抗インテグリン免疫グロブリン
インテグリンに対する免疫特異性を示す組換えヒト免疫グロブリンについて述べる。さらに、該組換え免疫グロブリンをコードするヌクレオチド配列およびペプチド配列ならびにそれらの使用について述べる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫グロブリンに関し、より具体的には、全くそれだけというわけではないが、インテグリンに対する特異性を示す組換え免疫グロブリンに関する。本発明はさらに、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列およびペプチド配列ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、αサブユニット鎖およびβサブユニット鎖から構成される、構造的、免疫化学的および機能的に関連するヘテロダイマー分子のファミリーである。現在、限定された様式で非共有結合により相互作用して２０種を超えるファミリー構成分子を形成する、少なくとも８種の既知のβ鎖および少なくとも１７種の既知のα鎖が存在する。
【０００３】
インテグリンは、細胞外マトリックスから細胞内の細胞骨格へと一体化（インテグレート）するのでそのように命名されたレセプターであり、細胞間相互作用（例えば、細胞接着、細胞移動および凝血反応）に関与する。従って、インテグリンは、血液凝固の間に血小板凝集を阻止するだけでなく抗炎症性の試薬としても作用する試薬の開発を可能にすることによって、治療的介入のための良好な候補をなす。このことは、フィブリノゲンに対するレセプター（すなわち、血小板インテグリン糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）を標的とするＡｂｉｃｉｍａｘのような免疫グロブリン試薬の存在によって実証されている。フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの間の相互作用は、血小板の最初の凝集（すなわち血液凝固）における重要な事象である。血小板の凝集および接着は、心臓発作および脳卒中による死亡の主要な原因であり続ける血栓症における基礎的な事象である。
【０００４】
試薬Ａｂｉｃｉｍａｘは、インテグリン糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａと反応するだけでなく、インテグリンＭＡＣ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４およびｐ１５０．９５とも反応することが示されており、従ってこれらのインテグリンは抗炎症の治療標的としての可能性も有する。
【０００５】
しかし、Ａｂｉｃｉｍａｘの主な不利益は、これが「ヒト化」されたマウス・モノクローナル抗体に由来することである。マウス・モノクローナル抗体のヒト化は、このマウス抗体分子の、同抗体とその標的抗原との直接的な相互作用に関与しない部分（すなわち、この抗体の枠組構造領域）を、ヒトの相当物によって置換することを含む。これは面倒な手法であり、標的抗原との相互作用に関与する抗体分子の部分（すなわち、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ））の親和性ひいては治療的潜在能力を有意に喪失させてしまう可能性がある。
【０００６】
インテグリン間が類似しているということは、免疫グロブリン・ライブラリーから単離された少数の抗体を使用することにより、各々が異なるインテグリンと反応する様々な免疫グロブリンのパネルを作製するための鋳型が得られるということである。残念ながら、上記のようなマウス／ヒト・ハイブリッド免疫グロブリンを適切な鋳型として使用することは困難である。
【０００７】
マウス・モノクローナル抗体の使用に代わる手法は、抗体の枠組構造領域の置換を必要としないと思われるヒト免疫グロブリンの生産である。次いで、当該抗体を、異なるインテグリンに反応性を示す抗体のパネルを開発するための鋳型として使用すればよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ヒト糖タンパク質インテグリンに対するヒト免疫グロブリンの主な不利益は、潜在的に病原性の分子に対してヒト患者を免疫することをめぐる倫理的な問題に起因して、該ヒト免疫グロブリンを生産するのは容易ではないということである。従って、ヒト患者を最初に免疫することなく、ヒト・インテグリンとの結合親和性を有するヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を生産する必要がある。
【０００９】
本発明の実施形態の目的は、上記の問題に取り組むことならびにインテグリンに対する親和性を有する免疫グロブリンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［定義］
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる少なくとも１つのポリペプチドから構成されるタンパク質を含み得る。既知の免疫グロブリン遺伝子には、κ定常遺伝子、λ定常遺伝子、μ定常遺伝子、γ定常遺伝子、ζ定常遺伝子、α定常遺伝子およびε定常遺伝子、ならびにさらには、多数存在する免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、抗体全体およびその生物学的に機能的な断片のいずれの抗体としても存在し得る。このような生物学的に機能的な断片は、対応する完全長の抗体のうち少なくとも１つの抗原結合領域を保持する（すなわち、インテグリンに対する免疫特異性を備えている）。免疫グロブリンは、モノクローナル抗体またはその機能的断片を含み得る。
【００１１】
１価の免疫グロブリンは、ジスルフィド架橋によって軽鎖（Ｌ）と結合した重鎖（Ｈ）を含むダイマー（ＨＬ）である。２価の免疫グロブリンは、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合した２つのダイマーを含むテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価の免疫グロブリンを、例えば、複数のダイマーを連結することによって生産することも可能である。
【００１２】
免疫グロブリンまたは抗体分子の基本的構造は、非共有結合的に結合し、ジスルフィド結合によって連結され得る、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される。各重鎖および軽鎖は、約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域と、鎖の残りの部分の定常配列とを含む。この可変領域は、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原に対する抗体分子の特異性を決定するいくつかの超可変領域（すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。重鎖および軽鎖のＣＤＲの両側が枠組構造領域であり、ＣＤＲを係留および配向する比較的保存されたアミノ酸配列である。この定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、αまたはε）のうち１つおよび２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうち１つから構成される。重鎖定常領域の配列は、抗体のアイソタイプおよび分子のエフェクター機能を決定する。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「ヒト免疫グロブリン」または「ヒト・モノクローナル抗体」は、ある特定のヒト免疫グロブリン中に見出されるのと実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を含むモノクローナル免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を意味することを意図する。重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列は、基準となる配列と比較した場合に、かなりの量または程度の配列同一性を示す。このような同一性とは、特定のヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体のアミノ酸配列を示すものとして明確に知られている、または特定のヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体のアミノ酸配列を示すものと認識することができる。実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の軽微な修飾または保存的置換を有し得る。このようなヒト免疫グロブリンは、インテグリン抗原に選択的に結合するその機能を保持している。用語「ヒト・モノクローナル免疫グロブリン」は、ヒトＣＤＲアミノ酸配
列を実質的に有するモノクローナル免疫グロブリンを含むことを意図し、該モノクローナル免疫グロブリンは、例えば、生産物がファージ・ライブラリーであるような組換え法により、リンパ球またはハイブリドーマ細胞により生産される。用語「組換えヒト免疫グロブリン」は、組換えＤＮＡ技術を使用して生産されたヒト免疫グロブリンを含むことを意図する。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「抗原結合領域」は、抗原に対する特異的結合親和性を有する免疫グロブリンの領域を意味することを意図する。この結合領域は、超可変領域ＣＤＲでもよいし超可変領域ＣＤＲの機能的部分でもよい。ＣＤＲの「機能的部分」という用語により、ＣＤＲ内の、抗原に対する特異的親和性を示す配列を意味することを意図する。ＣＤＲの機能的部分は、インテグリンに特異的に結合するリガンド（例えば、フィブロネクチン中に存在する「ＲＧＤ」モチーフまたはテネイシン中に存在する「ＡＥＩＤＧＩＥＬ」）を含んでいてもよい。インテグリンを認識する他のリガンドまたはモチーフは、本明細書中に援用するプロウら（Plow et al. ）の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻第２９号）中に記載されている。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＤＲ」は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域中の超可変領域を意味することを意図する。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々の中には、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、各鎖上に少なくとも３つのＣＤＲが存在し、該ＣＤＲは、合わせて構成されると抗原結合部位（すなわち、抗原が結合または特異的に反応する３次元結合部位）を形成する。重鎖中に４つのＣＤＲが存在し得ると仮定されている抗体もある。
【００１６】
ＣＤＲの定義はまた、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸がわかれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかをごく普通に決定することができる。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、用語「機能的断片」は、ヒト免疫グロブリンに関して使用される場合、機能的活性を保持している免疫グロブリンの一部分を指すことを意図する。機能的活性とは、例えば、抗原結合活性でも抗原特異性でもよい。機能的活性はまた、例えば、抗体の定常領域によって提供されるエフェクター機能であってもよい。ヒト・モノクローナル免疫グロブリンの機能的断片には、例えば、個々の重鎖または軽鎖およびそれらの断片（例えば、ＶＬ、ＶＨおよびＦｄ）；１価の断片（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’）；２価の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）；単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）；ならびにＦｃ断片が含まれる。このような用語は、例えば、本明細書中に援用する、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、「Antibodies: A Laboratory Manual 」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）、１９８９年；「Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference」、マイヤーズ アール．エイ．（Myers, R.A. ）編、ニューヨーク所在のブイシーエイチパブリッシャーインコーポレイテッド（VCH Publisher, Inc. ））；ヒューストンら（Huston et al. ）、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、第２２巻、ｐ．１８９〜２２４、１９９３年；プラックサム（Pluckthun ）およびスケッラ（Skerra）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１７８巻、ｐ．４９７〜５１５、１９８９年、ならびにデイ，イー．ディー．（Day, E.D. ）、「Advanced Immunochemistry 第２版」、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のワイリー−リスインコーポレイテッド（Wiley-Liss, Inc.）、１９９０年の中に記載されている。
【００１８】
用語「機能的断片」は、例えば、ヒト・モノクローナル抗体のプロテアーゼによる消化または縮減によって、および当業者に公知の組換えＤＮＡ法によって生産される断片を含
むことを意図する。
【００１９】
用語「ＶＬ断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の軽鎖の断片を指し、この断片は、ＣＤＲなど、軽鎖可変領域の全てまたは一部を含む。ＶＬ断片は、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
【００２０】
用語「ＶＨ断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の重鎖の断片を指し、この断片は、ＣＤＲなど、重鎖可変領域の全てまたは一部を含む。
用語「Ｆｄ断片」とは、本明細書中で使用する場合、重鎖の可変領域および定常領域に連結された軽鎖の可変領域および定常領域をいう（すなわち、ＶＬ ＣＬおよびＶＨ ＣＨ−１）。
【００２１】
用語「Ｆｖ断片」とは、本明細書中で使用する場合、重鎖および軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、重鎖および軽鎖の定常領域を含まない、ヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。重鎖および軽鎖の可変領域は、例えばＣＤＲを含む。例えば、Ｆｖ断片は、重鎖および軽鎖の両方の約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域の全てまたは一部を含む。
【００２２】
用語「Ｆａｂ断片」とは、本明細書中で使用する場合、Ｆｖ断片よりも大きいヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。例えば、Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の可変領域および第１の定常ドメインの全てまたは一部を含む。従って、Ｆａｂ断片は、例えば重鎖および軽鎖の約１１０〜約２２０アミノ酸残基をさらに含む。
【００２３】
用語「Ｆａｂ’断片」とは、本明細書中で使用する場合、Ｆａｂ断片よりも大きいヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。例えば、Ｆａｂ’断片は、軽鎖全体と、重鎖の可変領域全体と、重鎖の第１および第２の定常ドメインの全てまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’断片は、重鎖のアミノ酸残基２２０〜３３０の一部または全てをさらに含み得る。
【００２４】
用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の２価の抗原結合断片をいう。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、２つの重鎖および２つの軽鎖の第１の定常ドメインの全てまたは一部をさらに含み得る。
【００２５】
当業者には、ヒト・モノクローナル抗体の断片が機能的活性を維持している限り、同断片の正確な境界は重要でないことが知られている。周知の組換え法を使用して、当業者は、特定の適用のために所望される任意の終端を有する機能的断片を発現するようにポリヌクレオチド配列を操作し得る。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「血液凝固障害」とは、血栓塞栓性の障害の疾患状態（すなわち、血栓塞栓症に罹患しているかまたは過剰な血液凝固（血栓）状態にある個体）および血液凝固障害の疾患状態（すなわち、極度の血液凝固不足（例えば特発性血小板減少症）に罹患している個体）を含むことを意図する。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「炎症」は、感染に対する血液の任意の応答反応を包含することを意図し、該応答反応は、通常は白血球による感染に対する化学物質による反応である。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「標識」は、ヒト免疫グロブリンまたは本発明の他の分子に結合され得る部分構造（moiety）を意味することを意図する。該部分構造は、例え
ば、治療手順または診断手順のために使用され得る。治療的標識には、例えば、本発明の免疫グロブリンに結合可能であり該免疫グロブリンのインテグリンへの結合をモニタリングするために使用可能な部分構造が含まれる。診断的標識には、例えば、分析方法によって検出可能な部分構造が含まれる。
【００２９】
分析方法には、例えば、定性的手法および定量的手法が含まれる。定性的な分析方法には、例えば、免疫組織化学法および間接的免疫蛍光法が含まれる。定量的な分析方法には、例えば、イムノアフィニティ手法（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析）が含まれる。分析方法にはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の画像化手法が含まれる。分析手段によって検出され得る診断的標識の具体的な例には、酵素、放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカーおよびビオチンが含まれる。
【００３０】
標識は、本発明の免疫グロブリンに直接結合されてもよいし、または本発明の分子に特異的に結合する２次結合因子に結合されてもよい。このような２次結合因子は、例えば２次抗体であってもよい。２次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよく、ヒト抗体、げっ歯類の抗体またはキメラ起源の抗体のいずれでもよい。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫特異性」とは、その結合領域が、インテグリンと特異的に結合することによってインテグリンと免疫反応をし得ることを意味する。免疫グロブリンまたはその機能的断片は、約１０−５Ｍ−１〜１０−１３Ｍ−１、好ましくは１０−６Ｍ−１〜１０−１Ｍ−１、なおより好ましくは１０−７Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１の親和性定数で抗原（インテグリン分子）と選択的に相互作用し得る。用語「免疫反応」は、その結合領域が、インテグリンまたはそのエピトープと結合すると免疫応答を惹起し得ることを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンの結合領域を導き出し、該領域と結合する能力を有する抗原の任意の領域を意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、特定の疾患状態（すなわち、血液凝固障害）を軽減させ得る本発明の分子の量を意味することを意図する。特定の適用についての有効量であるとみなされる実際の量は、例えば、本発明の分子の親和性、反応性、安定性、バイオアベイラビリティまたは選択性、該分子に結合した部分構造、薬学的担体および投与経路のような要因によって変化しうる。有効量は、当業者に公知の方法を使用して決定または推定可能である。このような方法には、例えば、培養細胞または組織生検試料を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび信頼性のある動物モデルが挙げられる。
【００３３】
用語「実質的に該アミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列」により、本発明者らは、その配列が、参照された配列のいずれか１つのアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有することを意味する。異なるタンパク質配列間およびＤＮＡ配列間の同一性の割合（％）の計算は、Ｃｌｕｓｔａｌプログラムによる多重アラインメントの作成によって実施され得る。参照された配列のいずれかに対して６５％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して７０％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して７５％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列は、参照される配列のいずれかに対して８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、なおより好ましくは９２％の同一性、なおより好ましくは９５％の同一性、なおより好ましくは９７％の同一性、なおより好ましくは９８％の同一性を有し、最も好ましくは参照配列のいずれか
に対して９９％の同一性を有する。
【００３４】
実質的に類似するヌクレオチド配列は、配列番号１〜１０、１２および１４〜２０に示される配列またはそれらの相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされることになる。ストリンジェントな条件については、本発明者らは、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃で該ヌクレオチドをフィルタに結合したＤＮＡにハイブリダイズさせた後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で約５℃〜６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味している。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、配列番号１１および１３に示される配列と、少なくとも１アミノ酸、しかし好ましくは１００未満、５０未満、２０未満、１０未満または５未満のアミノ酸が異なるものでよい。
【００３５】
遺伝子コードの縮重に起因して、当然のことであるが、いかなる核酸配列も、同核酸配列によってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変更または変化させて、同核酸配列の機能的改変体を提供し得る。適切なヌクレオチド改変体は、その配列内に、同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換することによって変更された配列を有し、従ってサイレントな変化を生じる改変体である。
【００３６】
他の適切な改変体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、全配列または配列の一部分が異なるコドンで置換することによって変更されている改変体であり、該コドンは置換されるアミノ酸と類似した生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードしているので保存的変化を生じる。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００３７】
タンパク質配列またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは、多数の研究者によって詳細に研究されてきた複雑な方法である。配列の最適なマッチングとこのようなマッチングを得るためのギャップの導入との間の妥協が特に重要である。タンパク質の場合、マッチングをスコア化する手段もまた重要である。ＰＡＭマトリックス（例えば、デイホフ，エム．ら（Dayhoff, M. et al.）、１９７８年、「Atlas of protein sequence and structure 」、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．）およびＢＬＯＳＵＭマトリックスのファミリーは、保存的置換の性質および見込みを定量し、多重アラインメント・アルゴリズムにおいて使用されるが、他の等しく適用可能なマトリックスも当業者には公知であろう。一般的な多重アラインメントのプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷおよびそのウインドウズ・バージョンのＣｌｕｓｔａｌＸ（トンプソンら（Thompson et al. ）、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、ｐ．４６７３〜４６８０；トンプソンら（Thomson et al.）、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、ｐ．４８７６〜４８８２）は、タンパク質およびＤＮＡの多重アラインメントを作成するのに有効な方法である。
【００３８】
自動的に作成されたアラインメントは手動のアラインメントを必要とすることが多く、この手動のアラインメントには研究対象のタンパク質ファミリーに関する熟練した使用者の知識（例えば、保存性の高い重要な部位についての生物学的知識）が利用される。このようなアラインメント・エディタ・プログラムの１つはＡｌｉｇｎ（http://www.gwdg.de/~dhepper/download/ ；ヘッパール，ディー．（Hepperle, D.）、２００１年、「Multicolor Sequence Alignment Editor. 」、ドイツ連邦共和国、１６７７５、シュテヒリン（
Stechlin）所在の淡水生態学および内陸漁業研究所（Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries）であるが、ＪａｌＶｉｅｗまたはＣｉｎｅｍａのような他のプログラムもまた適切である。
【００３９】
