペプチドは、溶液中で遊離し、そして崩壊しており、放出光を脱偏光させる。しかし、基質ペプチドがより大きな分子、例えば（Ｐ）−Ｔｙｒに結合すると、その崩壊速度は極めて減少し、そして放出光は強く偏光したままである。キナーゼアッセイについては、一般に次の２つの選択肢がある：
（ａ）蛍光リンペプチドトレーサーが、（Ｐ）−特異的抗体に結合される。リン酸化産物は、抗体由来の蛍光リンペプチドと競合し、高から低への偏光変化をもたらす。
（ｂ）リン酸化基質ペプチドは、リン特異的抗体に結合し、低から高への偏光変化をもたらす。
【００４０】
ＡＬＰＨＡ（増幅型ルミネッセンス近接ホモジニアス）に基づくアッセイは、リン酸化ペプチドによって近接させられたドナービーズとアクセプタービーズとの間の一重項酸素の転移に基づくアッセイである。６８０ｎｍでの励起において、ドナービーズ中の光増感剤は、周囲の酸素を一重項状態の酸素に転換し、その酸素が２００ｎｍの距離まで拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、エネルギーをビーズ内の蛍光アクセプターに転移させ、次いでおよそ６００ｎｍで光を放射する。
【００４１】
ＥＦＣ（酵素断片相補性）に基づくアッセイ又はそれと同等のアッセイは、特に化合物のハイスループットスクリーニングに使用され得る。ＥＦＣアッセイは、２つの断片、すなわち酵素アクセプター（ＥＡ）及び酵素ドナー（ＥＤ）からなる設計されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づいている。断片が分離すると、β−ガラクトシダーゼ活性が失われるが、断片が合わさると、それらは連携して（補完して）、活性酵素を形成する。ＥＦＣアッセイは、ＥＤ−分析物結合体を利用し、この場合、この分析物は、抗体又は受容体のような特異的結合タンパク質によって認識され得る。特異的結合タンパク質の非存在下では、ＥＤ−分析物結合体は、ＥＡを補完し、活性なβ−ガラクトシダーゼを形成することが可能であり、正の発光シグナルを産生する。ＥＤ−分析物結合体が、特異的結合タンパク質によって結合される場合、ＥＡとの相補性が阻害され、シグナルは生じない。遊離の分析物が（サンプル中に）提供される場合、その分析物は、特異的結合タンパク質との結合に関してＥＤ−分析物結合体と競合する。遊離の分析物は、ＥＡとの相補性のためにＥＤ−分析物結合体を遊離し、サンプル中に存在する遊離分析物の量に応じてシグナルを産生する。
【００４２】
遺伝子アッセイの別の例は、キナーゼの活性が、機能的な細胞性応答、例えば増殖、増殖停止、分化又はアポトーシスに転換される機能的アッセイである。このタイプのスクリーニングに関して、酵母は、特に好適なモデル系である。例えばＡＲＫ２−酵母の機能的アッセイにおいて、グルコース含有培地上で培養されると、例えばＡＲＫ２−酵母細胞は、正常な酵母細胞のように増殖する。しかし、ガラクトースに曝露されると、ＡＲＫ２の細胞内発現が誘導され、酵母細胞を死に至らしめる。ＡＲＫ２活性を阻害する化合物は、この場合細胞死を妨げる。
【００４３】
別のアッセイは、固相に結合したポリペプチド、例えばＡＲＫ２及び試験されるべき化合物との干渉に基づいている。従って試験化合物は、検出可能なマーカーを含んでおり、例えば、この化合物は、上記ですでに説明されたように、放射標識、蛍光標識又は発光標識され得るものである。さらに化合物は、タンパク質に結合され得るものであり、これにより、例えば、発色性基質を用いるペルオキシダーゼアッセイを利用した酵素的な触媒作用によるか、又は検出可能な抗体を結合させることによる間接的な検出が可能となる。別の可能性は、質量分析によって、固相に結合したタンパク質複合体を調べることである（ＳＥＬＤＩ）。試験物質との相互作用の結果としての、例えば本明細書に記載のＡＲＫ２又はＡＲＫ２変異体のコンフォメーション変化は、例えば、ポリペプチド中の内在性のトリプトファン残基の蛍光変化によって検出することができる。
【００４４】
固相に結合したポリペプチドはまた、アレイの一部となることも可能である。固相化学及び光解離性保護基を用いてこのようなアレイを製造する方法は、例えばＵＳ５，７４４，３０５に開示されている。これらのアレイはまた、試験化合物又は化合物ライブラリと接触させられ、そして相互作用、例えば結合又はコンフォメーション変化について試験され得る。アレイの好適なフォーマットは、一次スクリーニング及び二次スクリーニングの両方に対して、現在９６、３８４又は１，５３６のフォーマットである。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、この方法は、全細胞を用いて行われる。通常、マルチウェルプレートの底部で増殖する細胞は、固定、透過処理、ブロッキングが行われ、そして例えば目的の基質に対する一次（Ｐ）−特異的抗体とインキュベートされる。次いで、例えば上記のような特異的な化学発光物質又は比色物質と一緒になって、例えばユーロピウム標識されるか又はＨＲＰに結合体化した二次抗体が、シグナル産生に利用される。顕微鏡の使用と組み合わせて、（Ｐ）−特異的抗体量が、単細胞レベルで定量され得るだけではなく、リン酸化により誘導される基質の移行又は細胞の形態学的変化もまた定量され得る。
【００４６】
有利には、本発明の方法は、例えば微小流体制御技術（すなわち溝をつけた構造）を用いて、例えばロボット式プレーティング及びロボット式液体移動システムを含むロボットシステムで行われる。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、本方法は、ハイスループットスクリーニングシステムの形態で行われる。このようなシステムにおいて、有利にはこのスクリーニング方法は、自動化及び小型化されており、特に、ロボットで制御された小型化したウェル及び微小流体制御技術を用いるものである。
【００４８】
上記の対象物を考慮して、本発明はまた、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置するための薬剤の製造方法に関し、この方法は、次の工程：
（ａ）上記で説明されたスクリーニング方法を行うこと、及び
（ｂ）単離された化合物を、１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能なキャリア又は補助剤とともに製剤化すること
を含むものである。
【００４９】
上記の方法の工程（ｂ）に従って検出される試験化合物は、通常、投与の種類如何により１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能な添加剤又は補助剤、例えば生理緩衝溶液、例えば塩化ナトリウム溶液、脱塩水、安定剤、ε−アミノカプロン酸若しくはペプスタチンＡ、又は金属イオン封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル化剤、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィン及び／又は黄ろうなどとともに処方される。
