恒常性および適応に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウムグルタミカム遺伝子
【課題】恒常性および適応に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウムグルタミカム遺伝子およびそのファインケミカル製造調節への利用の提供。
【解決手段】単離された核酸分子、指示されたＨＡ核酸であって、コリネバクテリウムグルタミカム由来の新規ＨＡタンパク質をコードするもの。アンチセンス核酸分子、ＨＡ核酸分子を含む組み換え発現ベクター、および発現ベクターが導入される宿主細胞。さらに単離されたＨＡタンパク質、突然変異させられたＨＡタンパク質、フュージョンタンパク質、抗原性ペプチド、およびＣ．グルタミカムからの、この生物のＨＡ遺伝子の遺伝子操作に基づく所望の化合物の製造を改善するための方法。
【解決手段】単離された核酸分子、指示されたＨＡ核酸であって、コリネバクテリウムグルタミカム由来の新規ＨＡタンパク質をコードするもの。アンチセンス核酸分子、ＨＡ核酸分子を含む組み換え発現ベクター、および発現ベクターが導入される宿主細胞。さらに単離されたＨＡタンパク質、突然変異させられたＨＡタンパク質、フュージョンタンパク質、抗原性ペプチド、およびＣ．グルタミカムからの、この生物のＨＡ遺伝子の遺伝子操作に基づく所望の化合物の製造を改善するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、恒常性および適応に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウムグルタミカム遺伝子に関するものである。
【０００２】
本出願は、先に提出した１９９９年６月２５日提出の米国仮特許出願６０／１４１０３１の優先権を主張する。本出願はまた、先に提出された１９９９月８日提出のドイツ特許出願１９９３１６３６．８、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２５．６、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２６．４、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２７．２、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２８．０、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２９．９、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２２２６．０、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２２９２０．６、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２２．２、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２４．９、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２８．１、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３０．３、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３３．８、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３５．４、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９７３．７、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００２．６、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００３．４、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００５．０、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００６．９、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３７８．９、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３７９．７、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３９０．８、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３９１．６、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９４２０８８．２の優先権を主張する。上記全出願の全ての内容は、本明細書中で明確に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
細胞の天然に存在する代謝過程の一定の産物および副産物は、食品、飼料、化粧品、および製薬産業を含む広範な種々の産業で有用である。これらの分子（集合的に、「精製化学製品」と呼ばれる）には、有機酸、タンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、ならびに酵素が含まれる。その生産は、１つまたは複数の所望の分子を大量に産生および分泌させるように開発された細菌の大量培養によって最も都合よく行われる。この目的の１つの特に有用な生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（コリネバクテリウムグルタミカム）（グラム陽性、非病原性細菌）である。株の選択によって、多数の所望の化合物を産生する多数の変異株が開発されている。しかし、特定の分子の産生用に改良された株の選択は、時間のかかる困難な過程である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、様々に用途がある新規の細菌核酸分子を提供する。これらの用途には、精製化学製品の製造に使用することができる細菌の同定、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌による精製化学製品の調整、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムのマッピングの基準点および形質転換のマーカーとしてのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の分類または同定が含まれる。これらの新規の核酸分子は、本明細書中で恒常性および適応（ＨＡ）タンパク質と呼ばれるタンパク質をコードする。
【０００５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、種々の精製化学製品の大量生産用、炭化水素の分解（石油流出など）、およびテルペノイドの酸化などの産業に一般に使用されているグラム陽性の好気性菌である。したがって、本発明のＨＡ核酸分子を使用して、例えば発酵過程による精製化学製品の生産に使用することができる細菌を同定することができる。本発明のＨＡ核酸分子の発現または本発明のＨＡ核酸分子配列改変を使用して、細菌由来の１つまたは複数の化学製品の生産を調整することができる（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産を改良する）。
【０００６】
本発明のＨＡ核酸を使用して、コリネバクテリウムグルタミカムまたはその密接な関連細菌としての細菌の同定またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはその関連細菌の混合細菌集団の存在の同定も可能である。本発明は、ストリンジェントな条件下でこの生物に固有のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子領域にかかるプローブを使用した細菌の固有または混合した集団の培地からの抽出ゲノムＤＮＡの探索（この生物が存在するかどうかを確認することができる）による多数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子の核酸配列を提供する。コリネバクテリウムグルタミカム自体が非病原性であるにもかかわらず、ヒトに病原性を示す種、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリアの原因物質）などに関連し、このような生物の検出は臨床的に有意に関連する。
【０００７】
本発明のＨＡ核酸分子はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムまたは関連生物のゲノムのマッピングにおける基準点として使用することができる。同様に、これらの分子またはその変異型もしくは一部は、遺伝子操作ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のマーカーとして使用することができる。
【０００８】
本発明の新規の核酸分子によってコードされるＨＡタンパク質は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持またはこの細菌の異なる環境条件への適応能力に関連する機能を果たすことができる。コリネバクテリウムグルタミカムで使用されるクローニングベクターの適用性（Ｓｉｎｓｋｅｙらに付与された米国特許第４，６４９、１１９号に開示）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ類（例えば、ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の遺伝子操作技術（Ｙｏｓｈｈａｍａら、Ｊ．Ｂａｖｔｅｒｉｏｌ．、１６２、５９１〜５９７、１９８５、Ｋａｔｓｕｍａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５９、３０６〜３１１、１９８４、およびＳａｎｔａｍａｒｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３０、２２３７〜２２４６、１９８４）を考慮すれば、本発明の核酸分子をこの生物の遺伝子操作に利用して１つまたは複数の精製化学製品のより良好またはより有効な生産が可能である。この精製化学製品の生産または生産効率の改良は、本発明の遺伝子操作の直接的効果によるか、このような操作の間接的な効果により得る。
【０００９】
本発明のＨＡタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。例えば、これらの酵素の活性または数を増加または減少させるように芳香族化合物または脂肪族化合物を改変する酵素操作により、これらの化合物の改変または分解産物である１つまたは複数の精製化学製品の生産を調整することができる。同様に、無機化合物代謝に関連する酵素により、アミノ酸、ビタミン、および核酸などのこのような精製化学製品の生合成用の鍵となる分子（例えば、亜リン酸、硫黄、および窒素分子）が得られる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのこれらの酵素の活性または数の変更により、これらの無機化合物変換の増加（または代わりの無機化合物の使用）によりこれらの精製化学製品への無機原子の組み込み率を改良可能である。一般的な細胞過程に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素の遺伝子操作により、これらの酵素の多くが精製化学製品（例えば、アミノ酸）または精製化学製品合成または分泌に関連する酵素を直接改変するので、精製化学製品の生産を直接改良することもできる。細胞プロテアーゼの活性または数の調整はまた、多数のプロテアーゼが精製化学製品または精製化学製品の生産もしくは崩壊に関連する酵素を分解することができるので、精製化学製品に直接影響を与え得る。
【００１０】
さらに、芳香族／脂肪族化合物の改変もしくは分解、一般的な生体触媒反応、無機化合物代謝、またはタンパク質分解に関与する上記の酵素自体が、その活性が種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ産業に適用に望ましい精製化学製品である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの１つまたは複数のこれらの酵素のコピー数の変更により、細胞によって産生されるこれらの酵素の数を増加させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の大量培養物由来のこれらのタンパク質の潜在的生産量または生産効率を増加させることができる。
【００１１】
本発明のＨＡタンパク質の変更はまた、このような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与え得る。例えば、細胞壁の構築または再配列に関連するこれらのタンパク質の活性および／または数の調整により、細胞が機械的ストレスおよび大量発酵培養中の他のストレスにより良好に耐えることができるように細胞壁の構造自体を改変することができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量増殖には、有意な細胞壁産生が必要である。細胞壁生合成または分解酵素の活性または数の調整により細胞壁をより迅速に生合成可能であり、それによりこの培養微生物の培養における増殖速度を増加させることができ、それにより所望の精製化学製品の生産細胞数を増加させることができる。
【００１２】
本発明のＨＡ酵素の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、または生産効率に直接影響を与えることもできる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多数の一般的酵素は、細胞過程全体（例えば、調節過程）に有意に影響を与え、それにより精製化学製品の代謝に有意な影響を与える。同様に、プロテアーゼ、毒性を示す可能性のある芳香族または脂肪族化合物を改変または分解する酵素、および無機化合物の代謝を促進する酵素は全てＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの生存度の増大に役立つ。プロテアーゼは、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質（大量発酵槽培養中に遭遇する比較的ストレスの多い環境条件下で生じ得るタンパク質など）の選択的除去を支援する。これらのタンパク質の変更によって、この活性をさらに向上させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養における生存度を改良することができる。芳香族／脂肪族の改変または分解タンパク質は、これらの廃棄化合物（培養培地中の不純物または細胞自体の廃棄物として遭遇し得る）の解毒だけでなく、最適な炭素源が培養物中で制限されている場合に細胞が代替炭素源を利用するのにも役立つ。その数および／または活性の増加により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存を向上させることができる。本発明の無機代謝タンパク質は、全てのタンパク質およびヌクレオチド（など）の合成に必要な無機分子を細胞に供給するので、細胞の全体的な生存度に重要である。大量培養における１つまたは複数の所望の精製化学製品を生産する生細胞数の増加により、培養による精製化学物質の生産量、生産、および／または生産効率が付随的に増加するはずである。
【００１３】
本発明は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連する機能を果たすか、この微生物の異なる環境条件への適応能に関連し得るタンパク質（本明細書中では、「ＨＡタンパク質」と呼ぶ）をコードする新規の核酸分子を提供する。ＨＡタンパク質をコードする核酸分子を、本明細書中でＨＡ核酸分子と呼ぶ。好ましい実施形態では、ＨＡタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の改変もしくは分解、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性の保有に関与する。このようなタンパク質の例には、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。
【００１４】
したがって、本発明の１つの態様は、ＨＡをタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその生物活性部分を含む単離核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）ならびにＨＡコード核酸の検出または増幅用のプライマーまたはハイブリッド形成プローブとして安定な核酸フラグメント（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に関する。特に好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列表の奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列の１つまたはこれらのヌクレオチド配列の１つのコード領域もしくは相補物を含む。他の特に好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、上記の配列表の奇数番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド結合するか、それに少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。他の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列表の偶数の配列番号（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８．．．．）に記載のアミノ酸配列の１つをコードする。本発明の好ましいＨＡタンパク質はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのＨＡ活性を有することが好ましい。
【００１５】
別の実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質またはその一部が本発明のアミノ酸配列に十分に相同的な、例えば、タンパク質またはその一部がＨＡ活性を維持するように本発明のアミノ酸配列に十分に相同的なアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号を有する配列）を含むタンパク質またはその一部をコードする。好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質またはその一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するか、異なる環境条件に対する根微生物の適応に関連する機能を果たす能力を維持する。１つの実施形態では、核酸分子によってコードされるタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号を有するアミノ酸から選択される全アミノ酸配列）に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。別の好ましい実施形態では、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同的な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質（配列表の対応する奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に示した読み取り枠によってコードされる）である。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来であり、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の１つの配列）の１つに少なくとも約５０％を超えて相同的で、ＤＮＡの修復または組換え、遺伝物質の転移、遺伝子発現（すなわち、転写または翻訳過程）、タンパク質折りたたみ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕａｍｉｃｕｍのタンパク質分泌に関連することができ、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し、また、異種ポリペプチドまたは調節領域をコードする異種核酸配列も含む生物活性ドメインを含むタンパク質（例えば、ＨＡ融合タンパク質）をコードする。
【００１７】
別の実施形態では、単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）を含む核酸分子とハイブリッド形成する。好ましくは、単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。より好ましくは、単離核酸は、天然に存在するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＨＡタンパク質またはその生物活性部分をコードする。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含むベクター（例えば、組換え発現ベクター）、このようなベクターが移入される宿主細胞に関する。１つの実施形態では、このような宿主細胞を使用して、安定な培地中での宿主細胞の培養によってＨＡタンパク質を産生させる。次いで、ＨＡタンパク質を、培地または宿主細胞から単離することができる。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＡ遺伝子が移入または変更された遺伝子変更微生物に関する。１つの実施形態では、微生物のゲノムを、導入遺伝子として野生型または変異ＨＡ配列をコードする本発明の核酸分子の移入によって変更されている。別の実施形態では、微生物ゲノム中の内因性ＨＡ遺伝子が変更ＨＡ遺伝子での相同組換えによって変更されており、例えば、機能的に破壊されている。別の実施形態では、微生物中の内因性または移入ＨＡ遺伝子が、１つまたは複数の点変異、欠失、または逆位で変更されているが、機能的ＨＡタンパク質はコードする。さらに別の実施形態では、ＨＡ遺伝子の発現が調節されるように、微生物におけるＨＡ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）が変更されている（例えば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。好ましい実施形態では、微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属するが、コリネバクテリウムグルタミカムが特に好ましい。好ましい実施形態では、微生物は、アミノ酸などの所望の化合物の生産にも利用されるが、リジンが特に好ましい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、被験体におけるＣｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の同定法を提供する。この方法には、本発明の被験体における１つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（配列表に記載の配列番号１〜４４０の配列）の検出による被験体におけるＣｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の検出が含まれる。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、単離ＨＡタンパク質またはその一部、例えば、生物活性部分に関する。好ましい実施形態では、単離ＨＡタンパク質またはその一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関し得るか、この微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができる。別の好ましい実施形態では、単離ＨＡタンパク質またはその一部は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するために本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相補的である。
【００２２】
本発明はまた、ＨＡタンパク質の単離調製物を提供する。好ましい実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）を含む。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）（配列表の対応する奇数の配列番号に記載の読み取り枠によってコードされる）に実質的に相補的な単離全長タンパク質に関する。さらに別の実施形態では、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。他の実施形態では、単離ＨＡタンパク質は、本発明のアミノ酸配列の１つ（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％またはそれ以上相補的で、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
あるいは、単離ＨＡタンパク質は、配列表に記載の偶数の配列番号の１つのヌクレオチド配列とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）か、その配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＨＡタンパク質の好ましい形態もまた本明細書中に記載のＨＡ生体活性を有することも好ましい。
【００２４】
ＨＡポリペプチドまたはその生物活性部分を、非ＨＡポリペプチドに作動可能に連結させて融合タンパク質を形成させることができる。好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、ＨＡタンパク質のみとは異なる活性を有する。他の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす。特に好ましい実施形態では、この融合タンパク質の宿主細胞への取り込みにより細胞由来の所望の化合物の産生が調整される。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＨＡタンパク質自体またはＨＡタンパク質の結合パートナーとの相互作用によるか、本発明のＨＡ核酸の転写または翻訳の調整によってＨＡタンパク質の活性を調整する分子のスクリーニング法を提供する。
【００２６】
本発明の別の態様は、精製化学製品の生産法に関する。この方法は、精製化学製品が生産されるように、本発明のＨＡ核酸分子の発現を指向するベクターを含む細胞を培養する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、さらに、細胞がＨＡ核酸の発現を指向するベクターでトランスフェクトされた、このようなベクターを含む細胞を獲得する工程を包含する。別の好ましい実施形態では、この方法は、さらに、培養物由来の精製化学製品の回収工程を包含する。特に好ましい実施形態では、細胞はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来であるか、表３に記載の株から選択される。
【００２７】
本発明の別の態様は、微生物由来の分子の産生の調整法に関する。このような方法は、細胞とＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を調整する作用因子とを接触させることにより細胞関連活性が作用因子の非存在下でこの同一の活性と比較して変更される工程を包含する。好ましい実施形態では、細胞は、細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性に関連する１つまたは複数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ過程が調整される。ＨＡタンパク質活性を調整する作用因子は、ＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を刺激する作用因子であり得る。ＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を刺激する作用因子の例には、細胞に移入されている小分子、活性ＨＡタンパク質、ＨＡタンパク質をコードする核酸が含まれる。ＨＡ活性または発現を阻害する作用因子の例には、小分子、アンチセンスＨＡ核酸分子が含まれる。
【００２８】
本発明の別の態様は、細胞に野生型または変異ＨＡ遺伝子を移入し、個別のプラスミドで維持されるか、宿主細胞のゲノムに取り込まれる工程を包含する、細胞由来の所望の化合物の生産量の調整法に関する。ゲノムに取り込まれた場合、このような取り込みはランダムであるか、天然の遺伝子が移入コピーによって置換されるような相同組換えが起こり調整されるべき細胞から所望の化合物を産生することができる。好ましい実施形態では、生産量が増加する。別の好ましい実施形態では、化合物は精製化学製品である。特に好ましい実施形態では、精製化学製品はアミノ酸である。特に好ましい実施形態では、アミノ酸はリジンである。
【００２９】
本発明は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解に関連するかＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するＨＡ核酸およびタンパク質分子を提供する。本発明の分子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物由来の精製化学製品の生産の調整に利用することができ、これにより、直接的（例えば、精製化学製品（例えば、酵素）の生産に関連するタンパク質活性の過剰発現または至適化により改変Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与える場合）または間接的に影響が与えられて所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効率が得られる（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ芳香族または脂肪族化合物の改変または分解タンパク質の活性または数の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存度を増加させ、大量培養での生産量も増加する場合）。本発明の態様を、以下でさらに詳細に説明する。
【００３０】
Ｉ．精製化学製品
用語「精製化学製品」は、当該分野で認識されており、これらに限定されないが、製薬、農業、および化粧品産業等の種々の産業に適用される生物によって産生される分子が含まれる。このような化合物には、酒石酸、イタコン酸ジアミノピメリン酸などの有機酸、タンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド（Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、「ヌクレオチドおよび関連化合物」、５６１〜６１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、Ｒｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例に記載）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールおよびブタンジオール）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリン、およびインディゴ）、ビタミンおよび補因子（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２７巻、「ビタミン」、４４３〜６１３、１９９６、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例、およびＯｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１９９５、「栄養素、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマレーシアのペナンで開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジカル研究協会−アジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載）、酵素、ポリケチド（Ｃａｎｅら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２、６３〜６８）、およびＧｕｔｃｈｏ、１９８３、「発酵による化合物」、Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０８１８８０５０８６および本明細書中の引例に記載の他の全ての化合物が含まれる。これらの一定の精製化学製品の代謝および使用を、以下にさらに詳述する。
【００３１】
Ａ．アミノ酸代謝および使用
アミノ酸は、全てのタンパク質の基本的単位を含み、そのようなものとして全ての生物における正常な細胞機能に必須である。用語「アミノ酸」は、当該分野で認識されている。２０種存在するタンパク質生成アミノ酸は、ペプチド結合で連結したタンパク質の構造単位として使用される一方で、非タンパク質生成アミノ酸（何百もが公知である）は通常タンパク質中に見出されない（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、１９８５、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。アミノ酸は、Ｄ型またはＬ型光学配置で存在し得るが、Ｌアミノ酸は一般に、天然に存在するタンパク質のみで見出される型である。２０種のタンパク質生成アミノ酸それぞれの生合成および分解経路は、原核細胞および真核細胞の両方で十分に特徴づけられている（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、５７８〜５９０、１９８８を参照のこと）。「必須」アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリン）は、その生合成の複雑さにより栄養素として必要であり、簡単な生合成経路によって残りの１１種の「非必須」アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、およびチロシン）に容易に変換されるので、そう呼ばれている。高等動物は、これらのアミノ酸のいくつかを合成する能力を保持しているが、正常なタンパク質合成を起こさせるために食物から供給されなければならない。
【００３２】
タンパク質生合成機能とは別に、これらのアミノ酸はこの化合物自体が興味深く、多数が食品、飼料、化学、化粧品、農業、および製薬産業における種々の適用が見出されている。リジンは、ヒトのみならず、家禽およびブタなどの単胃動物の栄養素として重要なアミノ酸である。アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、およびシステインと同様にグルタミン酸は香料（グルタミン酸一ナトリウム）として最も一般に使用されており、食品産業で広く一般に使用されている。グリシン、Ｌ−メチオニン、およびトリプトファンは、全て製薬産業で利用されている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリン、およびアラニンは、製薬産業および化粧品産業の両方で有用である。トレオニン、トリプトファン、およびＤ／Ｌ−メチオニンは、一般的な食品添加物である。（Ｌｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．、１９９６、「アミノ酸−技術的生産および使用」、４６６〜５０２、Ｒｅｈｍら編、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、第１４ａ章、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。さらに、これらのアミノ酸は、合成アミノ酸およびペプチド（Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、（Ｓ）−５−ヒドロキシトリプトファン、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８５に記載の他の合成アミノ酸など）の合成用前駆体として有用であることが見出されている。
【００３３】
アミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十分に特徴づけられている（細菌アミノ酸合成およびその調節についての総説については、Ｕｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７、５３３〜６０６を参照のこと）。グルタミン酸は、αケトグルタル酸（クエン酸回路の中間物）の還元的アミノ化によって合成される。グルタミン、プロリン、およびアルギニンは、それぞれグルタミン酸から引き続いて生成される。セリンの生合成は、３−ホスホグリセリン酸（解糖の中間物）から始まり、酸化、アミノ基転移、および加水分解後にこのアミノ酸が得られる３段階過程である。システインおよびグリシンはセリンから生成され、セリンヒドロキシメチラーゼによって触媒される反応において、前者はホモシステインのセリンとの縮合により、後者はテトラヒドロ葉酸への側鎖β炭素原子の転移による。フェニルアラニンおよびチロシンは、プレフェン酸合成後の最後の２段階のみが異なる９段階生合成経路において解糖経路およびペントースリン酸経路前駆体エリトロース４−リン酸およびホスホエノイルピルビン酸から合成される。トリプトファンはまた、これらの２つの最初の分子から生成されるが、その合成は、１１段階の経路である。チロシンもまた、フェニルアラニンヒドロキシラーゼによって触媒される反応においてフェニルアラニンから合成可能である。アラニン、バリン、およびロイシンは全てピルビン酸の生合成生成物（解糖の最終生成物）である。アスパラギン酸は、オキサロ酢酸（クエン酸回路の中間体）から形成される。アスパラギン、メチオニン、トレオニン、およびリジンは、それぞれアスパラギン酸の変換によって生成される。イソロイシンは、トレオニンから生成される。複雑な９段階経路により、５−ホスホリボシル−１−ピロホスフェート（活性糖）からヒスチジンが生成される。
【００３４】
細胞のタンパク質合成を超えるアミノ酸を蓄積することはできず、代わりに分解されて細胞の主要な代謝経路の中間体が得られる（総説として、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２１章、「アミノ酸分解および尿素回路」、４９５〜５１６、１９８８を参照のこと）。細胞は望ましくないアミノ酸を有用な代謝中間体に変換するにもかかわらず、アミノ酸生成は、合成に必要なエネルギー、前駆体分子、および酵素の点から費用がかかる。したがって、アミノ酸生合成はフィードバック阻害によって調節され、特定のアミノ酸の存在によりその生成が遅延するか完全に停止することは驚くべきことではない（アミノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の総説については、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２４章、「アミノ酸分解および尿素回路」、５７５〜６００、１９８８を参照のこと）。任意の特定のアミノ酸の生成量は、細胞中に存在するこのようなアミノ酸の量に制限される。
【００３５】
Ｂ．ビタミン、補因子、栄養補給物質代謝および使用
ビタミン、補因子、および栄養補給物質は、高等動物が合成能力を失っているので摂取しなければならない別の分子群であるにもかかわらず、これらは細菌などの他の生物によって容易に合成される。これらの分子は、それ自体が生体活性物質であるか、種々の代謝経路における電子伝達体として作用し得る。その栄養価値とは別に、これらの化合物はまた、着色剤、抗酸化剤、および触媒または他の加工助剤として有意な産業上の価値を有する。（構造、活性、および産業上の利用可能性の総説については、例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、「ビタミン」、Ａ２７巻、４４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６を参照のこと）。用語「ビタミン」は、当該分野で認識されており、正常な機能のために生物に必要である、生物自体で合成できない栄養素が含まれる。ビタミン群は、補因子および栄養補給化合物を含み得る。用語「補因子」には、正常な酵素活性の獲得に必要な非タンパク質性化合物が含まれる。このような化合物は、有機であっても無機であってもよく、本発明の補因子は有機が好ましい。用語「栄養補給物質」には、植物および動物、特に、ヒトの健康に有利な栄養補助食品が含まれる。このような分子の例には、ビタミン、酸化防止剤、および一定の脂質（例えば、多価不飽和脂肪酸）である。
【００３６】
細菌などのアミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十分に特徴づけられている（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、「ビタミン」、Ａ２７巻、４４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６、Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．、１９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｏｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１９９５、「栄養素、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマレーシアのペナンで開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジカル研究協会−アジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ Ｘ、３７４Ｓ）。
【００３７】
チアミン（ビタミンＢ1）は、ピリミジンとジアゾール部分との化学結合によって合成される。リボフラビン（ビタミンＢ2）は、グアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）およびリボース−５’−リン酸から合成される。同様に、リボフラビンは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の合成に利用される。集合的に「ビタミンＢ6」と呼ばれる化合物ファミリー（例えば、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサ−５’リン酸、および商業的に使用されるピリドキシン塩酸塩）は全て、共通の構造単位５−ヒドロキシ−６−メチルピリジンの誘導体である。パントテン酸塩（パントテン酸、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（２，４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチル−１−オキソブチル）β−アラニン）を、化学合成または発酵のいずれかによって生成することができる。パントテン酸塩合成の最終工程は、βアラニンおよびパントイン酸のＡＴＰ駆動縮合からなる。パントテン酸、βアラニン変換、およびパントテン酸の縮合用の生合成工程を担う酵素は公知である。パントテン酸塩の代謝活性形態は、補酵素Ａであり、生合成は５つの酵素工程において進行する。パントテン酸塩、ピリドキサル−５’リン酸、システイン、およびＡＴＰは、補酵素Ａの前駆体である。これらの酵素は、パントテン酸形成だけでなく、（Ｒ）−パントテン酸、（Ｒ）−パントラクトン、（Ｒ）−パンテノール（プロビタミンＢ5）、パンテテイン（およびその誘導体）、および補酵素Ａの生成を触媒する。
【００３８】
微生物における前駆体分子ピメロイル−ＣｏＡからのビオチンの生合成は詳細に研究されており、関連するいくつかの遺伝子が同定されている。多数の対応するタンパク質もまた、Ｆｅクラスター合成に関連することが見出されており、タンパク質のｎｉｆＳクラスのメンバーである。リポ酸はオクタン酸由来であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびα−ケトグルタミン酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部となる場合、エネルギー代謝における補酵素として利用される。葉酸塩は、その全てが葉酸の誘導体であり、Ｌ−グルタミン酸、ｐ−アミノ−安息香酸および６−メチルプテリン由来でもある。中間体グアノシン−５’三リン酸（ＧＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸、およびｐ−アミノ安息香酸から出発する葉酸およびその誘導体の合成が、一定の微生物で詳細に研究されている。
【００３９】
コリノイド（コバラミン、特に、ビタミンＢ12）およびポルフィリンは、テトラピロール環系によって特徴づけら得る群に属する。ビタミンＢ12の生合成は非常に複雑であり未だ完全に特徴づけられていないが、関与する酵素および基質は現在公知である。ニコチン酸（ニコチン酸塩）およびニコチンアミドは「ナイアシン」とも呼ばれるプリン誘導体である。ナイアシンは、重要な補酵素ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、およびその還元形態の前駆体である。
【００４０】
これらの化合物の大量生産は、ほとんど無細胞化学合成に依存しているにもかかわらず、これらのいくつかの化合物、例えばリボフラビン、ビタミンＢ6、パントテン酸塩、およびビオチンは微生物の大量培養によって産生されている。ビタミンＢ12のみは、唯一発酵で産生されているが、これはその合成の複雑さによる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法には、相当な材料および時間の投入が必要であり、たいてい非常に費用がかかる。
【００４１】
Ｃ．プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、およびヌクレオチド代謝およびその使用
プリンおよびピリミジン代謝遺伝子およびその対応するタンパク質は、腫瘍性疾患およびウイルス感染治療用の重要な標的である。用語「プリン」または「ピリミジン」には、核酸、補酵素、およびヌクレオチドからなる窒素塩基が含まれる。用語「ヌクレオチド」には、窒素塩基、ペントース糖（ＲＮＡの場合糖はリボースであり、ＤＮＡの場合糖はＤ−デオキシリボースである）、およびリン酸から構成される核酸分子の塩基性構造単位が含まれる。用語「ヌクレオシド」には、ヌクレオチドの前駆体として利用されるが、ヌクレオチドが保有するリン酸部分を欠く分子が含まれる。これらの分子の生合成または核酸分子を形成するその動員の阻害によりＲＮＡおよびＤＮＡ合成の阻害が可能であり、癌細胞を標的する様式での活性の阻害により腫瘍細胞の分裂および複製能力を阻害することができる。さらに、核酸分子を形成しないヌクレオチドが存在するが、これはむしろエネルギー保存物質（すなわち、ＡＭＰ）または補酵素（すなわち、ＦＡＤおよびＮＡＤ）として利用される。
【００４２】
いくつかの刊行物では、プリンおよび／またはピリミジン代謝の影響によるこれらの化学製品の医学的指標としての使用が記載されている（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．ａｎｄ Ｌｙｏｎｓ，Ｓ．Ｄ．、１９９０、「化学療法薬としてのｄｅ ｎｏｖｏでのピリミジンおよびプリン生合成の強力なインヒビター」、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０、５０５〜５４８）。プリンおよびピリミジン代謝に関連する酵素の研究では、例えば免疫抑制剤または抗炎症剤として使用することができる新規の薬物開発が注目されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．、１９９５、「ヌクレオチド合成における酵素」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５、７５２〜７５７、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．、２３、８７７〜９０２）。しかし、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、以下の他の有用性を有する：いくつかの精製化学製品（例えば、チアミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、葉酸塩、またはリボフラビン）の生合成の中間体、細胞のエネルギー担体（例えば、ＡＴＰまたはＧＴＰ）として、および化学製品自体が調味料として（例えば、ＩＭＰまたはＧＭＰ）またはいくつかの医学的適用に使用される（例えば、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、生物工学におけるヌクレオチドおよび関連化学物質、６巻、Ｒｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、５６１〜６１２を参照のこと）。また、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、またはヌクレオチド代謝に関連する酵素は標的としてますます利用されており、作物保護用の化学製品（殺真菌薬、除草剤、および殺虫剤を含む）が開発されている。
【００４３】
細菌におけるこれらの化合物の代謝が特徴づけられている（総説として、例えば、Ｚａｌｋｉｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．、１９９２、「ｄｅ ｎｏｖｏプリンヌクレオチド生合成」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２５９〜２８７およびＭｉｃｈｅａｌ，Ｇ．、１９９９、「ヌクレオチドおよびヌクレオシド」、第８章「生化学経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。プリン代謝は、徹底した研究の主題であり、細胞の正常な機能に必須である。高等動物においてプリン代謝が損なわれると重篤な疾患、例えば、通風を発症し得る。プリンヌクレオチドは、中間体化合物イノシン−５’リン酸（ＩＭＰ）を介した一連の工程においてリボース−５’リン酸から合成され、グアノシン−５’一リン酸（ＧＭＰ）またはアデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）が生成され、ヌクレオチドとして利用される三リン酸形態は容易に形成される。これらの化合物をエネルギー蓄積物質としても利用し、その分解により細胞における多数の生化学的過程のためのエネルギーが得られる。ピリミジン生合成は、リボース−５−リン酸からのウリジン−５’一リン酸（ＵＭＰ）の形成によって進行する。ＵＭＰは、次に、シチジン−５’三リン酸（ＣＴＰ）に変換される。これら全てのヌクレオチドのデオキシ−形態は、ヌクレオチドの二リン酸リボースからヌクレオチドの二リン酸デオキシリボース形態への１工程の還元反応において生成される。リン酸化反応の際、これらの分子はＤＮＡ合成に関与し得る。
【００４４】
Ｄ．トレハロース代謝およびその使用
トレハロースは、α、α−１，１結合で結合された２つのグルコース分子からなる。これは、一般的に、甘味料（乾燥または冷凍食品、および飲料用の添加物）として食品産業で使用されている。しかし、製薬、化粧品、および生物工学産業においても適用されている（例えば、１９９８年Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏらに付与された米国特許第５，５，７５９，６１０号、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、４６０〜４６７、Ｐａｉｖａ，Ｃ．Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｐａｎｅｋ，Ａ．Ｄ．、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．２、２９３〜３１４、およびＳｈｉｓａｋａ，Ｍ．、１９９７、Ｊ．Ｊａｐａｎ、１７２、９７〜１０２を参照のこと）。トレハロースは多くの微生物由来の酵素によって産生され、周囲の培地に天然に放出され、当該分野に公知の方法によって回収することができる。
【００４５】
ＩＩ．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持および環境への適応
細胞が機能する代謝および他の生化学的過程は、温度、圧力、絶対濃度、および酸素の利用可能性などの環境条件に感受性を示す。１つまたは複数のこのような環境条件がこれらの細胞過程の正常な機能に不適合な様式に混乱または変更された場合、細胞は不利な細胞外環境にもかかわらず起こり得る細胞内環境を維持するように作用しなければならない。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ細胞などのグラム陽性細菌細胞は、好ましくない細胞外条件にもかかわらず内部恒常性を維持することができる多数の機構を有する。これらには、細胞壁、毒性の可能性のある芳香族および脂肪族化合物を分解することができるタンパク質、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質を容易に破壊することができるタンパク質分解機構、細菌増殖に至適な条件下では通常起こらない細胞内反応を起こさせる触媒が含まれる。
【００４６】
不利な条件下でほとんど生存しないものは別として、細菌細胞（例えば、Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞）はまた、このような条件をうまく利用することができるように頻繁に適応することができる。例えば、所望の炭素源を欠く条件では、細胞は、あまり適切でない炭素源での増殖に適応することができる。また、細胞は、一般的に利用される無機化合物が利用不可能である場合はあまり望ましくない無機化合物を利用することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は、至適な増殖条件下で代謝のための栄養素および前駆体として通常遭遇しない無機および有機分子を利用するように適応する多数の遺伝子を有する。恒常性および適応に関連する細胞過程の態様を以下にさらに詳述する。
【００４７】
Ａ．芳香族および脂肪族化合物の改変および分解
細菌細胞は、種々の芳香族および脂肪族化合物に日常的に曝されている。芳香族化合物は、環状環構造を有する有機分子であり、脂肪族化合物は環構造よりもむしろ開環鎖構造を有する有機分子である。このような化合物は、産業過程の副産物（例えば、ベンゼンまたはトルエン）として得られ得るが、一定の微生物によっても産生され得る（例えば、アルコール）。これらの化合物の多くは細胞に毒性があり、特に芳香族化合物高エネルギー環構造のために反応性が高い。したがって、一定の細菌は、これらの化合物がもはや細胞に有害でないように改変または分解することができる発達した機構を有する。細胞は、例えば、毒性を低下させるかその改変形態が標準的暗細胞廃棄経路および分解経路によって処理することができるように芳香族または脂肪族化合物をヒドロキシル化、異性化、またはメチル化することができる酵素を有し得る。また、細胞は、１つまたは複数のこのような潜在的に有害な物質を特異的に分解して細胞を保護する酵素を有し得る。細菌におけるこれらの改変および分解過程の型の原理および例は、いくつかの刊行物（Ｓａｈｍ，Ｈ．、１９９９、「工業生産における原核生物」、Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら編、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｈ．Ｇ．、１９９２、Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｇｉｅ、Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）に記載されている。
【００４８】
有害な芳香族または脂肪族化合物を単に不活化することの他に、多くの細菌は、細胞の好ましい炭素源を利用できない場合にこれらの炭素源を代謝の継続のための炭素源としてこれらの化合物を利用することができるように進化している。例えば、炭素源としてトルエン、ベンゼン、および１，１０−ジクロロデカンを利用することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株が公知である（Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｖ．ら、１９９７、Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ、３５（１２）、２８０７〜２８１５、Ｗｉｓｃｈｎａｋ，Ｃ．ら、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４（９）、３５０７〜３５１１、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｓ．Ａ．ら、１９９９、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５（２）、５４９〜５５２）。当該分野で公知の他の多数の細菌種の類似の例が存在する。
【００４９】
一定の細菌の芳香族および脂肪族化合物の改変または分解能力が利用され始めている。石油は脂肪族分子および芳香族化合物を含む化学物質の複雑な混合物である。これらの毒性化合物の分解または改変能力の流出油への適用により、ひどい環境損害を非常に効率的且つ低費用で排除可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．、１９９０、「細菌による報告族炭化水素の生分解」、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、１（２−３）、１９１〜２０６およびＳｕｙａｍａ，Ｔ．ら、１９９８、「脂肪族ポリカーボネートを分解する細菌単離物」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６１（２）、２５５〜２６１を参照のこと）。
【００５０】
Ｂ．無機化合物の代謝
細胞（例えば、細菌細胞）は、大量の異なる分子（水、無機イオン、および有機物質（例えば、タンパク質、糖、および他の高分子）など）を含む。典型的な細胞の大部分の集団は、以下の４つの原子型のみからなる：炭素、酸素、水素、および窒素。これらは細胞内容物のより小さな割合で存在しているにもかかわらず、無機物質は、細胞の正確な機能に等しく重要である。このような分子には、リン酸、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、モリブデン、タングステン、およびコバルトが含まれる。これらの化合物の多くは、重要な分子（ヌクレオチド（リン酸）およびアミノ酸（窒素および硫黄）など）の構築に重要である。これらの他の無機イオンは、酵素反応の補因子として利用されるか、浸透圧に寄与する。このような全ての分子は、周囲環境由来の細菌によって取り込まれなければならない。