タンパク質間の同一性（％）は、Ｃｌｕｓｔａｌによる多重アラインメントの作成の間に計算される。しかし、同一性の値は、そのアラインメントが手動で改善された場合、または２つの配列を慎重に比較するために、再計算される必要がある。同一性（％）は、（Ｎ／Ｔ）×１００と規定することができるが、ここで、Ｎは、２つの配列が同一の残基を共有する部位の数であり、Ｔは比較される部位の総数である。一方の配列または両方の配列がギャップを有するアラインメント中の残基は、この計算に含めない。アラインメント内の対についてこの値を計算する多数のプログラムが存在する。タンパク質についての１例は、アミノ酸置換についてのモデルとして「Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｔａｂｌｅ」オプション（Ｐ）を使用した、ＰＨＹＬＩＰ系統発生学パッケージ中のＰＲＯＴＤＩＳＴ（フェルゼンシュタイン（Felsenstein ）；http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html）である。ＤＮＡ／ＲＮＡについては、ＰＨＹＬＩＰのＤＮＡＤＩＳＴプログラム内に同一のオプションが存在する。別例として、同一性（％）を、（Ｎ／Ｓ）×１００と規定することもでき、ここで、Ｓは比較されている配列の短い方の長さである。
【００４０】
タンパク質配列における他の修飾（すなわち、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、タンパク質分解による切断またはリガンドへの連結によって、翻訳中または翻訳後に生じる修飾）もまた想定され、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内にある。
【００４１】
本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供される。
【００４２】
この抗原結合領域は、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはその機能的断片を含み得る。免疫グロブリンまたはその機能的断片のＣＤＲ間で枠組構造領域に変異が存在してもよい。
【００４３】
本発明の第２の態様によれば、
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１２の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたは
その機能的断片が提供される。
【００４４】
本発明の第３の態様によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供され、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１３に定められたアミノ酸配列を有し、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１１に定められたアミノ酸配列を有する。
【００４５】
本発明の第４の態様によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供され、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１２に定められたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされ、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１０に定められたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４６】
第５の態様によれば、
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチドが提供される。
【００４７】
このペプチドはポリペプチドを含み得る。好ましくは、このペプチドはインテグリンに結合するように適合している。
本発明の第６の態様によれば、
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１０の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００４８】
好ましくは、このポリヌクレオチドは、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードする。好ましくは、このポリヌクレオチドは、組換えヒト免疫グロブリンの少なくとも１つの抗原結合領域のアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列、またはその機能的断片を含む。
【００４９】
有利なことに、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は、それ自体で潜在的な治療的相互作用を有し、非ヒト領域（例えばマウス）、Ｆｃ断片（枠組構造領域）または少なくとも１つのマウス抗原結合領域（すなわち、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む免疫グロブリンを使用する現在の治療に対する改善である。
【００５０】
第７の態様によれば、医薬としての使用または診断における使用のための、各々任意選
択で誘導体化された、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドが提供される。
【００５１】
第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５２】
好ましくは、前記医薬は、血液凝固障害を抑制または予防するように適合している。
第８の態様によれば、血液凝固障害を治療するための医薬の調製のための、任意選択で誘導体化済みの、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００５３】
従って、免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチドまたはポリヌクレオチドは、好ましくはその誘導体または改変体を作製するために、使用前に改変されてもよい。第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンもしくはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、または第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５４】
好ましくは、前記医薬は、血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを抑制または予防するように適合している。
第９の態様によれば、血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかを治療する方法が提供され、この方法は、各々任意選択で誘導体化された、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【００５５】
治療する方法は、抗炎症治療法および抗血栓塞栓治療法のうち少なくともいずれかを含み得る。
第１０の態様によれば、各々任意選択で誘導体化された、本発明の第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたは機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５６】
第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５７】
適切な医薬品賦形剤には、例えば、生理学的に緩衝化された生理食塩水のような水溶液、および、グリコール、グリセロール、油または注射可能な有機エステルのような他の溶媒または媒体が含まれる。医薬品担体は、例えば、医薬組成物を安定化させるように、または医薬組成物の溶解性を増大させるように作用する生理学的に許容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に許容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストロース）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）；キレート剤；低分子量タンパク質；または別の安定剤もしくは賦形剤であってもよい。当業者には周知のことであるが、医薬品媒体の選択および組成物の適切な調製は、意図される用途および投与様式に依存する。
【００５８】
好ましくは、この組成物は、患者において血液凝固障害および炎症のうち少なくともい
ずれかを予防または軽減させるために前記患者に投与されるように適合している。好ましくは、この血液凝固障害は、患者における血栓塞栓性の障害を含む。好ましくは、この組成物は、患者において血液凝固障害を、より好ましくは血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを検出するためにも使用され得る。
【００５９】
第１１の態様によれば、血液凝固障害を有する個体を治療または診断するためのキットが提供され、このキットは、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
好ましくは、このキットは検出手段をさらに含み、該検出手段は、前記免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的な抗原の有無を検出するように適したアッセイを含むことが好ましい。キットは、該検出手段によって検出され得る標識を含み得る。
【００６１】
第１２の態様によれば、血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかに対する個体の感受性を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ｉ）個体から試料を得る工程、および
（ｉｉ）第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを使用して、試料中の抗原のレベルを決定する工程
を含む。
【００６２】
抗原はインテグリンを含んでなることが好ましく、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含んでなることがより好ましい。試料は、血液、尿、組織などを含み得る。
この組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、第１および第２の態様に規定される抗原結合領域を、少なくとも２つ、適切には少なくとも３つ、より適切には少なくとも４つ含んでなるとよい。好ましくは、この組換え免疫グロブリンまたは機能的断片は、少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、なおより好ましくは少なくとも７つの抗原結合領域を含んでなる。好ましい実施形態において、この組換え免疫グロブリンまたは機能的断片は、８つ全ての抗原結合領域を含んでなる。
【００６３】
この組換え免疫グロブリンは、抗原結合領域のうちいずれか、または全ての抗原結合領域を含み得る。この組換え免疫グロブリンは抗原結合部位を含み得るが、この抗原結合部位に抗原が結合し、好ましくは免疫学的応答を惹起する。好ましくは、少なくとも１つの抗原結合領域が抗原結合部位の少なくとも一部を形成する。
【００６４】
好ましくは、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は１価である。しかし、この免疫グロブリンは２価であっても多価であってもよい。
不都合なことに、２価または多価の免疫グロブリンは、フィブリノゲン代替物として作用して血小板凝集を促進する傾向を有する可能性がある。これは、２価免疫グロブリンが、第１の血小板細胞上の第１のフィブリノゲン・レセプターに結合し、かつ第２の血小板細胞上の第２のフィブリノゲン・レセプターにも結合し得るからである。従って、２価免疫グロブリンによって２つの血小板細胞間に架橋が形成され、その結果血小板の凝集が生じる。これは危険性があろう。
【００６５】
有利なことに、上で議論した２価および多価の免疫グロブリンとは対照的に、１価の免疫グロブリンは、単一の血小板上の１つのフィブリノゲン・レセプターだけに結合し得るので、血小板にフィブリノゲンが結合するのを防止し、従って、血小板凝集を防止する。１価の免疫グロブリンは、血小板細胞間に架橋を形成し得ない。
【００６６】
従って、本発明は、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を作製する方法まで及び得るが、該方法において、免疫グロブリンまたはその機能的断片は１価である。
【００６７】
好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、１価の免疫グロブリンまたはその機能的断片として直接作製される。本発明の方法は、１価の免疫グロブリンを生産するために２価または多価の免疫グロブリンを切断する工程を含まないことが好ましい。このような手法は通常、直接作製された１価の免疫グロブリンよりもリガンドに対する親和性が低い１価の免疫グロブリンを生じるであろう。
【００６８】
１価の免疫グロブリンは、ヒトの体内におけるｉｎ ｖｉｖｏの寿命が比較的短いことが好ましく、例えば、好ましくは２カ月未満、より好ましくは１カ月未満、なおより好ましくは２週間未満、最も好ましくは４８時間未満である。免疫グロブリンは、例えば、手術後に患者が血栓症に罹患する危険性を低下させるために、手術後に患者に投与することによって医学的に使用され得る。２価および多価の免疫グロブリンは、かなり長い寿命（例えば、約２カ月〜３カ月）を有する傾向があり、医学的な使用にとってあまり適切ではない。さらに、２価の免疫グロブリンは、患者に血栓症を引き起こす傾向がある。
【００６９】
抗原はインテグリンを含んでなることが好ましい。
インテグリンは、好ましくは２つのファミリーに由来するα鎖およびβ鎖からなる。これらの鎖が組み換わることにより、免疫応答および凝固反応における異なる機能を有する種々のインテグリン分子を生じる。
【００７０】
α鎖には、α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１１、αＩｂ、αＩＩｂ、αＭ、αＶ、αＥ、αＬ、αＸが含まれる。
β鎖には、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８が含まれる。
【００７１】
このα鎖およびβ鎖は、特定の組合せを生じるように組み合わせることが可能であり、該組合せは、各々が例えば、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４であるインテグリンを生じる。
【００７２】
従って、約２４種のインテグリン・ファミリー構成分子が存在する。
抗原は、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなることが好ましい。
【００７３】
好ましくは、抗原はβ３インテグリンを含んでなる。好ましくは、抗原は、αＶβ３、αＩＩｂβ３およびαＩｂβ３からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる。
【００７４】
例えば、適切なインテグリンには、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３）、ＬＦＡ−１（αＬβ２）、ＶＬＡ−４（α４β１）、ＭＡＣ−１（αＭβ２）およびｐ１５０．９５（αＸβ２）が含まれる。上記インテグリンは、構造的、機能的および免疫化学的に互いに類似している。従って、上記のインテグリンに構造的、機能的および免疫化学的に類似している上に列挙した他のインテグリンもまた、特許請求の範囲に記載される
本発明の範囲内にある。
【００７５】
好ましくかつ有利には、本発明の免疫グロブリンまたはその機能的断片は、インテグリン（例えば、ヒト糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）が実質的に精製されている場合、該インテグリンに対する免疫特異性を有することが好ましい。好ましくかつ有利には、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、その外表面上にインテグリン（例えば、ヒト糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）を有する血小板に結合するように適合している。
【００７６】
本発明の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、好ましくは自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）に罹患している個体から単離され得る。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、患者の血小板濃度が健康な個体中の血小板濃度よりも低いことによって特徴付けられる。さらに、この疾患状態ＡＩＴＰは、血小板インテグリン（例えば、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）に対する免疫特異性を有する免疫グロブリンの存在によって特徴付けられる。他の血小板インテグリンに対する免疫特異性を有する免疫グロブリンもまた、ＡＩＴＰ患者体内に存在し得る。
【００７７】
好ましくかつ有利には、本発明の免疫グロブリンまたはその機能的断片は、アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している。好ましくかつ有利には、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合（血小板凝集の開始における主な相互作用）を実質的に阻害するように適合している。
【００７８】
興味深いことに、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、体細胞突然変異によって誘導される。好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、生殖系列の進化とは対照的に、親和性成熟によって誘導される。
【００７９】
ＡＩＴＰに罹患した個体では通常、機能を阻害する抗体が報告されているにもかかわらず、血小板が急速に除去されることが原因で血小板数が低い。しかし、驚くべきことに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノゲンとの間の相互作用を特異的に阻害するモチーフを含む抗体が、体細胞突然変異を介して生じるようである。単離されたモノマー形態は血小板凝集を阻害する一方、ｉｎ ｖｉｖｏで通常存在するダイマー形態は、血小板凝集を加速することによってこの疾患の通常の病態を阻害していることが予測され得る。
【００８０】
本発明のＣＤＲについて使用される名称を表１に示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
好ましくは、配列番号１３の残基３１〜３３によって規定される抗原結合領域は、アミノ酸配列「ＲＳＤ」を含む。好ましくは、配列番号１３の残基３０〜３８として示されるアミノ酸配列によって規定される結合領域は、「ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ」のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
好ましくは、免疫グロブリンの機能的断片は、ヒト免疫グロブリンと実質的に同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する断片を含む。好ましくは、この機能的断片はインテグリン特異的である。好ましくは、この機能的断片には、結合領域配列のうち少なくとも１つが免疫グロブリン、より好ましくはインテグリン特異的ヒト免疫グロブリンの結合領域配列と実質的に同じアミノ酸配列である断片が含まれる。この機能的断片は、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片からなる群から独立に選択される断片のいずれかを含み得る。
【００８４】
この機能的断片は、ヒト免疫グロブリンのＶＬの抗原結合領域配列のいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のいずれか１つ、またはＶＬ抗原結合領域およびＶＨ抗原結合領域の組合せを含み得る。ＶＨ抗原結合領域配列およびＶＬ抗原結合領域配列の適切な数および組合せは、機能的断片の所望の親和性および特異性ならびに意図される用途によって、当業者が決定することができる。
【００８５】
免疫グロブリンの機能的断片は、当業者に周知の方法を使用して容易に生産および単離可能である。このような方法には、例えば、タンパク質分解法、組換え法および化学合成が含まれる。
【００８６】
機能的断片の単離のためのタンパク質分解法は、出発材料としてヒト免疫グロブリンを
使用する工程を含む。ヒト免疫グロブリンのタンパク質分解に適切な酵素には、例えば、パパインおよびペプシンが含まれる。適切な酵素は、例えば、１価の断片が必要か２価の断片が必要かによって、当業者が容易に選択することができる。例えば、パパイン切断では、抗原に結合する２つの１価のＦａｂ’断片およびＦｃ断片を生じる。ペプシン切断では、例えば、２価のＦ（ａｂ’）断片を生じる。本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、２つの１価のＦａｂ’断片を生成させるために、例えばＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを使用してさらに還元されてもよい。
【００８７】
タンパク質分解によって生成された機能的断片は、アフィニティ・クロマトグラフィー手法およびカラム・クロマトグラフィー手法によって精製され得る。例えば、未消化の抗体およびＦｃ断片は、プロテインＡへの結合によって除去され得る。さらに、機能的断片は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、該断片の電荷およびサイズによって精製され得る。このような方法は当業者に周知である。
【００８８】
ヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片は、組換え法によって生産することもできる。好ましくは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを最初に単離する。このような領域は、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域の全体または一部を含み得る。好ましくは、このような領域は特に、重鎖および軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含み得る。
【００８９】
本発明のヒト免疫グロブリンまたは機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法を使用して生産することができる。免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド合成の方法によって直接合成され得る。別例として、比較的小さい断片を合成し、当該分野で公知の組み換え方法を使用して連結してより大きい機能的断片を形成することも可能である。
【００９０】
好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、バクテリオファージ発現系によって生産される。好ましくは、このバクテリオファージ発現系は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを含む。
【００９１】
免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを単離するために有用な手順は、自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）に罹患している個体から単離されたＲＮＡから逆転写され得るｃＤＮＡの単離から開始する。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａを含む血小板インテグリンに対する免疫特異性を有する抗体の存在によって特徴付けられる。ｃＤＮＡ合成のための方法は当該分野で周知である。重鎖または軽鎖を含む免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅され得る。
【００９２】
ＰＣＲのために適切なプライマーは、重鎖または軽鎖の特定の機能的断片に隣接する保存された配列を使用して、当業者によって決定され得る。例えば、適切なＰＣＲプライマーは、配列番号１〜配列番号７および配列番号１４〜配列番号２０として実質的に示されるポリヌクレオチドのうちいずれかを含み得る。適切なＰＣＲ条件は、当業者によって決定され得る。
【００９３】
好ましくは、ＰＣＲは、重鎖、より好ましくはＶＨ ＣＨ−１断片、なおより好ましくは重鎖可変領域の断片（ＶＨ）を増幅するように適合されている。別例として、または追加として、ＰＣＲは、軽鎖、より好ましくはＶＬ ＣＬ断片、なおより好ましくは軽鎖可変領域の断片（ＶＬ）を増幅するように適合されている。
【００９４】
好ましくは、ＰＣＲ反応は、例えば配列番号１〜７および１４〜２０からなるプライマー群から独立に選択され得る、適切なプライマーを使用して構成される。
好ましくは、ＰＣＲ産物は、適切な発現ベクター、より好ましくはファージ発現ベクター（例えばｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）中にクローニングされる。好ましくは、重鎖断片はＸｈｏＩおよび好ましくはＳｐｅＩによって消化されてからベクターへクローニングされる。好ましくは、軽鎖断片はＳａｃＩおよび好ましくはＸｂａＩによって消化されてから発現ベクターへクローニングされる。
【００９５】
好ましくは、該ベクターは、重鎖断片および好ましくは軽鎖断片が発現するように、適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に導入される。適切なベクターと宿主細胞の系は、例えば、重鎖および軽鎖の機能的断片の同時発現および集合を可能にし得る。好ましくは、ベクターは、エレクトロポレーションによって宿主中に導入される。
【００９６】
抗体断片の発現に適切な他の系は当業者であれば決定可能であり、該系には例えば、Ｍ１３ファージ発現ベクターが含まれる。組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、当該分野で公知の方法を使用して実質的に精製可能であり、該方法は使用される特定のベクターおよび宿主の発現系によって決まる。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明は、インテグリン特異的ヒト免疫グロブリンに関する。有利なことに、この免疫グロブリンはヒト起源であり、従って、非ヒト起源のエレメントを含む免疫グロブリンを使用する場合とは対照的に、ヒト患者への投与の際にあらゆる免疫応答をも最小限とする可能性が高い。さらに、免疫グロブリンまたはその機能的断片、ならびにこの免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば抗炎症および血液凝固障害の疾患状態に応じた、組成物および診断薬の製造、ならびにそれらの使用のために有効に使用され得る。
【００９８】
本発明の第１４の態様によれば、第６の態様において規定されるポリヌクレオチドまたはその誘導体を含んでなる組換えＤＮＡ分子が提供される。
好ましくは、この組換えＤＮＡ分子は発現ベクターを含む。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能な状態に連結される。適切な制御配列は、プロモーター、エンハンサーなどを含み得る。