【００５０】
好適なさらなる添加剤は、例えば、界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はデオキシコール酸ナトリウム、さらにポリオール、例えばポリエチレングリコール又はグリセロール、糖類、例えばスクロース又はグルコース、両性イオン化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、又は特にタウリン若しくはベタイン、及び／又はタンパク質、例えばウシ若しくはヒトの血清アルブミンである。界面活性剤、ポリオール及び／又は両性イオン化合物が好ましい。
【００５１】
生理緩衝溶液は、好ましくは、およそ６.０〜８.０、特におよそ６.８〜７.８、特におよそ７.４のｐＨを有し、そして／又はおよそ２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくはおよそ２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの浸透圧モル濃度を有するものである。薬剤のｐＨは、一般的に、好適な有機又は無機の緩衝液を用いて、例えば好ましくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］−エタンスルホン酸）、又はＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調整される。それぞれの緩衝液の選択は、一般的に、所望の緩衝液のモル濃度に左右される。例えばリン酸緩衝液は、注射溶液及び輸液に好適である。
【００５２】
薬剤は、慣用の様式、本発明の薬剤を含む、例えば経口投薬形態、例えば錠剤又はカプセル剤によって、粘膜、例えば鼻又は口腔経由で、皮下に埋め込むデポ製剤（ｄｉｓｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）の形態で、注射、輸液又はゲルによって投与され得るものである。さらに、薬剤を一時的に制御して放出することを可能にする経皮治療システム（ＴＴＳ）によって処置を行うことができる。ＴＴＳは、例えばＥＰ ０ ９４４ ３９８ Ａ１、ＥＰ ０ ９１６ ３３６ Ａ１、ＥＰ ０ ８８９ ７２３ Ａ１又はＥＰ ０ ８５２ ４９３ Ａ１から公知である。
【００５３】
比較的少量の溶液又は懸濁液、例えばおよそ１ｍｌ〜およそ２０ｍｌのみが体に投与されるべき場合には、一般的に注射溶液が用いられる。より大量の溶液又は懸濁液、例えば１リットル以上が投与されるべき場合には、一般的に、輸液が用いられる。輸液とは対照的に、注射溶液の場合は数ミリリットルだけが投与されるため、注射の際の血液又は組織液のｐＨ及び浸透圧のわずかな差は、痛覚に関して、それ自体重要ではないか、又はそれ自体問題にならない程度の重要性しか有さない。従って一般的に、使用前に本発明の処方物を希釈する必要はない。しかし、比較的大量の投与の場合、本発明の処方物は、投与前に、少なくともほぼ等張の溶液が得られるような程度に簡単に希釈されるべきである。等張溶液の例は、０．９％強度の塩化ナトリウム溶液である。輸液の場合、希釈は、例えば滅菌水を用いて行い得るが、その一方、投与は、例えばいわゆるバイパスを介して行い得る。
【００５４】
より好ましい工程は、実施例で個々に又はまとめて述べられており、そして各工程に対する参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
以下の表、配列、実施例及び添付図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する。
【００５６】
配列表の説明
配列番号１は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有するヒトＡＲＫ２タンパク質の核酸配列を示している。
配列番号２は、番号ＡＣ１３５１７８を有するＡＲＫ２の染色体核酸配列の一部を示している。
配列番号３は、ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有する核酸配列に由来するヒトＡＲＫ２のアミノ酸配列を示している。
配列番号４は、第一のプライマー配列ＡＲＫ２−２９８Ｒを示している。
配列番号５は、相補配列の第二のプライマー配列ＡＲＫ２−２９８Ｆを示している。
配列番号６は、ヒトＡＲＫ２遺伝子のＴ９５０Ｔ変異体の核酸配列を示している。
配列番号７は、ヒトＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のアミノ酸配列を示している。
【実施例】
【００５７】
５’−ヌクレアーゼアッセイによるＳＮＰ検出（ＴＡＱＭＡＮTM）
増幅のためのオリゴヌクレオチド（プライマー）：
以下のプライマーを、参照番号ＮＭ＿００４２１７を有するＡＲＫ２配列の９５０位でのＣからＴへのヌクレオチド変換を検出するために使用した：
プライマー１：５’−ＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧ−３’（参照配列ＡＣ１３５１７８のヌクレオチド１７９６０５−１７９５８４；図１Ｂ；配列番号５）；
プライマー２：５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣ−３’（参照配列ＡＣ１３５１７８の塩基１７９５３２−１７９５５３の相補配列；図１Ｂ；配列番号４）。
【００５８】
増幅のためのＰＣＲプロトコル：
使用した試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）のものであった。ＰＣＲ反応を、ＳｕｐｅｒＨｏｔ−Ｍａｓｔｅｒ−Ｍｉｘ（Ｂｉｏｒｏｎ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）２.５μｌ、Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ−Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）０.１２５μｌ、Ｈ2Ｏ ０.３７５μｌ及びＤＮＡ ２μｌを含む総量５μｌで、Ｐｒｉｍｕｓ９６ｐｌｕｓサーマルサイクラー（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。この反応混合物を、鉱油１５μｌで覆った。
【００５９】
ＰＣＲ反応の増幅プログラム：
９４℃で１分間×１サイクル
９２℃で１５秒間×４５サイクル
６０℃で１分間×１サイクル
【００６０】
ＰＣＲ産物の分析
蛍光を、ＦＡＭで標識したプローブ（２９８Ｔｈｒ対立遺伝子；ＡＲＫ２−２９８Ｍ１（Ｔｈｒ）ＦＡＭ−ＴＣＣＣＧＴＧＧＧＣＡＣＧ）については４８５ｎｍ／５２０ｎｍの、及びＶＩＣ標識されたプローブ（２９８Ｍｅｔ対立遺伝子；ＡＲＫ２−２９８Ｖ１（Ｍｅｔ）ＶＩＣ−ＣＴＣＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧ）にについては５３０ｎｍ／５７２ｎｍの、励起／発光フィルタを用いて、ＶＩＣＴＯＲ蛍光プレートリーダー（ＨＶＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）で検出した。データを、ＭＳ−Ｅｘｃｅｌフォーマットでエクスポートし、そして散布図で分析した。
