急性腎不全を診断するためのプロセス及びマーカー
本発明は、急性腎不全の診断方法であって、サンプル中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程を含み、ポリペプチドマーカーが表１中で分子量及び移動時間の値により特徴付けられているマーカーに含まれる、前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は急性腎不全の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全は腎機能の急激な低下を特徴とする。腎機能が急激に失われる原因としては、腎組織への酸素供給の異常、傷害又は手術による液体の減少、敗血症の存在、又は薬物過敏症が含まれる（非特許文献１〜３）。これらの全ての場合において、近位尿細管細胞にダメージがあり、その過程で細胞がムコタンパク質の円柱を形成する。次いで、これらの円柱による閉塞により、腎機能が失われる（非特許文献４）。
【０００３】
非特許文献５では、集中治療室の患者の３０％が直接的又は間接的に急性腎不全に冒されることを証明するデータが得られている。腎機能の回復についての予後が良好であっても、患者が容積置換（ｖｏｌｕｍｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び薬物療法の併用に反応すると、急性腎不全により、集中治療室で発生する全事例の２８〜９０％が、重症感染症若しくは敗血症の発症又は多臓器不全の結果、死亡する（非特許文献６）。
【０００４】
急性腎不全は血清クレアチニンの増加を介して後期にしか検出できない（非特許文献７及び８）。予防介入の利点を利用できるようにするために、近年、臨床症状が現れる前でも急性腎不全の信頼できる診断を可能にする診断マーカーを同定しようとする努力がなされてきた（非特許文献９）。最も有望なバイオマーカー候補には以下のものが含まれる：好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ｋｉｄｎｅｙ−ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコアミニダーゼ、インターロイキン−１８、及びシスタチンＣ（非特許文献１０）。しかし、急性腎不全は多くの異なる症状を発現するため、これらのマーカーによる疾患のマッピングも十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lameire et al., Lancet, 2005, Vol. 365, pages 417-430
【非特許文献２】Schrier and Wang, N Engl J Med, 2004, Vol. 351, pages 159-169
【非特許文献３】Thadhani et al., N Engl J Med, 1996, Vol. 334, pages 1448-1460
【非特許文献４】Patel et al., Lancet, 1964, Vol. 29, pages 457-461
【非特許文献５】Alkhunaizi et al., Am J Kidney Dis, 1996, Vol. 28, pages 315-328
【非特許文献６】Metnitz et al., Crit Care Med, 2002, Vol. 30, pages 2051-2058
【非特許文献７】Herget-Rosenthal, Lancet, 2005, Vol. 365, pages 1205-1206
【非特許文献８】Mehta et al., Crit Care, 2007, Vol. 11, R31
【非特許文献９】Vaidya et al., Clin Transl Sci, 2008, Vol. 1, pages 200-208
【非特許文献１０】Nguyen, Pediatr Nephrol, 2008, Vol. 23, pages 2151-2157
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、急性腎不全の早期診断のためのプロセス及び手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、尿サンプル中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程を含む急性腎不全の診断プロセスであって、ポリペプチドマーカーが、表１中で分子量及び移動時間の値により特徴付けられているマーカーから選択される、前記プロセスにより達成される。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】
これらのペプチドのほとんどのアミノ酸配列は公知であり、関連する前駆体タンパク質と共に表２に示されている。
【００１１】
【表３】
【００１２】
【表４】
【００１３】
測定されたマーカーの有無の評価は表３に示した参照値に基づいて行うことができる。
【００１４】
【表５】
【００１５】
【表６】
【００１６】
測定されたポリペプチドの評価は、以下の制限事項を考慮してマーカーの有無又は振幅（amplitude）に基づいて行うことができる。
【００１７】
特異性は、真陰性サンプルの数を真陰性サンプルと擬陽性サンプルの数の和で割ったものとして定義される。特異性１００％とは、試験が全健常者を健常であると認識すること、すなわち健常対象者が一人も病気であると判定されないことを意味する。このことは、試験が病気患者をどれだけ確実に認識するかについては何も示さない。
【００１８】
感度は、真陽性サンプルの数を真陽性サンプルと偽陰性サンプルの数の和で割ったものとして定義される。感度１００％とは、試験が全ての病人を認識することを意味する。このことは、試験が健常患者をどれだけ確実に認識するかについては何も示さない。
【００１９】
本発明に係るマーカーにより、急性腎不全について少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の特異性を実現することができる。
【００２０】
本発明に係るマーカーにより、急性腎不全について少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の感度を実現することができる。
【００２１】
移動時間は、例えば実施例の第２項に記載されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により決定される。本実施例では、長さ９０ｃｍ、内径（ＩＤ）５０μｍ、外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーを３０ｋＶの印加電圧で使用している。移動相溶媒（ｍｏｂｉｌｅ ｓｏｌｖｅｎｔ）として、例えば、３０％メタノール、０．５％ギ酸の水溶液を使用する。
【００２２】
ＣＥの移動時間は変わり得ることが知られている。しかし、使用する各ＣＥシステムについて記載の条件下でポリペプチドマーカーが溶出される順番は通常同じである。それでも起こり得る移動時間の差のバランスをとるために、移動時間が正確に分かっている標準を用いてシステムを正規化することができる。これらの標準は、例えば実施例中に記載されているポリペプチドであり得る（実施例の第３項参照）。ＣＥ時間の変動は、個々の測定間では比較的小さく、通常、±２分以内、好ましくは±１分以内、より好ましくは±０．５分、更により好ましくは±０．２分、又は０．１分である。
【００２３】
表１〜４に示したポリペプチドの特徴は、例えばNeuhoff et al.（Rapid communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156）に詳細が記載されているキャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）を用いて決定した。個々の測定間又は異なる質量分析装置間の分子量の変動は、較正が正確である場合、比較的小さく、通常±０．１％以内、好ましくは±０．０５％以内、より好ましくは±０．０３％、更により好ましくは±０．０１％、又は±０．００５％である。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドマーカーは、タンパク質若しくはペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの分解産物である。これらは、例えばグリコシル化、リン酸化、アルキル化、ジスルフィドブリッジ等の翻訳後修飾により、あるいは例えば分解の範疇にある他の反応により、化学的に修飾され得る。更に、ポリペプチドマーカーは、サンプル精製過程で、例えば酸化される等により、化学的に変化させられてもよい。
【００２５】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量及び移動時間）から進めて、先行技術で公知の方法により対応するポリペプチドの配列を同定することができる。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドは急性腎不全の診断に使用される。