【００９９】
本発明の第１５の態様によれば、第１４の態様の組換えＤＮＡ分子を含む細胞が提供される。
この細胞は、適切な手段によって組換えＤＮＡ分子で形質転換または形質移入され得る。
【０１００】
本発明の第１６の態様によれば、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を調製する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）必要とされる免疫グロブリンまたはその機能的断片を発現し得る、第１５の態様に規定される少なくとも１つの細胞を培養する工程、および
（ｉｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む。
【０１０１】
免疫グロブリンまたはその機能的断片は、インテグリン・ファミリーの他の構成分子に対する免疫特異性を示す免疫グロブリンの開発のためのフレームワークとなるように使用され得る。インテグリンは、２つのファミリー由来のα鎖およびβ鎖からなる。これらの鎖を組換えることにより、免疫応答および凝固反応において異なる機能を有する種々のインテグリン分子が生じる。インテグリンの例としては、
αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１、α６β４
が含まれる。
【０１０２】
これらの組合せの各々は、血小板凝集におけるその役割とは別の種々の機能、例えば免疫応答の活性化、白血球の遊走（これらはいずれも抗炎症治療の標的である）、精子と卵との間の相互作用、ならびに血管形成（主要な抗腫瘍治療の標的）などを有する。
【０１０３】
第１７の態様によれば、標的のインテグリンに結合する能力を有する組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を突然変異させて変異体を生成させる工程、および
（ｉｉ）標的のインテグリンに対する活性について変異体を選択する工程
を含む。
【０１０４】
第１の実施形態において、前記突然変異させる工程は、ランダム変異誘発、好ましくは縮重ＰＣＲの使用を含み得る。免疫グロブリンのｃＤＮＡがＰＣＲ反応中の鋳型として使用され、該反応に変異原を加えることが好ましい。ＰＣＲ反応には、変異誘発性のヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＰおよび８−オキソ−２’デオキシグアノシン）を加えることが好ましい。有利なことに、このことにより、高度に制御された様式でｃＤＮＡ中の至る所に変異を導入して変異体ライブラリーを作製することが可能である。得られた変異体ライブラリーは、ファージの表面上に提示可能であり、所望のインテグリンに対する抗体が選択可能である。
【０１０５】
得られた変異体抗体のライブラリーは、バイオパニングを使用して所望のインテグリンに対して選択可能である。ＥＬＩＳＡプレートを、所望のインテグリンで被覆すればよい。例えば、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）中の所望のインテグリンの１μｇ／ｍｌ溶液１００μｌを、４℃で一晩インキュベートすることができる。
【０１０６】
好ましくは、ＴＢＳで２回洗浄した後、プレートをＰＢＳ中５％のＢＳＡでブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートすればよい。さらに２回の洗浄後、１００μｌのファージ懸濁物を各ウェルに添加してプレートを３７℃で２時間インキュベートすることができる。
【０１０７】
ファージを除去し、ウェルをＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）で満たし、激しくピペット撹拌することができる。５分後にＴＢＳＴを除去すればよいが、第１回のパニングについては、プレートはこの方法で１回洗浄すればよい。第２回のパニングでは５回洗浄すればよく、第３回および以降の回においては１０回洗浄した。次いで、１ウェル当たり５０μｌの溶出緩衝液でファージを溶出可能であり、室温で１０分間インキュベートすればよい。激しくピペット撹拌した後、溶出したファージを取り出して、２Ｍ Ｔｒｉｓベース３μｌで中和することができる。
【０１０８】
第２の実施形態において、前記突然変異させる工程は、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の少なくとも１つの抗原結合領域中に、標的インテグリンに対する免疫特異性を有する少なくとも１つのリガンドを導入する工程を含み得る。
【０１０９】
この少なくとも１つのリガンドは、ＲＤＧ、ＲＳＧ、ＲＳＤ、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＧＰＲ、ＲＰＧ、ＡＥＩＤＧＩＥＬ、ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ、ＱＩＤＳ、ＬＤＴ、ＩＤ
ＡＰＳ、ＤＬＸＸＬおよびＧＦＯＧＥＲからなる一群のリガンドから独立に選択され得る。ＧＦＯＧＥＲはヒドロキシプロリンである。
【０１１０】
この少なくとも１つの抗原結合領域は、重鎖および軽鎖のうち少なくともいずれかの可変断片中に存在し得る。好ましくは、この少なくとも１つのリガンドは、免疫グロブリンまたはその機能的断片の重鎖の抗原結合領域のいずれかの中に導入される。好ましくは、この少なくとも１つのリガンドは、第１の結合領域中に導入される。例えば表１を参照のこと。
【０１１１】
リガンドは、分子モデリングを含む種々の技術によって決定された適切な部位に、制限酵素消化によって挿入され得る。リガンドのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、切断された制限酵素部位にライゲーションされ得る。これについての正確な詳細事項は、使用されるリガンドおよびＣＤＲの性質によって変わる。
【０１１２】
第２の実施形態において、前記突然変異させる工程は、ランダム変異誘発をさらに含み得る。
第１８の態様によれば、第１７の態様において規定される方法を使用して生成された、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片のライブラリーまたはパネルが提供される。
【０１１３】
上に列挙した多数のインテグリンの組合せは、種々の疾患（特に腫瘍）において過剰発現される可能性があり、従って、免疫グロブリンまたは抗体を用いて腫瘍の場所を特定することが可能である。腫瘍、および場合によっては他の疾患の治療成績をインテグリンの発現によって予測可能であることもまた示唆される。
【０１１４】
本発明の第１９の態様によれば、抗血小板作用を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）少なくとも１つの完全な血小板に対して少なくとも１種の免疫グロブリンまたはその機能的断片を接触させる工程、および
（ｉｉ）完全な血小板に対する結合特異性を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む。
【０１１５】
用語「完全な血小板」によって、本発明者らは、血小板膜が本来の状態ではない可能性のある血小板の領域または部分ではなく、血小板膜が好ましくは本来の状態である完全な血小板または無傷の血小板を意味する。抗血小板作用を有する免疫グロブリン、という用語によって、本発明者らは、アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している免疫グロブリンまたはその機能的断片を意味する。好ましくは、かつ有利なことに、本発明の抗血小板作用を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープへのフィブリノゲンの結合（血小板凝集の開始における主な相互作用）を実質的に阻害するように適合している。
【０１１６】
上記少なくとも１種の免疫グロブリンは、バクテリオファージと結合していることが好ましい。バクテリオファージ・ライブラリーを、少なくとも１つの完全な血小板に対して接触させることが好ましい。複数の完全な血小板が使用されることが好ましい。前期接触工程は、完全な血小板に対してファージ・ライブラリーをパニングする工程を含む。
【０１１７】
有利なことに、この方法は、機能的に活性な免疫グロブリンの探索において特定の抗原（例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に対して免疫グロブリンをスクリーニングすることよりも、時間がはるかにかからない。なぜなら、インテグリンが血小板膜と共に本来の状態で存在すると思われるからである。
【０１１８】
本明細書中に記載される特徴の全ては、任意の組合せで、上記の態様のいずれとも組み合わされる。
本発明のある実施形態は、添付の図面および配列表を参照しながら、実施例としてここに記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明の１実施形態を、以下の実施例によってここに説明する。
【実施例】
【０１２０】
この検討課題の第１段階は、２人の自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）の患者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーを構築することであった。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、患者の血小板濃度が健康な個体と比較して低いことによって特徴付けられる。さらに、この疾患状態ＡＩＴＰは、血小板インテグリン糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する免疫特異性を有する抗体の存在によって特徴付けられる。
【０１２１】
（ライブラリー構築）
全ＲＮＡを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ単離キット（英国所在のバイオテックス・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用してＡＩＴＰ患者由来のホモジナイズした脾臓組織から単離した。次いで、以下のように、脾臓組織から単離されたＲＮＡに対する逆転写を実施することによってｃＤＮＡを生成した。
【０１２２】
１０μｇ〜３０μｇの単離ＲＮＡを滅菌した１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに添加した。次いで、１μｇ（２μｌ）のオリゴｄＴを添加し、ヌクレアーゼを含まない水またはＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）水を用いて体積を２７μｌとした。この反応物を７０℃で１０分間加熱し、次いで４０℃まで冷却した。
【０１２３】
次いで、２μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤を１０μｌ（５×）ＲＴ緩衝液と共に添加した。続いて３μｌのｄＮＴＰを添加した（各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）。次いで５μｌの０．１Ｍ ＤＴＴを添加し、逆転写酵素の添加前にＤＥＰＣ水を使用して体積を４８μｌとした。次いで、２００ユニット（２μｌ）の逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）、英国所在のギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を添加し、反応物を室温で１０分間インキュベートした。この反応を、９０℃で５分間インキュベートしてから４℃で１０分間インキュベートすることによって終結させた。
【０１２４】
ＡＩＴＰ患者のＲＮＡを逆転写した後、ｃＤＮＡの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖（κ鎖）可変領域を、定常（Ｃ）領域プライマーおよび可変領域（ＶＨおよびＶκ）の第１フレームワークに特異的なプライマー群、ならびに追加のＶＨおよびＶκプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
【０１２５】
重鎖のＣＯＯＨ末端で増幅を開始する重鎖可変領域プライマーは以下である。
【０１２６】
【化１】
【０１２７】
上記重鎖可変領域プライマーを、以下の重鎖ＩｇＧ１特異的定常（ＣＨζ）ドメイン・プライマーと共にＰＣＲ反応において使用した。
【０１２８】
【化２】
【０１２９】
κ軽鎖のＣＯＯＨ末端で増幅を開始するκ軽鎖可変ドメイン・プライマーは以下である。
【０１３０】
【化３】
【０１３１】
上記軽鎖可変領域プライマーを、以下の軽鎖定常ドメイン・プライマーと共にＰＣＲ反応において使用した。
【０１３２】
【化４】
【０１３３】
使用可能な可変領域プライマーは多種多様であるため、全てのプライマーを全ての増幅において使用した。
上記ＲＮＡの逆転写反応から新たに調製されたＲＴ−ＰＣＲ混合物は、７９２μｌのＤ
ＮＡｓｅを含まない水、１００μｌの（１０×）Ｔａｑ緩衝液および８μｌのｄＮＴＰ（各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）から構成されるものとした。９０μｌのこのＰＣＲ混合物を新たなＰＣＲ反応用チューブに添加した。次いで、３μｌの５’プライマーおよび３μｌの３’プライマー（すなわち、６０ｐｍｏｌｅの各プライマー（各々２０μＭ））を、各ＰＣＲ反応チューブに添加した。
【０１３４】
次いで、５ユニット（０．５μｌ）のＴａｑポリメラーゼを各反応チューブに添加した。次いで、２μｌのｃＤＮＡ（本来２μｌのＲＮＡを含む）を添加した。次いで、２滴の鉱油を各反応チューブの上部に添加し、次いで２５〜４０サイクルのＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ反応の詳細は以下のとおりであった：
（９４℃で３０秒間、５２℃で５０秒間および６８℃で９０秒間）×４０サイクル。次いで、１０μｌのＰＣＲ反応産物を取り出して、２μｌの６×ローディングバッファ液を添加した。
【０１３５】
得られた混合物を、２％のアガロース・ゲル（５０：５０の通常アガロース：低融点アガロース）で、φ１７４／Ｈａｅ ＩＩＩマーカーと共に泳動した。約６６０ｂｐの強いバンドから、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）をコードするＤＮＡ、または軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードするＤＮＡが首尾よくＰＣＲ増幅されたことが示された。
【０１３６】
重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物をゲル精製し、抽出し（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＣＲ
Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）、英国所在のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、制限酵素消化およびクローニングの効率を増大させるために、５’ポリ（ＧＡ）テイルを有する伸長プライマーを使用して再増幅した［ウイリアムソン（Williamson）、１９９３年、ウイリアムソン アールエイ（Williamson RA ）、ブリオーニ アール（Burioni R ）、サンナ ピーピー（Sanna PP）、パートリッジ
エルジェイ（Partridge LJ）、バーバス シーエフ３世（Barbas CF,3rd ）、バートン
ディーアール（Burton DR ）、「Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries 」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻、４１４１〜５ページ、１９９３年］。このＰＣＲ反応は以下のとおりであった：
（９４℃で３０秒間、５２℃で５０秒間および６８℃で９０秒間）×４０サイクル。
【０１３７】
最初のファージ・ライブラリー構築には、スクリップス・リサーチ・インスティテュート社（Scripps Research Institute）［米国カリフォルニア州ラホヤ所在］提供の図１に示すｐＣｏｍＢ３ＨＳＳファージ・ディスプレイ・ベクターを使用した。制限酵素で消化するために、ＰＣＲ増幅された重鎖および軽鎖のＤＮＡの濃度を最初に決定した。次いで、軽鎖ＰＣＲ断片（ＶＬおよびＣＬ）をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、重鎖ＰＣＲ断片（ＶＨおよびＣＨ−１）をＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ（ギブコビーアールエル社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））で消化した。次いで、これらの消化物を、ライゲーションされるＰＣＲ断片について使用した酵素と同じ酵素で予め切断したｐＣｏｍＢ３ＨＳＳベクター中に順次ライゲーションした。すなわち、通常は軽鎖をベクター中に最初にクローニングし、その後重鎖をクローニングした。
【０１３８】
適切に消化した１４００ｎｇのベクターを反応チューブに添加し、４５０ｎｇの適切に消化したＰＣＲ産物（すなわち、重鎖断片（ＶＨおよびＣＨ−１）または軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬ）のいずれか）、４０μｌの５×リガーゼ緩衝液および１０μｌのリガーゼを含めて総体積２００μｌとした。このライゲーション反応物を室温で一晩インキュベートし、次いで７０℃で１０分間加熱して失活させた。ＤＮＡを沈殿させ、得られたＤＮＡペレットの水分を切り、７０％エタノールですすぎ、次いでペーパー・タオル上で乾燥させ
た。このペレットをＳｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）でさらに乾燥させ、１５μｌの水に再懸濁した。このチューブを１０分間氷上に配置した。ライゲーション反応が正常に行われたことを確認するために、陽性対照のライゲーション反応を実施した。
【０１３９】
次いで、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅのエレクトロコンピテント細胞（１回のライゲーション反応当たり３００μｌ）を解凍し、ライゲーションされたベクターＤＮＡを含むチューブに添加し、混合して１分間放置した。この細胞／ＤＮＡ混合物をエレクトロポレーション・キュベットに移し、エレクトロポレーションを以下のように実施した。
【０１４０】
エレクトロポレーションを実施するために、細胞を、２．５ｋＶ、ギャップサイズ０．２ｃｍのキュベット、２５μＦＤおよび２００Ωの条件でパルスした。エレクトロポレーション・キュベットを、最初に１ｍｌで洗い、次いで２ｍｌのＳＯＣ培地を室温にて即座に流し込み、その後すぐにこのＳＯＣ培地中でシェーカー（２５０ｒｐｍ）中で３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む予め温めた（３７℃）スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ、ＳＢ）１０ｍｌを添加した。対照のライゲーション試料については１００ｍｌ、１０ｍｌおよび１ｍｌ、ライブラリーのライゲーション試料については１０ｍｌ、１ｍｌおよび０．１ｍｌを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に播種することによって、即座に形質転換体の力価を決定した。
【０１４１】
形質転換された大腸菌の１０ｍｌ培養物を、シェーカー（３００ｒｐｍ）で３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、カルベニシリンを、５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７μＣでさらに１時間インキュベートした。１０ｍｌの培養物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに添加し、シェーカーで３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１４２】
一晩増殖させた後、ファージ・プラスミドＤＮＡをミニプレップ（小規模精製）することによって単離した。単離したベクターを第１鎖の挿入についてチェックし、次の鎖とのライゲーションのために準備した。通常、軽鎖をベクター中に最初にクローニングし、次いで重鎖をクローニングした。従って、得られたファージ・ライブラリーは、軽鎖および重鎖の両方がその中に挿入されたコンビナトリアル・ファージから構成された。
【０１４３】
（バイオパニング）
バイオパニングを以下のように実施して、抗血小板抗原特異的免疫グロブリンを発現したＦａｂファージを単離した。
【０１４４】
６０ｍｌの抗凝固処理血液を室温にて２００ｇで１０分間遠心分離することによって血小板を調製した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）中１０８個の血小板に相当する血小板懸濁物５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次の朝、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で２回洗浄した後、このプレートを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中５％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳでさらに２回洗浄した後、１００μｌのファージ懸濁物を各ウェルに添加し、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ファージの単離について以下に記載する。
【０１４５】
次いで、このファージを１ウェル当たり５０μｌの溶出緩衝液で溶出し、室温で１０分間、ＴＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）と共にインキュベートした。激しくピペット撹拌した後、溶出したファージを取り出し、３μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓベースを用いて中和することによって洗浄した。第１回のパニングについては、プレートをこの方法によって１回洗浄した。第２回のパニングでは、５回の洗浄を実施し、第３回および
その後の回においては、１０回の洗浄を実施した。
【０１４６】
図２を参照すると、５回のバイオパニングを実施した結果が示されている。各回のパニングの後、溶出した抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージの数を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア・ブロス（ＬＢ）上での力価測定によって決定し、コロニー形成単位の数を計数し（ｃｆｕ／ｍｌ）、平均（±ＳＥ）として示した。
【０１４７】
図２から理解されるように、第１回のパニングの培養物は、わずか２つの抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ・クローンが１０９ｃｆｕ／ｍｌのファージ懸濁物から単離されたことを示したにすぎなかったが、第５回のパニング後には、約７０個のクローンが１０９ｃｆｕ／ｍｌのファージ懸濁物から単離されたので、抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージの富化がバイオパニングによって達成された。
【０１４８】
（血小板に対するファージの特異性の測定）
図２中に示した５回のパニング後に得られた抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージを合わせたものをＥＬＩＳＡによって分析して、このファージによって生成されたＦａｂ断片の抗血小板抗原特異性を測定した。６０ｍｌの抗凝固処理血液を室温にて２００ｇで１０分間遠心分離することによって血小板を調製した。
【０１４９】
マイクロタイター・プレートを、１０８個の血小板に相当する５０μｌの血小板濃縮物でコーティングし、次いで密封し、４℃で一晩インキュベートした。このプレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中５％のＢＳＡでブロッキングし、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を振り出した後、１０８ｐｆｕを含む１００μｌのファージを各ウェルに添加した。同じ濃度の１００μｌのＭ１３ファージを、陰性対照として添加した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した後、１００μｌのウサギの抗ファージ抗体（７μｇ／ｍｌ、シグマカンパニー社（Sigma Co. ））を、ブランク以外全てのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）で６回洗浄した。１００μｌの特異的抗ウサギ抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中に１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、２００μｌの基質緩衝液（クエン酸塩緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＯＰＤ）を添加し、このプレートを３０分間暗所に放置した。この反応を、２５μｌの３Ｍ ＨＣＬを添加することによって停止させ、最後に４９０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーによって読み取った。
【０１５０】
図３を参照すると、５回のバイオパニングによって抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ・ライブラリーから選択された６つの代表クローン（Ｓ１〜Ｓ６）の血小板膜結合活性が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびブランク・ウェル（Ｂ）を含めて示されている。このデータは、２回の実験からの平均吸光度±ＳＥを示し、各実験において３つのウェルを各測定に使用した。
【０１５１】
図３は、コロニーの大きさが異なる無作為に選択したＦａｂファージ・クローン６種のうち、４種のクローン（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）は完全な血小板の調製物と強力に反応したが、２種のクローン（Ｓ５、Ｓ６）は、血小板抗原と反応できなかったことを示す。陰性対照およびブランク対照では反応は見られなかった。
【０１５２】
（血小板溶解調製物に対する血小板反応性ファージの反応）
図３中に示されるような完全な血小板に対する陽性反応を示した４種のＦａｂ発現ファージ（Ｓ１〜Ｓ４）をＥＬＩＳＡによって分析し、血小板溶解物に対する抗血小板抗原特異性を検出した。使用した方法は、５０μｌの血小板溶解物（２００ｇ／ｍｌ）をマイクロタイター・プレートに添加してからＰＢＳで洗浄し１００μｌのファージを添加したこ
と以外は、上記の完全な血小板の調製物についての方法と全く同じであった。血小板溶解物は以下のように作製した。
【０１５３】
