抗アルファ２インテグリン抗体及びそれらの使用
本発明は、α２β１インテグリンに特異的な抗体及びそれらの使用に関し、ヒト化抗アルファ２(α２)インテグリン抗体及び抗α２インテグリン抗体を用いた処置方法を含む。より具体的には、本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、変更されたエフェクター機能を示すヒト化抗α２インテグリン抗体に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、α２β１インテグリンに特異的な抗体及びそれらの使用に関し、これには、ヒト化抗アルファ２（α２）インテグリン抗体及び抗α２インテグリン抗体を用いた処置方法が含まれる。より具体的には、本発明は、変化したエフェクター機能を示す、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域、及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インテグリンα２β１（最晩期抗原２；ＶＬＡ−２）は、血小板、血管内皮細胞、上皮細胞、活性化単球／マクロファージ、線維芽細胞、白血球、リンパ球、活性化好中球及びマスト細胞を含む様々な細胞型において発現される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。最も典型的なα２β１のリガンドとしてはコラーゲン及びラミニンが挙げられ、これらは両方とも細胞外マトリックスで見られる。典型的には、α２インテグリンのＩ−ドメインは二価カチオン依存性の様式でコラーゲンに結合するが、同じドメインは二価カチオン依存性及び非依存性の機構の両方によりラミニンに結合する。（非特許文献４） α２β１インテグリンの特異性は細胞型によって変わり、そして特定の細胞型にたいしてはコラーゲン及び／又はラミニン受容体として作用し、例えばα２β１インテグリンは血小板についてはコラーゲン受容体として、そして内皮細胞についてはラミニン受容体として知られる。（非特許文献５） エコーウイルス−１、デコリン、Ｅ−カドヘリン、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）、エンドレペリン（ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）及び複数のコレクチン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｓ）並びに補体Ｃ１ｑタンパク質もまたα２β１インテグリンのリガンドである。（非特許文献６） α２β１インテグリンはいくつかの生物学的及び病的過程に関与しており、これらとしては、コラーゲン誘発血小板凝集、コラーゲンでの細胞遊走、コラーゲン線維の細胞依存性再構成、さらにはサイトカイン発現及び増殖の増加を生じるコラーゲン依存性細胞応答、（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、Ｔ細胞、マスト細胞及び好中球の機能の局面（非特許文献１０；非特許文献１１、非特許文献３、非特許文献１２）、遅延型過敏症（ｈｙｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、接触過敏症及びコラーゲン誘発関節炎（非特許文献１３；非特許文献１４）、乳腺管形態形成（非特許文献１５；非特許文献１６）、表皮創傷治癒（非特許文献１７）、並びにＶＥＧＦ誘発新脈管形成に関連する過程（非特許文献１８）が挙げられる。
【０００３】
インテグリン／リガンド相互作用は、白血球の炎症組織への管外遊出を促進し得（非特許文献１９；非特許文献２０、非特許文献２１）、そして炎症性の刺激に応じた白血球の循環から組織への初期の管外遊出後の下流事象（炎症部位における炎症促進性細胞の遊走、動員及び活性化を含む）において役割を果たし得る（非特許文献２２）。α２β１インテグリンを遮断するいくつかの抗体は、遅延型過敏症応答に対する影響並びに関節リウマチのマウスモデル及び炎症性腸疾患モデルにおける有効性を示すと報告され（非特許文献１４；非特許文献１３）、そしてインビトロで内皮細胞増殖及び遊走を減衰させることが報告され（非特許文献１８）、α２β１インテグリンの遮断が、種々のがんにおいて観察される異常な又は通常よりも高い新脈管形成を予防／抑制し得るということを示唆した。
【０００４】
α２β１インテグリン（血小板上のα２β１インテグリンを含む）に結合する治療的抗体は出血の合併症を生じ得ると予測される。例えば、ＧＰＩｂ（非特許文献２３）又はＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）のような他の血小板受容体を標的とする抗体は血小板減少症を伴うが、この背後にある機構は十分に理解されていない。血小板受容体への抗体の結合はその三次元構造を変更し得、そして通常は露出していないエピトープを露出させ、次いでこれが血小板の排出をもたらすという仮説が立てられている（非特許文献２６）。実際に、ＧＰ ＩＩａ／ＩＩＩｂアンタゴニストの経口投与に伴う出血の合併症は、このクラスの化合物の「影の側面」として記載されている（非特許文献２７）。α２β１インテグリンが炎症組織を通る白血球の移動において重要な役割を果たす場合、がん、炎症性疾患及び自己免疫疾患を含む、疾患、α２β１インテグリン関連障害及び／又はこれらの障害に関連する細胞プロセスのためのα２β１を標的とし得る治療薬を開発することが、このような薬剤が血小板を活性化しない場合は望ましい。白血球上のα２β１インテグリンのようなα２β１インテグリンを標的とし得る、有害な出血合併症を伴わないヒト化抗体が特許文献１に記載される。そこに記載されるヒト化抗α２インテグリン抗体は抗α２抗体の新規なサブグループを代表し、これらは予期せずインビボ出血合併症がないこと及び／又は血小板α２β１インテグリン活性化がないことを特徴とする。しかし特許文献１において開示されるＩｇＧ４抗体はＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣのようなエフェクター機能を有しておらず、この機能は特定の状況、例えばがんのようなα２β１インテグリン関連障害の処置のためには望ましく、この場合、この機能は処置の増加した有効性をもたらす。従って、これらのエフェクター機能を高度に示す抗α２β１インテグリン抗体を開発することが望ましいだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５６８５８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｍｌｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：３６５：３６５−４００（１９９９）
【非特許文献２】Ｗｕ ａｎｄ Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０６：１６９−１７１（１９９４）
【非特許文献３】Ｅｄｅｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．１０３（６）：２２１４−２０（２００４）
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．５：２７３−２８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｄｉｃｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６６１−７６６８（１９９７）
【非特許文献６】Ｅｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０７（１）：１４３−５０（２００６）
【非特許文献７】Ｇｅｎｄｒｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４８６３３−４８６４３（２００３）
【非特許文献８】Ａｎｄｒｅａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２８０４−２８１１（２００３）
【非特許文献９】Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（９）：４９３５−４０（２０００）
【非特許文献１０】Ｃｈａｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３９８−４０４（１９９１）
【非特許文献１１】Ｄｕｓｔｉｎ ａｎｄ ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：２８６−２９０（２００１）
【非特許文献１２】Ｗｅｒｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ９５：１８０４−１８０９（２０００）
【非特許文献１３】ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：７２１− ７２０（２０００）
【非特許文献１４】Ｋｒｉｅｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０（１２）：１７７３−８２（２００２）
【非特許文献１５】Ｋｅｅｌｙ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：５９５−６０７（１９９５）
【非特許文献１６】Ｚｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（３）：９２７−９４０（１９９５）
【非特許文献１７】Ｐｉｌｃｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８１４５７−５４（１９９７）
【非特許文献１８】Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０（１）：１９５−２０４（２００２）
【非特許文献１９】Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３３５９−３３６８（１９９７）
【非特許文献２０】Ｇａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５（５５５７）：１０８６−９（２００２）
【非特許文献２１】Ｓｉｒｃａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：２０５１−２０６６（２００２）
【非特許文献２２】Ｅｂｌｅ Ｊ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒ．Ｄｅｓ．１１（７）：８６７−８８０（２００５）
【非特許文献２３】Ｖａｎｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．３（２）：１２５−４０（２００３）
【非特許文献２４】Ｓｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：７６−７９（２００２）
【非特許文献２５】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ １０２（２）：４４９−４６１（２００３）
【非特許文献２６】Ｍｅｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：２２０３−２２０６（２００４）
【非特許文献２７】Ｂｈａｔｔ ａｎｄ Ｔｏｐｏｌ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２（１）：１５−２８（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、該変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該抗体は親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【０００８】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２β１インテグリン抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、上述の核酸を含むベクターを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上述の核酸又は上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン又は上述の組成物、及び２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、対象者においてα２β１インテグリン関連障害を処置する方法を提供し、該方法は、対象者に治療有効量の上述の抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を投与することを含む。
【００１４】
本発明はさらに、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法を提供し、該方法は、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、上述の抗α２β１インテグリン抗体又は上述の組成物を対象者に投与することを含む。
【００１５】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の、薬剤としての使用を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の使用を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための方法における使用のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための薬剤の製造のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の使用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体を提供するが、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の細胞ベースのＣＤＣアッセイを示す：（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【図２】最終濃度０．１μｇ／ｍｌでの選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【図３】選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の最終濃度０．０１μｇ／ｍｌでの細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示すヒト化抗α２インテグリン抗体に関する。
【００２２】
α２β１インテグリンは、アルファインテグリンファミリーからのα２インテグリンサブユニット、及びベータインテグリンファミリーからのβ１インテグリンサブユニットから構成される分子であり、そして哺乳動物を含むいずれの対象者由来でもよいが、好ましくはヒト由来である。α２β１インテグリンは、いずれかの天然供給源から精製されてもよく、合成的に製造されてもよい（例えば、組み換えＤＮＡ技術の使用により）。α２インテグリン及びβ１インテグリンについての配列をコードする核酸は、それぞれＴａｋａｄａ ａｎｄ Ｈｅｍｌｅｒ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９（１）：３９７−４０７（１９８９；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｘ１７０３３；その後エントリーＮＭ ００２２０３に更新）及びＡｒｇｒａｖｅｓ、Ｗ．Ｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｅｐ １０５（３）：１１８３−９０（１９８７；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託Ｘ０７９７９．１及び選択的スプライシングされた変異体を表す関連する配列）に記載される。
【００２３】
α２β１インテグリン分子の「Ｉ」ドメインは、α２サブユニット内のこのα２β１インテグリン分子の領域を指し、そして例えばＫａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９６５９−９６６３（１９９４）；Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８５１２（１９９７）及びＣｅｌｌ １０１：４７（２０００）に記載される。α２インテグリンのＩドメインは、ＭＩＤＡＳ型のリガンド結合部位（金属イオン依存性接着部位（Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ））を含み、これはリガンド結合を支持するための所定の二価カチオンに対する要件及び特異性を有する。
【００２４】
α２インテグリン関連障害には、標的組織内で異常な細胞応答を媒介するα２インテグリン依存性のプロセス／機能（例えば、結合、活性）を含む障害、疾患又は状態が含まれる。疾患に含まれるα２インテグリン依存性プロセスの例としては、サイトカイン発現及び増殖における増加に関与するようなコラーゲン依存性細胞応答、Ｔ細胞機能、マスト細胞機能及び好中球機能の局面、炎症性障害、乳腺管形態形成、表皮創傷治癒、並びに新脈管形成が挙げられる。α２インテグリン関連障害の例としては、限定されないが、炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）を含むがこれらに限定されない炎症性疾患、移植に対する反応（移植拒絶反応を含む）、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、多発性硬化症（それに伴う神経系続発症の処置、さらには再発を特徴とする多発性硬化症の処置を含む）、自己免疫疾患又は障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症を含む）、若年型糖尿病、及び異常な血管新生又は通常よりも増加した血管新生を伴う障害（例えば糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、関節リウマチ及びがん）、さらには炎症反応を誘発する感染症が挙げられる。
【００２５】
α２β１インテグリン関連障害の処置は、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体の治療的使用及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）使用の両方を含む。処置を必要とする者には、障害と既に診断された者に加えて、障害の発生を予防又は遅延させようとする者が含まれる。
【００２６】
用語「抗α２インテグリン抗体」又は「α２に結合する抗体」又は「α２インテグリンサブユニットに結合する抗体」又は「抗ＶＬＡ−２抗体」は、本明細書において同意語として使用され、そしてヒトα２インテグリンに結合する抗体、例えば固定化α２β１に５０ｎＭ又はそれ以下、好ましくは１０ｎＭ又はそれ以下、より好ましくは１ｎＭ又はそれ以下、特に０．５ｎＭ又はそれ以下の親和性（Ｋｄ）で結合する抗体、好ましくはヒト化ＩｇＧ抗体を含む。
【００２７】
本明細書において同意語として使用される用語「親ヒト化抗α２インテグリン抗体」又は「親抗α２インテグリン抗体」又は「親抗ＶＬＡ−２抗体」は、ヒトα２インテグリンに結合する抗体、例えば変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むように改変され得るヒト化ＩｇＧ１抗α２インテグリン抗体を意味する。親ヒト化抗α２インテグリン抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域におけるアミノ酸修飾を除いて、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と同一であり、通常は天然ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体である。アミノ酸修飾は、好ましくはアイソタイプではない。
【００２８】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は最も広い意味で使用され、そしてそれらが望ましい生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、及び多特異的抗体を網羅する。抗体又は免疫グロブリンという用語は、全長抗体、さらには抗原結合特性を有する（すなわちα２インテグリンに結合する）そのフラグメントも含む。用語「抗体」には、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合フラグメントが含まれる。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略される）から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれるより保存的な領域に組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への結合を媒介し得る。
【００２９】
本明細書で使用される用語「全長抗体」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒト及びマウスを含む大部分の哺乳動物において、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、そして２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、そして各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃ［ガンマ］１）、ＣＨ２（Ｃ［ガンマ］２）、及びＣＨ３（Ｃ［ガンマ］３）を含む。いくつかの哺乳動物において、例えばラクダ及びラマにおいて、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖のみからなるものであってもよく、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。
【００３０】
本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来するものである抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、そして定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含む。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内、さらには別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製され得る。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよい（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により導入された変異）。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図されない。
【００３３】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団（例えばその集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除けば同一である）から得られた抗体を含む。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられたものである。さらに、典型的に抗原上の異なる決定基（例えばエピトープ）に対するものである異なる抗体を含む従来の（例えばポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の少なくとも単一の決定基に向けられたものである。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得、又は組み換えＤＮＡ法により作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。モノクローナル抗体はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体はまた、米国特許第６，０２５，１５５号及び同第６，０７７，６７７号、さらには米国特許出願公開第２００２／０１６０９７０号及び同第２００３／００８３２９３号（例えば、Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（２１）：０１７７（２００４）も参照のこと）に記載される技術を使用して単離することもできる。
【００３４】
超可変領域は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を含む。超可変領域は、相補性決定領域すなわちＣＤＲからのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））、及び／又は超可変ループからの残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。フレームワーク又はＦＲ残基は、超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書において記載される抗体については、ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、重鎖のＣＤＲ１がＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ定義により残基２６〜３５に及ぶと定義されることを除いて、Ｋａｂａｔ付番方式に基づいて識別される。Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｃｃｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃ０７ｓ／）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０３、１２１−１５３（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、１、１２６（１９９２）；及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１−１７２．（１９９６））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａ超可変領域付番方式を組み合わせてＣＤＲを定義する。
【００３５】
本明細書における用語「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を含む。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは変異ポリペプチドを指し、この場合は重鎖可変フレームワーク領域変異体であり、ここで位置９４のアルギニンがリジンで置き換えられる。前の例について、９４Ｋは位置９４のリジンでの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は典型的にはスラッシュで区切られる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは置換Ｒ９４Ｋ及びＬ７８Ｖを含む二重変異を指す。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置においてアミノ酸を加えること意味する。例えば、挿入−９４は位置９４での挿入を示す。本明細書において使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は位置９４におけるアルギニンの欠失を示す。
【００３６】
本発明において考察される全ての免疫グロブリン重鎖定常領域の位置について、番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照により全体として加入される））におけるＥＵインデックスに従う。免疫グロブリン重鎖定常領域の位置の番号付けは、「Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式」又は「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」と呼ばれ、これは本明細書において同等に使用され、そしてＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う番号付けを示す。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９６９、ＰＮＡＳ ６３：７８−８５に記載されるヒトＩｇＧｌ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００３７】
抗体は、定常領域により遺伝学的に決定されるクラス（アイソタイプとも呼ばれる）に分類される。ヒト定常軽鎖はカッパ（ＣＫ）軽鎖及びラムダ（Ｃ［ラムダ］）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラスは治療目的のために最も一般的に使用される。ヒトにおいて、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。ＩｇＭはＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。従って、本明細書で使用される「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原性の特徴により定義される免疫グロブリンのクラス又はサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。
【００３８】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、第一定常領域免疫グロブリンドメインを除いて抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。従ってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃ［ガンマ］２及びＣ［ガンマ］３）、並びにＣガンマｌ（Ｃ［ガンマ］ｌ）とＣガンマ２（Ｃ［ガンマ］２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。Ｆｃはこの領域のことを分離して指していてもよいし、Ｆｃポリペプチド、例えば抗体と関連してこの領域を指していてもよい。
【００３９】
本明細書で使用される「変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域」は、親ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とは少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」又は「変異Ｆｃ」又は「変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域」は、親Ｆｃ配列の配列とは少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なるＦｃ配列を意味する。変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１つ又はそれ以上のアミノ酸修飾を含み、ここでこのアミノ酸修飾（単数又は複数）は、１つ又はそれ以上の最適化された特性を生じる。本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、アミノ酸配列において、その親ＩｇＧ１と少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なる。従って、本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。あるいは、本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親と比較して１つより多くのアミノ酸修飾を有し得、例えば定常領域免疫グロブリンドメイン全体の、又は好ましくは異なるアイソタイプの１つのアイソタイプのＦｃ領域の変換、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ領域のヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域への変換を含み得、これはヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体を生じる。修飾は、分子生物学を使用して遺伝子的に行われ得、又は酵素的若しくは化学的に行われ得る。
【００４０】
本発明のＦｃ変異体は、いずれかの免疫グロブリン遺伝子のいずれかのアロタイプ又は同型アロタイプ（ｉｓｏａｌｌｏｔｙｐｅ）により実質的にコードされ得る。好ましい実施態様において、本発明のＦｃ変異体は、Ｇ１ｍ（１）、Ｇ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１７）、ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ ｍ（２）、及び／又はｎＧ１ ｍ（１７）として分類されるＩｇＧ１配列を含む抗体又はＦｃ融合において用途を見出す。従って、ＩｇＧＩアイソタイプの文脈において、本発明のＦｃ変異体は、位置２１４においてＬｙｓ（Ｇ１ｍ（１７））若しくはＡｒｇ（Ｇ１ｍ（３））、Ａｓｐ３５６／Ｌｅｕ３５８（Ｇ１ｍ（１））若しくはＧｌｕ３５６／Ｍｅｔ３５８（ｎＧ１ｍ（１））、及び／又は位置４３１においてＧＩｙ（Ｇ１ｍ（２））若しくはＡｌａ（ｎＧ１ｍ（２））を含み得る。
【００４１】
本明細書において使用される用語「アイソタイプ変異体」は、１つのアイソタイプの少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは１つのアイソタイプの重鎖定常領域の少なくとも１つのアミノ酸を、整列された異なるアイソタイプにおける対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、定常領域免疫グロブリンドメイン全体の、又は好ましくは異なるアイソタイプにおける１つのアイソタイプのＦｃ領域の変換、例えばヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体を生じるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ領域のヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域への変換を含み得る。
【００４２】
本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は、抗体の第一の定常ドメインと第二の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、そしてＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ位置２３７の残基で始まる。従ってＩｇＧについては、抗体ヒンジは位置２２１（ＩｇＧＩにおいてＤ２２１）〜位置２３１（ＩｇＧＩにおいてＡ２３１）を含むように本明細書において定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。
【００４３】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を含む。本明細書で使用される用語「エフェクター機能」としては、ファゴサイトーシス、オプソニン作用、細胞結合、リセット、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｃ１ｑ結合、Ｆｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が挙げられる。好ましくは、エフェクター機能は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。エフェクター機能は、当該分野で公知であり市販されている標準的なインビトロアッセイにより測定される。通常、ＡＤＣＣは本出願の実施例２において記載されるような乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定され、そしてＣＤＣは、本出願の実施例１において記載される細胞ベースのアッセイにより測定される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能を変更する」又は「変化したエフェクター機能を示す」は、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体、例えばヒト化抗α２インテグリン抗体が、親抗体と比較して増強されたエフェクター機能を示すこと、すなわち、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体のエフェクター機能は、親抗体のエフェクター機能より、１０％より多く、好ましくは２０％より多く、より好ましくは３０％より多く、最も好ましくは５０％より多く、特に６０％より多く、最も特定には７０％より多く高いということを含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、Ｆｃ［ガンマ］Ｒｓを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の反応を含む。種々の局面において、増強されたＡＤＣＣエフェクター機能は、増強された効力又は増強された有効性を意味し得る。実験の文脈において使用される「効力」は、特定の治療効果が観察される場合の抗体の濃度 ＥＣ５０（最大半量有効濃度）を意味する。実験の文脈において使用される「有効性」は、飽和レベルの抗体での最大の可能なエフェクター機能を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される用語「ＣＤＣ」又は「補体依存性細胞傷害」は、１つ又はそれ以上の補体タンパク質成分が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす反応を含む。
【００４７】
本明細書で使用される用語「対象者」はヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。好ましくは対象者はヒトである。
【００４８】
細胞傷害性薬剤には、細胞の機能を阻害若しくは防止し、かつ／又は細胞の破壊を引き起こす物質が含まれる。それら（Ｔｈｅ）には、放射性同位体（例えば131Ｉ、125Ｉ、90Ｙ及び186Ｒｅ）、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらのフラグメントが含まれ得る。非細胞傷害性薬剤は、細胞の機能を阻害も防止もせず、かつ／又は細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害性薬剤には、活性化されて細胞傷害性になることができる薬剤が含まれ得る。非細胞傷害性薬剤はビーズ、リポソーム、マトリックス又は粒子を含み得る（例えば、米国特許公開第２００３／００２８０７１号及び同第２００３／００３２９９５号（これらは参
照により本明細書に加入される）を参照のこと）。このような薬剤は、本明細書に記載される抗α２β１インテグリン抗体に結合、カップリング、連結又は付着され得る。
【００４９】
化学療法剤は、がんの処置において有用な化学化合物を指す。化学療法剤の例としては、限定されないが、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、シトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン（Ｖｉｎｃｒｅｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン及び他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。
