抗イディオタイプ抗体を得る方法
【課題】自己免疫疾患関連自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）（自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））の１イディオタイプを模倣する分子の同定方法。
【解決手段】該方法は、以下の段階、すなわち（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞をアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分を除去すること；（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに（ｅ）該分子ライブラリーと抗Ｉｄを接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体の１イディオタイプを模倣する分子である）を含んでなる。
【解決手段】該方法は、以下の段階、すなわち（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞をアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分を除去すること；（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに（ｅ）該分子ライブラリーと抗Ｉｄを接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体の１イディオタイプを模倣する分子である）を含んでなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性自己抗体を模倣する合成分子の選択のための一ツールとして、および自己免疫疾患における治療的使用のための特異的抗体の単離のための一供給源としての、プールした血漿から精製した免疫グロブリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症（ＭＧ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のような自己免疫疾患は、自己成分を認識かつ攻撃するように個体の免疫系が始動される場合に発生する。例えば、ＳＬＥは典型的な異常な臨床検査値を伴う軽度の臨床所見から生命を脅かす状態までの範囲にわたる非常に多彩な臨床症状発現を伴う多系自己免疫疾患である。臨床検査値異常は、夥しい組織抗原に対する自己抗体の高力価を包含する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、核タンパク質およびタンパク質−核複合体のような細胞核の成分に対し向けられるものが最も特徴的である。ＳＬＥの臨床経過は高度に変動性かつ予測不可能であり、寛解および再発の期間を頻繁に伴う。
【０００３】
ＳＬＥを伴う患者の生存は、主としてコルチコステロイドおよび細胞傷害性薬物の使用により、過去数十年にわたって顕著に改善した。こうした医薬は強力な抗炎症および免疫調節効果を有する一方、それらの使用は免疫抑制、骨髄抑制および／若しくは多数の他の頻繁な副作用により厳しく制限されている。この障害のための免疫調節療法の安全かつ効率的な一様式はなお欠如している。
【０００４】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は何千名もの健康な血液供与者から収集したプールしたヒト血漿から製造した高度に精製されたＩｇＧ製剤である。ＩＶＩＧは自己免疫疾患に罹っている患者の臨床的改善を生じさせ得ることが既知である。高用量の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の投与は免疫調節性であるがしかし免疫抑制的若しくは骨髄傷害性でない。ＩＶＩＧは動物モデルおよびヒトにおいてＳＬＥを調節することが可能であるのみならず、しかしそれはまた感染を助長するよりはむしろそれに対する防禦も提供しうる。しかしながら、ＳＬＥの治療においてＩＶＩＧを使用することは、現在、費用、作用機序の不十分な理解および臨床的有効性に関する文献に提示されている逸話的報告により制限されている。
【０００５】
抗体はそれらのＨ鎖の構造に基づき異なるクラスに分類される。これらはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥを包含する。同一の定常構造を有する抗体は同一の「アイソタイプ」のものであるとみなされる。異なるアレルの遺伝の結果として異なる抗原決定基を有する同一アイソタイプの抗体は「アロタイプ」と呼ばれる。抗体の抗原結合部位に関連するＬおよび／若しくはＨ鎖の可変領域中の抗原決定基は「イディオタイプ」と呼ばれる。あるイディオタイプに対して生じる若しくは反応する抗体は「抗イディオタイプ抗体」（抗Ｉｄ）と呼ばれる。
【０００６】
特許文献１はヒト抗ＤＮＡ抗体に対するモノクローナル（ｍＡＢ）抗Ｉｄ抗体の製造を開示する。該ｍＡＢは複数のＳＬＥ患者の抗ＤＮＡ抗体上に存在する決定基を結合する。該決定基は好ましくは抗体のＤＮＡ結合部位の外側にある。抗天然ＤＮＡ抗体（ａｎｔｉ−ｎａｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の血清中での測定のための診断試薬、およびＳＬＥに罹っている患者の血清からの抗天然ＤＮＡ抗体の除去方法で使用しうる治療的試薬もまた開示される。
【０００７】
非特許文献１は、ＳＬＥを伴う７例の無関係の患者由来であったヒト−ヒトハイブリドーマにより産生された６０種のポリヌクレオチドに結合するモノクローナルの狼瘡自己抗体中でのイディオタイプの交差反応の評価を記述する。２例の患者からのモノクローナル自己抗体でのウサギ若しくはマウスの免疫感作により３種の抗イディオタイプ試薬を製造した。該３種の試薬のそれらの対応するイディオタイプへの結合は、１種若しくはそれ以上のポリヌクレオチドにより阻害され、該抗イディオタイプが自己抗体の可変領域と反応したことの表示である。モノクローナル抗イディオタイプ試薬は７例の患者のうち６例からの自己抗体と交差反応し、そして１６／６と命名された。無関係の患者からの免疫グロブリンのイディオタイプの交差反応は、該自己抗体が、ＳＬＥを伴う患者により発現される生殖系列遺伝子の関連したファミリー由来であることを示唆する。
【０００８】
非特許文献２は、ＳＬＥ患者の血清由来の抗ＤＮＡ抗体に結合するプールした正常ヒトＩｇＧからの抗Ｉｄ抗体の製造を記述する。ＳＬＥ患者に対するＩＶＩＧの治療効果は部分的に抗イディオタイプ抗体のＩＶＩＧ中での存在によるかもしれないと仮定されている。
【０００９】
この仮説は、ＩＶＩＧから精製した抗Ｉｄ抗体による狼瘡患者由来の抗ＤＮＡを分泌する末梢血単核細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ調節を記述する同一著者によるその後の論文（非特許文献３）でさらに裏付けられた。
【００１０】
非特許文献４は、ＳＬＥと関連する抗ＤＮＡ抗体に関する多数のイディオタイプ（Ｉｄ）マーカーを記述する。これらのマーカーは１６／６、Ｆ４、３Ｉおよび８．１２を包含する。多発性骨髄腫を伴う患者から単離した１００種の陽イオン性ヒトＩｇＧ骨髄腫タンパク質の４３％が、該Ｉｄマーカーの最低１種の存在を示すことが見出された。抗ＤＮＡ Ｉｄのいくつかは会合しているようであるがしかし正確な構造的基礎はさらなる研究を必要とすると述べられている。
【００１１】
特許文献２は、マウスでＳＬＥ様疾患を誘発する（実験的ＳＬＥ）病原性の抗ＤＮＡ ＭａｂのＨ若しくはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分を複製する合成ペプチドを開示する。具体的には、１２〜３０アミノ酸の５ペプチドの配列が開示されている。ＳＬＥ患者から単離したＴリンパ球の増殖応答を阻害するためのこうしたペプチドの使用もまた開示される。
【００１２】
非特許文献５は、１６／６ Ｉｄをもつ病原性の抗ＤＮＡ ＭａｂのＣＤＲ１およびＣＤＲ３の配列に基づく２種のペプチドの合成および特徴付けを記述する。該ペプチドはマウスで実験的ＳＬＥを調節することが見出された。
【００１３】
特許文献３は、抗ＤＮＡ抗体上に位置するイディオタイプ決定基に対する特異性を有する精製した抗Ｉｄ抗体（抗ＤＮＡ抗Ｉｄ）を含んでなる抗体組成物を投与することによるＳＬＥの治療方法を開示する。ＩＶＩＧからの抗ＤＮＡ抗Ｉｄの精製方法もまた開示される。該方法において、イディオタイプ決定基を発現するガンマグロブリン血症を伴う患者からの抗ＤＮＡ骨髄腫抗体を固相に結合する。ＩＶＩＧに該固相を通過させ、そして結合画分を溶出し、該結合画分は抗ＤＮＡ抗Ｉｄを含有する。
【００１４】
特許文献３は自己反応性の自己抗体のイディオタイプ決定基を複製することが可能な合成ペプチドを製造する可能性もまた開示する。こうした決定基は、非特許文献６に記述されているところのコンピュータプログラムに基づくイディオタイプと抗イディオタイプの相互作用の疎水性プロファイルの比較により同定されるかもしれない。これらの合成ペプチドは固相に結合されてもよく、そして上述されたとおりＩＶＩＧから抗ＤＮＡ抗Ｉｄを精製するのに使用してよい。
【００１５】
非特許文献７は、ＳＬＥ患者から単離したポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗ＤＮＡ抗体に対する広範な交差反応性を示すことが見出された４種のＳＬＥ血清からのヒト抗イディオタイプの単離を記述する。該抗イディオタイプは単一の狼瘡患者から調製した、精製済ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡ Ｆ（ａｂ’）２アフィニティーカラム上で単離した。
【００１６】
非特許文献８は、５種のランダムペプチドファージディスプレイライブラリー、ならびに感染していない個体およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により感染した患者からの血清抗体を使用するリガンドのスクリーニングおよび同定を記述する。該ウイルスの数種の免疫優性エピトープを模倣する多量体合成ペプチドを使用して、血清中のＨＣＶに対する抗体を検出する診断アッセイを開発した。
【００１７】
非特許文献９はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）のようなｄｓＤＮＡ上の抗原性および免疫原性エピトープを模倣するペプチドについてファージペプチドライブラリーをスクリーニングするためのＳＬＥ患者の血清から単離した抗ｄｓＤＮＡ抗体の使用を記述する。該合成ペプチドミモトープは配列ＲＬＴＳＳＬＲＹＮＰを有し、そしてｓｓＤＮＡと交差反応する抗ｄｓＤＮＡ抗体陽性ＳＬＥ血清の８８％により認識された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４，６９０，９０５号明細書（Ｄｉａｍｏｎｄ）
【特許文献２】第ＷＯ ９６／３００５７号明細書（Ｍｏｚｅｓ）
【特許文献３】米国特許第６，２３１，８５６号明細書（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙら、（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５８（３）：７１８−３０
【非特許文献２】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９１−５
【非特許文献３】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．とＡｂｄｏｕ，Ｎ．Ｉ．（１９９３）Ｌｕｐｕｓ ２：３７１−３７５
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊｒ．，Ｒ．Ｃ．ら（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７３：２１５−２２３
【非特許文献５】Ｗａｉｓｍａｎ，Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４６２０−４６２５
【非特許文献６】Ｍａｉｅｒ，Ｃ．Ｃ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ５：１０７−１１３
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら（２００１）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５３：１９２−１９７
【非特許文献８】Ｍｏｎａｃｉ，Ｐ．ら（２００１）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４７５８−４７６８
【非特許文献９】Ｓｕｎ，Ｙ．ら（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２２３−２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
自己免疫疾患と関連する抗体中に存在する抗原決定基を模倣する分子を提供することが、本発明の一目的である。
【００２１】
こうした分子の製造方法を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【００２２】
自己免疫疾患を治療するのに使用しうる抗イディオタイプ抗体の製造方法を提供することが、本発明のなおさらなる一目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の第一の局面において：
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞を該アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；
（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体のあるイディオタイプを模倣する分子である）
を含んでなる、１種または複数の自己免疫疾患関連自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）のイディオタイプを模倣する分子の同定方法を提供する。
【００２４】
本発明は、抗原を結合する抗体中よりもむしろ疾患に関連する抗原中に存在する抗原決定基を模倣する分子を単離する以前に記述された方法と異なり、自己免疫疾患と関連する抗体中に存在する抗原決定基を模倣する分子の単離に基づく。
【００２５】
本発明の方法は、本発明の分子および抗体は疾患に罹った個体から採取した血清と接触させずに製造され、その結果生成物は患者への投与に安全であるために、以前に知られている方法と異なる。
【００２６】
本明細の情況において、以下の用語は、別の方法で示されない限り、それらの後に続く意味するところを有する：
自己免疫疾患は自己抗原に対する細胞性および体液性応答の結果である。体液性の優勢な自己免疫状態は、それが今日そうであることが知られているにしろ将来そうしたものとして診断されうるものであるにしろ、患者自身のエピトープの１種若しくはそれ以上を結合する抗体を患者がその経過中に産生する疾患、疾病、障害若しくは症候群を包含する。
【００２７】