６０ｍｌの抗凝固処理血液を、室温にて２００ｇで１０分間遠心分離した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を取り出し、１２００ｇで１０分間再度遠心分離した（Ｍｉｓｔｒａｌ ３０００（商品名）、英国所在のファイソンズリミテッド社（Fisons Ltd））。沈降させた血小板を等張緩衝液で４回洗浄した後、６ｍｌの溶解緩衝液を添加し、４℃で１時間インキュベートし、その後、Ａｖａｎｔｉ（商標）Ｊ−２５遠心分離機（ベックマン社（Beckman ））で２０，０００ｇにて４℃で３０分間遠心分離した。５ｍｌの上清を、遠心濾過装置（カットオフ分子量１０，０００）を使用して４０００ｇで４０分間濃縮した。
【０１５４】
図４を参照すると、血小板溶解物に対するＦａｂ発現ファージの反応性が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびブランク・ウェル（Ｂ）を含めて示されている。結果は、図３中に示されるような完全な血小板の懸濁物中の血小板表面の膜抗原と強力に反応した４種全ての選択クローン（Ｓ１〜Ｓ４）が、陰性対照およびブランクと比較した場合、血小板溶解物とも強力に反応したことを示している。
【０１５５】
（血小板膜タンパク質へのファージの結合の感度）
１００μｌの血小板溶解物を使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）マイクロタイター・プレートの各ウェルをコーティングした。反応性を有する抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ１０６個を含む懸濁物を、１×１０−１ｃｆｕ〜１×１０−６ｃｆｕの範囲にわたって希釈し、１００μｌの各希釈物を各ウェルに添加した。ファージの結合を、抗ファージ抗体複合物を用いて検出した。
【０１５６】
図５を参照すると、血小板溶解調製物に対するＦａｂ保有ファージの力価決定が示されている（平均±ＳＥ）。図５は、Ｆａｂファージの元の濃度（１×１０６ｃｆｕ）が最も高い吸光度を与えたことを示している。吸光度の低下は、Ｆａｂ保有ファージの濃度の低下と相関した。
【０１５７】
（精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージ粒子の反応）
抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ粒子が糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａと特異的に反応することを実証するために、該ファージ粒子を、ＥＬＩＳＡによって、精製タンパク質に対して試験した。従って、完全な血小板（図３を参照のこと）および血小板溶解物（図４を参照のこと）のいずれとも強力な反応を示したコロニーを分析して、精製糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する反応性を決定した。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡを、完全な血小板について図３に、血小板溶解物について図４に示したように、以前と同様に実施した。ＥＬＩＳＡマイクロプレートの各ウェルを、１００μｌの精製された糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを２μｇ／ｍｌの濃度で用いてコーティングした。この糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａは、スイス国所在のバーゼル大学のビート シュタイナー博士（Dr Beat Steiner ）からの贈与物であった。ＰＢＳでの洗浄後、次いで１００μｌのファージを各ウェルに添加し、抗ファージ抗体を使用して、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するそれらの特異性を検出した。
【０１５９】
図６を参照すると、精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージの反応性が示されている。これらの結果は、完全な血小板懸濁物および血小板溶解物中の血小板抗原と強力に反応した４つ全ての選択クローン（Ｓ１〜Ｓ４）が、Ｍ１３陰性対照（Ｎ）およびブランク（Ｂ）と比較した場合、精製された糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体とも強力に反応したことを示している。
【０１６０】
（抗血小板抗体Ｆａｂライブラリーを用いた血小板膜溶解物に対するウエスタン・ブロット分析）
以下のように、すでに記載したように単離したＦａｂ発現ファージ・クローン（Ｓ１〜Ｓ４）を用いてウエスタン・ブロット分析を実施した。
【０１６１】
血小板溶解物の試料を、３部の血小板溶解物（２００ｇ／ｍｌ）に対して１部の試料緩衝液で希釈し、２分間煮沸することによって調製した。８％分離ゲルを注いで固め、その後３％の濃縮ゲルを添加した。４０μｌの血小板溶解物試料および５μｌの分子量（ＭＷ）マーカーを、このゲル中の別個のウェルに添加した。このゲルを、１００Ｖの一定電圧で２時間泳動した。タンパク質を、ポリアクリルアミド・ゲルから０．４５μｍのニトロセルロース・メンブレンに転写し、１００Ｖで９０分間泳動した。分離された血小板タンパク質を含むニトロセルロース・メンブレン細片を、ＴＢＳ中５％のＢＳＡで室温にて２時間ブロッキング処理した。３ｍｌの溶出ファージ（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を、個々の試料細片上に配置した。３ｍｌの同じ濃度のＭ１３を陰性対照として使用し、３ｍｌの抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（２μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。全ての試料および対照物を、４℃で一晩インキュベートした。
【０１６２】
これらの細片を、ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で２時間洗浄した。２０分毎に洗浄緩衝液を交換した。１：１０００に希釈した３ｍｌのウサギの抗ファージ抗体を（陽性対照以外）全ての試料に添加し、室温で１時間インキュベートした。
【０１６３】
前と同様に洗浄した後、１：１０，０００に希釈した抗ウサギ抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（３ｍｌ）を、全ての試料および陰性対照の細片に添加した。
陽性対照については、抗マウス抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（３ｍｌ）を同じ希釈率で添加した。室温で１時間のインキュベーション後、これらの細片を以前と同様に洗浄した。このブロットを３ｍｌのジアミノベンジジンで発色させた。
【０１６４】
図７を参照すると、４種の単離された抗血小板Ｆａｂ保有ファージ・クローン（Ｓ１〜Ｓ４）と結合させた、非還元状態のヒト血小板膜溶解物のウエスタン・ブロット分析が示されている。レーンＮはＭ１３ファージ陰性対照であり、レーンＰは、ＣＤ６１（すなわち、ＩＩａ／ＩＩＩｂ複合体のβインテグリン成分）に対する抗体を用いて染色した陽性対照である。分子量マーカーは、ＭＷレーン中を泳動させた。
【０１６５】
レーンＳ１〜Ｓ４は、４種の単離されたＦａｂファージ（Ｓ１〜Ｓ４）が、それぞれ１１ＫＤａおよび９２ＫＤａの分子量を有する血小板タンパク質のバンドと結合することを示している。
【０１６６】
（抗血小板抗体Ｆａｂライブラリーを用いた、精製されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するウエスタン・ブロット分析）
Ｆａｂ発現ファージ・ライブラリーの単離コロニーが血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと特異的に結合することを確認するために、４０μｌの精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを８μｇ／ｍｌの濃度でポリアクリルアミド・ゲルに装填し、電気泳動し、ニトロセルロース紙上に転写した。１０６個のＦａｂライブラリー・ファージを各試料細片に添加した。次いで、ウサギの抗ファージ抗体のＨＲＰ複合物を添加し、このブロットを上記のように発色させた。
【０１６７】
図８を参照すると、４種の血小板反応性ファージ・クローンに対する、非還元状態のヒト血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質のウエスタン・ブロット分析の結果が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびＣＤ６１陽性対照（Ｐ）の結果と共に示されている。分子マーカーも、ＭＷレーンに泳動した。
【０１６８】
レーンＳ１〜Ｓ４は、４つのＦａｂ抗血小板抗体全てが、９２ＫＤの分子量を有するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合することを示している。
（ファージ・ディスプレイから可溶性ＦａｂへのＰｃｏｍｂ３の変換）
すでに示されたデータは、Ｆａｂ発現ファージが血小板抗原に結合することを実証するが、ファージによって発現されたＦａｂ分子がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩｂを特異的に認識して免疫反応することを正式に示すものではない。このことは、このＦａｂ分子が、発現されてファージの表面に配置されるファージのコートタンパク質とのキメラ・タンパク質として形成されることに起因する。
【０１６９】
これらのＦａｂファージ・クローンがＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａを特異的に認識して反応するか否かを決定するために、ファージのコートタンパク質を除去し、ファージに結合していない可溶性タンパク質としてＦａｂを発現させた。可溶性Ｆａｂ断片を、以下に記載するように、血小板抗原と強力に反応した４つのコロニーから調製した。
【０１７０】
重鎖および軽鎖の挿入断片を含むファージＤＮＡ５μｇ／ｍｌを、２μｇの制限酵素Ｓｐｅ１およびＮｈｅ１（１０Ｕ／μｌ）で３７℃にて３時間消化して、ＰＩＩＩコートタンパク質をコードするＤＮＡを除去した。次いで、この切断したＤＮＡを０．６％の低融点アガロース・ゲルに装填し、４℃で電気泳動した。重鎖および軽鎖をコードするがＰＩＩＩコートタンパク質をコードするＤＮＡを含まない、ファージの４．７Ｋｂｐのバンドをゲルから切り出し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎシステム（プロメガ社（Promega ））を使用して回収した。
【０１７１】
４．７Ｋｂｐの回収されたＤＮＡ２００ｎｇを、２０μｌの総体積のリガーゼ緩衝液中の２μｌのリガーゼ（２Ｕ／μｌ）を用いて、室温で２時間ライゲーションした。１μｌのライゲーション済みＤＮＡを、４０μｌの大腸菌コンピテント細胞に添加し、２．５ＫＶ、２５μＦＤおよび２００Ωのエレクトロポレーションでパルス注入することによって形質導入した。
【０１７２】
エレクトロポレーションした細胞を、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍｌのスーパーブロスに移した。これらの細胞を直ぐに、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に接種した。２４時間後、単一コロニーを、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１０ｍｌのスーパーブロス中に接種し、３７℃で６時間インキュベートした。イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシドを１ｍＭの最終濃度まで添加することによってタンパク質の発現を誘導した。これらの細胞を１５００ｇで１５分間の遠心分離によって回収し、可溶性Ｆａｂを細胞溶解物から回収した。
【０１７３】
細胞溶解物上清中における血小板と可溶性Ｆａｂ断片との反応性を、ＥＬＩＳＡによって決定した。図９を参照すると、４種の反応性ファージ・コロニーのうち３種（Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４）についての結果が示されている。４番目のクローン（Ｓ２）は、可溶性ファージを発現しないようであった。３種全ての可溶性Ｆａｂ分子は、血小板膜タンパク質に対する有意な反応性を示している。
【０１７４】
（ＤＮＡ配列分析）
Ｓ４単離物のＦａｂ分子を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名）を使用してプラスミドＤＮＡを調製することによって配列決定した。核酸配列決定は、抗体の重鎖についてのプライマー：
５’−ｇａａａｔａｃｃｔａｔｔｇｃｃｔａｃｇｇ−３’（配列番号８）；
および抗体の軽鎖についてのプライマー：
５’−ｇｃｇａｔｔｇｃａｇｔｇｇｃａｃｔｇｇ−３’（配列番号９）
を使用して、ケンブリッジバイオサイエンシズ社（Cambridge Bio-sciences）によって実施された。
【０１７５】
使用した可変領域遺伝子を、
htt p://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901
において入手可能なＶ−Ｂａｓｅプログラムを使用することによって特徴付けた。
【０１７６】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）のＤＮＡ配列を配列番号１０として示す。免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）のＤＮＡ配列を配列番号１２として示す。
重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、オンライン（www.expasy.org/tools/dna.html ）で翻訳した。免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を配列番号１１として示す。免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１３として示す。
【０１７７】
この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列と、生殖系列（germline）の配列とのアラインメントを、ＤＮＡＰＬＯＴおよびＶＢＡＳＥを使用して実施した。
図１０を参照すると、発現された抗体の重鎖のアミノ酸配列をこの抗体が由来する生殖系列遺伝子と比較する配列アラインメントが示されている。重鎖の３つの相補性決定領域（ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３）は下線を付して示されている。Ｖ−ｂａｓｅプログラムは、可変領域遺伝子ＤＰ５８、Ｄ−７−２７およびＪＨ４ｂによって重鎖が生成されていることを示した。ドットは、生殖系列遺伝子と配列が同一であることを意味している。
【０１７８】
図１１を参照すると、発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列をこの抗体が由来する生殖系列遺伝子（ＤＰＫ１８／Ａ１７＋）と比較する配列アラインメントが示されている。軽鎖の３つの相補性決定領域（ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３）が示されている。Ｖ−ｂａｓｅプログラムは、軽鎖が可変領域遺伝子ＤＰＫ１８およびＪＫ２を使用していることを示した。
【０１７９】
これらの結果は、ファージによって発現されるＦａｂ領域をコードするＤＮＡとそれが由来する生殖系列遺伝子との間には約８０％の相同性が存在することを示している。さらに、これらの結果から、変異がＣＤＲ中に生じたので、抗原による駆動がこの抗体の発生において重要な役割を果たしたことを示される。
【０１８０】
軽鎖のアミノ酸残基３１位におけるチロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への変異により、主要なインテグリン・リガンドであるＲＧＤモチーフとの類似性を示すＲＳＤモチーフが生じる。ＲＳＤは、インテグリン・リガンドとしてはこれまで報告がなかった。
【０１８１】
多数のインテグリンについてのペプチド・リガンド部位は、プロウら（Plow et al. ）の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５（２９）巻、ｐ．２１７８５〜２１７８８）に記載されている。従って、抗体の配列内の推定リガンド・ミミトープ（mimitope、リガンドを模倣しているを思われる部位）を探索することが可能である。
【０１８２】
図１２を参照すると、軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１中に見出された２つの潜在的なミミトープが示されている。１つは、多数のインテグリンに結合するとして報告されたＲＧＤモチーフの模倣部と推定されるもの（すなわち、ＲＳＤ）である。テネイシン結合モチーフＡＥＩＤＧＩＥＬとのある程度の同一性もまた存在しており、変異によってこのモチーフを抗体の構造中に導入することは簡単である。さらに、ＧＰＲ配列の逆配列も存在するが、これは免疫グロブリンの枠組構造領域内にあり、アクセスできない可能性がある。阻害モチーフはＲＧＤのホモログを含んでいる必要はなく、多くの研究から、活性化すべきＲＧＤ
を含むペプチドが示されている（スミスら（Smith et al.））。従って、このモチーフの存在は機能を予言するものではなく、この配列中に見出されないはずの、スミスら（Smith et al.）によって報告された該領域の側面が存在する。
【０１８３】
（血小板抗原に対するＦａｂ発現ファージの結合の、フロー・サイトメトリーによる測定）
以下のように、洗浄した完全な血小板を、４種のファージ・コロニー（Ｓ１〜Ｓ４）と反応させ、結合を蛍光性の抗ファージ複合体によって測定した。
【０１８４】
１０７個の洗浄血小板を含む１００μｌを、１０７個のＦａｂファージ１００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。陰性対照として、同じ濃度の血小板１００μｌを同じ濃度のＭ１３と共にインキュベートした。これらのチューブを洗浄緩衝液で洗浄し、１２００ｇで５分間遠心分離した。
【０１８５】
結合したファージを、２００μｌのウサギの抗ファージ抗体を用いて、３５μｇ／ｍｌを１：２００希釈した濃度で３７℃にて３０分間検出した。洗浄緩衝液で２回洗浄した後、元の濃度２０μｇ／ｍｌを１：２０００希釈した、２００μｌの抗ウサギ抗体ＦＩＴＣ複合物をこれらの試料および陰性対照のチューブに添加した。５μｌの抗ＧＰＩＩｂ抗体ＦＩＴＣ複合物を陽性対照のチューブに添加し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１８６】
これらの試料および対照を、以下の閾値でフロー・サイトメーターによって分析した：前方散乱光（ＦＳＣ）：Ｅ０１、側方散乱光（ＳＳＣ）：５７５および蛍光（ＦＬ１）：４００（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson））。
【０１８７】
図１３を参照すると、Ｆａｂファージ・ライブラリー由来の４種の代表クローン（Ｓ１〜Ｓ４）の血小板抗原結合活性に関するフロー・サイトメトリー分析の結果が示されている。データは、４回の実験の蛍光の割合の平均（％）±ＳＥを示す。陽性対照（抗ＧＰＩＩｂ）を使用して、血小板の蛍光を決定するために使用したゲートを検出した。さらに、図１３は、陽性対照（Ｃｏｎ）、陰性対照（Ｍ１３ファージ）およびブランク対照（Ｎｅｇ）を示す。図１３中に示されるように、４種全てのクローンが、血小板集団の４０％〜６０％に結合する。
【０１８８】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタン・ブロット分析によってすでに示唆されたように、単離されたファージが血小板に結合するということをさらに支持するものである。
【０１８９】
（単離された抗血小板Ｆａｂ抗体の存在下における、血小板に対するフィブリノゲンの結合のフロー・サイトメトリー分析）
以下に記載されるように、多血小板血漿（ＰＲＰ）を４種の単離されたファージ・クローンと共にインキュベートして、これらの抗体が休止期の血小板および異なる濃度のＡＤＰによって活性化された血小板へのフィブリノゲンの結合を遮断するか否かを測定した。
【０１９０】
５μｌの正常な多血小板血漿（ＰＲＰ）を、１０μｌの単離されたＦａｂファージミド（１．５×１０８ｃｆｕ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌの同じ濃度のＭ−１３ファージおよび１０μｌのＴＢＳ緩衝液および１０μｌのＴｙｒｏｄｅ緩衝液を対照として適切なチューブに添加し、さらに２０μｌのＴｙｒｏｄｅ緩衝液を全てのチューブに添加した。
【０１９１】
２μｌの抗フィブリノゲン抗体フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を各
試料および各対照に添加し、次いで、５μｌの異なる濃度（０．１ｍｏｌ／ｍｌ、１ｍｏｌ／ｍｌ、１０ｍｏｌ／ｍｌ）のＡＤＰを適切なチューブに添加した。５μｌの抗ＩＩｂ・ＦＩＴＣ複合物を、陽性血小板のゲートの決定のためにＰＲＰに添加した。全ての試料の体積を、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を添加することによって５０μｌに調整した。全ての試料を暗所に３０分間放置した。
【０１９２】
これらの試料を、４５０μｌの１％パラホルムアルデヒドで固定し、以下の閾値設定にてＦＡＣＳｃａｎ（商標）で試験した：前方散乱光（ＦＳＣ）：Ｅ０１、側方散乱光（ＳＳＣ）：５７５および蛍光（ＦＬ１）：４００（ベクトンディッキンソン社）。
【０１９３】
図１４を参照すると、４つのファージ調製物（Ｓ１〜Ｓ４）のいずれか１つ、陰性対照としてＭ１３ファージ調製物、および緩衝液（Ｂｕｆ）と共にインキュベートし、各々異なる濃度のＡＤＰ（０．１、１、１０μｍｏｌ／ｍｌ）に曝露させた血小板に対するフィブリノゲンの結合を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合（％）の概要が示されている。
【０１９４】
対照はＡＤＰの濃度が増大するにつれて血小板へのフィブリノゲンの結合が増大することを示す一方、クローンＳ１〜Ｓ４と共にインキュベートした血小板においては増大は見られないことがわかる。これらの結果は、Ｆａｂを保有するファージが血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａとの反応性を有し、ＡＤＰによって活性化された血小板に対するフィブリノゲンの結合を阻害し得ることを示す。血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノゲンの結合は、血小板の凝集、従って、血餅の形成の開始における最初の重要な事象である。従って血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノゲンの結合は、血餅を予防するために設計される治療のための主な標的である。
【０１９５】
本願と関連して本明細書と同時またはその前に出願された全ての論文および文書、ならびに本明細書と共に公の閲覧に対して開かれた全ての論文および文書に対して注意が向けられるものであり、全てのこのような論文および文書の内容は、本明細書中に援用される。
【０１９６】
本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示された全ての特徴、および／または同様に開示された任意の方法の工程の全ては、このような特徴および／または工程のうち少なくともいくつかが互いに排除するような組合せ以外は、任意の組合せで組み合わせることが可能である。
【０１９７】
本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示される各特徴は、別途明記しない限り、同じ目的、等価な目的または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置換してもよい。従って、別途明記しない限り、開示された各特徴は、等価な特徴または類似の特徴の一般的なものの１例に過ぎない。
【０１９８】
本発明は、上記の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示される特徴のうち、任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せ、または同様に開示された任意の方法の工程の任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せに及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】ｐＣｏｍＢ３ＨＳＳファージ・ディスプレイ・ベクターの模式図。
【図２】５回の連続バイオパニングの間にファージが富化される様子を示す図。
【図３】完全な血小板に対するファージの反応性を示す図。
【図４】血小板溶解調製物に対する反応性ファージの反応性を示す図。
【図５】血小板溶解調製物に対するＦａｂ保有ファージの力価決定を示す図。
【図６】血小板糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージの反応性を示す図。
【図７】４種の抗血小板Ｆａｂクローンに対して反応する非還元状態のヒト血小板膜溶解物のウエスタン・ブロット分析を、陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）とともに示す図。
【図８】４種の抗血小板Ｆａｂクローンに対する非還元状態のヒト血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａのウエスタン・ブロット分析を、陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）と共に示す図。
【図９】洗浄された無傷の血小板に対する単離された可溶性の抗血小板Ｆａｂ抗体の反応性を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す図。
【図１０】発現された抗体の重鎖のアミノ酸配列と、生殖系列（germline）遺伝子のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１１】発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列と、生殖系列遺伝子のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１２】発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列と、推定リガンド・ミミトープのアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１３】Ｆａｂライブラリーから単離された４種のクローンの血小板結合活性についてのフロー・サイトメトリー分析を示す図。
【図１４】休止期の血小板および活性化された血小板に対するフィブリノゲンの結合を阻害する、血小板反応性Ｆａｂ保有ファージの能力を決定するための、フロー・サイトメトリー分析を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫グロブリンに関し、より具体的には、全くそれだけというわけではないが、インテグリンに対する特異性を示す組換え免疫グロブリンに関する。本発明はさらに、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列およびペプチド配列ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、αサブユニット鎖およびβサブユニット鎖から構成される、構造的、免疫化学的および機能的に関連するヘテロダイマー分子のファミリーである。現在、限定された様式で非共有結合により相互作用して２０種を超えるファミリー構成分子を形成する、少なくとも８種の既知のβ鎖および少なくとも１７種の既知のα鎖が存在する。