【００５０】
単離された核酸分子は、同定され、そして通常は供給源（例えば抗体核酸の天然供給源）中にある付随する少なくとも１つの混入核酸分子から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は状態以外のものである。従って単離された核酸分子は、天然細胞に存在するままの核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞とは異なる染色体上の位置にある場合の、通常その抗体を発現する細胞中に含有する核酸分子を含む。
【００５１】
細胞、細胞株、及び細胞培養物は、しばしば交換可能に使用され、そして全てのこのような表示は子孫を含む。形質転換体及び形質転換された細胞（例えば、核酸、ベクター、ウイルスなどのトランスフェクション、形質転換又は形質導入により得られる）は、初代対象者細胞、及び移入（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）の数に関係なくそれらから誘導される培養物を含む。計画的又は偶発性の変異のために、全ての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一でなくてもよいということも理解される。元の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別の表示が意図される場合、それは文脈から明らかだろう。
【００５２】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常（ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ドメインを含むヒト化抗α２インテグリン抗体
本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該抗体は親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【００５３】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である。
【００５４】
一実施態様において、アイソタイプ変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号３５を含む。
【００５５】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である。
【００５６】
一実施態様において、アイソタイプ変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号３６を含む。
【００５７】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【００５８】
一実施態様において、アミノ酸修飾は、２６９、２９８、及び３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、好ましくはアミノ酸位置２９８及び／又は３２４におけるアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００５９】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、及びＳ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換、好ましくはアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ及び／又はＳ３２４Ｎを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６０】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、２６９／２９８、２６９／３２４、２９８／３２４、及び２６９／２９８／３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換の組み合わせ（好ましくは２９８／３２４、又は２６９／２９８／３２４）を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６１】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせ（好ましくはＳ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ）を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６２】
一実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３７〜４３からなる群より選択される配列を含む。
変更されるエフェクター機能は、通常は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又はＣ１ｑ結合及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又はＦｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性、好ましくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。ＣＤＣ、Ｃ１ｑ結合、ＡＤＣＣ、及びＦｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性は標準的なインビトロアッセイで測定され、これらは当該分野で公知であり、市販されている。通常、ＡＤＣＣは例えば本出願の実施例２において記載されるような乳酸デヒドドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定され、そしてＣＤＣは例えば本出願の実施例１において記載される細胞ベースのアッセイによる測定である。
【００６３】
好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む本開示のヒト化抗α２インテグリン抗体は、親ヒト化抗体と比較して、上記のようなインビトロアッセイにおいて改善されたＣＤＣを示す。本明細書で使用される「改善されたＣＤＣを示すこと（Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＤＣ）」又は「改善されたＣＤＣを示すこと（ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＤＣ）」は、ａ） 親抗体と比較して増強されたＣＤＣを示すこと、すなわち、親ヒト化抗α２インテグリン抗体が既にＣＤＣを示し、これがヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸修飾により増強されること、及びｂ） 親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して新たにＣＤＣを示すこと、すなわち親ヒト化抗α２インテグリン抗体はＣＤＣを示さず、それ故ＣＤＣはヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸修飾により新たに導入されたということを含む。
【００６４】
従って、さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、そして該抗体は、親ヒト化抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。親ヒト化抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すヒト化抗α２インテグリン抗体の好ましい変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、より好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３９、４２及び４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
一実施態様において、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体は、親ヒト化抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。親ヒト化抗体と同等のＡＤＣＣを示すことは、親ヒト化抗体のＡＤＣＣの±５０％、好ましくは±４０％、より好ましくは±３０％、最も好ましくは±２０％、特に±１０％のＡＤＣＣを含む。親抗体としてのＩｇＧ１抗体、例えばヒト化ＩｇＧ１抗α２インテグリン抗体がＡＤＣＣを示すことは公知である。しかし、ＩｇＧ１重鎖定常領域の改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる修飾、例えばアミノ酸の置換がＡＤＣＣに影響を有するかどうかは予測不可能である。従って、改善されたＣＤＣを示す、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む本発明のヒト化抗α２インテグリン抗体は、驚くべきことに親ヒト化抗体と同等のＡＤＣＣを示す。
【００６６】
さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、一方で該抗体は親ヒト化抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。親ヒト化抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示すヒト化抗α２インテグリン抗体の好ましい変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、より好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３７、３８、４２及び４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、ここでアミノ酸修飾は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎであり、一方で該抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【００６８】
マウスモノクローナル抗体クローンＢＨＡ２．１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方からのＣＤＲを含む本発明の抗体が構築された（Ｈａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３１４２−３１４９（１９９６））。抗体を構築するための好ましい出発物質は、ヒトα２インテグリンに特異的な機能遮断抗体であり、かつ標的にされたα２インテグリン内のインタクトなＩ−ドメインの存在に結合及び活性が依存性である、ＢＨＡ２．１ハイブリドーマ（例えば、ＴＭＣ−２２０６）により分泌されるような抗α２インテグリン抗体である。ＴＭＣ−２２０６（又はＢＨＡ２．１）のエピトープ特異性を有するヒト化抗体が好ましく、これにはα２インテグリン分子の不活性コンホメーションに結合する抗体、及び／又はリガンド模倣物として作用しない抗体が含まれる。白血球及び血小板の両方に存在するα２β１インテグリンと相互作用するが、血小板活性化、コラーゲン上の活性化血小板の凝集不全を引き起こさず、出血に対して最小の効果しか有していないか若しくは効果を有しておらず、かつ／又は投与された濃度（インビボでの治療用量を含む）で出血合併症を伴わない、ＴＭＣ−２２０６（又はＢＨＡ２．１）のエピトープ特異性を有するヒト化抗体が好ましい。
【００６９】
従って、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７０】
アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７１】
アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに／又はアミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７２】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、（ａ）位置７１がＬｙｓであるか、（ｂ）位置７３がＡｓｎであるか、（ｃ）位置７８がＶａｌであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、配列番号８〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７５】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）を含むＦＷ４領域をさらに含む。
【００７７】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、（ａ）位置２がＰｈｅであるか、（ｂ）位置４５がＬｙｓであるか、（ｃ）位置４８がＴｙｒであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号２２〜３３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）を含むＦＷ４領域をさらに含む。
【００８２】
上述の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、上述の重鎖及び軽鎖可変領域並びにヒト軽鎖定常領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体がさらに提供される。
【００８３】
従って、さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４７を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８４】
さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４８を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８５】
さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４９〜５５からなる群より選択される重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８６】
親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体がさらに提供されるが、該抗体は、改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。
【００８７】
親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体がさらに提供されるが、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。本抗体はさらに、親抗体のアミノ酸位置２６９におけるグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換Ｅ２６９Ｄ、及び／又は親抗体のアミノ酸位置２９８におけるセリンをアラニンと置き換える置換Ｓ２９８Ａを含み得る。本抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選択され得る。本抗体は、好ましくはヒト化抗体であり、より好ましくはヒト化抗α２インテグリン抗体である。
【００８８】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、ヒトα２インテグリンのＩドメインを認識する。
【００８９】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、α２β１インテグリンに結合する。
【００９０】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、α２又はα２β１インテグリンのα２β１インテグリンリガンドに対する結合を阻害する。通常、α２β１インテグリンリガンドは、コラーゲン、ラミニン、エコーウイルス−１、デコリン、Ｅ−カドヘリン、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）、エンドレペリン（ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）、コレクチン及び補体Ｃ１ｑタンパク質から選択され、そして好ましくはコラーゲンである。
【００９１】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、及び該核酸又はベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【００９２】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物もまた提供される。
【００９３】
対象者におけるα２β１インテグリン関連障害を処置する方法もまた提供され、該方法は、対象者に治療有効量の上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を投与することを含む。α２β１インテグリン関連障害としては、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な血管新生又は増加した血管新生を特徴とする疾患が挙げられ、特に炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症、若年型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、がん、さらには炎症反応を誘発する感染であり、より特定の多発性硬化症、関節リウマチ、視神経炎及び脊髄外傷である。
【００９４】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物により処置され得るがんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜のがん、ヘパトーマ、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん及び種々の型の頭頸部がん、さらには低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）を含むＢ細胞リンパ腫、さらには母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常血管増殖、脳腫瘍に関連する浮腫のような浮腫、メイグス症候群、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がんからなる群より選択される。本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体を使用して好ましく処置されるがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カポージ肉腫、カルチノイドがん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。本発明の処置を受け入れやすい（ａｍｅｎｄｉｂｌｅ ｆｏｒ）がん性状態としては転移性がんが挙げられる。従って、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カポージ肉腫、カルチノイドがん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、多発性骨髄腫、転移性結腸直腸がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはさらにより好ましい。非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、骨肉腫、類表皮がん、転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんは特に好ましい。非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、 肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、 転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはより特に好ましい。膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、線維肉腫、転移性結腸直腸がん、前立腺がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはさらにより特に好ましい。膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、及び線維肉腫からなる群より選択されるがんは最も特に好ましい。膵臓がん、乳がん又は転移性乳がんは最も好ましく、特に膵臓がんが好ましい。前立腺がん又は転移性前立腺がんは等しく最も特に好ましい。本明細書で言及される「乳がん」は乳腺がんを含む。本発明の方法は、血管化腫瘍の処置に特に適している。
【００９５】
好ましくは、本方法は、（ａ）血小板活性化、（ｂ）血小板凝集、（ｃ）循環血小板数の減少、（ｄ）出血性合併症、又は（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせと関連づけられない。
【００９６】
コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体を対象者に投与することを含む、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法も提供される。
【００９７】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を従って（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）、及びα２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキットも提供される。
【００９８】
ヒト化抗α２インテグリン抗体及び複合体の構築
軽鎖可変領域のヒトアクセプター分子が、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づいて選択される抗体が構築され得る。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、潜在的な免疫原性を低減するために好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列までを読み取る抗体配列で構成されている。ＦＷ４領域の選択については、選択された生殖系列分子から誘導された成熟抗体配列のデータベースを検索することが好ましく、そして組み換え抗体分子における使用のための適度に相同なＦＷ４領域を選択することも好ましい。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから選択され、そしてマウスドナー分子の可変領域の同じ標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造クラスのものである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択に関する二次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースに対する相同性検索により選択され、そしてＫａｂａｔ、及び公開ＮＣＢＩデータベースのような他のデータベースも同様に使用され得る。ＴＭＣ−２２０６と同じか又は類似したエピトープ特異性及び／若しくは機能特性を有するヒト化抗α２インテグリン抗体については、好ましい軽鎖ヒトアクセプター分子は、ＦＷ１−３領域については生殖系列抗体配列Ａ１４、及びＦＷ４については配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）であり、これは成熟カッパ１軽鎖（例えば、軽鎖配列ＡＡＢ２４１３２（ＮＣＢＩエントリーｇｉ／２５９５９６／ｇｂ／ＡＡＢ２４１３２）の共通ＦＷ−４を表す。
【００９９】
重鎖可変領域のヒトアクセプター分子が、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づいて選択される抗体が構築され得る。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、潜在的な抗原性を低減するために好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列までを読み取る抗体配列で構成されている。ＦＷ４領域の選択については、選択された生殖系列分子から誘導された成熟抗体配列のデータベースを検索することが好ましく、そして組み換え抗体分子における使用のために適度に相同なＦＷ４領域を選択することも好ましい。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ重鎖クラスから選択され、そしてマウスドナー分子の可変領域の同じ標準的構造クラスのものである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択についての二次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースに対する相同性検索により選択されるが、Ｋａｂａｔ及び公開ＮＣＢＩデータベースのような他のデータベースも同様に使用され得る。ＴＭＣ−２２０６と同じか又は類似するエピトープ特異性及び／若しくは機能特性を有する抗α２インテグリン抗体については、好ましい重鎖アクセプター分子は、ＦＷ１−３領域については生殖系列抗体配列４−５９、及びＦＷ４領域については抗体、ＣＡＡ４８１０４．１（ＮＣＢＩエントリー、ｇｉ／３３５８３／ｅｍｂ／ＣＡＡ４８１０４．１）、生殖系列配列４−５９から誘導される成熟抗体である（配列番号２０）。
【０１００】
モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得、又は組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許第６，２０４，０２３号）により作製され得る。モノクローナル抗体はまた、米国特許第６，０２５，１５５号及び同第６，０７７，６７７号、さらには米国特許出願公開第２００２／０１６０９７０号及び同第２００３／００８３２９３号（例えばＬｉｎｄｅｎｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（２１）：０１７７（２００４）も参照のこと）に記載される技術を使用しても作製され得る。
【０１０１】
ヒト化抗α２β１インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をヒト化抗α２β１インテグリン抗体ＤＮＡに導入することにより、又はペプチド合成により製造される。このような変異体は、例えば、本発明の抗α２インテグリン抗体について示されるアミノ酸配列内の残基からの欠失、これらの残基への挿入及び／又はこれらの残基の置換を含む。アミノ酸の欠失、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせが、最終構築物に到達するために行われるが、ただし最終構築物は望ましい特徴を有する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数及び位置の変更のように、ヒト化抗α２インテグリン抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１０２】
抗体をヒト又はヒト様にする（例えば「ヒト化」）ために使用される多数の方法がある。抗体をヒト化するためのアプローチは長年にわたって変化してきた。１つのアプローチはヒト定常領域に融合されたマウス可変領域、いわゆるマウス−ヒトＦｃキメラを生成することであった（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。別のアプローチは、ＣＤＲがそれらの超可変性（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７））、Ｋａｂａｔ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８））及び標準的構造（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−１７（１９８７）；Ｌａｚａｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：９２９（１９９７））に基づいて容易に同定され得、そして例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１（６０６９）：５２２−５（１９８６）；（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第６，５４８，６４０号を参照のこと）により示されるように、単に非ヒトＣＤＲ領域（ドナーＣＤＲと呼ばれる）をヒトフレームワーク（アクセプターフレームワークと呼ばれる）上に移植することによりヒト化され得るということを利用する。６つのＣＤＲループがかたまって存在し、そして結晶解析に基づいて、ＣＤＲに隣接するか又は重鎖−軽鎖境界におけるいわゆるバーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」帯内の決定的なフレームワーク残基が容易に同定され得る（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６（３）：６５１−６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９）を参照のこと）。これらの残基は、６つのＣＤＲの正確な相対的定位を回復するためにマウス残基に復帰変異され得る（例えば、Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９（４８４７）：１５３４−６（１９８８）；Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（６１６２）：３２３−７（１９８８）；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（３）：２６６−７１（１９９１）を参照のこと）。可変領域は、マウスとヒトとの間に比較的高い相同性を有するファミリーに分類され得るので（例えば、Ｐａｓｃｕａｌ ａｎｄ Ｃａｐｒａ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：１−７４（１９９１）において概説される）、これらの初期の研究は、親和性の損失の可能性が、ヒトアクセプター分子としての使用のために目的のマウス抗体に対して最も高い相同性を有するヒト生殖系列配列を選択することにより、移植された抗体において最少にされ得るということも示した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９（４８４７）：１５３４−６（１９８８）を参照のこと）。
【０１０３】
非ヒトα２インテグリン抗体をヒト化するための方法は、例えばＷＯ２００７／０５６８５８に記載される。抗α２インテグリン抗体をヒト化するために、免疫化からの製造又は市販の抗体の購入を含めて、非ヒト抗体出発物質を入手する。本発明において使用される抗体をヒト化するため、例えばＴＭＣ−２２０６をヒト化するための例となる技術はＷＯ２００７／０５６８５８に記載される。
【０１０４】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換の領域における、例えばシート若しくはらせんコンホメーションのようなポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の体積の維持に対するそれらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。ヒト化抗α２インテグリン抗体の適切な確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の維持に関与しないいずれのシステイン残基も、分子の酸化的安定性を改善するため及び異常な架橋を防止するために、一般的にはセリンと置換され得る。反対に、システインの結合がその安定性を改善するために抗体に加えられ得る（特に抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１０５】
抗体の別の型のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更するということは、抗体において見られる１つ若しくはそれ以上の炭水化物部分を除去すること、及び／又は抗体に存在しない１つ若しくはそれ以上のグリコシル化部位を加えることを意味する。
【０１０６】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結又はＯ連結のいずれかである。Ｎ連結とは、炭水化物部位がアスパラギン残基の側鎖に結合することを指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン［ここでＸはプロリンを除くいずれかのアミノ酸である］は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合の認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じる。Ｏ連結グリコシル化は、糖Ｎ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０１０７】
抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、（Ｎ連結グリコシル化部位については）上記のトリペプチド配列の１つ又はそれ以上を含有するか又は欠くようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成され得る。この変更は、（Ｏ連結グリコシル化部位については）元の抗体の配列への１つ又はそれ以上のセリン又はスレオニン残基の付加、これらの残基での置換、又はこれらの残基の欠失によっても行われ得る。ヒト化抗α２インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の様々な方法により製造される。これらの方法としては、限定されないが、（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合は）天然供給源からの単離、又は前に製造された変異体若しくはヒト化抗α２インテグリン抗体の非変異バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異導入、若しくはカセット式変異誘発による製造が挙げられる。
【０１０８】
通常、ヒト化抗α２インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体は、元のヒト化抗体アミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％を含む）のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖又は軽鎖のいずれか（例えば、それぞれ配列番号１７又は配列番号３０におけるような可変領域配列）のアミノ酸配列を有する。この配列に関して同一性又は相同性は、本明細書において、必要な場合は最大の配列同一性パーセントを達成するように、そしていずれの保存的置換（上記のとおり）も配列同一性の一部として考慮せずに、配列を整列させてギャップを導入した後、候補配列中でヒト化抗α２インテグリン残基と同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失又は挿入はどれも配列同一性にも相同性にも影響を及ぼさないと解釈されるものとする。従って、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法により決定され得る。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを使用して、２つのポリペプチドを、（一方もしくは両方の配列の全長に沿って、又は一方若しくは両方の配列の所定の部分に沿って）それらのそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングのために整列される。これらのプログラムは、デフォルトオープンペナルティ（ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティを提供し、そしてＰＡＭ２５０のようなスコアリングマトリクス（標準的なスコアリングマトリクス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ ５、ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照のこと）がコンピュータープログラムと共に使用され得る。例えば、同一性パーセントは：完全な一致の総数に１００をかけて、次いで一致した範囲内のより長い配列の長さ及び２つの配列を整列させるためにより長い配列中に導入されたギャップの数の合計で割ったものとして計算され得る（ｃａｎ ｔｈｅ ｂｅ）。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（例えば二重特異性）ヒト化抗α２インテグリン抗体を生成することが望ましいかもしれない。例となる二重特異性抗体（例えば、２つの異なる結合アームを有する）は、α２β１インテグリンタンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗α２インテグリンアームは、その表面に結合したα２β１インテグリンを有する細胞に対する細胞防御機構に集中するように、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又はＩｇＧのＦｃ受容体（Ｆｃ(Ｒ）、例えばＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせられ得る。二重特異性抗体は、それらの表面に結合したα２β１インテグリンを有する細胞に局在化した細胞傷害性薬剤に対して使用され得る。これらの抗体は、α２β１インテグリン結合アーム及び細胞傷害性薬剤（例えば、ゲロニン、サポリン、抗インターフェロンアルファ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、又は放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。
【０１１０】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチにしたがって、一対の抗体分子間の接合部分は、組み換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にするように操作され得る。好ましい接合部分は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、１つ又はそれ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。置きな側鎖と等しいか又はより小さなサイズの代償性の（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二の抗体の接合部分に生成される。これが、ホモダイマーのような他の望まれない最終生成物よりもヘテロダイマーの収率を増加させるための機構を生じる（例えばＷＯ９６／２７０１１を参照のこと）。
【０１１１】
二重特異性抗体は、架橋した抗体又はヘテロ複合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の１つはアビジンとカップリングされ得、他方はビオチンにカップリングされ得る。ヘテロ複合体抗体は、いずれかの都合のよい架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、そして例えば米国特許第４，６７６，９８０号において多数の架橋技術とともに開示される。