今日まで知られている自己免疫疾患は、本発明の背景で挙げられたいかなる疾患、および以下すなわち重症筋無力症（ＭＧ）、先天性重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、スティッフマン症候群、熱帯性痙性対麻痺、ラスムッセン脳炎、急性運動性軸索性神経障害、急性感覚運動性軸索性神経障害、後根神経節神経炎、急性汎自律神経性神経障害、腕神経叢炎、急性壊死性出血性白質脳炎、散発性壊死性ミエロパシー、腫瘍随伴性小脳変性、ギラン・バレー症候群、辺縁系脳炎、眼球クローヌス−筋クローヌス運動失調、感覚神経炎、自律神経性神経障害、脱髄性神経障害、ＡＩＤＳ痴呆複合体、トゥーレット症候群、ミラー・フィッシャー症候群、アルツハイマー病、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、分娩後甲状腺炎、限局性甲状腺炎、若年性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、アジソン病、下垂体炎、自己免疫性尿崩症、副甲状腺機能低下、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡／妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、後天性表皮水疱症、多形性紅斑、妊娠性ヘルペス、白斑、慢性蕁麻疹、円板状狼瘡、全身性／円形脱毛症、乾癬、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、慢性活動性肝炎／原発性胆汁性肝硬変重複症候群、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、ヘパリン誘発性血小板減少症、原発性自己免疫性好中球減少症、乳児期の自己免疫性（原発性）好中球減少症、骨髄移植後の自己免疫性好中球減少症、後天性自己免疫性血友病、自己免疫性胃炎および悪性貧血、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、唾液腺炎、自己免疫性早発性卵巣機能不全、無精子症、性腺機能低下、精子の自己抗体に関連する男性不妊症、自己免疫性精巣炎、早発性卵巣機能不全、自己免疫性卵巣炎、ブドウ膜炎、網膜炎、症候性眼炎、バードショット脈絡網膜炎、フォークト・小柳・原田肉芽腫性ブドウ膜炎、網膜変性、レンズ誘発性ブドウ膜炎、視神経炎、自己免疫性感音障害、メニエール病、自己免疫性心筋炎、先天性心ブロック（新生児狼瘡）、シャーガス病、アドリアマイシン心毒性、ドレスラー心筋炎症候群、気管支喘息、間隙性線維化性肺疾患、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性尿細管間質性腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、フェルティ症候群、大型顆粒リンパ球増加症（ＬＧＬ）、シェーグレン症候群、全身性硬化症（強皮症）、Ｃｒｅｓｔ症候群、混合型結合組織疾患、多発性筋炎／皮膚筋炎、グッドパスチャー病、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ−ストラウス症候群、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、結節性動脈周囲炎、ベーチェット症候群、アテローム硬化症、側頭（巨）細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病、強直性脊椎炎、ライター病、スネドン病、自己免疫性多発性内分泌腺症、カンジダ症−外胚葉性ジストロフィ、生理的クリオグロブリン血性脈管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、ライム病、リウマチ熱および心疾患、好酸球性筋膜炎、発作性寒冷血色素尿症、リウマチ性多発性筋痛、線維筋痛症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経炎、臓器肥大症、内分泌異常症、Ｍ−ｓｐｏｔおよび皮膚病変）、再発性多発性軟骨炎、自己免疫性リンパ増殖症候群、ＴＩＮＵ症候群（急性尿細管間質性腎炎およびブドウ膜炎）、分類不能型免疫不全、ＴＡＰ（抗原提示に関連する輸送体）欠損症、オーメン症候群、過剰ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒＩｇＭ）症候群、ＢＴＫ無ガンマグロブリン血症、ヒト免疫不全ウイルスならびに骨髄移植後のいずれかを包含する。
【００２８】
自己免疫疾患関連自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）（自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ））は、自己抗原に対し身体により産生されかつ自己免疫疾患の病因若しくは症状に関与若しくは関連するいずれかの抗体である。
【００２９】
分子は、例としてペプチド、タンパク質およびコンビナトリアル化学物質、ならびに単独であれ他の分子とともにであれ例えばポリリシンバックボーン若しくは他の化学的基盤に基づく上のそれぞれの二量体、オリゴマー若しくは多量体（ｎ＝２若しくはそれ以上）を包含する有機若しくは無機、合成若しくは天然のいずれかの分子である。ペプチドおよびタンパク質の場合、分子という用語は、該分子の模倣機能に実質的に影響を及ぼさずに１個若しくはそれ以上のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているペプチドおよびタンパク質の誘導体もまた包含する。
【００３０】
本発明の情況における模倣（する）は、その構造を必ずしも複製せずにエピトープの三次元（３Ｄ）コンホメーションを再現する能力を有することを意味している。この模倣は完全な複製である必要はなく、そして、模倣する分子が元のイディオタイプと同一の抗Ｉｄ抗体により結合されるであろうように元のイディオタイプのものに十分に類似であるその近似であってもまたよい。
【００３１】
プールした血漿は、複数の健康な被験体からプールした免疫グロブリンを含有する血漿およびその画分を意味している。本発明の当業者は、こうしたプールした血漿は、限定されるものでないがプールした血漿のいかなる免疫グロブリン含有画分も挙げることができることを認識するであろう。プールした血漿のいかなる部分的に精製された若しくは精製された画分も本発明により使用してよい。好ましい一態様において、プールした血漿はＩＶＩＧ若しくはそのいずれかの誘導体である。プールした刺激したＢ細胞、および乳房（初乳）、腎、肺若しくは脳のような免疫グロブリンが豊富であるプールした器官もまた、本発明の範囲内で企図している。
【００３２】
本発明の情況における分子ライブラリーは、本発明により選択すべきイディオタイプを模倣する１種若しくはそれ以上の分子をそれから選択してよい分子の集合体を提供するいかなるライブラリーも意味している。例えばペプチドファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアル化学物質ライブラリー、一本鎖抗体ライブラリー、リボソームライブラリーなどを包含する多くのこうしたライブラリーが容易に入手可能である。
【００３３】
患者は、該人の疾患の相若しくは進行に関係なく、および該ヒトが該疾患若しくはその症状のいずれかについて治療されているか若しくはいないかに関係なく、自己免疫疾患に苦しめられているいかなる人も意味している。従って、患者は疾患の活動期（すなわち疾患の症状が発現されている場合）に苦しめられていても、若しくは寛解（すなわち該人が健康であるようにみえる）にあってもよい。
【００３４】
自己抗体は単一の患者若しくは患者の特定の一サブグループから収集してよいことが認識されるであろう。これは、本発明により、ドナーが罹っている特定の下位分類の自己免疫疾患と対応する、模倣する分子の同定を可能にすることができる。あるいは、分類されていない複数の患者からの自己抗体の収集は、例えば異なる予後を特徴とする、複数の異なる分類の同一の自己免疫疾患に対応する模倣分子の同定を可能にするかもしれない。
【００３５】
本発明のアフィニティーマトリックスを形成するのに使用される固相は、カラム、磁性ビーズ若しくはフィルターのようないずれかの適切な形態のエポキシ若しくはホルミル基のような当該技術分野で既知のいずれかの適切な固相であってよい。固相は一般に自己抗体がそれに結合することを可能にするように活性化することができる。活性化の例は、限定されるものでないがＣＮＢｒ活性化および過ヨウ素酸酸化を挙げることができる。
【００３６】
本発明の好ましい一態様によれば自己免疫疾患はＳＬＥである。少なくとも、いくつかの自己免疫疾患において、自己抗体を提供する患者は活動期の自己免疫疾患で苦しめられているかもしれないか、若しくは寛解にあるかもしれないかのいずれかであることが確立されている。従って、得られる抗体の量および型は異なるかもしれず、異なる組の模倣する分子を提供する。
【００３７】
本発明の好ましい一態様によれば、分子ライブラリーはペプチドファージディスプレイライブラリーである。こうしたファージディスプレイライブラリーは、例えば３若しくはそれ以上のアミノ酸を含んでなるペプチド、または例えば環状ペプチドを表示してよい。
こうしたライブラリーの使用は自己抗体のイディオタイプを模倣するペプチドを提供することができ、そして、こうしたペプチドの配列（アミノ酸であろうと核酸であろうと）は、既知の方法により同一のライブラリーから容易に得ることができる。他の態様において、分子ライブラリーはコンビナトリアル化学物質ライブラリー若しくは一本鎖抗体ライブラリーであってもよい。
【００３８】
当業者は、プールした血漿を一連のアフィニティーマトリックス（各アフィニティーマトリックスは異なる自己免疫疾患、若しくは一自己免疫疾患の異なる症状発現からの自己抗体をそれに結合させている）と接触させてよいことをさらに認識するであろう。従って、プールした血漿の１サンプルから、各自己免疫疾患についてプールした血漿を再度収集する必要性なしに多様な模倣する分子を同定することができる。これはプールした血漿のより効率的かつ経済的使用を見込むことができる。
【００３９】
本発明の第二の局面によれば、以下のペプチド：
【００４０】
【表１】
【００４１】
を除外する、ある自己抗体の１イディオタイプを模倣する分子が提供される。
【００４２】
本発明の当業者は、上で挙げられた分子を、ある自己抗体のイディオタイプを模倣する分子の上述された同定方法の段階ａ〜ｆにより製造しうることを認識するであろう。
【００４３】
本発明の一例により、３３種のこうしたペプチドを製造し、そして、以下の配列：
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
を有することが発見された。
【００４７】
こうした分子は多量体の形態にあってもよい。
【００４８】
第三の局面によれば、本発明は、自己免疫疾患に苦しめられている患者に有効量の本発明の分子を投与することを含んでなる、該患者の治療方法を提供する。
【００４９】
本発明のなおさらなる一局面によれば、有効量の本発明の分子を製薬学的に許容できる賦形剤と一緒に含んでなる自己免疫疾患の治療のための製薬学的組成物が提供される。こうした賦形剤は当業者に公知である。
【００５０】
別の局面によれば、本発明は、（ａ）以下のペプチド：
【００５１】
【表４】
【００５２】
を除外する、ある自己免疫疾患の１イディオタイプを模倣する分子を提供すること；（ｂ）スクリーニングした化合物を該分子と接触させること；および（ｃ）該分子に結合する化合物を同定すること（該結合する化合物は自己免疫疾患の治療における潜在的使用を有する）を含んでなる、自己免疫疾患の治療におけるそれらの潜在的使用についての化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００５３】
化合物への該分子の結合は、例えば結合条件（例えば塩濃度、ｐＨなど）の変動を包含する、該分子および選択すべき化合物に適切なところの多くの多様な方法により達成しうることが、本発明の当業者により認識されるであろう。
【００５４】
別の局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿を該アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンを該マトリックスから溶出すること；
（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体のイディオタイプを模倣する分子である）；
（ｇ）該結合した分子の１種若しくはそれ以上を固相に結合して第二のアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｈ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿を第二のアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｉ）該第二のマトリックスから、自己抗体に対する第二の抗Ｉｄである結合した免疫グロブリンを溶出すること（第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されていない）
を含んでなる、自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されていない、自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法を提供する。
【００５５】
好ましい一態様において、プールした血漿はＩＶＩＧである。
【００５６】
段階（ｄ）の第一の抗Ｉｄと異なり、第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患に苦しめられている患者の血漿成分の血清と接触されていない。これは第二の抗Ｉｄを第一の抗Ｉｄよりも投与により安全にする。健康でない個体の血漿成分による第二の抗Ｉｄの汚染の危険が除去されているためである。
【００５７】
第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患に苦しめられている患者の治療方法において有用であり得ることが、本発明の当業者により認識されるであろう。こうした方法は、有効量のこうした抗Ｉｄを患者に投与することを含んでなる。
【００５８】
本発明の別の局面によれば、有効量の本発明の分子で動物を免疫することを含んでなる、自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法が提供される。
【００５９】
さらなる一局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）本発明の既知のイディオタイプ特異性の一連の抗Ｉｄを提供すること；
（ｂ）該自己抗体を該一連の抗Ｉｄと接触させること；および
（ｃ）自己抗体に結合する抗Ｉｄを同定すること（結合した抗Ｉｄのイディオタイプは自己抗体のイディオタイプである）
を含んでなる、自己抗体の特異的１イディオタイプの同定方法を提供する。
【００６０】