【００５１】
これらの各無機化合物では、標準的な代謝装置によって最も容易に使用されることができる形態で細菌に取り込まれることが望ましい。しかし、細菌は好ましい形態を利用することができない環境に遭遇し得る。この環境下で生存するために、細胞は、あまり代謝活性が高くないがこれらの無機化合物の容易に利用可能な形態を細胞代謝で使用することができる形態に変換することができるさらなる生化学的機構を有することが重要である。細菌は、所望の無機種が利用可能でない限り発現しないこの目的のための酵素をコードする多数の遺伝子を多数保有する。したがって、種々の無機化合物の代謝用のこれらの遺伝子は、細菌を使用して最適以下の環境に適用することができる他のツールとして利用される。
【００５２】
炭素に次いで細胞中で最も重要な元素は窒素である。典型的な細菌細胞は、１２〜１５％の窒素を含む。これは、アミノ酸およびヌクレオチドならびに細胞中の多くの他の重要な分子の成分である。さらに、窒素はエネルギー代謝における最終的な電子受容体としての酸素の代替物として利用することができる。良好な窒素源には、多くの有機および無機化合物、アンモニアガス又はアンモニア塩（例えば、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）２ＳＯ4、又はＮＨ4ＯＨ）、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または複合窒素源（トウモロコシ浸漬液、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物など）が含まれる。アンモニア窒素は、以下の特定の酵素の作用によって固定される：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンターゼ、およびグルタミン−２−オキソグルタミン酸アミノトランスフェラーゼ。ある有機分子から別の分子へのアミノ−窒素の転移は、アミノトランスフェラーゼ（あるアミノ基をαアミノ酸またはαケト酸に転移する酵素のクラス）によって達成される。硝酸塩を、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、および標準的な代謝経路において細胞によって容易に利用することができる分子窒素またはアンモニアに変換されるまでの酸化還元酵素を解して還元することができる。
【００５３】
リンは、典型的には、有機および無機形態の両方で細胞内で見出され、同様にこれらの形態のいずれかを細胞は取り込むことができるが、ほとんどの微生物は無機リン酸を取り込むことが好ましい。有機リン酸塩の細胞が利用できる形態への変換には、ホスファターゼ（例えば、フィエート生成リン酸塩およびイノシトール誘導体を加水分解するフィターゼ）の作用が必要である。リン酸塩は、核酸合成のキーエレメントであり、細胞エネルギー代謝（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰの合成）において重要な役割も果たす。
【００５４】
硫黄は、アミノ酸（例えば、メチオニンおよびシステイン）、ビタミン（例えば、チアミン、ビオチン、およびリポ酸）、および鉄硫黄タンパク質の合成に必要である。細菌は、主に、無機硫酸塩から硫黄を得ているにもかかわらず、チオ硫酸塩、亜流酸塩、硫化物もまた一般に利用する。これらの化合物を容易に利用可能ではない条件下で、多くの細菌は、２−アミノスルホン酸（タウリン）などのスルホン酸化合物を利用可能な遺伝子を発現する（Ｋｅｒｔｅｓｚ，Ｍ．Ａ．、１９９３、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓにおける硫酸塩制限によって誘導されるタンパク質」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７５、１１８７〜１１９０）。
【００５５】
他の無機原子（例えば、金属またはカルシウムイオン）はまた、細胞の生存に重要である。例えば、鉄は、酸化還元反応の鍵となる役割を果たし、鉄−硫黄タンパク質、ヘムタンパク質、およびシトクロムの補因子である。鉄の細菌細胞への取り込みは、シデロフォア、細胞外鉄イオンに結合に結合して細胞内に転位させるキレート剤の作用によって達成することができる。鉄および他の無機化合物代謝に対する引例としては、Ｌｅｎｇｅｌｅｒら、１９９９、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら編、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａ．Ｌ．ら編、１９９？、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性細菌」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｖｏｅｔ，Ｄ．ａｎｄ Ｖｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｂｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．ａｎｄ Ｍａｄｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．、１９９１、微生物の生物学、第６版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ：Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、２６７〜２６９、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ｐ．Ｆ．、「応用微生物生理学−実際的アプローチ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。
【００５６】
Ｃ．酵素およびタンパク質分解
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌が最適化される細胞内条件は、頻繁に多くの生化学反応が正常に行われる条件ではない。生理学的条件下でこのような反応を進行させるために、細胞は酵素を使用する。酵素は、生化学反応に対するエネルギー障壁を低下させるように分子と反応するか特殊な環境を獲得するように空間的に配向したタンパク質性生物学的触媒である。異なる酵素は異なる反応を触媒し、各酵素は、適切な条件下で且つ特定の時間反応するような転写、翻訳、または翻訳後調節の対象である。酵素は化合物の分解（例えば、プロテアーゼ）、合成（例えば、シンターゼ）、改変（例えば、トランスフェラーゼまたはイソメラーゼ）に寄与し、その全てが細胞の必要な化合物の生成が可能である。次に、これは、細胞の恒常性の維持に寄与する。
【００５７】
しかし、細菌が最も生存し得る生理学的条件下で酵素活性が至適化されるという事実は、環境条件が混乱した場合に酵素活性が混乱する可能性が高いことを意味する。例えば、温度変化によりタンパク質が異常に折りたたまれ、ｐＨの変化によってもこれは真であるので（タンパク質の折りたたみはポリペプチド鎖内の静電気的および疎水相互作用に非常に依存する）、それぞれのアミノ酸の電荷の任意の変更により（細胞ｐＨの変化によって起こるように）、タンパク質が正確に折りたたまれる能力に対する意味深い効果を有し得る。温度変化は、ポリペプチドのエネルギー的に安定な配置に正確に折りたたむ能力に影響を与えるポリペプチド分子が保有する運動エネルギー量を有効に変化させる。誤折りたたみタンパク質は、２つの理由で細胞に有害であり得る。第１に、異常に折りたたまれたタンパク質は類似の異常な活性を有し得るか、全く活性を示さない。第２に、誤折りたたみタンパク質は他の細胞系による適切な調節に必要な立体配置領域を欠くので、活性であるが非制御の様式であり得る。
【００５８】
細胞は、細胞に任意の損傷を与える前に誤折りたたみ酵素および調節タンパク質を迅速に破壊することができる機構（タンパク質分解）を有する。ｌａ／ｌｏｎファミリーおよびＣｌｐファミリーなどのタンパク質は、誤折りたたみタンパク質を特異的に認識して分解する（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｙ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．、１９９９、ＥＸＳ、７７、５７〜７８およびその参考文献ならびにＰｏｒａｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｊ．、１９９９、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３２（３）、４４９〜５８およびその参考文献、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら、１９９６、「Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．およびその参考文献、ならびにＰｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｇ．Ｇ．ａｎｄ Ｃｏｏｌｂｅａｒ，Ｔ．、１９９３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｒｅｖ．１２（１−３）、１７９〜２０６およびその参考文献を参照のこと）。これらの酵素は誤折りたたみおよび非折りたたみタンパク質に結合して、ＡＴＰ依存様式でこれらを分解する。したがって、タンパク質分解は、環境の変化に対する正常な細胞機能の損傷を防止するために細胞によって使用される重要な機能として利用され、さらに、その他の誤調節および／または異常な酵素または調節活性によって毒性を示す条件および環境下で細胞を生存させる。
【００５９】
タンパク質分解はまた、至適環境条件下での細胞における重要な機能を有する。正常な代謝過程内で、プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解、必要な分解産物を得るための複合体分子の異化作用、およびタンパク質改変を補助する。分泌プロテアーゼは、これらの化合物の細胞への侵入前でさえも外部栄養素の異化において重要な役割を果たす。さらに、タンパク質分解活性自体が調節機能を利用する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子形成およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ種の細胞周期の進行はこれらの各種における鍵となるタンパク質分解事象によって調節されることが公知である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２（２）、１４２〜１４７）。したがって、タンパク質分解過程は、最適以下および最適環境条件下での細胞生存の鍵であり、細胞の恒常性の全体的な維持に寄与する。
【００６０】
Ｄ．細胞壁生成および再配列
細胞の生化学的機構が異なり且つおそらく好ましい環境に容易に適応することができるが、細胞は依然として環境から保護することができる一般的機構を必要とする。多数の細菌では、細胞壁はこのような保護を付与し、接着、細胞増殖および分裂、および所望の溶質および廃棄物質の輸送の役割も果たす。
【００６１】
機能させるために、細胞は、周囲の媒質より実質的に高い細胞内濃度の代謝産物および他の分子を必要とする。疎水性膜の存在のために細胞からのこれらの代謝産物の放出が非常に妨げられるので、系の傾向として、溶質の内部濃度が外部濃度に一致するように水分子が外部媒質から細胞に侵入する。水分子は細胞膜を容易に通過することができ、この膜は得られた膨張および圧力に耐えることができるので、細胞が浸透圧溶解し得る。細胞壁の剛性は、細胞のこれらの圧力への耐性を非常に改善し、さらに細胞由来のこれらの代謝産物および所望の媒質の望ましくない拡散に対するさらなる障壁を付与する。同様に、細胞壁はまた、望ましくない物質の細胞への侵入を防止する。
【００６２】
細胞壁はまた、多数の他の細胞過程、例えば、接着、細胞増殖および分裂などに関与する。細胞壁が細胞を完全に包囲しているという事実のために、細胞のその周囲との任意の相互作用が細胞壁に媒介されなければならない。したがって、細胞壁は、細胞の他の細胞および所望の表面への任意の接着に関与しねければならない。さらに、細胞が増殖または分裂すれば、細胞壁の変化が必ず付随し得る。細胞壁が付与する保護は増殖、形態形成、および増殖の間に必要であるので、細胞分裂中の鍵となる工程の１つは新規の細胞が古い細胞から分裂するような細胞内の細胞壁合成である。したがって、細胞増殖および細胞分裂につれて細胞壁が頻繁に合成される（例えば、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａ．Ｌ．ら編、１９９３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性細菌、ＡＳＭ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。
【００６３】
細胞壁の構造は、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間で異なる。しかし、両型では、以下の壁の基本的構造単位は類似のままである：「ペプチドグリカン」と呼ばれるアミノ酸（最も一般的には、Ｌ−アラニン、Ｄ−グルタミン酸、ジアミノピメリン酸、およびＤ−アラニン）によって架橋された２つの多糖類、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）の重複格子。細胞壁合成に関連する過程は公知である（例えば、Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．、１９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００６４】
グラム陰性細菌では、内部細胞膜は、ムレイン嚢と呼ばれる一重ペプチドグリカン（厚さ約１０ｎｍ）で覆われている。このペプチドグリカン構造は、非常に強靭で、その構造により生物の形態が決定される。ムレイン嚢の外表は、ポーリンおよび他の膜タンパク質、リン脂質、およびリポ多糖を含む外膜で覆われている。外膜との強固な会合を維持するために、グラム陰性細胞壁はまた、細胞壁を周囲の膜に固着させるために使用される分散型の脂質分子を有する。
【００６５】
グラム陽性細菌（コリネバクテリウムグルタミカムなど）では、原形質膜は、厚さ２０〜８０ｎｍの範囲の多重ペプチドグリカンによって覆われている（例えば、Ｌｅｎｇｅｌｅら編、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、９１３〜９１８、８７５〜８９９、および８８〜１０９ならびにその参考文献を参照のこと）。グラム陽性細胞壁はまた、テイコ酸（リン酸基を介して結合したグリセロールまたはリビトールのポリマー）を含む。テイコ酸はまたアミノ酸と会合することができ、ムラミン酸と共有結合を形成する。リポタイコ酸およびタイクロン酸もまた存在し得る。存在する場合、鞭毛または夾膜などの細胞表面構造もこの層に固着される。
【００６６】
ＩＩＩ．本発明の要素および方法
本発明は、少なくとも一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす、本明細書中でＨＡ核酸およびタンパク質分子と呼ばれる新規の分子の発見に基づく。１つの実施形態では、ＨＡ分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有する。好ましい実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性に関する本発明のＨＡ分子の活性は、この生物による所望の精製化学製品の生産に影響を与える。特に好ましい実施形態では、本発明のＨＡ分子は、ＨＡ分子が関与するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞過程（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性）の活性が変化して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによる所望の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接的または間接的に調整されるように活性を調整する。
【００６７】
用語「ＨＡタンパク質」または「ＨＡポリペプチド」には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ恒常性に関連する多数の細胞工程またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の好ましくない環境条件への適応能力に関連するタンパク質が含まれる。例えば、ＨＡタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関連するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有し得る。ＨＡタンパク質の例には、表１および偶数の配列番号に記載のＨＡ遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。用語「ＨＡ遺伝子」または「ＨＡ核酸配列」には、コード領域および対応する非翻訳５’および３’配列領域からなるＨＡタンパク質をコードする核酸配列が含まれる。ＨＡ遺伝子の例には、表１に記載の遺伝子が含まれる。用語「生産」または「生産性」は、当該分野で認識されており、所与の時間および所与の発酵体積（例えば、ｋｇ産物／時間／リットル）以内で形成された発酵産物（例えば、所望の精製化学製品）が含まれる。用語「生産効率」には、達成すべき特定の生産レベルに必要な時間（例えば、精製化学製品の特定の速度を達成するための細胞が要する時間）が含まれる。用語「生産量」または「産物／炭素量」は当該分野で認識されており、炭素源の産物（すなわち、精製化学製品）への変換効率が含まれる。これは、一般に、例えばｋｇ産物／炭素源と記載される。化合物の生産量または生産の増加により、回収された分子の量または所与の時間に対する所与の培養量中のその化合物の有用な回収分子の量が増加する。用語「生合成」または「生合成経路」は当該分野で認識されており、多工程で且つ高度に調節された過程における中間体化合物からの細胞による化合物、好ましくは有機化合物の合成が含まれる。用語「分解」または「分解経路」は当該分野で認識されており、多工程で且つ高度に調節された過程における分解産物（一般に、より小さいか複雑でない分子）への細胞による化合物、好ましくは有機化合物の破壊が含まれる。用語「代謝」は当該分野で認識されており、生物で行われた生化学反応の全てが含まれる。特定の化合物の代謝（例えば、グリシンなどのアミノ酸の代謝）は、細胞におけるこの化合物に関する全ての生合成、改変、および分解経路を含む。用語「恒常性」は当該分野で認識されており、細胞外環境条件に支配されているにもかかわらず一定の細胞な環境を維持するために細胞によって利用されている機構の全てが含まれる。このような過程の非限定的な例は、高細胞内媒質濃度による浸透圧溶解の防止のための細胞壁の利用である。用語「適応」または「環境条件への適応」は当該分野で認識されており、好ましくない環境条件下（一般に、１つまたは複数の好ましい栄養素が存在しない環境条件または細胞の至適生存範囲外の温度、ｐＨ、浸透圧、酸素の割合などの環境条件）で生存することができるように細胞によって利用される機構が含まれる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含む多くの細胞は、このような条件下で発現し、且つこのような最適以下条件で増殖を続けるタンパク質をコードする遺伝子を有する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明のＨＡ分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物における精製化学製品などの所望の分子の産生を調整することができる。本発明のＨＡタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。例えば、これらの酵素の活性または数を増加または減少させるように芳香族化合物または脂肪族化合物を改変する酵素操作により、これらの化合物の改変または分解産物である１つまたは複数の精製化学製品の生産を調整することができる。同様に、無機化合物代謝に関連する酵素により、アミノ酸、ビタミン、および核酸などのこのような精製化学製品の生合成用の鍵となる分子（例えば、亜リン酸、硫黄、および窒素分子）が得られる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのこれらの酵素の活性または数の変更により、これらの無機化合物変換の増加（または代わりの無機化合物の使用）によりこれらの精製化学製品への無機原子の組み込み率を改良可能である。一般的な細胞過程に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素の遺伝子操作により、これらの酵素の多くが精製化学製品（例えば、アミノ酸）または精製化学製品合成または分泌に関連する酵素を直接改変するので、精製化学製品の生産を直接改良することもできる。細胞プロテアーゼの活性または数の調整はまた、多数のプロテアーゼが精製化学製品または精製化学製品の生産もしくは崩壊に関連する酵素を分解することができるので、精製化学製品に直接影響を与え得る。
【００６９】
さらに、芳香族／脂肪族化合物の改変もしくは分解、一般的な生体触媒反応、無機化合物代謝、またはタンパク質分解に関与する上記の酵素自体が、その活性が種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ産業に適用に望ましい精製化学製品である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの１つまたは複数のこれらの酵素のコピー数の変更により、細胞によって産生されるこれらの酵素の数を増加させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の大量培養物由来のこれらのタンパク質の潜在的生産量または生産効率を増加させることができる。
【００７０】
本発明のＨＡタンパク質の変更はまた、このような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与え得る。例えば、細胞壁の構築または再配列に関連するこれらのタンパク質の活性および／または数の調整により、細胞が機械的ストレスおよび大量発酵培養中の他のストレスにより良好に耐えることができるように細胞壁の構造自体を改変することができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量増殖には、有意な細胞壁産生が必要である。細胞壁生合成または分解酵素の活性または数の調整により細胞壁をより迅速に生合成可能であり、それによりこの培養微生物の培養における増殖速度を増加させることができ、それにより所望の精製化学製品の生産細胞数を増加させることができる。
【００７１】
本発明のＨＡ酵素の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、または生産効率に直接影響を与えることもできる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多数の一般的酵素は、細胞過程全体（例えば、調節過程）に有意に影響を与え、それにより精製化学製品の代謝に有意な影響を与える。同様に、プロテアーゼ、毒性を示す可能性のある芳香族または脂肪族化合物を改変または分解する酵素、および無機化合物の代謝を促進する酵素は全てＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの生存度の増大に役立つ。プロテアーゼは、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質、例えば、大量発酵槽培養中に遭遇する比較的ストレスの多い環境条件下で生じ得るタンパク質などの選択的除去を支援する。これらのタンパク質の変更によって、この活性をさらに向上させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養における生存度を改良することができる。芳香族／脂肪族の改変または分解タンパク質は、これらの廃棄化合物（培養培地中の不純物または細胞自体の廃棄物として遭遇し得る）の解毒だけでなく、最適な炭素源が培養物中で制限されている場合に細胞が代替炭素源を利用するのにも役立つ。その数および／または活性の増加により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存を向上させることができる。本発明の無機代謝タンパク質は、全てのタンパク質およびヌクレオチド（など）の合成に必要な無機分子を細胞に供給するので、細胞の全体的な生存度に重要である。大量培養における１つまたは複数の所望の精製化学製品を生産する生細胞数の増加により、培養による精製化学物質の生産量、生産、および／または生産効率が付随的に増加するはずである。
【００７２】
本発明の単離核酸配列は、ＡＴＣＣ １３０３２と命名されたアメリカンタイプカルチャーコレクションから利用可能なＣｏｒｙｅｂａｃｔｅｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノム内に含まれる。単離Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質の推定アミノ酸配列を、配列表にそれぞれ奇数の配列番号および偶数の配列番号として示す。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の改変もしくは分解に関連するか、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するタンパク質をコードする配列としてのこれらのヌクレオチド配列を分類および／または同定するコンピュータ分析を行った。
【００７３】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に実質的に相補的なアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書中に記載のように、選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質は、選択されたアミノ酸配列、例えば、選択されたアミノ酸配列全体に少なくとも５０％相同である。選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質はまた、選択アミノ鎖配列に約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であり得る。
【００７４】
本発明のＨＡタンパク質またはその生物活性部分またはフラグメントは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たすか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し得る。
【００７５】
本発明の種々の態様を、以下の小節でさらに詳述する。
【００７６】
Ａ．単離核酸分子
本発明の１つの態様は、ＨＡポリペプチドまたはその生物活性部分をコードする単離核酸分子ならびにＨＡコード核酸（例えば、ＨＡ ＤＮＡ）の同定または増幅用のハイブリッド形成プローブまたはプライマーとしての使用に十分な核酸フラグメントに関する。本明細書中に記載のように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。この用語はまた、遺伝子の３’および５’コード領域に存在する非翻訳配列（コード領域の５’末端から少なくとも約１００ヌクレオチド上流の配列および遺伝子のコード領域の３’末端から少なくとも約２０ヌクレオチド下流）を含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。「単離」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離した分子である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、ＨＡ核酸分子は、核酸が由来する細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離」核酸分子（ＤＮＡ分子など）は、他の細胞物質、組換え技術によって産生された場合は培養培地、または化学合成された場合は化学前駆体または他の化学物質を実質的に含み得ない。
【００７７】
本発明の核酸分子（例えば、配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配列を有する核酸分子）またはその一部を、標準的な分子生物学技術および本明細書中で得られた配列情報を使用して単離することができる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡを、ハイブリッド形成プローブとして配列表の奇数の配列番号の１つの全てまたは一部および標準的なハイブリッド形成技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載）を使用してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍライブラリーから単離することができる。さらに、本発明の核酸配列（例えば、奇数の配列番号）の１つの全てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる（例えば、本発明の核酸配列（例えば、配列表の奇数の配列番号）の１つの全てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる）。例えば、ｍＲＮＡを、正常な内皮細胞から単離することができ（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４〜５２９９のグアニジニウム−チオシアン酸塩抽出法による）、ＤＮＡを逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから市販のＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから市販のＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマーを、配列表に記載のヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することができる。本発明の核酸を、標準的暗ＰＣＲ増幅技術によるテンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを使用して増幅することができる。このようにして増幅した核酸を、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけることができる。さらに、ＨＡヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用した標準的技術によって調製することができる。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表に記載のヌクレオチド配列の１つを含む。本発明の核酸配列は、配列表に記載のように、本発明のコリネバクテリウムグルタミカム ＨＡ ＤＮＡに対応する。このＤＮＡは、ＨＡタンパク質をコードする配列（すなわち、配列表のそれぞれ奇数の配列番号の配列中に表示の「コード領域」）ならびに配列表のそれぞれ奇数の配列番号に表示の５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。あるいは、核酸分子は、配列表の核酸配列中の任意の配列のコード領域のみを含む。
【００７９】
本出願の目的のために、配列表に記載の各核酸およびアミノ酸配列は、記号表示「ＲＸＡ」、「ＲＸＮ」、「ＲＸＳ」、または「ＲＸＣ」のあとに５桁の数字を有するＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ識別番号（すなわち、ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３）ことが理解される。各核酸配列は、以下の３つまでの部分を含む：５’上流領域、コード領域、および下流領域。混乱をなくすために、これらのそれぞれ３つの領域を同一のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示で識別する。詳述「配列表の奇数番号の配列の１つ」は、異なるＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示によって区別することもできる配列表の任意の核酸配列をいう。これらの各配列のコード領域は、対応するアミノ酸配列に翻訳され、これはまた、偶数の配列番号（配列表に対応する核酸配列の直後）として記載されている。例えば、ＲＸＡ０２５４８のコード領域を配列番号１に記載し、これがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明の核酸分子の配列は、容易に相関することができるようにコードされるアミノ酸分子と同一のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示によって識別される。例えば、ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３と表示されたアミノ酸配列は、それぞれ核酸分子ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３のヌクレオチド配列のコード領域の翻訳物である。本発明のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣヌクレオチドおよびアミノ酸配列と割り当てた配列番号との間の対応を、表１に示す。
【００８０】
本発明のいくつかの遺伝子は、「Ｆ表示遺伝子」である。Ｆ表示遺伝子には、ＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示の前に「Ｆ」を有する表１に記載の遺伝子が含まれる。例えば、表１に「Ｆ ＲＸＡ００２４９」と表示の配列番号５は、配列番号１１、１５、および３３のＦ表示遺伝子（それぞれ表１に「Ｆ ＲＸＡ０２２６４」、「Ｆ ＲＸＡ０２２７４」、および「Ｆ ＲＸＡ００６７５」として表示）である。
【００８１】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、表２に集めた核酸分子を含むことを意図しない。ｄａｐＤ遺伝子の場合、この遺伝子の配列は、Ｗｅｈｒｍａｎｎ，Ａ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０、（１２）、３１５９〜３１６５で公開されていた。しかし、本出願の発明で得られた配列は、公開されたものより有意に長い。公開された変形形態は不正確な開始コドンに依存するので実際のコード領域のフラグメントのみを示すと考えられる。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つまたはその一部の相補物である核酸分子を含む。本発明のヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の１つとハイブリッド形成して安定な二重らせんを形成することができるように配列表のヌクレオチド配列（例えば、奇数の配列番号の配列）の１つに十分に相補的である分子である。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。さらに好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の１つまたはその一部とハイブリッド形成する、例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
さらに、本発明の核酸分子は、配列表の奇数の配列番号の１つの配列領域をコードする部分のみ（例えば、ＨＡタンパク質の生物活性部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用することができるフラグメント）を含み得る。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＨＡ遺伝子のクローニングから同定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型および生物のＨＡホモログならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａまたは関連種由来のＨＡホモログの同定および／またはクローニング用に設計されたプローブおよびプライマーを作製可能である。プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つのセンス鎖、これらの配列のアンチセンス配列、または天然に存在するその変異体の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、より好ましくは少なくとも約４０、５０、または７５個の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含む。本発明のヌクレオチド配列に基づくプライマーをＰＣＲ反応で使用して、ＨＡホモログをクローン化することができる。ＨＡヌクレオチド配列に基づいたプローブを使用して、同一または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブは、これに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブを、細胞サンプル中のＨＡコード核酸レベルの測定（例えば、ＨＡ ｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＨＡ遺伝子が変異または欠失しているかどうかの同定）などによってＨＡタンパク質を誤発現する細胞の同定用の診断試験キットの一部として使用することができる。
【００８５】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するように本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相同的なアミノ酸配列含むタンパク質またはその一部をコードする。本明細書中で使用されるように、「十分に相補的な」は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるように本発明のアミノ酸配列に同一または等価な最小数のアミノ酸残基、例えば、配列表の偶数の配列番号の１つの配列中のアミノ酸残基として類似の側鎖を有するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部をいう。本明細書中に記載のように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有するタンパク質は、１つまたは複数の精製化学製品の生産および分泌で役割を果たし得る。このような活性の例はまた、本明細書中に記載されている。したがって、「ＨＡタンパク質の機能」は、１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接的または間接的に寄与する。ＨＡタンパク質活性の例は、表１に記載されている。
【００８６】
別の実施形態では、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。
【００８７】
本発明のＨＡ核酸分子によってコードされるタンパク質部分は、ＨＡタンパク質の１つの生物活性部分であることが好ましい。本明細書中で使用されるように、用語「ＨＡタンパク質の生物活性部分」は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たすか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し得るＨＡタンパク質の一部、例えば、ドメイン／モチーフを含むことが意図される。ＨＡタンパク質またはその生物活性部分がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解に関連することができるかＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するかどうかを同定するために、酵素活性アッセイを行うことができる。例示の実施例８に詳述のように、このようなアッセイ法は当業者に周知である。
【００８８】
ＨＡタンパク質の生物活性部分をコードするさらなる核酸フラグメントを、本発明のアミノ酸配列（配列表の偶数の配列番号の配列）の１つの一部の同定、ＨＡタンパク質またはペプチドのコード部分の発現（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換え発現による）、およびＨＡタンパク質またはペプチドのコード部分の活性の評価によって調製することができる。
【００８９】
本発明は、さらに、遺伝コードの縮重のために本発明のヌクレオチド配列（配列表の奇数の配列番号の配列）の１つ（およびその一部）と異なるが本発明に記載のヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＨＡタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表に記載のアミノ酸配列（偶数の配列番号）を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。なおさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明のアミノ酸配列（配列表の奇数の配列番号に記載の読み取り枠によってコードされる）に実施的に相同な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質をコードする。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明の配列は本発明の以前に利用可能であった当該分野の配列、たとえば、表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列などを含むことを意味すると当業者に理解される。１つの実施形態では、本発明は、先行技術の配列（例えば、表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列（またはこのような配列によってコードされるたんぱく質））よりも高い本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する同一％を有するヌクレオチドよび核酸配列を含む。例えば、本発明は、ＲＸＡ００４７１（配列番号２９３）と記号表示されたヌクレオチド配列に３９％を超えるおよび／または少なくとも３９％同一なヌクレオチド配列、ＲＸＡ００５００（配列番号１４３）と記号表示されたヌクレオチド配列に４１％を超えるおよび／または少なくとも４１％同一なヌクレオチド配列、およびＲＸＡ００５０２（配列番号１４７）と記号表示されたヌクレオチド配列に３５％を超えるおよび／または少なくとも３５％同一なヌクレオチド配列を含む。当業者は、所与の配列についてそれぞれ３つの上位のヒットについて表４に記載のＧＡＰ計算同一％スコアの試験および１００％から最も高いＧＡＰ計算同一％の引き算によって本発明の任意の所与の配列の同一％のより低い閾値を計算することができる。当業者はまた、このようにして計算したより低い閾値より高い同一％（例えば、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または、９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一）を有する核酸またはアミノ酸配列もまた本発明に含まれることを認識する。
【００９１】
奇数の配列番号のとして配列表に記載のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡヌクレオチドに加えて、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多形が集団（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ母集団）内に存在し得ることが当業者に認識される。ＨＡ遺伝子におけるこのような遺伝子多形は、天然の変動による集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＨＡタンパク質、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質をコードする読み取り枠を含む核酸分子をいう。このような天然の変動により、典型的には、ＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列が１〜５％変動し得る。天然の変動の結果であり、ＨＡタンパク質の機能活性が変化していない任意および全てのこのようなヌクレオチドの変動および得られたＨＡのアミノ酸多形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９２】
天然の変異型および本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡの非Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモログに対応する核酸分子を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標準的なハイブリッド形成技術のハイブリッド形成プローブとして、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤＮＡまたはその一部を使用して本明細書中に開示のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ核酸に対する相同性に基づいて単離することができる。したがって、別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の実施形態では、核酸は、少なくとも３０、５０、１００、２５０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。本明細書中で使用される、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」は、典型的には互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリッド結合したままであるハイブリッド形成および洗浄条件を記載することが意図される。好ましくは、互いに少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、またはそれ以上の条件の相同性で典型的に互いにハイブリッド形成を維持する。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．、１９８９、６．３．１〜６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントな条件の好ましい非限定的な例は、４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリッド形成後の５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される、「天然に存在する」核酸分子は、自然に発生する（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。１つの実施形態では、核酸は、天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質をコードする。
【００９３】
集団中に存在し得るＨＡ配列の天然に存在する変異型に加えて、当業者は、変化により変異による本発明のヌクレオチド配列が挿入され、それによりＨＡタンパク質の機能的活性を変化させることなくコードされたＨＡタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができることをさらに認識する。本発明のヌクレオチド配列中で、例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸を置換させるヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＨＡタンパク質活性を変化させることなくＨＡタンパク質（例えば、配列表の偶数の配列眼号）１つの野生型配列から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基はＨＡタンパク質活性に必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＨＡ活性を有するドメイン中で変換されないか半変換のみされる残基）は活性に必須ではないので、ＨＡ活性を変化させない変化に感受性を示すこともあり得る。
【００９４】
したがって、本発明の別の態様は、ＨＡ活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むＨＡタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＨＡタンパク質は、本明細書中に記載のＨＡ活性の少なくとも１つを依然として保持する配列表の偶数の配列番号の配列と核酸配列が異なる。１つの実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、本発明のアミノ酸配列に少なくとも約５０％相同なアミノ酸配列を含み、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子にコードされるタンパク質は、配列表の奇数の配列番号の１つのアミノ酸配列に約５０〜６０％相同、より好ましくはこれらの配列に少なくとも約６０〜７０％相同、より好ましくはこれらの配列に少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％相同、最も好ましくは本発明のアミノ酸配列の１つに少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【００９５】
２つのアミノ酸配列（本発明のアミノ酸の１つまたはその変異体）または２つの核酸の相同％を同定するために、配列を最適に比較できるように整列させる（例えば、他のタンパク質または核酸と最適に整列させるために１つのタンパク質または核酸配列にギャップを挿入することができる）。対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。１つの配列（本発明のアミノ酸配列の１つ）中の位置は、他の配列（例えば、アミノ酸配列の変異形態）中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列間の相同％は、同一の位置での配列の共有数の関数である（すなわち、相同％＝同一の位置数／全位置数×１００）。
【００９６】
本発明のタンパク質配列に相同なＨＡタンパク質（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）をコードする単離核酸分子を、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードタンパク質に移入されるような１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失の本発明のヌクレオチド配列への移入によって作製することができる。変異を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術によって本発明のヌクレオチド配列の１つに移入することができる。好ましくは、１つまたは複数の推定非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ＨＡタンパク質における推定非必須アミノ酸残基を、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。あるいは、変異を、飽和変異誘発などによってはコード配列の全てまたは一部に無作為に移入することができ、得られた変異体は本明細書中に記載のＨＡ活性についてのスクリーニングしてＨＡ活性を維持している変異体を同定することができる。配列表の奇数の配列番号１つのヌクレオチド配列の変異誘発後、コードタンパク質を組換え発現させることができ、タンパク質活性を、例えば本明細書中に記載のアッセイ（例示の実施例８を参照のこと）を使用して同定することができる。
【００９７】
上記のＨＡタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、アンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、例えば二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的なタンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全ＨＡコード鎖に相補的であっても、その一部のみに相補的であっても良い。１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されたコドンを含むヌクレオチド配列（例えば、配列番号３（ＲＸＮ００２４９）の全コード領域は１〜９５７のヌクレオチドを含む）をいう。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＨＡをコードするヌクレオチドのコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接した５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【００９８】
本明細書中に開示のＨＡをコードするコード鎖配列（例えば、配列表の奇数の配列番号として記載の配列）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸を、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ塩基対合にしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＨＡ ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、ＨＡ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＡ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野で公知の手順を使用した化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるかアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重らせんの物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを使用して化学合成することができる（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）。アンチセンス核酸を作製するために使用することができる改変ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアミン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノー３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、核酸がアンチセンス方向でサブクローン化される発現ベクターを使用して、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることができる（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である（以下の小節にさらに記載する））。
【００９９】
本発明のアンチセンス核酸は、典型的には、ＨＡタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するかそれに結合してタンパク質発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳の阻害による）ように、細胞に投与されるかｉｎ ｓｉｔｕで作製される。ハイブリッド形成は、従来のヌクレオチド相補性によって、または例えばＤＮＡ二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主要な溝における特異的相互作用によって安定な二本鎖を形成することであり得る。アンチセンス分子を、例えばアンチセンス核酸分子の細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体への連結によって選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変することができる。アンチセンス核酸分子を、本明細書中に記載のベクターを使用して細部に送達させることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、原核生物、ウイルス、または真核生物強力プロモーターの制御下でアンチセンス核酸分子が存在するベクター構築物が好ましい。
【０１００】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常β単位と対照的に鎖が互いに並行である相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５、３２７〜３３０）を含み得る。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、相補領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡなど）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ヒト化リボザイム（Ｈａｓｅｌｇｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、５８５〜５９１に記載））を使用してＨＡ ｍＲＮＡ転写物を触媒反応で切断して、ＨＡ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＨＡコード核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書中に記載のＨＡ ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号３（ＲＸＮ００２４９））に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＨＡコードｍＲＮＡ中で切断されるべきヌクレオチド配列に相補的なＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、Ｃｅｃｈらに付与された米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらに付与された同第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＨＡ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子プール由来の特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１０２】