【０１１２】
二価よりも多い抗体が考慮される。例えば、三重特異性抗体を製造することができる（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照のこと）。
【０１１３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体を含む免疫複合体は、α２インテグリンを発現する細胞、組織又は組織に対して薬剤を標的化するために、部分、例えば、分子、組成物、複合体、又は薬剤、例えば化学療法剤のような細胞傷害性薬剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（例えば放射複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））に結合した。このような免疫複合体は、部分又は薬剤を、α２又はα２β１インテグリンの存在を特徴とする特定の作用部位に対して標的化する方法において使用され得る。
【０１１４】
このような免疫複合体の生成において有用な化学療法剤は上に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらのフラグメントとしてはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）又はトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が挙げられる。様々な放射性核種が、放射複合体化された抗アルファ２インテグリン抗体の製造のために利用可能である。例としては、212 Ｂｉ、131Ｉｎ、90Ｙ又は186Ｒｅが挙げられる。
【０１１５】
抗体及び細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、又はビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素はＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように製造され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への結合のための例となるキレート剤である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。
【０１１６】
別の実施態様において、抗体は、α２インテグリンを発現する細胞、組織又は器官（ここで抗体−受容体複合体が患者に投与される）の予備標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）における利用のために受容体（例えばストレプトアビジン）に結合され得、続いて浄化剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して循環から未結合の複合体を除去し、次いで薬剤、例えば細胞傷害性薬剤（例えば放射性核種）に結合されるリガンド（例えばアビジン）を投与する。
【０１１７】
本明細書において開示される抗α２インテグリン抗体は、免疫リポソームとしても製剤化され得る。抗体を含有するリポソームは当該分野で公知の方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されるような方法により製造される。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６において開示される。
【０１１８】
ヒト化抗α２インテグリン抗体はまた、抗体をプロドラッグ−活性化酵素（これはプロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、例えばＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性薬物へと変換する）に結合することにより、抗体誘導性酵素プロドラッグ療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＤＥＰＴ）において使用され得る（例えば、ＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと）。
【０１１９】
酵素は、上で考察したヘテロ二重官能性架橋試薬の使用を含む当該分野で周知の技術により抗α２インテグリン抗体に共有結合で結合され得る。あるいは、酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された抗α２インテグリン抗体の少なくとも抗原に結合する領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
【０１２０】
ヒト化抗α２インテグリン抗体の共有結合の修飾は、例えば化学合成又は抗体の酵素的若しくは化学的切断により行われ得る。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。システイニル残基を、例えば最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。ヒスチジル残基は、例えば、ジエチルピロカーボネートがヒスチジル側鎖に比較的特異性であるので、ｐＨ５．５−７．０でのこの薬剤との反応により誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０にて行われる。リジニル及びアミノ末端残基を、例えば、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基の誘導体化のための他の適切な試薬としては、イミドエステル類、例えばピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。例えばアルギニル残基は、１つ又はいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫaのためにアルカリ条件で反応を行うことを必要とする。さらに、これらの試薬はリジンの基、さらにはアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。例えばチロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基中に導入することに特に興味を持って特異的に修飾される。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するために使用される。チロシル残基を125Ｉ又は131Ｉを使用してヨウ素化し、ラジオイムノアッセイにおける使用のための標識されたタンパク質を製造する。カルボキシル側基、例えばアスパルチル又はグルタミルは、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）、［ここでＲ及びＲ'は異なるアルキル基である］、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基へと変換される。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基になる。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に含まれる。他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１２１】
別の型の共有結合修飾は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素的なカップリングを含む。これらの手順は、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖（単数又は複数）が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのもの、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る（例えば、ＷＯ８７／０５３３０；Ａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）を参照のこと）。
【０１２２】
抗体に存在する炭水化物部分の除去は、例えば化学的又は酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物に曝露することを必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分又は全ての糖の切断を生じるが、抗体はインタクトなままである（例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）を参照のこと）。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る（例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）を参照のこと）。
【０１２３】
抗体の別の型の共有結合修飾は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つに抗体を連結させることを含む（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号又は同第４，１７９，３３７号を参照のこと）。
【０１２４】
ヒト化抗α２インテグリン抗体をコードする単離された核酸、さらにはこの核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに抗体の産生のための組み換え技術が本明細書に記載される。抗体の組み換え産生のために、抗体をコードする核酸（単数又は複数）を単離し、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター中に挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、そして従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、一般的には、限定されないが、以下のうちの１つ又はそれ以上を含む：シグナル配列、複製起点、１つ又はそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１２５】
抗α２インテグリン抗体は、好ましくは成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端における特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを含めて、組み換えにより産生され得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識されそしてプロセシングされる（例えばシグナルペプチドにより切断される）ものである。真核生物シグナル配列（例えば免疫グロブリンシグナル配列）を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、ペクチン酸リアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）（例えばｐｅｌＢ）、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーを含む原核生物シグナル配列により置換される。酵母分泌のためには酵母シグナル配列が利用され得、これらとしては、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロマイセス属及びクリベロマイセス属のα−因子リーダーを含む）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、又はＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルが挙げられる。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、さらにはウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが入手可能であり、利用され得る。このような前駆体領域のＤＮＡ（例えばシグナル配列）を抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームでライゲーションする。
【０１２６】
発現ベクター及びクローニングベクターは両方とも、ベクターが１つ又はそれ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的にクローニングベクターにおいて、この配列はベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にする配列であり、そして複製起点又は自己複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに関して周知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は典型的にはただそれが初期プロモーターを含有するという理由で使用され得る。
【０１２７】
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、又は（ｃ）複合培地から利用可能でない決定的な栄養素を供給する（例えばバシラス属に対してＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。
【０１２８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生し、従って選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例は薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、プロマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１２９】
哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの別の例は、抗α２インテグリン抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
【０１３０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で形質転換体を全て培養することにより最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１３１】
あるいは、抗α２インテグリン抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内在性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択可能なマーカーに対する選択剤（アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８を含む）を含有する培地における細胞増殖により選択され得る（例えば米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと）。
【０１３２】
酵母における使用のための１つの適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンが存在しない場合に増殖する能力のない酵母の変異系統のための選択マーカーを生じる、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１（例えば、Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７）を参照のこと）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷（ｌｅｓｉｏｎ）の存在が、トリプトファンが存在しない場合の増殖により形質転換を検出するための有効な環境を生じる。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母系統（ＡＴＣＣ ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０１３３】
さらに、１．６μ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターは、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換のために使用され得る。あるいは、組み換え仔牛キモシンの大規模製造のための発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓに関してＶａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（１９９０）により報告された。クリベロマイセス属の工業用菌株による成熟組み換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている（例えば、Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８−９７５（１９９１）を参照のこと）。
【０１３４】
発現ベクター及びクローニングベクターは、宿主生物に認識され、そして抗α２インテグリン抗体核酸に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されるプロモーターを通常は含有する。原核生物宿主とともに使用するために適したプロモーターとしては、アラビノースプロモーター（例えばａｒａＢ）、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適している。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０１３５】
プロモーター配列は真核生物に関して知られている。大部分の真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写始点から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列 はＣＮＣＡＡＴ領域［ここでＮはいずれのヌクレオチドであってもよい］である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加に関するシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。このような配列は真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【０１３６】
酵母宿主とともに使用するために適したプロモーター配列の例としては、限定されないが、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼについてのプロモーターが挙げられる。増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、並びにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクター及びプロモーターは、ＥＰ ７３，６５７にさらに記載される。酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１３７】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗α２インテグリン抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御されるが、ただしこのようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は米国特許第４，４１９，４４６号に開示され、そしてこの系の改変が米国特許第４，６０１，９７８号に記載される（単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関してＲｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照のこと）。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０１３８】
高等真核生物による抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによりしばしば増加される。多くのエンハンサー配列が現在では哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかししばしば、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサー（例えば、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関してＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）を参照のこと）。エンハンサーは抗α２インテグリン抗体コード配列に対して５’又は３’の位置でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。他の遺伝子調節系は当該分野で周知であり（例えば誘導性の系、例えばテトラサイクリン誘導系及びＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈTM）、抗α２インテグリンをコードするＤＮＡの転写を制御するために使用され得る。
【０１３９】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は一般的には真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'非翻訳領域（及び時折３'非翻訳領域）から入手可能である。これらの領域は、抗α２インテグリン抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチド区域を含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照のこと）。
【０１４０】
本明細書においてベクターでＤＮＡをクローニング又は発現させるための適切な宿主細胞は、上記のような原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的のために適切な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物を含む真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば大腸菌類、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、さらには桿菌、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びストレプトマイセスが挙げられる。適切なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が挙げられる。
【０１４１】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母は、抗アルファ２インテグリン抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、クリベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、クリベロマイセス・ウィッケルハミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クリベロマイセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、クリベロマイセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、又はクリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を含むクリベロマイセス属宿主；ヤロウイア（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及びニューロスポラ、ペニシリン、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）若しくはクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を含む糸状菌のような多数の他の属、種、及び系統が一般的に入手可能であり、かつ有用である。
【０１４２】
グリコシル化抗α２インテグリン抗体の発現に適した宿主細胞は多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異体、並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そしてこのようなウイルスは、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用され得る。
【０１４３】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養もまた宿主として利用され得る。
【０１４４】
しかし、脊椎動物細胞に最も興味が持たれており、そして様々な哺乳動物細胞を含む脊椎動物細胞の増殖は、慣用の手順になった。有用な哺乳動物宿主細胞の例としては：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎仔腎臓株２９３又は懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）を参照のこと）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲを欠損したＣＨＯ細胞を含む）（例えば、ＤＨＦＲ Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）を参照のこと）；マウスセルトリ細胞（（例えば、ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）を参照のこと）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；又はヒトヘパトーマ株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
【０１４５】
宿主細胞は、抗α２インテグリン抗体産生のための上記の発現ベクター又はクローニングベクターを用いて形質転換され、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、そして／又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切なように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１４６】
抗α２インテグリン抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；若しくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれかが宿主細胞のための培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬）、微量元素（通常はマイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を追加されてもよい。他の必要な栄養補助剤も、当業者に理解される適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、選択された宿主を用いて発現のために以前に使用された培養条件を含めて当業者により選択される。
【０１４７】
抗α２インテグリン抗体は、微生物又は哺乳動物細胞を含む細胞から、例えばプロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づいて抗体を精製するために使用され得る（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３）を参照のこと）。プロテインＧはマウスアイソタイプ及びヒトγ３に有用である（例えば、Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５１６−１５１７（１９８６）を参照のこと）。アフィニティリガンドが付着されるマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸTM（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製は、以下の技術の１つ又はそれ以上を含み得る、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥTMでのクロマトグラフィー、アニオン若しくはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー。例えば、いずれかの精製工程の後に、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨで溶離緩衝液を使用して、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることが有用であり得る。
【０１４８】
治療的投与のためのものを含む抗α２インテグリン抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容しうる担体、希釈剤、添加剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態で貯蔵のために製造される。許容しうる担体、希釈剤、添加剤又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類、若しくはグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮTM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTM又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。治療用途には、本発明の抗α２インテグリン抗体を例えば０，０３％Ｔｗｅｅｎ−８０TMを含有するリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化し得る。
【０１４９】
抗体製剤はまた、処置される特定の適応症に対して活性な化合物、好ましくは互いに不利な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを１つより多く含有してもよい。問題の障害を予防又は処置するために現在使用される１つ又はそれ以上の薬剤に加えて抗α２インテグリン抗体を使用することが望ましいかもしれない。さらに、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましいかもしれない。このような分子は意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１５０】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、それぞれコロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子又はナノカプセル）又はマクロエマルション（ｍａｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）で封入され得る。このような技術は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載される。
【０１５１】
インビボ投与のために使用するための製剤は好ましくは滅菌である。これは例えば滅菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。
【０１５２】
徐放性製剤が製造され得る。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形された物品の形態、例えばフィルム、又はマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔTM（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能マイクロスフェア）、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間で放出する。封入された抗体が体内に長時間残る場合、それらは３７℃で水分に曝される結果として変性又は凝集し得、生物活性の損失及び免疫原性の可能な変化を生じる。論理的な方策が含まれる機構に依存して安定化のために構築され得る。例えば、凝集機構はチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。
【０１５３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体の治療上の使用
抗α２インテグリン抗体は、本明細書に記載される様々なα２β１インテグリン関連障害を処置するために使用され得る。抗α２インテグリン抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、又は鼻腔内を含むいずれかの適切な手段により投与される。 局所免疫抑制処置が望まれる場合、抗体の病巣内投与（潅流又はそうでなければ移植片を移植前に抗体と接触させることを含む）が行われる。非経口投与としては、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。さらに、抗α２インテグリン抗体は、例えば抗体の漸減する用量を用いたパルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は注射により行われ、最も好ましくは静脈内又は皮下注射である。これは、投与が短時間又は慢性的のいずれであるかに一部依存し得る。より好ましくは、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体又は組成物は、本発明の方法において静脈内注入、静脈内ボーラス、皮下投与、皮下注入又は皮下ボーラスにより投与されるが、一方で（ｗｈｅｒａｓ）静脈内注入又は静脈内ボーラスが最も好ましい。用語「静脈内注入」は、薬物を動物又はヒト患者の静脈中に約５分よりも長い時間、好ましくは約３０〜９０分の間かけて導入することをさすが、本発明によれば、静脈内注入はあるいは１０時間又はそれ以下で投与される。用語「静脈内ボーラス」又は「静注（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｐｕｓｈ）」は、約１５分又はそれ以下、好ましくは５分又はそれ以下で薬物を身体に入れるように動物又はヒトの静脈中に薬物を投与することを指す。用語「皮下投与」は、動物又はヒト患者の皮膚の下に、好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内に、比較的ゆっくりと持続して薬物容器から送達することにより薬物を導入することを指す。このポケットは皮膚を下にある組織から上に離して挟むか引っ張ることにより作製され得る。用語「皮下注入」は、動物又はヒト患者の皮膚下に、好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内に、薬物容器から３０分若しくはそれ以下、又は９０分若しくはそれ以下を含むがこれらに限定されない時間の間、比較的ゆっくりと持続して送達することにより薬物を導入することを指す。用語「皮下ボーラス」は、ボーラス薬物送達が、好ましくは約１５分未満、より好ましくは５分未満、そして最も好ましくは６０秒未満である場合の、動物又はヒト患者の皮膚の下への薬物投与を指す。投与は好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内であり、この場合、ポケットは例えば皮膚を下にある組織の上に離して挟むか引っ張ることにより作製される。場合により、注入は、動物又はヒト患者の皮膚下に移植される薬物送達ポンプの皮下埋め込みにより行われ得、ここでポンプは所定の量の薬物を所定の期間の間、例えば３０分、９０分、又は処置計画の長さに及ぶ期間の間送達する。間欠性又は周期的な投薬は、特定の期間の間継続し、かつ好ましくは１日より長く一定間隔を空けられる投薬である。
【０１５４】
本明細書で同意語として使用される「治療有効量」又は「有効量」は、症状を寛解若しくは予防するか、又は処置される対象者の生存を延長させるために有効である、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体の量を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に記載される用語抗α２インテグリン抗体の「治療有効量」は、がん、例えば腫瘍成長を遅らせるか又は抑制するために必要な量を具体的に指す。
【０１５５】
α２β１インテグリン関連障害の予防又は処置については、抗体の適切な投薬量は、上で定義されるような処置しようとする疾患の型、疾患の重篤度及び経過、抗α２インテグリン抗体が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体への反応、並びに担当医の裁量に依存する。抗体は１回で、又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１５６】
従って抗α２インテグリン抗体は、対象者（好ましくはヒト）に、本発明の方法で、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量で投与され得る。好ましくは、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量、より好ましくは約３〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量が対象者、好ましくはヒトに投与される。ヒト化抗体又はその結合フラグメントの治療有効量は、１つ又はそれ以上の治療有効用量で対象者に投与され得る。
【０１５７】
α２β１インテグリン関連障害の予防又は処置については、抗体の適切な投薬量は、上で定義される処置しようとする疾患の型、疾患の重篤度及び経過、抗α２インテグリン抗体が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体への反応、並びに担当医の裁量に依存する。抗体は１回で、又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１５８】
α２β１インテグリン関連障害の型及び重篤度に依存して、例えば１回若しくはそれ以上の別々の投与によっても、又は持続注入によっても、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの抗体が対象者に投与するための最初の候補投薬量である。例えばヒトへの典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して０．１ｍｇ／ｋ〜２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。数日又はそれ以上にわたる反復投与については、状態に依存して、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで処置を持続する。しかし、他の投薬計画が有用かもしれず、例えば２週ごとに１回の用量計画は好ましいように思われる。この治療の進行は当業者により容易にモニタリングされる。
【０１５９】
抗α２インテグリン抗体組成物は、適した医療行為と整合するやり方で製剤化され、投薬され、そして投与される。この文脈で考慮される因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、薬理試験及び毒性試験からの結果、並びに医療実施者に公知の他の因子が挙げられる。投与しようとする抗体の治療有効量は、上述のことを考慮して決定され、そしてα２β１インテグリン関連障害を予防、寛解又は処置するために必要な最小量である。このような量は、好ましくは宿主に対して毒性であるか又は宿主を感染に対して有意により感受性にする量よりも少ない。