【００２７】
「診断」とは、症状又は現象を疾患又は傷害に対応付けることにより情報を得る（knowledge gaining）プロセスを意味する。本発明では、特定のポリペプチドマーカーの有無は鑑別診断（differential diagnosis）にも使用される。ポリペプチドマーカーの有無は先行技術で公知の任意の方法により測定することができる。使用され得る方法を以下に例示する。
【００２８】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ大きさである場合に、存在すると見なされる。測定値がそれよりも低い場合、ポリペプチドマーカーは存在しないと見なされる。閾値は、測定方法の感度（検出限界）により決定するか経験から定義することができる。
【００２９】
本発明では、好ましくは、特定の分子量についてサンプルの測定値がブランクサンプル（例えばバッファー又は溶媒のみ）の測定値の少なくとも２倍の大きさである場合に閾値を超えたと見なす。
【００３０】
ポリペプチドマーカーは、その有無が測定されるように使用され、この有無が急性腎不全の早期診断の指標となる。したがって、慢性腎疾患患者の体内には通常存在するが、急性腎不全を有さない対象の体内では発生しない又は発生頻度が少ないポリペプチドマーカーがある。更に、急性腎不全を有する対象の体内には存在するが、慢性腎疾患を有する対象の体内では発生しない又は発生頻度が低いポリペプチドマーカーがある。
【００３１】
頻度マーカー（有無の決定）に加えて、又はその代わりに、振幅マーカー（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｍａｒｋｅｒ）も診断に使用され得る。振幅マーカーは、有無が重要ではなく、シグナルが両方の群に存在する場合にシグナルの高さ（振幅）が決定的な意味をもつように使用される。測定した全サンプルに対して平均化した（質量及び移動時間により特徴付けられている）対応するシグナルの平均振幅を表中に記載した。濃縮のされ方が異なるサンプル間又は異なる測定法間での比較可能性を得るためには、２つの正規化方法が可能である。第１のアプローチでは、サンプルの全ペプチドシグナルを、１００万回分の計測の合計振幅に対して正規化する。したがって、個々のマーカーのそれぞれの平均振幅は１００万分率（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ：ｐｐｍ）として表される。
【００３２】
更に、別の正規化方法により更なる振幅マーカーを定義することができる。この場合、共通する正規化因子を用いて１サンプルの全ペプチドシグナルを評価する。したがって、個々のサンプルのペプチド振幅と既知の全ポリペプチドの参照値との間で線形回帰が形成される。この回帰直線の勾配はちょうど相対濃度に相当し、このサンプルの正規化因子として使用される。
【００３３】
診断の決定は、患者サンプル中の各ポリペプチドマーカーの振幅が対照群又は「病気」群の平均振幅と比較してどれだけ大きいかによってなされる。値が「病気」群の平均振幅に近ければ、急性腎不全が存在すると見なされ、どちらかというと対照群の平均振幅に相当する場合、急性腎不全が存在しないと見なされる。平均振幅からの距離をサンプルが特定の群に属する確率（probability）と解釈することができる。
【００３４】
頻度マーカーは、一部のサンプル中で振幅が低い振幅マーカーのバリアントである。マーカーが見出されない対応するサンプルを検出限界とほぼ同程度の非常に小さい振幅で振幅の計算に含めることでそのような頻度マーカーを振幅マーカーに変換することができる。
【００３５】
１又は複数のポリペプチドマーカーの有無を決定するサンプルが由来する対象は、急性腎不全に罹り得る任意の対象であり得る。好ましくは、対象は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、３つのポリペプチドマーカーだけでなく、より大きな、マーカーの組合せが使用される。複数のポリペプチドマーカーを比較することにより、その個体での典型的な存在確率からの少数の個々の逸脱による全体的結果におけるバイアスを低減又は回避することができる。
【００３７】
本発明に係るペプチドマーカーの有無を測定するサンプルは、対象の体から得られる任意のサンプルであり得る。サンプルは、対象の状態についての情報を提供するのに適したポリペプチド組成物を有するサンプルであり、例えば、血液、尿、滑液、組織液、身体分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ液、腸液、胃液、膵液、胆汁、涙液、組織サンプル、精液、膣液、又は排泄物サンプルであり得る。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。
【００３８】
好ましい実施形態では、サンプルは尿サンプルである。
【００３９】
尿サンプルは先行技術で選好される形で採取することができる。好ましくは、本発明では中間尿サンプルが使用される。例えば、尿サンプルは、カテーテルを用いて採取されてもよく、国際公開第０１／７４２７５号に記載されているように排尿装置を用いて採取されてもよい。
【００４０】
サンプル中のポリペプチドマーカーの有無は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術中に公知の任意の方法により決定され得る。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの有無は、質量分析法等の直接的方法又は例えばリガンドの利用等の間接的方法により決定することができる。
【００４１】
必要であれば、又は所望であれば、対象由来のサンプル、例えば尿サンプルは、ポリペプチドマーカーの有無を測定する前に、任意の好適な手段で前処理されてよく、例えば精製又は分離されてよい。処理には、例えば精製、分離、希釈、又は濃縮が含まれ得る。方法は、例えば、遠心、ろ過、限外ろ過、透析、沈殿、又はクロマトグラフィー的方法、例えばアフィニティー分離若しくはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分離、又は電気泳動的分離であり得る。その特定の例として、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンに基づくアフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相及び逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィー、並びに表面への選択的結合が挙げられる。これらの方法は全て当業者に周知であり、当業者は、使用するサンプル及びポリペプチドマーカーの有無を決定する方法に応じた方法を選択することができる。
【００４２】
サブサンプルとは、互いに異なる複数の部分にサンプルが分離されたことを意味する。簡単な形態では、これは例えば、サンプルの大きい成分と小さい成分を２つのサブサンプルに分離する膜ろ過であり得る。
【００４３】
別の実施形態では、これはサンプルを複数のサブサンプル（「画分」）に分離するクロマトグラフィー的分離であり得る。
【００４４】
本発明の一実施形態では、サンプルは測定前に、電気泳動による分離、超遠心による精製、及び／又は限外ろ過により、特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分に分けられる。
【００４５】
好ましくは、質量分析法を用いてポリペプチドマーカーの有無が決定され、サンプルの精製又は分離はそのような方法の上流（upstream）で行われ得る。現行の方法と比べて、質量分析は１回の分析でサンプル中の多数（＞１００）のポリペプチドの濃度を決定できるという利点がある。任意の種類の質量分析装置が使用され得る。質量分析法を用いて、通例、複合混合物中で約±０．０１％の測定精度で１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち１０ｋＤのタンパク質０．１ｎｇを測定することができる。質量分析装置中、イオン源（ｉｏｎ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）は好適な分析デバイスに連結されている。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースは主に液体サンプル中のイオンを測定するために使用され、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）技術はマトリックス中で結晶化したサンプルからのイオンを測定するために使用される。形成されたイオンを分析するために、例えば、四重極、イオントラップ、又は飛行時間型（ＴＯＦ）分析装置が使用され得る。
【００４６】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、とりわけ、高電圧の影響下（例えば１〜８ｋＶ）で、噴霧化され、帯電液滴を形成し、溶媒の蒸発により更に小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発により自由イオンが形成され、これを分析及び検出することができる。