あるいは、ＨＡ遺伝子発現を、ＨＡヌクレオチド配列の調節領域（例えば、ＨＡプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列の標的によって阻害して、標的細胞中でＨＡ遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成することができる。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、６（６）、５６９〜８４、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０、２７〜３６、およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．、１９９２、Ｂｉｏａｓｓｅｙｓ、１４（１２）、８０７〜１５を参照のこと。
【０１０３】
Ｂ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、ＨＡタンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、さらなるセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターである。一定のベクターは、移入された宿主細胞中の自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への移入の際に宿主細胞ゲノムに取り込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一定のベクターは、作動可能に連結される遺伝子発現を指向することができる。このようなベクターを、本明細書中では「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的なベクターの形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかし、本発明は、等価の機能を果たすウイルスベクターなどのこのような発現ベクターの他の形態（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むことを意図する。
【０１０４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターには、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された発現用に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクター内で「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が調節配列にヌクレオチド配列を発現させる様式で連結されていることを意味することが意図される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系中「またはベクターが宿主細胞内に移入されている場合は宿主細胞中）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化部位）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０に記載されている。調節配列には、多数の宿主細胞型でのヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列および一定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列が含まれる。好ましい調節配列は、例えば、細菌中で使用されることが好ましいプロモーター（ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩq−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰＯ２、λ−ＰR−、またはλＰLなど）である。さらなる調節配列は、例えば、酵母および真菌由来のプロモーター（ＡＤＣ１、Ｍｆα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨなど）、植物由来のプロモーター（ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターなど）である。人工プロモーターも使用可能である。発現ベクターの設計は形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者に認識される。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に移入して、本明細書中に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＨＡタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０１０５】
本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中でのＨＡタンパク質発現用に設計することができる。例えば、ＨＡ遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母および他の真菌細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ Ｍ．Ａ．ら、１９９２、「酵母での外来遺伝子の発現：総説」、Ｙｅａｓｔ、８、４２３〜４８８、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、１９９１、「「糸状菌における異種遺伝子発現：真菌におけるより多数の遺伝子操作」、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ ＆ Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ編、３９６〜４２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ．Ｐ．Ｊ．、１９９１、「糸状菌用の遺伝子導入系およびベクターの開発：真菌の応用分子遺伝学」、Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照のこと）、藻類および多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、１９８８、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの葉および子葉移植編を介した有効性の高いＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、５８３〜５８６を参照のこと）、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０でさらに考察されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【０１０６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指向する構成性または誘導プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に起こる。融合ベクターは、コードされるタンパク質（通常、組換えタンパク質のアミノ末端であるがＣ末端にも）アミノ酸数を追加するか、タンパク質内の適切な領域内で融合される。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的で利用される：１）組換えタンパク質発現の増加、２）組換えタンパク質の溶解性の増加、および３）親和性精製におけるリガンドとしての作用による組換えタンパク質精製の補助。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解結合部位と組換えタンパク質部分の分離を可能にするための組換えタンパク質との融合部分の接合部に移入し、その後融合タンパク質のを精製する。このような酵素およびその同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。
【０１０７】
典型的な融合発現ベクターには、組換えタンパク質に、それぞれ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、１９８８、Ｇｅｎｅ、６７、３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。１つの実施形態では、ＨＡタンパク質のコード配列を、ｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化して、ＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質をＮ末端からＣ末端まで含む融合タンパク質をコードするベクターを作製する。融合タンパク質を、グルタチオンアガロース樹脂を使用した親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＳＴに融合していない組換えＨＡタンパク質を、トロンビンとの融合タンパク質の切断によって回収することができる。
【０１０８】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６９、３０１〜３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、ｐＢｄＣｌ、およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０、６０〜８９、およびＰｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクター由来の標的遺伝子発現は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）の同時発現によって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター由来の転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下でＴ７ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。細菌の他の変種の形質転換のために、適切なベクターを選択することができる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、およびｐＩＪ３６１はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの形質転換に有用であり、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の形質転換に適切であることが公知である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍについての遺伝情報の伝達用のいくつかのプラスミドには、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓら編、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。
【０１０９】
組換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、組換えタンパク質のタンパク質分解による切断能力を損なった宿主細菌中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０、１１９〜１２８）。別のストラテジーは、各アミノ酸の各コドンが発現用に選択された細菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど）中で好ましく利用されるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更を、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１１０】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用のベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、６、２２９〜２３４）、２μ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐ１３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ、３０、９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５４、１１３〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。糸状菌などの他の真菌での使用に適切なベクターおよびベクターの構築法には、以下に記載のものが含まれる：ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆ Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．、１９９１、「糸状菌の遺伝導入系およびベクターの開発」、「真菌の応用分子遺伝学」、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｅｒｄｙら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、およびＰｏｕｗｅｌｓら編、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８。
【０１１１】
あるいは、本発明のＨＡタンパク質を、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現することができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３、２１５６〜２１６５）、およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０、３１〜３９）が含まれる。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明のＨＡタンパク質を単細胞植物細胞（藻類など）または高糖植物由来の植物細胞（例えば、作物植物などの種子植物）中で発現させることができる。植物発現ベクターの例には、以下に記載のものが含まれる：Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．、１９９２、「左側の境界近くに存在する選択マーカーを有する新規の植物に成分ベクター」、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０、１１９５〜１１９７およびＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．、１９８４、「植物形質転換用の二成分Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１２、８７１１〜８７２１ならびにｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、およびｐＤＨ５１（Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物ベクターを使用して哺乳動物細胞に発現させる。哺乳動物発現細胞の例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．、６、１８７、１９５）が含まれる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節エレメントによって得られる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞用の他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１１４】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で核酸の発現を指向することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、２６８〜２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ、１９８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３、２３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞レセプター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ．、８、７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３、７２９〜７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３、７４１〜７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメント、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ、１９８９、ＰＮＡＳ、８６、５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、９１２〜９１６）、および哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願２６４，１６６）が含まれる。発達調節プロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３７４〜３７９）およびαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ、１９８９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、３、５３７〜５４６）もまた含まれる。
【０１１５】
本発明は、さらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＨＡ ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子を発現可能な様式（ＤＮＡ分子の転写による）で調節配列を作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を指向する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列を選択することができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成性、特異的、または細胞型特異的発現を指向するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節領域の制御下で酸性され、その活性をベクターが移入された細胞型によって同定することができる組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、「遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１（１）、１９８６を参照のこと。
【０１１６】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが移入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では交換可能に使用される。このような用語は、特定の本件の細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫についてもいうことが理解される。変異または環境の影響により継代につれて一定の改変が生じ得るので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではないが、本明細書中で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１１７】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＨＡタンパク質を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。本発明の核酸およびタンパク質分子の宿主細胞として都合よく使用することができるコリネバクテリウムグルタミカムに関連する微生物を、表３に記載する。
【０１１８】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に移入することができる。本明細書中で使用される、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「接合」、および「形質導入」は、種々の分野で認識されている外来核酸（例えば、線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ベクターを含まない線状ベクターまたは遺伝子構築物のみ）またはベクターの形態（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポゾン、または他のＤＮＡ）の核酸の宿主細胞への移入技術（リン酸化カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、天然の能力、化学薬品媒介導入、またはエレクトロポレーションを含む）である。適切な宿主細胞の形質転換法またはトランスフェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験マニュアルに見出すことができる。
【０１１９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さなフラクションのみを外来ＤＮＡのそのゲノムに取り込むことができることが公知である。この取り込みを同定および選択するために、一般に、選択マーカーをコードする遺伝子（抗生物質耐性など）を、目的の遺伝子と共に宿主細胞に移入する。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物に耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸を、ＨＡタンパク質をコードするベクターと同一のベクターに対して宿主細胞に移入するか、別個のベクターに移入することができる。移入核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を、例えば、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。
【０１２０】
相同組換え微生物を作製するために、欠失、付加、置換によってＨＡ遺伝子が変化した（例えば、機能破壊）ＨＡ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。好ましくは、ＨＡ遺伝子はコリネバクテリウムグルタミカムＨＡ遺伝子であるが、関連細菌、または哺乳動物、酵母、または昆虫起源由来のホモログであり得る。好ましい実施形態では、相同組換えの際に内因性ＨＡ遺伝子が機能的に破壊されるようなベクター（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない（「ノックアウト」ベクターともいう））を設計する。あるいは、相同組換えの際に内因性ＨＡ遺伝子が変異されているか変更されているが依然として機能性タンパク質をコードするような（例えば、上流調節領域を変更して内因性ＨＡタンパク質発現を変更することができる）ベクターを設計することができる。相同組換えベクターでは、ＨＡ遺伝子の変更部分はベクターが保有する外因性ＨＡ遺伝子と微生物中の内因性は遺伝子との間で相同組換えが起こるようにＨＡ遺伝子のさらなるアミノ酸がその５’および３’末端に隣接している。さらなる隣接ＨＡ核酸は、内因性遺伝子との首尾の良い相同組換えに十分な長さである。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端）をベクター中でインキュベートする（例えば、相同組換えベクターの説明については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１、５０３を参照のこと）。ベクターを微生物に移入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、移入ＨＡ遺伝子が内因性ＨＡ遺伝子と相同組換えされた細胞を当該分野で公知の技術を使用して選択する。
【０１２１】
別の実施形態では、移入遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む組換え微生物を産生させることができる。例えば、ｌａｃオペロンの制御下に置いたベクターへのＨＡ遺伝子の封入により、ＩＰＴＧの存在下のみでＨＡ遺伝子を発現する。このような調節系は当該分野で周知である。
【０１２２】
別の実施形態では、宿主細胞中の内因性ＨＡ遺伝子を、そのタンパク質産物が発現しないように破壊する（例えば、相同組換えまたは当該分野で公知の他の遺伝的手段）。別の実施形態では、宿主細胞中の内因性または移入ＨＡ遺伝子は、１つまたは複数の点変異、欠失、または逆位によって変化されるが、機能性ＨＡタンパク質を依然としてコードする。さらに別の実施形態では、微生物中のＨＡ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）を、ＨＡ遺伝子発現が調整されるように変更した（例えば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。当業者は、１つを超える所望のＨＡ遺伝子およびタンパク質改変を含む宿主細胞を本発明の方法を使用して容易に産生させることができ、これは本発明に含まれることを意味することが認識される。
【０１２３】
本発明の宿主細胞、例えば、原核生物または真核生物培養細胞などを使用して、ＨＡタンパク質を産生（すなわち、発現）させることができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を使用したＨＡタンパク質の産生法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、ＨＡタンパク質が産生されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞（ＨＡタンパク質をコードする組換え発現ベクターが移入されているか、ゲノムに野生型または変更ＨＡタンパク質をコードする遺伝子が移入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態では、この方法は、さらに、培地または宿主細胞からＨＡタンパク質を単離する工程を包含する。
【０１２４】
Ｃ．単離ＨＡタンパク質
本発明の別の態様は、単離ＨＡタンパク質およびその生物活性部分に関する。「単離」または「精製」タンパク質またはその生物活性部分は、組換えＤＮＡ技術によって産生された細胞物質または化学合成の場合には化学物質前駆体もしくはたの化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は、タンパク質が天然または組換えによって産生された細胞の細胞性分から分離されているＨＡタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の非ＨＡタンパク質（本明細書中では「夾雑タンパク質」ともいう）、より好ましくは約２０％未満の非ＨＡタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の非ＨＡタンパク質、最も好ましくは約５％未満の非ＨＡタンパク質を含むＨＡタンパク質調製物を含む。ＨＡタンパク質またはその生物活性部分が組換えによって産生された場合、培養培地を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の体積で存在する。用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質の合成に関連する化学物質前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されたＨＡタンパク質調製物を含む。１つの実施形態では、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、より好ましくは約２０％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、最も好ましくは約５％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質を有するＨＡタンパク質調製物を含む。好ましい実施形態では、単離タンパク質またはその生物活性部分は、ＨＡタンパク質が由来する同一の生物由来の夾雑タンパク質を欠く。典型的には、このようなタンパク質を、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質の組換え発現によって産生する。
【０１２５】
本発明の単離ＨＡタンパク質またはその一部は、ＤＮＡの修復または組換え、遺伝物質の転位、遺伝子発現（すなわち、転写または翻訳過程）、タンパク質折りたたみ、またはコリネバクテリウムグルタミカムのタンパク質分泌に関与し得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有する。好ましい実施形態では、タンパク質またはその一部が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するように、タンパク質またはその一部は本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相同なアミノ酸配列を含む。タンパク質の一部は、本明細書中に記載の生物活性部分であることが好ましい。別の好ましい実施形態では、本発明のＨＡタンパク質は、配列表の偶数の配列番号として記載のアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を有する。さらに別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明の核酸配列の１つに少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部によってコードされるアミノ酸配列またはその一部を有する。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。本発明の好ましいＨＡタンパク質はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのは活性を有する。例えば、本発明の好ましいＨＡタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成し（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与し得るか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たし得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
他の実施形態では、ＨＡタンパク質は、上記の小節Ｉに詳述のように、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に実質的に相補的であり、天然の変動または変異誘発によってアミノ酸配列が異なるが本発明の１つまたは複数のアミノ酸配列の一部の機能的活性を保持している。したがって、別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含み、本明細書中に記載の少なくとも１つのＨＡ活性を有するタンパク質である。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。別の実施形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質に関する。
【０１２７】
ＨＡタンパク質の生物活性部分には、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）由来のアミノ酸配列、ＨＡタンパク質に相補的なタンパク質のアミノ酸配列（少なくとも１つのＨＡタンパク質活性を示す、全長ＨＡタンパク質よりも少ないアミノ酸またはＨＡタンパク質に相補的な全長ＨＡアミノ酸を含む）が含まれる。典型的には、生物活性部分（ペプチド、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長のペプチド）は、少なくとも１つのＨＡタンパク質活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、他のタンパク質領域が欠失した他の生物活性部分を組換え技術で調整して、本明細書中に記載の１つまたは複数の活性について評価することができる。好ましくは、ＨＡタンパク質の生物活性部分には、生物活性を有する１つまたは複数の選択ドメイン／モチーフまたはその一部が含まれる。
【０１２８】
ＨＡタンパク質は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を、発現ベクター（上記）にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞（上記）に移入し、宿主細胞中でＨＡタンパク質を発現させる。次いで、ＨＡタンパク質を、標準的な精製技術を使用した適切な精製スキームによって細胞から単離することができる。組換え発現の代わりに、ＨＡタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを標準的にペプチド合成技術を使用して化学合成することができる。さらに、天然のＨＡタンパク質を、例えば本発明のＨＡタンパク質またはそのフラグメントを利用した標準的な技術によって作製することができる抗ＨＡ抗体を使用して細胞（例えば、上皮細胞）から単離することができる。
【０１２９】
本発明はまた、ＨＡキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される、ＨＡ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＨＡポリペプチドに作動可能に連結されたＨＡポリペプチドを含む。「ＨＡポリペプチド」は、ＨＡタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、「非ＨＡタンパク質」は、ＨＡタンパク質に実質的に相同でないタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質と異なり、且つ同一および異なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質では、用語「作動可能に連結された」は、ＨＡポリペプチドおよび非ＨＡポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことが意図される。非ＨＡポリペプチドをＨＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。例えば、１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＨＡ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＨＡ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＨＡタンパク質の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＨＡタンパク質である。一定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ＨＡタンパク質の発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用によって増加させることができる。
【０１３０】
好ましくは、本発明のＨＡキメラタンパク質および融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術で産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術にしたがって、例えば、ライゲーション用のスタッガー末端または付着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのる仮ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションの使用によって、インフレームで互いにライゲーションする。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成することができる。あるいは、２つの連続的遺伝子間の相補的オーバーハングを引き起こす固着プライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行い、その後アニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、「現代の分子生物学プロトコール」、Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多数の発現ベクターが市販されている。ＨＡコード核酸を、融合部分がＨＡタンパク質にインフレームで連結するように、このような発現ベクターにクローン化することができる。
【０１３１】
ＨＡタンパク質のホモログを、変異誘発（例えば、ＨＡタンパク質の点変異または短縮）によって作製することができる。本明細書中で使用される、「ホモログ」は、ＨＡタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＨＡタンパク質の変異形態をいう。ＨＡタンパク質のアゴニストは、ＨＡタンパク質の実質的に同一またはサブセットの生物活性を保持することができる。ＨＡタンパク質のアンタゴニストは、例えば、機能的相互作用不可能になるようなＨＡタンパク質を含む生物学的カスケードの下流または上流メンバーへの競合的結合、ＨＡタンパク質が相互作用する標的分子への結合、またはＨＡタンパク質への直接的結合およびその通常の活性の阻害によってＨＡタンパク質の天然に存在する形態の１つまたは複数の活性を阻害することができる。
【０１３２】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質のホモログを、ＨＡタンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）の組み合わせライブラリーのＨＡタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてのスクリーニングによって同定することができる。１つの実施形態では、ＨＡ変異型の雑色ライブラリーを、核酸レベルでの組み合わせ変異誘発によって作製し、これは、雑色遺伝子ラブラリーによってコードされる。ＨＡ変異型の雑色ライブラリーを、例えば、潜在的なＨＡ配列の縮重セットがそれぞれのポリペプチドとしてあるいはＨＡ配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現可能なように、遺伝子配列への合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素ライゲーションによって産生させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＨＡホモログを産生するために使用することができる種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化ＤＮＡ合成機で行うことができ、その後合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションする。遺伝子の縮重セットの使用により、所望の潜在的なＨＡ配列のセットをコードする配列の全てを１つの混合物から獲得可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９、３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３、３２３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８、１０５６、Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１、４７７を参照のこと）。
【０１３３】
さらに、ＨＡタンパク質をコードするフラグメントのライブラリーを使用して、ＨＡタンパク質のホモログのスクリーニングおよびその後の分泌用のＨＡタンパク質の雑色集団を作製することができる。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーを、１分子あたり１回のみニックが起こる条件下でのヌクレアーゼでのＨＡコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントの処理、二本鎖ＤＮＡの変性、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させるためのＤＮＡの再生、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理による再形成二重らせんからの一本鎖部分の除去、および得られたフラグメントライブラリーの発現ベクターへのライゲーションによって作製することができる。この方法により、発現ライブラリーは、種々のサイズのＨＡタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、内部フラグメントをコードするベクターに由来し得る。
【０１３４】
点変異または短縮によって作製される組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングおよび選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用のいくつかの技術は、当該分野で公知である。このような技術は、ＨＡホモログの組み合わせ変異誘発によって作製される遺伝子ライブリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。高処理分析に利用可能な巨大な遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術には、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出により産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子の発現が含まれる。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリー中の帰納的変異体の頻度を向上させる技術）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＨＡホモログを同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ、１９９２、ＰＮＡＳ、８９、７８１１〜７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６（３）、３２７〜３３１）。
【０１３５】
別の実施形態では、細胞ベースのアッセイを利用した、当該分野で周知の方法の使用によって雑色ＨＡライブラリーを分析することができる。
【０１３６】
Ｄ．本発明の使用および用途
本明細書中に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、融合タンパク質、プライマー、ベクター、および宿主細胞を、以下の１つまたは複数の方法で使用することができる：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連生物の同定、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関連する生物のゲノムマッピング、目的のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列の同定および局在化、進化研究、機能に必要なＨＡタンパク質領域の同定、ＨＡタンパク質活性の調整、１つまたは複数の無機化合物代謝の調整、１つまたは複数の芳香族または脂肪族化合物の改変または分解の調整、細胞壁の合成または再配列の調整、酵素活性またはタンパク質分解の調整、および所望の化合物（精製化学製品など）の細胞による生産の調整。
【０１３７】
本発明のＨＡ核酸分子は、種々の用途がある。第１に、これを使用して、コリネバクテリウムグルタミカムまたはその密接な関連生物である生物を同定することができる。また、これを使用して、微生物の混合集団中のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはその関連生物の存在を同定することができる。本発明により、この生物に固有のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子領域にまたがるプローブを使用したストリンジェントな条件下での微生物の固有または混合集団の培養物からの抽出ゲノムＤＮＡの探索によって、多数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子の核酸配列が得られ、この生物が存在するかどうかを確認することができる。コリネバクテリウムグルタミカム自体は非病原性であるにもかかわらず、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅなどの病原種に関連する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅはジフテリアの原因物質であり、局所および全身性病態を含む急速に発症する（急性の）熱性感染症である。この疾患では、上気道が局所的に損傷し、上皮細胞が壊死性損傷を受け、バチルスが身体の離れた感受性組織に汎発する毒素を分泌する。変性による変化は、これらの組織（心臓、筋肉、末梢神経、副腎、腎臓、肝臓、および脾臓を含む）におけるタンパク質合成の阻害によって引き起こされ、全身性疾患を引き起こす。ジフテリアは、世界の多くの地域（アフリカ、アジア、東欧、および旧ソ連の独立国を含む）で高い発生率が維持されている。後者の２つの地域でのジフテリアの持続的流行により、１９９０年以来少なくとも５，０００人が死亡している。
【０１３８】
１つの実施形態では、本発明は、被験体におけるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の同定法を提供する。この方法には、被験体における本発明の１つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列表の奇数または偶数の配列番号に記載の配列）の検出による被験体におけるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の検出が含まれる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは関連細菌であり、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の多数の各鎖の予備タンパク質分子がＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの核酸およびタンパク質分子と相同であり、それにより被験体中のＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの検出に使用することができる。
【０１３９】
本発明の核酸およびタンパク質分子はまた、ゲノムの特異的領域についてのマーカーとして利用することができる。これは、ゲノムのマッピングだけでなく、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質の機能研究に有用である。例えば、特定のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＮＡ結合タンパク質に結合するゲノム領域を同定するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムを消化し、フラグメントをＤＮＡ結合タンパク質とインキュベートすることができる。タンパク質に結合するフラグメントを、好ましくは容易に検出可能な標識とともに本発明の核酸分子を用いてさらに探索することができる。このような核酸分子のゲノムフラグメントへの結合により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムマップへのフラグメントの局在化が可能であり、異なる酵素で複数回行った場合は、タンパク質が結合する核酸配列の迅速な同定が容易になる。さらに、本発明の核酸分子は、関連種の配列に十分に相同であり得るので、これらの核酸分子は関連細菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍなど）のゲノムマップの構築用のマーカーとして利用することができる。
【０１４０】
本発明のＨＡ核酸分子はまた、進化およびタンパク質構造研究に有用である。本発明の分子が関連する恒常性の適応および維持に関連する過程を、広範な種々の種に利用される。本発明の核酸分子配列と他の生物由来の類似の酵素をコードする配列との比較により、生物の進化上の関連を評価することができる。同様に、このような比較により、配列領域の保存の有無、酵素機能に必須のタンパク質領域の同定を補助することができる評価を行うことが可能である。この同定の型はタンパク質操作研究に価値があり、タンパク質が機能を喪失することなく変異誘発に耐性を示すかどうかの指標を得ることができる。
【０１４１】
本発明のＨＡ核酸分子の操作により、野生型ＨＡタンパク質と異なる機能を有するＨＡタンパク質を産生可能である。これらのタンパク質を、効率または活性を改良するか、細胞中に通常よりも多数の細胞を存在させるか、効率または活性を減少させることができる。
【０１４２】
本発明は、ＨＡタンパク質自体またはＨＡタンパク質の基質もしくは結合パートナーとの相互作用または本発明のＨＡ核酸分子の転写または翻訳の調整のいずれかによる、ＨＡタンパク質活性を調整する分子のスクリーニング法を提供する。このような方法では、本発明の１つまたは複数のＨＡタンパク質を発現する微生物を、１つまたは複数の試験化合物と接触させ、ＨＡタンパク質の活性または発現レベルに対する各試験化合物の効果を評価する。
【０１４３】
細胞壁生合成または再配列に関連するＨＡタンパク質の活性および数の調整により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の精製化学製品の生産、生産量、および／または生産効率に影響を与えることができる。例えば、これらのタンパク質活性の変更により、細胞壁の構造または厚さを調整可能である。細胞壁は、浸透圧溶解および損傷の外部起源に対する保護デバイスとして高頻度で利用される。細胞壁の改変によって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量発酵培養中のこの微生物が遭遇する機械的および剪断力に耐える能力の増大が可能である。さらに、各Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は厚い細胞壁で覆われているので、大量培養中に存在する生物量の大部分は細胞壁からなる。細胞壁合成速度の増加または細胞壁合成の活性化（本発明のＨＡ細胞壁タンパク質の遺伝子操作による）により、微生物の増殖速度を改良することが可能である。同様に、細胞壁分解に関連するタンパク質の活性または数の減少または細胞壁生合成の進行の減速により、全体的な細胞壁産生を増加させることができる。生きているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞数の増加（上記の任意のタンパク質の変更で達成可能なように）により、大量発酵槽培養における所望の精製化学製品を産生する細胞数を増加させ、それにより培養由来のこれらの化合物の生産量または生産効率が増加するはずである。
【０１４４】
芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＨＡタンパク質の活性または数の調整はまた、この細胞由来の１つまたは複数の精製化学製品の産生に直接的または間接的に影響を与え得る。一定の芳香族または脂肪族の改変または分解生成物は、望ましい精製化学製品である（例えば、有機酸または改変芳香族および脂肪族化合物）。したがって、これらの改変（例えば、水酸化、メチル化、または異性化）または分解反応を行う酵素の改変により、これらの所望の化合物の生産量の増加が可能である。同様に、上記の反応による改変または分解生成物をさらに分解する経路に関連するタンパク質の活性または数の減少により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来のこれらの精製化学製品の生産量を改良可能である。
【０１４５】
これらの芳香族および脂肪族の改変および分解酵素はそれ自体が精製化学製品である。精製形態では、これらの酵素を使用して、汚染部位のバイオレメディエーション用、廃棄物の分解操作用、または所望の改変芳香族または脂肪族化合物またはその分解生成物（そのうちのいくつかを培養による他の精製化学製品生産化合物の炭素源またはエネルギー源として都合よく使用することができる）の大量生産および経済的に可能な生産用の芳香族および脂肪族化合物（例えば、石油製品などの毒性化学物質）を分解することができる（例えば、Ｆａｂｅｒ，Ｋ．、１９９５、「有機化学における生体内変換」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎおよびその参考文献、ならびにＲｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編、１９９２〜１９９６、「予備的生体内変換」、Ｗｉｌｅｙ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒおよびその参考文献を参照のこと）。他の細胞機構による調節を減少させるか排除するようなこれらのタンパク質の遺伝的変更により、これらのタンパク質の全体的な数または活性を増加させ、それによりこれらの精製化学製品の生産量だけでなくこれらの回収されたタンパク質の活性も改良可能である。
【０１４６】
これらの芳香族および脂肪族化合物の改変および分解酵素の改変はまた、１つまたは複数の精製化学製品の生産に間接的に影響を与え得る。多数の芳香族および脂肪族化合物（培養培地中で遭遇し得る化合物または細胞代謝由来の廃棄物など）は細胞に有毒であり、これらを容易に除去または破壊することができるようなこれらの化合物の改変および／または分解により、細胞の生存度は増加するはずである。さらに、これらの酵素は、得られた産物が細胞の通常の炭素代謝経路に入り、それにより細胞はこれらの化合物を代替炭素源またはエネルギー源として使用することができる様式でこれらの化合物を改変または分解することができる。大量培養の状況では、最適な炭素源の量は制限され得るので、これらの酵素により、栄養源として芳香族または脂肪族化合物を使用して細胞が増殖または分裂し続けることができる方法が得られる。いずれかの場合、所望の精製化学製品生産培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞数の増加により精製化学物質の生産量または生産効率が増加する。
【０１４７】
無機化合物代謝に関連するＨＡタンパク質の活性または数の改変はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の培養由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産に直接的または間接的に影響を与え得る。例えば、多数の望ましい精製化学製品（核酸、アミノ酸、補因子、およびビタミン（例えば、チアミン、ビオチン、およびリポ酸）など）を、無機分子（リン、硝酸塩、硫酸塩、および鉄）なしでは合成できない。本発明の無機代謝タンパク質により細胞は種々の無機化合物からこれらの分子を獲得し、種々の精製化学製品生合成経路に送達させることが可能である。したがって、これらの無機化合物代謝に関連する酵素の活性または数の増加により、おそらく制限される無機分子の供給を増加させることが可能であり、それによりこのような変更タンパク質を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の種々の生成化学物質の生産または生産効率を直接的に増大可能である。本発明の無機代謝酵素の活性または数の改変によってもＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが制限された無機化合物の供給をより良好に利用するか最適でない無機化合物をアミノ酸、ビタミン、補因子、または核酸（これらは全て細胞の増殖の継続および複製に必要である）の合成に利用可能である。大量培養におけるこれらの細胞の生存度の改良により、培養における１つまたは複数の精製化学製品産生Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の数を増加させることができ、それにより１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産効率を増加させることができる。
【０１４８】
一般的な過程のためのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素は、それ自体が望ましい精製化学製品である。酵素の特異的特性（例えば、位置特異性および立体特異性など）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学反応用の有用な触媒となる。全Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞を、細胞中で所望の生成物が酵素によって産生されるように適切な基質とインキュベートすることができるか、所望の酵素をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ培養物（または関連細菌）から過剰産生および精製して産業上の設定条件（溶液中または適切な固定相上への固定）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に利用することができる。いずれかの状況で、酵素は天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質であり得るか、活性を変更させるように変異誘発することができる。このような酵素の典型的な産業上の用途には、化学工業（例えば、合成有機化学）における触媒として、食品添加物として、飼料成分として、果物処理用、皮革調製用、洗剤、分析および薬物、および繊維工業（例えば、Ｙａｍａｄａ，Ｈ．、１９９３、「有用な有機化合物生産のための微生物反応」、Ｃｈｉｍｉｃａ、４７、５〜１０、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．、「調製用生体内変換：合成化学における酵素および完全細胞の使用」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、１、１５７〜１６９、Ｚａｋｓ，Ａ．ａｎｄ Ｄｏｄｄｓ，Ｄ．Ｒ．、１９９７、「医薬品合成への生体触媒反応生体内変換の適用」、ＤＤＴ ２、５１３〜５３１、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．、１９９７「光学活性形態の生物活性天然生成物およびアナログの調整用の控訴の使用」、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１、１〜２０、Ｆａｂｅｒ，Ｋ．、１９９５、「有機化学における生体内変換」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編、１９９２〜９６、「調製用生体内変換」、Ｗｉｌｅｙ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｐ．Ｓ．Ｊ．、１９９５、「産業への酵素の適用」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｓｅｍａｎ，Ａ．編、Ｅｌｉｓ：Ｈｏｒｗｏｏｄ、４１９〜５５２、およびＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７、第Ａ９巻、「酵素」、３９０〜４５７を参照のこと）が含まれる。したがって、これらの酵素の活性または数の増加により、細胞の供給物質の所望の生成物への変換または大量培養による生産量増加のためのこれらの酵素の過剰産生も可能である。さらに、これらのタンパク質の変異誘発により、細胞がより多数のこれらの酵素を産生および活性化し、それにより大量培養による精製化学物質の生産量、生産、生産効率を増加可能であるように、フィードバック阻害または他の抑制的細胞調節を取り除くことが可能である。さらに、これらの酵素の操作により、１つまたは複数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ代謝経路（１つまたは複数の精製化学製品の生合成または分泌経路など）の活性を変化させることができる。