本方法は１患者若しくは１分類の患者の特定の自己抗体の診断において有用であり得る。本発明の当業者は、こうした同定が異なる患者に予後を提供して疾患の異なる局面の特徴付けに、および最終的には患者の治療において有用であるかもしれないことを認識するであろう。１患者における１種の自己抗体の特定のイディオタイプが同定されていることは、該患者の治療のために本発明の特定の１分類の分子若しくは抗Ｉｄを選択することを可能にするかもしれない。
【００６１】
なおさらなる一局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）被験体を本発明の分子で免疫すること；
（ｂ）該被験体から血清を収集すること；および
（ｃ）該血清からヒト抗Ｉｄ免疫グロブリンを精製すること
を含んでなる、精製されたヒト抗Ｉｄ免疫グロブリンの製造方法を提供する。
【００６２】
本発明を理解するため、およびそれが実務においてどのように実施されうるかを知るために、付随する図面を参照して制限しない例としてのみ好ましい態様を今や記述することができ、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】自己抗体のイディオタイプを模倣する分子を同定するための本発明の方法の一態様を示す流れ図である。
【図２】自己抗体に対する抗Ｉｄの本発明の製造方法の一態様を示す流れ図である。
【図３】７０６ペプチド配列をもつペプチドカラムからのビオチニル化ペプチド７０６、７０７およびＲ７０６への免疫グロブリンピーク溶出の特異的結合を具体的に説明するグラフである。
【図４】７０７ペプチド配列をもつペプチドカラムからのビオチニル化ペプチド７０６、７０７およびＲ７０６への免疫グロブリンピーク溶出の特異的結合を具体的に説明するグラフである。
【実施例】
【００６４】
［実施例Ｉ］
自己免疫−ａ−ａのイディオタイプを模倣する分子の同定方法の一態様を図１に具体的に説明する。
【００６５】
参照数字２により図１中で示される該方法の第一段階は、自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製することを必要とする。例えば、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体をＳＬＥに罹っている数十例の患者（狼瘡患者）から精製してよい。次の段階４において、自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成する。上の例に従えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに結合する。
【００６６】
後に続く段階６は、免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿をアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分の除去の段階８を含んでなる。該実施例において、ＩＶＩＧをアフィニティーカラムに負荷し、それをその後洗浄して未結合の免疫グロブリンを除去する。抗ｄｓＤＮＡ抗体を結合する免疫グロブリンのみがカラムに結合されたまま留まる。
【００６７】
次の段階１０において、結合した抗イディオタイプ抗体（＝抗Ｉｄ）をアフィニティーマトリックスから溶出する。該実施例において、これらは抗−抗ｄｓＤＮＡ抗イディオタイプであることができる。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、および狼瘡実験モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで、抗Ｉｄの効力を確認してよい１２。
【００６８】
後に続く段階１４において、複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供し、そして、溶出した抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させる。抗Ｉｄにより結合されている分子を単離かつ同定する１６。これらの分子は自己抗体の１イディオタイプを模倣する。上の実施例において、抗ｄｓＤＮＡ抗体をＣ７Ｃ−ペプチドファージディスプレイライブラリーに導入し、そして該抗体により結合されたペプチドを単離かつ同定する。これらのペプチドは抗ｄｓＤＮＡ抗体のイディオタイプを模倣する。その後、模倣するペプチドを合成してよい１８。
【００６９】
［実施例ＩＩ］
自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法の一態様を図２に示す。
【００７０】
第一段階２２において、図１に具体的に説明された方法により得た模倣する分子を固相に結合して第二のアフィニティーマトリックスを形成することにより、アフィニティーマトリックスを形成する。模倣する分子は、分子ライブラリーから単離されたものであっても、若しくは単離された分子に基づき合成した他の分子であってもよい。図１に関して示された実施例に従えば、これらは抗ｄｓＤＮＡ抗体のイディオタイプを模倣するペプチドであることができる。
【００７１】
次の段階２４において、免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿をこの第二のアフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去する２６。該実施例において、ＩＶＩＧをカラムに負荷し、それをその後洗浄して未結合の免疫グロブリンを除去する。後に続く段階２８において、抗Ｉｄをアフィニティーマトリックスから溶出する。抗Ｉｄの効力を例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によりおよび狼瘡実験モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで確認してよい３０。これらの第二の抗Ｉｄは、自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されておらず、患者の治療での使用に安全である。例えばそれらは狼瘡患者を治療するのに使用してよい。
【００７２】
［実施例ＩＩＩ］
１種の自己抗体のイディオタイプを模倣する分子の同定
１．材料および方法
実施例Ｉで上述されたところのＩＶＩＧから単離した抗−抗ｄｓＤＮＡ（抗Ｉｄ）を使用して、Ｍ１３ファージにより提示される特異的ペプチドを検出した。商業的Ｐｈ．Ｄ．７ＴＭファージディスプレイライブラリー（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）を、発明者により以下のとおりわずかに改変した製造元の手順に従って使用した：
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（Ｐｈ８．５）中の抗Ｉｄを、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１３３５）を添加することによりビオチニル化し、氷上で２時間インキュベートしかつ２％麦芽糖に対し透析した。ビオチニル化の効率はニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎｅ）被覆プレート上でのＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【００７３】
ビオチニル化抗Ｉｄ（１μｇ）をペプチドファージディスプレイライブラリー（１０μｇ−２×１０１１ｐｆｕ）に４℃で一夜導入した。混合物を、３％ＢＳＡでブロッキングしたストレプトアビジン被覆ペトリ皿（３ｃｍ、Ｎｕｎｃ）に入れた。２０分のインキュベーション後に、ストレプトアビジンとファージとの間の非特異的な低親和性結合を、ビオチン０．１ｍＭを５分間添加することにより予防した。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎでの徹底的な洗浄後に、結合したファージをグリシン−ＨＣｌ ０．２Ｍ ｐＨ２．３で溶出しかつトリスｐＨ９で即座に中和した。
【００７４】
溶出されたファージを対数中期（ＯＤ６００ 約０．５）でＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株に導入し、そして室温で５分間インキュベートしてファージを細菌に進入させ；その後複製のため４．５時間インキュベートし、そして細菌を遠心分離により沈降させた。４℃でのＰＥＧ−８０００ １：５とのインキュベーションによりファージを上清から単離した。増幅されたファージを、第２回のため、元のビオチニル化抗Ｉｄとともに再度インキュベートした。最後に、同一手順を使用して５回の増幅手順を実施した。各回の間に、ファージを再度Ｆｃ被覆プレート上でのパニングにかけてＦｃ結合ファージを最大限に抹消（ｄｅｌｅｔｅ）した。
【００７５】
１０倍連続希釈の、最後の回からの溶出されたファージをトップアガロースと混合し、そしてＬＢ／ＩＰＴＧ／ＸＧＡＬプレート上にプレーティングした。青色プラークを収集し、そして各プラークをファージ収集のため１０ｍｌ ＬＢ中で４．５時間個別に増殖させ、そして遠心分離した。ファージはＰＥＧ−８０００ １：５とともに上清をインキュベートすることにより培養物から単離した。
【００７６】
８４７個のコロニーをＥＬＩＳＡにより抗Ｉｄによる認識についてスクリーニングした。プレート（９６ウェル）をヤギ抗Ｍ１３で被覆し、３％ＢＳＡおよびヘモシアニンでブロッキングし、そしてファージとともにインキュベートした。ビオチニル化抗Ｉｄ若しくはビオチニル化した個々のＩｇＧ（陰性対照としての１人から）で結合をプロービングし、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび適切な基質に曝露した。最後に、３３クローンが抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄに対し有意に陽性であることが見出され、かつ、１人の健康なドナーからアフィニティー精製したＩｇＧにより認識されなかった。
【００７７】
陽性クローンは、製造元の手順に従ってキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）Ｍ１３（ＱＩＡＧＥＮＥ カタログ番号２７７０４）を使用してＤＮＡ調製のためファージを５．５時間増幅するためにＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株に導入した。簡潔には、上清を、少量ＤＮＡ調製物のための１．４ｍｌ、およびＬＢ中でのＥＲ２５３７（一夜培養物からの１００倍希釈した細菌ＥＲ２５３７）への導入のための残部に分けた。沈殿溶液を１．４ｍｌの上清チューブに添加し、ボルテックス攪拌しかつＲＴで７分間放置した。混合物を２回の７００μｌ／ミニカラムでミニカラム／２ｍｌチューブに負荷した。チューブは第一および第二の負荷後にＲＴで８，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。溶解緩衝液をカラムに添加し（７００μｌ／カラム）、ＲＴで１分インキュベートしかつ遠心分離した。洗浄緩衝液を７００μｌ／カラム添加し、そしてカラムをＲＴで８，０００ｒｐｍ、１５秒遠心分離し、液体を廃棄しかつカラムを再度遠心分離した。カラムを滅菌チューブに接続した。予め加温した（５０℃）溶出緩衝液をカラム上に添加した（５０μｌ／カラム）。カラムをＲＴで１０分インキュベートし、そしてＲＴで１４，０００ｒｐｍで２分遠心分離した。
【００７８】
ＤＮＡ調製物を、ｍｂｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、イスラエル国ネス−ジオナ（Ｎｅｓ−Ｚｉｏｎａ）によりシークェンシングした。
【００７９】
ペプチドはＴｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、イスラエル国レホボト（Ｒｅｈｏｖｏｔ）で環状ペプチドとして合成した。ペプチド配列を表１に列挙する：
【００８０】
【表５】
【００８１】
２．合成ペプチドへの抗Ｉｄの直接結合：
ペプチドへの抗Ｉｄの結合をＥＬＩＳＡにより試験した。
【００８２】
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのペプチドにより４℃で一夜被覆した。プレートを３％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングした。抗Ｉｄを多様な濃度で添加した。１ドナーから精製したＩｇＧを陰性対照として使用した。
【００８３】
アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよび適切な基質で免疫グロブリンの結合をプロービングした。各段階の間に０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで徹底的な洗浄を実施した。
以下のペプチドを使用した：
【００８４】
【表６】
【００８５】
結合の結果（４０５ｎｍでのＯＤ）を表２に提示する。
【００８６】
【表７】
【００８７】
３．直接結合合成ペプチド：
上と同一のプロトコルを使用したが、しかしこの試験で使用したペプチドは、前の実験で最初のペプチドであるペプチド番号１を除き文献から採用した。
【００８８】
使用したペプチドは：
【００８９】
【表８】
【００９０】
であった。
【００９１】
【表９】
【００９２】
４．混合環状ペプチドでの阻害パーセント
上の２節（「合成ペプチドへの抗Ｉｄの直接結合」）で示した１５種の環状ペプチドの混合物を使用して、７例の狼瘡患者のそれぞれからアフィニティー精製した抗ｄｓＤＮＡ抗体への抗Ｉｄの結合を阻害した。混合物は狼瘡患者の抗ｄｓＤＮＡ Ｉｄ（１種若しくは複数）の認識確率を増大させるよう作成した。
【００９３】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＮａＨＣＯ３ ０．０５Ｍ ｐＨ８．５中、抗Ｆｃ ２μｇ／ｍｌで４℃で一夜被覆した。こうして、抗ｄｓＤＮＡの免疫グロブリン分子のＦ（ａｂ）部分がイディオタイプをより効率的に提示することができる。
【００９４】
プレートを３％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングし、そして各ヒト抗ｄｓＤＮＡ抗体溶液をＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌで添加しかつ４℃で一夜インキュベートした。別個のチューブに、ペプチド混合物１を、４℃での一夜インキュベーションのため、ＩＶＩＧからのビオチニル化抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄ（抗ｄｓＤＮＡへの５０％結合の濃度の）に多様な濃度で添加した。翌日、抗Ｉｄおよびペプチド混合物の混合物を抗ｄｓＤＮＡ被覆したプレートに４時間添加した。ペプチド混合物により認識されなかった未結合の抗Ｉｄの結合を、アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジンおよび適切な基質でプロービングした。
【００９５】
表４に提示した結果は、ペプチド混合物による、特定の１狼瘡患者からの抗ｄｓＤＮＡへの抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄの結合のＩＶＩＧの特定の画分の阻害のパーセンテージを示す。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