【００４７】
ＴＯＦを用いたイオン分析では、特定の加速電圧が印加されて等量の運動エネルギーがイオンに付与される。その後、各イオンが飛行チューブ（ｆｌｙｉｎｇ ｔｕｂｅ）を通って特定のドリフト距離を移動するのにかかる時間を非常に正確に測定する。等量の運動エネルギーではイオンの速度は質量に依存するので、質量を決定することができる。ＴＯＦ分析装置は非常に走査速度が速いので、良好な解像度が得られる。
【００４８】
ポリペプチドマーカーの有無の決定に好ましい方法としては、気相イオンスペクトロメトリー（ｇａｓ−ｐｈａｓｅ ｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、例えばレーザー脱離／イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析法）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ、及びキャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）が含まれる。記載の方法は全て当業者に公知である。
【００４９】
特に好ましい方法は、キャピラリー電気泳動が質量分析法と連結されたＣＥ−ＭＳである。この方法は、例えば独国特許出願第１００２１７３７号、Kaiser et al.（J. Chromatogr A, 2003, Vol. 1013: 157-171及びElectrophoresis, 2004, 25: 2044-2055）、及びWittke et al.（J. Chromatogr. A, 2003, 1013: 173-181）に幾分詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術を用いることで、サンプルの数百個のポリペプチドマーカーの存在を少ない体積で同時に短時間且つ高感度で決定することができる。サンプルを測定した後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンを作製し、このパターンを病気対象者又は健常対象者の参照パターンと比較することができる。ほとんどの場合、ＵＡＳの診断には限られた数のポリペプチドマーカーを使用すれば十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法が更に好ましい。
【００５０】
ＣＥ−ＭＳでは、揮発性溶媒の使用が好ましく、本質的に塩を含まない条件下で行われるのが最も好ましい。好適な溶媒の例としてはアセトニトリル、メタノール等が挙げられる。分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために、溶媒を水又は酸（例えば０．１〜１％のギ酸）で希釈してもよい。
【００５１】
キャピラリー電気泳動を用いることで、分子の電荷及びサイズに従って分子を分離することができる。電流を印加すると中性粒子は電気浸透流と同じ速度で移動し、一方、陽イオンは陰極に向かって加速され、陰イオンは遅れる。電気泳動におけるキャピラリーの利点は、表面と体積の比率が好ましいことであり、これにより、電流フロー中に発生するジュール熱の良好な放散が可能になる。そのため、高電圧（通常３０ｋＶまで）を印加することが可能になるので、高い分離性能及び短時間の分析が可能になる。
【００５２】
キャピラリー電気泳動では通常、内径が典型的には５０〜７５μｍの石英ガラスキャピラリーが使用される。長さは３０〜１００ｃｍのものが使用される。更に、キャピラリーは通常、プラスチックコートされた石英ガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内面に親水性基が露出していてもよく、内面がコートされていてもよい。疎水性コーティングを用いて分解能を向上させてもよい。電圧に加えて、圧力も印加され得、圧力は通常０〜１ｐｓｉの範囲内である。圧力は、分離の間だけ印加されてもよく、その間に変化させてもよい。
【００５３】
ポリペプチドマーカーの好ましい測定方法では、サンプルのマーカーは、キャピラリー電気泳動により分離された後、直接イオン化され、連結された質量分析装置にオンラインで送られて検出される。
【００５４】
本発明に係る方法では、複数のポリペプチドマーカーを診断に使用することが有益である。
【００５５】
少なくとも５、６、８、又は１０個のマーカーの使用が好ましい。
【００５６】
一実施形態では、２０〜５０個のマーカーが使用される。
【００５７】
好ましくは、前記マーカーは、表１による以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、７４０６、１６８３２、１７７９２、１８１６８、２０７４９、２１２０３、２２２８２、２６０４２、２６８９１、２７５１７、２７７９６、２８７０２、３０７３３、３８８７９、４１８３３、４３６８６、５３２１６、５６８８４、５７５３１、６１５７３、６４２５６、７０４１３、７４１８７、８９３２５、９２６９８、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０２３９２、１０６１９５、１１５４９１、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００５８】
更により好ましくは、前記マーカーは、表１による以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、７４０６、１６８３２、１７７９２、１８１６８、２０７４９、２１２０３、２２２８２、２６０４２、２６８９１、２７７９６、２８７０２、４１８３３、４３６８６、５６８８４、６１５７３、８２０９４、８９３２５、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００５９】
一実施形態では、前記マーカー又はマーカーのサブグループは、以下の数字により特定されるように選択される：
２５０５、５９１３、１４９０６、１６８３２、２０７４９、２７５１７、２８５６１、３０１７４、３０７３３、３８８７９、４０８６４、４１８３３、４２５９４、４６８８０、５０００８、５１１２０、５２１００、５３２１６、５３９５７、５５１４３、５６８８４、５７５３１、５８９５４、６１５７３、６３８７７、６４０８７、６４２５６、６７６３２、７０４１３、７４１８７、８２０９４、８４１９２、８７７２４、８９３２５、９０８４０、９２６９８、９６３７０、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０１８８８、１０２３９２、１０３４９３、１０６１９５、１１５４９１、１２１７７５、１２２４００、１２３６７１、１２４８８６、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６０】
別の実施形態では、以下のタンパク質ＩＤのマーカーを使用する：
５９１３、１６８３２、２０７４９、２７５１７、３０７３３、３８８７９、４１８３３、５３２１６、５６８８４、５７５３１、６１５７３、６４２５６、７０４１３、７４１８７、８９３２５、９２６９８、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０２３９２、１０６１９５、１１５４９１、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６１】
別の実施形態では、マーカーは、以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、１６８３２、２０７４９、４１８３３、５６８８４、６１５７３、８２０９４、８９３２５、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６２】
複数のマーカーを使用した場合に疾患が存在する確率を決定するために、当業者に公知の統計方法が使用され得る。例えば、Weissinger et al.（Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434）に記載されているＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ法が、同文献に記載されているように、Ｓ−Ｐｌｕｓ等のコンピュータプログラム又はサポートベクターマシーンを用いて使用され得る。
【実施例】
【００６３】
１．サンプル調製
診断用のポリペプチドマーカーを検出するために、尿を使用した。尿は健常ドナー（対照群）及び腎疾患に罹患している患者から採取した。
【００６４】
その後のＣＥ−ＭＳ測定に、これも患者の尿に高濃度で含まれるタンパク質であるアルブミン、免疫グロブリン等を限外ろ過により分離する必要があった。そのため、７００μｌの尿を採取し、７００μｌのろ過バッファー（２Ｍ尿素、１０ｍＭアンモニア、０．０２％ＳＤＳ）と混合した。この体積１．４ｍｌのサンプルを限外ろ過した（ドイツ、ゲッティンゲンのザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、２０ｋＤａ）。限外ろ過は遠心機を用いて３０００ｒｐｍで行い、１．１ｍｌの限外ろ液を得た。