【０１４９】
活性または数が変化するような本発明のタンパク質分解酵素変異誘発はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接的または間接的に影響を与え得る。例えば、これらのタンパク質の活性または数の増加により、大量培養における細菌の生存能力を増大可能であり、これは、発酵槽培養中に遭遇する高温、非至適ｐＨ、および他のストレスによる誤折りたたみタンパク質の細胞の迅速な分解能力の増加による。これらの培養における細胞数の増加により、培養における比較的多数の化合物産生細胞数のために、１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産効率を増加させることができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は、外来栄養素を細胞によって炭素／エネルギー源または他の種の栄養素としてより容易に取り込むことができる分子に分解するために利用される多細胞表面プロテアーゼを有する。これらの酵素の活性または数の増加により、この代謝回転を改良し、利用可能な栄養素レベルを増加させ、細胞増殖または産生を改良することができる。したがって、本発明のプロテアーゼの改変より、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ精製化学物質生産に間接的に影響を与えることができる。
【０１５０】
これらのプロテアーゼが所望の精製化学製品の生産または分解に関与する場合、本発明の１つまたは複数の精製化学製品の改変に対する精製化学製品生産にさらに影響を与えることができる。精製化学製品または精製化学製品合成に関連するタンパク質を分解するプロテアーゼ活性の増加により、精製化学製品のレベルを増加可能である（化合物の分解の現象または合成の増加による）。同様に、精製化学製品または精製化学製品の分解に関連するタンパク質が得られる化合物を分解するプロテアーゼの活性の増加により、類似の結果が得られるはずである（これらの操作タンパク質を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の所望の精製化学製品レベルの増加）。
【０１５１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の精製化学製品の生産量を増加させるＨＡタンパク質の上記の変異誘発ストラテジーは、制限を意味しない。これらのストラテジーの変形形態は、当業者に容易に認識される。このようなストラテジーの使および本明細書中に開示の機構の組み込みによって、本発明の核酸およびタンパク質分子を利用して、変異ＨＡ核酸およびタンパク質分子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌を作製して所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効率を改良することができる。この所望の化合物は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによって産生された任意の生成物であり得るが、これには、生合成経路の最終生成物および天然に存在する代謝経路の中間物、ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの代謝において天然では得られないが本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株によって産生される分子が含まれる。
【０１５２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての引例、特許出願書類、特許、公開された特許出願書類、表、および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
【表３】
【０１５６】
【表４】
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
【表７】
【０１６０】
【表８】
【０１６１】
【表９】
【０１６２】
【表１０】
【０１６３】
【表１１】
【０１６４】
【表１２】
【０１６５】
【表１３】
【０１６６】
【表１４】
【０１６７】
【表１５】
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
【表１７】
【０１７０】
【表１８】
【０１７１】
【表１９】
【０１７２】
【表２０】
【０１７３】
【表２１】
【０１７４】
【表２２】
【０１７５】
【表２３】
【０１７６】
【表２４】
【０１７７】
【表２５】
【０１７８】
【表２６】
【０１７９】
【表２７】
【０１８０】
【表２８】
【０１８１】
【表２９】
【０１８２】
【表３０】
【０１８３】
【表３１】
【０１８４】
【表３２】
【０１８５】
【表３３】
【０１８６】
【表３４】
【０１８７】
【表３５】
【０１８８】
【表３６】
【０１８９】
【表３７】
【０１９０】
【表３８】
【０１９１】
【表３９】
【０１９２】
【表４０】
【０１９３】
【表４１】
【０１９４】
【表４２】
【０１９５】
【表４３】
【実施例】
【０１９６】
実施例１：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC13032の全ゲノムＤＮＡの製造
コリネバクテリウムグルタミカム (ATCC13032）の培養は、激しく攪拌したＢＨＩ媒体（Ｄｉｆｃｏ）中で、３０℃で終夜行なわれた。細胞は遠心分離により回収され、上澄みを処分し、細胞は、５ｍｌの緩衝液Ｉ（最初の培養容積の５％、すべての示された容積は、１００ｍｌの培養容積のために計算されたものである。）中再懸濁された。緩衝液Ｉの組成は、１４０．３４ｇ／ｌのショ糖、２．４６ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、１０ｍｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4溶液（１００ｇ／ｌ、ＫＯＨでｐＨ６．７に調整）、５０ｍｌ／ｌのＭ１２濃縮物（１０ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０.２ｇ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍｌ／ｌのトレース−エレメンツ−ミックス（２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ4ｘＨ2Ｏ、１０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ2ｘ４Ｈ2Ｏ、３０ｍｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、２０ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、１ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ、５００ｍｇ／ｌの錯化剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸）、１００ｍｌ／ｌのビタミン−ミックス（０．２ｍｇ／ｌのビオチン、０．２ｍｇ／ｌの葉酸、２０ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０ｍｇ／ｌのリボフラビン、４０ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシウム、１４０ｍｇ／ｌのニコチン酸、４０ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキソール、２００ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール）である。リゾチームを最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるまで懸濁液に加えた。約４時間、３７℃での培養の後、細胞壁を劣化させ得られたプロトプラストを遠心分離によって回収した。ペレットを５ｍｌの緩衝液Ｉで一度、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で一度洗浄した。ペレットを４ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、０．５ｍｌのＳＤＳ溶液（１０％）と０．５ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）を加えた。プロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるまで加えた後、懸濁液を約１８時間、３７℃で培養した。ＤＮＡを標準的な操作で、フェノール、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびクロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出により精製した。それから、ＤＮＡを１／５０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積のエタノールを加えて析出させ、次いで３０分間、−２０℃でインキュベートし、ＳＳ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用した高速遠心分離機で１２０００ｒｐｍで遠心分離を３０分間行なった。ＤＮＡを２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、４℃で、少なくとも３時間１０００ｍｌのＴＥ緩衝液に対して透析した。この間、緩衝液を３度交換した。透析したＤＮＡ溶液の０．４ｍｌの部分に、０．４ｍｌの２ＭＬｉＣｌと０．８ｍｌのエタノールを加えた。３０分間、−２０℃でインキュベートした後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｆｒｅｓｃｏ，Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液に溶解した。この操作により製造されたＤＮＡは、すべての目的、サザンブロット法またはゲノムライブラリーの構築に使用することができた。
【０１９７】
実施例２：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC13032のEscherichia Coliにおけるゲノムライブラリーの構築
実施例１に記載したように製造されたＤＮＡを用いて、コスミッドおよびプラスミドライブラリーが、公知で、よく確立された方法に従って構築された(例えば、Sambrook,Jら、(1989)'Molecular Cloning:A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.Mら(1994) 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons.を参照）。
【０１９８】
どんなプラスミドまたはコスミッドでも使用することができた。特別に、プラスミドpBR322（Sutcliffe, J.G.(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3737-3741);pACYC177 (Change とCohen(1978) J.Bacteriol 134:1141-1156),pBSの系列のプラスミド(pBSSK+,pBSSK-およびその他；Stratagene LaJolla,USA),またはSuperCos1（Stratagene LaJolla,USA)、Lorist6(Gibson,T.J.,Rosenthal A.およびWaterson,R.H.(1987) Gene 53:283-286)のコスミッドが使用された。特にC.glutamicumにおいて使用するためのジーンライブラリーは、プラスミドpSL109( Lee,H.S.およびA.J.Sinskey(1994) J.Microbiol.Biotechnol.4:256-263)を用いて構築することができる。
【０１９９】
実施例３：ＤＮＡシーケンスとコンピューターによる機能解析
実施例２に記載されたゲノムライブラリーを標準的な方法、特にＡＢＩ３７７シーケンスマシーンを用いた鎖成長停止反応法（例えばFleischman,R.D.ら(1995)'Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.',Science, 269:496-512参照）に従ったＤＮＡシーケンスに使用した。以下のヌクレオチド配列のシーケンスプライマーが使用された：5'-GGAAACAGTATGACCATG-3'（SEQ ID NO:441）または5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'（SEQ ID NO:442）。
【０２００】
実施例４：生体内突然変異誘発
コリネバクテリウムグルタミカムの生体内突然変異誘発が、E.coliまたは他の微生物(例えばBacillus spp.またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母）であってその遺伝子情報の完全性を保つための能力が減じられているものを通して、プラスミド（または他のベクター）の通過により行なうことができる。典型的なミューテーター株は、ＤＮＡ修復システム（例えばmutHLS,mutD,mutTその他；Rupp,W.D.(1996) DNA repair mechanisms,Escherichiacoli and Salmonella、p2277-2294、ASM:Washington参照）の遺伝子に変異を持っている。このような株は当業者によく知られている。このような株の使用は、例えばGreener,A.およびCallahan,M.(1994) Strategies 7:32-34に記載されている。
【０２０１】
実施例５：Escherichia coli および コリネバクテリウムグルタミカムの間のＤＮＡ転換
いくつかのCorynebacteriumとBrevibacterium種は自律的に複製する(例えば、Martin, J.F.ら(1987) Biotechnology, 5:137-146参照）内因性プラスミド（例えばpHM1519またはpBL1)を含む。Escherichia coliとCorynebacuterium glutamicumのシャトルベクターは、E.coliの標準ベクター（Sambrook,J.et al.(1989),'Molecular Cloning:A Laboratory Manual',Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.M.et al.(1994)'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons)を用いて、これに、開始または複製のおよび適当なコリネバクテリウムグルタミカム由来のマーカーを加えることで容易に構築することができる。このような複製の開始点は、好ましくはCorynebacteriumとBrevibacterium種から単離された内因性プラスミドからもたらされる。これらの種の形質転換マーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３トランスポゾンから誘導されたもの）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Winnacker,E.L.(1987)'From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology,VCH,Weinheim)が特に用いられる。E.coli とC.glutamicumの双方でおいて複製するシャトルベクターの広範囲の構築の文献は数多く例があり、遺伝子過剰発現を含むいくつかの目的に使用することができる（例えば、Yoshihama,M.et al.(1985) J.Bacteriol. 162:591-597, Martin,J.F.et al.(1987) Biotechnology,5:137-146 およびEikmanns,B.J.et al.(1991) Gene, 102:93-98参照）。
【０２０２】
標準的な方法を用いて、上述のように注目の遺伝子をシャトルベクターの一つヘクローンすることが可能であり、またこのようなハイブリッドベクターをコリネバクテリウムグルタミカム株に導入することが可能である。C.glutamicumの形質転換を、プロトプラスト形質転換（Kastsumata,R.et al.(1984) J.Bacteriol. 159306-311),エレクトロポレーション（Liebl,E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters,53:399-303)そして特別のベクターが用いられた場合には、接合（例えば Schaefer,A et al.(1990)J.Bacteriol.172:1663-1666に記載）によって達成することができる。C.glutamicumからのプラスミドＤＮＡの製造（周知の標準的な方法を用いて）およびそのE.Coliへの形質転換によるC.glutamicumからE.coliへのシャトルベクターの転換も可能である。この形質転換の段階は、標準的な方法を用いて行なうことができるが、Ｍｃｒ−不足E.coli株、例えばＮＭ５２２(Gough and Murray(1983)J.Mol.Biol.166:1-19)を使用することが有利である。
【０２０３】
遺伝子は、ｐＣＧ１（U.S.patent No.4617267)またはその断片、任意でＴＮ９０３（Grindley,N.D.and Joyce,C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12):7176-7180)からのカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いたC.glutamicum 株中に過剰発現させることができる。加えて、遺伝子は、プラスミドｐＳＬ１０９（Lee,H.S and A.J.Sinskey(1994) J.Microbiol Biotechnol.4:256-263)を用いてC.Glutamicum株中に過剰発現することができる。
【０２０４】
複製プラスミドに加えて、遺伝子の過剰発現は、ゲノムへの組み込みによって達成することができる。C.glutamicum または他のCorynebacteriumまたはbrevibacterium種における遺伝子組み込みは、周知の方法、例えばゲノム領域での相同性組換え、制限エンドヌクレアーゼ仲介の組み込み（ＲＥＭＩ）（例えばDE patent 19823834)またはトランスポゾンの使用などによって達成することができる。調節領域（例えば、プロモーター、レプレッサー、および／またはエンハンサー）を配列の修飾、挿入、サイト−ダイレクテド法（例えば相同性組換え）による削除、またはランダムイベントに基づく方法（例えばトランスポゾン突然変異誘発またはＲＥＭＩ）により変形することにより、注目遺伝子の活性を変化させることもできる。転写ターミネーターとして機能する核酸配列は、本発明の一以上の遺伝子のコード領域へ３’挿入されることもできる。このようなターミネーターは、周知であり、例えばWinnacker, E.L. (1987)From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim中に記載されている。
【０２０５】
実施例６：変異タンパクの発現の評価
形質転換された宿主細胞中の変異タンパクの活性の観察は、変異タンパクが、野生種のタンパクと類似した形態と類似した量で発現されるという事実に基づいている。変異遺伝子（遺伝子産物に対する転写に用いられるｍＲＮＡの量のインジケーター）の転写のレベルを確認するために有用な方法は、ノーザン・ブロット法（Ausubel et al.(1988) Current Protocols in Molecular Bioloｇy, Wiley: New York参照)であり、注目遺伝子に結合するように設計されたプライマーが、検出タグ（通常放射性または化学ルミネセンス）により、生物の培養の総ＲＮＡを抽出し、ゲルに流し、安定マトリックスに移動させ、このプローブでインキュベートする場合に、プローブの結合および結合の量が、この遺伝子のｍＲＮＡの存在と量を示すようにラベルされている。この情報は、変異遺伝子の転写の程度の証拠である。全部の細胞のＲＮＡは、いくつかの周知の方法、例えば、 Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326に記載された方法により、コリネバクテリウムグルタミカムから製造することができる。
【０２０６】
このｍＲＮＡから翻訳されたタンパクの存在と比較量の評価のために、ウェスタン・ブロッド法などの標準的な技術が使用され得る(例えばAusubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York参照)。この方法では、全部の細胞のタンパクは、抽出され、ゲル電気泳動により分離され、ニトロセルロースのようなマトリックスに移され、設計されたタンパクに特異的に結合する抗体などのプローブとともにインキュベートされる。このプローブは、一般に容易に検出可能な化学ルミネセンスまたは比色のラベルでタグがつけられている。観察されたラベルの存在と量は、細胞中の所望の変異タンパクの存在と量を示す。
【０２０７】
実施例７：遺伝子的に修飾されたCorynebacteriaの成長−媒体および培養条件
遺伝子的に修飾されたコリネバクテリウムグルタミカムは、合成または天然成長媒体中で培養される。Corynebacteriaの異なった成長媒体の多くはどちらも知られており、容易に入手可能である(Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992)'The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Spring-Verlag)。これらの媒体は、一種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび痕跡の要素からなる。好ましい炭素源は、モノ−、ジ−またはポリサッカライドなどの砂糖である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースが非常によい炭素源として働く。糖蜜または他の砂糖精製の副生成物のような複合化合物によって媒体に砂糖を供給することも可能である。異なった炭素源の混合物を供給することも有利である。他の可能な炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸、乳酸などのアルコールおよび有機酸である。窒素源は通常有機または無機の窒素化合物か、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源として例えば、アンモニアガス、アンモニウム塩（例えばＮＨ4Ｃｌまたは（ＮＨ4）2ＳＯ4）、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、酵母抽出物、肉抽出物などの複合窒素源が含まれる。
【０２０８】
媒体に含まれる無機塩化合物は、クロリド−、リン酸、硫酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、コバルト塩、モリブデン塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銅塩、鉄塩を含む。金属イオンを溶液中に保持するために
媒体中にキレート化合物を加えることができる。特に有用なキレート化合物は、カテコールやプロトカテチュエートなどのジヒドロキシフェノールまたはクエン酸などの有機酸を含む。ビタミンなどの成長因子または成長促進剤、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩、ピリドキシンなどを含む媒体が典型的である。成長因子および塩はしばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合媒体成分に由来する。正確な媒体化合物の組成は、直接の実験に強く依存し、各々の特定の場合に個々に決定される。媒体の最適化の情報は、テキストブックApplied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 019 963577 3) から入手可能である。成長媒体を市販品、例えば標準1(Merck)またはBHI(grain heart infusion, DIFCO)などから選定することも可能である。
【０２０９】
すべての媒体成分は、熱（１．５×１０5Ｐａ、１２１℃で２０分間）またはろ過殺菌法のいずれかにより殺菌される。成分は、一緒に、または所望により分割して殺菌することができる。すべての媒体成分は、成長の初期に存在させるか、または任意に連続的にまたは回分式に加えることができる。
【０２１０】
培養条件は各々の実験のために分けて定義される。温度は、１５℃から４５℃の範囲であるべきである。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。媒体のｐＨは、５から８．５、好ましくは７．０前後の範囲であるべきであり、媒体に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための緩衝液の例は、リン酸カリウム緩衝液である。MOPS, HEPES, ACESその他の合成緩衝液を代わりに、または同時に使用することができる。成長の間にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽出物などの複合媒体成分が使用される場合、多くの複合成分は高い緩衝能力があるという事実によって、追加の緩衝液が必要ないかもしれない。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスにより制御することもできる。
【０２１１】
インキュベート時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロスの中に蓄積される生成物を最大にするように選択される。開示された成長実験は、種々の容器、例えばミクロタイター板、ガラス管、ガラスフラスコ、または種々のサイズのガラスまたは金属発酵槽等の中で行なうことができる。多数のクローンのスクリーニングのために、微生物をミクロタイター板、ガラス管、振とうフラスコ中、バッフル付きで、またはなしで培養すべきである。好ましくは１００ｍｌの振とうフラスコを使用し、所望の成長媒体の１０容積％で満たす。フラスコを１００から３００ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（ふり幅２５ｍｍ）で振とうすべきである。蒸発ロスは湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる。代わりに、蒸発ロスの数学的補正が行なわれるべきである。
【０２１２】
遺伝子的に修飾されたクローンを試験した場合、修飾されていないコントロールのクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含むコントロールのクローンも試験するべきである。媒体を寒天平板上、例えばＣＭプレート（10g/lのグルコース、2.5g/lのNaCl、2g/lの尿素、10g/lのポリペプトン、5g/lの酵母抽出物、5g/lの肉抽出物、22g/lの寒天、2M NaOHによるｐＨ６．８としたもの）を３０℃でインキュベートしたもので成長させた細胞を用いて０．５−１．５のＯＤ600まで接種する。媒体の接種は、ＣＭプレートからのC.glutamicum細胞のサリーン懸濁液の導入、またはこのバクテリアの前培養液の添加のいずれかによりなされる。
【０２１３】
実施例８：変異タンパクの機能のインビトロ解析
酵素の活性と速度論的パラメーターの決定は、先行技術でよく確立されている。得られた改変された酵素の活性決定のための実験は、当業者の能力の範囲内で、野生種酵素の比活性に対して行なわれなければならない。一般に酵素についての概要は、構造、速度論的、原理、方法、適用および多数の酵素の活性の決定例に関する特定の詳細と同様に、例えば以下の参照に見出される：Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:Oxford; Boyer, P.D., ed(1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetic, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325), Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, 'Enzymes'. VCH: Weinheim, p. 352-363.。
【０２１４】
ＤＮＡと結合するタンパクの活性は、数種のよく確立された方法、例えばＤＮＡバンド−シフトアッセイ（ゲル遅延アッセイとも呼ばれる）により測定することができる。他の分子の発現におけるこのようなタンパクの効果は、レポーター遺伝子アッセイ（例えばKolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904および引用文献に記載されたような） を用いて測定される。レポーター遺伝子試験系は、周知であり、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑蛍光性タンパクおよびその他数種の酵素を用いて、原核および真核細胞のどちらにでも適用が確立されている。
【０２１５】
膜輸送タンパクの活性の決定は、例えばGennis, R.B. (1989) 'Pores, Channels and Transporters', in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer; Heidelberg, p. 85-137; 199-234; and 270-322に記載されたような技術に従って行なわれる。
【０２１６】
実施例９：所望の製造物の製造における変異タンパクの感化の解析
所望の化合物（例えばアミノ酸）の製造におけるC.Glutamicumの遺伝子修飾の効果は、適当な条件（例えば上述の）下の改変された微生物成長および媒体及び／または細胞成分の増加した所望の製造物（即ちアミノ酸）の生成の解析によって評価することができる。このような解析法は当業者に周知であり分光法、薄層クロマトグラフィー、種々の染色法、酵素的および微生物学的方法、高速液体クロマトグラフィーのような解析クロマトグラフィー（例えばUllman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 and p. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) 'Applications of HPLC in Biochemistry 'in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: 'Product recovery and purification', page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D.(1988) Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications参照)を含む。
【０２１７】
最終発酵生成物の測定に加えて、所望の化合物の生産に使用された代謝経路の他の成分、例えば中間体、副生成物を、化合物の製造の全体の効率を決定するために解析することもできる。解析法は、媒体中の栄養剤（例えば砂糖、炭化水素、窒素源、ホスファートおよび他のイオン）のレベルの測定、バイオマス組成物と成長の測定、通常の生合成経路の代謝物の製造の解析、発酵の間に生成したガスの測定を含む。これらの測定のための標準的な方法は、Applied Micro Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, p. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN: 0199635773) および引用文献に概説してある。
【０２１８】
実施例１０：C.glutamicum培養からの所望の製造物の精製
C.glutamicum細胞からまたは上述の培養物の上澄みからの所望の製造物の回収は、周知の種々の方法により行なうことができる。所望の製造物が細胞から隠されていない場合、細胞を培養物から低速遠心分離により回収することができ、細胞を機械的力または超音波のような標準的な方法で溶解することができる。細胞の破片を遠心分離で取り除き、可溶性タンパクを含む上澄み画分を所望の化合物のさらなる精製のために保持する。製造物がC.glutamicum細胞から隠されている場合、細胞を培養物から低速遠心分離により取り除き、上澄み画分をさらなる精製のために保持する。
【０２１９】
双方の精製法からの上澄み画分を、適当なレジンであって、所望の分子がクロマトグラフィーレジンに保持され、サンプル中の多くの不純物が保持されないか、または不純物がレジンにより保持され、サンプルが保持されないようなレジンを用いたクロマトグラフィーで処理する。このようなクロマトグラフィーの工程は、必要に応じて、同じまたは異なるクロマトグラフィーレジンを用いて繰り返すことができる。当業者は、適当なクロマトグラフィーレジンの選択と、精製される特別の分子への最も効率的な適用に精通しているであろう。精製された製造物はろ過または限外ろ過により濃縮し、製造物の安定性が最も大きくなる温度で保存することができる。
【０２２０】
広い範囲の精製法が周知であり、前述した精製法は範囲の減縮を意味しない。このような精製法が、例えば Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)に記載されている。
【０２２１】
単離した化合物の同定と純度が、先行技術で標準的な方法で評価される。これらは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素的または微生物学的アッセイを含む。このような解析方法は、Petek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al.(1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1988) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p.540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17に記載されている。
【０２２２】
実施例１１：本発明の遺伝子配列の解析
配列の比較と、２個の配列の間の相同性の百分率の決定は、公知の技術であり、数学的アルゴリズム、例えばKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264-68のアルゴリズムで、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77に記載のように変形されたものなどを使用して行なうことができる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２によって、本発明のＨＡ核酸分子に対するヌクレオチド配列の相同性を得るために行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３によって、本発明のＨＡタンパク分子に対するアミノ酸配列の相同性を得るために行なうことができる。比較の目的で、間隙のあけられたアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムの使用に際して、当業者はプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のパラメーターの、解析される特定の配列のための最適化の方法についてよく知っている。
【０２２３】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Meyers とMiller （(1988) Comput. Appln. Biosci. 4: 11-17）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧシーケンスアライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較のために使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残渣表、１２のギャップ長さペナルティー、４のギャップペナルティーを使用することができる。さらに配列解析に使用されるアルゴリズムが公知であり、ＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ（Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載）および FASTA（ Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8に記載）を含む。
【０２２４】
２本のアミノ酸配列の間の相同性の百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http: //www.gcg.comで入手可能）を用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１２、１０、８、６、または４の間隙重さ、２、３または４の長さ重さを用いて行なうことができる。２本の核酸配列の間の相同性の百分率は、標準的なパラメーター、例えば間隙重さが５０、および長さ重さが３などを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【０２２５】
本発明の遺伝子配列と、遺伝子バンクに存在する配列の比較解析が先行技術において公知の技術を用いて行なわれた（例えばBexevanis and Ouellette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York参照)。本発明の遺伝子配列が、遺伝子バンクに存在する遺伝子と、３段階の工程で比較された。第一段階で、遺伝子バンクに存在するヌクレオチド配列に対する本発明の配列の各々について、ＢＬＡＳＴＮ解析（例えばローカルアライメント解析）が行なわれた。最初にヒットした５００個についてさらに解析が続けられた。次いでＦＡＳＴＡ探索（例えば、結合されたローカルおよびグローバルアライメント解析で、配列の限定された領域を整列させる）が、これらの５００個について行われた。各々の本発明の遺伝子配列は次いで全体的に、ＦＡＳＴＡの頭の３個のヒットの各々について、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて（標準的なパラメーターを使用して）整列させられる。正しい結果を得るために、遺伝子バンクから抽出された配列の長さは、周知の方法により質問の配列の長さに調整された。この解析の結果は、表４にまとめられている。得られた結果は、遺伝子バンクの参照の各々と比較した本発明の遺伝子の各々においてＧＡＰ（グローバル）解析を単独で行なったときに得られるであろう結果と一致したが、このようなデータベースを広げて行なったＧＡＰ（グローバル）解析と比較して明らかに計算時間が短縮された。切り捨て値を上回るアライメントが得られなかった本発明の配列を、アライメントの情報なく表４に示した。表４に、’％相同性（ＧＡＰ）’の見出しで記載されたＧＡＰアライメント相同性百分率は、’，’は小数点を表すヨーロッパの数の形式で、並べられているということは、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、このカラム中の’４０，３４５’の値は、４０．３４５％を表す。
【０２２６】
実施例１２：ＤＮＡマイクロアレイの構築と操作
本発明の配列を追加で、ＤＮＡマイクロアレイ（デザイン、方法論、ＤＮＡアレイの使用は周知であり、例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48; and DeRisi, J.L. et al. (1997) Science 278: 680-686に記載されている。)の構築と適用に使用することができる。
【０２２７】
ＤＮＡマイクロアレイは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリコーンまたは他の材料からなる固体または柔軟性のある支持体である。核酸分子を、注文された方法で表面に取り付けることができる。適当なラベリングのあと、他の核酸または核酸混合物を固定された核酸分子にハイブリダイズすることができ、限定された領域でハイブリダイズされた分子の個々の信号強度を検知し、測定するためにラベルを使用することができる。この方法論は、適用された核酸サンプルまたは混合物中のすべてあるいは選択された核酸の相対量または絶対量を同時に定量化することを可能にする。このためＤＮＡマイクロアレイは、並行して多数の（６８００以上）核酸の発現を解析することを可能とする（Schena, M. (1996) BioEssays 18(5): 427-431参照）。
【０２２８】
本発明の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅反応によって、１種以上のC.glutamicum遺伝子の限定された領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用することができる。５’または３’オリゴヌクレオチドプライマーあるいは適当なリンカーの選択と設計は、上述の支持媒体（例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470にも記載されている。）の表面に対する、得られたＰＣＲ産物の共有結合を可能とする。
【０２２９】
核酸マイクロアレイは、Wodicka,L.et al.(1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367に記載されたようにその場のオリゴヌクレオチド合成によっても構築することができる。写真平板法により、マトリックスの正確に限定された領域が露光される。光不安定な保護基はこれによって活性化され、ヌクレオチド付加が進行し、一方光からマスクされた領域はいかなる修飾も進行しない。続く保護と光活性化のサイクルは、限定された位置における異なったオリゴヌクレオチドの合成を可能とする。小さい、限定された本発明の遺伝子の領域は、マイクロアレイ上で、固相オリゴヌクレオチド合成により合成することができる。
【０２３０】
ヌクレオチドのサンプルまたは混合物の中に存在する本発明の核酸分子は、マイクロアレイに対してハイブリダイズすることができる。これらの核酸分子は標準的な方法でラベルすることができる。要するに、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）は、例えば、逆転写またはＤＮＡ合成の間、放射性同位元素によりまたは蛍光によりラベルされたヌクレオチドの組み込みによりラベルされる。ラベルされた核酸のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションは、例えば Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997), supra; and DeSaizieu A. et al (1998), supraに記載されている。ハイブリダイズされた分子の検出と定量化は、特定の組み込まれたラベルにより行なわれる。放射性のラベルは例えばSchena, M. et al. (1995) supraに記載されたように検出することができ、蛍光ラベルは例えばShalon et al. (1996) Genome Research 6: 639-645の方法により検出することができる。
【０２３１】
本発明の配列のＤＮＡマイクロアレイ技術に対する適用は、上述したように、C.glutamicumまたは他のCorynebacteriaの異なった株の比較解析を可能とする。例えば、個々の転写の特徴に基づく内部株の変種の研究および特定するために重要な遺伝子の同定および／または所望の株の特性、例えば病原性、生産性、およびストレス寛容などの同定は、核酸アレイ方法論により促進される。発酵反応の進行の間の、本発明の遺伝子の発現の特徴の比較は、核酸アレイ技術を用いることで可能である。
【０２３２】
実施例１３：細胞タンパクポピュレーションの動力学的解析（プロテオミクス）
本発明の遺伝子、組成、方法は、タンパクのポピュレーションの相互作用および動力学（プロテオミクスと定義する）の研究に適用することができる。注目のタンパクポピュレーションは、C.glutamicum(例えば他の生物のタンパクポピュレーションと比較して）、特定の環境または代謝条件下（例えば高いまたは低い温度で、または高いまたは低いｐＨでの発酵の間）で活性なタンパクまたは特定の成長および発達の相の間に活性なタンパクの総タンパクポピュレーションを含むが、これに限定されない。
【０２３３】
タンパクポピュレーションは、種々の周知の技術、例えばゲル電気泳動などにより解析することができる。細胞タンパクは、例えば細胞溶解または抽出により得られ、種々の電気泳動技術を用いて互いに分離することができる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タンパクをその分子量に基づいて大部分分離する。等電点のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＩＥＦ−ＰＡＧＥ）は、タンパクをその等電点（アミノ酸配列を反映するのみならずタンパクの後翻訳修飾も反映する）により分離する。他の、さらに好ましいタンパク解析の方法は、２−Ｄ−ゲル電気泳動（例えばHermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463に記載されている)として知られるＩＥＦ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＰＡＧＥの連続する組み合わせである。他の分離技術、例えばキャピラリーゲル電気泳動などもタンパクの分離に利用することができ、このような技術は、周知である。
【０２３４】
これらの方法論により分離されたタンパクは、標準的な技術、例えば染色またはラベリングにより可視化することができる。適当な染色は公知であり、Coomassie ブリリアントブルー、銀染色、蛍光染料、例えばＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む。C.glutamicumの媒体中にある、放射性物質によりラベルされたアミノ酸またはその他のタンパク前駆体（例えば35Ｓ−メチオニン、35Ｓ−システイン、14Ｃ−ラベルされたアミノ酸、15Ｎ−アミノ酸、15ＮＯ3または15ＮＨ4+またはＣ13ラベルされたアミノ酸）の含有物は、分離に先立ってこれらの細胞からタンパクをラベルすることを可能とする。同様に、蛍光ラベルを使用することができる。これらのラベルされたタンパクは、抽出され、単離され、前述した技術に従って分離される。
【０２３５】
これらの技術により可視化されたタンパクはさらに、使用された染料またはラベルの量を測定することにより解析することができる。得られたタンパクの量は、定量的に、例えば光学的方法を用いて決定することができ、同様のゲルまたは他のゲル中の他のタンパクの量と比較することができる。ゲル上のタンパクの比較は、例えば光学的比較、分光学的、ゲルのイメージスキャンおよび解析、または写真フィルムおよびスクリーンの使用を通じて行なうことができる。このような技術は周知である。
【０２３６】
得られたタンパクを同定するために、直接シーケンスまたは他の標準的な技術を使用することができる。例えば、Ｎ−および／またはＣ末端アミノ酸シーケンス（例えばエドマン分解）を、マススペクトロメトリー（特にＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ技術（例えばLangen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192参照））として使用することができる。ここで提供されたタンパク配列を、これらの技術によりC.glutamicumタンパクの同定のために使用することができる。
【０２３７】
これらの方法により得られた情報は、タンパクの存在、活性、種々の生物学的条件（例えば、異なった生物、発酵の時点、媒体条件、または異なったビオトープ、その他）からの異なったサンプルの間の修飾の様式の比較に使用することができる。このような実験から単独で、または他の技術との組み合わせにより得られたデータは、様々な適用、例えば与えられた（例えば代謝的）状況にある種々の生物の挙動の比較、ファインケミカルを産出する株の生産性の上昇、またはファインケミカルの製造の効率の上昇などに使用することができる。
【０２３８】
同等物
当業者は、わずかの型にはまった実験を用いて、ここに記載された発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するか、確認することができるであろう。このような同等物は、請求の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、恒常性および適応に関連するタンパク質をコードするコリネバクテリウムグルタミカム遺伝子に関するものである。
【０００２】
本出願は、先に提出した１９９９年６月２５日提出の米国仮特許出願６０／１４１０３１の優先権を主張する。本出願はまた、先に提出された１９９９月８日提出のドイツ特許出願１９９３１６３６．８、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２５．６、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２６．４、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２７．２、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２８．０、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２１２９．９、１９９９年７月９日提出のドイツ特許出願１９９３２２２６．０、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２２９２０．６、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２２．２、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２４．９、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９２８．１、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３０．３、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３３．８、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９３５．４、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３２９７３．７、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００２．６、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００３．４、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００５．０、１９９９年７月１４日提出のドイツ特許出願１９９３３００６．９、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３７８．９、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３７９．７、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３９０．８、１９９９年８月３１日提出のドイツ特許出願１９９４１３９１．６、１９９９年９月３日提出のドイツ特許出願１９９４２０８８．２の優先権を主張する。上記全出願の全ての内容は、本明細書中で明確に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
細胞の天然に存在する代謝過程の一定の産物および副産物は、食品、飼料、化粧品、および製薬産業を含む広範な種々の産業で有用である。これらの分子（集合的に、「精製化学製品」と呼ばれる）には、有機酸、タンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミンおよび補因子、ならびに酵素が含まれる。その生産は、１つまたは複数の所望の分子を大量に産生および分泌させるように開発された細菌の大量培養によって最も都合よく行われる。この目的の１つの特に有用な生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（コリネバクテリウムグルタミカム）（グラム陽性、非病原性細菌）である。株の選択によって、多数の所望の化合物を産生する多数の変異株が開発されている。しかし、特定の分子の産生用に改良された株の選択は、時間のかかる困難な過程である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
本発明は、様々に用途がある新規の細菌核酸分子を提供する。これらの用途には、精製化学製品の製造に使用することができる細菌の同定、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌による精製化学製品の調整、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムのマッピングの基準点および形質転換のマーカーとしてのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の分類または同定が含まれる。これらの新規の核酸分子は、本明細書中で恒常性および適応（ＨＡ）タンパク質と呼ばれるタンパク質をコードする。
【０００５】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、種々の精製化学製品の大量生産用、炭化水素の分解（石油流出など）、およびテルペノイドの酸化などの産業に一般に使用されているグラム陽性の好気性菌である。したがって、本発明のＨＡ核酸分子を使用して、例えば発酵過程による精製化学製品の生産に使用することができる細菌を同定することができる。本発明のＨＡ核酸分子の発現または本発明のＨＡ核酸分子配列改変を使用して、細菌由来の１つまたは複数の化学製品の生産を調整することができる（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産を改良する）。
【０００６】
本発明のＨＡ核酸を使用して、コリネバクテリウムグルタミカムまたはその密接な関連細菌としての細菌の同定またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはその関連細菌の混合細菌集団の存在の同定も可能である。本発明は、ストリンジェントな条件下でこの生物に固有のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子領域にかかるプローブを使用した細菌の固有または混合した集団の培地からの抽出ゲノムＤＮＡの探索（この生物が存在するかどうかを確認することができる）による多数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子の核酸配列を提供する。コリネバクテリウムグルタミカム自体が非病原性であるにもかかわらず、ヒトに病原性を示す種、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリアの原因物質）などに関連し、このような生物の検出は臨床的に有意に関連する。
【０００７】
本発明のＨＡ核酸分子はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムまたは関連生物のゲノムのマッピングにおける基準点として使用することができる。同様に、これらの分子またはその変異型もしくは一部は、遺伝子操作ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のマーカーとして使用することができる。
【０００８】
本発明の新規の核酸分子によってコードされるＨＡタンパク質は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持またはこの細菌の異なる環境条件への適応能力に関連する機能を果たすことができる。コリネバクテリウムグルタミカムで使用されるクローニングベクターの適用性（Ｓｉｎｓｋｅｙらに付与された米国特許第４，６４９、１１９号に開示）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ類（例えば、ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の遺伝子操作技術（Ｙｏｓｈｈａｍａら、Ｊ．Ｂａｖｔｅｒｉｏｌ．、１６２、５９１〜５９７、１９８５、Ｋａｔｓｕｍａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５９、３０６〜３１１、１９８４、およびＳａｎｔａｍａｒｉａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３０、２２３７〜２２４６、１９８４）を考慮すれば、本発明の核酸分子をこの生物の遺伝子操作に利用して１つまたは複数の精製化学製品のより良好またはより有効な生産が可能である。この精製化学製品の生産または生産効率の改良は、本発明の遺伝子操作の直接的効果によるか、このような操作の間接的な効果により得る。
【０００９】