【０１６０】
抗α２インテグリン抗体は、問題となる障害を予防又は処置するために現在使用される１つ又はそれ以上の薬剤との補助的療法として、必ずしも必要でないが場合により製剤化されても、同時投与されても、使用されてもよい。例えば関節リウマチにおいて、抗体はグルココルチコステロイド、Ｒｅｍｉｃａｉｄ(R)又は関節リウマチについて承認されたいずれかの処置と関連して投与され得る。多発性硬化症については、インターフェロンβ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｃｏｐａｘｏｎ、又は多発性硬化症の徴候及び症状の処置のための他の認証された治療と関連して投与され得る。移植については、抗体は、シクロスポリンＡのような上で定義された免疫抑制剤と同時に、又は別々に、免疫抑制効果を調節するために投与され得る。あるいは、又はさらに、α２β１インテグリンアンタゴニストは、α２β１インテグリン関連障害に罹患している哺乳動物に投与され得る。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗α２インテグリン抗体の量、障害又は処置の型、及び上で考察された他の因子に依存する。これらは一般的に、同じ投薬量で、そして本明細書で以前に使用された投与経路で、又は従来使用される投薬量のおよそ１〜９９％で使用される。
【０１６１】
以下の実施例は例示のために提供されるのであり、限定のためではない。明細書中の全ての引用の開示は、参照により本明細書に明示的に加入される。
【実施例】
【０１６２】
実施例１：増強された補体媒介性エフェクター機能を有するヒト化抗アルファ２インテグリン抗体変異体
そこで記載されるヒト化抗α２インテグリン抗体は、抗α２（抗ＶＬＡ２）抗体の新規なサブグループを表し、これらは予期せずインビボ出血合併症がないこと、及び／又は血小板α２β１インテグリン活性化がないことを特徴とする。しかしＷＯ２００７／０５６８５８において開示されるＩｇＧ４抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣのようなエフェクター機能を有しておらず、これらは特定の状況下、例えばα２β１インテグリン関連がんの処置のためには望ましく、この場合この機能は、処置の増加した有効性をもたらし得る。従って、これらのエフェクター機能を高度に示す抗α２β１インテグリン抗体を開発することが望ましいだろう。
【０１６３】
ヒトＩｇＧの４つのアイソタイプは、エフェクター機能及び他の活性の効力において互いに異なる。一般に、効力の順位は、ＡＤＣＣについてＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、そしてＣＤＣについてＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２＝ＩｇＧ４である（Ｎｉｗａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；３０６：１５１−６０）。この研究において、ＷＯ２００７／０５６８５８に開示される１つの抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（重鎖配列番号５７、及び軽鎖配列番号５６を有する）を、天然に存在するヒト抗体アイソタイプ変異体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３；操作されたヒトＩｇＧ１アイソタイプ変異体、並びにヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ３アイソタイプ変異体のキメラからなる抗ＶＬＡ２抗体の新しいサブグループを作製するために使用した。全ての変異体を、オーバーラップＰＣＲアセンブリ法に基づく変異誘発技術により作製した。
【０１６４】
全長抗体変異体を生成するために、それぞれ新しく作製された重鎖ベクターを、軽鎖配列（配列番号５６）をコードする抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ｃＤＮＡを有しそして以下に記載される重鎖ベクターと同一の発現調節エレメントを有する同じ抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ベクターを用いてトランスフェクトした。結果として、新規な抗ＶＬＡ２抗体変異体の重鎖は、新規な全長抗体変異体を規定し；従って重鎖及び対応する全長抗体は同じ名称指定される。
【０１６５】
天然に存在するヒト抗体アイソタイプに基づく変異体
天然に存在するアイソタイプ変異体重鎖を作製するために、重鎖ヒンジ及び配列番号５７の定常ドメイン（そのＣ末端にに対してＫａｂａｔ残基１１９（配列番号５７における残基１２１に相当する））をコードする抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体のｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２２８．１、残基１からそのＣ末端までの配列）、ヒトＩｇＧ２（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２３０．１、残基１からそのＣ末端までの配列）、及びヒトＩｇＧ３（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１、残基２からそのＣ末端までの配列）のヒンジ及び定常ドメインについてのアミノ酸をコードする対応するｃＤＮＡ配列で置き換えた。これらの天然に存在する重鎖変異体が、その後それぞれ重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１（配列番号４４）、重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２（配列番号４５）、及び重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３（配列番号４６）と指定される新規な抗ＶＬＡ２抗体を規定する。
【０１６６】
ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ３ヒンジ−Ｆｃドメインシャフリングに基づく変異体
ヒトＩｇＧ３抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体と比較して一般的に増強されたＣＤＣを有し、これは部分的に、ＩｇＧ３ ＦｃがＩｇＧ１ Ｆｃより高いＣ１ｑ結合親和性を有するためである（Ｓｃｈｕｍａｋｅｒ ＶＮ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７６、１５：５１７５−８１）。増強されたＣＤＣを有する抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４のキメラを生成するために、ヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常ドメインとヒトＩｇＧ３のヒンジ及び定常ドメインとのシャフリングストラテジーに着手した。
２つのキメラを構築した。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４に基づく第一のキメラを、ＣＨ１及びヒトＩｇＧ１由来のヒンジをヒトＩｇＧ３のＦｃ部分に融合させるように操作し、そしてこれを本明細書では重鎖抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３（配列番号４７）と呼び；一方、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３に基づく第二の構築物を、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジをヒトＩｇＧ１由来のヒンジと置き換えるように操作し、この後者のキメラを本明細書では重鎖抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３（配列番号４８）と呼ぶ。
抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３重鎖ｃＤＮＡコード配列（配列番号４７）を作製するため、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１のための発現ベクター中のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインをコードする（Ｋａｂａｔ残基２３１からそのＣ末端までをコードする）抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１の重鎖ｃＤＮＡの一部を、ヒトＩｇＧ３重鎖遺伝子の対応する部分（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１、残基１６１〜３７７）と置き換えた。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３重鎖ｃＤＮＡコード配列（配列番号４８）については、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３重鎖についての発現ベクターにおけるヒンジ領域（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）をコードする抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３の重鎖ｃＤＮＡの部分を、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２２８．１）の対応する部分（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）と置き換えた。
【０１６７】
増強されたＣＤＣを有するアミノ酸変異抗ＶＬＡ２抗体
抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１の多数の変異体を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強させる目的で設計した。Ｆｃγ受容体とのＦｃ相互作用がＡＤＣＣを媒介するのと同様に、補体構成要素Ｃ１ｑとのＦｃ相互作用がＣＤＣを媒介する。現在Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に関して利用可能な３Ｄ構造は存在しないが、いくつかの研究は、ヒトＩｇＧ上のＣ１ｑに対する結合部位を、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１を中心とする領域に位置づけた（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００、１６４：４１７８−４１８４）。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１抗体について増強されたＣＤＣを媒介し得る変異体を調べるために、ＣＨ２ドメインのＤ２６９−Ｋ３３４領域においてアミノ酸修飾を設計した。
【０１６８】
これらの変異体ｃＤＮＡコード配列を作製するために、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１重鎖（配列番号４４）をコードするｃＤＮＡ、ｃＤＮＡを以下の置換を含むように変異させた：Ｓ３２４Ｎ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎと呼ばれる；配列番号４９）、Ｅ２６９Ｄ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄと呼ばれる；配列番号５０）、及びＳ２９８Ａ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａと呼ばれる；配列番号５１）。これらの点変異を対で組み合わせることによりさらなる変異体を作製した：Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａを組み合わせて本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（配列番号５２）と呼ばれる変異体を作製した；本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５３）と呼ばれる別の組み合わせはＥ２６９Ｄ及びＳ３２４Ｎからなる；本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５４）と呼ばれる第三の組み合わせは、Ｓ２９８Ａ及びＳ３２４Ｎの変異を組み合わせた。最後に、全ての３つの変異を加えて本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５５）と呼ばれる変異体を作製した。
【０１６９】
これらの変異体をコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）ベクターに基づくベクターにおいて連結した。この発現ベクターにおいて、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより分泌を促進させた。
【０１７０】
抗ＶＬＡ２抗体変異体の製造
一過性発現のために、等量の各ベクター重鎖（上記）及び抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して懸濁適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）中に同時トランスフェクトした。典型的には、１ｍｌあたり８０万〜１２０万細胞の密度で懸濁状態の細胞１００ｍｌを、変異重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及び発現ベクター軽鎖５０μｇを含有するＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を用いてトランスフェクトした。それぞれの操作された鎖の遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが宿主細胞中に導入される場合、細胞を４〜５日間さらに培養して、０．１％プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、４ｍＭグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌジェネティシンを補充した培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中への分泌を可能にすることにより構築物を製造した。次いでこの構築物を組み換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ媒体（ｍｅｄｉａ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して無細胞上清から精製し、そしてさらなる分析に使用した。
【０１７１】
これらの変異体のうちのいくつかの発現レベルを表１に列挙する。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】
ＨＴ１０８０細胞に対する補体媒介毒性
細胞ベースのアッセイを使用して、変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定した。
仔ウサギ補体による変異体−オプソニン化ＨＴ１０８０細胞の溶解をモニタリングするために乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を使用して溶解を測定した（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃ−００９９Ｆ、ＡＮ ＶＥＮＲＡＹ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。標的細胞（ＨＴ１０８０、ＡＴＴＣ(R)Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１）を完全培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び１％ Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））で遠心分離及び再懸濁により２回洗浄した。変異体−抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌで加えた。仔ウサギ血清を完全培地で７．５％まで希釈し、そして抗体−オプソニン化標的細胞に加えた。プレートを３時間３７℃でインキュベートした。
細胞傷害性を、Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【０１７４】
図１は、三つ組で行われたデータ±標準偏差を用いたこのアッセイの典型的な結果を示す。このアッセイにおいて、ＩｇＧ１コントロール（データ点１２番）又は親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（データ点１番）又は抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ２（データ点３番）抗体に起因する特異的な溶解はほとんど観測されなかった。後者の天然に存在するアイソタイプからはＣＤＣは全く期待されないか非常に低いレベルのＣＤＣしか期待されないが、ＩｇＧ１抗体アイソタイプはＩｇＧ４及びＩｇＧ２アイソタイプに勝るＣＤＣを有することが予測されていたので、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１（データ点２番）がＣＤＣの有意な増加をもたらさなかったことはむしろ驚くべきことである。Ｓ３２４Ｎ変異が存在する場合のみ、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎについて少なくとも６．４倍（データ点７番）、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎについて６．６倍（データ点１１番）、及び抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎについて９倍（データ点１０番）ＣＤＣが増加した。補体誘導溶解はまた、ヒトＩｇＧ３抗体アイソタイプ定常領域の構成要素を有する抗体変異体について大いに増加し、ＣＤＣは抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３について少なくとも５．６倍増加し（データ点５番）、そして抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３について少なくとも８．６倍増加した（データ点６番）。最大のＣＤＣの増加は、天然に存在する変異体抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３（データ点４番）について観察され、親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体に対して少なくとも９．６倍の増加であった。結論として、これらの結果は、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１抗体の状況におけるＳ３２４Ｎ変異は強力な補体誘導溶解を回復させることができ、一方で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３変異体はＣＤＣの誘発において抗ＶＬＡ２抗体変異体のうち最も強力であるということの証拠を提供した。
【０１７５】
実施例２：増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有するヒト化抗アルファ２インテグリン抗体変異体
実施例１におい記載される研究で調べられた抗ＶＬＡ２抗体変異体を、それらがＡＤＣＣを誘発する能力について評価した。
抗体のＡＤＣＣ活性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによりＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して測定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をクエン酸塩加全血から標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離により精製し、完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、２ｍＭ ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ １（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、及び１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に再懸濁し、そして終夜３７℃でインキュベートした。翌日に、遠心分離によりＰＢＭＣを集め、２回洗浄し、そして培地に８ｘ１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞株ＨＴ１０８０を標的細胞として使用した。ＨＴ１０８０細胞を２回洗浄し、そして完全培地に０．２ｘ１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。１．５μｇ／ｍｌで希釈された抗体５０マイクロリットルを、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ（図２）又は０．０１μｇ／ｍｌ（図３）で標的細胞５０μｌと混合し、そしてＵ底９６ウェルプレート中の等体積のＰＢＭＣに加えた。標的対エフェクター比１：４０を実験の間中使用した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離して無細胞上清の５０μｌサンプルを集めて、平底９６ウェルプレートに移し、そしてアッセイを行った。溶解パーセントを以下のように計算した：（サンプル放出−標的自発性放出−エフェクター自発性放出） ／（最大放出−標的自発性放出）＊１００；ここで標的自発性放出は、標的細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、エフェクター自発性放出は、エフェクター細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、そして最大放出は、溶解緩衝液で処理された標的細胞を含有するウェルからの蛍光である。抗体が存在しない場合（標的＋エフェクター細胞）に得られた溶解のバックグラウンドパーセントを、サンプルの溶解パーセントから差し引いた；示されるデータは、１つのドナーから単離されたＰＢＭＣを使用した三つ組のウェルの平均細胞傷害パーセント±標準偏差である。
【０１７６】
図２は、ＩｇＧ１コントロール抗体又は親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（それぞれデータ点１番及び１２番）に起因するほとんど特異的でないＡＤＣＣを示す；示されるデータは、抗ＶＬＡ２抗体の天然に存在するヒトＩｇＧ１アイソタイプがＶＬＡ−２+を発現する細胞に対して増強された細胞傷害性を有することを実証し、そしてより好ましくは、以下の効力の順位を有する抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１抗体点変異体を実証した：抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（データ点１１番；２倍増加）＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ（データ点８番；１．８倍増加）＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１（データ点２番；１．７倍増加）又は抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（データ点１０番；１．７倍増加） ＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ（データ点９番；１．５倍増加）。
【０１７７】
図３は、抗ＶＬＡ２抗体変異体について類似した順位のＡＤＣＣ効力が１０倍希釈の抗体において維持されたことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、α２β１インテグリンに特異的な抗体及びそれらの使用に関し、これには、ヒト化抗アルファ２（α２）インテグリン抗体及び抗α２インテグリン抗体を用いた処置方法が含まれる。より具体的には、本発明は、変化したエフェクター機能を示す、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域、及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インテグリンα２β１（最晩期抗原２；ＶＬＡ−２）は、血小板、血管内皮細胞、上皮細胞、活性化単球／マクロファージ、線維芽細胞、白血球、リンパ球、活性化好中球及びマスト細胞を含む様々な細胞型において発現される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。最も典型的なα２β１のリガンドとしてはコラーゲン及びラミニンが挙げられ、これらは両方とも細胞外マトリックスで見られる。典型的には、α２インテグリンのＩ−ドメインは二価カチオン依存性の様式でコラーゲンに結合するが、同じドメインは二価カチオン依存性及び非依存性の機構の両方によりラミニンに結合する。（非特許文献４） α２β１インテグリンの特異性は細胞型によって変わり、そして特定の細胞型にたいしてはコラーゲン及び／又はラミニン受容体として作用し、例えばα２β１インテグリンは血小板についてはコラーゲン受容体として、そして内皮細胞についてはラミニン受容体として知られる。（非特許文献５） エコーウイルス−１、デコリン、Ｅ−カドヘリン、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）、エンドレペリン（ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）及び複数のコレクチン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｓ）並びに補体Ｃ１ｑタンパク質もまたα２β１インテグリンのリガンドである。（非特許文献６） α２β１インテグリンはいくつかの生物学的及び病的過程に関与しており、これらとしては、コラーゲン誘発血小板凝集、コラーゲンでの細胞遊走、コラーゲン線維の細胞依存性再構成、さらにはサイトカイン発現及び増殖の増加を生じるコラーゲン依存性細胞応答、（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、Ｔ細胞、マスト細胞及び好中球の機能の局面（非特許文献１０；非特許文献１１、非特許文献３、非特許文献１２）、遅延型過敏症（ｈｙｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、接触過敏症及びコラーゲン誘発関節炎（非特許文献１３；非特許文献１４）、乳腺管形態形成（非特許文献１５；非特許文献１６）、表皮創傷治癒（非特許文献１７）、並びにＶＥＧＦ誘発新脈管形成に関連する過程（非特許文献１８）が挙げられる。
【０００３】
インテグリン／リガンド相互作用は、白血球の炎症組織への管外遊出を促進し得（非特許文献１９；非特許文献２０、非特許文献２１）、そして炎症性の刺激に応じた白血球の循環から組織への初期の管外遊出後の下流事象（炎症部位における炎症促進性細胞の遊走、動員及び活性化を含む）において役割を果たし得る（非特許文献２２）。α２β１インテグリンを遮断するいくつかの抗体は、遅延型過敏症応答に対する影響並びに関節リウマチのマウスモデル及び炎症性腸疾患モデルにおける有効性を示すと報告され（非特許文献１４；非特許文献１３）、そしてインビトロで内皮細胞増殖及び遊走を減衰させることが報告され（非特許文献１８）、α２β１インテグリンの遮断が、種々のがんにおいて観察される異常な又は通常よりも高い新脈管形成を予防／抑制し得るということを示唆した。
【０００４】
α２β１インテグリン（血小板上のα２β１インテグリンを含む）に結合する治療的抗体は出血の合併症を生じ得ると予測される。例えば、ＧＰＩｂ（非特許文献２３）又はＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）のような他の血小板受容体を標的とする抗体は血小板減少症を伴うが、この背後にある機構は十分に理解されていない。血小板受容体への抗体の結合はその三次元構造を変更し得、そして通常は露出していないエピトープを露出させ、次いでこれが血小板の排出をもたらすという仮説が立てられている（非特許文献２６）。実際に、ＧＰ ＩＩａ／ＩＩＩｂアンタゴニストの経口投与に伴う出血の合併症は、このクラスの化合物の「影の側面」として記載されている（非特許文献２７）。α２β１インテグリンが炎症組織を通る白血球の移動において重要な役割を果たす場合、がん、炎症性疾患及び自己免疫疾患を含む、疾患、α２β１インテグリン関連障害及び／又はこれらの障害に関連する細胞プロセスのためのα２β１を標的とし得る治療薬を開発することが、このような薬剤が血小板を活性化しない場合は望ましい。白血球上のα２β１インテグリンのようなα２β１インテグリンを標的とし得る、有害な出血合併症を伴わないヒト化抗体が特許文献１に記載される。そこに記載されるヒト化抗α２インテグリン抗体は抗α２抗体の新規なサブグループを代表し、これらは予期せずインビボ出血合併症がないこと及び／又は血小板α２β１インテグリン活性化がないことを特徴とする。しかし特許文献１において開示されるＩｇＧ４抗体はＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣのようなエフェクター機能を有しておらず、この機能は特定の状況、例えばがんのようなα２β１インテグリン関連障害の処置のためには望ましく、この場合、この機能は処置の増加した有効性をもたらす。従って、これらのエフェクター機能を高度に示す抗α２β１インテグリン抗体を開発することが望ましいだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５６８５８
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｍｌｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：３６５：３６５−４００（１９９９）
【非特許文献２】Ｗｕ ａｎｄ Ｓａｎｔｏｒｏ、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０６：１６９−１７１（１９９４）
【非特許文献３】Ｅｄｅｌｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．１０３（６）：２２１４−２０（２００４）
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．５：２７３−２８１（１９９８）
【非特許文献５】Ｄｉｃｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６６１−７６６８（１９９７）
【非特許文献６】Ｅｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０７（１）：１４３−５０（２００６）
【非特許文献７】Ｇｅｎｄｒｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４８６３３−４８６４３（２００３）
【非特許文献８】Ａｎｄｒｅａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：２８０４−２８１１（２００３）
【非特許文献９】Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（９）：４９３５−４０（２０００）
【非特許文献１０】Ｃｈａｎ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３９８−４０４（１９９１）
【非特許文献１１】Ｄｕｓｔｉｎ ａｎｄ ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：２８６−２９０（２００１）
【非特許文献１２】Ｗｅｒｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ ９５：１８０４−１８０９（２０００）
【非特許文献１３】ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：７２１− ７２０（２０００）
【非特許文献１４】Ｋｒｉｅｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０（１２）：１７７３−８２（２００２）
【非特許文献１５】Ｋｅｅｌｙ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：５９５−６０７（１９９５）
【非特許文献１６】Ｚｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（３）：９２７−９４０（１９９５）
【非特許文献１７】Ｐｉｌｃｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８１４５７−５４（１９９７）
【非特許文献１８】Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０（１）：１９５−２０４（２００２）
【非特許文献１９】Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３３５９−３３６８（１９９７）
【非特許文献２０】Ｇａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５（５５５７）：１０８６−９（２００２）
【非特許文献２１】Ｓｉｒｃａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０：２０５１−２０６６（２００２）
【非特許文献２２】Ｅｂｌｅ Ｊ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒ．Ｄｅｓ．１１（７）：８６７−８８０（２００５）
【非特許文献２３】Ｖａｎｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．３（２）：１２５−４０（２００３）
【非特許文献２４】Ｓｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８１：７６−７９（２００２）
【非特許文献２５】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ、Ｂｌｏｏｄ １０２（２）：４４９−４６１（２００３）
【非特許文献２６】Ｍｅｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：２２０３−２２０６（２００４）
【非特許文献２７】Ｂｈａｔｔ ａｎｄ Ｔｏｐｏｌ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２（１）：１５−２８（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、該変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該抗体は親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【０００８】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２β１インテグリン抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、上述の核酸を含むベクターを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、上述の核酸又は上述のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン又は上述の組成物、及び２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、対象者においてα２β１インテグリン関連障害を処置する方法を提供し、該方法は、対象者に治療有効量の上述の抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を投与することを含む。
【００１４】
本発明はさらに、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法を提供し、該方法は、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、上述の抗α２β１インテグリン抗体又は上述の組成物を対象者に投与することを含む。
【００１５】
本発明はさらに、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の、薬剤としての使用を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の使用を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための方法における使用のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、α２β１インテグリン関連障害の処置のための薬剤の製造のための、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物の使用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体を提供するが、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の細胞ベースのＣＤＣアッセイを示す：（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【図２】最終濃度０．１μｇ／ｍｌでの選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【図３】選択された抗ＶＬＡ２抗体変異体の最終濃度０．０１μｇ／ｍｌでの細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。（１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ４；（２）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１；（３）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２；（４）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３；（５）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１１３３；（６）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３１３３；（７）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎ；（８）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ、（９）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ；（１０）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１１）抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ；（１２）ＩｇＧ１コントロール；（１３）ネガティブコントロール−抗体無し。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示すヒト化抗α２インテグリン抗体に関する。