【００６５】
次いで、得られた１．１ｍｌのろ液をＰＤ１０カラム（スウェーデン、ウプサラのアマシャム・バイオサイエンス社製）にアプライし、０．０１％のＮＨ４ＯＨ２．５ｍｌに対して脱塩し、凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、その後、ポリペプチドを２０μｌの水（ＨＰＬＣグレード、メルク社製）に再懸濁した。
【００６６】
２．ＣＥ−ＭＳ測定
ベックマン・コールター社製のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｓｙｓｔｅｍ；米国カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社製）及びブルカー社製ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置（マイクロ−ＴＯＦ ＭＳ；ドイツ、ブレーメンのブルカー・ダルトニク社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）製）を用いて、ＣＥ−ＭＳ測定を行った。
【００６７】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社により供給されたものであり、ＩＤ／ＯＤが５０／３６０μｍ、長さが９０ｃｍであった。ＣＥ分離用の移動相は２０％アセトニトリル及び０．２５％ギ酸の水溶液からなる。ＭＳ上での「シースフロー（ｓｈｅａｔｈ ｆｌｏｗ）」には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールを用い、流量は２μｌ／ｍｉｎとした。ＣＥとＭＳの連結は、ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳ Ｓｐｒａｙｅｒ Ｋｉｔ（ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ）のアジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）によりなされた。
【００６８】
サンプルの注入には、１ｐｓｉから最大６ｐｓｉの圧力を印加し、注入期間は９９秒とした。これらのパラメータを用いて、約１５０ｎｌのサンプルをキャピラリーに注入した。これはキャピラリー容積の約１０％に相当する。スタッキング技術を用いてキャピラリー中でサンプルを濃縮した。そのため、サンプルを注入する前に、１ＭのＮＨ３溶液を７秒間（１ｐｓｉで）注入し、サンプル注入後に２Ｍのギ酸溶液を５秒間注入した。分離電圧（３０ｋＶ）を印加した時、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００６９】
その後のＣＥ分離は、圧力法（０ｐｓｉで４０分、０．１ｐｓｉで２分、０．２ｐｓｉで２分、０．３ｐｓｉで２分、０．４ｐｓｉで２分、最後に０．５ｐｓｉで３２分）を用いて行った。したがって、分離ランの合計時間は８０分間であった。
【００７０】
ＭＳ側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、噴霧ガスを可能な最も低い値にした。エレクトロスプレーを生成するためにスプレーニードルに印加した電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析装置の残りの設定はメーカーの取扱説明書に従いペプチド検出に最適化した。スペクトルをｍ／ｚ４００〜ｍ／ｚ３０００の質量範囲で記録し、３秒ごとに蓄積した。
【００７１】
３．ＣＥ測定用の標準
ＣＥ測定のチェック及び標準化のために、選択した条件下での記載のＣＥ移動時間により特徴付けられる以下のタンパク質又はポリペプチドを使用した。
【００７２】
【表７】
【００７３】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれの水中濃度１０ｐｍｏｌ／μｌで使用した。「ＲＥＶ」、「ＥＬＭ」、「ＫＩＮＣＯＮ」、及び「ＧＩＶＬＹ」は合成ペプチドである。
【００７４】
原則的に、キャピラリー電気泳動による分離において移動時間にわずかなばらつきが生じ得ることは当業者に公知である。しかし、記載の条件下では、移動の順番は変わらない。記載の質量及びＣＥ時間を知っている当業者であれば、自身の測定値を本発明に係るポリペプチドマーカーに問題なく帰属（assign）させることができる。例えば以下のように進められ得る：最初に、測定中に見つかったポリペプチドの１つを選択し（ペプチド１）、記載のＣＥ時間の時間枠内（例えば±５分）に１又は複数の同じ質量を見つけることを試みる。この間隔中に同じ質量が１つだけが見つかれば、帰属は完了する。一致する質量が複数見つかる場合、まだ帰属（assignment）についての決定をなす必要がある。したがって、測定から別のペプチド（ペプチド２）を選択し、再度対応する時間枠を考慮して適切なポリペプチドマーカーを同定することを試みる。
【００７５】
ここでも、対応する質量で複数のマーカーが見つけられる場合、最も可能性の高い帰属は、ペプチド１のシフトとペプチド２のシフトの間に実質的に線形な関係がある帰属である。
【００７６】
帰属問題の複雑さに応じて、当業者には、帰属のためにサンプルから更なるタンパク質（例えば１０個のタンパク質）を必要に応じて使用することが示唆される。典型的には、移動時間が特定の絶対値分だけ長くなるか短くなり、あるいは過程全体が短縮又は延長される。しかし、一緒に移動するペプチドはそのような条件下でも一緒に移動する（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）。
【００７７】
更に、当業者は、Zuerbig et al.（Electrophoresis 27 (2006), pp. 2111-2125）に記載されている移動パターンを利用することができる。簡単なダイアグラムを用いて（例えばＭＳ Ｅｘｃｅｌを用いて）ｍ／ｚ対移動時間の形で測定値をプロットすることにより、記載されている線パターンを可視化することもできる。これにより、線を数えることで個々のポリペプチドを容易に帰属することができる。
【００７８】
その他の帰属方法も可能である。基本的に、当業者は、ＣＥ測定値を帰属するための内部標準として上記のペプチドを使用することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は急性腎不全の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全は腎機能の急激な低下を特徴とする。腎機能が急激に失われる原因としては、腎組織への酸素供給の異常、傷害又は手術による液体の減少、敗血症の存在、又は薬物過敏症が含まれる（非特許文献１〜３）。これらの全ての場合において、近位尿細管細胞にダメージがあり、その過程で細胞がムコタンパク質の円柱を形成する。次いで、これらの円柱による閉塞により、腎機能が失われる（非特許文献４）。
【０００３】
非特許文献５では、集中治療室の患者の３０％が直接的又は間接的に急性腎不全に冒されることを証明するデータが得られている。腎機能の回復についての予後が良好であっても、患者が容積置換（ｖｏｌｕｍｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び薬物療法の併用に反応すると、急性腎不全により、集中治療室で発生する全事例の２８〜９０％が、重症感染症若しくは敗血症の発症又は多臓器不全の結果、死亡する（非特許文献６）。
【０００４】
急性腎不全は血清クレアチニンの増加を介して後期にしか検出できない（非特許文献７及び８）。予防介入の利点を利用できるようにするために、近年、臨床症状が現れる前でも急性腎不全の信頼できる診断を可能にする診断マーカーを同定しようとする努力がなされてきた（非特許文献９）。最も有望なバイオマーカー候補には以下のものが含まれる：好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ｋｉｄｎｅｙ−ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコアミニダーゼ、インターロイキン−１８、及びシスタチンＣ（非特許文献１０）。しかし、急性腎不全は多くの異なる症状を発現するため、これらのマーカーによる疾患のマッピングも十分ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lameire et al., Lancet, 2005, Vol. 365, pages 417-430
【非特許文献２】Schrier and Wang, N Engl J Med, 2004, Vol. 351, pages 159-169
【非特許文献３】Thadhani et al., N Engl J Med, 1996, Vol. 334, pages 1448-1460
【非特許文献４】Patel et al., Lancet, 1964, Vol. 29, pages 457-461