［実施例ＩＶ］：自己免疫疾患のイディオタイプ模倣の単離のための鋳型としてのＩＶＩＧおよび／若しくはプールした血漿の使用。
１．緒言：
本実施例は、共通のＳＬＥイディオタイプすなわちＩｄ １６／６の同定をもたらした慣習的方法での直接選択の実験的立証を提供する。１６．６ ＣＤＲ、ＣＤＲ３に基づくペプチドの１種がマウスでＳＬＥの症状を引き起こし得る一方、ＣＤＲ１の優勢な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ）機能は実験的ＳＬＥマウス（１）において疾患を軽減することであることが判明している。
【００９８】
１６／６ Ｉｄをもつ病原性マウスモノクローナル抗ＤＮＡ Ａｂ（５Ｇ１２）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列に基づく２種のペプチドを合成した。ｐＣＤＲ１（ＣＤＲ１−ＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ）およびｐＣＤＲ３（ＣＤＲ３−ＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ）（ＣＤＲに下線を引いてある）が、それぞれＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬマウス系統における免疫優性のＴ細胞エピトープであることが示され、そして応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）マウスにおいて軽度のＳＬＥ様疾患を誘発した（Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，Ｕ．編（Ａｌｍｑｖｉｓｔ ＆ Ｗｉｋｓｅｌｌ、ストックホルム）中、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｅｉｌａｎ，Ｈ．、Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ｓ．とＧｅｉｓｅｒ，Ｔ．（１９８４）、ｐｐ．１８５−１８８）。さらに、ＣＤＲに基づくペプチドは、同一ペプチドまたはマウス若しくはヒトいずれかの起源のモノクローナル抗ＤＮＡ １６／６Ｉｄ＋ Ａｂで免疫したマウスのリンパ節細胞（ＬＮＣ）のプライミングを阻害した。ＣＤＲ１に基づくペプチドはまた、ｐＣＤＲ１若しくは病原性自己Ａｂのいずれかで後に免疫したＢＡＬＢ／ｃ新生マウスにおける自己Ａｂ産生を予防することも示された（Ｋｅｎｔ、前掲書）。
【００９９】
２．材料および方法
２．１ 合成ペプチド。
７０６と呼称される１６．６モノクローナル抗体ＣＤＲ１に基づくペプチドＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ（ｐＣＤＲ１）および７０７と呼称されるＣＤＲ３に基づくペプチドＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ（ｐＣＤＲ３）を、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）戦略のための会社のプロトコルを使用して、自動化合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍモデル４３０Ａ）で製造した（Ｋｅｎｔ、前掲書、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ，、Ａｌｅｗｏｏｄ，Ｐ．Ｆ．とＫｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４０、１８０−１９３）。Ｒ７０６と呼称される逆順のＣＤＲ１、ＧＩＷＥＬＳＫＥＰＳＱＫＶＷＱＭＹＹＧＴを対照として使用した。別の類似の合成において、生じるペプチドを、後にＥＬＩＳＡ試験で使用するためにそれらのＮ末端でビオチンにより標識した。
【０１００】
２．２ アフィニティークロマトグラフィー：ペプチドカラムの調製
２．２．１ 還元的アミノ化によるペプチド７０７のカップリング
２．２．１．１ 活性化プロトコル
ａ．過ヨウ素酸酸化可能なマトリックスの創製
１０ｍｌのトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＮＨ６５Ｆ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）を焼結グラスフィルター（多孔性Ｇ３）上で３００ｍｌの水で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＯＨで５回連続して（合計８０ｍｌ）洗浄した。樹脂を焼結グラスフィルターから取り出し、そして１０ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ、１ｍｌのグリシドール（Ｓｉｇｍａ）および０．０１ｇのホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ４）で懸濁した。反応混合物を穏やかな回転を伴い室温で一夜インキュベートした。朝に、樹脂を２００ｍｌの水、１Ｍ ＮａＣｌおよび再度水のそれぞれで徹底的に洗浄した。グリシドール修飾樹脂は今や過ヨウ素酸酸化の準備ができた。
ｂ．マトリックスの直接過ヨウ素酸酸化
過ヨウ素酸酸化樹脂を調製するために以下のプロトコルを設計した。すなわち、ビシナルヒドロキシル基を含有する１０ｍｌの水分を含むゲルを１０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＩＯ４（１００ｍｌの水中の４．２８ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウム）に再懸濁し、そして穏やかな回転により十分に混合した。反応を室温で９０分間継続した。ホルミル樹脂を３００ｍｌの水により洗浄して酸化を停止した。この手順により創製されるアルデヒドは、カップリング能力の低下を伴わずに樹脂が長期間保存されることを可能にするのに十分安定である。
【０１０１】
２．２．１．２ リガンドカップリングプロトコル
ＮａＣＮＢＨ４および特定のペプチドを含有する１ｍｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を２ｍｌの過ヨウ素酸酸化マトリックスに添加した。リン酸緩衝液中のペプチドの濃度は１０ｍｇ／ｍｌ（約３．３μモル／ｍｌ）であった。従って、該比は１ｍｌの樹脂に対し１．１μモルの７０７であった。反応を攪拌しながら室温で一夜継続した。カップリングした樹脂を水、１Ｍ ＮａＣｌおよび再度水で徹底的に洗浄して、未反応のリガンドおよびシアノホウ水素化ナトリウムを除去した。
【０１０２】
樹脂は２０Ｍｍリン酸緩衝液ｐＨ７中で保存した。
２．２．２ ＣＮＢｒ活性化マトリックスへのペプチド７０６のカップリング３ｇの凍結乾燥したＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４ファストフロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）を２０ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌ（氷冷）に懸濁した。樹脂を２００ｍｌの酸を使用して焼結グラスフィルター（多孔性Ｇ３）上で１５分間激しく洗浄した。
最終洗浄後に、２ｍｌの洗浄した樹脂を、カップリングされるべきペプチドを溶解しておいたカップリング溶液中に移した。カップリング溶液は９００μｌの０．１−Ｍ炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ８．５および１００μｌの１００ｍｇ／ｍｌのペプチド７０６を含有した。樹脂に対するペプチドの比は再度１ｍｌの樹脂あたり１．１μモルであった。混合物を４℃で一夜回転した。カップリング後、樹脂を含むバイアルを樹脂の沈降のため垂直位置で放置した。上清を廃棄し、そして、樹脂上の残存する活性基の封鎖のため１５ｍｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０を添加した。封鎖は回転しながら室温で４．５時間実施した。
【０１０３】
封鎖後に、樹脂を１０カラム容量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ８．５で洗浄し、次いで３周期の交替するｐＨで洗浄した。各周期は、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４の１５ｍｌ洗浄、次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８での洗浄よりなった。
【０１０４】
樹脂を０．０５Ｍトリス ｐＨ７．４中に保存した。
２．３ アフィニティークロマトグラフィー：ペプチドカラムを使用する静脈内免疫グロブリン溶液からの抗イディオタイプの精製。
【０１０５】
ペプチドカラムを、２８０ｎｍでの吸光度測定値が安定（ＯＤ約０．００５）になるまで、最低１０容量の負荷緩衝液（２０ｍＭ ＰＢ）で洗浄した。
【０１０６】
１００ｍｌの希釈ＩＶＩＧ（オムリガム（ＯｍｒｉＧａｍ）、（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、イスラエル）製造工程の工程サンプルＧ１２中、高精製二重不活性化ＩＶＩＧ）を２ｍｌペプチド樹脂の上部に負荷した。出発原料の濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。この濃度に達するために、ＩＶＩＧをリン酸緩衝液、ｐＨ７で希釈して所望のモル濃度に達せさせた。負荷はおよそ１００μｌ／分の流速で４℃で一夜進行させた。負荷は２回実施した。その後、２８０での吸光度がベースラインに達するまで、カラムを負荷緩衝液で洗浄した。溶出は、溶出物を中和するための１Ｍトリス塩基緩衝液ｐＨ９中へ、０．１Ｍグリシン、ＨＣｌ ｐＨ２．７を用いて行った。各溶出は１ピーク（通常は１ｍｌカラムから約４〜５ｍｌ）よりなった。溶出および負荷中のタンパク質はブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８）により測定した。
【０１０７】
２．４ アフィニティークロマトグラフィー段階の効率：ＥＬＩＳＡ
ペプチドカラム溶出物（７０６および７０７）の結合効率を測定するために以下のＥＬＩＳＡを実施した：
マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔｅｒ、米国）を、０．１Ｍ、ｐＨ８．８の炭酸−重炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ 米国）に懸濁した１０μｇ／ｍｌのニュートラビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）で２〜８℃で一夜被覆した。被覆溶液を除去し、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ）で３回洗浄し、そしてウェルあたり２００μｌのブロッキング溶液（新たに調製した１％Ｉ Ｂｌｏｃｋ、Ｔｒｏｐｉｘ、米国）を添加しかつ３７ ℃で１時間インキュベートした。被覆しかつブロッキングしたプレートは使用前に１か月間−２０℃で保存し得る。
【０１０８】
ブロッキング溶液で希釈した、試験されるサンプルを、個別のチューブ中にて１μｇ／ｍｌ（最終濃度）の適切なビオチニル化ペプチドと混合し、そして混合物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、各反応チューブからの１００μｌを、ブロッキングしたマイクロタイタープレートに移し、そして３７℃で１／２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液で希釈した５０００倍アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、米国からのＨおよびＬ鎖）１００μｌを該マイクロタイターウェルに適用しかつ１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼの酵素活性はその場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ 米国）との室温での一夜インキュベーションにより示される。測定を４０５ｎｍで測光的に行った。
【０１０９】
３．結果および考察。
２００ｍｌのＩＶＩＧを２ｍｌのペプチドカラム（一方はＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）マトリックスに結合するペプチド７０６、および他方は還元的アミノ化によりポリマーマトリックスに結合する７０７ペプチドよりなる（材料および方法を参照されたい））のそれぞれに負荷した。
【０１１０】
タンパク質濃度およびビオチニル化ペプチドの結合を試験し、そして結果を表５ならびに図３および４に提供する。
【０１１１】
【表１１】
【０１１２】
結合したピークの溶出は異なる回収、すなわち、カラムペプチド７０６について約０．０１８％対カラムペプチド７０７について約０．０４７をもたらした。従って、ペプチドカラム７０６はプールしたＩＶＩＧ中で見出される５５５５種の分子から１種を結合する能力を有する一方、ペプチドカラム７０７は２２３７種の免疫グロブリン分子から１種を結合する能力を有すると結論づけ得る。従って、７０７のエピトープがより豊富でありかつＩＶＩｇ中でより高頻度で見出し得ると想定し得る。
【０１１３】
溶出ピークの特異性を、３種のビオチニル化ペプチド（７０６、７０７およびＲ７０６）に対するペプチドカラム溶出ピークへの特異的結合により評価し、そして結果を図３および４に要約する。
【０１１４】
ペプチド７０６をもつペプチドカラムから溶出された免疫グロブリンは、７０６のビオチニル化ペプチドとのみ直線状の様式で特異的に反応し、そしてペプチド７０７若しくは逆の順序の同一配列をもつペプチドとさえ反応しなかったことが示され得る（図３）。他方、ペプチド７０７と結合されたペプチドカラムからの溶出ピークは非特異的様式で反応した（図４）。生じる免疫グロブリンはビオチニル化ペプチド７０６と反応し、かつ、なおより興味深いことに、該免疫グロブリンは７０６の逆にした配列となおより強く反応した。７０７−免疫グロブリン調製物が７０７および７０６のペプチド配列ならびにおそらく多数の他の配列と非特異的に反応するかもしれないことを示す。
【０１１５】
上の結果は、Ｉｄ１６．６上で見出される全部のＣＤＲ配列が特異的であるわけでなく、かつ、それらの少なくともいくつかは非特異的様式でＩＶＩｇと反応することを示した。
【０１１６】
これらの結果は、ＳＬＥ患者由来のモノクローナルの使用が免疫グロブリンの非特異的選択をもたらしうるという概念を裏付ける。
【０１１７】