【０００３】
インテグリンは、細胞外マトリックスから細胞内の細胞骨格へと一体化（インテグレート）するのでそのように命名されたレセプターであり、細胞間相互作用（例えば、細胞接着、細胞移動および凝血反応）に関与する。従って、インテグリンは、血液凝固の間に血小板凝集を阻止するだけでなく抗炎症性の試薬としても作用する試薬の開発を可能にすることによって、治療的介入のための良好な候補をなす。このことは、フィブリノゲンに対するレセプター（すなわち、血小板インテグリン糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）を標的とするＡｂｉｃｉｍａｘのような免疫グロブリン試薬の存在によって実証されている。フィブリノゲンとＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとの間の相互作用は、血小板の最初の凝集（すなわち血液凝固）における重要な事象である。血小板の凝集および接着は、心臓発作および脳卒中による死亡の主要な原因であり続ける血栓症における基礎的な事象である。
【０００４】
試薬Ａｂｉｃｉｍａｘは、インテグリン糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａと反応するだけでなく、インテグリンＭＡＣ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４およびｐ１５０．９５とも反応することが示されており、従ってこれらのインテグリンは抗炎症の治療標的としての可能性も有する。
【０００５】
しかし、Ａｂｉｃｉｍａｘの主な不利益は、これが「ヒト化」されたマウス・モノクローナル抗体に由来することである。マウス・モノクローナル抗体のヒト化は、このマウス抗体分子の、同抗体とその標的抗原との直接的な相互作用に関与しない部分（すなわち、この抗体の枠組構造領域）を、ヒトの相当物によって置換することを含む。これは面倒な手法であり、標的抗原との相互作用に関与する抗体分子の部分（すなわち、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ））の親和性ひいては治療的潜在能力を有意に喪失させてしまう可能性がある。
【０００６】
インテグリン間が類似しているということは、免疫グロブリン・ライブラリーから単離された少数の抗体を使用することにより、各々が異なるインテグリンと反応する様々な免疫グロブリンのパネルを作製するための鋳型が得られるということである。残念ながら、上記のようなマウス／ヒト・ハイブリッド免疫グロブリンを適切な鋳型として使用することは困難である。
【０００７】
マウス・モノクローナル抗体の使用に代わる手法は、抗体の枠組構造領域の置換を必要としないと思われるヒト免疫グロブリンの生産である。次いで、当該抗体を、異なるインテグリンに反応性を示す抗体のパネルを開発するための鋳型として使用すればよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ヒト糖タンパク質インテグリンに対するヒト免疫グロブリンの主な不利益は、潜在的に病原性の分子に対してヒト患者を免疫することをめぐる倫理的な問題に起因して、該ヒト免疫グロブリンを生産するのは容易ではないということである。従って、ヒト患者を最初に免疫することなく、ヒト・インテグリンとの結合親和性を有するヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を生産する必要がある。
【０００９】
本発明の実施形態の目的は、上記の問題に取り組むことならびにインテグリンに対する親和性を有する免疫グロブリンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［定義］
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる少なくとも１つのポリペプチドから構成されるタンパク質を含み得る。既知の免疫グロブリン遺伝子には、κ定常遺伝子、λ定常遺伝子、μ定常遺伝子、γ定常遺伝子、ζ定常遺伝子、α定常遺伝子およびε定常遺伝子、ならびにさらには、多数存在する免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンは、抗体全体およびその生物学的に機能的な断片のいずれの抗体としても存在し得る。このような生物学的に機能的な断片は、対応する完全長の抗体のうち少なくとも１つの抗原結合領域を保持する（すなわち、インテグリンに対する免疫特異性を備えている）。免疫グロブリンは、モノクローナル抗体またはその機能的断片を含み得る。
【００１１】
１価の免疫グロブリンは、ジスルフィド架橋によって軽鎖（Ｌ）と結合した重鎖（Ｈ）を含むダイマー（ＨＬ）である。２価の免疫グロブリンは、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって結合した２つのダイマーを含むテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価の免疫グロブリンを、例えば、複数のダイマーを連結することによって生産することも可能である。
【００１２】
免疫グロブリンまたは抗体分子の基本的構造は、非共有結合的に結合し、ジスルフィド結合によって連結され得る、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖から構成される。各重鎖および軽鎖は、約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域と、鎖の残りの部分の定常配列とを含む。この可変領域は、抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原に対する抗体分子の特異性を決定するいくつかの超可変領域（すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。重鎖および軽鎖のＣＤＲの両側が枠組構造領域であり、ＣＤＲを係留および配向する比較的保存されたアミノ酸配列である。この定常領域は、５つの重鎖配列（μ、γ、ζ、αまたはε）のうち１つおよび２つの軽鎖配列（κまたはλ）のうち１つから構成される。重鎖定常領域の配列は、抗体のアイソタイプおよび分子のエフェクター機能を決定する。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、用語「ヒト免疫グロブリン」または「ヒト・モノクローナル抗体」は、ある特定のヒト免疫グロブリン中に見出されるのと実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列を含むモノクローナル免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体を意味することを意図する。重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列は、基準となる配列と比較した場合に、かなりの量または程度の配列同一性を示す。このような同一性とは、特定のヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体のアミノ酸配列を示すものとして明確に知られている、または特定のヒト免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体のアミノ酸配列を示すものと認識することができる。実質的に同じ重鎖および軽鎖のＣＤＲアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸の軽微な修飾または保存的置換を有し得る。このようなヒト免疫グロブリンは、インテグリン抗原に選択的に結合するその機能を保持している。用語「ヒト・モノクローナル免疫グロブリン」は、ヒトＣＤＲアミノ酸配
列を実質的に有するモノクローナル免疫グロブリンを含むことを意図し、該モノクローナル免疫グロブリンは、例えば、生産物がファージ・ライブラリーであるような組換え法により、リンパ球またはハイブリドーマ細胞により生産される。用語「組換えヒト免疫グロブリン」は、組換えＤＮＡ技術を使用して生産されたヒト免疫グロブリンを含むことを意図する。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「抗原結合領域」は、抗原に対する特異的結合親和性を有する免疫グロブリンの領域を意味することを意図する。この結合領域は、超可変領域ＣＤＲでもよいし超可変領域ＣＤＲの機能的部分でもよい。ＣＤＲの「機能的部分」という用語により、ＣＤＲ内の、抗原に対する特異的親和性を示す配列を意味することを意図する。ＣＤＲの機能的部分は、インテグリンに特異的に結合するリガンド（例えば、フィブロネクチン中に存在する「ＲＧＤ」モチーフまたはテネイシン中に存在する「ＡＥＩＤＧＩＥＬ」）を含んでいてもよい。インテグリンを認識する他のリガンドまたはモチーフは、本明細書中に援用するプロウら（Plow et al. ）の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻第２９号）中に記載されている。
【００１５】
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＤＲ」は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域中の超可変領域を意味することを意図する。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の各々の中には、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、各鎖上に少なくとも３つのＣＤＲが存在し、該ＣＤＲは、合わせて構成されると抗原結合部位（すなわち、抗原が結合または特異的に反応する３次元結合部位）を形成する。重鎖中に４つのＣＤＲが存在し得ると仮定されている抗体もある。
【００１６】
ＣＤＲの定義はまた、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸がわかれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかをごく普通に決定することができる。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、用語「機能的断片」は、ヒト免疫グロブリンに関して使用される場合、機能的活性を保持している免疫グロブリンの一部分を指すことを意図する。機能的活性とは、例えば、抗原結合活性でも抗原特異性でもよい。機能的活性はまた、例えば、抗体の定常領域によって提供されるエフェクター機能であってもよい。ヒト・モノクローナル免疫グロブリンの機能的断片には、例えば、個々の重鎖または軽鎖およびそれらの断片（例えば、ＶＬ、ＶＨおよびＦｄ）；１価の断片（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’）；２価の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）；単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）；ならびにＦｃ断片が含まれる。このような用語は、例えば、本明細書中に援用する、ハーロウ（Harlow）およびレーン（Lane）、「Antibodies: A Laboratory Manual 」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）、１９８９年；「Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference」、マイヤーズ アール．エイ．（Myers, R.A. ）編、ニューヨーク所在のブイシーエイチパブリッシャーインコーポレイテッド（VCH Publisher, Inc. ））；ヒューストンら（Huston et al. ）、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、第２２巻、ｐ．１８９〜２２４、１９９３年；プラックサム（Pluckthun ）およびスケッラ（Skerra）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１７８巻、ｐ．４９７〜５１５、１９８９年、ならびにデイ，イー．ディー．（Day, E.D. ）、「Advanced Immunochemistry 第２版」、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のワイリー−リスインコーポレイテッド（Wiley-Liss, Inc.）、１９９０年の中に記載されている。
【００１８】
用語「機能的断片」は、例えば、ヒト・モノクローナル抗体のプロテアーゼによる消化または縮減によって、および当業者に公知の組換えＤＮＡ法によって生産される断片を含
むことを意図する。
【００１９】
用語「ＶＬ断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の軽鎖の断片を指し、この断片は、ＣＤＲなど、軽鎖可変領域の全てまたは一部を含む。ＶＬ断片は、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
【００２０】
用語「ＶＨ断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の重鎖の断片を指し、この断片は、ＣＤＲなど、重鎖可変領域の全てまたは一部を含む。
用語「Ｆｄ断片」とは、本明細書中で使用する場合、重鎖の可変領域および定常領域に連結された軽鎖の可変領域および定常領域をいう（すなわち、ＶＬ ＣＬおよびＶＨ ＣＨ−１）。
【００２１】
用語「Ｆｖ断片」とは、本明細書中で使用する場合、重鎖および軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、重鎖および軽鎖の定常領域を含まない、ヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。重鎖および軽鎖の可変領域は、例えばＣＤＲを含む。例えば、Ｆｖ断片は、重鎖および軽鎖の両方の約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域の全てまたは一部を含む。
【００２２】
用語「Ｆａｂ断片」とは、本明細書中で使用する場合、Ｆｖ断片よりも大きいヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。例えば、Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の可変領域および第１の定常ドメインの全てまたは一部を含む。従って、Ｆａｂ断片は、例えば重鎖および軽鎖の約１１０〜約２２０アミノ酸残基をさらに含む。
【００２３】
用語「Ｆａｂ’断片」とは、本明細書中で使用する場合、Ｆａｂ断片よりも大きいヒト・モノクローナル抗体の１価の抗原結合断片をいう。例えば、Ｆａｂ’断片は、軽鎖全体と、重鎖の可変領域全体と、重鎖の第１および第２の定常ドメインの全てまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’断片は、重鎖のアミノ酸残基２２０〜３３０の一部または全てをさらに含み得る。
【００２４】
用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、本明細書中で使用する場合、ヒト・モノクローナル抗体の２価の抗原結合断片をいう。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖の可変領域の全てまたは一部を含み、２つの重鎖および２つの軽鎖の第１の定常ドメインの全てまたは一部をさらに含み得る。
【００２５】
当業者には、ヒト・モノクローナル抗体の断片が機能的活性を維持している限り、同断片の正確な境界は重要でないことが知られている。周知の組換え法を使用して、当業者は、特定の適用のために所望される任意の終端を有する機能的断片を発現するようにポリヌクレオチド配列を操作し得る。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「血液凝固障害」とは、血栓塞栓性の障害の疾患状態（すなわち、血栓塞栓症に罹患しているかまたは過剰な血液凝固（血栓）状態にある個体）および血液凝固障害の疾患状態（すなわち、極度の血液凝固不足（例えば特発性血小板減少症）に罹患している個体）を含むことを意図する。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「炎症」は、感染に対する血液の任意の応答反応を包含することを意図し、該応答反応は、通常は白血球による感染に対する化学物質による反応である。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、用語「標識」は、ヒト免疫グロブリンまたは本発明の他の分子に結合され得る部分構造（moiety）を意味することを意図する。該部分構造は、例え
ば、治療手順または診断手順のために使用され得る。治療的標識には、例えば、本発明の免疫グロブリンに結合可能であり該免疫グロブリンのインテグリンへの結合をモニタリングするために使用可能な部分構造が含まれる。診断的標識には、例えば、分析方法によって検出可能な部分構造が含まれる。
【００２９】
分析方法には、例えば、定性的手法および定量的手法が含まれる。定性的な分析方法には、例えば、免疫組織化学法および間接的免疫蛍光法が含まれる。定量的な分析方法には、例えば、イムノアフィニティ手法（例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析）が含まれる。分析方法にはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方の画像化手法が含まれる。分析手段によって検出され得る診断的標識の具体的な例には、酵素、放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカーおよびビオチンが含まれる。
【００３０】
標識は、本発明の免疫グロブリンに直接結合されてもよいし、または本発明の分子に特異的に結合する２次結合因子に結合されてもよい。このような２次結合因子は、例えば２次抗体であってもよい。２次抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよく、ヒト抗体、げっ歯類の抗体またはキメラ起源の抗体のいずれでもよい。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫特異性」とは、その結合領域が、インテグリンと特異的に結合することによってインテグリンと免疫反応をし得ることを意味する。免疫グロブリンまたはその機能的断片は、約１０−５Ｍ−１〜１０−１３Ｍ−１、好ましくは１０−６Ｍ−１〜１０−１Ｍ−１、なおより好ましくは１０−７Ｍ−１〜１０−９Ｍ−１の親和性定数で抗原（インテグリン分子）と選択的に相互作用し得る。用語「免疫反応」は、その結合領域が、インテグリンまたはそのエピトープと結合すると免疫応答を惹起し得ることを意味する。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリンの結合領域を導き出し、該領域と結合する能力を有する抗原の任意の領域を意味する。
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、特定の疾患状態（すなわち、血液凝固障害）を軽減させ得る本発明の分子の量を意味することを意図する。特定の適用についての有効量であるとみなされる実際の量は、例えば、本発明の分子の親和性、反応性、安定性、バイオアベイラビリティまたは選択性、該分子に結合した部分構造、薬学的担体および投与経路のような要因によって変化しうる。有効量は、当業者に公知の方法を使用して決定または推定可能である。このような方法には、例えば、培養細胞または組織生検試料を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよび信頼性のある動物モデルが挙げられる。
【００３３】
用語「実質的に該アミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列」により、本発明者らは、その配列が、参照された配列のいずれか１つのアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有することを意味する。異なるタンパク質配列間およびＤＮＡ配列間の同一性の割合（％）の計算は、Ｃｌｕｓｔａｌプログラムによる多重アラインメントの作成によって実施され得る。参照された配列のいずれかに対して６５％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して７０％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して７５％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。参照された配列のいずれかに対して８０％より高い同一性を有するアミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸配列／ポリヌクレオチド配列／ペプチド配列は、参照される配列のいずれかに対して８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、なおより好ましくは９２％の同一性、なおより好ましくは９５％の同一性、なおより好ましくは９７％の同一性、なおより好ましくは９８％の同一性を有し、最も好ましくは参照配列のいずれか
に対して９９％の同一性を有する。
【００３４】
実質的に類似するヌクレオチド配列は、配列番号１〜１０、１２および１４〜２０に示される配列またはそれらの相補体と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされることになる。ストリンジェントな条件については、本発明者らは、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃で該ヌクレオチドをフィルタに結合したＤＮＡにハイブリダイズさせた後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で約５℃〜６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味している。あるいは、実質的に類似するポリペプチドは、配列番号１１および１３に示される配列と、少なくとも１アミノ酸、しかし好ましくは１００未満、５０未満、２０未満、１０未満または５未満のアミノ酸が異なるものでよい。
【００３５】
遺伝子コードの縮重に起因して、当然のことであるが、いかなる核酸配列も、同核酸配列によってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変更または変化させて、同核酸配列の機能的改変体を提供し得る。適切なヌクレオチド改変体は、その配列内に、同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換することによって変更された配列を有し、従ってサイレントな変化を生じる改変体である。
【００３６】
他の適切な改変体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、全配列または配列の一部分が異なるコドンで置換することによって変更されている改変体であり、該コドンは置換されるアミノ酸と類似した生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードしているので保存的変化を生じる。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリンおよびメチオニンが含まれる。大きい非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性の中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００３７】
タンパク質配列またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは、多数の研究者によって詳細に研究されてきた複雑な方法である。配列の最適なマッチングとこのようなマッチングを得るためのギャップの導入との間の妥協が特に重要である。タンパク質の場合、マッチングをスコア化する手段もまた重要である。ＰＡＭマトリックス（例えば、デイホフ，エム．ら（Dayhoff, M. et al.）、１９７８年、「Atlas of protein sequence and structure 」、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．）およびＢＬＯＳＵＭマトリックスのファミリーは、保存的置換の性質および見込みを定量し、多重アラインメント・アルゴリズムにおいて使用されるが、他の等しく適用可能なマトリックスも当業者には公知であろう。一般的な多重アラインメントのプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷおよびそのウインドウズ・バージョンのＣｌｕｓｔａｌＸ（トンプソンら（Thompson et al. ）、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２２巻、ｐ．４６７３〜４６８０；トンプソンら（Thomson et al.）、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、ｐ．４８７６〜４８８２）は、タンパク質およびＤＮＡの多重アラインメントを作成するのに有効な方法である。
【００３８】
自動的に作成されたアラインメントは手動のアラインメントを必要とすることが多く、この手動のアラインメントには研究対象のタンパク質ファミリーに関する熟練した使用者の知識（例えば、保存性の高い重要な部位についての生物学的知識）が利用される。このようなアラインメント・エディタ・プログラムの１つはＡｌｉｇｎ（http://www.gwdg.de/~dhepper/download/ ；ヘッパール，ディー．（Hepperle, D.）、２００１年、「Multicolor Sequence Alignment Editor. 」、ドイツ連邦共和国、１６７７５、シュテヒリン（
Stechlin）所在の淡水生態学および内陸漁業研究所（Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries）であるが、ＪａｌＶｉｅｗまたはＣｉｎｅｍａのような他のプログラムもまた適切である。
【００３９】