【非特許文献５】Alkhunaizi et al., Am J Kidney Dis, 1996, Vol. 28, pages 315-328
【非特許文献６】Metnitz et al., Crit Care Med, 2002, Vol. 30, pages 2051-2058
【非特許文献７】Herget-Rosenthal, Lancet, 2005, Vol. 365, pages 1205-1206
【非特許文献８】Mehta et al., Crit Care, 2007, Vol. 11, R31
【非特許文献９】Vaidya et al., Clin Transl Sci, 2008, Vol. 1, pages 200-208
【非特許文献１０】Nguyen, Pediatr Nephrol, 2008, Vol. 23, pages 2151-2157
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、急性腎不全の早期診断のためのプロセス及び手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、尿サンプル中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程を含む急性腎不全の診断プロセスであって、ポリペプチドマーカーが、表１中で分子量及び移動時間の値により特徴付けられているマーカーから選択される、前記プロセスにより達成される。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】
これらのペプチドのほとんどのアミノ酸配列は公知であり、関連する前駆体タンパク質と共に表２に示されている。
【００１１】
【表３】
【００１２】
【表４】
【００１３】
測定されたマーカーの有無の評価は表３に示した参照値に基づいて行うことができる。
【００１４】
【表５】
【００１５】
【表６】
【００１６】
測定されたポリペプチドの評価は、以下の制限事項を考慮してマーカーの有無又は振幅（amplitude）に基づいて行うことができる。
【００１７】
特異性は、真陰性サンプルの数を真陰性サンプルと擬陽性サンプルの数の和で割ったものとして定義される。特異性１００％とは、試験が全健常者を健常であると認識すること、すなわち健常対象者が一人も病気であると判定されないことを意味する。このことは、試験が病気患者をどれだけ確実に認識するかについては何も示さない。
【００１８】
感度は、真陽性サンプルの数を真陽性サンプルと偽陰性サンプルの数の和で割ったものとして定義される。感度１００％とは、試験が全ての病人を認識することを意味する。このことは、試験が健常患者をどれだけ確実に認識するかについては何も示さない。
【００１９】
本発明に係るマーカーにより、急性腎不全について少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の特異性を実現することができる。
【００２０】
本発明に係るマーカーにより、急性腎不全について少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の感度を実現することができる。
【００２１】
移動時間は、例えば実施例の第２項に記載されているように、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により決定される。本実施例では、長さ９０ｃｍ、内径（ＩＤ）５０μｍ、外径（ＯＤ）３６０μｍのガラスキャピラリーを３０ｋＶの印加電圧で使用している。移動相溶媒（ｍｏｂｉｌｅ ｓｏｌｖｅｎｔ）として、例えば、３０％メタノール、０．５％ギ酸の水溶液を使用する。
【００２２】
ＣＥの移動時間は変わり得ることが知られている。しかし、使用する各ＣＥシステムについて記載の条件下でポリペプチドマーカーが溶出される順番は通常同じである。それでも起こり得る移動時間の差のバランスをとるために、移動時間が正確に分かっている標準を用いてシステムを正規化することができる。これらの標準は、例えば実施例中に記載されているポリペプチドであり得る（実施例の第３項参照）。ＣＥ時間の変動は、個々の測定間では比較的小さく、通常、±２分以内、好ましくは±１分以内、より好ましくは±０．５分、更により好ましくは±０．２分、又は０．１分である。
【００２３】
表１〜４に示したポリペプチドの特徴は、例えばNeuhoff et al.（Rapid communications in mass spectrometry, 2004, Vol. 20, pages 149-156）に詳細が記載されているキャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）を用いて決定した。個々の測定間又は異なる質量分析装置間の分子量の変動は、較正が正確である場合、比較的小さく、通常±０．１％以内、好ましくは±０．０５％以内、より好ましくは±０．０３％、更により好ましくは±０．０１％、又は±０．００５％である。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドマーカーは、タンパク質若しくはペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの分解産物である。これらは、例えばグリコシル化、リン酸化、アルキル化、ジスルフィドブリッジ等の翻訳後修飾により、あるいは例えば分解の範疇にある他の反応により、化学的に修飾され得る。更に、ポリペプチドマーカーは、サンプル精製過程で、例えば酸化される等により、化学的に変化させられてもよい。
【００２５】
ポリペプチドマーカーを決定するパラメーター（分子量及び移動時間）から進めて、先行技術で公知の方法により対応するポリペプチドの配列を同定することができる。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドは急性腎不全の診断に使用される。
【００２７】
「診断」とは、症状又は現象を疾患又は傷害に対応付けることにより情報を得る（knowledge gaining）プロセスを意味する。本発明では、特定のポリペプチドマーカーの有無は鑑別診断（differential diagnosis）にも使用される。ポリペプチドマーカーの有無は先行技術で公知の任意の方法により測定することができる。使用され得る方法を以下に例示する。
【００２８】
ポリペプチドマーカーは、その測定値が少なくともその閾値と同じ大きさである場合に、存在すると見なされる。測定値がそれよりも低い場合、ポリペプチドマーカーは存在しないと見なされる。閾値は、測定方法の感度（検出限界）により決定するか経験から定義することができる。
【００２９】
本発明では、好ましくは、特定の分子量についてサンプルの測定値がブランクサンプル（例えばバッファー又は溶媒のみ）の測定値の少なくとも２倍の大きさである場合に閾値を超えたと見なす。
【００３０】
ポリペプチドマーカーは、その有無が測定されるように使用され、この有無が急性腎不全の早期診断の指標となる。したがって、慢性腎疾患患者の体内には通常存在するが、急性腎不全を有さない対象の体内では発生しない又は発生頻度が少ないポリペプチドマーカーがある。更に、急性腎不全を有する対象の体内には存在するが、慢性腎疾患を有する対象の体内では発生しない又は発生頻度が低いポリペプチドマーカーがある。
【００３１】
頻度マーカー（有無の決定）に加えて、又はその代わりに、振幅マーカー（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｍａｒｋｅｒ）も診断に使用され得る。振幅マーカーは、有無が重要ではなく、シグナルが両方の群に存在する場合にシグナルの高さ（振幅）が決定的な意味をもつように使用される。測定した全サンプルに対して平均化した（質量及び移動時間により特徴付けられている）対応するシグナルの平均振幅を表中に記載した。濃縮のされ方が異なるサンプル間又は異なる測定法間での比較可能性を得るためには、２つの正規化方法が可能である。第１のアプローチでは、サンプルの全ペプチドシグナルを、１００万回分の計測の合計振幅に対して正規化する。したがって、個々のマーカーのそれぞれの平均振幅は１００万分率（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ：ｐｐｍ）として表される。
【００３２】
更に、別の正規化方法により更なる振幅マーカーを定義することができる。この場合、共通する正規化因子を用いて１サンプルの全ペプチドシグナルを評価する。したがって、個々のサンプルのペプチド振幅と既知の全ポリペプチドの参照値との間で線形回帰が形成される。この回帰直線の勾配はちょうど相対濃度に相当し、このサンプルの正規化因子として使用される。
【００３３】
診断の決定は、患者サンプル中の各ポリペプチドマーカーの振幅が対照群又は「病気」群の平均振幅と比較してどれだけ大きいかによってなされる。値が「病気」群の平均振幅に近ければ、急性腎不全が存在すると見なされ、どちらかというと対照群の平均振幅に相当する場合、急性腎不全が存在しないと見なされる。平均振幅からの距離をサンプルが特定の群に属する確率（probability）と解釈することができる。