【表１２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性自己抗体を模倣する合成分子の選択のための一ツールとして、および自己免疫疾患における治療的使用のための特異的抗体の単離のための一供給源としての、プールした血漿から精製した免疫グロブリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症（ＭＧ）および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のような自己免疫疾患は、自己成分を認識かつ攻撃するように個体の免疫系が始動される場合に発生する。例えば、ＳＬＥは典型的な異常な臨床検査値を伴う軽度の臨床所見から生命を脅かす状態までの範囲にわたる非常に多彩な臨床症状発現を伴う多系自己免疫疾患である。臨床検査値異常は、夥しい組織抗原に対する自己抗体の高力価を包含する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヒストン、核タンパク質およびタンパク質−核複合体のような細胞核の成分に対し向けられるものが最も特徴的である。ＳＬＥの臨床経過は高度に変動性かつ予測不可能であり、寛解および再発の期間を頻繁に伴う。
【０００３】
ＳＬＥを伴う患者の生存は、主としてコルチコステロイドおよび細胞傷害性薬物の使用により、過去数十年にわたって顕著に改善した。こうした医薬は強力な抗炎症および免疫調節効果を有する一方、それらの使用は免疫抑制、骨髄抑制および／若しくは多数の他の頻繁な副作用により厳しく制限されている。この障害のための免疫調節療法の安全かつ効率的な一様式はなお欠如している。
【０００４】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は何千名もの健康な血液供与者から収集したプールしたヒト血漿から製造した高度に精製されたＩｇＧ製剤である。ＩＶＩＧは自己免疫疾患に罹っている患者の臨床的改善を生じさせ得ることが既知である。高用量の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の投与は免疫調節性であるがしかし免疫抑制的若しくは骨髄傷害性でない。ＩＶＩＧは動物モデルおよびヒトにおいてＳＬＥを調節することが可能であるのみならず、しかしそれはまた感染を助長するよりはむしろそれに対する防禦も提供しうる。しかしながら、ＳＬＥの治療においてＩＶＩＧを使用することは、現在、費用、作用機序の不十分な理解および臨床的有効性に関する文献に提示されている逸話的報告により制限されている。
【０００５】
抗体はそれらのＨ鎖の構造に基づき異なるクラスに分類される。これらはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥを包含する。同一の定常構造を有する抗体は同一の「アイソタイプ」のものであるとみなされる。異なるアレルの遺伝の結果として異なる抗原決定基を有する同一アイソタイプの抗体は「アロタイプ」と呼ばれる。抗体の抗原結合部位に関連するＬおよび／若しくはＨ鎖の可変領域中の抗原決定基は「イディオタイプ」と呼ばれる。あるイディオタイプに対して生じる若しくは反応する抗体は「抗イディオタイプ抗体」（抗Ｉｄ）と呼ばれる。
【０００６】
特許文献１はヒト抗ＤＮＡ抗体に対するモノクローナル（ｍＡＢ）抗Ｉｄ抗体の製造を開示する。該ｍＡＢは複数のＳＬＥ患者の抗ＤＮＡ抗体上に存在する決定基を結合する。該決定基は好ましくは抗体のＤＮＡ結合部位の外側にある。抗天然ＤＮＡ抗体（ａｎｔｉ−ｎａｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の血清中での測定のための診断試薬、およびＳＬＥに罹っている患者の血清からの抗天然ＤＮＡ抗体の除去方法で使用しうる治療的試薬もまた開示される。
【０００７】
非特許文献１は、ＳＬＥを伴う７例の無関係の患者由来であったヒト−ヒトハイブリドーマにより産生された６０種のポリヌクレオチドに結合するモノクローナルの狼瘡自己抗体中でのイディオタイプの交差反応の評価を記述する。２例の患者からのモノクローナル自己抗体でのウサギ若しくはマウスの免疫感作により３種の抗イディオタイプ試薬を製造した。該３種の試薬のそれらの対応するイディオタイプへの結合は、１種若しくはそれ以上のポリヌクレオチドにより阻害され、該抗イディオタイプが自己抗体の可変領域と反応したことの表示である。モノクローナル抗イディオタイプ試薬は７例の患者のうち６例からの自己抗体と交差反応し、そして１６／６と命名された。無関係の患者からの免疫グロブリンのイディオタイプの交差反応は、該自己抗体が、ＳＬＥを伴う患者により発現される生殖系列遺伝子の関連したファミリー由来であることを示唆する。
【０００８】
非特許文献２は、ＳＬＥ患者の血清由来の抗ＤＮＡ抗体に結合するプールした正常ヒトＩｇＧからの抗Ｉｄ抗体の製造を記述する。ＳＬＥ患者に対するＩＶＩＧの治療効果は部分的に抗イディオタイプ抗体のＩＶＩＧ中での存在によるかもしれないと仮定されている。
【０００９】
この仮説は、ＩＶＩＧから精製した抗Ｉｄ抗体による狼瘡患者由来の抗ＤＮＡを分泌する末梢血単核細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ調節を記述する同一著者によるその後の論文（非特許文献３）でさらに裏付けられた。
【００１０】
非特許文献４は、ＳＬＥと関連する抗ＤＮＡ抗体に関する多数のイディオタイプ（Ｉｄ）マーカーを記述する。これらのマーカーは１６／６、Ｆ４、３Ｉおよび８．１２を包含する。多発性骨髄腫を伴う患者から単離した１００種の陽イオン性ヒトＩｇＧ骨髄腫タンパク質の４３％が、該Ｉｄマーカーの最低１種の存在を示すことが見出された。抗ＤＮＡ Ｉｄのいくつかは会合しているようであるがしかし正確な構造的基礎はさらなる研究を必要とすると述べられている。
【００１１】
特許文献２は、マウスでＳＬＥ様疾患を誘発する（実験的ＳＬＥ）病原性の抗ＤＮＡ ＭａｂのＨ若しくはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分を複製する合成ペプチドを開示する。具体的には、１２〜３０アミノ酸の５ペプチドの配列が開示されている。ＳＬＥ患者から単離したＴリンパ球の増殖応答を阻害するためのこうしたペプチドの使用もまた開示される。
【００１２】
非特許文献５は、１６／６ Ｉｄをもつ病原性の抗ＤＮＡ ＭａｂのＣＤＲ１およびＣＤＲ３の配列に基づく２種のペプチドの合成および特徴付けを記述する。該ペプチドはマウスで実験的ＳＬＥを調節することが見出された。
【００１３】
特許文献３は、抗ＤＮＡ抗体上に位置するイディオタイプ決定基に対する特異性を有する精製した抗Ｉｄ抗体（抗ＤＮＡ抗Ｉｄ）を含んでなる抗体組成物を投与することによるＳＬＥの治療方法を開示する。ＩＶＩＧからの抗ＤＮＡ抗Ｉｄの精製方法もまた開示される。該方法において、イディオタイプ決定基を発現するガンマグロブリン血症を伴う患者からの抗ＤＮＡ骨髄腫抗体を固相に結合する。ＩＶＩＧに該固相を通過させ、そして結合画分を溶出し、該結合画分は抗ＤＮＡ抗Ｉｄを含有する。
【００１４】
特許文献３は自己反応性の自己抗体のイディオタイプ決定基を複製することが可能な合成ペプチドを製造する可能性もまた開示する。こうした決定基は、非特許文献６に記述されているところのコンピュータプログラムに基づくイディオタイプと抗イディオタイプの相互作用の疎水性プロファイルの比較により同定されるかもしれない。これらの合成ペプチドは固相に結合されてもよく、そして上述されたとおりＩＶＩＧから抗ＤＮＡ抗Ｉｄを精製するのに使用してよい。
【００１５】
非特許文献７は、ＳＬＥ患者から単離したポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗ＤＮＡ抗体に対する広範な交差反応性を示すことが見出された４種のＳＬＥ血清からのヒト抗イディオタイプの単離を記述する。該抗イディオタイプは単一の狼瘡患者から調製した、精製済ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡ Ｆ（ａｂ’）２アフィニティーカラム上で単離した。
【００１６】
非特許文献８は、５種のランダムペプチドファージディスプレイライブラリー、ならびに感染していない個体およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により感染した患者からの血清抗体を使用するリガンドのスクリーニングおよび同定を記述する。該ウイルスの数種の免疫優性エピトープを模倣する多量体合成ペプチドを使用して、血清中のＨＣＶに対する抗体を検出する診断アッセイを開発した。
【００１７】
非特許文献９はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）のようなｄｓＤＮＡ上の抗原性および免疫原性エピトープを模倣するペプチドについてファージペプチドライブラリーをスクリーニングするためのＳＬＥ患者の血清から単離した抗ｄｓＤＮＡ抗体の使用を記述する。該合成ペプチドミモトープは配列ＲＬＴＳＳＬＲＹＮＰを有し、そしてｓｓＤＮＡと交差反応する抗ｄｓＤＮＡ抗体陽性ＳＬＥ血清の８８％により認識された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第４，６９０，９０５号明細書（Ｄｉａｍｏｎｄ）
【特許文献２】第ＷＯ ９６／３００５７号明細書（Ｍｏｚｅｓ）
【特許文献３】米国特許第６，２３１，８５６号明細書（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙら、（１９８３）Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１５８（３）：７１８−３０
【非特許文献２】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２９１−５
【非特許文献３】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．とＡｂｄｏｕ，Ｎ．Ｉ．（１９９３）Ｌｕｐｕｓ ２：３７１−３７５
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｊｒ．，Ｒ．Ｃ．ら（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．７３：２１５−２２３
【非特許文献５】Ｗａｉｓｍａｎ，Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４６２０−４６２５
【非特許文献６】Ｍａｉｅｒ，Ｃ．Ｃ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ５：１０７−１１３
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら（２００１）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５３：１９２−１９７
【非特許文献８】Ｍｏｎａｃｉ，Ｐ．ら（２００１）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４７５８−４７６８
【非特許文献９】Ｓｕｎ，Ｙ．ら（２００１）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２２３−２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
自己免疫疾患と関連する抗体中に存在する抗原決定基を模倣する分子を提供することが、本発明の一目的である。
【００２１】
こうした分子の製造方法を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【００２２】
自己免疫疾患を治療するのに使用しうる抗イディオタイプ抗体の製造方法を提供することが、本発明のなおさらなる一目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の第一の局面において：
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞を該アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；
（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体のあるイディオタイプを模倣する分子である）
を含んでなる、１種または複数の自己免疫疾患関連自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）のイディオタイプを模倣する分子の同定方法を提供する。
【００２４】
本発明は、抗原を結合する抗体中よりもむしろ疾患に関連する抗原中に存在する抗原決定基を模倣する分子を単離する以前に記述された方法と異なり、自己免疫疾患と関連する抗体中に存在する抗原決定基を模倣する分子の単離に基づく。
【００２５】
本発明の方法は、本発明の分子および抗体は疾患に罹った個体から採取した血清と接触させずに製造され、その結果生成物は患者への投与に安全であるために、以前に知られている方法と異なる。
【００２６】
本明細の情況において、以下の用語は、別の方法で示されない限り、それらの後に続く意味するところを有する：
自己免疫疾患は自己抗原に対する細胞性および体液性応答の結果である。体液性の優勢な自己免疫状態は、それが今日そうであることが知られているにしろ将来そうしたものとして診断されうるものであるにしろ、患者自身のエピトープの１種若しくはそれ以上を結合する抗体を患者がその経過中に産生する疾患、疾病、障害若しくは症候群を包含する。
【００２７】