本発明のＨＡタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。例えば、これらの酵素の活性または数を増加または減少させるように芳香族化合物または脂肪族化合物を改変する酵素操作により、これらの化合物の改変または分解産物である１つまたは複数の精製化学製品の生産を調整することができる。同様に、無機化合物代謝に関連する酵素により、アミノ酸、ビタミン、および核酸などのこのような精製化学製品の生合成用の鍵となる分子（例えば、亜リン酸、硫黄、および窒素分子）が得られる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのこれらの酵素の活性または数の変更により、これらの無機化合物変換の増加（または代わりの無機化合物の使用）によりこれらの精製化学製品への無機原子の組み込み率を改良可能である。一般的な細胞過程に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素の遺伝子操作により、これらの酵素の多くが精製化学製品（例えば、アミノ酸）または精製化学製品合成または分泌に関連する酵素を直接改変するので、精製化学製品の生産を直接改良することもできる。細胞プロテアーゼの活性または数の調整はまた、多数のプロテアーゼが精製化学製品または精製化学製品の生産もしくは崩壊に関連する酵素を分解することができるので、精製化学製品に直接影響を与え得る。
【００１０】
さらに、芳香族／脂肪族化合物の改変もしくは分解、一般的な生体触媒反応、無機化合物代謝、またはタンパク質分解に関与する上記の酵素自体が、その活性が種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ産業に適用に望ましい精製化学製品である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの１つまたは複数のこれらの酵素のコピー数の変更により、細胞によって産生されるこれらの酵素の数を増加させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の大量培養物由来のこれらのタンパク質の潜在的生産量または生産効率を増加させることができる。
【００１１】
本発明のＨＡタンパク質の変更はまた、このような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与え得る。例えば、細胞壁の構築または再配列に関連するこれらのタンパク質の活性および／または数の調整により、細胞が機械的ストレスおよび大量発酵培養中の他のストレスにより良好に耐えることができるように細胞壁の構造自体を改変することができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量増殖には、有意な細胞壁産生が必要である。細胞壁生合成または分解酵素の活性または数の調整により細胞壁をより迅速に生合成可能であり、それによりこの培養微生物の培養における増殖速度を増加させることができ、それにより所望の精製化学製品の生産細胞数を増加させることができる。
【００１２】
本発明のＨＡ酵素の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、または生産効率に直接影響を与えることもできる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多数の一般的酵素は、細胞過程全体（例えば、調節過程）に有意に影響を与え、それにより精製化学製品の代謝に有意な影響を与える。同様に、プロテアーゼ、毒性を示す可能性のある芳香族または脂肪族化合物を改変または分解する酵素、および無機化合物の代謝を促進する酵素は全てＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの生存度の増大に役立つ。プロテアーゼは、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質（大量発酵槽培養中に遭遇する比較的ストレスの多い環境条件下で生じ得るタンパク質など）の選択的除去を支援する。これらのタンパク質の変更によって、この活性をさらに向上させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養における生存度を改良することができる。芳香族／脂肪族の改変または分解タンパク質は、これらの廃棄化合物（培養培地中の不純物または細胞自体の廃棄物として遭遇し得る）の解毒だけでなく、最適な炭素源が培養物中で制限されている場合に細胞が代替炭素源を利用するのにも役立つ。その数および／または活性の増加により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存を向上させることができる。本発明の無機代謝タンパク質は、全てのタンパク質およびヌクレオチド（など）の合成に必要な無機分子を細胞に供給するので、細胞の全体的な生存度に重要である。大量培養における１つまたは複数の所望の精製化学製品を生産する生細胞数の増加により、培養による精製化学物質の生産量、生産、および／または生産効率が付随的に増加するはずである。
【００１３】
本発明は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連する機能を果たすか、この微生物の異なる環境条件への適応能に関連し得るタンパク質（本明細書中では、「ＨＡタンパク質」と呼ぶ）をコードする新規の核酸分子を提供する。ＨＡタンパク質をコードする核酸分子を、本明細書中でＨＡ核酸分子と呼ぶ。好ましい実施形態では、ＨＡタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の改変もしくは分解、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性の保有に関与する。このようなタンパク質の例には、表１に記載の遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。
【００１４】
したがって、本発明の１つの態様は、ＨＡをタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその生物活性部分を含む単離核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）ならびにＨＡコード核酸の検出または増幅用のプライマーまたはハイブリッド形成プローブとして安定な核酸フラグメント（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に関する。特に好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列表の奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列の１つまたはこれらのヌクレオチド配列の１つのコード領域もしくは相補物を含む。他の特に好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、上記の配列表の奇数番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に記載のヌクレオチド配列にハイブリッド結合するか、それに少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。他の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、配列表の偶数の配列番号（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８．．．．）に記載のアミノ酸配列の１つをコードする。本発明の好ましいＨＡタンパク質はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのＨＡ活性を有することが好ましい。
【００１５】
別の実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質またはその一部が本発明のアミノ酸配列に十分に相同的な、例えば、タンパク質またはその一部がＨＡ活性を維持するように本発明のアミノ酸配列に十分に相同的なアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号を有する配列）を含むタンパク質またはその一部をコードする。好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質またはその一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するか、異なる環境条件に対する根微生物の適応に関連する機能を果たす能力を維持する。１つの実施形態では、核酸分子によってコードされるタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号を有するアミノ酸から選択される全アミノ酸配列）に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。別の好ましい実施形態では、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同的な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質（配列表の対応する奇数の配列番号（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７．．．．）に示した読み取り枠によってコードされる）である。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、単離核酸分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来であり、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の１つの配列）の１つに少なくとも約５０％を超えて相同的で、ＤＮＡの修復または組換え、遺伝物質の転移、遺伝子発現（すなわち、転写または翻訳過程）、タンパク質折りたたみ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕａｍｉｃｕｍのタンパク質分泌に関連することができ、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し、また、異種ポリペプチドまたは調節領域をコードする異種核酸配列も含む生物活性ドメインを含むタンパク質（例えば、ＨＡ融合タンパク質）をコードする。
【００１７】
別の実施形態では、単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）を含む核酸分子とハイブリッド形成する。好ましくは、単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。より好ましくは、単離核酸は、天然に存在するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＨＡタンパク質またはその生物活性部分をコードする。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子を含むベクター（例えば、組換え発現ベクター）、このようなベクターが移入される宿主細胞に関する。１つの実施形態では、このような宿主細胞を使用して、安定な培地中での宿主細胞の培養によってＨＡタンパク質を産生させる。次いで、ＨＡタンパク質を、培地または宿主細胞から単離することができる。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＡ遺伝子が移入または変更された遺伝子変更微生物に関する。１つの実施形態では、微生物のゲノムを、導入遺伝子として野生型または変異ＨＡ配列をコードする本発明の核酸分子の移入によって変更されている。別の実施形態では、微生物ゲノム中の内因性ＨＡ遺伝子が変更ＨＡ遺伝子での相同組換えによって変更されており、例えば、機能的に破壊されている。別の実施形態では、微生物中の内因性または移入ＨＡ遺伝子が、１つまたは複数の点変異、欠失、または逆位で変更されているが、機能的ＨＡタンパク質はコードする。さらに別の実施形態では、ＨＡ遺伝子の発現が調節されるように、微生物におけるＨＡ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）が変更されている（例えば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。好ましい実施形態では、微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属するが、コリネバクテリウムグルタミカムが特に好ましい。好ましい実施形態では、微生物は、アミノ酸などの所望の化合物の生産にも利用されるが、リジンが特に好ましい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、被験体におけるＣｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の同定法を提供する。この方法には、本発明の被験体における１つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（配列表に記載の配列番号１〜４４０の配列）の検出による被験体におけるＣｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の検出が含まれる。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、単離ＨＡタンパク質またはその一部、例えば、生物活性部分に関する。好ましい実施形態では、単離ＨＡタンパク質またはその一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関し得るか、この微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができる。別の好ましい実施形態では、単離ＨＡタンパク質またはその一部は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するために本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相補的である。
【００２２】
本発明はまた、ＨＡタンパク質の単離調製物を提供する。好ましい実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）を含む。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）（配列表の対応する奇数の配列番号に記載の読み取り枠によってコードされる）に実質的に相補的な単離全長タンパク質に関する。さらに別の実施形態では、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。他の実施形態では、単離ＨＡタンパク質は、本発明のアミノ酸配列の１つ（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％またはそれ以上相補的で、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２３】
あるいは、単離ＨＡタンパク質は、配列表に記載の偶数の配列番号の１つのヌクレオチド配列とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）か、その配列に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み得る。ＨＡタンパク質の好ましい形態もまた本明細書中に記載のＨＡ生体活性を有することも好ましい。
【００２４】
ＨＡポリペプチドまたはその生物活性部分を、非ＨＡポリペプチドに作動可能に連結させて融合タンパク質を形成させることができる。好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、ＨＡタンパク質のみとは異なる活性を有する。他の好ましい実施形態では、この融合タンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす。特に好ましい実施形態では、この融合タンパク質の宿主細胞への取り込みにより細胞由来の所望の化合物の産生が調整される。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＨＡタンパク質自体またはＨＡタンパク質の結合パートナーとの相互作用によるか、本発明のＨＡ核酸の転写または翻訳の調整によってＨＡタンパク質の活性を調整する分子のスクリーニング法を提供する。
【００２６】
本発明の別の態様は、精製化学製品の生産法に関する。この方法は、精製化学製品が生産されるように、本発明のＨＡ核酸分子の発現を指向するベクターを含む細胞を培養する工程を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、さらに、細胞がＨＡ核酸の発現を指向するベクターでトランスフェクトされた、このようなベクターを含む細胞を獲得する工程を包含する。別の好ましい実施形態では、この方法は、さらに、培養物由来の精製化学製品の回収工程を包含する。特に好ましい実施形態では、細胞はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来であるか、表３に記載の株から選択される。
【００２７】
本発明の別の態様は、微生物由来の分子の産生の調整法に関する。このような方法は、細胞とＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を調整する作用因子とを接触させることにより細胞関連活性が作用因子の非存在下でこの同一の活性と比較して変更される工程を包含する。好ましい実施形態では、細胞は、細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性に関連する１つまたは複数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ過程が調整される。ＨＡタンパク質活性を調整する作用因子は、ＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を刺激する作用因子であり得る。ＨＡタンパク質活性またはＨＡ核酸発現を刺激する作用因子の例には、細胞に移入されている小分子、活性ＨＡタンパク質、ＨＡタンパク質をコードする核酸が含まれる。ＨＡ活性または発現を阻害する作用因子の例には、小分子、アンチセンスＨＡ核酸分子が含まれる。
【００２８】
本発明の別の態様は、細胞に野生型または変異ＨＡ遺伝子を移入し、個別のプラスミドで維持されるか、宿主細胞のゲノムに取り込まれる工程を包含する、細胞由来の所望の化合物の生産量の調整法に関する。ゲノムに取り込まれた場合、このような取り込みはランダムであるか、天然の遺伝子が移入コピーによって置換されるような相同組換えが起こり調整されるべき細胞から所望の化合物を産生することができる。好ましい実施形態では、生産量が増加する。別の好ましい実施形態では、化合物は精製化学製品である。特に好ましい実施形態では、精製化学製品はアミノ酸である。特に好ましい実施形態では、アミノ酸はリジンである。
【００２９】
本発明は、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解に関連するかＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するＨＡ核酸およびタンパク質分子を提供する。本発明の分子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物由来の精製化学製品の生産の調整に利用することができ、これにより、直接的（例えば、精製化学製品（例えば、酵素）の生産に関連するタンパク質活性の過剰発現または至適化により改変Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与える場合）または間接的に影響が与えられて所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効率が得られる（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ芳香族または脂肪族化合物の改変または分解タンパク質の活性または数の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存度を増加させ、大量培養での生産量も増加する場合）。本発明の態様を、以下でさらに詳細に説明する。
【００３０】
Ｉ．精製化学製品
用語「精製化学製品」は、当該分野で認識されており、これらに限定されないが、製薬、農業、および化粧品産業等の種々の産業に適用される生物によって産生される分子が含まれる。このような化合物には、酒石酸、イタコン酸ジアミノピメリン酸などの有機酸、タンパク質生成および非タンパク質生成アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド（Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、「ヌクレオチドおよび関連化合物」、５６１〜６１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６、Ｒｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例に記載）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸）、ジオール（例えば、プロパンジオールおよびブタンジオール）、炭水化物（例えば、ヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリン、およびインディゴ）、ビタミンおよび補因子（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２７巻、「ビタミン」、４４３〜６１３、１９９６、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、および本明細書中の引例、およびＯｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１９９５、「栄養素、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマレーシアのペナンで開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジカル研究協会−アジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載）、酵素、ポリケチド（Ｃａｎｅら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２、６３〜６８）、およびＧｕｔｃｈｏ、１９８３、「発酵による化合物」、Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＩＳＢＮ：０８１８８０５０８６および本明細書中の引例に記載の他の全ての化合物が含まれる。これらの一定の精製化学製品の代謝および使用を、以下にさらに詳述する。
【００３１】
Ａ．アミノ酸代謝および使用
アミノ酸は、全てのタンパク質の基本的単位を含み、そのようなものとして全ての生物における正常な細胞機能に必須である。用語「アミノ酸」は、当該分野で認識されている。２０種存在するタンパク質生成アミノ酸は、ペプチド結合で連結したタンパク質の構造単位として使用される一方で、非タンパク質生成アミノ酸（何百もが公知である）は通常タンパク質中に見出されない（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、１９８５、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。アミノ酸は、Ｄ型またはＬ型光学配置で存在し得るが、Ｌアミノ酸は一般に、天然に存在するタンパク質のみで見出される型である。２０種のタンパク質生成アミノ酸それぞれの生合成および分解経路は、原核細胞および真核細胞の両方で十分に特徴づけられている（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、５７８〜５９０、１９８８を参照のこと）。「必須」アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリン）は、その生合成の複雑さにより栄養素として必要であり、簡単な生合成経路によって残りの１１種の「非必須」アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、およびチロシン）に容易に変換されるので、そう呼ばれている。高等動物は、これらのアミノ酸のいくつかを合成する能力を保持しているが、正常なタンパク質合成を起こさせるために食物から供給されなければならない。
【００３２】
タンパク質生合成機能とは別に、これらのアミノ酸はこの化合物自体が興味深く、多数が食品、飼料、化学、化粧品、農業、および製薬産業における種々の適用が見出されている。リジンは、ヒトのみならず、家禽およびブタなどの単胃動物の栄養素として重要なアミノ酸である。アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、およびシステインと同様にグルタミン酸は香料（グルタミン酸一ナトリウム）として最も一般に使用されており、食品産業で広く一般に使用されている。グリシン、Ｌ−メチオニン、およびトリプトファンは、全て製薬産業で利用されている。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリン、およびアラニンは、製薬産業および化粧品産業の両方で有用である。トレオニン、トリプトファン、およびＤ／Ｌ−メチオニンは、一般的な食品添加物である。（Ｌｅｕｃｈｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｗ．、１９９６、「アミノ酸−技術的生産および使用」、４６６〜５０２、Ｒｅｈｍら編、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻、第１４ａ章、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）。さらに、これらのアミノ酸は、合成アミノ酸およびペプチド（Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、（Ｓ）−５−ヒドロキシトリプトファン、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ２巻、５７〜９７、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９８５に記載の他の合成アミノ酸など）の合成用前駆体として有用であることが見出されている。
【００３３】
アミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十分に特徴づけられている（細菌アミノ酸合成およびその調節についての総説については、Ｕｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７、５３３〜６０６を参照のこと）。グルタミン酸は、αケトグルタル酸（クエン酸回路の中間物）の還元的アミノ化によって合成される。グルタミン、プロリン、およびアルギニンは、それぞれグルタミン酸から引き続いて生成される。セリンの生合成は、３−ホスホグリセリン酸（解糖の中間物）から始まり、酸化、アミノ基転移、および加水分解後にこのアミノ酸が得られる３段階過程である。システインおよびグリシンはセリンから生成され、セリンヒドロキシメチラーゼによって触媒される反応において、前者はホモシステインのセリンとの縮合により、後者はテトラヒドロ葉酸への側鎖β炭素原子の転移による。フェニルアラニンおよびチロシンは、プレフェン酸合成後の最後の２段階のみが異なる９段階生合成経路において解糖経路およびペントースリン酸経路前駆体エリトロース４−リン酸およびホスホエノイルピルビン酸から合成される。トリプトファンはまた、これらの２つの最初の分子から生成されるが、その合成は、１１段階の経路である。チロシンもまた、フェニルアラニンヒドロキシラーゼによって触媒される反応においてフェニルアラニンから合成可能である。アラニン、バリン、およびロイシンは全てピルビン酸の生合成生成物（解糖の最終生成物）である。アスパラギン酸は、オキサロ酢酸（クエン酸回路の中間体）から形成される。アスパラギン、メチオニン、トレオニン、およびリジンは、それぞれアスパラギン酸の変換によって生成される。イソロイシンは、トレオニンから生成される。複雑な９段階経路により、５−ホスホリボシル−１−ピロホスフェート（活性糖）からヒスチジンが生成される。
【００３４】
細胞のタンパク質合成を超えるアミノ酸を蓄積することはできず、代わりに分解されて細胞の主要な代謝経路の中間体が得られる（総説として、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２１章、「アミノ酸分解および尿素回路」、４９５〜５１６、１９８８を参照のこと）。細胞は望ましくないアミノ酸を有用な代謝中間体に変換するにもかかわらず、アミノ酸生成は、合成に必要なエネルギー、前駆体分子、および酵素の点から費用がかかる。したがって、アミノ酸生合成はフィードバック阻害によって調節され、特定のアミノ酸の存在によりその生成が遅延するか完全に停止することは驚くべきことではない（アミノ酸生合成経路におけるフィードバック機構の総説については、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、第２４章、「アミノ酸分解および尿素回路」、５７５〜６００、１９８８を参照のこと）。任意の特定のアミノ酸の生成量は、細胞中に存在するこのようなアミノ酸の量に制限される。
【００３５】
Ｂ．ビタミン、補因子、栄養補給物質代謝および使用
ビタミン、補因子、および栄養補給物質は、高等動物が合成能力を失っているので摂取しなければならない別の分子群であるにもかかわらず、これらは細菌などの他の生物によって容易に合成される。これらの分子は、それ自体が生体活性物質であるか、種々の代謝経路における電子伝達体として作用し得る。その栄養価値とは別に、これらの化合物はまた、着色剤、抗酸化剤、および触媒または他の加工助剤として有意な産業上の価値を有する。（構造、活性、および産業上の利用可能性の総説については、例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、「ビタミン」、Ａ２７巻、４４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６を参照のこと）。用語「ビタミン」は、当該分野で認識されており、正常な機能のために生物に必要である、生物自体で合成できない栄養素が含まれる。ビタミン群は、補因子および栄養補給化合物を含み得る。用語「補因子」には、正常な酵素活性の獲得に必要な非タンパク質性化合物が含まれる。このような化合物は、有機であっても無機であってもよく、本発明の補因子は有機が好ましい。用語「栄養補給物質」には、植物および動物、特に、ヒトの健康に有利な栄養補助食品が含まれる。このような分子の例には、ビタミン、酸化防止剤、および一定の脂質（例えば、多価不飽和脂肪酸）である。
【００３６】
細菌などのアミノ酸産生生物におけるこれらの天然のアミノ酸の生合成は、十分に特徴づけられている（Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、「ビタミン」、Ａ２７巻、４４３〜６１３、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９６、Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．、１９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｏｎｇ，Ａ．Ｓ．Ｎｉｋｉ，Ｅ．＆Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．、１９９５、「栄養素、脂質、健康、および疾患」、１９９４年９月１日〜３日にマレーシアのペナンで開催されたＵＮＥＳＣＯ／化学・工学協会およびフリーラジカル研究協会−アジアの集録、ＡＯＣＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ Ｘ、３７４Ｓ）。
【００３７】
チアミン（ビタミンＢ1）は、ピリミジンとジアゾール部分との化学結合によって合成される。リボフラビン（ビタミンＢ2）は、グアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）およびリボース−５’−リン酸から合成される。同様に、リボフラビンは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の合成に利用される。集合的に「ビタミンＢ6」と呼ばれる化合物ファミリー（例えば、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサ−５’リン酸、および商業的に使用されるピリドキシン塩酸塩）は全て、共通の構造単位５−ヒドロキシ−６−メチルピリジンの誘導体である。パントテン酸塩（パントテン酸、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（２，４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチル−１−オキソブチル）β−アラニン）を、化学合成または発酵のいずれかによって生成することができる。パントテン酸塩合成の最終工程は、βアラニンおよびパントイン酸のＡＴＰ駆動縮合からなる。パントテン酸、βアラニン変換、およびパントテン酸の縮合用の生合成工程を担う酵素は公知である。パントテン酸塩の代謝活性形態は、補酵素Ａであり、生合成は５つの酵素工程において進行する。パントテン酸塩、ピリドキサル−５’リン酸、システイン、およびＡＴＰは、補酵素Ａの前駆体である。これらの酵素は、パントテン酸形成だけでなく、（Ｒ）−パントテン酸、（Ｒ）−パントラクトン、（Ｒ）−パンテノール（プロビタミンＢ5）、パンテテイン（およびその誘導体）、および補酵素Ａの生成を触媒する。
【００３８】
微生物における前駆体分子ピメロイル−ＣｏＡからのビオチンの生合成は詳細に研究されており、関連するいくつかの遺伝子が同定されている。多数の対応するタンパク質もまた、Ｆｅクラスター合成に関連することが見出されており、タンパク質のｎｉｆＳクラスのメンバーである。リポ酸はオクタン酸由来であり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびα−ケトグルタミン酸デヒドロゲナーゼ複合体の一部となる場合、エネルギー代謝における補酵素として利用される。葉酸塩は、その全てが葉酸の誘導体であり、Ｌ−グルタミン酸、ｐ−アミノ−安息香酸および６−メチルプテリン由来でもある。中間体グアノシン−５’三リン酸（ＧＴＰ）、Ｌ−グルタミン酸、およびｐ−アミノ安息香酸から出発する葉酸およびその誘導体の合成が、一定の微生物で詳細に研究されている。
【００３９】
コリノイド（コバラミン、特に、ビタミンＢ12）およびポルフィリンは、テトラピロール環系によって特徴づけら得る群に属する。ビタミンＢ12の生合成は非常に複雑であり未だ完全に特徴づけられていないが、関与する酵素および基質は現在公知である。ニコチン酸（ニコチン酸塩）およびニコチンアミドは「ナイアシン」とも呼ばれるプリン誘導体である。ナイアシンは、重要な補酵素ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、およびその還元形態の前駆体である。
【００４０】
これらの化合物の大量生産は、ほとんど無細胞化学合成に依存しているにもかかわらず、これらのいくつかの化合物、例えばリボフラビン、ビタミンＢ6、パントテン酸塩、およびビオチンは微生物の大量培養によって産生されている。ビタミンＢ12のみは、唯一発酵で産生されているが、これはその合成の複雑さによる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法には、相当な材料および時間の投入が必要であり、たいてい非常に費用がかかる。
【００４１】
Ｃ．プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、およびヌクレオチド代謝およびその使用
プリンおよびピリミジン代謝遺伝子およびその対応するタンパク質は、腫瘍性疾患およびウイルス感染治療用の重要な標的である。用語「プリン」または「ピリミジン」には、核酸、補酵素、およびヌクレオチドからなる窒素塩基が含まれる。用語「ヌクレオチド」には、窒素塩基、ペントース糖（ＲＮＡの場合糖はリボースであり、ＤＮＡの場合糖はＤ−デオキシリボースである）、およびリン酸から構成される核酸分子の塩基性構造単位が含まれる。用語「ヌクレオシド」には、ヌクレオチドの前駆体として利用されるが、ヌクレオチドが保有するリン酸部分を欠く分子が含まれる。これらの分子の生合成または核酸分子を形成するその動員の阻害によりＲＮＡおよびＤＮＡ合成の阻害が可能であり、癌細胞を標的する様式での活性の阻害により腫瘍細胞の分裂および複製能力を阻害することができる。さらに、核酸分子を形成しないヌクレオチドが存在するが、これはむしろエネルギー保存物質（すなわち、ＡＭＰ）または補酵素（すなわち、ＦＡＤおよびＮＡＤ）として利用される。
【００４２】
いくつかの刊行物では、プリンおよび／またはピリミジン代謝の影響によるこれらの化学製品の医学的指標としての使用が記載されている（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．ａｎｄ Ｌｙｏｎｓ，Ｓ．Ｄ．、１９９０、「化学療法薬としてのｄｅ ｎｏｖｏでのピリミジンおよびプリン生合成の強力なインヒビター」、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１０、５０５〜５４８）。プリンおよびピリミジン代謝に関連する酵素の研究では、例えば免疫抑制剤または抗炎症剤として使用することができる新規の薬物開発が注目されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．、１９９５、「ヌクレオチド合成における酵素」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５、７５２〜７５７、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．、２３、８７７〜９０２）。しかし、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチドは、以下の他の有用性を有する：いくつかの精製化学製品（例えば、チアミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、葉酸塩、またはリボフラビン）の生合成の中間体、細胞のエネルギー担体（例えば、ＡＴＰまたはＧＴＰ）として、および化学製品自体が調味料として（例えば、ＩＭＰまたはＧＭＰ）またはいくつかの医学的適用に使用される（例えば、Ｋｕｎｉｎａｋａ，Ａ．、１９９６、生物工学におけるヌクレオチドおよび関連化学物質、６巻、Ｒｅｈｍら編、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、５６１〜６１２を参照のこと）。また、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、またはヌクレオチド代謝に関連する酵素は標的としてますます利用されており、作物保護用の化学製品（殺真菌薬、除草剤、および殺虫剤を含む）が開発されている。
【００４３】
細菌におけるこれらの化合物の代謝が特徴づけられている（総説として、例えば、Ｚａｌｋｉｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．、１９９２、「ｄｅ ｎｏｖｏプリンヌクレオチド生合成」、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２５９〜２８７およびＭｉｃｈｅａｌ，Ｇ．、１９９９、「ヌクレオチドおよびヌクレオシド」、第８章「生化学経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。プリン代謝は、徹底した研究の主題であり、細胞の正常な機能に必須である。高等動物においてプリン代謝が損なわれると重篤な疾患、例えば、通風を発症し得る。プリンヌクレオチドは、中間体化合物イノシン−５’リン酸（ＩＭＰ）を介した一連の工程においてリボース−５’リン酸から合成され、グアノシン−５’一リン酸（ＧＭＰ）またはアデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）が生成され、ヌクレオチドとして利用される三リン酸形態は容易に形成される。これらの化合物をエネルギー蓄積物質としても利用し、その分解により細胞における多数の生化学的過程のためのエネルギーが得られる。ピリミジン生合成は、リボース−５−リン酸からのウリジン−５’一リン酸（ＵＭＰ）の形成によって進行する。ＵＭＰは、次に、シチジン−５’三リン酸（ＣＴＰ）に変換される。これら全てのヌクレオチドのデオキシ−形態は、ヌクレオチドの二リン酸リボースからヌクレオチドの二リン酸デオキシリボース形態への１工程の還元反応において生成される。リン酸化反応の際、これらの分子はＤＮＡ合成に関与し得る。
【００４４】
Ｄ．トレハロース代謝およびその使用
トレハロースは、α、α−１，１結合で結合された２つのグルコース分子からなる。これは、一般的に、甘味料（乾燥または冷凍食品、および飲料用の添加物）として食品産業で使用されている。しかし、製薬、化粧品、および生物工学産業においても適用されている（例えば、１９９８年Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏらに付与された米国特許第５，５，７５９，６１０号、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６、４６０〜４６７、Ｐａｉｖａ，Ｃ．Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｐａｎｅｋ，Ａ．Ｄ．、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．２、２９３〜３１４、およびＳｈｉｓａｋａ，Ｍ．、１９９７、Ｊ．Ｊａｐａｎ、１７２、９７〜１０２を参照のこと）。トレハロースは多くの微生物由来の酵素によって産生され、周囲の培地に天然に放出され、当該分野に公知の方法によって回収することができる。
【００４５】
ＩＩ．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持および環境への適応
細胞が機能する代謝および他の生化学的過程は、温度、圧力、絶対濃度、および酸素の利用可能性などの環境条件に感受性を示す。１つまたは複数のこのような環境条件がこれらの細胞過程の正常な機能に不適合な様式に混乱または変更された場合、細胞は不利な細胞外環境にもかかわらず起こり得る細胞内環境を維持するように作用しなければならない。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕ細胞などのグラム陽性細菌細胞は、好ましくない細胞外条件にもかかわらず内部恒常性を維持することができる多数の機構を有する。これらには、細胞壁、毒性の可能性のある芳香族および脂肪族化合物を分解することができるタンパク質、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質を容易に破壊することができるタンパク質分解機構、細菌増殖に至適な条件下では通常起こらない細胞内反応を起こさせる触媒が含まれる。
【００４６】
不利な条件下でほとんど生存しないものは別として、細菌細胞（例えば、Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞）はまた、このような条件をうまく利用することができるように頻繁に適応することができる。例えば、所望の炭素源を欠く条件では、細胞は、あまり適切でない炭素源での増殖に適応することができる。また、細胞は、一般的に利用される無機化合物が利用不可能である場合はあまり望ましくない無機化合物を利用することができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は、至適な増殖条件下で代謝のための栄養素および前駆体として通常遭遇しない無機および有機分子を利用するように適応する多数の遺伝子を有する。恒常性および適応に関連する細胞過程の態様を以下にさらに詳述する。
【００４７】
Ａ．芳香族および脂肪族化合物の改変および分解
細菌細胞は、種々の芳香族および脂肪族化合物に日常的に曝されている。芳香族化合物は、環状環構造を有する有機分子であり、脂肪族化合物は環構造よりもむしろ開環鎖構造を有する有機分子である。このような化合物は、産業過程の副産物（例えば、ベンゼンまたはトルエン）として得られ得るが、一定の微生物によっても産生され得る（例えば、アルコール）。これらの化合物の多くは細胞に毒性があり、特に芳香族化合物高エネルギー環構造のために反応性が高い。したがって、一定の細菌は、これらの化合物がもはや細胞に有害でないように改変または分解することができる発達した機構を有する。細胞は、例えば、毒性を低下させるかその改変形態が標準的暗細胞廃棄経路および分解経路によって処理することができるように芳香族または脂肪族化合物をヒドロキシル化、異性化、またはメチル化することができる酵素を有し得る。また、細胞は、１つまたは複数のこのような潜在的に有害な物質を特異的に分解して細胞を保護する酵素を有し得る。細菌におけるこれらの改変および分解過程の型の原理および例は、いくつかの刊行物（Ｓａｈｍ，Ｈ．、１９９９、「工業生産における原核生物」、Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら編、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｈ．Ｇ．、１９９２、Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｇｉｅ、Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）に記載されている。
【００４８】
有害な芳香族または脂肪族化合物を単に不活化することの他に、多くの細菌は、細胞の好ましい炭素源を利用できない場合にこれらの炭素源を代謝の継続のための炭素源としてこれらの化合物を利用することができるように進化している。例えば、炭素源としてトルエン、ベンゼン、および１，１０−ジクロロデカンを利用することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株が公知である（Ｃｈａｎｇ，Ｂ．Ｖ．ら、１９９７、Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ、３５（１２）、２８０７〜２８１５、Ｗｉｓｃｈｎａｋ，Ｃ．ら、１９９８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４（９）、３５０７〜３５１１、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｓ．Ａ．ら、１９９９、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６５（２）、５４９〜５５２）。当該分野で公知の他の多数の細菌種の類似の例が存在する。
【００４９】
一定の細菌の芳香族および脂肪族化合物の改変または分解能力が利用され始めている。石油は脂肪族分子および芳香族化合物を含む化学物質の複雑な混合物である。これらの毒性化合物の分解または改変能力の流出油への適用により、ひどい環境損害を非常に効率的且つ低費用で排除可能である（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．、１９９０、「細菌による報告族炭化水素の生分解」、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、１（２−３）、１９１〜２０６およびＳｕｙａｍａ，Ｔ．ら、１９９８、「脂肪族ポリカーボネートを分解する細菌単離物」、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１６１（２）、２５５〜２６１を参照のこと）。
【００５０】
Ｂ．無機化合物の代謝
細胞（例えば、細菌細胞）は、大量の異なる分子（水、無機イオン、および有機物質（例えば、タンパク質、糖、および他の高分子）など）を含む。典型的な細胞の大部分の集団は、以下の４つの原子型のみからなる：炭素、酸素、水素、および窒素。これらは細胞内容物のより小さな割合で存在しているにもかかわらず、無機物質は、細胞の正確な機能に等しく重要である。このような分子には、リン酸、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、マンガン、銅、モリブデン、タングステン、およびコバルトが含まれる。これらの化合物の多くは、重要な分子（ヌクレオチド（リン酸）およびアミノ酸（窒素および硫黄）など）の構築に重要である。これらの他の無機イオンは、酵素反応の補因子として利用されるか、浸透圧に寄与する。このような全ての分子は、周囲環境由来の細菌によって取り込まれなければならない。
【００５１】
これらの各無機化合物では、標準的な代謝装置によって最も容易に使用されることができる形態で細菌に取り込まれることが望ましい。しかし、細菌は好ましい形態を利用することができない環境に遭遇し得る。この環境下で生存するために、細胞は、あまり代謝活性が高くないがこれらの無機化合物の容易に利用可能な形態を細胞代謝で使用することができる形態に変換することができるさらなる生化学的機構を有することが重要である。細菌は、所望の無機種が利用可能でない限り発現しないこの目的のための酵素をコードする多数の遺伝子を多数保有する。したがって、種々の無機化合物の代謝用のこれらの遺伝子は、細菌を使用して最適以下の環境に適用することができる他のツールとして利用される。
【００５２】
炭素に次いで細胞中で最も重要な元素は窒素である。典型的な細菌細胞は、１２〜１５％の窒素を含む。これは、アミノ酸およびヌクレオチドならびに細胞中の多くの他の重要な分子の成分である。さらに、窒素はエネルギー代謝における最終的な電子受容体としての酸素の代替物として利用することができる。良好な窒素源には、多くの有機および無機化合物、アンモニアガス又はアンモニア塩（例えば、ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）２ＳＯ4、又はＮＨ4ＯＨ）、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または複合窒素源（トウモロコシ浸漬液、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物など）が含まれる。アンモニア窒素は、以下の特定の酵素の作用によって固定される：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンターゼ、およびグルタミン−２−オキソグルタミン酸アミノトランスフェラーゼ。ある有機分子から別の分子へのアミノ−窒素の転移は、アミノトランスフェラーゼ（あるアミノ基をαアミノ酸またはαケト酸に転移する酵素のクラス）によって達成される。硝酸塩を、硝酸還元酵素、亜硝酸還元酵素、および標準的な代謝経路において細胞によって容易に利用することができる分子窒素またはアンモニアに変換されるまでの酸化還元酵素を解して還元することができる。
【００５３】
リンは、典型的には、有機および無機形態の両方で細胞内で見出され、同様にこれらの形態のいずれかを細胞は取り込むことができるが、ほとんどの微生物は無機リン酸を取り込むことが好ましい。有機リン酸塩の細胞が利用できる形態への変換には、ホスファターゼ（例えば、フィエート生成リン酸塩およびイノシトール誘導体を加水分解するフィターゼ）の作用が必要である。リン酸塩は、核酸合成のキーエレメントであり、細胞エネルギー代謝（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰの合成）において重要な役割も果たす。
【００５４】
硫黄は、アミノ酸（例えば、メチオニンおよびシステイン）、ビタミン（例えば、チアミン、ビオチン、およびリポ酸）、および鉄硫黄タンパク質の合成に必要である。細菌は、主に、無機硫酸塩から硫黄を得ているにもかかわらず、チオ硫酸塩、亜流酸塩、硫化物もまた一般に利用する。これらの化合物を容易に利用可能ではない条件下で、多くの細菌は、２−アミノスルホン酸（タウリン）などのスルホン酸化合物を利用可能な遺伝子を発現する（Ｋｅｒｔｅｓｚ，Ｍ．Ａ．、１９９３、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓにおける硫酸塩制限によって誘導されるタンパク質」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７５、１１８７〜１１９０）。
【００５５】
他の無機原子（例えば、金属またはカルシウムイオン）はまた、細胞の生存に重要である。例えば、鉄は、酸化還元反応の鍵となる役割を果たし、鉄−硫黄タンパク質、ヘムタンパク質、およびシトクロムの補因子である。鉄の細菌細胞への取り込みは、シデロフォア、細胞外鉄イオンに結合に結合して細胞内に転位させるキレート剤の作用によって達成することができる。鉄および他の無機化合物代謝に対する引例としては、Ｌｅｎｇｅｌｅｒら、１９９９、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら編、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａ．Ｌ．ら編、１９９？、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性細菌」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、Ｖｏｅｔ，Ｄ．ａｎｄ Ｖｏｅｔ，Ｊ．Ｇ．、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｂｒｏｃｋ，Ｔ．Ｄ．ａｎｄ Ｍａｄｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．、１９９１、微生物の生物学、第６版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ：Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ、２６７〜２６９、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ｐ．Ｆ．、「応用微生物生理学−実際的アプローチ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと。
【００５６】
Ｃ．酵素およびタンパク質分解
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌が最適化される細胞内条件は、頻繁に多くの生化学反応が正常に行われる条件ではない。生理学的条件下でこのような反応を進行させるために、細胞は酵素を使用する。酵素は、生化学反応に対するエネルギー障壁を低下させるように分子と反応するか特殊な環境を獲得するように空間的に配向したタンパク質性生物学的触媒である。異なる酵素は異なる反応を触媒し、各酵素は、適切な条件下で且つ特定の時間反応するような転写、翻訳、または翻訳後調節の対象である。酵素は化合物の分解（例えば、プロテアーゼ）、合成（例えば、シンターゼ）、改変（例えば、トランスフェラーゼまたはイソメラーゼ）に寄与し、その全てが細胞の必要な化合物の生成が可能である。次に、これは、細胞の恒常性の維持に寄与する。
【００５７】
しかし、細菌が最も生存し得る生理学的条件下で酵素活性が至適化されるという事実は、環境条件が混乱した場合に酵素活性が混乱する可能性が高いことを意味する。例えば、温度変化によりタンパク質が異常に折りたたまれ、ｐＨの変化によってもこれは真であるので（タンパク質の折りたたみはポリペプチド鎖内の静電気的および疎水相互作用に非常に依存する）、それぞれのアミノ酸の電荷の任意の変更により（細胞ｐＨの変化によって起こるように）、タンパク質が正確に折りたたまれる能力に対する意味深い効果を有し得る。温度変化は、ポリペプチドのエネルギー的に安定な配置に正確に折りたたむ能力に影響を与えるポリペプチド分子が保有する運動エネルギー量を有効に変化させる。誤折りたたみタンパク質は、２つの理由で細胞に有害であり得る。第１に、異常に折りたたまれたタンパク質は類似の異常な活性を有し得るか、全く活性を示さない。第２に、誤折りたたみタンパク質は他の細胞系による適切な調節に必要な立体配置領域を欠くので、活性であるが非制御の様式であり得る。
【００５８】
細胞は、細胞に任意の損傷を与える前に誤折りたたみ酵素および調節タンパク質を迅速に破壊することができる機構（タンパク質分解）を有する。ｌａ／ｌｏｎファミリーおよびＣｌｐファミリーなどのタンパク質は、誤折りたたみタンパク質を特異的に認識して分解する（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｙ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．、１９９９、ＥＸＳ、７７、５７〜７８およびその参考文献ならびにＰｏｒａｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｊ．、１９９９、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３２（３）、４４９〜５８およびその参考文献、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら、１９９６、「Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ」、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．およびその参考文献、ならびにＰｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｇ．Ｇ．ａｎｄ Ｃｏｏｌｂｅａｒ，Ｔ．、１９９３、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｒｅｖ．１２（１−３）、１７９〜２０６およびその参考文献を参照のこと）。これらの酵素は誤折りたたみおよび非折りたたみタンパク質に結合して、ＡＴＰ依存様式でこれらを分解する。したがって、タンパク質分解は、環境の変化に対する正常な細胞機能の損傷を防止するために細胞によって使用される重要な機能として利用され、さらに、その他の誤調節および／または異常な酵素または調節活性によって毒性を示す条件および環境下で細胞を生存させる。
【００５９】
タンパク質分解はまた、至適環境条件下での細胞における重要な機能を有する。正常な代謝過程内で、プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解、必要な分解産物を得るための複合体分子の異化作用、およびタンパク質改変を補助する。分泌プロテアーゼは、これらの化合物の細胞への侵入前でさえも外部栄養素の異化において重要な役割を果たす。さらに、タンパク質分解活性自体が調節機能を利用する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子形成およびＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ種の細胞周期の進行はこれらの各種における鍵となるタンパク質分解事象によって調節されることが公知である（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２（２）、１４２〜１４７）。したがって、タンパク質分解過程は、最適以下および最適環境条件下での細胞生存の鍵であり、細胞の恒常性の全体的な維持に寄与する。