【００２２】
α２β１インテグリンは、アルファインテグリンファミリーからのα２インテグリンサブユニット、及びベータインテグリンファミリーからのβ１インテグリンサブユニットから構成される分子であり、そして哺乳動物を含むいずれの対象者由来でもよいが、好ましくはヒト由来である。α２β１インテグリンは、いずれかの天然供給源から精製されてもよく、合成的に製造されてもよい（例えば、組み換えＤＮＡ技術の使用により）。α２インテグリン及びβ１インテグリンについての配列をコードする核酸は、それぞれＴａｋａｄａ ａｎｄ Ｈｅｍｌｅｒ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９（１）：３９７−４０７（１９８９；ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｘ１７０３３；その後エントリーＮＭ ００２２０３に更新）及びＡｒｇｒａｖｅｓ、Ｗ．Ｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｅｐ １０５（３）：１１８３−９０（１９８７；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託Ｘ０７９７９．１及び選択的スプライシングされた変異体を表す関連する配列）に記載される。
【００２３】
α２β１インテグリン分子の「Ｉ」ドメインは、α２サブユニット内のこのα２β１インテグリン分子の領域を指し、そして例えばＫａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９６５９−９６６３（１９９４）；Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８５１２（１９９７）及びＣｅｌｌ １０１：４７（２０００）に記載される。α２インテグリンのＩドメインは、ＭＩＤＡＳ型のリガンド結合部位（金属イオン依存性接着部位（Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ））を含み、これはリガンド結合を支持するための所定の二価カチオンに対する要件及び特異性を有する。
【００２４】
α２インテグリン関連障害には、標的組織内で異常な細胞応答を媒介するα２インテグリン依存性のプロセス／機能（例えば、結合、活性）を含む障害、疾患又は状態が含まれる。疾患に含まれるα２インテグリン依存性プロセスの例としては、サイトカイン発現及び増殖における増加に関与するようなコラーゲン依存性細胞応答、Ｔ細胞機能、マスト細胞機能及び好中球機能の局面、炎症性障害、乳腺管形態形成、表皮創傷治癒、並びに新脈管形成が挙げられる。α２インテグリン関連障害の例としては、限定されないが、炎症性腸疾患（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）を含むがこれらに限定されない炎症性疾患、移植に対する反応（移植拒絶反応を含む）、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、多発性硬化症（それに伴う神経系続発症の処置、さらには再発を特徴とする多発性硬化症の処置を含む）、自己免疫疾患又は障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症を含む）、若年型糖尿病、及び異常な血管新生又は通常よりも増加した血管新生を伴う障害（例えば糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、関節リウマチ及びがん）、さらには炎症反応を誘発する感染症が挙げられる。
【００２５】
α２β１インテグリン関連障害の処置は、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体の治療的使用及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）使用の両方を含む。処置を必要とする者には、障害と既に診断された者に加えて、障害の発生を予防又は遅延させようとする者が含まれる。
【００２６】
用語「抗α２インテグリン抗体」又は「α２に結合する抗体」又は「α２インテグリンサブユニットに結合する抗体」又は「抗ＶＬＡ−２抗体」は、本明細書において同意語として使用され、そしてヒトα２インテグリンに結合する抗体、例えば固定化α２β１に５０ｎＭ又はそれ以下、好ましくは１０ｎＭ又はそれ以下、より好ましくは１ｎＭ又はそれ以下、特に０．５ｎＭ又はそれ以下の親和性（Ｋｄ）で結合する抗体、好ましくはヒト化ＩｇＧ抗体を含む。
【００２７】
本明細書において同意語として使用される用語「親ヒト化抗α２インテグリン抗体」又は「親抗α２インテグリン抗体」又は「親抗ＶＬＡ−２抗体」は、ヒトα２インテグリンに結合する抗体、例えば変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むように改変され得るヒト化ＩｇＧ１抗α２インテグリン抗体を意味する。親ヒト化抗α２インテグリン抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域におけるアミノ酸修飾を除いて、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体と同一であり、通常は天然ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を有する抗体である。アミノ酸修飾は、好ましくはアイソタイプではない。
【００２８】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は最も広い意味で使用され、そしてそれらが望ましい生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、及び多特異的抗体を網羅する。抗体又は免疫グロブリンという用語は、全長抗体、さらには抗原結合特性を有する（すなわちα２インテグリンに結合する）そのフラグメントも含む。用語「抗体」には、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合フラグメントが含まれる。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（本明細書においてＣＬと略される）から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）と呼ばれるより保存的な領域に組み入れられている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織又は因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む）への結合を媒介し得る。
【００２９】
本明細書で使用される用語「全長抗体」は、可変領域及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒト及びマウスを含む大部分の哺乳動物において、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、そして２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの軽鎖及び１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、そして各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１（Ｃ［ガンマ］１）、ＣＨ２（Ｃ［ガンマ］２）、及びＣＨ３（Ｃ［ガンマ］３）を含む。いくつかの哺乳動物において、例えばラクダ及びラマにおいて、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖のみからなるものであってもよく、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変ドメインを含む。
【００３０】
本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来するものである抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、そして定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含む。さらなるフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内、さらには別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内で作製され得る。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよい（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により導入された変異）。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図されない。
【００３３】
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団（例えばその集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除けば同一である）から得られた抗体を含む。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられたものである。さらに、典型的に抗原上の異なる決定基（例えばエピトープ）に対するものである異なる抗体を含む従来の（例えばポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の少なくとも単一の決定基に向けられたものである。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とするとは解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得、又は組み換えＤＮＡ法により作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。モノクローナル抗体はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体はまた、米国特許第６，０２５，１５５号及び同第６，０７７，６７７号、さらには米国特許出願公開第２００２／０１６０９７０号及び同第２００３／００８３２９３号（例えば、Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（２１）：０１７７（２００４）も参照のこと）に記載される技術を使用して単離することもできる。
【００３４】
超可変領域は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を含む。超可変領域は、相補性決定領域すなわちＣＤＲからのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））、及び／又は超可変ループからの残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）、並びに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。フレームワーク又はＦＲ残基は、超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書において記載される抗体については、ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、重鎖のＣＤＲ１がＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ定義により残基２６〜３５に及ぶと定義されることを除いて、Ｋａｂａｔ付番方式に基づいて識別される。Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ'ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｃｃｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃ０７ｓ／）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２０３、１２１−１５３（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、１、１２６（１９９２）；及びＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１４１−１７２．（１９９６））は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａ超可変領域付番方式を組み合わせてＣＤＲを定義する。
【００３５】
本明細書における用語「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を含む。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは変異ポリペプチドを指し、この場合は重鎖可変フレームワーク領域変異体であり、ここで位置９４のアルギニンがリジンで置き換えられる。前の例について、９４Ｋは位置９４のリジンでの置換を示す。本明細書における目的のために、複数の置換は典型的にはスラッシュで区切られる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは置換Ｒ９４Ｋ及びＬ７８Ｖを含む二重変異を指す。本明細書で使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置においてアミノ酸を加えること意味する。例えば、挿入−９４は位置９４での挿入を示す。本明細書において使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は位置９４におけるアルギニンの欠失を示す。
【００３６】
本発明において考察される全ての免疫グロブリン重鎖定常領域の位置について、番号付けはＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照により全体として加入される））におけるＥＵインデックスに従う。免疫グロブリン重鎖定常領域の位置の番号付けは、「Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式」又は「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」と呼ばれ、これは本明細書において同等に使用され、そしてＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う番号付けを示す。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、１９６９、ＰＮＡＳ ６３：７８−８５に記載されるヒトＩｇＧｌ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００３７】
抗体は、定常領域により遺伝学的に決定されるクラス（アイソタイプとも呼ばれる）に分類される。ヒト定常軽鎖はカッパ（ＣＫ）軽鎖及びラムダ（Ｃ［ラムダ］）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラスは治療目的のために最も一般的に使用される。ヒトにおいて、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいて、このクラスはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。ＩｇＭはＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。従って、本明細書で使用される「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的及び抗原性の特徴により定義される免疫グロブリンのクラス又はサブクラスのいずれかを意味する。公知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。
【００３８】
本明細書で使用される用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、第一定常領域免疫グロブリンドメインを除いて抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。従ってＦｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃ［ガンマ］２及びＣ［ガンマ］３）、並びにＣガンマｌ（Ｃ［ガンマ］ｌ）とＣガンマ２（Ｃ［ガンマ］２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。Ｆｃはこの領域のことを分離して指していてもよいし、Ｆｃポリペプチド、例えば抗体と関連してこの領域を指していてもよい。
【００３９】
本明細書で使用される「変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域」は、親ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とは少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」又は「変異Ｆｃ」又は「変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域」は、親Ｆｃ配列の配列とは少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なるＦｃ配列を意味する。変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドと比較して１つ又はそれ以上のアミノ酸修飾を含み、ここでこのアミノ酸修飾（単数又は複数）は、１つ又はそれ以上の最適化された特性を生じる。本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、アミノ酸配列において、その親ＩｇＧ１と少なくとも１つのアミノ酸修飾によって異なる。従って、本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＦｃ変異体は、親と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。あるいは、本発明の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親と比較して１つより多くのアミノ酸修飾を有し得、例えば定常領域免疫グロブリンドメイン全体の、又は好ましくは異なるアイソタイプの１つのアイソタイプのＦｃ領域の変換、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ領域のヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域への変換を含み得、これはヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体を生じる。修飾は、分子生物学を使用して遺伝子的に行われ得、又は酵素的若しくは化学的に行われ得る。
【００４０】
本発明のＦｃ変異体は、いずれかの免疫グロブリン遺伝子のいずれかのアロタイプ又は同型アロタイプ（ｉｓｏａｌｌｏｔｙｐｅ）により実質的にコードされ得る。好ましい実施態様において、本発明のＦｃ変異体は、Ｇ１ｍ（１）、Ｇ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（３）、Ｇ１ｍ（１７）、ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ ｍ（２）、及び／又はｎＧ１ ｍ（１７）として分類されるＩｇＧ１配列を含む抗体又はＦｃ融合において用途を見出す。従って、ＩｇＧＩアイソタイプの文脈において、本発明のＦｃ変異体は、位置２１４においてＬｙｓ（Ｇ１ｍ（１７））若しくはＡｒｇ（Ｇ１ｍ（３））、Ａｓｐ３５６／Ｌｅｕ３５８（Ｇ１ｍ（１））若しくはＧｌｕ３５６／Ｍｅｔ３５８（ｎＧ１ｍ（１））、及び／又は位置４３１においてＧＩｙ（Ｇ１ｍ（２））若しくはＡｌａ（ｎＧ１ｍ（２））を含み得る。
【００４１】
本明細書において使用される用語「アイソタイプ変異体」は、１つのアイソタイプの少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは１つのアイソタイプの重鎖定常領域の少なくとも１つのアミノ酸を、整列された異なるアイソタイプにおける対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、定常領域免疫グロブリンドメイン全体の、又は好ましくは異なるアイソタイプにおける１つのアイソタイプのＦｃ領域の変換、例えばヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体を生じるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ領域のヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域への変換を含み得る。
【００４２】
本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は、抗体の第一の定常ドメインと第二の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、そしてＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ位置２３７の残基で始まる。従ってＩｇＧについては、抗体ヒンジは位置２２１（ＩｇＧＩにおいてＤ２２１）〜位置２３１（ＩｇＧＩにおいてＡ２３１）を含むように本明細書において定義され、ここで番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従う。
【００４３】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を含む。本明細書で使用される用語「エフェクター機能」としては、ファゴサイトーシス、オプソニン作用、細胞結合、リセット、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｃ１ｑ結合、Ｆｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が挙げられる。好ましくは、エフェクター機能は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。エフェクター機能は、当該分野で公知であり市販されている標準的なインビトロアッセイにより測定される。通常、ＡＤＣＣは本出願の実施例２において記載されるような乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定され、そしてＣＤＣは、本出願の実施例１において記載される細胞ベースのアッセイにより測定される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「エフェクター機能を変更する」又は「変化したエフェクター機能を示す」は、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体、例えばヒト化抗α２インテグリン抗体が、親抗体と比較して増強されたエフェクター機能を示すこと、すなわち、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体のエフェクター機能は、親抗体のエフェクター機能より、１０％より多く、好ましくは２０％より多く、より好ましくは３０％より多く、最も好ましくは５０％より多く、特に６０％より多く、最も特定には７０％より多く高いということを含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、Ｆｃ［ガンマ］Ｒｓを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の反応を含む。種々の局面において、増強されたＡＤＣＣエフェクター機能は、増強された効力又は増強された有効性を意味し得る。実験の文脈において使用される「効力」は、特定の治療効果が観察される場合の抗体の濃度 ＥＣ５０（最大半量有効濃度）を意味する。実験の文脈において使用される「有効性」は、飽和レベルの抗体での最大の可能なエフェクター機能を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される用語「ＣＤＣ」又は「補体依存性細胞傷害」は、１つ又はそれ以上の補体タンパク質成分が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす反応を含む。
【００４７】
本明細書で使用される用語「対象者」はヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。好ましくは対象者はヒトである。
【００４８】
細胞傷害性薬剤には、細胞の機能を阻害若しくは防止し、かつ／又は細胞の破壊を引き起こす物質が含まれる。それら（Ｔｈｅ）には、放射性同位体（例えば131Ｉ、125Ｉ、90Ｙ及び186Ｒｅ）、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらのフラグメントが含まれ得る。非細胞傷害性薬剤は、細胞の機能を阻害も防止もせず、かつ／又は細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害性薬剤には、活性化されて細胞傷害性になることができる薬剤が含まれ得る。非細胞傷害性薬剤はビーズ、リポソーム、マトリックス又は粒子を含み得る（例えば、米国特許公開第２００３／００２８０７１号及び同第２００３／００３２９９５号（これらは参
照により本明細書に加入される）を参照のこと）。このような薬剤は、本明細書に記載される抗α２β１インテグリン抗体に結合、カップリング、連結又は付着され得る。
【００４９】
化学療法剤は、がんの処置において有用な化学化合物を指す。化学療法剤の例としては、限定されないが、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、シトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクレイスチン（Ｖｉｎｃｒｅｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン及び他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられる。
【００５０】
単離された核酸分子は、同定され、そして通常は供給源（例えば抗体核酸の天然供給源）中にある付随する少なくとも１つの混入核酸分子から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は状態以外のものである。従って単離された核酸分子は、天然細胞に存在するままの核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば核酸分子が天然細胞とは異なる染色体上の位置にある場合の、通常その抗体を発現する細胞中に含有する核酸分子を含む。
【００５１】
細胞、細胞株、及び細胞培養物は、しばしば交換可能に使用され、そして全てのこのような表示は子孫を含む。形質転換体及び形質転換された細胞（例えば、核酸、ベクター、ウイルスなどのトランスフェクション、形質転換又は形質導入により得られる）は、初代対象者細胞、及び移入（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）の数に関係なくそれらから誘導される培養物を含む。計画的又は偶発性の変異のために、全ての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一でなくてもよいということも理解される。元の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。別の表示が意図される場合、それは文脈から明らかだろう。
【００５２】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常（ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）ドメインを含むヒト化抗α２インテグリン抗体
本発明は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該抗体は親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す。
【００５３】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である。
【００５４】
一実施態様において、アイソタイプ変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号３５を含む。
【００５５】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である。
【００５６】
一実施態様において、アイソタイプ変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号３６を含む。
【００５７】
一局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【００５８】
一実施態様において、アミノ酸修飾は、２６９、２９８、及び３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換、好ましくはアミノ酸位置２９８及び／又は３２４におけるアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００５９】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、及びＳ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換、好ましくはアミノ酸置換Ｓ２９８Ａ及び／又はＳ３２４Ｎを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６０】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、２６９／２９８、２６９／３２４、２９８／３２４、及び２６９／２９８／３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換の組み合わせ（好ましくは２９８／３２４、又は２６９／２９８／３２４）を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６１】
別の実施態様において、アミノ酸修飾は、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせ（好ましくはＳ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ）を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される。
【００６２】
一実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３７〜４３からなる群より選択される配列を含む。
変更されるエフェクター機能は、通常は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又はＣ１ｑ結合及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又はＦｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性、好ましくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。ＣＤＣ、Ｃ１ｑ結合、ＡＤＣＣ、及びＦｃ［ガンマ］受容体に対する抗体の結合親和性は標準的なインビトロアッセイで測定され、これらは当該分野で公知であり、市販されている。通常、ＡＤＣＣは例えば本出願の実施例２において記載されるような乳酸デヒドドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイにより測定され、そしてＣＤＣは例えば本出願の実施例１において記載される細胞ベースのアッセイによる測定である。
【００６３】
好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む本開示のヒト化抗α２インテグリン抗体は、親ヒト化抗体と比較して、上記のようなインビトロアッセイにおいて改善されたＣＤＣを示す。本明細書で使用される「改善されたＣＤＣを示すこと（Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＤＣ）」又は「改善されたＣＤＣを示すこと（ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＤＣ）」は、ａ） 親抗体と比較して増強されたＣＤＣを示すこと、すなわち、親ヒト化抗α２インテグリン抗体が既にＣＤＣを示し、これがヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸修飾により増強されること、及びｂ） 親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して新たにＣＤＣを示すこと、すなわち親ヒト化抗α２インテグリン抗体はＣＤＣを示さず、それ故ＣＤＣはヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸修飾により新たに導入されたということを含む。
【００６４】
従って、さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供するが、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、そして該抗体は、親ヒト化抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。親ヒト化抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示すヒト化抗α２インテグリン抗体の好ましい変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、より好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３９、４２及び４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
一実施態様において、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体は、親ヒト化抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。親ヒト化抗体と同等のＡＤＣＣを示すことは、親ヒト化抗体のＡＤＣＣの±５０％、好ましくは±４０％、より好ましくは±３０％、最も好ましくは±２０％、特に±１０％のＡＤＣＣを含む。親抗体としてのＩｇＧ１抗体、例えばヒト化ＩｇＧ１抗α２インテグリン抗体がＡＤＣＣを示すことは公知である。しかし、ＩｇＧ１重鎖定常領域の改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる修飾、例えばアミノ酸の置換がＡＤＣＣに影響を有するかどうかは予測不可能である。従って、改善されたＣＤＣを示す、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む本発明のヒト化抗α２インテグリン抗体は、驚くべきことに親ヒト化抗体と同等のＡＤＣＣを示す。
【００６６】
さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、一方で該抗体は親ヒト化抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。親ヒト化抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示すヒト化抗α２インテグリン抗体の好ましい変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、より好ましくは、変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、配列番号３７、３８、４２及び４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
さらなる局面において、本開示は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体を提供し、ここで変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、ここでアミノ酸修飾は、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎであり、一方で該抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。
【００６８】
マウスモノクローナル抗体クローンＢＨＡ２．１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方からのＣＤＲを含む本発明の抗体が構築された（Ｈａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３１４２−３１４９（１９９６））。抗体を構築するための好ましい出発物質は、ヒトα２インテグリンに特異的な機能遮断抗体であり、かつ標的にされたα２インテグリン内のインタクトなＩ−ドメインの存在に結合及び活性が依存性である、ＢＨＡ２．１ハイブリドーマ（例えば、ＴＭＣ−２２０６）により分泌されるような抗α２インテグリン抗体である。ＴＭＣ−２２０６（又はＢＨＡ２．１）のエピトープ特異性を有するヒト化抗体が好ましく、これにはα２インテグリン分子の不活性コンホメーションに結合する抗体、及び／又はリガンド模倣物として作用しない抗体が含まれる。白血球及び血小板の両方に存在するα２β１インテグリンと相互作用するが、血小板活性化、コラーゲン上の活性化血小板の凝集不全を引き起こさず、出血に対して最小の効果しか有していないか若しくは効果を有しておらず、かつ／又は投与された濃度（インビボでの治療用量を含む）で出血合併症を伴わない、ＴＭＣ−２２０６（又はＢＨＡ２．１）のエピトープ特異性を有するヒト化抗体が好ましい。
【００６９】
従って、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７０】
アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７１】
アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに／又はアミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体もまた提供される。
【００７２】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、（ａ）位置７１がＬｙｓであるか、（ｂ）位置７３がＡｓｎであるか、（ｃ）位置７８がＶａｌであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、配列番号８〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７５】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
一実施態様において、上述の重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）を含むＦＷ４領域をさらに含む。