今日まで知られている自己免疫疾患は、本発明の背景で挙げられたいかなる疾患、および以下すなわち重症筋無力症（ＭＧ）、先天性重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、スティッフマン症候群、熱帯性痙性対麻痺、ラスムッセン脳炎、急性運動性軸索性神経障害、急性感覚運動性軸索性神経障害、後根神経節神経炎、急性汎自律神経性神経障害、腕神経叢炎、急性壊死性出血性白質脳炎、散発性壊死性ミエロパシー、腫瘍随伴性小脳変性、ギラン・バレー症候群、辺縁系脳炎、眼球クローヌス−筋クローヌス運動失調、感覚神経炎、自律神経性神経障害、脱髄性神経障害、ＡＩＤＳ痴呆複合体、トゥーレット症候群、ミラー・フィッシャー症候群、アルツハイマー病、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、分娩後甲状腺炎、限局性甲状腺炎、若年性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下、Ｉ型（インスリン依存性）糖尿病、アジソン病、下垂体炎、自己免疫性尿崩症、副甲状腺機能低下、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡／妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、後天性表皮水疱症、多形性紅斑、妊娠性ヘルペス、白斑、慢性蕁麻疹、円板状狼瘡、全身性／円形脱毛症、乾癬、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、慢性活動性肝炎／原発性胆汁性肝硬変重複症候群、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、ヘパリン誘発性血小板減少症、原発性自己免疫性好中球減少症、乳児期の自己免疫性（原発性）好中球減少症、骨髄移植後の自己免疫性好中球減少症、後天性自己免疫性血友病、自己免疫性胃炎および悪性貧血、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、唾液腺炎、自己免疫性早発性卵巣機能不全、無精子症、性腺機能低下、精子の自己抗体に関連する男性不妊症、自己免疫性精巣炎、早発性卵巣機能不全、自己免疫性卵巣炎、ブドウ膜炎、網膜炎、症候性眼炎、バードショット脈絡網膜炎、フォークト・小柳・原田肉芽腫性ブドウ膜炎、網膜変性、レンズ誘発性ブドウ膜炎、視神経炎、自己免疫性感音障害、メニエール病、自己免疫性心筋炎、先天性心ブロック（新生児狼瘡）、シャーガス病、アドリアマイシン心毒性、ドレスラー心筋炎症候群、気管支喘息、間隙性線維化性肺疾患、急速進行性糸球体腎炎、自己免疫性尿細管間質性腎炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、フェルティ症候群、大型顆粒リンパ球増加症（ＬＧＬ）、シェーグレン症候群、全身性硬化症（強皮症）、Ｃｒｅｓｔ症候群、混合型結合組織疾患、多発性筋炎／皮膚筋炎、グッドパスチャー病、ヴェーゲナー肉芽腫症、チャーグ−ストラウス症候群、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、結節性動脈周囲炎、ベーチェット症候群、アテローム硬化症、側頭（巨）細胞性動脈炎、高安動脈炎、川崎病、強直性脊椎炎、ライター病、スネドン病、自己免疫性多発性内分泌腺症、カンジダ症−外胚葉性ジストロフィ、生理的クリオグロブリン血性脈管炎、皮膚白血球破砕性血管炎、ライム病、リウマチ熱および心疾患、好酸球性筋膜炎、発作性寒冷血色素尿症、リウマチ性多発性筋痛、線維筋痛症、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経炎、臓器肥大症、内分泌異常症、Ｍ−ｓｐｏｔおよび皮膚病変）、再発性多発性軟骨炎、自己免疫性リンパ増殖症候群、ＴＩＮＵ症候群（急性尿細管間質性腎炎およびブドウ膜炎）、分類不能型免疫不全、ＴＡＰ（抗原提示に関連する輸送体）欠損症、オーメン症候群、過剰ＩｇＭ（ｈｙｐｅｒＩｇＭ）症候群、ＢＴＫ無ガンマグロブリン血症、ヒト免疫不全ウイルスならびに骨髄移植後のいずれかを包含する。
【００２８】
自己免疫疾患関連自己抗体（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）（自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ））は、自己抗原に対し身体により産生されかつ自己免疫疾患の病因若しくは症状に関与若しくは関連するいずれかの抗体である。
【００２９】
分子は、例としてペプチド、タンパク質およびコンビナトリアル化学物質、ならびに単独であれ他の分子とともにであれ例えばポリリシンバックボーン若しくは他の化学的基盤に基づく上のそれぞれの二量体、オリゴマー若しくは多量体（ｎ＝２若しくはそれ以上）を包含する有機若しくは無機、合成若しくは天然のいずれかの分子である。ペプチドおよびタンパク質の場合、分子という用語は、該分子の模倣機能に実質的に影響を及ぼさずに１個若しくはそれ以上のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されているペプチドおよびタンパク質の誘導体もまた包含する。
【００３０】
本発明の情況における模倣（する）は、その構造を必ずしも複製せずにエピトープの三次元（３Ｄ）コンホメーションを再現する能力を有することを意味している。この模倣は完全な複製である必要はなく、そして、模倣する分子が元のイディオタイプと同一の抗Ｉｄ抗体により結合されるであろうように元のイディオタイプのものに十分に類似であるその近似であってもまたよい。
【００３１】
プールした血漿は、複数の健康な被験体からプールした免疫グロブリンを含有する血漿およびその画分を意味している。本発明の当業者は、こうしたプールした血漿は、限定されるものでないがプールした血漿のいかなる免疫グロブリン含有画分も挙げることができることを認識するであろう。プールした血漿のいかなる部分的に精製された若しくは精製された画分も本発明により使用してよい。好ましい一態様において、プールした血漿はＩＶＩＧ若しくはそのいずれかの誘導体である。プールした刺激したＢ細胞、および乳房（初乳）、腎、肺若しくは脳のような免疫グロブリンが豊富であるプールした器官もまた、本発明の範囲内で企図している。
【００３２】
本発明の情況における分子ライブラリーは、本発明により選択すべきイディオタイプを模倣する１種若しくはそれ以上の分子をそれから選択してよい分子の集合体を提供するいかなるライブラリーも意味している。例えばペプチドファージディスプレイライブラリー、コンビナトリアル化学物質ライブラリー、一本鎖抗体ライブラリー、リボソームライブラリーなどを包含する多くのこうしたライブラリーが容易に入手可能である。
【００３３】
患者は、該人の疾患の相若しくは進行に関係なく、および該ヒトが該疾患若しくはその症状のいずれかについて治療されているか若しくはいないかに関係なく、自己免疫疾患に苦しめられているいかなる人も意味している。従って、患者は疾患の活動期（すなわち疾患の症状が発現されている場合）に苦しめられていても、若しくは寛解（すなわち該人が健康であるようにみえる）にあってもよい。
【００３４】
自己抗体は単一の患者若しくは患者の特定の一サブグループから収集してよいことが認識されるであろう。これは、本発明により、ドナーが罹っている特定の下位分類の自己免疫疾患と対応する、模倣する分子の同定を可能にすることができる。あるいは、分類されていない複数の患者からの自己抗体の収集は、例えば異なる予後を特徴とする、複数の異なる分類の同一の自己免疫疾患に対応する模倣分子の同定を可能にするかもしれない。
【００３５】
本発明のアフィニティーマトリックスを形成するのに使用される固相は、カラム、磁性ビーズ若しくはフィルターのようないずれかの適切な形態のエポキシ若しくはホルミル基のような当該技術分野で既知のいずれかの適切な固相であってよい。固相は一般に自己抗体がそれに結合することを可能にするように活性化することができる。活性化の例は、限定されるものでないがＣＮＢｒ活性化および過ヨウ素酸酸化を挙げることができる。
【００３６】
本発明の好ましい一態様によれば自己免疫疾患はＳＬＥである。少なくとも、いくつかの自己免疫疾患において、自己抗体を提供する患者は活動期の自己免疫疾患で苦しめられているかもしれないか、若しくは寛解にあるかもしれないかのいずれかであることが確立されている。従って、得られる抗体の量および型は異なるかもしれず、異なる組の模倣する分子を提供する。
【００３７】
本発明の好ましい一態様によれば、分子ライブラリーはペプチドファージディスプレイライブラリーである。こうしたファージディスプレイライブラリーは、例えば３若しくはそれ以上のアミノ酸を含んでなるペプチド、または例えば環状ペプチドを表示してよい。
こうしたライブラリーの使用は自己抗体のイディオタイプを模倣するペプチドを提供することができ、そして、こうしたペプチドの配列（アミノ酸であろうと核酸であろうと）は、既知の方法により同一のライブラリーから容易に得ることができる。他の態様において、分子ライブラリーはコンビナトリアル化学物質ライブラリー若しくは一本鎖抗体ライブラリーであってもよい。
【００３８】
当業者は、プールした血漿を一連のアフィニティーマトリックス（各アフィニティーマトリックスは異なる自己免疫疾患、若しくは一自己免疫疾患の異なる症状発現からの自己抗体をそれに結合させている）と接触させてよいことをさらに認識するであろう。従って、プールした血漿の１サンプルから、各自己免疫疾患についてプールした血漿を再度収集する必要性なしに多様な模倣する分子を同定することができる。これはプールした血漿のより効率的かつ経済的使用を見込むことができる。
【００３９】
本発明の第二の局面によれば、以下のペプチド：
【００４０】
【表１】
【００４１】
を除外する、ある自己抗体の１イディオタイプを模倣する分子が提供される。
【００４２】
本発明の当業者は、上で挙げられた分子を、ある自己抗体のイディオタイプを模倣する分子の上述された同定方法の段階ａ〜ｆにより製造しうることを認識するであろう。
【００４３】
本発明の一例により、３３種のこうしたペプチドを製造し、そして、以下の配列：
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
を有することが発見された。
【００４７】
こうした分子は多量体の形態にあってもよい。
【００４８】
第三の局面によれば、本発明は、自己免疫疾患に苦しめられている患者に有効量の本発明の分子を投与することを含んでなる、該患者の治療方法を提供する。
【００４９】
本発明のなおさらなる一局面によれば、有効量の本発明の分子を製薬学的に許容できる賦形剤と一緒に含んでなる自己免疫疾患の治療のための製薬学的組成物が提供される。こうした賦形剤は当業者に公知である。
【００５０】
別の局面によれば、本発明は、（ａ）以下のペプチド：
【００５１】
【表４】
【００５２】
を除外する、ある自己免疫疾患の１イディオタイプを模倣する分子を提供すること；（ｂ）スクリーニングした化合物を該分子と接触させること；および（ｃ）該分子に結合する化合物を同定すること（該結合する化合物は自己免疫疾患の治療における潜在的使用を有する）を含んでなる、自己免疫疾患の治療におけるそれらの潜在的使用についての化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００５３】
化合物への該分子の結合は、例えば結合条件（例えば塩濃度、ｐＨなど）の変動を包含する、該分子および選択すべき化合物に適切なところの多くの多様な方法により達成しうることが、本発明の当業者により認識されるであろう。
【００５４】
別の局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿を該アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンを該マトリックスから溶出すること；
（ｅ）複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させること、および該抗Ｉｄにより結合される結合した分子を単離すること（該結合した分子は自己抗体のイディオタイプを模倣する分子である）；
（ｇ）該結合した分子の１種若しくはそれ以上を固相に結合して第二のアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｈ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿を第二のアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｉ）該第二のマトリックスから、自己抗体に対する第二の抗Ｉｄである結合した免疫グロブリンを溶出すること（第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されていない）
を含んでなる、自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されていない、自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法を提供する。
【００５５】
好ましい一態様において、プールした血漿はＩＶＩＧである。
【００５６】
段階（ｄ）の第一の抗Ｉｄと異なり、第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患に苦しめられている患者の血漿成分の血清と接触されていない。これは第二の抗Ｉｄを第一の抗Ｉｄよりも投与により安全にする。健康でない個体の血漿成分による第二の抗Ｉｄの汚染の危険が除去されているためである。
【００５７】
第二の抗Ｉｄは自己免疫疾患に苦しめられている患者の治療方法において有用であり得ることが、本発明の当業者により認識されるであろう。こうした方法は、有効量のこうした抗Ｉｄを患者に投与することを含んでなる。
【００５８】
本発明の別の局面によれば、有効量の本発明の分子で動物を免疫することを含んでなる、自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法が提供される。
【００５９】
さらなる一局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）本発明の既知のイディオタイプ特異性の一連の抗Ｉｄを提供すること；
（ｂ）該自己抗体を該一連の抗Ｉｄと接触させること；および
（ｃ）自己抗体に結合する抗Ｉｄを同定すること（結合した抗Ｉｄのイディオタイプは自己抗体のイディオタイプである）
を含んでなる、自己抗体の特異的１イディオタイプの同定方法を提供する。
【００６０】
本方法は１患者若しくは１分類の患者の特定の自己抗体の診断において有用であり得る。本発明の当業者は、こうした同定が異なる患者に予後を提供して疾患の異なる局面の特徴付けに、および最終的には患者の治療において有用であるかもしれないことを認識するであろう。１患者における１種の自己抗体の特定のイディオタイプが同定されていることは、該患者の治療のために本発明の特定の１分類の分子若しくは抗Ｉｄを選択することを可能にするかもしれない。
【００６１】
なおさらなる一局面によれば、本発明は、以下の段階：
（ａ）被験体を本発明の分子で免疫すること；
（ｂ）該被験体から血清を収集すること；および
（ｃ）該血清からヒト抗Ｉｄ免疫グロブリンを精製すること
を含んでなる、精製されたヒト抗Ｉｄ免疫グロブリンの製造方法を提供する。
【００６２】
本発明を理解するため、およびそれが実務においてどのように実施されうるかを知るために、付随する図面を参照して制限しない例としてのみ好ましい態様を今や記述することができ、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】自己抗体のイディオタイプを模倣する分子を同定するための本発明の方法の一態様を示す流れ図である。
【図２】自己抗体に対する抗Ｉｄの本発明の製造方法の一態様を示す流れ図である。
【図３】７０６ペプチド配列をもつペプチドカラムからのビオチニル化ペプチド７０６、７０７およびＲ７０６への免疫グロブリンピーク溶出の特異的結合を具体的に説明するグラフである。
【図４】７０７ペプチド配列をもつペプチドカラムからのビオチニル化ペプチド７０６、７０７およびＲ７０６への免疫グロブリンピーク溶出の特異的結合を具体的に説明するグラフである。
【実施例】
【００６４】
［実施例Ｉ］
自己免疫−ａ−ａのイディオタイプを模倣する分子の同定方法の一態様を図１に具体的に説明する。
【００６５】
参照数字２により図１中で示される該方法の第一段階は、自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製することを必要とする。例えば、抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体をＳＬＥに罹っている数十例の患者（狼瘡患者）から精製してよい。次の段階４において、自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成する。上の例に従えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに結合する。
【００６６】