【００６０】
Ｄ．細胞壁生成および再配列
細胞の生化学的機構が異なり且つおそらく好ましい環境に容易に適応することができるが、細胞は依然として環境から保護することができる一般的機構を必要とする。多数の細菌では、細胞壁はこのような保護を付与し、接着、細胞増殖および分裂、および所望の溶質および廃棄物質の輸送の役割も果たす。
【００６１】
機能させるために、細胞は、周囲の媒質より実質的に高い細胞内濃度の代謝産物および他の分子を必要とする。疎水性膜の存在のために細胞からのこれらの代謝産物の放出が非常に妨げられるので、系の傾向として、溶質の内部濃度が外部濃度に一致するように水分子が外部媒質から細胞に侵入する。水分子は細胞膜を容易に通過することができ、この膜は得られた膨張および圧力に耐えることができるので、細胞が浸透圧溶解し得る。細胞壁の剛性は、細胞のこれらの圧力への耐性を非常に改善し、さらに細胞由来のこれらの代謝産物および所望の媒質の望ましくない拡散に対するさらなる障壁を付与する。同様に、細胞壁はまた、望ましくない物質の細胞への侵入を防止する。
【００６２】
細胞壁はまた、多数の他の細胞過程、例えば、接着、細胞増殖および分裂などに関与する。細胞壁が細胞を完全に包囲しているという事実のために、細胞のその周囲との任意の相互作用が細胞壁に媒介されなければならない。したがって、細胞壁は、細胞の他の細胞および所望の表面への任意の接着に関与しねければならない。さらに、細胞が増殖または分裂すれば、細胞壁の変化が必ず付随し得る。細胞壁が付与する保護は増殖、形態形成、および増殖の間に必要であるので、細胞分裂中の鍵となる工程の１つは新規の細胞が古い細胞から分裂するような細胞内の細胞壁合成である。したがって、細胞増殖および細胞分裂につれて細胞壁が頻繁に合成される（例えば、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａ．Ｌ．ら編、１９９３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグラム陽性細菌、ＡＳＭ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。
【００６３】
細胞壁の構造は、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間で異なる。しかし、両型では、以下の壁の基本的構造単位は類似のままである：「ペプチドグリカン」と呼ばれるアミノ酸（最も一般的には、Ｌ−アラニン、Ｄ−グルタミン酸、ジアミノピメリン酸、およびＤ−アラニン）によって架橋された２つの多糖類、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）の重複格子。細胞壁合成に関連する過程は公知である（例えば、Ｍｉｃｈａｌ，Ｇ．、１９９９、「生化学的経路：生化学および分子生物学アトラス」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００６４】
グラム陰性細菌では、内部細胞膜は、ムレイン嚢と呼ばれる一重ペプチドグリカン（厚さ約１０ｎｍ）で覆われている。このペプチドグリカン構造は、非常に強靭で、その構造により生物の形態が決定される。ムレイン嚢の外表は、ポーリンおよび他の膜タンパク質、リン脂質、およびリポ多糖を含む外膜で覆われている。外膜との強固な会合を維持するために、グラム陰性細胞壁はまた、細胞壁を周囲の膜に固着させるために使用される分散型の脂質分子を有する。
【００６５】
グラム陽性細菌（コリネバクテリウムグルタミカムなど）では、原形質膜は、厚さ２０〜８０ｎｍの範囲の多重ペプチドグリカンによって覆われている（例えば、Ｌｅｎｇｅｌｅら編、「原核生物の生物学」、Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、９１３〜９１８、８７５〜８９９、および８８〜１０９ならびにその参考文献を参照のこと）。グラム陽性細胞壁はまた、テイコ酸（リン酸基を介して結合したグリセロールまたはリビトールのポリマー）を含む。テイコ酸はまたアミノ酸と会合することができ、ムラミン酸と共有結合を形成する。リポタイコ酸およびタイクロン酸もまた存在し得る。存在する場合、鞭毛または夾膜などの細胞表面構造もこの層に固着される。
【００６６】
ＩＩＩ．本発明の要素および方法
本発明は、少なくとも一部は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす、本明細書中でＨＡ核酸およびタンパク質分子と呼ばれる新規の分子の発見に基づく。１つの実施形態では、ＨＡ分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有する。好ましい実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性に関する本発明のＨＡ分子の活性は、この生物による所望の精製化学製品の生産に影響を与える。特に好ましい実施形態では、本発明のＨＡ分子は、ＨＡ分子が関与するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞過程（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解、または酵素活性またはタンパク質分解活性）の活性が変化して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによる所望の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接的または間接的に調整されるように活性を調整する。
【００６７】
用語「ＨＡタンパク質」または「ＨＡポリペプチド」には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ恒常性に関連する多数の細胞工程またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の好ましくない環境条件への適応能力に関連するタンパク質が含まれる。例えば、ＨＡタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関連するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有し得る。ＨＡタンパク質の例には、表１および偶数の配列番号に記載のＨＡ遺伝子によってコードされるタンパク質が含まれる。用語「ＨＡ遺伝子」または「ＨＡ核酸配列」には、コード領域および対応する非翻訳５’および３’配列領域からなるＨＡタンパク質をコードする核酸配列が含まれる。ＨＡ遺伝子の例には、表１に記載の遺伝子が含まれる。用語「生産」または「生産性」は、当該分野で認識されており、所与の時間および所与の発酵体積（例えば、ｋｇ産物／時間／リットル）以内で形成された発酵産物（例えば、所望の精製化学製品）が含まれる。用語「生産効率」には、達成すべき特定の生産レベルに必要な時間（例えば、精製化学製品の特定の速度を達成するための細胞が要する時間）が含まれる。用語「生産量」または「産物／炭素量」は当該分野で認識されており、炭素源の産物（すなわち、精製化学製品）への変換効率が含まれる。これは、一般に、例えばｋｇ産物／炭素源と記載される。化合物の生産量または生産の増加により、回収された分子の量または所与の時間に対する所与の培養量中のその化合物の有用な回収分子の量が増加する。用語「生合成」または「生合成経路」は当該分野で認識されており、多工程で且つ高度に調節された過程における中間体化合物からの細胞による化合物、好ましくは有機化合物の合成が含まれる。用語「分解」または「分解経路」は当該分野で認識されており、多工程で且つ高度に調節された過程における分解産物（一般に、より小さいか複雑でない分子）への細胞による化合物、好ましくは有機化合物の破壊が含まれる。用語「代謝」は当該分野で認識されており、生物で行われた生化学反応の全てが含まれる。特定の化合物の代謝（例えば、グリシンなどのアミノ酸の代謝）は、細胞におけるこの化合物に関する全ての生合成、改変、および分解経路を含む。用語「恒常性」は当該分野で認識されており、細胞外環境条件に支配されているにもかかわらず一定の細胞な環境を維持するために細胞によって利用されている機構の全てが含まれる。このような過程の非限定的な例は、高細胞内媒質濃度による浸透圧溶解の防止のための細胞壁の利用である。用語「適応」または「環境条件への適応」は当該分野で認識されており、好ましくない環境条件下（一般に、１つまたは複数の好ましい栄養素が存在しない環境条件または細胞の至適生存範囲外の温度、ｐＨ、浸透圧、酸素の割合などの環境条件）で生存することができるように細胞によって利用される機構が含まれる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含む多くの細胞は、このような条件下で発現し、且つこのような最適以下条件で増殖を続けるタンパク質をコードする遺伝子を有する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明のＨＡ分子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物における精製化学製品などの所望の分子の産生を調整することができる。本発明のＨＡタンパク質の変更によりこのような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率が直接影響を受け得る多数の機構が存在する。例えば、これらの酵素の活性または数を増加または減少させるように芳香族化合物または脂肪族化合物を改変する酵素操作により、これらの化合物の改変または分解産物である１つまたは複数の精製化学製品の生産を調整することができる。同様に、無機化合物代謝に関連する酵素により、アミノ酸、ビタミン、および核酸などのこのような精製化学製品の生合成用の鍵となる分子（例えば、亜リン酸、硫黄、および窒素分子）が得られる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのこれらの酵素の活性または数の変更により、これらの無機化合物変換の増加（または代わりの無機化合物の使用）によりこれらの精製化学製品への無機原子の組み込み率を改良可能である。一般的な細胞過程に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素の遺伝子操作により、これらの酵素の多くが精製化学製品（例えば、アミノ酸）または精製化学製品合成または分泌に関連する酵素を直接改変するので、精製化学製品の生産を直接改良することもできる。細胞プロテアーゼの活性または数の調整はまた、多数のプロテアーゼが精製化学製品または精製化学製品の生産もしくは崩壊に関連する酵素を分解することができるので、精製化学製品に直接影響を与え得る。
【００６９】
さらに、芳香族／脂肪族化合物の改変もしくは分解、一般的な生体触媒反応、無機化合物代謝、またはタンパク質分解に関与する上記の酵素自体が、その活性が種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ産業に適用に望ましい精製化学製品である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの１つまたは複数のこれらの酵素のコピー数の変更により、細胞によって産生されるこれらの酵素の数を増加させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の大量培養物由来のこれらのタンパク質の潜在的生産量または生産効率を増加させることができる。
【００７０】
本発明のＨＡタンパク質の変更はまた、このような変更タンパク質が組み込まれたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株由来の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接影響を与え得る。例えば、細胞壁の構築または再配列に関連するこれらのタンパク質の活性および／または数の調整により、細胞が機械的ストレスおよび大量発酵培養中の他のストレスにより良好に耐えることができるように細胞壁の構造自体を改変することができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量増殖には、有意な細胞壁産生が必要である。細胞壁生合成または分解酵素の活性または数の調整により細胞壁をより迅速に生合成可能であり、それによりこの培養微生物の培養における増殖速度を増加させることができ、それにより所望の精製化学製品の生産細胞数を増加させることができる。
【００７１】
本発明のＨＡ酵素の改変により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、または生産効率に直接影響を与えることもできる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの多数の一般的酵素は、細胞過程全体（例えば、調節過程）に有意に影響を与え、それにより精製化学製品の代謝に有意な影響を与える。同様に、プロテアーゼ、毒性を示す可能性のある芳香族または脂肪族化合物を改変または分解する酵素、および無機化合物の代謝を促進する酵素は全てＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの生存度の増大に役立つ。プロテアーゼは、誤折りたたみまたは誤調節タンパク質、例えば、大量発酵槽培養中に遭遇する比較的ストレスの多い環境条件下で生じ得るタンパク質などの選択的除去を支援する。これらのタンパク質の変更によって、この活性をさらに向上させ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの培養における生存度を改良することができる。芳香族／脂肪族の改変または分解タンパク質は、これらの廃棄化合物（培養培地中の不純物または細胞自体の廃棄物として遭遇し得る）の解毒だけでなく、最適な炭素源が培養物中で制限されている場合に細胞が代替炭素源を利用するのにも役立つ。その数および／または活性の増加により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の生存を向上させることができる。本発明の無機代謝タンパク質は、全てのタンパク質およびヌクレオチド（など）の合成に必要な無機分子を細胞に供給するので、細胞の全体的な生存度に重要である。大量培養における１つまたは複数の所望の精製化学製品を生産する生細胞数の増加により、培養による精製化学物質の生産量、生産、および／または生産効率が付随的に増加するはずである。
【００７２】
本発明の単離核酸配列は、ＡＴＣＣ １３０３２と命名されたアメリカンタイプカルチャーコレクションから利用可能なＣｏｒｙｅｂａｃｔｅｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノム内に含まれる。単離Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡのヌクレオチド配列およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質の推定アミノ酸配列を、配列表にそれぞれ奇数の配列番号および偶数の配列番号として示す。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の改変もしくは分解に関連するか、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するタンパク質をコードする配列としてのこれらのヌクレオチド配列を分類および／または同定するコンピュータ分析を行った。
【００７３】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に実質的に相補的なアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。本明細書中に記載のように、選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質は、選択されたアミノ酸配列、例えば、選択されたアミノ酸配列全体に少なくとも５０％相同である。選択アミノ酸配列に実質的に相同的なアミノ酸配列を有するタンパク質はまた、選択アミノ鎖配列に約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であり得る。
【００７４】
本発明のＨＡタンパク質またはその生物活性部分またはフラグメントは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たすか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し得る。
【００７５】
本発明の種々の態様を、以下の小節でさらに詳述する。
【００７６】
Ａ．単離核酸分子
本発明の１つの態様は、ＨＡポリペプチドまたはその生物活性部分をコードする単離核酸分子ならびにＨＡコード核酸（例えば、ＨＡ ＤＮＡ）の同定または増幅用のハイブリッド形成プローブまたはプライマーとしての使用に十分な核酸フラグメントに関する。本明細書中に記載のように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。この用語はまた、遺伝子の３’および５’コード領域に存在する非翻訳配列（コード領域の５’末端から少なくとも約１００ヌクレオチド上流の配列および遺伝子のコード領域の３’末端から少なくとも約２０ヌクレオチド下流）を含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、二本鎖ＤＮＡが好ましい。「単離」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離した分子である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、ＨＡ核酸分子は、核酸が由来する細胞（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離」核酸分子（ＤＮＡ分子など）は、他の細胞物質、組換え技術によって産生された場合は培養培地、または化学合成された場合は化学前駆体または他の化学物質を実質的に含み得ない。
【００７７】
本発明の核酸分子（例えば、配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配列を有する核酸分子）またはその一部を、標準的な分子生物学技術および本明細書中で得られた配列情報を使用して単離することができる。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡを、ハイブリッド形成プローブとして配列表の奇数の配列番号の１つの全てまたは一部および標準的なハイブリッド形成技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載）を使用してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍライブラリーから単離することができる。さらに、本発明の核酸配列（例えば、奇数の配列番号）の１つの全てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる（例えば、本発明の核酸配列（例えば、配列表の奇数の配列番号）の１つの全てまたは一部を含む核酸分子を、この配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる）。例えば、ｍＲＮＡを、正常な内皮細胞から単離することができ（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８、５２９４〜５２９９のグアニジニウム−チオシアン酸塩抽出法による）、ＤＮＡを逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから市販のＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから市販のＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマーを、配列表に記載のヌクレオチド配列の１つに基づいて設計することができる。本発明の核酸を、標準的暗ＰＣＲ増幅技術によるテンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを使用して増幅することができる。このようにして増幅した核酸を、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけることができる。さらに、ＨＡヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用した標準的技術によって調製することができる。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表に記載のヌクレオチド配列の１つを含む。本発明の核酸配列は、配列表に記載のように、本発明のコリネバクテリウムグルタミカム ＨＡ ＤＮＡに対応する。このＤＮＡは、ＨＡタンパク質をコードする配列（すなわち、配列表のそれぞれ奇数の配列番号の配列中に表示の「コード領域」）ならびに配列表のそれぞれ奇数の配列番号に表示の５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含む。あるいは、核酸分子は、配列表の核酸配列中の任意の配列のコード領域のみを含む。
【００７９】
本出願の目的のために、配列表に記載の各核酸およびアミノ酸配列は、記号表示「ＲＸＡ」、「ＲＸＮ」、「ＲＸＳ」、または「ＲＸＣ」のあとに５桁の数字を有するＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ識別番号（すなわち、ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３）ことが理解される。各核酸配列は、以下の３つまでの部分を含む：５’上流領域、コード領域、および下流領域。混乱をなくすために、これらのそれぞれ３つの領域を同一のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示で識別する。詳述「配列表の奇数番号の配列の１つ」は、異なるＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示によって区別することもできる配列表の任意の核酸配列をいう。これらの各配列のコード領域は、対応するアミノ酸配列に翻訳され、これはまた、偶数の配列番号（配列表に対応する核酸配列の直後）として記載されている。例えば、ＲＸＡ０２５４８のコード領域を配列番号１に記載し、これがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明の核酸分子の配列は、容易に相関することができるようにコードされるアミノ酸分子と同一のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示によって識別される。例えば、ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３と表示されたアミノ酸配列は、それぞれ核酸分子ＲＸＡ０２４５８、ＲＸＮ００２４９、ＲＸＳ００１５３、またはＲＸＣ００９６３のヌクレオチド配列のコード領域の翻訳物である。本発明のＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣヌクレオチドおよびアミノ酸配列と割り当てた配列番号との間の対応を、表１に示す。
【００８０】
本発明のいくつかの遺伝子は、「Ｆ表示遺伝子」である。Ｆ表示遺伝子には、ＲＸＡ、ＲＸＮ、ＲＸＳ、またはＲＸＣ記号表示の前に「Ｆ」を有する表１に記載の遺伝子が含まれる。例えば、表１に「Ｆ ＲＸＡ００２４９」と表示の配列番号５は、配列番号１１、１５、および３３のＦ表示遺伝子（それぞれ表１に「Ｆ ＲＸＡ０２２６４」、「Ｆ ＲＸＡ０２２７４」、および「Ｆ ＲＸＡ００６７５」として表示）である。
【００８１】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、表２に集めた核酸分子を含むことを意図しない。ｄａｐＤ遺伝子の場合、この遺伝子の配列は、Ｗｅｈｒｍａｎｎ，Ａ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０、（１２）、３１５９〜３１６５で公開されていた。しかし、本出願の発明で得られた配列は、公開されたものより有意に長い。公開された変形形態は不正確な開始コドンに依存するので実際のコード領域のフラグメントのみを示すと考えられる。
【００８２】
別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つまたはその一部の相補物である核酸分子を含む。本発明のヌクレオチド配列の１つに相補的な核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の１つとハイブリッド形成して安定な二重らせんを形成することができるように配列表のヌクレオチド配列（例えば、奇数の配列番号の配列）の１つに十分に相補的である分子である。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部を含む。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。さらに好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列の１つまたはその一部とハイブリッド形成する、例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
さらに、本発明の核酸分子は、配列表の奇数の配列番号の１つの配列領域をコードする部分のみ（例えば、ＨＡタンパク質の生物活性部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用することができるフラグメント）を含み得る。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＨＡ遺伝子のクローニングから同定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型および生物のＨＡホモログならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａまたは関連種由来のＨＡホモログの同定および／またはクローニング用に設計されたプローブおよびプライマーを作製可能である。プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）の１つのセンス鎖、これらの配列のアンチセンス配列、または天然に存在するその変異体の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、より好ましくは少なくとも約４０、５０、または７５個の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列領域を含む。本発明のヌクレオチド配列に基づくプライマーをＰＣＲ反応で使用して、ＨＡホモログをクローン化することができる。ＨＡヌクレオチド配列に基づいたプローブを使用して、同一または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブは、これに結合した標識基をさらに含み、例えば、標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブを、細胞サンプル中のＨＡコード核酸レベルの測定（例えば、ＨＡ ｍＲＮＡレベルの検出またはゲノムＨＡ遺伝子が変異または欠失しているかどうかの同定）などによってＨＡタンパク質を誤発現する細胞の同定用の診断試験キットの一部として使用することができる。
【００８５】
１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するように本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相同的なアミノ酸配列含むタンパク質またはその一部をコードする。本明細書中で使用されるように、「十分に相補的な」は、タンパク質またはその一部がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるように本発明のアミノ酸配列に同一または等価な最小数のアミノ酸残基、例えば、配列表の偶数の配列番号の１つの配列中のアミノ酸残基として類似の側鎖を有するアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部をいう。本明細書中に記載のように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞壁の生合成または再配列、無機化合物の代謝、芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関するか、酵素活性またはタンパク質分解活性を有するタンパク質は、１つまたは複数の精製化学製品の生産および分泌で役割を果たし得る。このような活性の例はまた、本明細書中に記載されている。したがって、「ＨＡタンパク質の機能」は、１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接的または間接的に寄与する。ＨＡタンパク質活性の例は、表１に記載されている。
【００８６】
別の実施形態では、タンパク質は、本発明の全アミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。
【００８７】
本発明のＨＡ核酸分子によってコードされるタンパク質部分は、ＨＡタンパク質の１つの生物活性部分であることが好ましい。本明細書中で使用されるように、用語「ＨＡタンパク質の生物活性部分」は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与するか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たすか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有し得るＨＡタンパク質の一部、例えば、ドメイン／モチーフを含むことが意図される。ＨＡタンパク質またはその生物活性部分がＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞壁の生合成もしくは再構成、無機化合物の代謝、芳香族もしくは脂肪族化合物の分解に関連することができるかＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの酵素活性またはタンパク質分解活性を有するかどうかを同定するために、酵素活性アッセイを行うことができる。例示の実施例８に詳述のように、このようなアッセイ法は当業者に周知である。
【００８８】
ＨＡタンパク質の生物活性部分をコードするさらなる核酸フラグメントを、本発明のアミノ酸配列（配列表の偶数の配列番号の配列）の１つの一部の同定、ＨＡタンパク質またはペプチドのコード部分の発現（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換え発現による）、およびＨＡタンパク質またはペプチドのコード部分の活性の評価によって調製することができる。
【００８９】
本発明は、さらに、遺伝コードの縮重のために本発明のヌクレオチド配列（配列表の奇数の配列番号の配列）の１つ（およびその一部）と異なるが本発明に記載のヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＨＡタンパク質をコードする核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列表に記載のアミノ酸配列（偶数の配列番号）を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。なおさらなる実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明のアミノ酸配列（配列表の奇数の配列番号に記載の読み取り枠によってコードされる）に実施的に相同な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質をコードする。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明の配列は本発明の以前に利用可能であった当該分野の配列、たとえば、表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列などを含むことを意味すると当業者に理解される。１つの実施形態では、本発明は、先行技術の配列（例えば、表２または表４に記載のＧｅｎｂａｎｋ配列（またはこのような配列によってコードされるたんぱく質））よりも高い本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する同一％を有するヌクレオチドよび核酸配列を含む。例えば、本発明は、ＲＸＡ００４７１（配列番号２９３）と記号表示されたヌクレオチド配列に３９％を超えるおよび／または少なくとも３９％同一なヌクレオチド配列、ＲＸＡ００５００（配列番号１４３）と記号表示されたヌクレオチド配列に４１％を超えるおよび／または少なくとも４１％同一なヌクレオチド配列、およびＲＸＡ００５０２（配列番号１４７）と記号表示されたヌクレオチド配列に３５％を超えるおよび／または少なくとも３５％同一なヌクレオチド配列を含む。当業者は、所与の配列についてそれぞれ３つの上位のヒットについて表４に記載のＧＡＰ計算同一％スコアの試験および１００％から最も高いＧＡＰ計算同一％の引き算によって本発明の任意の所与の配列の同一％のより低い閾値を計算することができる。当業者はまた、このようにして計算したより低い閾値より高い同一％（例えば、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または、９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一）を有する核酸またはアミノ酸配列もまた本発明に含まれることを認識する。
【００９１】
奇数の配列番号のとして配列表に記載のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡヌクレオチドに加えて、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多形が集団（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ母集団）内に存在し得ることが当業者に認識される。ＨＡ遺伝子におけるこのような遺伝子多形は、天然の変動による集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＨＡタンパク質、好ましくはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質をコードする読み取り枠を含む核酸分子をいう。このような天然の変動により、典型的には、ＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列が１〜５％変動し得る。天然の変動の結果であり、ＨＡタンパク質の機能活性が変化していない任意および全てのこのようなヌクレオチドの変動および得られたＨＡのアミノ酸多形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９２】
天然の変異型および本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ ＤＮＡの非Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍホモログに対応する核酸分子を、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標準的なハイブリッド形成技術のハイブリッド形成プローブとして、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＤＮＡまたはその一部を使用して本明細書中に開示のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡ核酸に対する相同性に基づいて単離することができる。したがって、別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で配列表の奇数の配列番号のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の実施形態では、核酸は、少なくとも３０、５０、１００、２５０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。本明細書中で使用される、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」は、典型的には互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリッド結合したままであるハイブリッド形成および洗浄条件を記載することが意図される。好ましくは、互いに少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、またはそれ以上の条件の相同性で典型的に互いにハイブリッド形成を維持する。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．、１９８９、６．３．１〜６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントな条件の好ましい非限定的な例は、４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリッド形成後の５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される、「天然に存在する」核酸分子は、自然に発生する（例えば、天然タンパク質をコードする）ヌクレチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。１つの実施形態では、核酸は、天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質をコードする。
【００９３】
集団中に存在し得るＨＡ配列の天然に存在する変異型に加えて、当業者は、変化により変異による本発明のヌクレオチド配列が挿入され、それによりＨＡタンパク質の機能的活性を変化させることなくコードされたＨＡタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができることをさらに認識する。本発明のヌクレオチド配列中で、例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸を置換させるヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＨＡタンパク質活性を変化させることなくＨＡタンパク質（例えば、配列表の偶数の配列眼号）１つの野生型配列から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基はＨＡタンパク質活性に必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＨＡ活性を有するドメイン中で変換されないか半変換のみされる残基）は活性に必須ではないので、ＨＡ活性を変化させない変化に感受性を示すこともあり得る。
【００９４】
したがって、本発明の別の態様は、ＨＡ活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むＨＡタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＨＡタンパク質は、本明細書中に記載のＨＡ活性の少なくとも１つを依然として保持する配列表の偶数の配列番号の配列と核酸配列が異なる。１つの実施形態では、単離核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、本発明のアミノ酸配列に少なくとも約５０％相同なアミノ酸配列を含み、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たすことができるか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子にコードされるタンパク質は、配列表の奇数の配列番号の１つのアミノ酸配列に約５０〜６０％相同、より好ましくはこれらの配列に少なくとも約６０〜７０％相同、より好ましくはこれらの配列に少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、または９０〜９５％相同、最も好ましくは本発明のアミノ酸配列の１つに少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【００９５】
２つのアミノ酸配列（本発明のアミノ酸の１つまたはその変異体）または２つの核酸の相同％を同定するために、配列を最適に比較できるように整列させる（例えば、他のタンパク質または核酸と最適に整列させるために１つのタンパク質または核酸配列にギャップを挿入することができる）。対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。１つの配列（本発明のアミノ酸配列の１つ）中の位置は、他の配列（例えば、アミノ酸配列の変異形態）中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。２つの配列間の相同％は、同一の位置での配列の共有数の関数である（すなわち、相同％＝同一の位置数／全位置数×１００）。
【００９６】
本発明のタンパク質配列に相同なＨＡタンパク質（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）をコードする単離核酸分子を、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードタンパク質に移入されるような１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失の本発明のヌクレオチド配列への移入によって作製することができる。変異を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術によって本発明のヌクレオチド配列の１つに移入することができる。好ましくは、１つまたは複数の推定非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ＨＡタンパク質における推定非必須アミノ酸残基を、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換することが好ましい。あるいは、変異を、飽和変異誘発などによってはコード配列の全てまたは一部に無作為に移入することができ、得られた変異体は本明細書中に記載のＨＡ活性についてのスクリーニングしてＨＡ活性を維持している変異体を同定することができる。配列表の奇数の配列番号１つのヌクレオチド配列の変異誘発後、コードタンパク質を組換え発現させることができ、タンパク質活性を、例えば本明細書中に記載のアッセイ（例示の実施例８を参照のこと）を使用して同定することができる。
【００９７】
上記のＨＡタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、アンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、例えば二本鎖ＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的なタンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全ＨＡコード鎖に相補的であっても、その一部のみに相補的であっても良い。１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されたコドンを含むヌクレオチド配列（例えば、配列番号３（ＲＸＮ００２４９）の全コード領域は１〜９５７のヌクレオチドを含む）をいう。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＨＡをコードするヌクレオチドのコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接した５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【００９８】
本明細書中に開示のＨＡをコードするコード鎖配列（例えば、配列表の奇数の配列番号として記載の配列）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸を、Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ塩基対合にしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＨＡ ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、ＨＡ ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることがより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＡ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野で公知の手順を使用した化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるかアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重らせんの物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを使用して化学合成することができる（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）。アンチセンス核酸を作製するために使用することができる改変ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアミン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノー３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、核酸がアンチセンス方向でサブクローン化される発現ベクターを使用して、アンチセンス核酸を生物学的に産生させることができる（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である（以下の小節にさらに記載する））。
【００９９】
本発明のアンチセンス核酸は、典型的には、ＨＡタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するかそれに結合してタンパク質発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳の阻害による）ように、細胞に投与されるかｉｎ ｓｉｔｕで作製される。ハイブリッド形成は、従来のヌクレオチド相補性によって、または例えばＤＮＡ二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主要な溝における特異的相互作用によって安定な二本鎖を形成することであり得る。アンチセンス分子を、例えばアンチセンス核酸分子の細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体への連結によって選択された細胞表面上に発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変することができる。アンチセンス核酸分子を、本明細書中に記載のベクターを使用して細部に送達させることもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、原核生物、ウイルス、または真核生物強力プロモーターの制御下でアンチセンス核酸分子が存在するベクター構築物が好ましい。
【０１００】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常β単位と対照的に鎖が互いに並行である相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１５、６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５、３２７〜３３０）を含み得る。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、相補領域を有する一本鎖核酸（ｍＲＮＡなど）を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、ヒト化リボザイム（Ｈａｓｅｌｇｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、５８５〜５９１に記載））を使用してＨＡ ｍＲＮＡ転写物を触媒反応で切断して、ＨＡ ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＨＡコード核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書中に記載のＨＡ ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号３（ＲＸＮ００２４９））に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＨＡコードｍＲＮＡ中で切断されるべきヌクレオチド配列に相補的なＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、Ｃｅｃｈらに付与された米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらに付与された同第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＨＡ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子プール由来の特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１０２】
あるいは、ＨＡ遺伝子発現を、ＨＡヌクレオチド配列の調節領域（例えば、ＨＡプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列の標的によって阻害して、標的細胞中でＨＡ遺伝子の転写を阻害する三重らせん構造を形成することができる。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．、１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、６（６）、５６９〜８４、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、６６０、２７〜３６、およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．、１９９２、Ｂｉｏａｓｓｅｙｓ、１４（１２）、８０７〜１５を参照のこと。
【０１０３】
Ｂ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、ＨＡタンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、さらなるセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターである。一定のベクターは、移入された宿主細胞中の自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への移入の際に宿主細胞ゲノムに取り込まれて、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一定のベクターは、作動可能に連結される遺伝子発現を指向することができる。このようなベクターを、本明細書中では「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的なベクターの形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかし、本発明は、等価の機能を果たすウイルスベクターなどのこのような発現ベクターの他の形態（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含むことを意図する。
【０１０４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターには、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された発現用に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクター内で「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が調節配列にヌクレオチド配列を発現させる様式で連結されていることを意味することが意図される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系中「またはベクターが宿主細胞内に移入されている場合は宿主細胞中）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化部位）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０に記載されている。調節配列には、多数の宿主細胞型でのヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列および一定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列が含まれる。好ましい調節配列は、例えば、細菌中で使用されることが好ましいプロモーター（ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩq−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ＳＰ６−、ａｒｎｙ、ＳＰＯ２、λ−ＰR−、またはλＰLなど）である。さらなる調節配列は、例えば、酵母および真菌由来のプロモーター（ＡＤＣ１、Ｍｆα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨなど）、植物由来のプロモーター（ＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターなど）である。人工プロモーターも使用可能である。発現ベクターの設計は形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者に認識される。本発明の発現ベクターを、宿主細胞に移入して、本明細書中に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＨＡタンパク質、ＨＡタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を含むタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０１０５】
本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中でのＨＡタンパク質発現用に設計することができる。例えば、ＨＡ遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母および他の真菌細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ Ｍ．Ａ．ら、１９９２、「酵母での外来遺伝子の発現：総説」、Ｙｅａｓｔ、８、４２３〜４８８、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、１９９１、「「糸状菌における異種遺伝子発現：真菌におけるより多数の遺伝子操作」、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ ＆ Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ編、３９６〜４２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆Ｐｕｎｔ．Ｐ．Ｊ．、１９９１、「糸状菌用の遺伝子導入系およびベクターの開発：真菌の応用分子遺伝学」、Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照のこと）、藻類および多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、１９８８、「Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの葉および子葉移植編を介した有効性の高いＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、５８３〜５８６を参照のこと）、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０でさらに考察されている。あるいは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、組換え発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【０１０６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指向する構成性または誘導プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に起こる。融合ベクターは、コードされるタンパク質（通常、組換えタンパク質のアミノ末端であるがＣ末端にも）アミノ酸数を追加するか、タンパク質内の適切な領域内で融合される。このような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的で利用される：１）組換えタンパク質発現の増加、２）組換えタンパク質の溶解性の増加、および３）親和性精製におけるリガンドとしての作用による組換えタンパク質精製の補助。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解結合部位と組換えタンパク質部分の分離を可能にするための組換えタンパク質との融合部分の接合部に移入し、その後融合タンパク質のを精製する。このような酵素およびその同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。
【０１０７】
典型的な融合発現ベクターには、組換えタンパク質に、それぞれ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、１９８８、Ｇｅｎｅ、６７、３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。１つの実施形態では、ＨＡタンパク質のコード配列を、ｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化して、ＧＳＴ−トロンビン切断部位−Ｘタンパク質をＮ末端からＣ末端まで含む融合タンパク質をコードするベクターを作製する。融合タンパク質を、グルタチオンアガロース樹脂を使用した親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＳＴに融合していない組換えＨＡタンパク質を、トロンビンとの融合タンパク質の切断によって回収することができる。