【００６１】
結果
ヒトのグループの特徴
表１は、研究されたヒトのグループの特徴を示している。
【表１】
【００６２】
ＡＲＫ２遺伝子の変異体の頻度及び分布
表２は、研究された患者群における参照配列ＮＭ＿００４２１７の９５０位でのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子変異体の頻度及び分布を示している。
【表２】
【００６３】
ＡＲＫ２の変異体Ｔｈｒ２９８Ｍｅｔの影響
表３は、研究された患者群における、高血圧、冠動脈心疾患（２０％を超える狭窄を伴う）、１を超える心筋梗塞の発生率、及び発作／ＴＩＡ／ＰＲＩＮＤ（ＴＩＡ＝一過性脳虚血発作；ＰＲＩＮＤ＝遷延性可逆性虚血性神経障害）の発生に対するＡＲＫ２の変異体Ｔｈｒ２９８Ｍｅｔの影響を示している。０.０５未満のｐ値は、統計上関連性を有していると考えられる。
【表３】
【００６４】
結果：
ＡＲＫ２−Ｔ９５０Ｔを有する患者は、この９５０位に異なるＡＲＫ２遺伝子型を有する患者と比較して、高血圧及び冠動脈心疾患の発生率、１を超える心筋梗塞、及び発作／ＴＩＡ／ＰＲＩＮＤの発生率が統計上より高いことを示した。
【００６５】
結論：
上記で示される、ＡＲＫ２をコードする遺伝子の遺伝子変異体及び／又はタンパク質ＡＲＫ２との間での統計上の有意な関連性は、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントの発症において、この遺伝子変異体が関与することを明確に示している。従って、この遺伝子変異体は、例えば心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを予測するための生物学的マーカーである。本発見に基づく本発明のさらなる実施態様は、本明細書にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有するヒトＡＲＫ２遺伝子の核酸配列を示している。
【図１Ｂ】番号ＡＣ１３５１７８を有するＡＲＫ２の染色体核酸配列の一部を示している。参照配列ＮＭ＿００４２１７の９５０位に対応するＣからＴへの遺伝的変異を有する遺伝子の区分の増幅に使用されるプライマーに、太字で下線を付している。（ＡＲＫ２−２９８Ｒ＝ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＡＧＴＴＣ；ＡＲＫ２−２９８Ｆ＝ＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧ）
【図２】ＮＣＢＩ番号ＮＭ＿００４２１７を有する核酸配列に由来するヒトＡＲＫ２のアミノ酸配列を示している。ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸に、太字で下線を付している。
【図３】ヒトＡＲＫ２遺伝子のＴ９５０Ｔ変異体の核酸配列を示している。
【図４】ヒトＡＲＫ２のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体のアミノ酸配列を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド、又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸が決定される、心血管系疾患のインビトロ診断方法。
【請求項２】
心血管系疾患が、高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
９５０位のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡのチミジン若しくはｍＲＮＡのウラシルであると決定されるか、又は２９８位のアミノ酸がメチオニンであると決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸が、配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒトＡＲＫ２タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
９５０位のヌクレオチドが、核酸シーケンス法、核酸の質量分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法からなる群より選択される方法によって決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸シーケンス法が、ピロシーケンス及び／又は放射標識性及び／又は蛍光標識性ヌクレオチドを利用したシーケンス法からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション法が、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析及び／又はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション法からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
増幅法が、ＴａｑＭａｎ分析、差異ＲＮＡ発現分析及び／又は発現量差異分析からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
２９８位のアミノ酸配列が、特定のタンパク質の量を測定する方法、及び／又は特定のタンパク質の活性、好ましくはセリン／トレオニンキナーゼ活性を測定する方法からなる群より選択される方法によって決定される、請求項１〜３及び５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定のタンパク質の量が、ウエスタンブロット分析及び／又はＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法によって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
特定のタンパク質の活性が、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞を用いて、インビトロ試験アッセイ及び／又はインビトロ全細胞試験アッセイによって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが、細胞、組織及び／又は体液からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