タンパク質間の同一性（％）は、Ｃｌｕｓｔａｌによる多重アラインメントの作成の間に計算される。しかし、同一性の値は、そのアラインメントが手動で改善された場合、または２つの配列を慎重に比較するために、再計算される必要がある。同一性（％）は、（Ｎ／Ｔ）×１００と規定することができるが、ここで、Ｎは、２つの配列が同一の残基を共有する部位の数であり、Ｔは比較される部位の総数である。一方の配列または両方の配列がギャップを有するアラインメント中の残基は、この計算に含めない。アラインメント内の対についてこの値を計算する多数のプログラムが存在する。タンパク質についての１例は、アミノ酸置換についてのモデルとして「Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｔａｂｌｅ」オプション（Ｐ）を使用した、ＰＨＹＬＩＰ系統発生学パッケージ中のＰＲＯＴＤＩＳＴ（フェルゼンシュタイン（Felsenstein ）；http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html）である。ＤＮＡ／ＲＮＡについては、ＰＨＹＬＩＰのＤＮＡＤＩＳＴプログラム内に同一のオプションが存在する。別例として、同一性（％）を、（Ｎ／Ｓ）×１００と規定することもでき、ここで、Ｓは比較されている配列の短い方の長さである。
【００４０】
タンパク質配列における他の修飾（すなわち、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、タンパク質分解による切断またはリガンドへの連結によって、翻訳中または翻訳後に生じる修飾）もまた想定され、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内にある。
【００４１】
本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供される。
【００４２】
この抗原結合領域は、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはその機能的断片を含み得る。免疫グロブリンまたはその機能的断片のＣＤＲ間で枠組構造領域に変異が存在してもよい。
【００４３】
本発明の第２の態様によれば、
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１２の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたは
その機能的断片が提供される。
【００４４】
本発明の第３の態様によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供され、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１３に定められたアミノ酸配列を有し、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１１に定められたアミノ酸配列を有する。
【００４５】
本発明の第４の態様によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片が提供され、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１２に定められたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされ、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１０に定められたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４６】
第５の態様によれば、
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたペプチドが提供される。
【００４７】
このペプチドはポリペプチドを含み得る。好ましくは、このペプチドはインテグリンに結合するように適合している。
本発明の第６の態様によれば、
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１０の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００４８】
好ましくは、このポリヌクレオチドは、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードする。好ましくは、このポリヌクレオチドは、組換えヒト免疫グロブリンの少なくとも１つの抗原結合領域のアミノ酸配列を実質的にコードするヌクレオチド配列、またはその機能的断片を含む。
【００４９】
有利なことに、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は、それ自体で潜在的な治療的相互作用を有し、非ヒト領域（例えばマウス）、Ｆｃ断片（枠組構造領域）または少なくとも１つのマウス抗原結合領域（すなわち、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む免疫グロブリンを使用する現在の治療に対する改善である。
【００５０】
第７の態様によれば、医薬としての使用または診断における使用のための、各々任意選
択で誘導体化された、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドが提供される。
【００５１】
第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５２】
好ましくは、前記医薬は、血液凝固障害を抑制または予防するように適合している。
第８の態様によれば、血液凝固障害を治療するための医薬の調製のための、任意選択で誘導体化済みの、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００５３】
従って、免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチドまたはポリヌクレオチドは、好ましくはその誘導体または改変体を作製するために、使用前に改変されてもよい。第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンもしくはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、または第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５４】
好ましくは、前記医薬は、血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを抑制または予防するように適合している。
第９の態様によれば、血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかを治療する方法が提供され、この方法は、各々任意選択で誘導体化された、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む。
【００５５】
治療する方法は、抗炎症治療法および抗血栓塞栓治療法のうち少なくともいずれかを含み得る。
第１０の態様によれば、各々任意選択で誘導体化された、本発明の第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたは機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５６】
第１〜第４の態様のいずれかに規定される免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドは、誘導体化されなくてもよい。
【００５７】
適切な医薬品賦形剤には、例えば、生理学的に緩衝化された生理食塩水のような水溶液、および、グリコール、グリセロール、油または注射可能な有機エステルのような他の溶媒または媒体が含まれる。医薬品担体は、例えば、医薬組成物を安定化させるように、または医薬組成物の溶解性を増大させるように作用する生理学的に許容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に許容可能な化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロースまたはデキストロース）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）；キレート剤；低分子量タンパク質；または別の安定剤もしくは賦形剤であってもよい。当業者には周知のことであるが、医薬品媒体の選択および組成物の適切な調製は、意図される用途および投与様式に依存する。
【００５８】
好ましくは、この組成物は、患者において血液凝固障害および炎症のうち少なくともい
ずれかを予防または軽減させるために前記患者に投与されるように適合している。好ましくは、この血液凝固障害は、患者における血栓塞栓性の障害を含む。好ましくは、この組成物は、患者において血液凝固障害を、より好ましくは血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを検出するためにも使用され得る。
【００５９】
第１１の態様によれば、血液凝固障害を有する個体を治療または診断するためのキットが提供され、このキットは、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
好ましくは、このキットは検出手段をさらに含み、該検出手段は、前記免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的な抗原の有無を検出するように適したアッセイを含むことが好ましい。キットは、該検出手段によって検出され得る標識を含み得る。
【００６１】
第１２の態様によれば、血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかに対する個体の感受性を決定するための方法が提供され、この方法は、
（ｉ）個体から試料を得る工程、および
（ｉｉ）第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその断片、第５の態様に規定されるペプチド、あるいは第６の態様に規定されるポリヌクレオチドを使用して、試料中の抗原のレベルを決定する工程
を含む。
【００６２】
抗原はインテグリンを含んでなることが好ましく、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを含んでなることがより好ましい。試料は、血液、尿、組織などを含み得る。
この組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、第１および第２の態様に規定される抗原結合領域を、少なくとも２つ、適切には少なくとも３つ、より適切には少なくとも４つ含んでなるとよい。好ましくは、この組換え免疫グロブリンまたは機能的断片は、少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つ、なおより好ましくは少なくとも７つの抗原結合領域を含んでなる。好ましい実施形態において、この組換え免疫グロブリンまたは機能的断片は、８つ全ての抗原結合領域を含んでなる。
【００６３】
この組換え免疫グロブリンは、抗原結合領域のうちいずれか、または全ての抗原結合領域を含み得る。この組換え免疫グロブリンは抗原結合部位を含み得るが、この抗原結合部位に抗原が結合し、好ましくは免疫学的応答を惹起する。好ましくは、少なくとも１つの抗原結合領域が抗原結合部位の少なくとも一部を形成する。
【００６４】
好ましくは、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は１価である。しかし、この免疫グロブリンは２価であっても多価であってもよい。
不都合なことに、２価または多価の免疫グロブリンは、フィブリノゲン代替物として作用して血小板凝集を促進する傾向を有する可能性がある。これは、２価免疫グロブリンが、第１の血小板細胞上の第１のフィブリノゲン・レセプターに結合し、かつ第２の血小板細胞上の第２のフィブリノゲン・レセプターにも結合し得るからである。従って、２価免疫グロブリンによって２つの血小板細胞間に架橋が形成され、その結果血小板の凝集が生じる。これは危険性があろう。
【００６５】
有利なことに、上で議論した２価および多価の免疫グロブリンとは対照的に、１価の免疫グロブリンは、単一の血小板上の１つのフィブリノゲン・レセプターだけに結合し得るので、血小板にフィブリノゲンが結合するのを防止し、従って、血小板凝集を防止する。１価の免疫グロブリンは、血小板細胞間に架橋を形成し得ない。
【００６６】
従って、本発明は、第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を作製する方法まで及び得るが、該方法において、免疫グロブリンまたはその機能的断片は１価である。
【００６７】
好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、１価の免疫グロブリンまたはその機能的断片として直接作製される。本発明の方法は、１価の免疫グロブリンを生産するために２価または多価の免疫グロブリンを切断する工程を含まないことが好ましい。このような手法は通常、直接作製された１価の免疫グロブリンよりもリガンドに対する親和性が低い１価の免疫グロブリンを生じるであろう。
【００６８】
１価の免疫グロブリンは、ヒトの体内におけるｉｎ ｖｉｖｏの寿命が比較的短いことが好ましく、例えば、好ましくは２カ月未満、より好ましくは１カ月未満、なおより好ましくは２週間未満、最も好ましくは４８時間未満である。免疫グロブリンは、例えば、手術後に患者が血栓症に罹患する危険性を低下させるために、手術後に患者に投与することによって医学的に使用され得る。２価および多価の免疫グロブリンは、かなり長い寿命（例えば、約２カ月〜３カ月）を有する傾向があり、医学的な使用にとってあまり適切ではない。さらに、２価の免疫グロブリンは、患者に血栓症を引き起こす傾向がある。
【００６９】
抗原はインテグリンを含んでなることが好ましい。
インテグリンは、好ましくは２つのファミリーに由来するα鎖およびβ鎖からなる。これらの鎖が組み換わることにより、免疫応答および凝固反応における異なる機能を有する種々のインテグリン分子を生じる。
【００７０】
α鎖には、α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α１１、αＩｂ、αＩＩｂ、αＭ、αＶ、αＥ、αＬ、αＸが含まれる。
β鎖には、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８が含まれる。
【００７１】
このα鎖およびβ鎖は、特定の組合せを生じるように組み合わせることが可能であり、該組合せは、各々が例えば、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４であるインテグリンを生じる。
【００７２】
従って、約２４種のインテグリン・ファミリー構成分子が存在する。
抗原は、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなることが好ましい。
【００７３】
好ましくは、抗原はβ３インテグリンを含んでなる。好ましくは、抗原は、αＶβ３、αＩＩｂβ３およびαＩｂβ３からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる。
【００７４】
例えば、適切なインテグリンには、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３）、ＬＦＡ−１（αＬβ２）、ＶＬＡ−４（α４β１）、ＭＡＣ−１（αＭβ２）およびｐ１５０．９５（αＸβ２）が含まれる。上記インテグリンは、構造的、機能的および免疫化学的に互いに類似している。従って、上記のインテグリンに構造的、機能的および免疫化学的に類似している上に列挙した他のインテグリンもまた、特許請求の範囲に記載される
本発明の範囲内にある。
【００７５】
好ましくかつ有利には、本発明の免疫グロブリンまたはその機能的断片は、インテグリン（例えば、ヒト糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）が実質的に精製されている場合、該インテグリンに対する免疫特異性を有することが好ましい。好ましくかつ有利には、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、その外表面上にインテグリン（例えば、ヒト糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）を有する血小板に結合するように適合している。
【００７６】
本発明の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、好ましくは自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）に罹患している個体から単離され得る。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、患者の血小板濃度が健康な個体中の血小板濃度よりも低いことによって特徴付けられる。さらに、この疾患状態ＡＩＴＰは、血小板インテグリン（例えば、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ）に対する免疫特異性を有する免疫グロブリンの存在によって特徴付けられる。他の血小板インテグリンに対する免疫特異性を有する免疫グロブリンもまた、ＡＩＴＰ患者体内に存在し得る。
【００７７】
好ましくかつ有利には、本発明の免疫グロブリンまたはその機能的断片は、アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している。好ましくかつ有利には、この免疫グロブリンまたはその機能的断片は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合（血小板凝集の開始における主な相互作用）を実質的に阻害するように適合している。
【００７８】
興味深いことに、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、体細胞突然変異によって誘導される。好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、生殖系列の進化とは対照的に、親和性成熟によって誘導される。
【００７９】
ＡＩＴＰに罹患した個体では通常、機能を阻害する抗体が報告されているにもかかわらず、血小板が急速に除去されることが原因で血小板数が低い。しかし、驚くべきことに、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとフィブリノゲンとの間の相互作用を特異的に阻害するモチーフを含む抗体が、体細胞突然変異を介して生じるようである。単離されたモノマー形態は血小板凝集を阻害する一方、ｉｎ ｖｉｖｏで通常存在するダイマー形態は、血小板凝集を加速することによってこの疾患の通常の病態を阻害していることが予測され得る。
【００８０】
本発明のＣＤＲについて使用される名称を表１に示す。
【００８１】
【表１】
【００８２】
好ましくは、配列番号１３の残基３１〜３３によって規定される抗原結合領域は、アミノ酸配列「ＲＳＤ」を含む。好ましくは、配列番号１３の残基３０〜３８として示されるアミノ酸配列によって規定される結合領域は、「ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ」のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
好ましくは、免疫グロブリンの機能的断片は、ヒト免疫グロブリンと実質的に同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する断片を含む。好ましくは、この機能的断片はインテグリン特異的である。好ましくは、この機能的断片には、結合領域配列のうち少なくとも１つが免疫グロブリン、より好ましくはインテグリン特異的ヒト免疫グロブリンの結合領域配列と実質的に同じアミノ酸配列である断片が含まれる。この機能的断片は、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片からなる群から独立に選択される断片のいずれかを含み得る。
【００８４】
この機能的断片は、ヒト免疫グロブリンのＶＬの抗原結合領域配列のいずれか１つ、ＶＨの抗原結合領域配列のいずれか１つ、またはＶＬ抗原結合領域およびＶＨ抗原結合領域の組合せを含み得る。ＶＨ抗原結合領域配列およびＶＬ抗原結合領域配列の適切な数および組合せは、機能的断片の所望の親和性および特異性ならびに意図される用途によって、当業者が決定することができる。
【００８５】
免疫グロブリンの機能的断片は、当業者に周知の方法を使用して容易に生産および単離可能である。このような方法には、例えば、タンパク質分解法、組換え法および化学合成が含まれる。
【００８６】
機能的断片の単離のためのタンパク質分解法は、出発材料としてヒト免疫グロブリンを
使用する工程を含む。ヒト免疫グロブリンのタンパク質分解に適切な酵素には、例えば、パパインおよびペプシンが含まれる。適切な酵素は、例えば、１価の断片が必要か２価の断片が必要かによって、当業者が容易に選択することができる。例えば、パパイン切断では、抗原に結合する２つの１価のＦａｂ’断片およびＦｃ断片を生じる。ペプシン切断では、例えば、２価のＦ（ａｂ’）断片を生じる。本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、２つの１価のＦａｂ’断片を生成させるために、例えばＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールを使用してさらに還元されてもよい。
【００８７】
タンパク質分解によって生成された機能的断片は、アフィニティ・クロマトグラフィー手法およびカラム・クロマトグラフィー手法によって精製され得る。例えば、未消化の抗体およびＦｃ断片は、プロテインＡへの結合によって除去され得る。さらに、機能的断片は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、該断片の電荷およびサイズによって精製され得る。このような方法は当業者に周知である。
【００８８】
ヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片は、組換え法によって生産することもできる。好ましくは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の所望の領域をコードするポリヌクレオチドを最初に単離する。このような領域は、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域の全体または一部を含み得る。好ましくは、このような領域は特に、重鎖および軽鎖の抗原結合領域、好ましくは抗原結合部位、最も好ましくはＣＤＲを含み得る。
【００８９】
本発明のヒト免疫グロブリンまたは機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法を使用して生産することができる。免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド合成の方法によって直接合成され得る。別例として、比較的小さい断片を合成し、当該分野で公知の組み換え方法を使用して連結してより大きい機能的断片を形成することも可能である。
【００９０】
好ましくは、免疫グロブリンまたはその機能的断片は、バクテリオファージ発現系によって生産される。好ましくは、このバクテリオファージ発現系は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを含む。
【００９１】
免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを単離するために有用な手順は、自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）に罹患している個体から単離されたＲＮＡから逆転写され得るｃＤＮＡの単離から開始する。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａを含む血小板インテグリンに対する免疫特異性を有する抗体の存在によって特徴付けられる。ｃＤＮＡ合成のための方法は当該分野で周知である。重鎖または軽鎖を含む免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするｃＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅され得る。
【００９２】
ＰＣＲのために適切なプライマーは、重鎖または軽鎖の特定の機能的断片に隣接する保存された配列を使用して、当業者によって決定され得る。例えば、適切なＰＣＲプライマーは、配列番号１〜配列番号７および配列番号１４〜配列番号２０として実質的に示されるポリヌクレオチドのうちいずれかを含み得る。適切なＰＣＲ条件は、当業者によって決定され得る。
【００９３】
好ましくは、ＰＣＲは、重鎖、より好ましくはＶＨ ＣＨ−１断片、なおより好ましくは重鎖可変領域の断片（ＶＨ）を増幅するように適合されている。別例として、または追加として、ＰＣＲは、軽鎖、より好ましくはＶＬ ＣＬ断片、なおより好ましくは軽鎖可変領域の断片（ＶＬ）を増幅するように適合されている。
【００９４】
好ましくは、ＰＣＲ反応は、例えば配列番号１〜７および１４〜２０からなるプライマー群から独立に選択され得る、適切なプライマーを使用して構成される。
好ましくは、ＰＣＲ産物は、適切な発現ベクター、より好ましくはファージ発現ベクター（例えばｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）中にクローニングされる。好ましくは、重鎖断片はＸｈｏＩおよび好ましくはＳｐｅＩによって消化されてからベクターへクローニングされる。好ましくは、軽鎖断片はＳａｃＩおよび好ましくはＸｂａＩによって消化されてから発現ベクターへクローニングされる。
【００９５】
好ましくは、該ベクターは、重鎖断片および好ましくは軽鎖断片が発現するように、適切な宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に導入される。適切なベクターと宿主細胞の系は、例えば、重鎖および軽鎖の機能的断片の同時発現および集合を可能にし得る。好ましくは、ベクターは、エレクトロポレーションによって宿主中に導入される。
【００９６】
抗体断片の発現に適切な他の系は当業者であれば決定可能であり、該系には例えば、Ｍ１３ファージ発現ベクターが含まれる。組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片は、当該分野で公知の方法を使用して実質的に精製可能であり、該方法は使用される特定のベクターおよび宿主の発現系によって決まる。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明は、インテグリン特異的ヒト免疫グロブリンに関する。有利なことに、この免疫グロブリンはヒト起源であり、従って、非ヒト起源のエレメントを含む免疫グロブリンを使用する場合とは対照的に、ヒト患者への投与の際にあらゆる免疫応答をも最小限とする可能性が高い。さらに、免疫グロブリンまたはその機能的断片、ならびにこの免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば抗炎症および血液凝固障害の疾患状態に応じた、組成物および診断薬の製造、ならびにそれらの使用のために有効に使用され得る。
【００９８】
本発明の第１４の態様によれば、第６の態様において規定されるポリヌクレオチドまたはその誘導体を含んでなる組換えＤＮＡ分子が提供される。
好ましくは、この組換えＤＮＡ分子は発現ベクターを含む。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能な状態に連結される。適切な制御配列は、プロモーター、エンハンサーなどを含み得る。
【００９９】
本発明の第１５の態様によれば、第１４の態様の組換えＤＮＡ分子を含む細胞が提供される。
この細胞は、適切な手段によって組換えＤＮＡ分子で形質転換または形質移入され得る。
【０１００】