【００７７】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、（ａ）位置２がＰｈｅであるか、（ｂ）位置４５がＬｙｓであるか、（ｃ）位置４８がＴｙｒであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号２２〜３３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
一実施態様において、上述の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）を含むＦＷ４領域をさらに含む。
【００８２】
上述の変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、上述の重鎖及び軽鎖可変領域並びにヒト軽鎖定常領域を含む上述のヒト化抗α２インテグリン抗体がさらに提供される。
【００８３】
従って、さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４７を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８４】
さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４８を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８５】
さらなる実施態様において、抗α２インテグリン抗体は、配列番号４９〜５５からなる群より選択される重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む。
【００８６】
親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体がさらに提供されるが、該抗体は、改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す。
【００８７】
親抗体のアミノ酸位置３２４におけるセリンをアスパラギンと置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体がさらに提供されるが、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す。本抗体はさらに、親抗体のアミノ酸位置２６９におけるグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換Ｅ２６９Ｄ、及び／又は親抗体のアミノ酸位置２９８におけるセリンをアラニンと置き換える置換Ｓ２９８Ａを含み得る。本抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒト抗体からなる群より選択され得る。本抗体は、好ましくはヒト化抗体であり、より好ましくはヒト化抗α２インテグリン抗体である。
【００８８】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、ヒトα２インテグリンのＩドメインを認識する。
【００８９】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、α２β１インテグリンに結合する。
【００９０】
一実施態様において、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体は、α２又はα２β１インテグリンのα２β１インテグリンリガンドに対する結合を阻害する。通常、α２β１インテグリンリガンドは、コラーゲン、ラミニン、エコーウイルス−１、デコリン、Ｅ−カドヘリン、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）、エンドレペリン（ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）、コレクチン及び補体Ｃ１ｑタンパク質から選択され、そして好ましくはコラーゲンである。
【００９１】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター、及び該核酸又はベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【００９２】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物もまた提供される。
【００９３】
対象者におけるα２β１インテグリン関連障害を処置する方法もまた提供され、該方法は、対象者に治療有効量の上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を投与することを含む。α２β１インテグリン関連障害としては、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な血管新生又は増加した血管新生を特徴とする疾患が挙げられ、特に炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症、若年型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、がん、さらには炎症反応を誘発する感染であり、より特定の多発性硬化症、関節リウマチ、視神経炎及び脊髄外傷である。
【００９４】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物により処置され得るがんは、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜のがん、ヘパトーマ、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｏｒ ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん及び種々の型の頭頸部がん、さらには低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）を含むＢ細胞リンパ腫、さらには母斑症（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）に関連する異常血管増殖、脳腫瘍に関連する浮腫のような浮腫、メイグス症候群、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がんからなる群より選択される。本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体を使用して好ましく処置されるがんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カポージ肉腫、カルチノイドがん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。本発明の処置を受け入れやすい（ａｍｅｎｄｉｂｌｅ ｆｏｒ）がん性状態としては転移性がんが挙げられる。従って、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、肝臓がん、膵臓がん、軟部組織肉腫、カポージ肉腫、カルチノイドがん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、多発性骨髄腫、転移性結腸直腸がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはさらにより好ましい。非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、骨肉腫、類表皮がん、転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんは特に好ましい。非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、 肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、 転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはより特に好ましい。膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、線維肉腫、転移性結腸直腸がん、前立腺がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんはさらにより特に好ましい。膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、及び線維肉腫からなる群より選択されるがんは最も特に好ましい。膵臓がん、乳がん又は転移性乳がんは最も好ましく、特に膵臓がんが好ましい。前立腺がん又は転移性前立腺がんは等しく最も特に好ましい。本明細書で言及される「乳がん」は乳腺がんを含む。本発明の方法は、血管化腫瘍の処置に特に適している。
【００９５】
好ましくは、本方法は、（ａ）血小板活性化、（ｂ）血小板凝集、（ｃ）循環血小板数の減少、（ｄ）出血性合併症、又は（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせと関連づけられない。
【００９６】
コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、上述のヒト化抗α２インテグリン抗体を対象者に投与することを含む、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法も提供される。
【００９７】
上述のヒト化抗α２インテグリン抗体又は上述の組成物を従って（ａｃｃｏｒｄｉｎｇ）、及びα２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキットも提供される。
【００９８】
ヒト化抗α２インテグリン抗体及び複合体の構築
軽鎖可変領域のヒトアクセプター分子が、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の軽鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づいて選択される抗体が構築され得る。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、潜在的な免疫原性を低減するために好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列までを読み取る抗体配列で構成されている。ＦＷ４領域の選択については、選択された生殖系列分子から誘導された成熟抗体配列のデータベースを検索することが好ましく、そして組み換え抗体分子における使用のための適度に相同なＦＷ４領域を選択することも好ましい。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ軽鎖クラスから選択され、そしてマウスドナー分子の可変領域の同じ標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造クラスのものである。軽鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択に関する二次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースに対する相同性検索により選択され、そしてＫａｂａｔ、及び公開ＮＣＢＩデータベースのような他のデータベースも同様に使用され得る。ＴＭＣ−２２０６と同じか又は類似したエピトープ特異性及び／若しくは機能特性を有するヒト化抗α２インテグリン抗体については、好ましい軽鎖ヒトアクセプター分子は、ＦＷ１−３領域については生殖系列抗体配列Ａ１４、及びＦＷ４については配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）であり、これは成熟カッパ１軽鎖（例えば、軽鎖配列ＡＡＢ２４１３２（ＮＣＢＩエントリーｇｉ／２５９５９６／ｇｂ／ＡＡＢ２４１３２）の共通ＦＷ−４を表す。
【００９９】
重鎖可変領域のヒトアクセプター分子が、可能性のあるアクセプター分子可変領域とマウス抗体の重鎖可変領域との間の相同性の考慮に基づいて選択される抗体が構築され得る。生殖系列候補ヒトアクセプター分子は、潜在的な抗原性を低減するために好ましい。生殖系列データベースは、重鎖ＦＷ３領域の末端を通って部分的にＣＤＲ３配列までを読み取る抗体配列で構成されている。ＦＷ４領域の選択については、選択された生殖系列分子から誘導された成熟抗体配列のデータベースを検索することが好ましく、そして組み換え抗体分子における使用のために適度に相同なＦＷ４領域を選択することも好ましい。ヒトアクセプター分子は、好ましくはマウスドナー分子と同じ重鎖クラスから選択され、そしてマウスドナー分子の可変領域の同じ標準的構造クラスのものである。重鎖可変領域についてのヒトアクセプター分子の選択についての二次的な考慮は、マウスドナー分子とヒトアクセプター分子との間のＣＤＲ長における相同性を含む。ヒトアクセプター抗体分子は、好ましくはＶ−ＢＡＳＥデータベースに対する相同性検索により選択されるが、Ｋａｂａｔ及び公開ＮＣＢＩデータベースのような他のデータベースも同様に使用され得る。ＴＭＣ−２２０６と同じか又は類似するエピトープ特異性及び／若しくは機能特性を有する抗α２インテグリン抗体については、好ましい重鎖アクセプター分子は、ＦＷ１−３領域については生殖系列抗体配列４−５９、及びＦＷ４領域については抗体、ＣＡＡ４８１０４．１（ＮＣＢＩエントリー、ｇｉ／３３５８３／ｅｍｂ／ＣＡＡ４８１０４．１）、生殖系列配列４−５９から誘導される成熟抗体である（配列番号２０）。
【０１００】
モノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得、又は組み換えＤＮＡ法（例えば米国特許第６，２０４，０２３号）により作製され得る。モノクローナル抗体はまた、米国特許第６，０２５，１５５号及び同第６，０７７，６７７号、さらには米国特許出願公開第２００２／０１６０９７０号及び同第２００３／００８３２９３号（例えばＬｉｎｄｅｎｂａｕｍ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（２１）：０１７７（２００４）も参照のこと）に記載される技術を使用しても作製され得る。
【０１０１】
ヒト化抗α２β１インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をヒト化抗α２β１インテグリン抗体ＤＮＡに導入することにより、又はペプチド合成により製造される。このような変異体は、例えば、本発明の抗α２インテグリン抗体について示されるアミノ酸配列内の残基からの欠失、これらの残基への挿入及び／又はこれらの残基の置換を含む。アミノ酸の欠失、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせが、最終構築物に到達するために行われるが、ただし最終構築物は望ましい特徴を有する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数及び位置の変更のように、ヒト化抗α２インテグリン抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
【０１０２】
抗体をヒト又はヒト様にする（例えば「ヒト化」）ために使用される多数の方法がある。抗体をヒト化するためのアプローチは長年にわたって変化してきた。１つのアプローチはヒト定常領域に融合されたマウス可変領域、いわゆるマウス−ヒトＦｃキメラを生成することであった（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。別のアプローチは、ＣＤＲがそれらの超可変性（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７））、Ｋａｂａｔ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８））及び標準的構造（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−１７（１９８７）；Ｌａｚａｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：９２９（１９９７））に基づいて容易に同定され得、そして例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１（６０６９）：５２２−５（１９８６）；（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；米国特許第６，５４８，６４０号を参照のこと）により示されるように、単に非ヒトＣＤＲ領域（ドナーＣＤＲと呼ばれる）をヒトフレームワーク（アクセプターフレームワークと呼ばれる）上に移植することによりヒト化され得るということを利用する。６つのＣＤＲループがかたまって存在し、そして結晶解析に基づいて、ＣＤＲに隣接するか又は重鎖−軽鎖境界におけるいわゆるバーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」帯内の決定的なフレームワーク残基が容易に同定され得る（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６（３）：６５１−６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９）を参照のこと）。これらの残基は、６つのＣＤＲの正確な相対的定位を回復するためにマウス残基に復帰変異され得る（例えば、Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９（４８４７）：１５３４−６（１９８８）；Ｒｅｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（６１６２）：３２３−７（１９８８）；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（３）：２６６−７１（１９９１）を参照のこと）。可変領域は、マウスとヒトとの間に比較的高い相同性を有するファミリーに分類され得るので（例えば、Ｐａｓｃｕａｌ ａｎｄ Ｃａｐｒａ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：１−７４（１９９１）において概説される）、これらの初期の研究は、親和性の損失の可能性が、ヒトアクセプター分子としての使用のために目的のマウス抗体に対して最も高い相同性を有するヒト生殖系列配列を選択することにより、移植された抗体において最少にされ得るということも示した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｖｅｒｈｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９（４８４７）：１５３４−６（１９８８）を参照のこと）。
【０１０３】
非ヒトα２インテグリン抗体をヒト化するための方法は、例えばＷＯ２００７／０５６８５８に記載される。抗α２インテグリン抗体をヒト化するために、免疫化からの製造又は市販の抗体の購入を含めて、非ヒト抗体出発物質を入手する。本発明において使用される抗体をヒト化するため、例えばＴＭＣ−２２０６をヒト化するための例となる技術はＷＯ２００７／０５６８５８に記載される。
【０１０４】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換の領域における、例えばシート若しくはらせんコンホメーションのようなポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の体積の維持に対するそれらの効果において有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。ヒト化抗α２インテグリン抗体の適切な確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）の維持に関与しないいずれのシステイン残基も、分子の酸化的安定性を改善するため及び異常な架橋を防止するために、一般的にはセリンと置換され得る。反対に、システインの結合がその安定性を改善するために抗体に加えられ得る（特に抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１０５】
抗体の別の型のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更するということは、抗体において見られる１つ若しくはそれ以上の炭水化物部分を除去すること、及び／又は抗体に存在しない１つ若しくはそれ以上のグリコシル化部位を加えることを意味する。
【０１０６】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結又はＯ連結のいずれかである。Ｎ連結とは、炭水化物部位がアスパラギン残基の側鎖に結合することを指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン［ここでＸはプロリンを除くいずれかのアミノ酸である］は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合の認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じる。Ｏ連結グリコシル化は、糖Ｎ−アセイルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、又はキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０１０７】
抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、（Ｎ連結グリコシル化部位については）上記のトリペプチド配列の１つ又はそれ以上を含有するか又は欠くようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成され得る。この変更は、（Ｏ連結グリコシル化部位については）元の抗体の配列への１つ又はそれ以上のセリン又はスレオニン残基の付加、これらの残基での置換、又はこれらの残基の欠失によっても行われ得る。ヒト化抗α２インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の様々な方法により製造される。これらの方法としては、限定されないが、（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合は）天然供給源からの単離、又は前に製造された変異体若しくはヒト化抗α２インテグリン抗体の非変異バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異導入、若しくはカセット式変異誘発による製造が挙げられる。
【０１０８】
通常、ヒト化抗α２インテグリン抗体のアミノ酸配列変異体は、元のヒト化抗体アミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％を含む）のアミノ酸配列同一性を有する、重鎖又は軽鎖のいずれか（例えば、それぞれ配列番号１７又は配列番号３０におけるような可変領域配列）のアミノ酸配列を有する。この配列に関して同一性又は相同性は、本明細書において、必要な場合は最大の配列同一性パーセントを達成するように、そしていずれの保存的置換（上記のとおり）も配列同一性の一部として考慮せずに、配列を整列させてギャップを導入した後、候補配列中でヒト化抗α２インテグリン残基と同一であるアミノ酸残基のパーセントとして定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失又は挿入はどれも配列同一性にも相同性にも影響を及ぼさないと解釈されるものとする。従って、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に使用される標準的な方法により決定され得る。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを使用して、２つのポリペプチドを、（一方もしくは両方の配列の全長に沿って、又は一方若しくは両方の配列の所定の部分に沿って）それらのそれぞれのアミノ酸の最適なマッチングのために整列される。これらのプログラムは、デフォルトオープンペナルティ（ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティを提供し、そしてＰＡＭ２５０のようなスコアリングマトリクス（標準的なスコアリングマトリクス；Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ ５、ｓｕｐｐ．３（１９７８）を参照のこと）がコンピュータープログラムと共に使用され得る。例えば、同一性パーセントは：完全な一致の総数に１００をかけて、次いで一致した範囲内のより長い配列の長さ及び２つの配列を整列させるためにより長い配列中に導入されたギャップの数の合計で割ったものとして計算され得る（ｃａｎ ｔｈｅ ｂｅ）。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する多重特異性（例えば二重特異性）ヒト化抗α２インテグリン抗体を生成することが望ましいかもしれない。例となる二重特異性抗体（例えば、２つの異なる結合アームを有する）は、α２β１インテグリンタンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、抗α２インテグリンアームは、その表面に結合したα２β１インテグリンを有する細胞に対する細胞防御機構に集中するように、白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又はＩｇＧのＦｃ受容体（Ｆｃ(Ｒ）、例えばＦｃγＲ１（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組み合わせられ得る。二重特異性抗体は、それらの表面に結合したα２β１インテグリンを有する細胞に局在化した細胞傷害性薬剤に対して使用され得る。これらの抗体は、α２β１インテグリン結合アーム及び細胞傷害性薬剤（例えば、ゲロニン、サポリン、抗インターフェロンアルファ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、又は放射性同位体ハプテン）に結合するアームを有する。
【０１１０】
二重特異性抗体を作製するための別のアプローチにしたがって、一対の抗体分子間の接合部分は、組み換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にするように操作され得る。好ましい接合部分は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、１つ又はそれ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。置きな側鎖と等しいか又はより小さなサイズの代償性の（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二の抗体の接合部分に生成される。これが、ホモダイマーのような他の望まれない最終生成物よりもヘテロダイマーの収率を増加させるための機構を生じる（例えばＷＯ９６／２７０１１を参照のこと）。
【０１１１】
二重特異性抗体は、架橋した抗体又はヘテロ複合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体を含む。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の１つはアビジンとカップリングされ得、他方はビオチンにカップリングされ得る。ヘテロ複合体抗体は、いずれかの都合のよい架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、そして例えば米国特許第４，６７６，９８０号において多数の架橋技術とともに開示される。
【０１１２】
二価よりも多い抗体が考慮される。例えば、三重特異性抗体を製造することができる（例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照のこと）。
【０１１３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体を含む免疫複合体は、α２インテグリンを発現する細胞、組織又は組織に対して薬剤を標的化するために、部分、例えば、分子、組成物、複合体、又は薬剤、例えば化学療法剤のような細胞傷害性薬剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（例えば放射複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））に結合した。このような免疫複合体は、部分又は薬剤を、α２又はα２β１インテグリンの存在を特徴とする特定の作用部位に対して標的化する方法において使用され得る。
【０１１４】
このような免疫複合体の生成において有用な化学療法剤は上に記載されている。使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらのフラグメントとしてはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）又はトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が挙げられる。様々な放射性核種が、放射複合体化された抗アルファ２インテグリン抗体の製造のために利用可能である。例としては、212 Ｂｉ、131Ｉｎ、90Ｙ又は186Ｒｅが挙げられる。
【０１１５】
抗体及び細胞傷害性薬剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、又はビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素はＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように製造され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への結合のための例となるキレート剤である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。
【０１１６】
別の実施態様において、抗体は、α２インテグリンを発現する細胞、組織又は器官（ここで抗体−受容体複合体が患者に投与される）の予備標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）における利用のために受容体（例えばストレプトアビジン）に結合され得、続いて浄化剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を使用して循環から未結合の複合体を除去し、次いで薬剤、例えば細胞傷害性薬剤（例えば放射性核種）に結合されるリガンド（例えばアビジン）を投与する。
【０１１７】
本明細書において開示される抗α２インテグリン抗体は、免疫リポソームとしても製剤化され得る。抗体を含有するリポソームは当該分野で公知の方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）；並びに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されるような方法により製造される。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６において開示される。
【０１１８】
ヒト化抗α２インテグリン抗体はまた、抗体をプロドラッグ−活性化酵素（これはプロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、例えばＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性薬物へと変換する）に結合することにより、抗体誘導性酵素プロドラッグ療法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＤＥＰＴ）において使用され得る（例えば、ＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと）。
【０１１９】
酵素は、上で考察したヘテロ二重官能性架橋試薬の使用を含む当該分野で周知の技術により抗α２インテグリン抗体に共有結合で結合され得る。あるいは、酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された抗α２インテグリン抗体の少なくとも抗原に結合する領域を含む融合タンパク質は、当該分野で周知の組み換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
【０１２０】
ヒト化抗α２インテグリン抗体の共有結合の修飾は、例えば化学合成又は抗体の酵素的若しくは化学的切断により行われ得る。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより分子中に導入される。システイニル残基を、例えば最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応させてカルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。ヒスチジル残基は、例えば、ジエチルピロカーボネートがヒスチジル側鎖に比較的特異性であるので、ｐＨ５．５−７．０でのこの薬剤との反応により誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中でｐＨ６．０にて行われる。リジニル及びアミノ末端残基を、例えば、コハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基の誘導体化のための他の適切な試薬としては、イミドエステル類、例えばピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。例えばアルギニル残基は、１つ又はいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫaのためにアルカリ条件で反応を行うことを必要とする。さらに、これらの試薬はリジンの基、さらにはアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。例えばチロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応により、スペクトル標識をチロシル残基中に導入することに特に興味を持って特異的に修飾される。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンが、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するために使用される。チロシル残基を125Ｉ又は131Ｉを使用してヨウ素化し、ラジオイムノアッセイにおける使用のための標識されたタンパク質を製造する。カルボキシル側基、例えばアスパルチル又はグルタミルは、カルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ'）、［ここでＲ及びＲ'は異なるアルキル基である］、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基へと変換される。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基になる。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に含まれる。他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１２１】
別の型の共有結合修飾は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素的なカップリングを含む。これらの手順は、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖（単数又は複数）が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのもの、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る（例えば、ＷＯ８７／０５３３０；Ａｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）を参照のこと）。
【０１２２】
抗体に存在する炭水化物部分の除去は、例えば化学的又は酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は同等の化合物に曝露することを必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分又は全ての糖の切断を生じるが、抗体はインタクトなままである（例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）；Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）を参照のこと）。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用により達成され得る（例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）を参照のこと）。
【０１２３】
抗体の別の型の共有結合修飾は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのような様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つに抗体を連結させることを含む（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号又は同第４，１７９，３３７号を参照のこと）。
【０１２４】
ヒト化抗α２インテグリン抗体をコードする単離された核酸、さらにはこの核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに抗体の産生のための組み換え技術が本明細書に記載される。抗体の組み換え産生のために、抗体をコードする核酸（単数又は複数）を単離し、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター中に挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、そして従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、一般的には、限定されないが、以下のうちの１つ又はそれ以上を含む：シグナル配列、複製起点、１つ又はそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【０１２５】
抗α２インテグリン抗体は、好ましくは成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端における特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを含めて、組み換えにより産生され得る。選択された異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識されそしてプロセシングされる（例えばシグナルペプチドにより切断される）ものである。真核生物シグナル配列（例えば免疫グロブリンシグナル配列）を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は、例えば、ペクチン酸リアーゼ（ｌｙｓａｓｅ）（例えばｐｅｌＢ）、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーを含む原核生物シグナル配列により置換される。酵母分泌のためには酵母シグナル配列が利用され得、これらとしては、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロマイセス属及びクリベロマイセス属のα−因子リーダーを含む）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、又はＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルが挙げられる。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、さらにはウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが入手可能であり、利用され得る。このような前駆体領域のＤＮＡ（例えばシグナル配列）を抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレームでライゲーションする。