【００３４】
頻度マーカーは、一部のサンプル中で振幅が低い振幅マーカーのバリアントである。マーカーが見出されない対応するサンプルを検出限界とほぼ同程度の非常に小さい振幅で振幅の計算に含めることでそのような頻度マーカーを振幅マーカーに変換することができる。
【００３５】
１又は複数のポリペプチドマーカーの有無を決定するサンプルが由来する対象は、急性腎不全に罹り得る任意の対象であり得る。好ましくは、対象は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、３つのポリペプチドマーカーだけでなく、より大きな、マーカーの組合せが使用される。複数のポリペプチドマーカーを比較することにより、その個体での典型的な存在確率からの少数の個々の逸脱による全体的結果におけるバイアスを低減又は回避することができる。
【００３７】
本発明に係るペプチドマーカーの有無を測定するサンプルは、対象の体から得られる任意のサンプルであり得る。サンプルは、対象の状態についての情報を提供するのに適したポリペプチド組成物を有するサンプルであり、例えば、血液、尿、滑液、組織液、身体分泌物、汗、脳脊髄液、リンパ液、腸液、胃液、膵液、胆汁、涙液、組織サンプル、精液、膣液、又は排泄物サンプルであり得る。好ましくは、サンプルは液体サンプルである。
【００３８】
好ましい実施形態では、サンプルは尿サンプルである。
【００３９】
尿サンプルは先行技術で選好される形で採取することができる。好ましくは、本発明では中間尿サンプルが使用される。例えば、尿サンプルは、カテーテルを用いて採取されてもよく、国際公開第０１／７４２７５号に記載されているように排尿装置を用いて採取されてもよい。
【００４０】
サンプル中のポリペプチドマーカーの有無は、ポリペプチドマーカーの測定に適した先行技術中に公知の任意の方法により決定され得る。そのような方法は当業者に公知である。原則的に、ポリペプチドマーカーの有無は、質量分析法等の直接的方法又は例えばリガンドの利用等の間接的方法により決定することができる。
【００４１】
必要であれば、又は所望であれば、対象由来のサンプル、例えば尿サンプルは、ポリペプチドマーカーの有無を測定する前に、任意の好適な手段で前処理されてよく、例えば精製又は分離されてよい。処理には、例えば精製、分離、希釈、又は濃縮が含まれ得る。方法は、例えば、遠心、ろ過、限外ろ過、透析、沈殿、又はクロマトグラフィー的方法、例えばアフィニティー分離若しくはイオン交換クロマトグラフィーを用いた分離、又は電気泳動的分離であり得る。その特定の例として、ゲル電気泳動、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、金属アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、レクチンに基づくアフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、順相及び逆相ＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィー、並びに表面への選択的結合が挙げられる。これらの方法は全て当業者に周知であり、当業者は、使用するサンプル及びポリペプチドマーカーの有無を決定する方法に応じた方法を選択することができる。
【００４２】
サブサンプルとは、互いに異なる複数の部分にサンプルが分離されたことを意味する。簡単な形態では、これは例えば、サンプルの大きい成分と小さい成分を２つのサブサンプルに分離する膜ろ過であり得る。
【００４３】
別の実施形態では、これはサンプルを複数のサブサンプル（「画分」）に分離するクロマトグラフィー的分離であり得る。
【００４４】
本発明の一実施形態では、サンプルは測定前に、電気泳動による分離、超遠心による精製、及び／又は限外ろ過により、特定の分子サイズのポリペプチドマーカーを含む画分に分けられる。
【００４５】
好ましくは、質量分析法を用いてポリペプチドマーカーの有無が決定され、サンプルの精製又は分離はそのような方法の上流（upstream）で行われ得る。現行の方法と比べて、質量分析は１回の分析でサンプル中の多数（＞１００）のポリペプチドの濃度を決定できるという利点がある。任意の種類の質量分析装置が使用され得る。質量分析法を用いて、通例、複合混合物中で約±０．０１％の測定精度で１０ｆｍｏｌのポリペプチドマーカー、すなわち１０ｋＤのタンパク質０．１ｎｇを測定することができる。質量分析装置中、イオン源（ｉｏｎ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）は好適な分析デバイスに連結されている。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースは主に液体サンプル中のイオンを測定するために使用され、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）技術はマトリックス中で結晶化したサンプルからのイオンを測定するために使用される。形成されたイオンを分析するために、例えば、四重極、イオントラップ、又は飛行時間型（ＴＯＦ）分析装置が使用され得る。
【００４６】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、溶液中に存在する分子は、とりわけ、高電圧の影響下（例えば１〜８ｋＶ）で、噴霧化され、帯電液滴を形成し、溶媒の蒸発により更に小さくなる。最後に、いわゆるクーロン爆発により自由イオンが形成され、これを分析及び検出することができる。
【００４７】
ＴＯＦを用いたイオン分析では、特定の加速電圧が印加されて等量の運動エネルギーがイオンに付与される。その後、各イオンが飛行チューブ（ｆｌｙｉｎｇ ｔｕｂｅ）を通って特定のドリフト距離を移動するのにかかる時間を非常に正確に測定する。等量の運動エネルギーではイオンの速度は質量に依存するので、質量を決定することができる。ＴＯＦ分析装置は非常に走査速度が速いので、良好な解像度が得られる。
【００４８】
ポリペプチドマーカーの有無の決定に好ましい方法としては、気相イオンスペクトロメトリー（ｇａｓ−ｐｈａｓｅ ｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、例えばレーザー脱離／イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（表面増強レーザー脱離／イオン化）、ＬＣ ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析法）、２Ｄ−ＰＡＧＥ／ＭＳ、及びキャピラリー電気泳動−質量分析法（ＣＥ−ＭＳ）が含まれる。記載の方法は全て当業者に公知である。
【００４９】
特に好ましい方法は、キャピラリー電気泳動が質量分析法と連結されたＣＥ−ＭＳである。この方法は、例えば独国特許出願第１００２１７３７号、Kaiser et al.（J. Chromatogr A, 2003, Vol. 1013: 157-171及びElectrophoresis, 2004, 25: 2044-2055）、及びWittke et al.（J. Chromatogr. A, 2003, 1013: 173-181）に幾分詳細に記載されている。ＣＥ−ＭＳ技術を用いることで、サンプルの数百個のポリペプチドマーカーの存在を少ない体積で同時に短時間且つ高感度で決定することができる。サンプルを測定した後、測定されたポリペプチドマーカーのパターンを作製し、このパターンを病気対象者又は健常対象者の参照パターンと比較することができる。ほとんどの場合、ＵＡＳの診断には限られた数のポリペプチドマーカーを使用すれば十分である。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにオンラインで連結されたＣＥを含むＣＥ−ＭＳ法が更に好ましい。
【００５０】
ＣＥ−ＭＳでは、揮発性溶媒の使用が好ましく、本質的に塩を含まない条件下で行われるのが最も好ましい。好適な溶媒の例としてはアセトニトリル、メタノール等が挙げられる。分析物、好ましくはポリペプチドをプロトン化するために、溶媒を水又は酸（例えば０．１〜１％のギ酸）で希釈してもよい。
【００５１】
キャピラリー電気泳動を用いることで、分子の電荷及びサイズに従って分子を分離することができる。電流を印加すると中性粒子は電気浸透流と同じ速度で移動し、一方、陽イオンは陰極に向かって加速され、陰イオンは遅れる。電気泳動におけるキャピラリーの利点は、表面と体積の比率が好ましいことであり、これにより、電流フロー中に発生するジュール熱の良好な放散が可能になる。そのため、高電圧（通常３０ｋＶまで）を印加することが可能になるので、高い分離性能及び短時間の分析が可能になる。
【００５２】
キャピラリー電気泳動では通常、内径が典型的には５０〜７５μｍの石英ガラスキャピラリーが使用される。長さは３０〜１００ｃｍのものが使用される。更に、キャピラリーは通常、プラスチックコートされた石英ガラス製である。キャピラリーは、未処理、すなわち内面に親水性基が露出していてもよく、内面がコートされていてもよい。疎水性コーティングを用いて分解能を向上させてもよい。電圧に加えて、圧力も印加され得、圧力は通常０〜１ｐｓｉの範囲内である。圧力は、分離の間だけ印加されてもよく、その間に変化させてもよい。