本発明の第１６の態様によれば、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を調製する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）必要とされる免疫グロブリンまたはその機能的断片を発現し得る、第１５の態様に規定される少なくとも１つの細胞を培養する工程、および
（ｉｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む。
【０１０１】
免疫グロブリンまたはその機能的断片は、インテグリン・ファミリーの他の構成分子に対する免疫特異性を示す免疫グロブリンの開発のためのフレームワークとなるように使用され得る。インテグリンは、２つのファミリー由来のα鎖およびβ鎖からなる。これらの鎖を組換えることにより、免疫応答および凝固反応において異なる機能を有する種々のインテグリン分子が生じる。インテグリンの例としては、
αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１、α６β４
が含まれる。
【０１０２】
これらの組合せの各々は、血小板凝集におけるその役割とは別の種々の機能、例えば免疫応答の活性化、白血球の遊走（これらはいずれも抗炎症治療の標的である）、精子と卵との間の相互作用、ならびに血管形成（主要な抗腫瘍治療の標的）などを有する。
【０１０３】
第１７の態様によれば、標的のインテグリンに結合する能力を有する組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）第１〜第４の態様のいずれかに規定される組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を突然変異させて変異体を生成させる工程、および
（ｉｉ）標的のインテグリンに対する活性について変異体を選択する工程
を含む。
【０１０４】
第１の実施形態において、前記突然変異させる工程は、ランダム変異誘発、好ましくは縮重ＰＣＲの使用を含み得る。免疫グロブリンのｃＤＮＡがＰＣＲ反応中の鋳型として使用され、該反応に変異原を加えることが好ましい。ＰＣＲ反応には、変異誘発性のヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＰおよび８−オキソ−２’デオキシグアノシン）を加えることが好ましい。有利なことに、このことにより、高度に制御された様式でｃＤＮＡ中の至る所に変異を導入して変異体ライブラリーを作製することが可能である。得られた変異体ライブラリーは、ファージの表面上に提示可能であり、所望のインテグリンに対する抗体が選択可能である。
【０１０５】
得られた変異体抗体のライブラリーは、バイオパニングを使用して所望のインテグリンに対して選択可能である。ＥＬＩＳＡプレートを、所望のインテグリンで被覆すればよい。例えば、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）中の所望のインテグリンの１μｇ／ｍｌ溶液１００μｌを、４℃で一晩インキュベートすることができる。
【０１０６】
好ましくは、ＴＢＳで２回洗浄した後、プレートをＰＢＳ中５％のＢＳＡでブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートすればよい。さらに２回の洗浄後、１００μｌのファージ懸濁物を各ウェルに添加してプレートを３７℃で２時間インキュベートすることができる。
【０１０７】
ファージを除去し、ウェルをＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）で満たし、激しくピペット撹拌することができる。５分後にＴＢＳＴを除去すればよいが、第１回のパニングについては、プレートはこの方法で１回洗浄すればよい。第２回のパニングでは５回洗浄すればよく、第３回および以降の回においては１０回洗浄した。次いで、１ウェル当たり５０μｌの溶出緩衝液でファージを溶出可能であり、室温で１０分間インキュベートすればよい。激しくピペット撹拌した後、溶出したファージを取り出して、２Ｍ Ｔｒｉｓベース３μｌで中和することができる。
【０１０８】
第２の実施形態において、前記突然変異させる工程は、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の少なくとも１つの抗原結合領域中に、標的インテグリンに対する免疫特異性を有する少なくとも１つのリガンドを導入する工程を含み得る。
【０１０９】
この少なくとも１つのリガンドは、ＲＤＧ、ＲＳＧ、ＲＳＤ、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＧＰＲ、ＲＰＧ、ＡＥＩＤＧＩＥＬ、ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ、ＱＩＤＳ、ＬＤＴ、ＩＤ
ＡＰＳ、ＤＬＸＸＬおよびＧＦＯＧＥＲからなる一群のリガンドから独立に選択され得る。ＧＦＯＧＥＲはヒドロキシプロリンである。
【０１１０】
この少なくとも１つの抗原結合領域は、重鎖および軽鎖のうち少なくともいずれかの可変断片中に存在し得る。好ましくは、この少なくとも１つのリガンドは、免疫グロブリンまたはその機能的断片の重鎖の抗原結合領域のいずれかの中に導入される。好ましくは、この少なくとも１つのリガンドは、第１の結合領域中に導入される。例えば表１を参照のこと。
【０１１１】
リガンドは、分子モデリングを含む種々の技術によって決定された適切な部位に、制限酵素消化によって挿入され得る。リガンドのペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列は、切断された制限酵素部位にライゲーションされ得る。これについての正確な詳細事項は、使用されるリガンドおよびＣＤＲの性質によって変わる。
【０１１２】
第２の実施形態において、前記突然変異させる工程は、ランダム変異誘発をさらに含み得る。
第１８の態様によれば、第１７の態様において規定される方法を使用して生成された、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片のライブラリーまたはパネルが提供される。
【０１１３】
上に列挙した多数のインテグリンの組合せは、種々の疾患（特に腫瘍）において過剰発現される可能性があり、従って、免疫グロブリンまたは抗体を用いて腫瘍の場所を特定することが可能である。腫瘍、および場合によっては他の疾患の治療成績をインテグリンの発現によって予測可能であることもまた示唆される。
【０１１４】
本発明の第１９の態様によれば、抗血小板作用を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）少なくとも１つの完全な血小板に対して少なくとも１種の免疫グロブリンまたはその機能的断片を接触させる工程、および
（ｉｉ）完全な血小板に対する結合特異性を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む。
【０１１５】
用語「完全な血小板」によって、本発明者らは、血小板膜が本来の状態ではない可能性のある血小板の領域または部分ではなく、血小板膜が好ましくは本来の状態である完全な血小板または無傷の血小板を意味する。抗血小板作用を有する免疫グロブリン、という用語によって、本発明者らは、アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している免疫グロブリンまたはその機能的断片を意味する。好ましくは、かつ有利なことに、本発明の抗血小板作用を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープへのフィブリノゲンの結合（血小板凝集の開始における主な相互作用）を実質的に阻害するように適合している。
【０１１６】
上記少なくとも１種の免疫グロブリンは、バクテリオファージと結合していることが好ましい。バクテリオファージ・ライブラリーを、少なくとも１つの完全な血小板に対して接触させることが好ましい。複数の完全な血小板が使用されることが好ましい。前期接触工程は、完全な血小板に対してファージ・ライブラリーをパニングする工程を含む。
【０１１７】
有利なことに、この方法は、機能的に活性な免疫グロブリンの探索において特定の抗原（例えばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）に対して免疫グロブリンをスクリーニングすることよりも、時間がはるかにかからない。なぜなら、インテグリンが血小板膜と共に本来の状態で存在すると思われるからである。
【０１１８】
本明細書中に記載される特徴の全ては、任意の組合せで、上記の態様のいずれとも組み合わされる。
本発明のある実施形態は、添付の図面および配列表を参照しながら、実施例としてここに記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明の１実施形態を、以下の実施例によってここに説明する。
【実施例】
【０１２０】
この検討課題の第１段階は、２人の自己免疫性特発性血小板減少症（ＡＩＴＰ）の患者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーを構築することであった。この疾患状態（ＡＩＴＰ）は、患者の血小板濃度が健康な個体と比較して低いことによって特徴付けられる。さらに、この疾患状態ＡＩＴＰは、血小板インテグリン糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する免疫特異性を有する抗体の存在によって特徴付けられる。
【０１２１】
（ライブラリー構築）
全ＲＮＡを、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ単離キット（英国所在のバイオテックス・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用してＡＩＴＰ患者由来のホモジナイズした脾臓組織から単離した。次いで、以下のように、脾臓組織から単離されたＲＮＡに対する逆転写を実施することによってｃＤＮＡを生成した。
【０１２２】
１０μｇ〜３０μｇの単離ＲＮＡを滅菌した１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標）チューブに添加した。次いで、１μｇ（２μｌ）のオリゴｄＴを添加し、ヌクレアーゼを含まない水またはＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）水を用いて体積を２７μｌとした。この反応物を７０℃で１０分間加熱し、次いで４０℃まで冷却した。
【０１２３】
次いで、２μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤を１０μｌ（５×）ＲＴ緩衝液と共に添加した。続いて３μｌのｄＮＴＰを添加した（各々２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）。次いで５μｌの０．１Ｍ ＤＴＴを添加し、逆転写酵素の添加前にＤＥＰＣ水を使用して体積を４８μｌとした。次いで、２００ユニット（２μｌ）の逆転写酵素（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）、英国所在のギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を添加し、反応物を室温で１０分間インキュベートした。この反応を、９０℃で５分間インキュベートしてから４℃で１０分間インキュベートすることによって終結させた。
【０１２４】
ＡＩＴＰ患者のＲＮＡを逆転写した後、ｃＤＮＡの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖（κ鎖）可変領域を、定常（Ｃ）領域プライマーおよび可変領域（ＶＨおよびＶκ）の第１フレームワークに特異的なプライマー群、ならびに追加のＶＨおよびＶκプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
【０１２５】
重鎖のＣＯＯＨ末端で増幅を開始する重鎖可変領域プライマーは以下である。
【０１２６】
【化１】
【０１２７】
上記重鎖可変領域プライマーを、以下の重鎖ＩｇＧ１特異的定常（ＣＨζ）ドメイン・プライマーと共にＰＣＲ反応において使用した。
【０１２８】
【化２】
【０１２９】
κ軽鎖のＣＯＯＨ末端で増幅を開始するκ軽鎖可変ドメイン・プライマーは以下である。
【０１３０】
【化３】
【０１３１】
上記軽鎖可変領域プライマーを、以下の軽鎖定常ドメイン・プライマーと共にＰＣＲ反応において使用した。
【０１３２】
【化４】
【０１３３】
使用可能な可変領域プライマーは多種多様であるため、全てのプライマーを全ての増幅において使用した。
上記ＲＮＡの逆転写反応から新たに調製されたＲＴ−ＰＣＲ混合物は、７９２μｌのＤ
ＮＡｓｅを含まない水、１００μｌの（１０×）Ｔａｑ緩衝液および８μｌのｄＮＴＰ（各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）から構成されるものとした。９０μｌのこのＰＣＲ混合物を新たなＰＣＲ反応用チューブに添加した。次いで、３μｌの５’プライマーおよび３μｌの３’プライマー（すなわち、６０ｐｍｏｌｅの各プライマー（各々２０μＭ））を、各ＰＣＲ反応チューブに添加した。
【０１３４】
次いで、５ユニット（０．５μｌ）のＴａｑポリメラーゼを各反応チューブに添加した。次いで、２μｌのｃＤＮＡ（本来２μｌのＲＮＡを含む）を添加した。次いで、２滴の鉱油を各反応チューブの上部に添加し、次いで２５〜４０サイクルのＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ反応の詳細は以下のとおりであった：
（９４℃で３０秒間、５２℃で５０秒間および６８℃で９０秒間）×４０サイクル。次いで、１０μｌのＰＣＲ反応産物を取り出して、２μｌの６×ローディングバッファ液を添加した。
【０１３５】
得られた混合物を、２％のアガロース・ゲル（５０：５０の通常アガロース：低融点アガロース）で、φ１７４／Ｈａｅ ＩＩＩマーカーと共に泳動した。約６６０ｂｐの強いバンドから、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）をコードするＤＮＡ、または軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードするＤＮＡが首尾よくＰＣＲ増幅されたことが示された。
【０１３６】
重鎖および軽鎖のＰＣＲ産物をゲル精製し、抽出し（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＰＣＲ
Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）、英国所在のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、制限酵素消化およびクローニングの効率を増大させるために、５’ポリ（ＧＡ）テイルを有する伸長プライマーを使用して再増幅した［ウイリアムソン（Williamson）、１９９３年、ウイリアムソン アールエイ（Williamson RA ）、ブリオーニ アール（Burioni R ）、サンナ ピーピー（Sanna PP）、パートリッジ
エルジェイ（Partridge LJ）、バーバス シーエフ３世（Barbas CF,3rd ）、バートン
ディーアール（Burton DR ）、「Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries 」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ 第９０巻、４１４１〜５ページ、１９９３年］。このＰＣＲ反応は以下のとおりであった：
（９４℃で３０秒間、５２℃で５０秒間および６８℃で９０秒間）×４０サイクル。
【０１３７】
最初のファージ・ライブラリー構築には、スクリップス・リサーチ・インスティテュート社（Scripps Research Institute）［米国カリフォルニア州ラホヤ所在］提供の図１に示すｐＣｏｍＢ３ＨＳＳファージ・ディスプレイ・ベクターを使用した。制限酵素で消化するために、ＰＣＲ増幅された重鎖および軽鎖のＤＮＡの濃度を最初に決定した。次いで、軽鎖ＰＣＲ断片（ＶＬおよびＣＬ）をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、重鎖ＰＣＲ断片（ＶＨおよびＣＨ−１）をＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ（ギブコビーアールエル社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））で消化した。次いで、これらの消化物を、ライゲーションされるＰＣＲ断片について使用した酵素と同じ酵素で予め切断したｐＣｏｍＢ３ＨＳＳベクター中に順次ライゲーションした。すなわち、通常は軽鎖をベクター中に最初にクローニングし、その後重鎖をクローニングした。
【０１３８】
適切に消化した１４００ｎｇのベクターを反応チューブに添加し、４５０ｎｇの適切に消化したＰＣＲ産物（すなわち、重鎖断片（ＶＨおよびＣＨ−１）または軽鎖断片（ＶＬおよびＣＬ）のいずれか）、４０μｌの５×リガーゼ緩衝液および１０μｌのリガーゼを含めて総体積２００μｌとした。このライゲーション反応物を室温で一晩インキュベートし、次いで７０℃で１０分間加熱して失活させた。ＤＮＡを沈殿させ、得られたＤＮＡペレットの水分を切り、７０％エタノールですすぎ、次いでペーパー・タオル上で乾燥させ
た。このペレットをＳｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）でさらに乾燥させ、１５μｌの水に再懸濁した。このチューブを１０分間氷上に配置した。ライゲーション反応が正常に行われたことを確認するために、陽性対照のライゲーション反応を実施した。
【０１３９】
次いで、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅのエレクトロコンピテント細胞（１回のライゲーション反応当たり３００μｌ）を解凍し、ライゲーションされたベクターＤＮＡを含むチューブに添加し、混合して１分間放置した。この細胞／ＤＮＡ混合物をエレクトロポレーション・キュベットに移し、エレクトロポレーションを以下のように実施した。
【０１４０】
エレクトロポレーションを実施するために、細胞を、２．５ｋＶ、ギャップサイズ０．２ｃｍのキュベット、２５μＦＤおよび２００Ωの条件でパルスした。エレクトロポレーション・キュベットを、最初に１ｍｌで洗い、次いで２ｍｌのＳＯＣ培地を室温にて即座に流し込み、その後すぐにこのＳＯＣ培地中でシェーカー（２５０ｒｐｍ）中で３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む予め温めた（３７℃）スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ、ＳＢ）１０ｍｌを添加した。対照のライゲーション試料については１００ｍｌ、１０ｍｌおよび１ｍｌ、ライブラリーのライゲーション試料については１０ｍｌ、１ｍｌおよび０．１ｍｌを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に播種することによって、即座に形質転換体の力価を決定した。
【０１４１】
形質転換された大腸菌の１０ｍｌ培養物を、シェーカー（３００ｒｐｍ）で３７℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、カルベニシリンを、５０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７μＣでさらに１時間インキュベートした。１０ｍｌの培養物を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに添加し、シェーカーで３７℃にて一晩インキュベートした。
【０１４２】
一晩増殖させた後、ファージ・プラスミドＤＮＡをミニプレップ（小規模精製）することによって単離した。単離したベクターを第１鎖の挿入についてチェックし、次の鎖とのライゲーションのために準備した。通常、軽鎖をベクター中に最初にクローニングし、次いで重鎖をクローニングした。従って、得られたファージ・ライブラリーは、軽鎖および重鎖の両方がその中に挿入されたコンビナトリアル・ファージから構成された。
【０１４３】
（バイオパニング）
バイオパニングを以下のように実施して、抗血小板抗原特異的免疫グロブリンを発現したＦａｂファージを単離した。
【０１４４】
６０ｍｌの抗凝固処理血液を室温にて２００ｇで１０分間遠心分離することによって血小板を調製した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．６）中１０８個の血小板に相当する血小板懸濁物５０μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次の朝、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）で２回洗浄した後、このプレートを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中５％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）でブロッキングし、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳでさらに２回洗浄した後、１００μｌのファージ懸濁物を各ウェルに添加し、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ファージの単離について以下に記載する。
【０１４５】
次いで、このファージを１ウェル当たり５０μｌの溶出緩衝液で溶出し、室温で１０分間、ＴＢＳ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）と共にインキュベートした。激しくピペット撹拌した後、溶出したファージを取り出し、３μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓベースを用いて中和することによって洗浄した。第１回のパニングについては、プレートをこの方法によって１回洗浄した。第２回のパニングでは、５回の洗浄を実施し、第３回および
その後の回においては、１０回の洗浄を実施した。
【０１４６】
図２を参照すると、５回のバイオパニングを実施した結果が示されている。各回のパニングの後、溶出した抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージの数を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア・ブロス（ＬＢ）上での力価測定によって決定し、コロニー形成単位の数を計数し（ｃｆｕ／ｍｌ）、平均（±ＳＥ）として示した。
【０１４７】
図２から理解されるように、第１回のパニングの培養物は、わずか２つの抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ・クローンが１０９ｃｆｕ／ｍｌのファージ懸濁物から単離されたことを示したにすぎなかったが、第５回のパニング後には、約７０個のクローンが１０９ｃｆｕ／ｍｌのファージ懸濁物から単離されたので、抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージの富化がバイオパニングによって達成された。
【０１４８】
（血小板に対するファージの特異性の測定）
図２中に示した５回のパニング後に得られた抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージを合わせたものをＥＬＩＳＡによって分析して、このファージによって生成されたＦａｂ断片の抗血小板抗原特異性を測定した。６０ｍｌの抗凝固処理血液を室温にて２００ｇで１０分間遠心分離することによって血小板を調製した。
【０１４９】
マイクロタイター・プレートを、１０８個の血小板に相当する５０μｌの血小板濃縮物でコーティングし、次いで密封し、４℃で一晩インキュベートした。このプレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中５％のＢＳＡでブロッキングし、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を振り出した後、１０８ｐｆｕを含む１００μｌのファージを各ウェルに添加した。同じ濃度の１００μｌのＭ１３ファージを、陰性対照として添加した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で６回洗浄した後、１００μｌのウサギの抗ファージ抗体（７μｇ／ｍｌ、シグマカンパニー社（Sigma Co. ））を、ブランク以外全てのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液（ＴＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）で６回洗浄した。１００μｌの特異的抗ウサギ抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ中に１：１０，０００希釈）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、２００μｌの基質緩衝液（クエン酸塩緩衝液中１０μｇ／ｍｌのＯＰＤ）を添加し、このプレートを３０分間暗所に放置した。この反応を、２５μｌの３Ｍ ＨＣＬを添加することによって停止させ、最後に４９０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーによって読み取った。
【０１５０】
図３を参照すると、５回のバイオパニングによって抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ・ライブラリーから選択された６つの代表クローン（Ｓ１〜Ｓ６）の血小板膜結合活性が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびブランク・ウェル（Ｂ）を含めて示されている。このデータは、２回の実験からの平均吸光度±ＳＥを示し、各実験において３つのウェルを各測定に使用した。
【０１５１】
図３は、コロニーの大きさが異なる無作為に選択したＦａｂファージ・クローン６種のうち、４種のクローン（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）は完全な血小板の調製物と強力に反応したが、２種のクローン（Ｓ５、Ｓ６）は、血小板抗原と反応できなかったことを示す。陰性対照およびブランク対照では反応は見られなかった。
【０１５２】
（血小板溶解調製物に対する血小板反応性ファージの反応）
図３中に示されるような完全な血小板に対する陽性反応を示した４種のＦａｂ発現ファージ（Ｓ１〜Ｓ４）をＥＬＩＳＡによって分析し、血小板溶解物に対する抗血小板抗原特異性を検出した。使用した方法は、５０μｌの血小板溶解物（２００ｇ／ｍｌ）をマイクロタイター・プレートに添加してからＰＢＳで洗浄し１００μｌのファージを添加したこ
と以外は、上記の完全な血小板の調製物についての方法と全く同じであった。血小板溶解物は以下のように作製した。
【０１５３】
６０ｍｌの抗凝固処理血液を、室温にて２００ｇで１０分間遠心分離した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を取り出し、１２００ｇで１０分間再度遠心分離した（Ｍｉｓｔｒａｌ ３０００（商品名）、英国所在のファイソンズリミテッド社（Fisons Ltd））。沈降させた血小板を等張緩衝液で４回洗浄した後、６ｍｌの溶解緩衝液を添加し、４℃で１時間インキュベートし、その後、Ａｖａｎｔｉ（商標）Ｊ−２５遠心分離機（ベックマン社（Beckman ））で２０，０００ｇにて４℃で３０分間遠心分離した。５ｍｌの上清を、遠心濾過装置（カットオフ分子量１０，０００）を使用して４０００ｇで４０分間濃縮した。