【０１２６】
発現ベクター及びクローニングベクターは両方とも、ベクターが１つ又はそれ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的にクローニングベクターにおいて、この配列はベクターが宿主染色体ＤＮＡとは無関係に複製することを可能にする配列であり、そして複製起点又は自己複製配列を含む。このような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに関して周知である。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、そして様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターには必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は典型的にはただそれが初期プロモーターを含有するという理由で使用され得る。
【０１２７】
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか、又は（ｃ）複合培地から利用可能でない決定的な栄養素を供給する（例えばバシラス属に対してＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）、タンパク質をコードする。
【０１２８】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生し、従って選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例は薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、プロマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１２９】
哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーの別の例は、抗α２インテグリン抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
【０１３０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で形質転換体を全て培養することにより最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０１３１】
あるいは、抗α２インテグリン抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内在性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、選択可能なマーカーに対する選択剤（アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８を含む）を含有する培地における細胞増殖により選択され得る（例えば米国特許第４，９６５，１９９号を参照のこと）。
【０１３２】
酵母における使用のための１つの適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンが存在しない場合に増殖する能力のない酵母の変異系統のための選択マーカーを生じる、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１（例えば、Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７）を参照のこと）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷（ｌｅｓｉｏｎ）の存在が、トリプトファンが存在しない場合の増殖により形質転換を検出するための有効な環境を生じる。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母系統（ＡＴＣＣ ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
【０１３３】
さらに、１．６μ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターは、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換のために使用され得る。あるいは、組み換え仔牛キモシンの大規模製造のための発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓに関してＶａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（１９９０）により報告された。クリベロマイセス属の工業用菌株による成熟組み換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている（例えば、Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８−９７５（１９９１）を参照のこと）。
【０１３４】
発現ベクター及びクローニングベクターは、宿主生物に認識され、そして抗α２インテグリン抗体核酸に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されるプロモーターを通常は含有する。原核生物宿主とともに使用するために適したプロモーターとしては、アラビノースプロモーター（例えばａｒａＢ）、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適している。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
【０１３５】
プロモーター配列は真核生物に関して知られている。大部分の真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写始点から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列 はＣＮＣＡＡＴ領域［ここでＮはいずれのヌクレオチドであってもよい］である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加に関するシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。このような配列は真核生物発現ベクター中に適切に挿入される。
【０１３６】
酵母宿主とともに使用するために適したプロモーター配列の例としては、限定されないが、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼについてのプロモーターが挙げられる。増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、並びにマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現における使用に適したベクター及びプロモーターは、ＥＰ ７３，６５７にさらに記載される。酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０１３７】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗α２インテグリン抗体の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御されるが、ただしこのようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は米国特許第４，４１９，４４６号に開示され、そしてこの系の改変が米国特許第４，６０１，９７８号に記載される（単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関してＲｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照のこと）。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０１３８】
高等真核生物による抗α２インテグリン抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによりしばしば増加される。多くのエンハンサー配列が現在では哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。しかししばしば、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサー（例えば、真核生物プロモーターの活性化のための増強エレメントに関してＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７−１８（１９８２）を参照のこと）。エンハンサーは抗α２インテグリン抗体コード配列に対して５’又は３’の位置でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。他の遺伝子調節系は当該分野で周知であり（例えば誘導性の系、例えばテトラサイクリン誘導系及びＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈTM）、抗α２インテグリンをコードするＤＮＡの転写を制御するために使用され得る。
【０１３９】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有する。このような配列は一般的には真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'非翻訳領域（及び時折３'非翻訳領域）から入手可能である。これらの領域は、抗α２インテグリン抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチド区域を含有する。１つの有用な転写終結構成要素は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である（例えば、ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示される発現ベクターを参照のこと）。
【０１４０】
本明細書においてベクターでＤＮＡをクローニング又は発現させるための適切な宿主細胞は、上記のような原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的のために適切な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物を含む真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば大腸菌類、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、例えば、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、及び赤痢菌、さらには桿菌、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びストレプトマイセスが挙げられる。適切なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）が挙げられる。
【０１４１】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母は、抗アルファ２インテグリン抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、クリベロマイセス・ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、クリベロマイセス・ウィッケルハミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クリベロマイセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、クリベロマイセス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、クリベロマイセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、又はクリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を含むクリベロマイセス属宿主；ヤロウイア（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及びニューロスポラ、ペニシリン、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）若しくはクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を含む糸状菌のような多数の他の属、種、及び系統が一般的に入手可能であり、かつ有用である。
【０１４２】
グリコシル化抗α２インテグリン抗体の発現に適した宿主細胞は多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異体、並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そしてこのようなウイルスは、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用され得る。
【０１４３】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養もまた宿主として利用され得る。
【０１４４】
しかし、脊椎動物細胞に最も興味が持たれており、そして様々な哺乳動物細胞を含む脊椎動物細胞の増殖は、慣用の手順になった。有用な哺乳動物宿主細胞の例としては：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（例えば、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎仔腎臓株２９３又は懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）を参照のこと）；ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲを欠損したＣＨＯ細胞を含む）（例えば、ＤＨＦＲ Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０）を参照のこと）；マウスセルトリ細胞（（例えば、ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）を参照のこと）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；又はヒトヘパトーマ株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。
【０１４５】
宿主細胞は、抗α２インテグリン抗体産生のための上記の発現ベクター又はクローニングベクターを用いて形質転換され、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、そして／又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切なように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１４６】
抗α２インテグリン抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；若しくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれかが宿主細胞のための培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬）、微量元素（通常はマイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を追加されてもよい。他の必要な栄養補助剤も、当業者に理解される適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、選択された宿主を用いて発現のために以前に使用された培養条件を含めて当業者により選択される。
【０１４７】
抗α２インテグリン抗体は、微生物又は哺乳動物細胞を含む細胞から、例えばプロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づいて抗体を精製するために使用され得る（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３）を参照のこと）。プロテインＧはマウスアイソタイプ及びヒトγ３に有用である（例えば、Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５１６−１５１７（１９８６）を参照のこと）。アフィニティリガンドが付着されるマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば制御孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸTM（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製は、以下の技術の１つ又はそれ以上を含み得る、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥTMでのクロマトグラフィー、アニオン若しくはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー。例えば、いずれかの精製工程の後に、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨで溶離緩衝液を使用して、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることが有用であり得る。
【０１４８】
治療的投与のためのものを含む抗α２インテグリン抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容しうる担体、希釈剤、添加剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性液剤の形態で貯蔵のために製造される。許容しうる担体、希釈剤、添加剤又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジン；単糖類、二糖類、若しくはグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮTM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳTM又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。治療用途には、本発明の抗α２インテグリン抗体を例えば０，０３％Ｔｗｅｅｎ−８０TMを含有するリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化し得る。
【０１４９】
抗体製剤はまた、処置される特定の適応症に対して活性な化合物、好ましくは互いに不利な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを１つより多く含有してもよい。問題の障害を予防又は処置するために現在使用される１つ又はそれ以上の薬剤に加えて抗α２インテグリン抗体を使用することが望ましいかもしれない。さらに、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましいかもしれない。このような分子は意図される目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１５０】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術により、又は界面重合により製造されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に、それぞれコロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子又はナノカプセル）又はマクロエマルション（ｍａｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）で封入され得る。このような技術は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載される。
【０１５１】
インビボ投与のために使用するための製剤は好ましくは滅菌である。これは例えば滅菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。
【０１５２】
徐放性製剤が製造され得る。徐放性製剤の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形された物品の形態、例えばフィルム、又はマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔTM（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能マイクロスフェア）、並びにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間で放出する。封入された抗体が体内に長時間残る場合、それらは３７℃で水分に曝される結果として変性又は凝集し得、生物活性の損失及び免疫原性の可能な変化を生じる。論理的な方策が含まれる機構に依存して安定化のために構築され得る。例えば、凝集機構はチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、水分含有量を制御すること、適切な添加剤を使用すること、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成され得る。
【０１５３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体の治療上の使用
抗α２インテグリン抗体は、本明細書に記載される様々なα２β１インテグリン関連障害を処置するために使用され得る。抗α２インテグリン抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、又は鼻腔内を含むいずれかの適切な手段により投与される。 局所免疫抑制処置が望まれる場合、抗体の病巣内投与（潅流又はそうでなければ移植片を移植前に抗体と接触させることを含む）が行われる。非経口投与としては、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。さらに、抗α２インテグリン抗体は、例えば抗体の漸減する用量を用いたパルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は注射により行われ、最も好ましくは静脈内又は皮下注射である。これは、投与が短時間又は慢性的のいずれであるかに一部依存し得る。より好ましくは、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体又は組成物は、本発明の方法において静脈内注入、静脈内ボーラス、皮下投与、皮下注入又は皮下ボーラスにより投与されるが、一方で（ｗｈｅｒａｓ）静脈内注入又は静脈内ボーラスが最も好ましい。用語「静脈内注入」は、薬物を動物又はヒト患者の静脈中に約５分よりも長い時間、好ましくは約３０〜９０分の間かけて導入することをさすが、本発明によれば、静脈内注入はあるいは１０時間又はそれ以下で投与される。用語「静脈内ボーラス」又は「静注（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｐｕｓｈ）」は、約１５分又はそれ以下、好ましくは５分又はそれ以下で薬物を身体に入れるように動物又はヒトの静脈中に薬物を投与することを指す。用語「皮下投与」は、動物又はヒト患者の皮膚の下に、好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内に、比較的ゆっくりと持続して薬物容器から送達することにより薬物を導入することを指す。このポケットは皮膚を下にある組織から上に離して挟むか引っ張ることにより作製され得る。用語「皮下注入」は、動物又はヒト患者の皮膚下に、好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内に、薬物容器から３０分若しくはそれ以下、又は９０分若しくはそれ以下を含むがこれらに限定されない時間の間、比較的ゆっくりと持続して送達することにより薬物を導入することを指す。用語「皮下ボーラス」は、ボーラス薬物送達が、好ましくは約１５分未満、より好ましくは５分未満、そして最も好ましくは６０秒未満である場合の、動物又はヒト患者の皮膚の下への薬物投与を指す。投与は好ましくは皮膚と下にある組織との間のポケット内であり、この場合、ポケットは例えば皮膚を下にある組織の上に離して挟むか引っ張ることにより作製される。場合により、注入は、動物又はヒト患者の皮膚下に移植される薬物送達ポンプの皮下埋め込みにより行われ得、ここでポンプは所定の量の薬物を所定の期間の間、例えば３０分、９０分、又は処置計画の長さに及ぶ期間の間送達する。間欠性又は周期的な投薬は、特定の期間の間継続し、かつ好ましくは１日より長く一定間隔を空けられる投薬である。
【０１５４】
本明細書で同意語として使用される「治療有効量」又は「有効量」は、症状を寛解若しくは予防するか、又は処置される対象者の生存を延長させるために有効である、本明細書に記載される抗α２インテグリン抗体の量を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮すれば十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に記載される用語抗α２インテグリン抗体の「治療有効量」は、がん、例えば腫瘍成長を遅らせるか又は抑制するために必要な量を具体的に指す。
【０１５５】
α２β１インテグリン関連障害の予防又は処置については、抗体の適切な投薬量は、上で定義されるような処置しようとする疾患の型、疾患の重篤度及び経過、抗α２インテグリン抗体が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体への反応、並びに担当医の裁量に依存する。抗体は１回で、又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１５６】
従って抗α２インテグリン抗体は、対象者（好ましくはヒト）に、本発明の方法で、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量で投与され得る。好ましくは、約１〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量、より好ましくは約３〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ治療有効量が対象者、好ましくはヒトに投与される。ヒト化抗体又はその結合フラグメントの治療有効量は、１つ又はそれ以上の治療有効用量で対象者に投与され得る。
【０１５７】
α２β１インテグリン関連障害の予防又は処置については、抗体の適切な投薬量は、上で定義される処置しようとする疾患の型、疾患の重篤度及び経過、抗α２インテグリン抗体が予防目的又は治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴及び抗体への反応、並びに担当医の裁量に依存する。抗体は１回で、又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【０１５８】
α２β１インテグリン関連障害の型及び重篤度に依存して、例えば１回若しくはそれ以上の別々の投与によっても、又は持続注入によっても、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの抗体が対象者に投与するための最初の候補投薬量である。例えばヒトへの典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して０．１ｍｇ／ｋ〜２０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。数日又はそれ以上にわたる反復投与については、状態に依存して、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで処置を持続する。しかし、他の投薬計画が有用かもしれず、例えば２週ごとに１回の用量計画は好ましいように思われる。この治療の進行は当業者により容易にモニタリングされる。
【０１５９】
抗α２インテグリン抗体組成物は、適した医療行為と整合するやり方で製剤化され、投薬され、そして投与される。この文脈で考慮される因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、薬理試験及び毒性試験からの結果、並びに医療実施者に公知の他の因子が挙げられる。投与しようとする抗体の治療有効量は、上述のことを考慮して決定され、そしてα２β１インテグリン関連障害を予防、寛解又は処置するために必要な最小量である。このような量は、好ましくは宿主に対して毒性であるか又は宿主を感染に対して有意により感受性にする量よりも少ない。
【０１６０】
抗α２インテグリン抗体は、問題となる障害を予防又は処置するために現在使用される１つ又はそれ以上の薬剤との補助的療法として、必ずしも必要でないが場合により製剤化されても、同時投与されても、使用されてもよい。例えば関節リウマチにおいて、抗体はグルココルチコステロイド、Ｒｅｍｉｃａｉｄ(R)又は関節リウマチについて承認されたいずれかの処置と関連して投与され得る。多発性硬化症については、インターフェロンβ、Ａｖｏｎｅｘ、Ｃｏｐａｘｏｎ、又は多発性硬化症の徴候及び症状の処置のための他の認証された治療と関連して投与され得る。移植については、抗体は、シクロスポリンＡのような上で定義された免疫抑制剤と同時に、又は別々に、免疫抑制効果を調節するために投与され得る。あるいは、又はさらに、α２β１インテグリンアンタゴニストは、α２β１インテグリン関連障害に罹患している哺乳動物に投与され得る。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗α２インテグリン抗体の量、障害又は処置の型、及び上で考察された他の因子に依存する。これらは一般的に、同じ投薬量で、そして本明細書で以前に使用された投与経路で、又は従来使用される投薬量のおよそ１〜９９％で使用される。
【０１６１】
以下の実施例は例示のために提供されるのであり、限定のためではない。明細書中の全ての引用の開示は、参照により本明細書に明示的に加入される。
【実施例】
【０１６２】
実施例１：増強された補体媒介性エフェクター機能を有するヒト化抗アルファ２インテグリン抗体変異体
そこで記載されるヒト化抗α２インテグリン抗体は、抗α２（抗ＶＬＡ２）抗体の新規なサブグループを表し、これらは予期せずインビボ出血合併症がないこと、及び／又は血小板α２β１インテグリン活性化がないことを特徴とする。しかしＷＯ２００７／０５６８５８において開示されるＩｇＧ４抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣのようなエフェクター機能を有しておらず、これらは特定の状況下、例えばα２β１インテグリン関連がんの処置のためには望ましく、この場合この機能は、処置の増加した有効性をもたらし得る。従って、これらのエフェクター機能を高度に示す抗α２β１インテグリン抗体を開発することが望ましいだろう。
【０１６３】
ヒトＩｇＧの４つのアイソタイプは、エフェクター機能及び他の活性の効力において互いに異なる。一般に、効力の順位は、ＡＤＣＣについてＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、そしてＣＤＣについてＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２＝ＩｇＧ４である（Ｎｉｗａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００５；３０６：１５１−６０）。この研究において、ＷＯ２００７／０５６８５８に開示される１つの抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（重鎖配列番号５７、及び軽鎖配列番号５６を有する）を、天然に存在するヒト抗体アイソタイプ変異体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３；操作されたヒトＩｇＧ１アイソタイプ変異体、並びにヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ３アイソタイプ変異体のキメラからなる抗ＶＬＡ２抗体の新しいサブグループを作製するために使用した。全ての変異体を、オーバーラップＰＣＲアセンブリ法に基づく変異誘発技術により作製した。
【０１６４】
全長抗体変異体を生成するために、それぞれ新しく作製された重鎖ベクターを、軽鎖配列（配列番号５６）をコードする抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ｃＤＮＡを有しそして以下に記載される重鎖ベクターと同一の発現調節エレメントを有する同じ抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ベクターを用いてトランスフェクトした。結果として、新規な抗ＶＬＡ２抗体変異体の重鎖は、新規な全長抗体変異体を規定し；従って重鎖及び対応する全長抗体は同じ名称指定される。
【０１６５】
天然に存在するヒト抗体アイソタイプに基づく変異体
天然に存在するアイソタイプ変異体重鎖を作製するために、重鎖ヒンジ及び配列番号５７の定常ドメイン（そのＣ末端にに対してＫａｂａｔ残基１１９（配列番号５７における残基１２１に相当する））をコードする抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体のｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２２８．１、残基１からそのＣ末端までの配列）、ヒトＩｇＧ２（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２３０．１、残基１からそのＣ末端までの配列）、及びヒトＩｇＧ３（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１、残基２からそのＣ末端までの配列）のヒンジ及び定常ドメインについてのアミノ酸をコードする対応するｃＤＮＡ配列で置き換えた。これらの天然に存在する重鎖変異体が、その後それぞれ重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ１（配列番号４４）、重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ２（配列番号４５）、及び重鎖抗ＶＬＡ２ ＩｇＧ３（配列番号４６）と指定される新規な抗ＶＬＡ２抗体を規定する。
【０１６６】
ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ３ヒンジ−Ｆｃドメインシャフリングに基づく変異体
ヒトＩｇＧ３抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体と比較して一般的に増強されたＣＤＣを有し、これは部分的に、ＩｇＧ３ ＦｃがＩｇＧ１ Ｆｃより高いＣ１ｑ結合親和性を有するためである（Ｓｃｈｕｍａｋｅｒ ＶＮ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７６、１５：５１７５−８１）。増強されたＣＤＣを有する抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４のキメラを生成するために、ヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常ドメインとヒトＩｇＧ３のヒンジ及び定常ドメインとのシャフリングストラテジーに着手した。
２つのキメラを構築した。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４に基づく第一のキメラを、ＣＨ１及びヒトＩｇＧ１由来のヒンジをヒトＩｇＧ３のＦｃ部分に融合させるように操作し、そしてこれを本明細書では重鎖抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３（配列番号４７）と呼び；一方、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３に基づく第二の構築物を、ヒトＩｇＧ３由来のヒンジをヒトＩｇＧ１由来のヒンジと置き換えるように操作し、この後者のキメラを本明細書では重鎖抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３（配列番号４８）と呼ぶ。
抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３重鎖ｃＤＮＡコード配列（配列番号４７）を作製するため、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１のための発現ベクター中のＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインをコードする（Ｋａｂａｔ残基２３１からそのＣ末端までをコードする）抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１の重鎖ｃＤＮＡの一部を、ヒトＩｇＧ３重鎖遺伝子の対応する部分（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１、残基１６１〜３７７）と置き換えた。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３重鎖ｃＤＮＡコード配列（配列番号４８）については、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３重鎖についての発現ベクターにおけるヒンジ領域（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０３６０４．１からのＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）をコードする抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３の重鎖ｃＤＮＡの部分を、ヒトＩｇＧ１重鎖遺伝子（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２２８．１）の対応する部分（ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）と置き換えた。
【０１６７】
増強されたＣＤＣを有するアミノ酸変異抗ＶＬＡ２抗体
抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１の多数の変異体を、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強させる目的で設計した。Ｆｃγ受容体とのＦｃ相互作用がＡＤＣＣを媒介するのと同様に、補体構成要素Ｃ１ｑとのＦｃ相互作用がＣＤＣを媒介する。現在Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体に関して利用可能な３Ｄ構造は存在しないが、いくつかの研究は、ヒトＩｇＧ上のＣ１ｑに対する結合部位を、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１を中心とする領域に位置づけた（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００、１６４：４１７８−４１８４）。抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１抗体について増強されたＣＤＣを媒介し得る変異体を調べるために、ＣＨ２ドメインのＤ２６９−Ｋ３３４領域においてアミノ酸修飾を設計した。