【００５３】
ポリペプチドマーカーの好ましい測定方法では、サンプルのマーカーは、キャピラリー電気泳動により分離された後、直接イオン化され、連結された質量分析装置にオンラインで送られて検出される。
【００５４】
本発明に係る方法では、複数のポリペプチドマーカーを診断に使用することが有益である。
【００５５】
少なくとも５、６、８、又は１０個のマーカーの使用が好ましい。
【００５６】
一実施形態では、２０〜５０個のマーカーが使用される。
【００５７】
好ましくは、前記マーカーは、表１による以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、７４０６、１６８３２、１７７９２、１８１６８、２０７４９、２１２０３、２２２８２、２６０４２、２６８９１、２７５１７、２７７９６、２８７０２、３０７３３、３８８７９、４１８３３、４３６８６、５３２１６、５６８８４、５７５３１、６１５７３、６４２５６、７０４１３、７４１８７、８９３２５、９２６９８、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０２３９２、１０６１９５、１１５４９１、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００５８】
更により好ましくは、前記マーカーは、表１による以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、７４０６、１６８３２、１７７９２、１８１６８、２０７４９、２１２０３、２２２８２、２６０４２、２６８９１、２７７９６、２８７０２、４１８３３、４３６８６、５６８８４、６１５７３、８２０９４、８９３２５、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００５９】
一実施形態では、前記マーカー又はマーカーのサブグループは、以下の数字により特定されるように選択される：
２５０５、５９１３、１４９０６、１６８３２、２０７４９、２７５１７、２８５６１、３０１７４、３０７３３、３８８７９、４０８６４、４１８３３、４２５９４、４６８８０、５０００８、５１１２０、５２１００、５３２１６、５３９５７、５５１４３、５６８８４、５７５３１、５８９５４、６１５７３、６３８７７、６４０８７、６４２５６、６７６３２、７０４１３、７４１８７、８２０９４、８４１９２、８７７２４、８９３２５、９０８４０、９２６９８、９６３７０、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０１８８８、１０２３９２、１０３４９３、１０６１９５、１１５４９１、１２１７７５、１２２４００、１２３６７１、１２４８８６、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６０】
別の実施形態では、以下のタンパク質ＩＤのマーカーを使用する：
５９１３、１６８３２、２０７４９、２７５１７、３０７３３、３８８７９、４１８３３、５３２１６、５６８８４、５７５３１、６１５７３、６４２５６、７０４１３、７４１８７、８９３２５、９２６９８、９７３０１、９８０８９、１００５３７、１０２３９２、１０６１９５、１１５４９１、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６１】
別の実施形態では、マーカーは、以下のタンパク質ＩＤのマーカーから選択される：
５９１３、１６８３２、２０７４９、４１８３３、５６８８４、６１５７３、８２０９４、８９３２５、１３０７４７、１５９９５４、１６０６２８。
【００６２】
複数のマーカーを使用した場合に疾患が存在する確率を決定するために、当業者に公知の統計方法が使用され得る。例えば、Weissinger et al.（Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434）に記載されているＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ法が、同文献に記載されているように、Ｓ−Ｐｌｕｓ等のコンピュータプログラム又はサポートベクターマシーンを用いて使用され得る。
【実施例】
【００６３】
１．サンプル調製
診断用のポリペプチドマーカーを検出するために、尿を使用した。尿は健常ドナー（対照群）及び腎疾患に罹患している患者から採取した。
【００６４】
その後のＣＥ−ＭＳ測定に、これも患者の尿に高濃度で含まれるタンパク質であるアルブミン、免疫グロブリン等を限外ろ過により分離する必要があった。そのため、７００μｌの尿を採取し、７００μｌのろ過バッファー（２Ｍ尿素、１０ｍＭアンモニア、０．０２％ＳＤＳ）と混合した。この体積１．４ｍｌのサンプルを限外ろ過した（ドイツ、ゲッティンゲンのザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、２０ｋＤａ）。限外ろ過は遠心機を用いて３０００ｒｐｍで行い、１．１ｍｌの限外ろ液を得た。
【００６５】
次いで、得られた１．１ｍｌのろ液をＰＤ１０カラム（スウェーデン、ウプサラのアマシャム・バイオサイエンス社製）にアプライし、０．０１％のＮＨ４ＯＨ２．５ｍｌに対して脱塩し、凍結乾燥した。ＣＥ−ＭＳ測定のために、その後、ポリペプチドを２０μｌの水（ＨＰＬＣグレード、メルク社製）に再懸濁した。
【００６６】
２．ＣＥ−ＭＳ測定
ベックマン・コールター社製のキャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｓｙｓｔｅｍ；米国カリフォルニア州フラートンのベックマン・コールター社製）及びブルカー社製ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置（マイクロ−ＴＯＦ ＭＳ；ドイツ、ブレーメンのブルカー・ダルトニク社（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）製）を用いて、ＣＥ−ＭＳ測定を行った。
【００６７】
ＣＥキャピラリーはベックマン・コールター社により供給されたものであり、ＩＤ／ＯＤが５０／３６０μｍ、長さが９０ｃｍであった。ＣＥ分離用の移動相は２０％アセトニトリル及び０．２５％ギ酸の水溶液からなる。ＭＳ上での「シースフロー（ｓｈｅａｔｈ ｆｌｏｗ）」には、０．５％ギ酸を含む３０％イソプロパノールを用い、流量は２μｌ／ｍｉｎとした。ＣＥとＭＳの連結は、ＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳ Ｓｐｒａｙｅｒ Ｋｉｔ（ドイツ、ワルドブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ）のアジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製）によりなされた。
【００６８】
サンプルの注入には、１ｐｓｉから最大６ｐｓｉの圧力を印加し、注入期間は９９秒とした。これらのパラメータを用いて、約１５０ｎｌのサンプルをキャピラリーに注入した。これはキャピラリー容積の約１０％に相当する。スタッキング技術を用いてキャピラリー中でサンプルを濃縮した。そのため、サンプルを注入する前に、１ＭのＮＨ３溶液を７秒間（１ｐｓｉで）注入し、サンプル注入後に２Ｍのギ酸溶液を５秒間注入した。分離電圧（３０ｋＶ）を印加した時、分析物はこれらの溶液の間で自動的に濃縮された。
【００６９】
その後のＣＥ分離は、圧力法（０ｐｓｉで４０分、０．１ｐｓｉで２分、０．２ｐｓｉで２分、０．３ｐｓｉで２分、０．４ｐｓｉで２分、最後に０．５ｐｓｉで３２分）を用いて行った。したがって、分離ランの合計時間は８０分間であった。
【００７０】
ＭＳ側で可能な限り良好なシグナル強度を得るために、噴霧ガスを可能な最も低い値にした。エレクトロスプレーを生成するためにスプレーニードルに印加した電圧は３７００〜４１００Ｖであった。質量分析装置の残りの設定はメーカーの取扱説明書に従いペプチド検出に最適化した。スペクトルをｍ／ｚ４００〜ｍ／ｚ３０００の質量範囲で記録し、３秒ごとに蓄積した。
【００７１】
３．ＣＥ測定用の標準
ＣＥ測定のチェック及び標準化のために、選択した条件下での記載のＣＥ移動時間により特徴付けられる以下のタンパク質又はポリペプチドを使用した。
【００７２】
【表７】
【００７３】
タンパク質／ポリペプチドはそれぞれの水中濃度１０ｐｍｏｌ／μｌで使用した。「ＲＥＶ」、「ＥＬＭ」、「ＫＩＮＣＯＮ」、及び「ＧＩＶＬＹ」は合成ペプチドである。
【００７４】