後に続く段階６は、免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿をアフィニティーマトリックスと接触させること、次いで未結合の血漿成分の除去の段階８を含んでなる。該実施例において、ＩＶＩＧをアフィニティーカラムに負荷し、それをその後洗浄して未結合の免疫グロブリンを除去する。抗ｄｓＤＮＡ抗体を結合する免疫グロブリンのみがカラムに結合されたまま留まる。
【００６７】
次の段階１０において、結合した抗イディオタイプ抗体（＝抗Ｉｄ）をアフィニティーマトリックスから溶出する。該実施例において、これらは抗−抗ｄｓＤＮＡ抗イディオタイプであることができる。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、および狼瘡実験モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで、抗Ｉｄの効力を確認してよい１２。
【００６８】
後に続く段階１４において、複数の分子メンバーを含んでなる分子ライブラリーを提供し、そして、溶出した抗Ｉｄを該分子ライブラリーと接触させる。抗Ｉｄにより結合されている分子を単離かつ同定する１６。これらの分子は自己抗体の１イディオタイプを模倣する。上の実施例において、抗ｄｓＤＮＡ抗体をＣ７Ｃ−ペプチドファージディスプレイライブラリーに導入し、そして該抗体により結合されたペプチドを単離かつ同定する。これらのペプチドは抗ｄｓＤＮＡ抗体のイディオタイプを模倣する。その後、模倣するペプチドを合成してよい１８。
【００６９】
［実施例ＩＩ］
自己抗体に対する抗Ｉｄの製造方法の一態様を図２に示す。
【００７０】
第一段階２２において、図１に具体的に説明された方法により得た模倣する分子を固相に結合して第二のアフィニティーマトリックスを形成することにより、アフィニティーマトリックスを形成する。模倣する分子は、分子ライブラリーから単離されたものであっても、若しくは単離された分子に基づき合成した他の分子であってもよい。図１に関して示された実施例に従えば、これらは抗ｄｓＤＮＡ抗体のイディオタイプを模倣するペプチドであることができる。
【００７１】
次の段階２４において、免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿をこの第二のアフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去する２６。該実施例において、ＩＶＩＧをカラムに負荷し、それをその後洗浄して未結合の免疫グロブリンを除去する。後に続く段階２８において、抗Ｉｄをアフィニティーマトリックスから溶出する。抗Ｉｄの効力を例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ試験によりおよび狼瘡実験モデルを使用してｉｎ ｖｉｖｏで確認してよい３０。これらの第二の抗Ｉｄは、自己免疫疾患の患者の血清由来のタンパク質と接触されておらず、患者の治療での使用に安全である。例えばそれらは狼瘡患者を治療するのに使用してよい。
【００７２】
［実施例ＩＩＩ］
１種の自己抗体のイディオタイプを模倣する分子の同定
１．材料および方法
実施例Ｉで上述されたところのＩＶＩＧから単離した抗−抗ｄｓＤＮＡ（抗Ｉｄ）を使用して、Ｍ１３ファージにより提示される特異的ペプチドを検出した。商業的Ｐｈ．Ｄ．７ＴＭファージディスプレイライブラリー（カタログ番号Ｅ８１００Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）を、発明者により以下のとおりわずかに改変した製造元の手順に従って使用した：
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（Ｐｈ８．５）中の抗Ｉｄを、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ ＃２１３３５）を添加することによりビオチニル化し、氷上で２時間インキュベートしかつ２％麦芽糖に対し透析した。ビオチニル化の効率はニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎｅ）被覆プレート上でのＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【００７３】
ビオチニル化抗Ｉｄ（１μｇ）をペプチドファージディスプレイライブラリー（１０μｇ−２×１０１１ｐｆｕ）に４℃で一夜導入した。混合物を、３％ＢＳＡでブロッキングしたストレプトアビジン被覆ペトリ皿（３ｃｍ、Ｎｕｎｃ）に入れた。２０分のインキュベーション後に、ストレプトアビジンとファージとの間の非特異的な低親和性結合を、ビオチン０．１ｍＭを５分間添加することにより予防した。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎでの徹底的な洗浄後に、結合したファージをグリシン−ＨＣｌ ０．２Ｍ ｐＨ２．３で溶出しかつトリスｐＨ９で即座に中和した。
【００７４】
溶出されたファージを対数中期（ＯＤ６００ 約０．５）でＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株に導入し、そして室温で５分間インキュベートしてファージを細菌に進入させ；その後複製のため４．５時間インキュベートし、そして細菌を遠心分離により沈降させた。４℃でのＰＥＧ−８０００ １：５とのインキュベーションによりファージを上清から単離した。増幅されたファージを、第２回のため、元のビオチニル化抗Ｉｄとともに再度インキュベートした。最後に、同一手順を使用して５回の増幅手順を実施した。各回の間に、ファージを再度Ｆｃ被覆プレート上でのパニングにかけてＦｃ結合ファージを最大限に抹消（ｄｅｌｅｔｅ）した。
【００７５】
１０倍連続希釈の、最後の回からの溶出されたファージをトップアガロースと混合し、そしてＬＢ／ＩＰＴＧ／ＸＧＡＬプレート上にプレーティングした。青色プラークを収集し、そして各プラークをファージ収集のため１０ｍｌ ＬＢ中で４．５時間個別に増殖させ、そして遠心分離した。ファージはＰＥＧ−８０００ １：５とともに上清をインキュベートすることにより培養物から単離した。
【００７６】
８４７個のコロニーをＥＬＩＳＡにより抗Ｉｄによる認識についてスクリーニングした。プレート（９６ウェル）をヤギ抗Ｍ１３で被覆し、３％ＢＳＡおよびヘモシアニンでブロッキングし、そしてファージとともにインキュベートした。ビオチニル化抗Ｉｄ若しくはビオチニル化した個々のＩｇＧ（陰性対照としての１人から）で結合をプロービングし、次いでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよび適切な基質に曝露した。最後に、３３クローンが抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄに対し有意に陽性であることが見出され、かつ、１人の健康なドナーからアフィニティー精製したＩｇＧにより認識されなかった。
【００７７】
陽性クローンは、製造元の手順に従ってキアプレップ（ＱＩＡｐｒｅｐ）Ｍ１３（ＱＩＡＧＥＮＥ カタログ番号２７７０４）を使用してＤＮＡ調製のためファージを５．５時間増幅するためにＥＲ２７３８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株に導入した。簡潔には、上清を、少量ＤＮＡ調製物のための１．４ｍｌ、およびＬＢ中でのＥＲ２５３７（一夜培養物からの１００倍希釈した細菌ＥＲ２５３７）への導入のための残部に分けた。沈殿溶液を１．４ｍｌの上清チューブに添加し、ボルテックス攪拌しかつＲＴで７分間放置した。混合物を２回の７００μｌ／ミニカラムでミニカラム／２ｍｌチューブに負荷した。チューブは第一および第二の負荷後にＲＴで８，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。溶解緩衝液をカラムに添加し（７００μｌ／カラム）、ＲＴで１分インキュベートしかつ遠心分離した。洗浄緩衝液を７００μｌ／カラム添加し、そしてカラムをＲＴで８，０００ｒｐｍ、１５秒遠心分離し、液体を廃棄しかつカラムを再度遠心分離した。カラムを滅菌チューブに接続した。予め加温した（５０℃）溶出緩衝液をカラム上に添加した（５０μｌ／カラム）。カラムをＲＴで１０分インキュベートし、そしてＲＴで１４，０００ｒｐｍで２分遠心分離した。
【００７８】
ＤＮＡ調製物を、ｍｂｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、イスラエル国ネス−ジオナ（Ｎｅｓ−Ｚｉｏｎａ）によりシークェンシングした。
【００７９】
ペプチドはＴｈｅ Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、イスラエル国レホボト（Ｒｅｈｏｖｏｔ）で環状ペプチドとして合成した。ペプチド配列を表１に列挙する：
【００８０】
【表５】
【００８１】
２．合成ペプチドへの抗Ｉｄの直接結合：
ペプチドへの抗Ｉｄの結合をＥＬＩＳＡにより試験した。
【００８２】
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのペプチドにより４℃で一夜被覆した。プレートを３％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングした。抗Ｉｄを多様な濃度で添加した。１ドナーから精製したＩｇＧを陰性対照として使用した。
【００８３】
アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよび適切な基質で免疫グロブリンの結合をプロービングした。各段階の間に０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで徹底的な洗浄を実施した。
以下のペプチドを使用した：
【００８４】
【表６】
【００８５】
結合の結果（４０５ｎｍでのＯＤ）を表２に提示する。
【００８６】
【表７】
【００８７】
３．直接結合合成ペプチド：
上と同一のプロトコルを使用したが、しかしこの試験で使用したペプチドは、前の実験で最初のペプチドであるペプチド番号１を除き文献から採用した。
【００８８】
使用したペプチドは：
【００８９】
【表８】
【００９０】
であった。
【００９１】
【表９】
【００９２】
４．混合環状ペプチドでの阻害パーセント
上の２節（「合成ペプチドへの抗Ｉｄの直接結合」）で示した１５種の環状ペプチドの混合物を使用して、７例の狼瘡患者のそれぞれからアフィニティー精製した抗ｄｓＤＮＡ抗体への抗Ｉｄの結合を阻害した。混合物は狼瘡患者の抗ｄｓＤＮＡ Ｉｄ（１種若しくは複数）の認識確率を増大させるよう作成した。
【００９３】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＮａＨＣＯ３ ０．０５Ｍ ｐＨ８．５中、抗Ｆｃ ２μｇ／ｍｌで４℃で一夜被覆した。こうして、抗ｄｓＤＮＡの免疫グロブリン分子のＦ（ａｂ）部分がイディオタイプをより効率的に提示することができる。
【００９４】
プレートを３％ＢＳＡで３７℃で１時間ブロッキングし、そして各ヒト抗ｄｓＤＮＡ抗体溶液をＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌで添加しかつ４℃で一夜インキュベートした。別個のチューブに、ペプチド混合物１を、４℃での一夜インキュベーションのため、ＩＶＩＧからのビオチニル化抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄ（抗ｄｓＤＮＡへの５０％結合の濃度の）に多様な濃度で添加した。翌日、抗Ｉｄおよびペプチド混合物の混合物を抗ｄｓＤＮＡ被覆したプレートに４時間添加した。ペプチド混合物により認識されなかった未結合の抗Ｉｄの結合を、アルカリホスファターゼと結合したストレプトアビジンおよび適切な基質でプロービングした。
【００９５】
表４に提示した結果は、ペプチド混合物による、特定の１狼瘡患者からの抗ｄｓＤＮＡへの抗ｄｓＤＮＡ抗Ｉｄの結合のＩＶＩＧの特定の画分の阻害のパーセンテージを示す。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
［実施例ＩＶ］：自己免疫疾患のイディオタイプ模倣の単離のための鋳型としてのＩＶＩＧおよび／若しくはプールした血漿の使用。
１．緒言：
本実施例は、共通のＳＬＥイディオタイプすなわちＩｄ １６／６の同定をもたらした慣習的方法での直接選択の実験的立証を提供する。１６．６ ＣＤＲ、ＣＤＲ３に基づくペプチドの１種がマウスでＳＬＥの症状を引き起こし得る一方、ＣＤＲ１の優勢な（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅ）機能は実験的ＳＬＥマウス（１）において疾患を軽減することであることが判明している。
【００９８】
１６／６ Ｉｄをもつ病原性マウスモノクローナル抗ＤＮＡ Ａｂ（５Ｇ１２）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列に基づく２種のペプチドを合成した。ｐＣＤＲ１（ＣＤＲ１−ＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ）およびｐＣＤＲ３（ＣＤＲ３−ＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ）（ＣＤＲに下線を引いてある）が、それぞれＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬマウス系統における免疫優性のＴ細胞エピトープであることが示され、そして応答体（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）マウスにおいて軽度のＳＬＥ様疾患を誘発した（Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ，Ｕ．編（Ａｌｍｑｖｉｓｔ ＆ Ｗｉｋｓｅｌｌ、ストックホルム）中、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｅｉｌａｎ，Ｈ．、Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ｓ．とＧｅｉｓｅｒ，Ｔ．（１９８４）、ｐｐ．１８５−１８８）。さらに、ＣＤＲに基づくペプチドは、同一ペプチドまたはマウス若しくはヒトいずれかの起源のモノクローナル抗ＤＮＡ １６／６Ｉｄ＋ Ａｂで免疫したマウスのリンパ節細胞（ＬＮＣ）のプライミングを阻害した。ＣＤＲ１に基づくペプチドはまた、ｐＣＤＲ１若しくは病原性自己Ａｂのいずれかで後に免疫したＢＡＬＢ／ｃ新生マウスにおける自己Ａｂ産生を予防することも示された（Ｋｅｎｔ、前掲書）。
【００９９】
２．材料および方法
２．１ 合成ペプチド。
７０６と呼称される１６．６モノクローナル抗体ＣＤＲ１に基づくペプチドＴＧＹＹＭＱＷＶＫＱＳＰＥＫＳＬＥＷＩＧ（ｐＣＤＲ１）および７０７と呼称されるＣＤＲ３に基づくペプチドＹＹＣＡＲＦＬＷＥＰＹＡＭＤＹＷＧＱＧＳ（ｐＣＤＲ３）を、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）戦略のための会社のプロトコルを使用して、自動化合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍモデル４３０Ａ）で製造した（Ｋｅｎｔ、前掲書、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ，、Ａｌｅｗｏｏｄ，Ｐ．Ｆ．とＫｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４０、１８０−１９３）。Ｒ７０６と呼称される逆順のＣＤＲ１、ＧＩＷＥＬＳＫＥＰＳＱＫＶＷＱＭＹＹＧＴを対照として使用した。別の類似の合成において、生じるペプチドを、後にＥＬＩＳＡ試験で使用するためにそれらのＮ末端でビオチンにより標識した。