さらなる工程において、ヒトの心血管系疾患を患うリスクが決定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらなる工程において、適切な医薬品が選択されるか、又は医薬品の投薬量が決定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒトからサンプルを得ること；
（ｂ）サンプルから核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを単離すること；
（ｃ）プライマーを利用して、ＡＲＫ２遺伝子の９５０位を含む特定の領域を増幅すること；
（ｄ）増幅された領域をシーケンスすること；
（ｅ）シーケンスされた領域を分析すること；及び
（ｆ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントのリスクを評価すること
を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プライマーが、配列番号４及び／又は配列番号５から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者から、サンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）ＡＲＫ２タンパク質をサンプルから単離すること；
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定すること；及び
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントのリスクを評価すること
を含む、請求項１〜４、６〜９又は１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで決定すること、及び
（ｂ）上記ヒトが心血管系疾患を発症するリスクを予測するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となる、ヒトが心血管系疾患を患うリスクを決定する方法。
【請求項２０】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで測定すること、及び
（ｂ）上記ヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定するか、又は治療処置の有効性を決定すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を有するヒトについて、薬学的に活性な化合物が選択されるか及び／又は薬学的に活性な化合物の投薬量及び／又は治療処置の有効性が決定される、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは血栓イベントを患うヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定する方法、又は心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは血栓イベントの治療処置の有効性を決定する方法。
【請求項２１】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで測定すること、及び
（ｂ）上記ヒトを同定するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となる、心血管系疾患に対するリスクが増大したヒトを同定する方法。
【請求項２２】
心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置する薬剤を製造するための、配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質若しくはアミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸配列の使用。
【請求項２３】
変異体が、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
次の工程：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、アミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸を提供すること、
（ｂ）試験化合物を提供すること、
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体又は対応する核酸に対する試験化合物の影響を決定又は検出すること、並びに
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントの処置に好適な化合物を単離すること
を含む、心血管系疾患を処置するための薬学的に活性な因子をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
変異体が、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試験化合物が、化学化合物ライブラリの形態で提供される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体又は対応する核酸に対する試験化合物の影響が、ヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイにおいて決定又は検出される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ヘテロジニアスアッセイが、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＤＥＬＦＩＡ（分離強化型ランタニド蛍光免疫測定法）、ＳＰＡ（シンチレーション近接度測定法）又はフラッシュプレートアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ホモジニアスアッセイが、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移）アッセイ、ＦＰ（蛍光偏光）アッセイ、ＡＬＰＨＡ（増幅型ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ）、ＥＦＣ（酵素断片相補性）アッセイ又は遺伝子アッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
アレイ上で行われる、請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
全細胞を使用して行われる、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ロボットシステムで行われる、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