【０１６８】
これらの変異体ｃＤＮＡコード配列を作製するために、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１重鎖（配列番号４４）をコードするｃＤＮＡ、ｃＤＮＡを以下の置換を含むように変異させた：Ｓ３２４Ｎ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎと呼ばれる；配列番号４９）、Ｅ２６９Ｄ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄと呼ばれる；配列番号５０）、及びＳ２９８Ａ（本明細書では抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａと呼ばれる；配列番号５１）。これらの点変異を対で組み合わせることによりさらなる変異体を作製した：Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａを組み合わせて本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ（配列番号５２）と呼ばれる変異体を作製した；本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５３）と呼ばれる別の組み合わせはＥ２６９Ｄ及びＳ３２４Ｎからなる；本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５４）と呼ばれる第三の組み合わせは、Ｓ２９８Ａ及びＳ３２４Ｎの変異を組み合わせた。最後に、全ての３つの変異を加えて本明細書で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（配列番号５５）と呼ばれる変異体を作製した。
【０１６９】
これらの変異体をコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）ベクターに基づくベクターにおいて連結した。この発現ベクターにおいて、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより分泌を促進させた。
【０１７０】
抗ＶＬＡ２抗体変異体の製造
一過性発現のために、等量の各ベクター重鎖（上記）及び抗ＶＬＡ−２カッパ軽鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して懸濁適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）中に同時トランスフェクトした。典型的には、１ｍｌあたり８０万〜１２０万細胞の密度で懸濁状態の細胞１００ｍｌを、変異重鎖をコードする発現ベクター５０μｇ及び発現ベクター軽鎖５０μｇを含有するＤＮＡ−ＰＥＩ混合物を用いてトランスフェクトした。それぞれの操作された鎖の遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが宿主細胞中に導入される場合、細胞を４〜５日間さらに培養して、０．１％プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、４ｍＭグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌジェネティシンを補充した培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中への分泌を可能にすることにより構築物を製造した。次いでこの構築物を組み換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ媒体（ｍｅｄｉａ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して無細胞上清から精製し、そしてさらなる分析に使用した。
【０１７１】
これらの変異体のうちのいくつかの発現レベルを表１に列挙する。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】
ＨＴ１０８０細胞に対する補体媒介毒性
細胞ベースのアッセイを使用して、変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定した。
仔ウサギ補体による変異体−オプソニン化ＨＴ１０８０細胞の溶解をモニタリングするために乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を使用して溶解を測定した（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃ−００９９Ｆ、ＡＮ ＶＥＮＲＡＹ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。標的細胞（ＨＴ１０８０、ＡＴＴＣ(R)Ｎｏ．ＣＣＬ−１２１）を完全培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及び１％ Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））で遠心分離及び再懸濁により２回洗浄した。変異体−抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌで加えた。仔ウサギ血清を完全培地で７．５％まで希釈し、そして抗体−オプソニン化標的細胞に加えた。プレートを３時間３７℃でインキュベートした。
細胞傷害性を、Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【０１７４】
図１は、三つ組で行われたデータ±標準偏差を用いたこのアッセイの典型的な結果を示す。このアッセイにおいて、ＩｇＧ１コントロール（データ点１２番）又は親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（データ点１番）又は抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ２（データ点３番）抗体に起因する特異的な溶解はほとんど観測されなかった。後者の天然に存在するアイソタイプからはＣＤＣは全く期待されないか非常に低いレベルのＣＤＣしか期待されないが、ＩｇＧ１抗体アイソタイプはＩｇＧ４及びＩｇＧ２アイソタイプに勝るＣＤＣを有することが予測されていたので、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１（データ点２番）がＣＤＣの有意な増加をもたらさなかったことはむしろ驚くべきことである。Ｓ３２４Ｎ変異が存在する場合のみ、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ３２４Ｎについて少なくとも６．４倍（データ点７番）、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎについて６．６倍（データ点１１番）、及び抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎについて９倍（データ点１０番）ＣＤＣが増加した。補体誘導溶解はまた、ヒトＩｇＧ３抗体アイソタイプ定常領域の構成要素を有する抗体変異体について大いに増加し、ＣＤＣは抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−１１３３について少なくとも５．６倍増加し（データ点５番）、そして抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ−３１３３について少なくとも８．６倍増加した（データ点６番）。最大のＣＤＣの増加は、天然に存在する変異体抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３（データ点４番）について観察され、親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体に対して少なくとも９．６倍の増加であった。結論として、これらの結果は、抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ１抗体の状況におけるＳ３２４Ｎ変異は強力な補体誘導溶解を回復させることができ、一方で抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ３変異体はＣＤＣの誘発において抗ＶＬＡ２抗体変異体のうち最も強力であるということの証拠を提供した。
【０１７５】
実施例２：増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有するヒト化抗アルファ２インテグリン抗体変異体
実施例１におい記載される研究で調べられた抗ＶＬＡ２抗体変異体を、それらがＡＤＣＣを誘発する能力について評価した。
抗体のＡＤＣＣ活性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによりＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して測定した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をクエン酸塩加全血から標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離により精製し、完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、２ｍＭ ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ １（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｃｈｅｍｉｅ Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ ＡＧ、ＰＡＡ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、及び１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に再懸濁し、そして終夜３７℃でインキュベートした。翌日に、遠心分離によりＰＢＭＣを集め、２回洗浄し、そして培地に８ｘ１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞株ＨＴ１０８０を標的細胞として使用した。ＨＴ１０８０細胞を２回洗浄し、そして完全培地に０．２ｘ１０6細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。１．５μｇ／ｍｌで希釈された抗体５０マイクロリットルを、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ（図２）又は０．０１μｇ／ｍｌ（図３）で標的細胞５０μｌと混合し、そしてＵ底９６ウェルプレート中の等体積のＰＢＭＣに加えた。標的対エフェクター比１：４０を実験の間中使用した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離して無細胞上清の５０μｌサンプルを集めて、平底９６ウェルプレートに移し、そしてアッセイを行った。溶解パーセントを以下のように計算した：（サンプル放出−標的自発性放出−エフェクター自発性放出） ／（最大放出−標的自発性放出）＊１００；ここで標的自発性放出は、標的細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、エフェクター自発性放出は、エフェクター細胞のみを含有するウェルからの蛍光であり、そして最大放出は、溶解緩衝液で処理された標的細胞を含有するウェルからの蛍光である。抗体が存在しない場合（標的＋エフェクター細胞）に得られた溶解のバックグラウンドパーセントを、サンプルの溶解パーセントから差し引いた；示されるデータは、１つのドナーから単離されたＰＢＭＣを使用した三つ組のウェルの平均細胞傷害パーセント±標準偏差である。
【０１７６】
図２は、ＩｇＧ１コントロール抗体又は親抗ＶＬＡ−２ ＩｇＧ４抗体（それぞれデータ点１番及び１２番）に起因するほとんど特異的でないＡＤＣＣを示す；示されるデータは、抗ＶＬＡ２抗体の天然に存在するヒトＩｇＧ１アイソタイプがＶＬＡ−２+を発現する細胞に対して増強された細胞傷害性を有することを実証し、そしてより好ましくは、以下の効力の順位を有する抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１抗体点変異体を実証した：抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（データ点１１番；２倍増加）＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｓ２９８Ａ（データ点８番；１．８倍増加）＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１（データ点２番；１．７倍増加）又は抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ（データ点１０番；１．７倍増加） ＞抗ＶＬＡ２−ＩｇＧ１−Ｅ２６９Ｄ（データ点９番；１．５倍増加）。
【０１７７】
図３は、抗ＶＬＡ２抗体変異体について類似した順位のＡＤＣＣ効力が１０倍希釈の抗体において維持されたことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体であって、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、そして該抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す、上記ヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体
【請求項４】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項５】
アミノ酸修飾が、２６９、２９８、及び３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項６】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、及びＳ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項７】
アミノ酸修飾が、２６９／２９８、２６９／３２４、２９８／３２４、及び２６９／２９８／３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項８】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項９】
エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１０に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１２】
アミノ酸修飾が、Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換であり、抗体が親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１４】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換であり、抗体が親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１５】
アミノ酸修飾が、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎであり、抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して、改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１６】
配列番号３５を含む変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１７】
配列番号３６を含む変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項３に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１８】
配列番号３７〜４３からなる群より選択される変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項４に記載のヒト抗α２インテグリン抗体。
【請求項１９】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項にヒト化抗体。
【請求項２０】
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含み；かつ／又は
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
重鎖可変領域は、（ａ）位置７１がＬｙｓであるか、（ｂ）位置７３がＡｓｎであるか、（ｃ）位置７８位がＶａｌであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２４】
重鎖可変領域が、配列番号８〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２５】
重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２６】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）を含むＦＷ４領域をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２７】
軽鎖可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２８】
軽鎖可変領域は、（ａ）位置２がＰｈｅであるか、（ｂ）位置４５がＬｙｓであるか、（ｃ）位置４８がＴｙｒであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２９】
軽鎖可変領域が、配列番号２２〜３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３０】
軽鎖可変領域が配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３１】
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）を含むＦＷ４領域をさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３２】
配列番号４７を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３３】
配列番号４８を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３４】
配列番号４９〜５５からなる群より選択される重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２β１インテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３５に記載の核酸又は請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項３９】
対象者においてα２β１インテグリン関連障害を処置する方法であって、対象者に治療有効量の請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項４０】
α２β１インテグリン関連障害が、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び異常な血管新生又は増加した血管新生を特徴とする疾患から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
α２β１インテグリン関連障害が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、若年型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、がん、さらには炎症反応を誘発する感染から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
α２β１インテグリン関連障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、視神経炎及び脊髄外傷から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
α２β１インテグリン関連障害が、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん及び種々の型の頭頸部がん、さらには低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）を含むＢ細胞リンパ腫、さらには母斑症に関連する異常血管増殖、脳腫瘍に関連する浮腫のような浮腫、メイグス症候群、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
α２β１インテグリン関連障害が、非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がん、転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
α２β１インテグリン関連障害が、膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、線維肉腫、転移性結腸直腸がん、前立腺がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）血小板活性化、（ｂ）血小板凝集、（ｃ）循環血小板数の減少、（ｄ）出血性合併症、又は（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせを伴なわない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法であって、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗α２β１インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物を対象者に投与することを含む、上記方法。
【請求項４８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の、薬剤としての使用。
【請求項４９】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の、α２β１インテグリン関連障害の処置のための使用。
【請求項５０】
α２β１インテグリン関連障害の処置のための方法における使用のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物。
【請求項５１】
α２β１インテグリン関連障害の処置のための薬剤の製造のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物、及びα２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキット。
【請求項５３】
親抗体のアミノ酸位置３２４においてセリンをアスパラギンに置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体であって、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、抗体。
【請求項５４】
親抗体のアミノ酸位置２６９におけるグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換Ｅ２６９Ｄ、及び親抗体のアミノ酸位置２９８におけるセリンをアラニンと置き換える置換Ｓ２９８Ａをさらに含む、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項５３又は５４に記載の抗体。
【請求項５６】
ヒト化抗α２インテグリン抗体である、請求項５３又は５４に記載の抗体。
【請求項１】
重鎖可変領域、軽鎖可変領域、ヒト軽鎖定常領域及び変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含むヒト化抗α２インテグリン抗体であって、変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、そして該抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して変化したエフェクター機能を示す、上記ヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ及びヒトＩｇＧ３由来のＦｃ領域を含むアイソタイプ変異体である、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体
【請求項４】
変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項５】
アミノ酸修飾が、２６９、２９８、及び３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項６】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、及びＳ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項７】
アミノ酸修飾が、２６９／２９８、２６９／３２４、２９８／３２４、及び２６９／２９８／３２４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項８】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ、Ｅ２６９Ｄ／Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含み、ここで群の各メンバーのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔにおいて示される付番方式を利用して示される、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項９】
エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１１】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１０に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１２】
アミノ酸修飾が、Ｓ３２４Ｎ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換であり、抗体が親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１３】
ヒト化抗α２インテグリン抗体が、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と同等の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項１２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１４】
アミノ酸修飾が、Ｅ２６９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ、及びＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎからなる群より選択されるアミノ酸置換であり、抗体が親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１５】
アミノ酸修飾が、アミノ酸置換Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎ又はＥ２６９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｓ３２４Ｎであり、抗体は、親ヒト化抗α２インテグリン抗体と比較して、改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、請求項４に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１６】
配列番号３５を含む変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１７】
配列番号３６を含む変異ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項３に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項１８】
配列番号３７〜４３からなる群より選択される変異ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項４に記載のヒト抗α２インテグリン抗体。
【請求項１９】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項にヒト化抗体。
【請求項２０】
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＧＦＳＬＴＮＹＧＩＨ（配列番号１）を含むＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＩＷＡＲＧＦＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２）を含むＨＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＡＮＤＧＶＹＹＡＭＤＹ（配列番号３）を含むＨＣＤＲ３を含み；かつ／又は
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＳＡＱＳＳＶＮＹＩＨ（配列番号４）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＷＴＴＮＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
重鎖可変領域は、（ａ）位置７１がＬｙｓであるか、（ｂ）位置７３がＡｓｎであるか、（ｃ）位置７８位がＶａｌであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２４】
重鎖可変領域が、配列番号８〜１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２５】
重鎖可変領域が配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２６】
重鎖可変領域が、アミノ酸配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）を含むＦＷ４領域をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２７】
軽鎖可変領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２８】
軽鎖可変領域は、（ａ）位置２がＰｈｅであるか、（ｂ）位置４５がＬｙｓであるか、（ｃ）位置４８がＴｙｒであるか、又は（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせである配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項２９】
軽鎖可変領域が、配列番号２２〜３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３０】
軽鎖可変領域が配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３１】
軽鎖可変領域が、アミノ酸配列ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３４）を含むＦＷ４領域をさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３２】
配列番号４７を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３３】
配列番号４８を含む重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３４】
配列番号４９〜５５からなる群より選択される重鎖及び配列番号５６を含む軽鎖を含む、請求項１に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２β１インテグリン抗体をコードする単離された核酸。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３７】
請求項３５に記載の核酸又は請求項３６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体及び薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
【請求項３９】
対象者においてα２β１インテグリン関連障害を処置する方法であって、対象者に治療有効量の請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項４０】
α２β１インテグリン関連障害が、炎症性疾患、自己免疫疾患、及び異常な血管新生又は増加した血管新生を特徴とする疾患から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
α２β１インテグリン関連障害が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、若年型糖尿病、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、心血管疾患、乾癬、がん、さらには炎症反応を誘発する感染から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
α２β１インテグリン関連障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、視神経炎及び脊髄外傷から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
α２β１インテグリン関連障害が、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む肺がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん又は腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がん及び種々の型の頭頸部がん、さらには低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）を含むＢ細胞リンパ腫、さらには母斑症に関連する異常血管増殖、脳腫瘍に関連する浮腫のような浮腫、メイグス症候群、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
α２β１インテグリン関連障害が、非小細胞肺がん、膵臓がん、神経繆芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、前立腺がん、転移性前立腺がん、中皮腫、線維肉腫、骨肉腫、及び類表皮がん、転移性結腸直腸がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
α２β１インテグリン関連障害が、膵臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、線維肉腫、転移性結腸直腸がん、前立腺がん、転移性前立腺がん及び転移性乳がんからなる群より選択されるがんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）血小板活性化、（ｂ）血小板凝集、（ｃ）循環血小板数の減少、（ｄ）出血性合併症、又は（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせを伴なわない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するための方法であって、コラーゲンに対する白血球の結合を阻害するために有効な量の、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の抗α２β１インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物を対象者に投与することを含む、上記方法。
【請求項４８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の、薬剤としての使用。
【請求項４９】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の、α２β１インテグリン関連障害の処置のための使用。
【請求項５０】
α２β１インテグリン関連障害の処置のための方法における使用のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物。
【請求項５１】
α２β１インテグリン関連障害の処置のための薬剤の製造のための、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のヒト化抗α２インテグリン抗体又は請求項３８に記載の組成物、及びα２β１インテグリン関連障害の処置のための指示書を含むキット。
【請求項５３】
親抗体のアミノ酸位置３２４においてセリンをアスパラギンに置き換えるアミノ酸置換Ｓ３２４Ｎを含む変異ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体であって、該抗体は、親抗体と比較して改善された補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す、抗体。
【請求項５４】
親抗体のアミノ酸位置２６９におけるグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換Ｅ２６９Ｄ、及び親抗体のアミノ酸位置２９８におけるセリンをアラニンと置き換える置換Ｓ２９８Ａをさらに含む、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項５３又は５４に記載の抗体。
【請求項５６】
ヒト化抗α２インテグリン抗体である、請求項５３又は５４に記載の抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５２０１９４（Ｐ２０１３−５２０１９４Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４４３３（Ｐ２０１２−５５４４３３）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００３４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４６０４
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００３４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４６０４
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０４４５６７９８）サノフイ (433)
【Ｆターム（参考）】
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