【０１００】
２．２ アフィニティークロマトグラフィー：ペプチドカラムの調製
２．２．１ 還元的アミノ化によるペプチド７０７のカップリング
２．２．１．１ 活性化プロトコル
ａ．過ヨウ素酸酸化可能なマトリックスの創製
１０ｍｌのトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）ＮＨ６５Ｆ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ、日本）を焼結グラスフィルター（多孔性Ｇ３）上で３００ｍｌの水で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＯＨで５回連続して（合計８０ｍｌ）洗浄した。樹脂を焼結グラスフィルターから取り出し、そして１０ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨ、１ｍｌのグリシドール（Ｓｉｇｍａ）および０．０１ｇのホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ４）で懸濁した。反応混合物を穏やかな回転を伴い室温で一夜インキュベートした。朝に、樹脂を２００ｍｌの水、１Ｍ ＮａＣｌおよび再度水のそれぞれで徹底的に洗浄した。グリシドール修飾樹脂は今や過ヨウ素酸酸化の準備ができた。
ｂ．マトリックスの直接過ヨウ素酸酸化
過ヨウ素酸酸化樹脂を調製するために以下のプロトコルを設計した。すなわち、ビシナルヒドロキシル基を含有する１０ｍｌの水分を含むゲルを１０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＩＯ４（１００ｍｌの水中の４．２８ｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウム）に再懸濁し、そして穏やかな回転により十分に混合した。反応を室温で９０分間継続した。ホルミル樹脂を３００ｍｌの水により洗浄して酸化を停止した。この手順により創製されるアルデヒドは、カップリング能力の低下を伴わずに樹脂が長期間保存されることを可能にするのに十分安定である。
【０１０１】
２．２．１．２ リガンドカップリングプロトコル
ＮａＣＮＢＨ４および特定のペプチドを含有する１ｍｌのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を２ｍｌの過ヨウ素酸酸化マトリックスに添加した。リン酸緩衝液中のペプチドの濃度は１０ｍｇ／ｍｌ（約３．３μモル／ｍｌ）であった。従って、該比は１ｍｌの樹脂に対し１．１μモルの７０７であった。反応を攪拌しながら室温で一夜継続した。カップリングした樹脂を水、１Ｍ ＮａＣｌおよび再度水で徹底的に洗浄して、未反応のリガンドおよびシアノホウ水素化ナトリウムを除去した。
【０１０２】
樹脂は２０Ｍｍリン酸緩衝液ｐＨ７中で保存した。
２．２．２ ＣＮＢｒ活性化マトリックスへのペプチド７０６のカップリング３ｇの凍結乾燥したＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４ファストフロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）を２０ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌ（氷冷）に懸濁した。樹脂を２００ｍｌの酸を使用して焼結グラスフィルター（多孔性Ｇ３）上で１５分間激しく洗浄した。
最終洗浄後に、２ｍｌの洗浄した樹脂を、カップリングされるべきペプチドを溶解しておいたカップリング溶液中に移した。カップリング溶液は９００μｌの０．１−Ｍ炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ８．５および１００μｌの１００ｍｇ／ｍｌのペプチド７０６を含有した。樹脂に対するペプチドの比は再度１ｍｌの樹脂あたり１．１μモルであった。混合物を４℃で一夜回転した。カップリング後、樹脂を含むバイアルを樹脂の沈降のため垂直位置で放置した。上清を廃棄し、そして、樹脂上の残存する活性基の封鎖のため１５ｍｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０を添加した。封鎖は回転しながら室温で４．５時間実施した。
【０１０３】
封鎖後に、樹脂を１０カラム容量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ８．５で洗浄し、次いで３周期の交替するｐＨで洗浄した。各周期は、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４の１５ｍｌ洗浄、次いで０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８での洗浄よりなった。
【０１０４】
樹脂を０．０５Ｍトリス ｐＨ７．４中に保存した。
２．３ アフィニティークロマトグラフィー：ペプチドカラムを使用する静脈内免疫グロブリン溶液からの抗イディオタイプの精製。
【０１０５】
ペプチドカラムを、２８０ｎｍでの吸光度測定値が安定（ＯＤ約０．００５）になるまで、最低１０容量の負荷緩衝液（２０ｍＭ ＰＢ）で洗浄した。
【０１０６】
１００ｍｌの希釈ＩＶＩＧ（オムリガム（ＯｍｒｉＧａｍ）、（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、イスラエル）製造工程の工程サンプルＧ１２中、高精製二重不活性化ＩＶＩＧ）を２ｍｌペプチド樹脂の上部に負荷した。出発原料の濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。この濃度に達するために、ＩＶＩＧをリン酸緩衝液、ｐＨ７で希釈して所望のモル濃度に達せさせた。負荷はおよそ１００μｌ／分の流速で４℃で一夜進行させた。負荷は２回実施した。その後、２８０での吸光度がベースラインに達するまで、カラムを負荷緩衝液で洗浄した。溶出は、溶出物を中和するための１Ｍトリス塩基緩衝液ｐＨ９中へ、０．１Ｍグリシン、ＨＣｌ ｐＨ２．７を用いて行った。各溶出は１ピーク（通常は１ｍｌカラムから約４〜５ｍｌ）よりなった。溶出および負荷中のタンパク質はブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８）により測定した。
【０１０７】
２．４ アフィニティークロマトグラフィー段階の効率：ＥＬＩＳＡ
ペプチドカラム溶出物（７０６および７０７）の結合効率を測定するために以下のＥＬＩＳＡを実施した：
マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔｅｒ、米国）を、０．１Ｍ、ｐＨ８．８の炭酸−重炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ 米国）に懸濁した１０μｇ／ｍｌのニュートラビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）で２〜８℃で一夜被覆した。被覆溶液を除去し、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ）で３回洗浄し、そしてウェルあたり２００μｌのブロッキング溶液（新たに調製した１％Ｉ Ｂｌｏｃｋ、Ｔｒｏｐｉｘ、米国）を添加しかつ３７ ℃で１時間インキュベートした。被覆しかつブロッキングしたプレートは使用前に１か月間−２０℃で保存し得る。
【０１０８】
ブロッキング溶液で希釈した、試験されるサンプルを、個別のチューブ中にて１μｇ／ｍｌ（最終濃度）の適切なビオチニル化ペプチドと混合し、そして混合物を３７℃で１時間インキュベートした。その後、各反応チューブからの１００μｌを、ブロッキングしたマイクロタイタープレートに移し、そして３７℃で１／２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液で希釈した５０００倍アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ、米国からのＨおよびＬ鎖）１００μｌを該マイクロタイターウェルに適用しかつ１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼの酵素活性はその場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ 米国）との室温での一夜インキュベーションにより示される。測定を４０５ｎｍで測光的に行った。
【０１０９】
３．結果および考察。
２００ｍｌのＩＶＩＧを２ｍｌのペプチドカラム（一方はＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）マトリックスに結合するペプチド７０６、および他方は還元的アミノ化によりポリマーマトリックスに結合する７０７ペプチドよりなる（材料および方法を参照されたい））のそれぞれに負荷した。
【０１１０】
タンパク質濃度およびビオチニル化ペプチドの結合を試験し、そして結果を表５ならびに図３および４に提供する。
【０１１１】
【表１１】
【０１１２】
結合したピークの溶出は異なる回収、すなわち、カラムペプチド７０６について約０．０１８％対カラムペプチド７０７について約０．０４７をもたらした。従って、ペプチドカラム７０６はプールしたＩＶＩＧ中で見出される５５５５種の分子から１種を結合する能力を有する一方、ペプチドカラム７０７は２２３７種の免疫グロブリン分子から１種を結合する能力を有すると結論づけ得る。従って、７０７のエピトープがより豊富でありかつＩＶＩｇ中でより高頻度で見出し得ると想定し得る。
【０１１３】
溶出ピークの特異性を、３種のビオチニル化ペプチド（７０６、７０７およびＲ７０６）に対するペプチドカラム溶出ピークへの特異的結合により評価し、そして結果を図３および４に要約する。
【０１１４】
ペプチド７０６をもつペプチドカラムから溶出された免疫グロブリンは、７０６のビオチニル化ペプチドとのみ直線状の様式で特異的に反応し、そしてペプチド７０７若しくは逆の順序の同一配列をもつペプチドとさえ反応しなかったことが示され得る（図３）。他方、ペプチド７０７と結合されたペプチドカラムからの溶出ピークは非特異的様式で反応した（図４）。生じる免疫グロブリンはビオチニル化ペプチド７０６と反応し、かつ、なおより興味深いことに、該免疫グロブリンは７０６の逆にした配列となおより強く反応した。７０７−免疫グロブリン調製物が７０７および７０６のペプチド配列ならびにおそらく多数の他の配列と非特異的に反応するかもしれないことを示す。
【０１１５】
上の結果は、Ｉｄ１６．６上で見出される全部のＣＤＲ配列が特異的であるわけでなく、かつ、それらの少なくともいくつかは非特異的様式でＩＶＩｇと反応することを示した。
【０１１６】
これらの結果は、ＳＬＥ患者由来のモノクローナルの使用が免疫グロブリンの非特異的選択をもたらしうるという概念を裏付ける。
【０１１７】
【表１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一覧：
【表１】
【表２】
から選択され、
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）前記自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞を前記アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンを前記マトリックスから溶出すること；
（ｅ）ランダムヘプタペプチドをディスプレイするペプチドファージディスプレイライブラリーまたはコンビナトリアル化学物質ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）前記抗Ｉｄを前記ライブラリーと接触させること、および前記抗Ｉｄにより結合される結合したペプチドを単離すること（前記結合したペプチドは自己抗体のイディオタイプを模倣するが、イディオタイプの構造を複製しないペプチドである）
を含んでなる方法によって得られる、
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）イディオタイプ（Ｉｄ）エピトープ模倣ヘプタペプチド。
【請求項１】
以下の一覧：
【表１】
【表２】
から選択され、
（ａ）自己免疫疾患に苦しめられている１人若しくはそれ以上の患者の血清から自己抗体を精製すること；
（ｂ）前記自己抗体を固相に結合してアフィニティーマトリックスを形成すること；
（ｃ）免疫グロブリンを含んでなるプールした血漿若しくはＢ細胞を前記アフィニティーマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；
（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンを前記マトリックスから溶出すること；
（ｅ）ランダムヘプタペプチドをディスプレイするペプチドファージディスプレイライブラリーまたはコンビナトリアル化学物質ライブラリーを提供すること；ならびに
（ｆ）前記抗Ｉｄを前記ライブラリーと接触させること、および前記抗Ｉｄにより結合される結合したペプチドを単離すること（前記結合したペプチドは自己抗体のイディオタイプを模倣するが、イディオタイプの構造を複製しないペプチドである）
を含んでなる方法によって得られる、
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）イディオタイプ（Ｉｄ）エピトープ模倣ヘプタペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−１００３６１（Ｐ２０１３−１００３６１Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−３３２２５（Ｐ２０１３−３３２２５）
【出願日】平成２５年２月２２日（２０１３．２．２２）
【分割の表示】特願２００９−２９７６０５（Ｐ２００９−２９７６０５）の分割
【原出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【出願人】（５０４４３８８５３）オムリクス・バイオフアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年２月２２日（２０１３．２．２２）
【分割の表示】特願２００９−２９７６０５（Ｐ２００９−２９７６０５）の分割
【原出願日】平成１５年５月２２日（２００３．５．２２）
【出願人】（５０４４３８８５３）オムリクス・バイオフアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド (5)
【Ｆターム（参考）】
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