微小流体制御技術を使用して行われる、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ハイスループットスクリーニングの方法である、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
次の工程：
（ａ）請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法を行うこと、及び
（ｂ）単離された化合物を、１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能な担体又は補助剤とともに製剤化すること
を含む、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置するための薬剤の製造方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、又は実施例を含む明細書に記載されるいずれかの主題。
【請求項１】
ヒトサンプル中のヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸の９５０位のヌクレオチド、又はヒトＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸が決定される、心血管系疾患のインビトロ診断方法。
【請求項２】
心血管系疾患が、高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
９５０位のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡのチミジン若しくはｍＲＮＡのウラシルであると決定されるか、又は２９８位のアミノ酸がメチオニンであると決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＡＲＫ２タンパク質をコードする核酸が、配列番号６のヌクレオチド配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒトＡＲＫ２タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
９５０位のヌクレオチドが、核酸シーケンス法、核酸の質量分析、ハイブリダイゼーション法及び／又は増幅法からなる群より選択される方法によって決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸シーケンス法が、ピロシーケンス及び／又は放射標識性及び／又は蛍光標識性ヌクレオチドを利用したシーケンス法からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション法が、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析及び／又はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーション法からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
増幅法が、ＴａｑＭａｎ分析、差異ＲＮＡ発現分析及び／又は発現量差異分析からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
２９８位のアミノ酸配列が、特定のタンパク質の量を測定する方法、及び／又は特定のタンパク質の活性、好ましくはセリン／トレオニンキナーゼ活性を測定する方法からなる群より選択される方法によって決定される、請求項１〜３及び５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定のタンパク質の量が、ウエスタンブロット分析及び／又はＥＬＩＳＡからなる群より選択される方法によって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
特定のタンパク質の活性が、ヒト細胞、動物細胞、細菌細胞又は酵母細胞を用いて、インビトロ試験アッセイ及び／又はインビトロ全細胞試験アッセイによって測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが、細胞、組織及び／又は体液からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
さらなる工程において、ヒトの心血管系疾患を患うリスクが決定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
さらなる工程において、適切な医薬品が選択されるか、又は医薬品の投薬量が決定される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒトからサンプルを得ること；
（ｂ）サンプルから核酸プローブ、特にＤＮＡプローブを単離すること；
（ｃ）プライマーを利用して、ＡＲＫ２遺伝子の９５０位を含む特定の領域を増幅すること；
（ｄ）増幅された領域をシーケンスすること；
（ｅ）シーケンスされた領域を分析すること；及び
（ｆ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントのリスクを評価すること
を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
プライマーが、配列番号４及び／又は配列番号５から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
次の工程：
（ａ）場合により、検査されるヒト又は患者から、サンプル、特に細胞、組織、体液、血液の細胞成分、内皮細胞又は平滑筋細胞を得ること；
（ｂ）ＡＲＫ２タンパク質をサンプルから単離すること；
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質の２９８位のアミノ酸を決定すること；及び
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントのリスクを評価すること
を含む、請求項１〜４、６〜９又は１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで決定すること、及び
（ｂ）上記ヒトが心血管系疾患を発症するリスクを予測するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となる、ヒトが心血管系疾患を患うリスクを決定する方法。
【請求項２０】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで測定すること、及び