【０１０８】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６９、３０１〜３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、ｐＢｄＣｌ、およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０、６０〜８９、およびＰｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクター由来の標的遺伝子発現は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）の同時発現によって媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター由来の転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下でＴ７ｇｎ１遺伝子を保有する常在性λプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。細菌の他の変種の形質転換のために、適切なベクターを選択することができる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、およびｐＩＪ３６１はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの形質転換に有用であり、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の形質転換に適切であることが公知である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍについての遺伝情報の伝達用のいくつかのプラスミドには、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓら編、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）が含まれる。
【０１０９】
組換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、組換えタンパク質のタンパク質分解による切断能力を損なった宿主細菌中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、「遺伝子発現技術」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｄａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１９９０、１１９〜１２８）。別のストラテジーは、各アミノ酸の各コドンが発現用に選択された細菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど）中で好ましく利用されるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、２１１１〜２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更を、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
【０１１０】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現用のベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、Ｅｍｂｏ．Ｊ．、６、２２９〜２３４）、２μ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐ１３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ、３０、９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ、５４、１１３〜１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。糸状菌などの他の真菌での使用に適切なベクターおよびベクターの構築法には、以下に記載のものが含まれる：ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ．Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆ Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．、１９９１、「糸状菌の遺伝導入系およびベクターの開発」、「真菌の応用分子遺伝学」、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｅｒｄｙら編、１〜２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、およびＰｏｕｗｅｌｓら編、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８。
【０１１１】
あるいは、本発明のＨＡタンパク質を、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現することができる。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３、２１５６〜２１６５）、およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０、３１〜３９）が含まれる。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明のＨＡタンパク質を単細胞植物細胞（藻類など）または高糖植物由来の植物細胞（例えば、作物植物などの種子植物）中で発現させることができる。植物発現ベクターの例には、以下に記載のものが含まれる：Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ，Ｒ．、１９９２、「左側の境界近くに存在する選択マーカーを有する新規の植物に成分ベクター」、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０、１１９５〜１１９７およびＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．、１９８４、「植物形質転換用の二成分Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、１２、８７１１〜８７２１ならびにｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、およびｐＤＨ５１（Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９８５、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＢＳＮ ０ ４４４ ９０４０１８）。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物ベクターを使用して哺乳動物細胞に発現させる。哺乳動物発現細胞の例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．、６、１８７、１９５）が含まれる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節エレメントによって得られる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来である。原核細胞および真核細胞用の他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１１４】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で核酸の発現を指向することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１、２６８〜２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ、１９８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４３、２３５〜２７５）、特に、Ｔ細胞レセプター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ．、８、７２９〜７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３、７２９〜７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８３、Ｃｅｌｌ、３３、７４１〜７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメント、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ、１９８９、ＰＮＡＳ、８６、５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０、９１２〜９１６）、および哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願２６４，１６６）が含まれる。発達調節プロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３７４〜３７９）およびαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ、１９８９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、３、５３７〜５４６）もまた含まれる。
【０１１５】
本発明は、さらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ＨＡ ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子を発現可能な様式（ＤＮＡ分子の転写による）で調節配列を作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を指向する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列を選択することができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成性、特異的、または細胞型特異的発現を指向するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節領域の制御下で酸性され、その活性をベクターが移入された細胞型によって同定することができる組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得る。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、「遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１（１）、１９８６を参照のこと。
【０１１６】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが移入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では交換可能に使用される。このような用語は、特定の本件の細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫についてもいうことが理解される。変異または環境の影響により継代につれて一定の改変が生じ得るので、このような子孫は、実際は、親細胞と同一ではないが、本明細書中で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１１７】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＨＡタンパク質を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）中で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。本発明の核酸およびタンパク質分子の宿主細胞として都合よく使用することができるコリネバクテリウムグルタミカムに関連する微生物を、表３に記載する。
【０１１８】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に移入することができる。本明細書中で使用される、用語「形質転換」、「トランスフェクション」、「接合」、および「形質導入」は、種々の分野で認識されている外来核酸（例えば、線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ベクターを含まない線状ベクターまたは遺伝子構築物のみ）またはベクターの形態（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポゾン、または他のＤＮＡ）の核酸の宿主細胞への移入技術（リン酸化カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、天然の能力、化学薬品媒介導入、またはエレクトロポレーションを含む）である。適切な宿主細胞の形質転換法またはトランスフェクション法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験マニュアルに見出すことができる。
【０１１９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さなフラクションのみを外来ＤＮＡのそのゲノムに取り込むことができることが公知である。この取り込みを同定および選択するために、一般に、選択マーカーをコードする遺伝子（抗生物質耐性など）を、目的の遺伝子と共に宿主細胞に移入する。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物に耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸を、ＨＡタンパク質をコードするベクターと同一のベクターに対して宿主細胞に移入するか、別個のベクターに移入することができる。移入核酸で安定にトランスフェクションされた細胞を、例えば、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込まれた細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。
【０１２０】
相同組換え微生物を作製するために、欠失、付加、置換によってＨＡ遺伝子が変化した（例えば、機能破壊）ＨＡ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。好ましくは、ＨＡ遺伝子はコリネバクテリウムグルタミカムＨＡ遺伝子であるが、関連細菌、または哺乳動物、酵母、または昆虫起源由来のホモログであり得る。好ましい実施形態では、相同組換えの際に内因性ＨＡ遺伝子が機能的に破壊されるようなベクター（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない（「ノックアウト」ベクターともいう））を設計する。あるいは、相同組換えの際に内因性ＨＡ遺伝子が変異されているか変更されているが依然として機能性タンパク質をコードするような（例えば、上流調節領域を変更して内因性ＨＡタンパク質発現を変更することができる）ベクターを設計することができる。相同組換えベクターでは、ＨＡ遺伝子の変更部分はベクターが保有する外因性ＨＡ遺伝子と微生物中の内因性は遺伝子との間で相同組換えが起こるようにＨＡ遺伝子のさらなるアミノ酸がその５’および３’末端に隣接している。さらなる隣接ＨＡ核酸は、内因性遺伝子との首尾の良い相同組換えに十分な長さである。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端）をベクター中でインキュベートする（例えば、相同組換えベクターの説明については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１、５０３を参照のこと）。ベクターを微生物に移入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、移入ＨＡ遺伝子が内因性ＨＡ遺伝子と相同組換えされた細胞を当該分野で公知の技術を使用して選択する。
【０１２１】
別の実施形態では、移入遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む組換え微生物を産生させることができる。例えば、ｌａｃオペロンの制御下に置いたベクターへのＨＡ遺伝子の封入により、ＩＰＴＧの存在下のみでＨＡ遺伝子を発現する。このような調節系は当該分野で周知である。
【０１２２】
別の実施形態では、宿主細胞中の内因性ＨＡ遺伝子を、そのタンパク質産物が発現しないように破壊する（例えば、相同組換えまたは当該分野で公知の他の遺伝的手段）。別の実施形態では、宿主細胞中の内因性または移入ＨＡ遺伝子は、１つまたは複数の点変異、欠失、または逆位によって変化されるが、機能性ＨＡタンパク質を依然としてコードする。さらに別の実施形態では、微生物中のＨＡ遺伝子の１つまたは複数の調節領域（例えば、プロモーター、リプレッサー、またはインデューサー）を、ＨＡ遺伝子発現が調整されるように変更した（例えば、欠失、短縮、逆位、または点変異による）。当業者は、１つを超える所望のＨＡ遺伝子およびタンパク質改変を含む宿主細胞を本発明の方法を使用して容易に産生させることができ、これは本発明に含まれることを意味することが認識される。
【０１２３】
本発明の宿主細胞、例えば、原核生物または真核生物培養細胞などを使用して、ＨＡタンパク質を産生（すなわち、発現）させることができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の宿主細胞を使用したＨＡタンパク質の産生法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、ＨＡタンパク質が産生されるまで、適切な培地中で本発明の宿主細胞（ＨＡタンパク質をコードする組換え発現ベクターが移入されているか、ゲノムに野生型または変更ＨＡタンパク質をコードする遺伝子が移入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態では、この方法は、さらに、培地または宿主細胞からＨＡタンパク質を単離する工程を包含する。
【０１２４】
Ｃ．単離ＨＡタンパク質
本発明の別の態様は、単離ＨＡタンパク質およびその生物活性部分に関する。「単離」または「精製」タンパク質またはその生物活性部分は、組換えＤＮＡ技術によって産生された細胞物質または化学合成の場合には化学物質前駆体もしくはたの化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は、タンパク質が天然または組換えによって産生された細胞の細胞性分から分離されているＨＡタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の非ＨＡタンパク質（本明細書中では「夾雑タンパク質」ともいう）、より好ましくは約２０％未満の非ＨＡタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の非ＨＡタンパク質、最も好ましくは約５％未満の非ＨＡタンパク質を含むＨＡタンパク質調製物を含む。ＨＡタンパク質またはその生物活性部分が組換えによって産生された場合、培養培地を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の体積で存在する。用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質の合成に関連する化学物質前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されたＨＡタンパク質調製物を含む。１つの実施形態では、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量）未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、より好ましくは約２０％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、さらに好ましくは約１０％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質、最も好ましくは約５％未満の化学物質前駆体または非ＨＡタンパク質を有するＨＡタンパク質調製物を含む。好ましい実施形態では、単離タンパク質またはその生物活性部分は、ＨＡタンパク質が由来する同一の生物由来の夾雑タンパク質を欠く。典型的には、このようなタンパク質を、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＨＡタンパク質の組換え発現によって産生する。
【０１２５】
本発明の単離ＨＡタンパク質またはその一部は、ＤＮＡの修復または組換え、遺伝物質の転位、遺伝子発現（すなわち、転写または翻訳過程）、タンパク質折りたたみ、またはコリネバクテリウムグルタミカムのタンパク質分泌に関与し得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有する。好ましい実施形態では、タンパク質またはその一部が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関連するかこの微生物の異なる環境条件への適応に関連する機能を果たす能力を維持するように、タンパク質またはその一部は本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に十分に相同なアミノ酸配列を含む。タンパク質の一部は、本明細書中に記載の生物活性部分であることが好ましい。別の好ましい実施形態では、本発明のＨＡタンパク質は、配列表の偶数の配列番号として記載のアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列（例えば、配列表の奇数の配列番号の配列）とハイブリッド形成する（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を有する。さらに別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明の核酸配列の１つに少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列またはその一部によってコードされるアミノ酸配列またはその一部を有する。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。本発明の好ましいＨＡタンパク質はまた、本明細書中に記載の少なくとも１つのは活性を有する。例えば、本発明の好ましいＨＡタンパク質は、本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成し（例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの恒常性の維持に関与し得るか、この微生物の異なる環境条件への適用に関連する機能を果たし得るか、表１に記載の１つまたは複数の活性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
他の実施形態では、ＨＡタンパク質は、上記の小節Ｉに詳述のように、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）に実質的に相補的であり、天然の変動または変異誘発によってアミノ酸配列が異なるが本発明の１つまたは複数のアミノ酸配列の一部の機能的活性を保持している。したがって、別の実施形態では、ＨＡタンパク質は、本発明の全アミノ酸配列に少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％、より好ましくは少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７７％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８８％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％、または９１％、９２％、９３％、９４％、更により好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含み、本明細書中に記載の少なくとも１つのＨＡ活性を有するタンパク質である。上記範囲の中間の範囲および同一値（例えば、７０〜９０％同一または８０〜９５％同一）はまた、本発明に含まれることが意図される。例えば、上限および／下限として上記の任意の値の組み合わせを使用した同一値の範囲が含まれることが意図される。別の実施形態では、本発明は、本発明の全アミノ酸配列に実質的に相同な全長Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質に関する。
【０１２７】
ＨＡタンパク質の生物活性部分には、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列表の偶数の配列番号の配列）由来のアミノ酸配列、ＨＡタンパク質に相補的なタンパク質のアミノ酸配列（少なくとも１つのＨＡタンパク質活性を示す、全長ＨＡタンパク質よりも少ないアミノ酸またはＨＡタンパク質に相補的な全長ＨＡアミノ酸を含む）が含まれる。典型的には、生物活性部分（ペプチド、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長のペプチド）は、少なくとも１つのＨＡタンパク質活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、他のタンパク質領域が欠失した他の生物活性部分を組換え技術で調整して、本明細書中に記載の１つまたは複数の活性について評価することができる。好ましくは、ＨＡタンパク質の生物活性部分には、生物活性を有する１つまたは複数の選択ドメイン／モチーフまたはその一部が含まれる。
【０１２８】
ＨＡタンパク質は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を、発現ベクター（上記）にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞（上記）に移入し、宿主細胞中でＨＡタンパク質を発現させる。次いで、ＨＡタンパク質を、標準的な精製技術を使用した適切な精製スキームによって細胞から単離することができる。組換え発現の代わりに、ＨＡタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを標準的にペプチド合成技術を使用して化学合成することができる。さらに、天然のＨＡタンパク質を、例えば本発明のＨＡタンパク質またはそのフラグメントを利用した標準的な技術によって作製することができる抗ＨＡ抗体を使用して細胞（例えば、上皮細胞）から単離することができる。
【０１２９】
本発明はまた、ＨＡキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される、ＨＡ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＨＡポリペプチドに作動可能に連結されたＨＡポリペプチドを含む。「ＨＡポリペプチド」は、ＨＡタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、「非ＨＡタンパク質」は、ＨＡタンパク質に実質的に相同でないタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質と異なり、且つ同一および異なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。融合タンパク質では、用語「作動可能に連結された」は、ＨＡポリペプチドおよび非ＨＡポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことが意図される。非ＨＡポリペプチドをＨＡポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。例えば、１つの実施形態では、融合タンパク質は、ＨＡ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−ＨＡ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＨＡタンパク質の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＨＡタンパク質である。一定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ＨＡタンパク質の発現および／または分泌を、異種シグナル配列の使用によって増加させることができる。
【０１３０】
好ましくは、本発明のＨＡキメラタンパク質および融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術で産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来技術にしたがって、例えば、ライゲーション用のスタッガー末端または付着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、適切な付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのる仮ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーションの使用によって、インフレームで互いにライゲーションする。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成することができる。あるいは、２つの連続的遺伝子間の相補的オーバーハングを引き起こす固着プライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行い、その後アニーリングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、「現代の分子生物学プロトコール」、Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードしている多数の発現ベクターが市販されている。ＨＡコード核酸を、融合部分がＨＡタンパク質にインフレームで連結するように、このような発現ベクターにクローン化することができる。
【０１３１】
ＨＡタンパク質のホモログを、変異誘発（例えば、ＨＡタンパク質の点変異または短縮）によって作製することができる。本明細書中で使用される、「ホモログ」は、ＨＡタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するＨＡタンパク質の変異形態をいう。ＨＡタンパク質のアゴニストは、ＨＡタンパク質の実質的に同一またはサブセットの生物活性を保持することができる。ＨＡタンパク質のアンタゴニストは、例えば、機能的相互作用不可能になるようなＨＡタンパク質を含む生物学的カスケードの下流または上流メンバーへの競合的結合、ＨＡタンパク質が相互作用する標的分子への結合、またはＨＡタンパク質への直接的結合およびその通常の活性の阻害によってＨＡタンパク質の天然に存在する形態の１つまたは複数の活性を阻害することができる。
【０１３２】
別の実施形態では、ＨＡタンパク質のホモログを、ＨＡタンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）の組み合わせライブラリーのＨＡタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてのスクリーニングによって同定することができる。１つの実施形態では、ＨＡ変異型の雑色ライブラリーを、核酸レベルでの組み合わせ変異誘発によって作製し、これは、雑色遺伝子ラブラリーによってコードされる。ＨＡ変異型の雑色ライブラリーを、例えば、潜在的なＨＡ配列の縮重セットがそれぞれのポリペプチドとしてあるいはＨＡ配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイ）として発現可能なように、遺伝子配列への合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素ライゲーションによって産生させることができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＨＡホモログを産生するために使用することができる種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化ＤＮＡ合成機で行うことができ、その後合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションする。遺伝子の縮重セットの使用により、所望の潜在的なＨＡ配列のセットをコードする配列の全てを１つの混合物から獲得可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９、３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３、３２３、Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８、１０５６、Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１、４７７を参照のこと）。
【０１３３】
さらに、ＨＡタンパク質をコードするフラグメントのライブラリーを使用して、ＨＡタンパク質のホモログのスクリーニングおよびその後の分泌用のＨＡタンパク質の雑色集団を作製することができる。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーを、１分子あたり１回のみニックが起こる条件下でのヌクレアーゼでのＨＡコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントの処理、二本鎖ＤＮＡの変性、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させるためのＤＮＡの再生、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理による再形成二重らせんからの一本鎖部分の除去、および得られたフラグメントライブラリーの発現ベクターへのライゲーションによって作製することができる。この方法により、発現ライブラリーは、種々のサイズのＨＡタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、内部フラグメントをコードするベクターに由来し得る。
【０１３４】
点変異または短縮によって作製される組み合わせライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングおよび選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用のいくつかの技術は、当該分野で公知である。このような技術は、ＨＡホモログの組み合わせ変異誘発によって作製される遺伝子ライブリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。高処理分析に利用可能な巨大な遺伝子ライブラリーのスクリーニングに最も広く使用されている技術には、典型的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出により産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子の発現が含まれる。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリー中の帰納的変異体の頻度を向上させる技術）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＨＡホモログを同定することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ、１９９２、ＰＮＡＳ、８９、７８１１〜７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６（３）、３２７〜３３１）。
【０１３５】
別の実施形態では、細胞ベースのアッセイを利用した、当該分野で周知の方法の使用によって雑色ＨＡライブラリーを分析することができる。
【０１３６】
Ｄ．本発明の使用および用途
本明細書中に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、融合タンパク質、プライマー、ベクター、および宿主細胞を、以下の１つまたは複数の方法で使用することができる：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび関連生物の同定、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに関連する生物のゲノムマッピング、目的のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ配列の同定および局在化、進化研究、機能に必要なＨＡタンパク質領域の同定、ＨＡタンパク質活性の調整、１つまたは複数の無機化合物代謝の調整、１つまたは複数の芳香族または脂肪族化合物の改変または分解の調整、細胞壁の合成または再配列の調整、酵素活性またはタンパク質分解の調整、および所望の化合物（精製化学製品など）の細胞による生産の調整。
【０１３７】
本発明のＨＡ核酸分子は、種々の用途がある。第１に、これを使用して、コリネバクテリウムグルタミカムまたはその密接な関連生物である生物を同定することができる。また、これを使用して、微生物の混合集団中のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはその関連生物の存在を同定することができる。本発明により、この生物に固有のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子領域にまたがるプローブを使用したストリンジェントな条件下での微生物の固有または混合集団の培養物からの抽出ゲノムＤＮＡの探索によって、多数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子の核酸配列が得られ、この生物が存在するかどうかを確認することができる。コリネバクテリウムグルタミカム自体は非病原性であるにもかかわらず、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅなどの病原種に関連する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅはジフテリアの原因物質であり、局所および全身性病態を含む急速に発症する（急性の）熱性感染症である。この疾患では、上気道が局所的に損傷し、上皮細胞が壊死性損傷を受け、バチルスが身体の離れた感受性組織に汎発する毒素を分泌する。変性による変化は、これらの組織（心臓、筋肉、末梢神経、副腎、腎臓、肝臓、および脾臓を含む）におけるタンパク質合成の阻害によって引き起こされ、全身性疾患を引き起こす。ジフテリアは、世界の多くの地域（アフリカ、アジア、東欧、および旧ソ連の独立国を含む）で高い発生率が維持されている。後者の２つの地域でのジフテリアの持続的流行により、１９９０年以来少なくとも５，０００人が死亡している。
【０１３８】
１つの実施形態では、本発明は、被験体におけるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の同定法を提供する。この方法には、被験体における本発明の１つまたは複数の核酸またはアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列表の奇数または偶数の配列番号に記載の配列）の検出による被験体におけるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの存在または活性の検出が含まれる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは関連細菌であり、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中の多数の各鎖の予備タンパク質分子がＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの核酸およびタンパク質分子と相同であり、それにより被験体中のＣ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅの検出に使用することができる。
【０１３９】
本発明の核酸およびタンパク質分子はまた、ゲノムの特異的領域についてのマーカーとして利用することができる。これは、ゲノムのマッピングだけでなく、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質の機能研究に有用である。例えば、特定のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＤＮＡ結合タンパク質に結合するゲノム領域を同定するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムを消化し、フラグメントをＤＮＡ結合タンパク質とインキュベートすることができる。タンパク質に結合するフラグメントを、好ましくは容易に検出可能な標識とともに本発明の核酸分子を用いてさらに探索することができる。このような核酸分子のゲノムフラグメントへの結合により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムマップへのフラグメントの局在化が可能であり、異なる酵素で複数回行った場合は、タンパク質が結合する核酸配列の迅速な同定が容易になる。さらに、本発明の核酸分子は、関連種の配列に十分に相同であり得るので、これらの核酸分子は関連細菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍなど）のゲノムマップの構築用のマーカーとして利用することができる。
【０１４０】
本発明のＨＡ核酸分子はまた、進化およびタンパク質構造研究に有用である。本発明の分子が関連する恒常性の適応および維持に関連する過程を、広範な種々の種に利用される。本発明の核酸分子配列と他の生物由来の類似の酵素をコードする配列との比較により、生物の進化上の関連を評価することができる。同様に、このような比較により、配列領域の保存の有無、酵素機能に必須のタンパク質領域の同定を補助することができる評価を行うことが可能である。この同定の型はタンパク質操作研究に価値があり、タンパク質が機能を喪失することなく変異誘発に耐性を示すかどうかの指標を得ることができる。
【０１４１】
本発明のＨＡ核酸分子の操作により、野生型ＨＡタンパク質と異なる機能を有するＨＡタンパク質を産生可能である。これらのタンパク質を、効率または活性を改良するか、細胞中に通常よりも多数の細胞を存在させるか、効率または活性を減少させることができる。
【０１４２】
本発明は、ＨＡタンパク質自体またはＨＡタンパク質の基質もしくは結合パートナーとの相互作用または本発明のＨＡ核酸分子の転写または翻訳の調整のいずれかによる、ＨＡタンパク質活性を調整する分子のスクリーニング法を提供する。このような方法では、本発明の１つまたは複数のＨＡタンパク質を発現する微生物を、１つまたは複数の試験化合物と接触させ、ＨＡタンパク質の活性または発現レベルに対する各試験化合物の効果を評価する。
【０１４３】
細胞壁生合成または再配列に関連するＨＡタンパク質の活性および数の調整により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の精製化学製品の生産、生産量、および／または生産効率に影響を与えることができる。例えば、これらのタンパク質活性の変更により、細胞壁の構造または厚さを調整可能である。細胞壁は、浸透圧溶解および損傷の外部起源に対する保護デバイスとして高頻度で利用される。細胞壁の改変によって、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの大量発酵培養中のこの微生物が遭遇する機械的および剪断力に耐える能力の増大が可能である。さらに、各Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は厚い細胞壁で覆われているので、大量培養中に存在する生物量の大部分は細胞壁からなる。細胞壁合成速度の増加または細胞壁合成の活性化（本発明のＨＡ細胞壁タンパク質の遺伝子操作による）により、微生物の増殖速度を改良することが可能である。同様に、細胞壁分解に関連するタンパク質の活性または数の減少または細胞壁生合成の進行の減速により、全体的な細胞壁産生を増加させることができる。生きているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞数の増加（上記の任意のタンパク質の変更で達成可能なように）により、大量発酵槽培養における所望の精製化学製品を産生する細胞数を増加させ、それにより培養由来のこれらの化合物の生産量または生産効率が増加するはずである。
【０１４４】
芳香族または脂肪族化合物の改変または分解に関連するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＨＡタンパク質の活性または数の調整はまた、この細胞由来の１つまたは複数の精製化学製品の産生に直接的または間接的に影響を与え得る。一定の芳香族または脂肪族の改変または分解生成物は、望ましい精製化学製品である（例えば、有機酸または改変芳香族および脂肪族化合物）。したがって、これらの改変（例えば、水酸化、メチル化、または異性化）または分解反応を行う酵素の改変により、これらの所望の化合物の生産量の増加が可能である。同様に、上記の反応による改変または分解生成物をさらに分解する経路に関連するタンパク質の活性または数の減少により、培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来のこれらの精製化学製品の生産量を改良可能である。
【０１４５】
これらの芳香族および脂肪族の改変および分解酵素はそれ自体が精製化学製品である。精製形態では、これらの酵素を使用して、汚染部位のバイオレメディエーション用、廃棄物の分解操作用、または所望の改変芳香族または脂肪族化合物またはその分解生成物（そのうちのいくつかを培養による他の精製化学製品生産化合物の炭素源またはエネルギー源として都合よく使用することができる）の大量生産および経済的に可能な生産用の芳香族および脂肪族化合物（例えば、石油製品などの毒性化学物質）を分解することができる（例えば、Ｆａｂｅｒ，Ｋ．、１９９５、「有機化学における生体内変換」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎおよびその参考文献、ならびにＲｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編、１９９２〜１９９６、「予備的生体内変換」、Ｗｉｌｅｙ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒおよびその参考文献を参照のこと）。他の細胞機構による調節を減少させるか排除するようなこれらのタンパク質の遺伝的変更により、これらのタンパク質の全体的な数または活性を増加させ、それによりこれらの精製化学製品の生産量だけでなくこれらの回収されたタンパク質の活性も改良可能である。
【０１４６】
これらの芳香族および脂肪族化合物の改変および分解酵素の改変はまた、１つまたは複数の精製化学製品の生産に間接的に影響を与え得る。多数の芳香族および脂肪族化合物（培養培地中で遭遇し得る化合物または細胞代謝由来の廃棄物など）は細胞に有毒であり、これらを容易に除去または破壊することができるようなこれらの化合物の改変および／または分解により、細胞の生存度は増加するはずである。さらに、これらの酵素は、得られた産物が細胞の通常の炭素代謝経路に入り、それにより細胞はこれらの化合物を代替炭素源またはエネルギー源として使用することができる様式でこれらの化合物を改変または分解することができる。大量培養の状況では、最適な炭素源の量は制限され得るので、これらの酵素により、栄養源として芳香族または脂肪族化合物を使用して細胞が増殖または分裂し続けることができる方法が得られる。いずれかの場合、所望の精製化学製品生産培養におけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞数の増加により精製化学物質の生産量または生産効率が増加する。
【０１４７】
無機化合物代謝に関連するＨＡタンパク質の活性または数の改変はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌の培養由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産に直接的または間接的に影響を与え得る。例えば、多数の望ましい精製化学製品（核酸、アミノ酸、補因子、およびビタミン（例えば、チアミン、ビオチン、およびリポ酸）など）を、無機分子（リン、硝酸塩、硫酸塩、および鉄）なしでは合成できない。本発明の無機代謝タンパク質により細胞は種々の無機化合物からこれらの分子を獲得し、種々の精製化学製品生合成経路に送達させることが可能である。したがって、これらの無機化合物代謝に関連する酵素の活性または数の増加により、おそらく制限される無機分子の供給を増加させることが可能であり、それによりこのような変更タンパク質を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の種々の生成化学物質の生産または生産効率を直接的に増大可能である。本発明の無機代謝酵素の活性または数の改変によってもＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが制限された無機化合物の供給をより良好に利用するか最適でない無機化合物をアミノ酸、ビタミン、補因子、または核酸（これらは全て細胞の増殖の継続および複製に必要である）の合成に利用可能である。大量培養におけるこれらの細胞の生存度の改良により、培養における１つまたは複数の精製化学製品産生Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞の数を増加させることができ、それにより１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産効率を増加させることができる。
【０１４８】
一般的な過程のためのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ酵素は、それ自体が望ましい精製化学製品である。酵素の特異的特性（例えば、位置特異性および立体特異性など）により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学反応用の有用な触媒となる。全Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞を、細胞中で所望の生成物が酵素によって産生されるように適切な基質とインキュベートすることができるか、所望の酵素をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ培養物（または関連細菌）から過剰産生および精製して産業上の設定条件（溶液中または適切な固定相上への固定）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ反応に利用することができる。いずれかの状況で、酵素は天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質であり得るか、活性を変更させるように変異誘発することができる。このような酵素の典型的な産業上の用途には、化学工業（例えば、合成有機化学）における触媒として、食品添加物として、飼料成分として、果物処理用、皮革調製用、洗剤、分析および薬物、および繊維工業（例えば、Ｙａｍａｄａ，Ｈ．、１９９３、「有用な有機化合物生産のための微生物反応」、Ｃｈｉｍｉｃａ、４７、５〜１０、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．、「調製用生体内変換：合成化学における酵素および完全細胞の使用」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．、１、１５７〜１６９、Ｚａｋｓ，Ａ．ａｎｄ Ｄｏｄｄｓ，Ｄ．Ｒ．、１９９７、「医薬品合成への生体触媒反応生体内変換の適用」、ＤＤＴ ２、５１３〜５３１、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｎ．Ｍ．、１９９７「光学活性形態の生物活性天然生成物およびアナログの調整用の控訴の使用」、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇａｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１、１〜２０、Ｆａｂｅｒ，Ｋ．、１９９５、「有機化学における生体内変換」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｂｅｒｌｉｎ、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編、１９９２〜９６、「調製用生体内変換」、Ｗｉｌｅｙ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｃｈｅｅｔｈａｍ，Ｐ．Ｓ．Ｊ．、１９９５、「産業への酵素の適用」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗｉｓｅｍａｎ，Ａ．編、Ｅｌｉｓ：Ｈｏｒｗｏｏｄ、４１９〜５５２、およびＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８７、第Ａ９巻、「酵素」、３９０〜４５７を参照のこと）が含まれる。したがって、これらの酵素の活性または数の増加により、細胞の供給物質の所望の生成物への変換または大量培養による生産量増加のためのこれらの酵素の過剰産生も可能である。さらに、これらのタンパク質の変異誘発により、細胞がより多数のこれらの酵素を産生および活性化し、それにより大量培養による精製化学物質の生産量、生産、生産効率を増加可能であるように、フィードバック阻害または他の抑制的細胞調節を取り除くことが可能である。さらに、これらの酵素の操作により、１つまたは複数のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ代謝経路（１つまたは複数の精製化学製品の生合成または分泌経路など）の活性を変化させることができる。
【０１４９】
活性または数が変化するような本発明のタンパク質分解酵素変異誘発はまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の１つまたは複数の精製化学製品の生産量、生産、および／または生産効率に直接的または間接的に影響を与え得る。例えば、これらのタンパク質の活性または数の増加により、大量培養における細菌の生存能力を増大可能であり、これは、発酵槽培養中に遭遇する高温、非至適ｐＨ、および他のストレスによる誤折りたたみタンパク質の細胞の迅速な分解能力の増加による。これらの培養における細胞数の増加により、培養における比較的多数の化合物産生細胞数のために、１つまたは複数の精製化学製品の生産量または生産効率を増加させることができる。また、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞は、外来栄養素を細胞によって炭素／エネルギー源または他の種の栄養素としてより容易に取り込むことができる分子に分解するために利用される多細胞表面プロテアーゼを有する。これらの酵素の活性または数の増加により、この代謝回転を改良し、利用可能な栄養素レベルを増加させ、細胞増殖または産生を改良することができる。したがって、本発明のプロテアーゼの改変より、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ精製化学物質生産に間接的に影響を与えることができる。
【０１５０】
これらのプロテアーゼが所望の精製化学製品の生産または分解に関与する場合、本発明の１つまたは複数の精製化学製品の改変に対する精製化学製品生産にさらに影響を与えることができる。精製化学製品または精製化学製品合成に関連するタンパク質を分解するプロテアーゼ活性の増加により、精製化学製品のレベルを増加可能である（化合物の分解の現象または合成の増加による）。同様に、精製化学製品または精製化学製品の分解に関連するタンパク質が得られる化合物を分解するプロテアーゼの活性の増加により、類似の結果が得られるはずである（これらの操作タンパク質を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ細胞由来の所望の精製化学製品レベルの増加）。
【０１５１】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の精製化学製品の生産量を増加させるＨＡタンパク質の上記の変異誘発ストラテジーは、制限を意味しない。これらのストラテジーの変形形態は、当業者に容易に認識される。このようなストラテジーの使および本明細書中に開示の機構の組み込みによって、本発明の核酸およびタンパク質分子を利用して、変異ＨＡ核酸およびタンパク質分子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは関連細菌を作製して所望の化合物の生産量、生産、および／または生産効率を改良することができる。この所望の化合物は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによって産生された任意の生成物であり得るが、これには、生合成経路の最終生成物および天然に存在する代謝経路の中間物、ならびにＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの代謝において天然では得られないが本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株によって産生される分子が含まれる。
【０１５２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、限定と解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての引例、特許出願書類、特許、公開された特許出願書類、表、および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
【表３】
【０１５６】
【表４】
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
【表６】
【０１５９】
【表７】
【０１６０】
【表８】
【０１６１】
【表９】
【０１６２】
【表１０】
【０１６３】
【表１１】
【０１６４】
【表１２】
【０１６５】
【表１３】
【０１６６】
【表１４】
【０１６７】
【表１５】
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
【表１７】
【０１７０】
【表１８】
【０１７１】
【表１９】
【０１７２】
【表２０】
【０１７３】
【表２１】
【０１７４】
【表２２】
【０１７５】