原則的に、キャピラリー電気泳動による分離において移動時間にわずかなばらつきが生じ得ることは当業者に公知である。しかし、記載の条件下では、移動の順番は変わらない。記載の質量及びＣＥ時間を知っている当業者であれば、自身の測定値を本発明に係るポリペプチドマーカーに問題なく帰属（assign）させることができる。例えば以下のように進められ得る：最初に、測定中に見つかったポリペプチドの１つを選択し（ペプチド１）、記載のＣＥ時間の時間枠内（例えば±５分）に１又は複数の同じ質量を見つけることを試みる。この間隔中に同じ質量が１つだけが見つかれば、帰属は完了する。一致する質量が複数見つかる場合、まだ帰属（assignment）についての決定をなす必要がある。したがって、測定から別のペプチド（ペプチド２）を選択し、再度対応する時間枠を考慮して適切なポリペプチドマーカーを同定することを試みる。
【００７５】
ここでも、対応する質量で複数のマーカーが見つけられる場合、最も可能性の高い帰属は、ペプチド１のシフトとペプチド２のシフトの間に実質的に線形な関係がある帰属である。
【００７６】
帰属問題の複雑さに応じて、当業者には、帰属のためにサンプルから更なるタンパク質（例えば１０個のタンパク質）を必要に応じて使用することが示唆される。典型的には、移動時間が特定の絶対値分だけ長くなるか短くなり、あるいは過程全体が短縮又は延長される。しかし、一緒に移動するペプチドはそのような条件下でも一緒に移動する（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）。
【００７７】
更に、当業者は、Zuerbig et al.（Electrophoresis 27 (2006), pp. 2111-2125）に記載されている移動パターンを利用することができる。簡単なダイアグラムを用いて（例えばＭＳ Ｅｘｃｅｌを用いて）ｍ／ｚ対移動時間の形で測定値をプロットすることにより、記載されている線パターンを可視化することもできる。これにより、線を数えることで個々のポリペプチドを容易に帰属することができる。
【００７８】
その他の帰属方法も可能である。基本的に、当業者は、ＣＥ測定値を帰属するための内部標準として上記のペプチドを使用することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎不全の診断プロセスであって、サンプル中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程を含み、前記ポリペプチドマーカーが、表１中で分子量及び移動時間の値により特徴付けられているポリペプチドマーカーから選択される、前記プロセス。
【請求項２】
決定された前記マーカーの有無又は振幅の評価が以下の表３に記載の参照値を用いてなされることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、又は少なくとも５０個の請求項１に記載のポリペプチドマーカーが使用される、請求項１〜２の少なくとも１項に記載のプロセス。
【請求項４】
対象に由来する前記サンプルが中間尿サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ポリペプチドマーカーの有無又は振幅の検出にキャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトロメトリー、及び／又は質量分析法が用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ポリペプチドマーカーの分子量を測定する前にキャピラリー電気泳動が行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ポリペプチドマーカーの有無の検出に質量分析法が使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
分子量及び移動時間の値によって特徴付けられる表１に記載のマーカーから選択される少なくとも３つのペプチドマーカーの、急性腎不全を診断するための使用。
【請求項９】
（ａ）サンプルを少なくとも５個、好ましくは１０個のサブサンプルに分ける工程；
（ｂ）少なくとも５個の前記サブサンプルを分析して前記サンプル中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程であって、前記ポリペプチドマーカーが、分子量及び移動時間（ＣＥ時間）により特徴付けられる表１のマーカーから選択される、工程
を含む急性腎不全の診断プロセス。
【請求項１０】
少なくとも１０個のサブサンプルを測定する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ＣＥ時間が、２０％アセトニトリル、０．２５％ギ酸の水溶液を移動相溶液として用い、２５ｋＶの印加電圧、長さ９０ｃｍ、内径（ＩＤ）５０μｍのガラスキャピラリーに基づくことを特徴とする、請求項１〜１０の少なくとも１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
感度が少なくとも６０％であり且つ特異性が少なくとも４０％である、請求項１〜７又は９〜１１の少なくとも１項に記載のプロセス。
【請求項１】
急性腎不全の診断プロセスであって、サンプル中の少なくとも３つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程を含み、前記ポリペプチドマーカーが、表１中で分子量及び移動時間の値により特徴付けられているポリペプチドマーカーから選択される、前記プロセス。
【請求項２】
決定された前記マーカーの有無又は振幅の評価が以下の表３に記載の参照値を用いてなされることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、又は少なくとも５０個の請求項１に記載のポリペプチドマーカーが使用される、請求項１〜２の少なくとも１項に記載のプロセス。
【請求項４】
対象に由来する前記サンプルが中間尿サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記ポリペプチドマーカーの有無又は振幅の検出にキャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣ、気相イオンスペクトロメトリー、及び／又は質量分析法が用いられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記ポリペプチドマーカーの分子量を測定する前にキャピラリー電気泳動が行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記ポリペプチドマーカーの有無の検出に質量分析法が使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
分子量及び移動時間の値によって特徴付けられる表１に記載のマーカーから選択される少なくとも３つのペプチドマーカーの、急性腎不全を診断するための使用。
【請求項９】
（ａ）サンプルを少なくとも５個、好ましくは１０個のサブサンプルに分ける工程；
（ｂ）少なくとも５個の前記サブサンプルを分析して前記サンプル中の少なくとも１つのポリペプチドマーカーの有無又は振幅を決定する工程であって、前記ポリペプチドマーカーが、分子量及び移動時間（ＣＥ時間）により特徴付けられる表１のマーカーから選択される、工程
を含む急性腎不全の診断プロセス。
【請求項１０】
少なくとも１０個のサブサンプルを測定する、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ＣＥ時間が、２０％アセトニトリル、０．２５％ギ酸の水溶液を移動相溶液として用い、２５ｋＶの印加電圧、長さ９０ｃｍ、内径（ＩＤ）５０μｍのガラスキャピラリーに基づくことを特徴とする、請求項１〜１０の少なくとも１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
感度が少なくとも６０％であり且つ特異性が少なくとも４０％である、請求項１〜７又は９〜１１の少なくとも１項に記載のプロセス。
【公表番号】特表２０１２−５３１６１５（Ｐ２０１２−５３１６１５Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８９２１（Ｐ２０１２−５１８９２１）
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９４４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００９３８
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１０２５２４４９）モザイクス ダイアグノスティクス アンド セラピューティクス アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９４４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００９３８
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１０２５２４４９）モザイクス ダイアグノスティクス アンド セラピューティクス アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
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