（ｂ）上記ヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定するか、又は治療処置の有効性を決定すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を有するヒトについて、薬学的に活性な化合物が選択されるか及び／又は薬学的に活性な化合物の投薬量及び／又は治療処置の有効性が決定される、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは血栓イベントを患うヒトに対して、薬学的に活性な化合物を選択するか若しくは薬学的に活性な化合物の投薬量を決定する方法、又は心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／若しくは血栓イベントの治療処置の有効性を決定する方法。
【請求項２１】
次の工程：
（ａ）ヒトのＡＲＫ２遺伝子の遺伝子型をインビトロで測定すること、及び
（ｂ）上記ヒトを同定するために、（ａ）で得られたデータを変換すること
を含み、
ＡＲＫ２ Ｍｅｔ２９８Ｍｅｔ変異を検出することが、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は血栓イベントを発症するリスクが増大することの指標となる、心血管系疾患に対するリスクが増大したヒトを同定する方法。
【請求項２２】
心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置する薬剤を製造するための、配列番号３のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質若しくはアミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸配列の使用。
【請求項２３】
変異体が、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
次の工程：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＡＲＫ２タンパク質、アミノ酸２９８位でのＡＲＫ２変異体、及び／又はＡＲＫ２タンパク質若しくはその変異体をコードする対応する核酸を提供すること、
（ｂ）試験化合物を提供すること、
（ｃ）ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体又は対応する核酸に対する試験化合物の影響を決定又は検出すること、並びに
（ｄ）心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントの処置に好適な化合物を単離すること
を含む、心血管系疾患を処置するための薬学的に活性な因子をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
変異体が、配列番号７のＡＲＫ２タンパク質のＭｅｔ２９８Ｍｅｔ変異体、又は配列番号６のＡＲＫ２核酸のＴ９５０Ｔ変異体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試験化合物が、化学化合物ライブラリの形態で提供される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＡＲＫ２タンパク質若しくはＡＲＫ２変異体又は対応する核酸に対する試験化合物の影響が、ヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイにおいて決定又は検出される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ヘテロジニアスアッセイが、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＤＥＬＦＩＡ（分離強化型ランタニド蛍光免疫測定法）、ＳＰＡ（シンチレーション近接度測定法）又はフラッシュプレートアッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ホモジニアスアッセイが、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移）アッセイ、ＦＰ（蛍光偏光）アッセイ、ＡＬＰＨＡ（増幅型ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ）、ＥＦＣ（酵素断片相補性）アッセイ又は遺伝子アッセイである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
アレイ上で行われる、請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
全細胞を使用して行われる、請求項２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ロボットシステムで行われる、請求項２４〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
微小流体制御技術を使用して行われる、請求項２４〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ハイスループットスクリーニングの方法である、請求項２４〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
次の工程：
（ａ）請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法を行うこと、及び
（ｂ）単離された化合物を、１つ又はそれ以上の薬学的に受容可能な担体又は補助剤とともに製剤化すること
を含む、心血管系疾患、特に高血圧、狭窄、血管閉塞及び／又は他の血栓イベントを処置するための薬剤の製造方法。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、又は実施例を含む明細書に記載されるいずれかの主題。
【公表番号】特表２００９−５１８０１８（Ｐ２００９−５１８０１８Ａ）
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４３６８８（Ｐ２００８−５４３６８８）
【出願日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５５６２
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（３９９０５０９０９）サノフィ−アベンティス (225)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２３日（２００６．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０１１２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６５５６２
【国際公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【出願人】（３９９０５０９０９）サノフィ−アベンティス (225)
【Ｆターム（参考）】
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