【表２３】
【０１７６】
【表２４】
【０１７７】
【表２５】
【０１７８】
【表２６】
【０１７９】
【表２７】
【０１８０】
【表２８】
【０１８１】
【表２９】
【０１８２】
【表３０】
【０１８３】
【表３１】
【０１８４】
【表３２】
【０１８５】
【表３３】
【０１８６】
【表３４】
【０１８７】
【表３５】
【０１８８】
【表３６】
【０１８９】
【表３７】
【０１９０】
【表３８】
【０１９１】
【表３９】
【０１９２】
【表４０】
【０１９３】
【表４１】
【０１９４】
【表４２】
【０１９５】
【表４３】
【実施例】
【０１９６】
実施例１：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC13032の全ゲノムＤＮＡの製造
コリネバクテリウムグルタミカム (ATCC13032）の培養は、激しく攪拌したＢＨＩ媒体（Ｄｉｆｃｏ）中で、３０℃で終夜行なわれた。細胞は遠心分離により回収され、上澄みを処分し、細胞は、５ｍｌの緩衝液Ｉ（最初の培養容積の５％、すべての示された容積は、１００ｍｌの培養容積のために計算されたものである。）中再懸濁された。緩衝液Ｉの組成は、１４０．３４ｇ／ｌのショ糖、２．４６ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、１０ｍｌ／ｌのＫＨ2ＰＯ4溶液（１００ｇ／ｌ、ＫＯＨでｐＨ６．７に調整）、５０ｍｌ／ｌのＭ１２濃縮物（１０ｇ／ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇ／ｌのＮａＣｌ、２ｇ／ｌのＭｇＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、０.２ｇ／ｌのＣａＣｌ2、０．５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、１０ｍｌ／ｌのトレース−エレメンツ−ミックス（２００ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ4ｘＨ2Ｏ、１０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ4ｘ７Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ2ｘ４Ｈ2Ｏ、３０ｍｇ／ｌのＨ3ＢＯ3、２０ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、１ｍｇ／ｌのＮｉＣｌ2ｘ６Ｈ2Ｏ、３ｍｇ／ｌのＮａ2ＭｏＯ4ｘ２Ｈ2Ｏ、５００ｍｇ／ｌの錯化剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸）、１００ｍｌ／ｌのビタミン−ミックス（０．２ｍｇ／ｌのビオチン、０．２ｍｇ／ｌの葉酸、２０ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸、２０ｍｇ／ｌのリボフラビン、４０ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシウム、１４０ｍｇ／ｌのニコチン酸、４０ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキソール、２００ｍｇ／ｌのミオ−イノシトール）である。リゾチームを最終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌになるまで懸濁液に加えた。約４時間、３７℃での培養の後、細胞壁を劣化させ得られたプロトプラストを遠心分離によって回収した。ペレットを５ｍｌの緩衝液Ｉで一度、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で一度洗浄した。ペレットを４ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、０．５ｍｌのＳＤＳ溶液（１０％）と０．５ｍｌのＮａＣｌ溶液（５Ｍ）を加えた。プロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるまで加えた後、懸濁液を約１８時間、３７℃で培養した。ＤＮＡを標準的な操作で、フェノール、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールおよびクロロホルム−イソアミルアルコールによる抽出により精製した。それから、ＤＮＡを１／５０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積のエタノールを加えて析出させ、次いで３０分間、−２０℃でインキュベートし、ＳＳ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）を使用した高速遠心分離機で１２０００ｒｐｍで遠心分離を３０分間行なった。ＤＮＡを２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、４℃で、少なくとも３時間１０００ｍｌのＴＥ緩衝液に対して透析した。この間、緩衝液を３度交換した。透析したＤＮＡ溶液の０．４ｍｌの部分に、０．４ｍｌの２ＭＬｉＣｌと０．８ｍｌのエタノールを加えた。３０分間、−２０℃でインキュベートした後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ、Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｆｒｅｓｃｏ，Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＤＮＡを集めた。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液に溶解した。この操作により製造されたＤＮＡは、すべての目的、サザンブロット法またはゲノムライブラリーの構築に使用することができた。
【０１９７】
実施例２：コリネバクテリウムグルタミカム ATCC13032のEscherichia Coliにおけるゲノムライブラリーの構築
実施例１に記載したように製造されたＤＮＡを用いて、コスミッドおよびプラスミドライブラリーが、公知で、よく確立された方法に従って構築された(例えば、Sambrook,Jら、(1989)'Molecular Cloning:A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.Mら(1994) 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons.を参照）。
【０１９８】
どんなプラスミドまたはコスミッドでも使用することができた。特別に、プラスミドpBR322（Sutcliffe, J.G.(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3737-3741);pACYC177 (Change とCohen(1978) J.Bacteriol 134:1141-1156),pBSの系列のプラスミド(pBSSK+,pBSSK-およびその他；Stratagene LaJolla,USA),またはSuperCos1（Stratagene LaJolla,USA)、Lorist6(Gibson,T.J.,Rosenthal A.およびWaterson,R.H.(1987) Gene 53:283-286)のコスミッドが使用された。特にC.glutamicumにおいて使用するためのジーンライブラリーは、プラスミドpSL109( Lee,H.S.およびA.J.Sinskey(1994) J.Microbiol.Biotechnol.4:256-263)を用いて構築することができる。
【０１９９】
実施例３：ＤＮＡシーケンスとコンピューターによる機能解析
実施例２に記載されたゲノムライブラリーを標準的な方法、特にＡＢＩ３７７シーケンスマシーンを用いた鎖成長停止反応法（例えばFleischman,R.D.ら(1995)'Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.',Science, 269:496-512参照）に従ったＤＮＡシーケンスに使用した。以下のヌクレオチド配列のシーケンスプライマーが使用された：5'-GGAAACAGTATGACCATG-3'（SEQ ID NO:441）または5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'（SEQ ID NO:442）。
【０２００】
実施例４：生体内突然変異誘発
コリネバクテリウムグルタミカムの生体内突然変異誘発が、E.coliまたは他の微生物(例えばBacillus spp.またはSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母）であってその遺伝子情報の完全性を保つための能力が減じられているものを通して、プラスミド（または他のベクター）の通過により行なうことができる。典型的なミューテーター株は、ＤＮＡ修復システム（例えばmutHLS,mutD,mutTその他；Rupp,W.D.(1996) DNA repair mechanisms,Escherichiacoli and Salmonella、p2277-2294、ASM:Washington参照）の遺伝子に変異を持っている。このような株は当業者によく知られている。このような株の使用は、例えばGreener,A.およびCallahan,M.(1994) Strategies 7:32-34に記載されている。
【０２０１】
実施例５：Escherichia coli および コリネバクテリウムグルタミカムの間のＤＮＡ転換
いくつかのCorynebacteriumとBrevibacterium種は自律的に複製する(例えば、Martin, J.F.ら(1987) Biotechnology, 5:137-146参照）内因性プラスミド（例えばpHM1519またはpBL1)を含む。Escherichia coliとCorynebacuterium glutamicumのシャトルベクターは、E.coliの標準ベクター（Sambrook,J.et al.(1989),'Molecular Cloning:A Laboratory Manual',Cold Spring Harbor Laboratory PressまたはAusubel,F.M.et al.(1994)'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons)を用いて、これに、開始または複製のおよび適当なコリネバクテリウムグルタミカム由来のマーカーを加えることで容易に構築することができる。このような複製の開始点は、好ましくはCorynebacteriumとBrevibacterium種から単離された内因性プラスミドからもたらされる。これらの種の形質転換マーカーとして、カナマイシン耐性の遺伝子（Ｔｎ５またはＴｎ９０３トランスポゾンから誘導されたもの）またはクロラムフェニコール耐性遺伝子（Winnacker,E.L.(1987)'From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology,VCH,Weinheim)が特に用いられる。E.coli とC.glutamicumの双方でおいて複製するシャトルベクターの広範囲の構築の文献は数多く例があり、遺伝子過剰発現を含むいくつかの目的に使用することができる（例えば、Yoshihama,M.et al.(1985) J.Bacteriol. 162:591-597, Martin,J.F.et al.(1987) Biotechnology,5:137-146 およびEikmanns,B.J.et al.(1991) Gene, 102:93-98参照）。
【０２０２】
標準的な方法を用いて、上述のように注目の遺伝子をシャトルベクターの一つヘクローンすることが可能であり、またこのようなハイブリッドベクターをコリネバクテリウムグルタミカム株に導入することが可能である。C.glutamicumの形質転換を、プロトプラスト形質転換（Kastsumata,R.et al.(1984) J.Bacteriol. 159306-311),エレクトロポレーション（Liebl,E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters,53:399-303)そして特別のベクターが用いられた場合には、接合（例えば Schaefer,A et al.(1990)J.Bacteriol.172:1663-1666に記載）によって達成することができる。C.glutamicumからのプラスミドＤＮＡの製造（周知の標準的な方法を用いて）およびそのE.Coliへの形質転換によるC.glutamicumからE.coliへのシャトルベクターの転換も可能である。この形質転換の段階は、標準的な方法を用いて行なうことができるが、Ｍｃｒ−不足E.coli株、例えばＮＭ５２２(Gough and Murray(1983)J.Mol.Biol.166:1-19)を使用することが有利である。
【０２０３】
遺伝子は、ｐＣＧ１（U.S.patent No.4617267)またはその断片、任意でＴＮ９０３（Grindley,N.D.and Joyce,C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12):7176-7180)からのカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを用いたC.glutamicum 株中に過剰発現させることができる。加えて、遺伝子は、プラスミドｐＳＬ１０９（Lee,H.S and A.J.Sinskey(1994) J.Microbiol Biotechnol.4:256-263)を用いてC.Glutamicum株中に過剰発現することができる。
【０２０４】
複製プラスミドに加えて、遺伝子の過剰発現は、ゲノムへの組み込みによって達成することができる。C.glutamicum または他のCorynebacteriumまたはbrevibacterium種における遺伝子組み込みは、周知の方法、例えばゲノム領域での相同性組換え、制限エンドヌクレアーゼ仲介の組み込み（ＲＥＭＩ）（例えばDE patent 19823834)またはトランスポゾンの使用などによって達成することができる。調節領域（例えば、プロモーター、レプレッサー、および／またはエンハンサー）を配列の修飾、挿入、サイト−ダイレクテド法（例えば相同性組換え）による削除、またはランダムイベントに基づく方法（例えばトランスポゾン突然変異誘発またはＲＥＭＩ）により変形することにより、注目遺伝子の活性を変化させることもできる。転写ターミネーターとして機能する核酸配列は、本発明の一以上の遺伝子のコード領域へ３’挿入されることもできる。このようなターミネーターは、周知であり、例えばWinnacker, E.L. (1987)From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim中に記載されている。
【０２０５】
実施例６：変異タンパクの発現の評価
形質転換された宿主細胞中の変異タンパクの活性の観察は、変異タンパクが、野生種のタンパクと類似した形態と類似した量で発現されるという事実に基づいている。変異遺伝子（遺伝子産物に対する転写に用いられるｍＲＮＡの量のインジケーター）の転写のレベルを確認するために有用な方法は、ノーザン・ブロット法（Ausubel et al.(1988) Current Protocols in Molecular Bioloｇy, Wiley: New York参照)であり、注目遺伝子に結合するように設計されたプライマーが、検出タグ（通常放射性または化学ルミネセンス）により、生物の培養の総ＲＮＡを抽出し、ゲルに流し、安定マトリックスに移動させ、このプローブでインキュベートする場合に、プローブの結合および結合の量が、この遺伝子のｍＲＮＡの存在と量を示すようにラベルされている。この情報は、変異遺伝子の転写の程度の証拠である。全部の細胞のＲＮＡは、いくつかの周知の方法、例えば、 Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326に記載された方法により、コリネバクテリウムグルタミカムから製造することができる。
【０２０６】
このｍＲＮＡから翻訳されたタンパクの存在と比較量の評価のために、ウェスタン・ブロッド法などの標準的な技術が使用され得る(例えばAusubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York参照)。この方法では、全部の細胞のタンパクは、抽出され、ゲル電気泳動により分離され、ニトロセルロースのようなマトリックスに移され、設計されたタンパクに特異的に結合する抗体などのプローブとともにインキュベートされる。このプローブは、一般に容易に検出可能な化学ルミネセンスまたは比色のラベルでタグがつけられている。観察されたラベルの存在と量は、細胞中の所望の変異タンパクの存在と量を示す。
【０２０７】
実施例７：遺伝子的に修飾されたCorynebacteriaの成長−媒体および培養条件
遺伝子的に修飾されたコリネバクテリウムグルタミカムは、合成または天然成長媒体中で培養される。Corynebacteriaの異なった成長媒体の多くはどちらも知られており、容易に入手可能である(Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992)'The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Spring-Verlag)。これらの媒体は、一種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび痕跡の要素からなる。好ましい炭素源は、モノ−、ジ−またはポリサッカライドなどの砂糖である。例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースが非常によい炭素源として働く。糖蜜または他の砂糖精製の副生成物のような複合化合物によって媒体に砂糖を供給することも可能である。異なった炭素源の混合物を供給することも有利である。他の可能な炭素源は、メタノール、エタノール、酢酸、乳酸などのアルコールおよび有機酸である。窒素源は通常有機または無機の窒素化合物か、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源として例えば、アンモニアガス、アンモニウム塩（例えばＮＨ4Ｃｌまたは（ＮＨ4）2ＳＯ4）、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、酵母抽出物、肉抽出物などの複合窒素源が含まれる。
【０２０８】
媒体に含まれる無機塩化合物は、クロリド−、リン酸、硫酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、コバルト塩、モリブデン塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、銅塩、鉄塩を含む。金属イオンを溶液中に保持するために
媒体中にキレート化合物を加えることができる。特に有用なキレート化合物は、カテコールやプロトカテチュエートなどのジヒドロキシフェノールまたはクエン酸などの有機酸を含む。ビタミンなどの成長因子または成長促進剤、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩、ピリドキシンなどを含む媒体が典型的である。成長因子および塩はしばしば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合媒体成分に由来する。正確な媒体化合物の組成は、直接の実験に強く依存し、各々の特定の場合に個々に決定される。媒体の最適化の情報は、テキストブックApplied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 019 963577 3) から入手可能である。成長媒体を市販品、例えば標準1(Merck)またはBHI(grain heart infusion, DIFCO)などから選定することも可能である。
【０２０９】
すべての媒体成分は、熱（１．５×１０5Ｐａ、１２１℃で２０分間）またはろ過殺菌法のいずれかにより殺菌される。成分は、一緒に、または所望により分割して殺菌することができる。すべての媒体成分は、成長の初期に存在させるか、または任意に連続的にまたは回分式に加えることができる。
【０２１０】
培養条件は各々の実験のために分けて定義される。温度は、１５℃から４５℃の範囲であるべきである。温度を一定に保つか、実験中に変えることができる。媒体のｐＨは、５から８．５、好ましくは７．０前後の範囲であるべきであり、媒体に緩衝液を添加することで一定に保つことができる。この目的のための緩衝液の例は、リン酸カリウム緩衝液である。MOPS, HEPES, ACESその他の合成緩衝液を代わりに、または同時に使用することができる。成長の間にＮａＯＨまたはＮＨ4ＯＨを添加することより一定の培養ｐＨを保つことも可能である。酵母抽出物などの複合媒体成分が使用される場合、多くの複合成分は高い緩衝能力があるという事実によって、追加の緩衝液が必要ないかもしれない。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨはアンモニアガスにより制御することもできる。
【０２１１】
インキュベート時間は通常数時間から数日の範囲である。この時間は、ブロスの中に蓄積される生成物を最大にするように選択される。開示された成長実験は、種々の容器、例えばミクロタイター板、ガラス管、ガラスフラスコ、または種々のサイズのガラスまたは金属発酵槽等の中で行なうことができる。多数のクローンのスクリーニングのために、微生物をミクロタイター板、ガラス管、振とうフラスコ中、バッフル付きで、またはなしで培養すべきである。好ましくは１００ｍｌの振とうフラスコを使用し、所望の成長媒体の１０容積％で満たす。フラスコを１００から３００ｒｐｍの速さの範囲を使用して、ロータリーシェーカー（ふり幅２５ｍｍ）で振とうすべきである。蒸発ロスは湿潤雰囲気中に保つことによって少なくすることができる。代わりに、蒸発ロスの数学的補正が行なわれるべきである。
【０２１２】
遺伝子的に修飾されたクローンを試験した場合、修飾されていないコントロールのクローンまたはいかなる挿入もなされていない基本的なプラスミドを含むコントロールのクローンも試験するべきである。媒体を寒天平板上、例えばＣＭプレート（10g/lのグルコース、2.5g/lのNaCl、2g/lの尿素、10g/lのポリペプトン、5g/lの酵母抽出物、5g/lの肉抽出物、22g/lの寒天、2M NaOHによるｐＨ６．８としたもの）を３０℃でインキュベートしたもので成長させた細胞を用いて０．５−１．５のＯＤ600まで接種する。媒体の接種は、ＣＭプレートからのC.glutamicum細胞のサリーン懸濁液の導入、またはこのバクテリアの前培養液の添加のいずれかによりなされる。
【０２１３】
実施例８：変異タンパクの機能のインビトロ解析
酵素の活性と速度論的パラメーターの決定は、先行技術でよく確立されている。得られた改変された酵素の活性決定のための実験は、当業者の能力の範囲内で、野生種酵素の比活性に対して行なわれなければならない。一般に酵素についての概要は、構造、速度論的、原理、方法、適用および多数の酵素の活性の決定例に関する特定の詳細と同様に、例えば以下の参照に見出される：Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press:Oxford; Boyer, P.D., ed(1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetic, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325), Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, 'Enzymes'. VCH: Weinheim, p. 352-363.。
【０２１４】
ＤＮＡと結合するタンパクの活性は、数種のよく確立された方法、例えばＤＮＡバンド−シフトアッセイ（ゲル遅延アッセイとも呼ばれる）により測定することができる。他の分子の発現におけるこのようなタンパクの効果は、レポーター遺伝子アッセイ（例えばKolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904および引用文献に記載されたような） を用いて測定される。レポーター遺伝子試験系は、周知であり、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑蛍光性タンパクおよびその他数種の酵素を用いて、原核および真核細胞のどちらにでも適用が確立されている。
【０２１５】
膜輸送タンパクの活性の決定は、例えばGennis, R.B. (1989) 'Pores, Channels and Transporters', in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer; Heidelberg, p. 85-137; 199-234; and 270-322に記載されたような技術に従って行なわれる。
【０２１６】
実施例９：所望の製造物の製造における変異タンパクの感化の解析
所望の化合物（例えばアミノ酸）の製造におけるC.Glutamicumの遺伝子修飾の効果は、適当な条件（例えば上述の）下の改変された微生物成長および媒体及び／または細胞成分の増加した所望の製造物（即ちアミノ酸）の生成の解析によって評価することができる。このような解析法は当業者に周知であり分光法、薄層クロマトグラフィー、種々の染色法、酵素的および微生物学的方法、高速液体クロマトグラフィーのような解析クロマトグラフィー（例えばUllman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 and p. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. et al., (1987) 'Applications of HPLC in Biochemistry 'in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: 'Product recovery and purification', page 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D.(1988) Biochemical separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, page 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications参照)を含む。
【０２１７】
最終発酵生成物の測定に加えて、所望の化合物の生産に使用された代謝経路の他の成分、例えば中間体、副生成物を、化合物の製造の全体の効率を決定するために解析することもできる。解析法は、媒体中の栄養剤（例えば砂糖、炭化水素、窒素源、ホスファートおよび他のイオン）のレベルの測定、バイオマス組成物と成長の測定、通常の生合成経路の代謝物の製造の解析、発酵の間に生成したガスの測定を含む。これらの測定のための標準的な方法は、Applied Micro Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, p. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN: 0199635773) および引用文献に概説してある。
【０２１８】
実施例１０：C.glutamicum培養からの所望の製造物の精製
C.glutamicum細胞からまたは上述の培養物の上澄みからの所望の製造物の回収は、周知の種々の方法により行なうことができる。所望の製造物が細胞から隠されていない場合、細胞を培養物から低速遠心分離により回収することができ、細胞を機械的力または超音波のような標準的な方法で溶解することができる。細胞の破片を遠心分離で取り除き、可溶性タンパクを含む上澄み画分を所望の化合物のさらなる精製のために保持する。製造物がC.glutamicum細胞から隠されている場合、細胞を培養物から低速遠心分離により取り除き、上澄み画分をさらなる精製のために保持する。
【０２１９】
双方の精製法からの上澄み画分を、適当なレジンであって、所望の分子がクロマトグラフィーレジンに保持され、サンプル中の多くの不純物が保持されないか、または不純物がレジンにより保持され、サンプルが保持されないようなレジンを用いたクロマトグラフィーで処理する。このようなクロマトグラフィーの工程は、必要に応じて、同じまたは異なるクロマトグラフィーレジンを用いて繰り返すことができる。当業者は、適当なクロマトグラフィーレジンの選択と、精製される特別の分子への最も効率的な適用に精通しているであろう。精製された製造物はろ過または限外ろ過により濃縮し、製造物の安定性が最も大きくなる温度で保存することができる。
【０２２０】
広い範囲の精製法が周知であり、前述した精製法は範囲の減縮を意味しない。このような精製法が、例えば Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)に記載されている。
【０２２１】
単離した化合物の同定と純度が、先行技術で標準的な方法で評価される。これらは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、分光学的方法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素的または微生物学的アッセイを含む。このような解析方法は、Petek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al.(1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1988) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p.540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17に記載されている。
【０２２２】
実施例１１：本発明の遺伝子配列の解析
配列の比較と、２個の配列の間の相同性の百分率の決定は、公知の技術であり、数学的アルゴリズム、例えばKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264-68のアルゴリズムで、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77に記載のように変形されたものなどを使用して行なうことができる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２によって、本発明のＨＡ核酸分子に対するヌクレオチド配列の相同性を得るために行なうことができる。ＢＬＡＳＴタンパク探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３によって、本発明のＨＡタンパク分子に対するアミノ酸配列の相同性を得るために行なうことができる。比較の目的で、間隙のあけられたアライメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムの使用に際して、当業者はプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のパラメーターの、解析される特定の配列のための最適化の方法についてよく知っている。
【０２２３】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの他の例は、Meyers とMiller （(1988) Comput. Appln. Biosci. 4: 11-17）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧシーケンスアライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられている。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較のために使用する場合、ＰＡＭ１２０重量残渣表、１２のギャップ長さペナルティー、４のギャップペナルティーを使用することができる。さらに配列解析に使用されるアルゴリズムが公知であり、ＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ（Torelli and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載）および FASTA（ Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8に記載）を含む。
【０２２４】
２本のアミノ酸配列の間の相同性の百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（http: //www.gcg.comで入手可能）を用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１２、１０、８、６、または４の間隙重さ、２、３または４の長さ重さを用いて行なうことができる。２本の核酸配列の間の相同性の百分率は、標準的なパラメーター、例えば間隙重さが５０、および長さ重さが３などを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【０２２５】
本発明の遺伝子配列と、遺伝子バンクに存在する配列の比較解析が先行技術において公知の技術を用いて行なわれた（例えばBexevanis and Ouellette, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York参照)。本発明の遺伝子配列が、遺伝子バンクに存在する遺伝子と、３段階の工程で比較された。第一段階で、遺伝子バンクに存在するヌクレオチド配列に対する本発明の配列の各々について、ＢＬＡＳＴＮ解析（例えばローカルアライメント解析）が行なわれた。最初にヒットした５００個についてさらに解析が続けられた。次いでＦＡＳＴＡ探索（例えば、結合されたローカルおよびグローバルアライメント解析で、配列の限定された領域を整列させる）が、これらの５００個について行われた。各々の本発明の遺伝子配列は次いで全体的に、ＦＡＳＴＡの頭の３個のヒットの各々について、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて（標準的なパラメーターを使用して）整列させられる。正しい結果を得るために、遺伝子バンクから抽出された配列の長さは、周知の方法により質問の配列の長さに調整された。この解析の結果は、表４にまとめられている。得られた結果は、遺伝子バンクの参照の各々と比較した本発明の遺伝子の各々においてＧＡＰ（グローバル）解析を単独で行なったときに得られるであろう結果と一致したが、このようなデータベースを広げて行なったＧＡＰ（グローバル）解析と比較して明らかに計算時間が短縮された。切り捨て値を上回るアライメントが得られなかった本発明の配列を、アライメントの情報なく表４に示した。表４に、’％相同性（ＧＡＰ）’の見出しで記載されたＧＡＰアライメント相同性百分率は、’，’は小数点を表すヨーロッパの数の形式で、並べられているということは、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、このカラム中の’４０，３４５’の値は、４０．３４５％を表す。
【０２２６】
実施例１２：ＤＮＡマイクロアレイの構築と操作
本発明の配列を追加で、ＤＮＡマイクロアレイ（デザイン、方法論、ＤＮＡアレイの使用は周知であり、例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470; Wodicka, L. et al. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaizieu, A. et al. (1998) Nature Biotechnology 16: 45-48; and DeRisi, J.L. et al. (1997) Science 278: 680-686に記載されている。)の構築と適用に使用することができる。
【０２２７】
ＤＮＡマイクロアレイは、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリコーンまたは他の材料からなる固体または柔軟性のある支持体である。核酸分子を、注文された方法で表面に取り付けることができる。適当なラベリングのあと、他の核酸または核酸混合物を固定された核酸分子にハイブリダイズすることができ、限定された領域でハイブリダイズされた分子の個々の信号強度を検知し、測定するためにラベルを使用することができる。この方法論は、適用された核酸サンプルまたは混合物中のすべてあるいは選択された核酸の相対量または絶対量を同時に定量化することを可能にする。このためＤＮＡマイクロアレイは、並行して多数の（６８００以上）核酸の発現を解析することを可能とする（Schena, M. (1996) BioEssays 18(5): 427-431参照）。
【０２２８】
本発明の配列は、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅反応によって、１種以上のC.glutamicum遺伝子の限定された領域を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライマーの設計に使用することができる。５’または３’オリゴヌクレオチドプライマーあるいは適当なリンカーの選択と設計は、上述の支持媒体（例えばSchena, M. et al. (1995) Science 270: 467-470にも記載されている。）の表面に対する、得られたＰＣＲ産物の共有結合を可能とする。
【０２２９】
核酸マイクロアレイは、Wodicka,L.et al.(1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367に記載されたようにその場のオリゴヌクレオチド合成によっても構築することができる。写真平板法により、マトリックスの正確に限定された領域が露光される。光不安定な保護基はこれによって活性化され、ヌクレオチド付加が進行し、一方光からマスクされた領域はいかなる修飾も進行しない。続く保護と光活性化のサイクルは、限定された位置における異なったオリゴヌクレオチドの合成を可能とする。小さい、限定された本発明の遺伝子の領域は、マイクロアレイ上で、固相オリゴヌクレオチド合成により合成することができる。
【０２３０】
ヌクレオチドのサンプルまたは混合物の中に存在する本発明の核酸分子は、マイクロアレイに対してハイブリダイズすることができる。これらの核酸分子は標準的な方法でラベルすることができる。要するに、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）は、例えば、逆転写またはＤＮＡ合成の間、放射性同位元素によりまたは蛍光によりラベルされたヌクレオチドの組み込みによりラベルされる。ラベルされた核酸のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションは、例えば Schena, M. et al. (1995) supra; Wodicka, L. et al. (1997), supra; and DeSaizieu A. et al (1998), supraに記載されている。ハイブリダイズされた分子の検出と定量化は、特定の組み込まれたラベルにより行なわれる。放射性のラベルは例えばSchena, M. et al. (1995) supraに記載されたように検出することができ、蛍光ラベルは例えばShalon et al. (1996) Genome Research 6: 639-645の方法により検出することができる。
【０２３１】
本発明の配列のＤＮＡマイクロアレイ技術に対する適用は、上述したように、C.glutamicumまたは他のCorynebacteriaの異なった株の比較解析を可能とする。例えば、個々の転写の特徴に基づく内部株の変種の研究および特定するために重要な遺伝子の同定および／または所望の株の特性、例えば病原性、生産性、およびストレス寛容などの同定は、核酸アレイ方法論により促進される。発酵反応の進行の間の、本発明の遺伝子の発現の特徴の比較は、核酸アレイ技術を用いることで可能である。
【０２３２】
実施例１３：細胞タンパクポピュレーションの動力学的解析（プロテオミクス）
本発明の遺伝子、組成、方法は、タンパクのポピュレーションの相互作用および動力学（プロテオミクスと定義する）の研究に適用することができる。注目のタンパクポピュレーションは、C.glutamicum(例えば他の生物のタンパクポピュレーションと比較して）、特定の環境または代謝条件下（例えば高いまたは低い温度で、または高いまたは低いｐＨでの発酵の間）で活性なタンパクまたは特定の成長および発達の相の間に活性なタンパクの総タンパクポピュレーションを含むが、これに限定されない。
【０２３３】
タンパクポピュレーションは、種々の周知の技術、例えばゲル電気泳動などにより解析することができる。細胞タンパクは、例えば細胞溶解または抽出により得られ、種々の電気泳動技術を用いて互いに分離することができる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、タンパクをその分子量に基づいて大部分分離する。等電点のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＩＥＦ−ＰＡＧＥ）は、タンパクをその等電点（アミノ酸配列を反映するのみならずタンパクの後翻訳修飾も反映する）により分離する。他の、さらに好ましいタンパク解析の方法は、２−Ｄ−ゲル電気泳動（例えばHermann et al. (1998) Electrophoresis 19: 3217-3221; Fountoulakis et al. (1998) Electrophoresis 19: 1193-1202; Langen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192; Antelmann et al. (1997) Electrophoresis 18: 1451-1463に記載されている)として知られるＩＥＦ−ＰＡＧＥとＳＤＳ−ＰＡＧＥの連続する組み合わせである。他の分離技術、例えばキャピラリーゲル電気泳動などもタンパクの分離に利用することができ、このような技術は、周知である。
【０２３４】
これらの方法論により分離されたタンパクは、標準的な技術、例えば染色またはラベリングにより可視化することができる。適当な染色は公知であり、Coomassie ブリリアントブルー、銀染色、蛍光染料、例えばＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む。C.glutamicumの媒体中にある、放射性物質によりラベルされたアミノ酸またはその他のタンパク前駆体（例えば35Ｓ−メチオニン、35Ｓ−システイン、14Ｃ−ラベルされたアミノ酸、15Ｎ−アミノ酸、15ＮＯ3または15ＮＨ4+またはＣ13ラベルされたアミノ酸）の含有物は、分離に先立ってこれらの細胞からタンパクをラベルすることを可能とする。同様に、蛍光ラベルを使用することができる。これらのラベルされたタンパクは、抽出され、単離され、前述した技術に従って分離される。
【０２３５】
これらの技術により可視化されたタンパクはさらに、使用された染料またはラベルの量を測定することにより解析することができる。得られたタンパクの量は、定量的に、例えば光学的方法を用いて決定することができ、同様のゲルまたは他のゲル中の他のタンパクの量と比較することができる。ゲル上のタンパクの比較は、例えば光学的比較、分光学的、ゲルのイメージスキャンおよび解析、または写真フィルムおよびスクリーンの使用を通じて行なうことができる。このような技術は周知である。
【０２３６】
得られたタンパクを同定するために、直接シーケンスまたは他の標準的な技術を使用することができる。例えば、Ｎ−および／またはＣ末端アミノ酸シーケンス（例えばエドマン分解）を、マススペクトロメトリー（特にＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ技術（例えばLangen et al. (1997) Electrophoresis 18: 1184-1192参照））として使用することができる。ここで提供されたタンパク配列を、これらの技術によりC.glutamicumタンパクの同定のために使用することができる。
【０２３７】
これらの方法により得られた情報は、タンパクの存在、活性、種々の生物学的条件（例えば、異なった生物、発酵の時点、媒体条件、または異なったビオトープ、その他）からの異なったサンプルの間の修飾の様式の比較に使用することができる。このような実験から単独で、または他の技術との組み合わせにより得られたデータは、様々な適用、例えば与えられた（例えば代謝的）状況にある種々の生物の挙動の比較、ファインケミカルを産出する株の生産性の上昇、またはファインケミカルの製造の効率の上昇などに使用することができる。
【０２３８】
同等物
当業者は、わずかの型にはまった実験を用いて、ここに記載された発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するか、確認することができるであろう。このような同等物は、請求の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項２】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項３】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの自然に発生する対立性変異体をコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項４】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項５】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドフラグメントを含む、単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項６】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子、および異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が微生物である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記核酸分子の発現により、前記細胞からのファインケミカルの製造が調節される請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ファインケミカルが、有機酸、タンパク原アミノ酸および非タンパク原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
適当な培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、これによりポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの、自然に発生する対立性変異体を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ポリペプチドフラグメントが配列番号（SEQ ID NO)４００のアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性を維持している単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
異種アミノ酸配列を含む、請求項１６から２１のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１０に記載の細胞を培養してファインケミカルを製造する、ファインケミカルの製造方法。
【請求項２４】
培養物からファインケミカルを回収する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
当該細胞が、コリネバクテリウム−グルタミカム、コリネバクテリウム−ヘルキュリス、コリネバクテリウム−リリウム、コリネバクテリウム−アセトアシドフィリウム、コリネバクテリウム−アセトグルタミカム、コリネバクテリウム−アセトフィリウム、コリネバクテリウム−アンモニアゲン、 コリネバクテリウム−フジオケンス、コリネバクテリウム−ニトリロフィリウス、 ブレビバクテリウム−アンモニアゲン、ブレビバクテリウム−ブタニカム、 ブレビバクテリウム−ジバリカツム、ブレビバクテリウム−フラビン、ブレビバクテリウム−ヘアリ、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム−ケトソレダクタム、ブレビバクテリウム−ラクトフェルメンツム、ブレビバクテリウム−リネンス、ブレビバクテリウム−パラフィノリツカム、および表３に記載の株からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターによる核酸分子の発現により、前記ファインケミカルの製造が調節される請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
当該ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸および非タンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、共同因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ファインケミカルがアミノ酸である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸が、リジン、グルタマート、グルタミン、アラニン、アスパルタート、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子の導入によってゲノムＤＮＡが変異した細胞を培養する工程を含むファインケミカルの製造方法。
【請求項３２】
サンプルにおけるin vitroでのコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する方法であって、請求項１から６のいずれか1項に記載の少なくとも１個の核酸分子、または請求項１６から２１のいずれか1項に記載の少なくとも１個のポリペプチド分子の存在をサンプルから検出することによりサンプルのコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する、コリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する方法。
【請求項３３】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子が混乱している宿主細胞。
【請求項３４】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子が配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された配列に対して１個以上の核酸の修飾を含む宿主細胞。
【請求項３５】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子の調節領域が、分子の野生型の調節領域に対して修飾されている宿主細胞。
【請求項１】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項２】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項３】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの自然に発生する対立性変異体をコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項４】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項５】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドフラグメントを含む、単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項６】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはその相補物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子、および異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
発現ベクターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が微生物である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記核酸分子の発現により、前記細胞からのファインケミカルの製造が調節される請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ファインケミカルが、有機酸、タンパク原アミノ酸および非タンパク原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、補助因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
適当な培地中で請求項１０に記載の宿主細胞を培養し、これによりポリペプチドを製造することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの、自然に発生する対立性変異体を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列全体に対し、少なくとも５０％の相同性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号（SEQ ID NO)４００に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、ポリペプチドフラグメントが配列番号（SEQ ID NO)４００のアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性を維持している単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
異種アミノ酸配列を含む、請求項１６から２１のいずれかに記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１０に記載の細胞を培養してファインケミカルを製造する、ファインケミカルの製造方法。
【請求項２４】
培養物からファインケミカルを回収する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
当該細胞が、コリネバクテリウム−グルタミカム、コリネバクテリウム−ヘルキュリス、コリネバクテリウム−リリウム、コリネバクテリウム−アセトアシドフィリウム、コリネバクテリウム−アセトグルタミカム、コリネバクテリウム−アセトフィリウム、コリネバクテリウム−アンモニアゲン、 コリネバクテリウム−フジオケンス、コリネバクテリウム−ニトリロフィリウス、 ブレビバクテリウム−アンモニアゲン、ブレビバクテリウム−ブタニカム、 ブレビバクテリウム−ジバリカツム、ブレビバクテリウム−フラビン、ブレビバクテリウム−ヘアリ、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム−ケトソレダクタム、ブレビバクテリウム−ラクトフェルメンツム、ブレビバクテリウム−リネンス、ブレビバクテリウム−パラフィノリツカム、および表３に記載の株からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ベクターによる核酸分子の発現により、前記ファインケミカルの製造が調節される請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
当該ファインケミカルが、有機酸、タンパク質原アミノ酸および非タンパク質原アミノ酸、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、飽和および不飽和の脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン、共同因子、ポリケチド、および酵素からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ファインケミカルがアミノ酸である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
アミノ酸が、リジン、グルタマート、グルタミン、アラニン、アスパルタート、グリシン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンから成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子の導入によってゲノムＤＮＡが変異した細胞を培養する工程を含むファインケミカルの製造方法。
【請求項３２】
サンプルにおけるin vitroでのコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する方法であって、請求項１から６のいずれか1項に記載の少なくとも１個の核酸分子、または請求項１６から２１のいずれか1項に記載の少なくとも１個のポリペプチド分子の存在をサンプルから検出することによりサンプルのコリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する、コリネバクテリウム−ジフテリアの存在または活性を検出する方法。
【請求項３３】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子が混乱している宿主細胞。
【請求項３４】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子が配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された配列に対して１個以上の核酸の修飾を含む宿主細胞。
【請求項３５】
配列番号（SEQ ID NO)３３９に示された核酸分子を含み、核酸分子の調節領域が、分子の野生型の調節領域に対して修飾されている宿主細胞。
【公開番号】特開２００７−２５９８５９（Ｐ２００７−２５９８５９Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１１３８８１（Ｐ２００７−１１３８８１）
【出願日】平成１９年４月２４日（２００７．４．２４）
【分割の表示】特願２００１−５０６８３４（Ｐ２００１−５０６８３４）の分割
【原出願日】平成１２年６月２３日（２０００．６．２３）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月２４日（２００７．４．２４）
【分割の表示】特願２００１−５０６８３４（Ｐ２００１−５０６８３４）の分割
【原出願日】平成１２年６月２３日（２０００．６．２３）
【出願人】（５９５１２３０６９）ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト (847)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ
【住所又は居所原語表記】Ｄ−６７０５６ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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