【０１５４】
図４を参照すると、血小板溶解物に対するＦａｂ発現ファージの反応性が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびブランク・ウェル（Ｂ）を含めて示されている。結果は、図３中に示されるような完全な血小板の懸濁物中の血小板表面の膜抗原と強力に反応した４種全ての選択クローン（Ｓ１〜Ｓ４）が、陰性対照およびブランクと比較した場合、血小板溶解物とも強力に反応したことを示している。
【０１５５】
（血小板膜タンパク質へのファージの結合の感度）
１００μｌの血小板溶解物を使用して、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）マイクロタイター・プレートの各ウェルをコーティングした。反応性を有する抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ１０６個を含む懸濁物を、１×１０−１ｃｆｕ〜１×１０−６ｃｆｕの範囲にわたって希釈し、１００μｌの各希釈物を各ウェルに添加した。ファージの結合を、抗ファージ抗体複合物を用いて検出した。
【０１５６】
図５を参照すると、血小板溶解調製物に対するＦａｂ保有ファージの力価決定が示されている（平均±ＳＥ）。図５は、Ｆａｂファージの元の濃度（１×１０６ｃｆｕ）が最も高い吸光度を与えたことを示している。吸光度の低下は、Ｆａｂ保有ファージの濃度の低下と相関した。
【０１５７】
（精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージ粒子の反応）
抗血小板抗原特異的Ｆａｂファージ粒子が糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａと特異的に反応することを実証するために、該ファージ粒子を、ＥＬＩＳＡによって、精製タンパク質に対して試験した。従って、完全な血小板（図３を参照のこと）および血小板溶解物（図４を参照のこと）のいずれとも強力な反応を示したコロニーを分析して、精製糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する反応性を決定した。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡを、完全な血小板について図３に、血小板溶解物について図４に示したように、以前と同様に実施した。ＥＬＩＳＡマイクロプレートの各ウェルを、１００μｌの精製された糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを２μｇ／ｍｌの濃度で用いてコーティングした。この糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａは、スイス国所在のバーゼル大学のビート シュタイナー博士（Dr Beat Steiner ）からの贈与物であった。ＰＢＳでの洗浄後、次いで１００μｌのファージを各ウェルに添加し、抗ファージ抗体を使用して、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するそれらの特異性を検出した。
【０１５９】
図６を参照すると、精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージの反応性が示されている。これらの結果は、完全な血小板懸濁物および血小板溶解物中の血小板抗原と強力に反応した４つ全ての選択クローン（Ｓ１〜Ｓ４）が、Ｍ１３陰性対照（Ｎ）およびブランク（Ｂ）と比較した場合、精製された糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体とも強力に反応したことを示している。
【０１６０】
（抗血小板抗体Ｆａｂライブラリーを用いた血小板膜溶解物に対するウエスタン・ブロット分析）
以下のように、すでに記載したように単離したＦａｂ発現ファージ・クローン（Ｓ１〜Ｓ４）を用いてウエスタン・ブロット分析を実施した。
【０１６１】
血小板溶解物の試料を、３部の血小板溶解物（２００ｇ／ｍｌ）に対して１部の試料緩衝液で希釈し、２分間煮沸することによって調製した。８％分離ゲルを注いで固め、その後３％の濃縮ゲルを添加した。４０μｌの血小板溶解物試料および５μｌの分子量（ＭＷ）マーカーを、このゲル中の別個のウェルに添加した。このゲルを、１００Ｖの一定電圧で２時間泳動した。タンパク質を、ポリアクリルアミド・ゲルから０．４５μｍのニトロセルロース・メンブレンに転写し、１００Ｖで９０分間泳動した。分離された血小板タンパク質を含むニトロセルロース・メンブレン細片を、ＴＢＳ中５％のＢＳＡで室温にて２時間ブロッキング処理した。３ｍｌの溶出ファージ（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を、個々の試料細片上に配置した。３ｍｌの同じ濃度のＭ１３を陰性対照として使用し、３ｍｌの抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（２μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。全ての試料および対照物を、４℃で一晩インキュベートした。
【０１６２】
これらの細片を、ＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で２時間洗浄した。２０分毎に洗浄緩衝液を交換した。１：１０００に希釈した３ｍｌのウサギの抗ファージ抗体を（陽性対照以外）全ての試料に添加し、室温で１時間インキュベートした。
【０１６３】
前と同様に洗浄した後、１：１０，０００に希釈した抗ウサギ抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（３ｍｌ）を、全ての試料および陰性対照の細片に添加した。
陽性対照については、抗マウス抗体のセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合物（３ｍｌ）を同じ希釈率で添加した。室温で１時間のインキュベーション後、これらの細片を以前と同様に洗浄した。このブロットを３ｍｌのジアミノベンジジンで発色させた。
【０１６４】
図７を参照すると、４種の単離された抗血小板Ｆａｂ保有ファージ・クローン（Ｓ１〜Ｓ４）と結合させた、非還元状態のヒト血小板膜溶解物のウエスタン・ブロット分析が示されている。レーンＮはＭ１３ファージ陰性対照であり、レーンＰは、ＣＤ６１（すなわち、ＩＩａ／ＩＩＩｂ複合体のβインテグリン成分）に対する抗体を用いて染色した陽性対照である。分子量マーカーは、ＭＷレーン中を泳動させた。
【０１６５】
レーンＳ１〜Ｓ４は、４種の単離されたＦａｂファージ（Ｓ１〜Ｓ４）が、それぞれ１１ＫＤａおよび９２ＫＤａの分子量を有する血小板タンパク質のバンドと結合することを示している。
【０１６６】
（抗血小板抗体Ｆａｂライブラリーを用いた、精製されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するウエスタン・ブロット分析）
Ｆａｂ発現ファージ・ライブラリーの単離コロニーが血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと特異的に結合することを確認するために、４０μｌの精製された血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを８μｇ／ｍｌの濃度でポリアクリルアミド・ゲルに装填し、電気泳動し、ニトロセルロース紙上に転写した。１０６個のＦａｂライブラリー・ファージを各試料細片に添加した。次いで、ウサギの抗ファージ抗体のＨＲＰ複合物を添加し、このブロットを上記のように発色させた。
【０１６７】
図８を参照すると、４種の血小板反応性ファージ・クローンに対する、非還元状態のヒト血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ糖タンパク質のウエスタン・ブロット分析の結果が、Ｍ１３ファージ陰性対照（Ｎ）およびＣＤ６１陽性対照（Ｐ）の結果と共に示されている。分子マーカーも、ＭＷレーンに泳動した。
【０１６８】
レーンＳ１〜Ｓ４は、４つのＦａｂ抗血小板抗体全てが、９２ＫＤの分子量を有するＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと結合することを示している。
（ファージ・ディスプレイから可溶性ＦａｂへのＰｃｏｍｂ３の変換）
すでに示されたデータは、Ｆａｂ発現ファージが血小板抗原に結合することを実証するが、ファージによって発現されたＦａｂ分子がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩｂを特異的に認識して免疫反応することを正式に示すものではない。このことは、このＦａｂ分子が、発現されてファージの表面に配置されるファージのコートタンパク質とのキメラ・タンパク質として形成されることに起因する。
【０１６９】
これらのＦａｂファージ・クローンがＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａを特異的に認識して反応するか否かを決定するために、ファージのコートタンパク質を除去し、ファージに結合していない可溶性タンパク質としてＦａｂを発現させた。可溶性Ｆａｂ断片を、以下に記載するように、血小板抗原と強力に反応した４つのコロニーから調製した。
【０１７０】
重鎖および軽鎖の挿入断片を含むファージＤＮＡ５μｇ／ｍｌを、２μｇの制限酵素Ｓｐｅ１およびＮｈｅ１（１０Ｕ／μｌ）で３７℃にて３時間消化して、ＰＩＩＩコートタンパク質をコードするＤＮＡを除去した。次いで、この切断したＤＮＡを０．６％の低融点アガロース・ゲルに装填し、４℃で電気泳動した。重鎖および軽鎖をコードするがＰＩＩＩコートタンパク質をコードするＤＮＡを含まない、ファージの４．７Ｋｂｐのバンドをゲルから切り出し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎシステム（プロメガ社（Promega ））を使用して回収した。
【０１７１】
４．７Ｋｂｐの回収されたＤＮＡ２００ｎｇを、２０μｌの総体積のリガーゼ緩衝液中の２μｌのリガーゼ（２Ｕ／μｌ）を用いて、室温で２時間ライゲーションした。１μｌのライゲーション済みＤＮＡを、４０μｌの大腸菌コンピテント細胞に添加し、２．５ＫＶ、２５μＦＤおよび２００Ωのエレクトロポレーションでパルス注入することによって形質導入した。
【０１７２】
エレクトロポレーションした細胞を、２０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む１０ｍｌのスーパーブロスに移した。これらの細胞を直ぐに、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に接種した。２４時間後、単一コロニーを、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１０ｍｌのスーパーブロス中に接種し、３７℃で６時間インキュベートした。イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシドを１ｍＭの最終濃度まで添加することによってタンパク質の発現を誘導した。これらの細胞を１５００ｇで１５分間の遠心分離によって回収し、可溶性Ｆａｂを細胞溶解物から回収した。
【０１７３】
細胞溶解物上清中における血小板と可溶性Ｆａｂ断片との反応性を、ＥＬＩＳＡによって決定した。図９を参照すると、４種の反応性ファージ・コロニーのうち３種（Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４）についての結果が示されている。４番目のクローン（Ｓ２）は、可溶性ファージを発現しないようであった。３種全ての可溶性Ｆａｂ分子は、血小板膜タンパク質に対する有意な反応性を示している。
【０１７４】
（ＤＮＡ配列分析）
Ｓ４単離物のＦａｂ分子を、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名）を使用してプラスミドＤＮＡを調製することによって配列決定した。核酸配列決定は、抗体の重鎖についてのプライマー：
５’−ｇａａａｔａｃｃｔａｔｔｇｃｃｔａｃｇｇ−３’（配列番号８）；
および抗体の軽鎖についてのプライマー：
５’−ｇｃｇａｔｔｇｃａｇｔｇｇｃａｃｔｇｇ−３’（配列番号９）
を使用して、ケンブリッジバイオサイエンシズ社（Cambridge Bio-sciences）によって実施された。
【０１７５】
使用した可変領域遺伝子を、
htt p://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901
において入手可能なＶ−Ｂａｓｅプログラムを使用することによって特徴付けた。
【０１７６】
免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）のＤＮＡ配列を配列番号１０として示す。免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）のＤＮＡ配列を配列番号１２として示す。
重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、オンライン（www.expasy.org/tools/dna.html ）で翻訳した。免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列を配列番号１１として示す。免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１３として示す。
【０１７７】
この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列と、生殖系列（germline）の配列とのアラインメントを、ＤＮＡＰＬＯＴおよびＶＢＡＳＥを使用して実施した。
図１０を参照すると、発現された抗体の重鎖のアミノ酸配列をこの抗体が由来する生殖系列遺伝子と比較する配列アラインメントが示されている。重鎖の３つの相補性決定領域（ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３）は下線を付して示されている。Ｖ−ｂａｓｅプログラムは、可変領域遺伝子ＤＰ５８、Ｄ−７−２７およびＪＨ４ｂによって重鎖が生成されていることを示した。ドットは、生殖系列遺伝子と配列が同一であることを意味している。
【０１７８】
図１１を参照すると、発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列をこの抗体が由来する生殖系列遺伝子（ＤＰＫ１８／Ａ１７＋）と比較する配列アラインメントが示されている。軽鎖の３つの相補性決定領域（ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３）が示されている。Ｖ−ｂａｓｅプログラムは、軽鎖が可変領域遺伝子ＤＰＫ１８およびＪＫ２を使用していることを示した。
【０１７９】
これらの結果は、ファージによって発現されるＦａｂ領域をコードするＤＮＡとそれが由来する生殖系列遺伝子との間には約８０％の相同性が存在することを示している。さらに、これらの結果から、変異がＣＤＲ中に生じたので、抗原による駆動がこの抗体の発生において重要な役割を果たしたことを示される。
【０１８０】
軽鎖のアミノ酸残基３１位におけるチロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への変異により、主要なインテグリン・リガンドであるＲＧＤモチーフとの類似性を示すＲＳＤモチーフが生じる。ＲＳＤは、インテグリン・リガンドとしてはこれまで報告がなかった。
【０１８１】
多数のインテグリンについてのペプチド・リガンド部位は、プロウら（Plow et al. ）の文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５（２９）巻、ｐ．２１７８５〜２１７８８）に記載されている。従って、抗体の配列内の推定リガンド・ミミトープ（mimitope、リガンドを模倣しているを思われる部位）を探索することが可能である。
【０１８２】
図１２を参照すると、軽鎖のＶＬ−ＣＤＲ１中に見出された２つの潜在的なミミトープが示されている。１つは、多数のインテグリンに結合するとして報告されたＲＧＤモチーフの模倣部と推定されるもの（すなわち、ＲＳＤ）である。テネイシン結合モチーフＡＥＩＤＧＩＥＬとのある程度の同一性もまた存在しており、変異によってこのモチーフを抗体の構造中に導入することは簡単である。さらに、ＧＰＲ配列の逆配列も存在するが、これは免疫グロブリンの枠組構造領域内にあり、アクセスできない可能性がある。阻害モチーフはＲＧＤのホモログを含んでいる必要はなく、多くの研究から、活性化すべきＲＧＤ
を含むペプチドが示されている（スミスら（Smith et al.））。従って、このモチーフの存在は機能を予言するものではなく、この配列中に見出されないはずの、スミスら（Smith et al.）によって報告された該領域の側面が存在する。
【０１８３】
（血小板抗原に対するＦａｂ発現ファージの結合の、フロー・サイトメトリーによる測定）
以下のように、洗浄した完全な血小板を、４種のファージ・コロニー（Ｓ１〜Ｓ４）と反応させ、結合を蛍光性の抗ファージ複合体によって測定した。
【０１８４】
１０７個の洗浄血小板を含む１００μｌを、１０７個のＦａｂファージ１００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。陰性対照として、同じ濃度の血小板１００μｌを同じ濃度のＭ１３と共にインキュベートした。これらのチューブを洗浄緩衝液で洗浄し、１２００ｇで５分間遠心分離した。
【０１８５】
結合したファージを、２００μｌのウサギの抗ファージ抗体を用いて、３５μｇ／ｍｌを１：２００希釈した濃度で３７℃にて３０分間検出した。洗浄緩衝液で２回洗浄した後、元の濃度２０μｇ／ｍｌを１：２０００希釈した、２００μｌの抗ウサギ抗体ＦＩＴＣ複合物をこれらの試料および陰性対照のチューブに添加した。５μｌの抗ＧＰＩＩｂ抗体ＦＩＴＣ複合物を陽性対照のチューブに添加し、暗所で室温にて３０分間インキュベートした。
【０１８６】
これらの試料および対照を、以下の閾値でフロー・サイトメーターによって分析した：前方散乱光（ＦＳＣ）：Ｅ０１、側方散乱光（ＳＳＣ）：５７５および蛍光（ＦＬ１）：４００（ベクトンディッキンソン社（Becton Dickinson））。
【０１８７】
図１３を参照すると、Ｆａｂファージ・ライブラリー由来の４種の代表クローン（Ｓ１〜Ｓ４）の血小板抗原結合活性に関するフロー・サイトメトリー分析の結果が示されている。データは、４回の実験の蛍光の割合の平均（％）±ＳＥを示す。陽性対照（抗ＧＰＩＩｂ）を使用して、血小板の蛍光を決定するために使用したゲートを検出した。さらに、図１３は、陽性対照（Ｃｏｎ）、陰性対照（Ｍ１３ファージ）およびブランク対照（Ｎｅｇ）を示す。図１３中に示されるように、４種全てのクローンが、血小板集団の４０％〜６０％に結合する。
【０１８８】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタン・ブロット分析によってすでに示唆されたように、単離されたファージが血小板に結合するということをさらに支持するものである。
【０１８９】
（単離された抗血小板Ｆａｂ抗体の存在下における、血小板に対するフィブリノゲンの結合のフロー・サイトメトリー分析）
以下に記載されるように、多血小板血漿（ＰＲＰ）を４種の単離されたファージ・クローンと共にインキュベートして、これらの抗体が休止期の血小板および異なる濃度のＡＤＰによって活性化された血小板へのフィブリノゲンの結合を遮断するか否かを測定した。
【０１９０】
５μｌの正常な多血小板血漿（ＰＲＰ）を、１０μｌの単離されたＦａｂファージミド（１．５×１０８ｃｆｕ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌの同じ濃度のＭ−１３ファージおよび１０μｌのＴＢＳ緩衝液および１０μｌのＴｙｒｏｄｅ緩衝液を対照として適切なチューブに添加し、さらに２０μｌのＴｙｒｏｄｅ緩衝液を全てのチューブに添加した。
【０１９１】
２μｌの抗フィブリノゲン抗体フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を各
試料および各対照に添加し、次いで、５μｌの異なる濃度（０．１ｍｏｌ／ｍｌ、１ｍｏｌ／ｍｌ、１０ｍｏｌ／ｍｌ）のＡＤＰを適切なチューブに添加した。５μｌの抗ＩＩｂ・ＦＩＴＣ複合物を、陽性血小板のゲートの決定のためにＰＲＰに添加した。全ての試料の体積を、Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を添加することによって５０μｌに調整した。全ての試料を暗所に３０分間放置した。
【０１９２】
これらの試料を、４５０μｌの１％パラホルムアルデヒドで固定し、以下の閾値設定にてＦＡＣＳｃａｎ（商標）で試験した：前方散乱光（ＦＳＣ）：Ｅ０１、側方散乱光（ＳＳＣ）：５７５および蛍光（ＦＬ１）：４００（ベクトンディッキンソン社）。
【０１９３】
図１４を参照すると、４つのファージ調製物（Ｓ１〜Ｓ４）のいずれか１つ、陰性対照としてＭ１３ファージ調製物、および緩衝液（Ｂｕｆ）と共にインキュベートし、各々異なる濃度のＡＤＰ（０．１、１、１０μｍｏｌ／ｍｌ）に曝露させた血小板に対するフィブリノゲンの結合を反映する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合（％）の概要が示されている。
【０１９４】
対照はＡＤＰの濃度が増大するにつれて血小板へのフィブリノゲンの結合が増大することを示す一方、クローンＳ１〜Ｓ４と共にインキュベートした血小板においては増大は見られないことがわかる。これらの結果は、Ｆａｂを保有するファージが血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａとの反応性を有し、ＡＤＰによって活性化された血小板に対するフィブリノゲンの結合を阻害し得ることを示す。血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノゲンの結合は、血小板の凝集、従って、血餅の形成の開始における最初の重要な事象である。従って血小板ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するフィブリノゲンの結合は、血餅を予防するために設計される治療のための主な標的である。
【０１９５】
本願と関連して本明細書と同時またはその前に出願された全ての論文および文書、ならびに本明細書と共に公の閲覧に対して開かれた全ての論文および文書に対して注意が向けられるものであり、全てのこのような論文および文書の内容は、本明細書中に援用される。
【０１９６】
本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示された全ての特徴、および／または同様に開示された任意の方法の工程の全ては、このような特徴および／または工程のうち少なくともいくつかが互いに排除するような組合せ以外は、任意の組合せで組み合わせることが可能である。
【０１９７】
本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示される各特徴は、別途明記しない限り、同じ目的、等価な目的または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置換してもよい。従って、別途明記しない限り、開示された各特徴は、等価な特徴または類似の特徴の一般的なものの１例に過ぎない。
【０１９８】
本発明は、上記の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）中に開示される特徴のうち、任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せ、または同様に開示された任意の方法の工程の任意の新規な１つもしくは任意の新規な組合せに及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】ｐＣｏｍＢ３ＨＳＳファージ・ディスプレイ・ベクターの模式図。
【図２】５回の連続バイオパニングの間にファージが富化される様子を示す図。
【図３】完全な血小板に対するファージの反応性を示す図。
【図４】血小板溶解調製物に対する反応性ファージの反応性を示す図。
【図５】血小板溶解調製物に対するＦａｂ保有ファージの力価決定を示す図。
【図６】血小板糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するファージの反応性を示す図。
【図７】４種の抗血小板Ｆａｂクローンに対して反応する非還元状態のヒト血小板膜溶解物のウエスタン・ブロット分析を、陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）とともに示す図。
【図８】４種の抗血小板Ｆａｂクローンに対する非還元状態のヒト血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａのウエスタン・ブロット分析を、陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）と共に示す図。
【図９】洗浄された無傷の血小板に対する単離された可溶性の抗血小板Ｆａｂ抗体の反応性を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを示す図。
【図１０】発現された抗体の重鎖のアミノ酸配列と、生殖系列（germline）遺伝子のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１１】発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列と、生殖系列遺伝子のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１２】発現された抗体の軽鎖のアミノ酸配列と、推定リガンド・ミミトープのアミノ酸配列とのアラインメントを示す図。
【図１３】Ｆａｂライブラリーから単離された４種のクローンの血小板結合活性についてのフロー・サイトメトリー分析を示す図。
【図１４】休止期の血小板および活性化された血小板に対するフィブリノゲンの結合を阻害する、血小板反応性Ｆａｂ保有ファージの能力を決定するための、フロー・サイトメトリー分析を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１２の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１３に示されるとおりのアミノ酸配列を有し、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１１に示されるとおりのアミノ酸配列を有する、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項４】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１２に示されるとおりのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされ、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１０に示されるとおりのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド。
【請求項６】
インテグリンに結合するように適合している、請求項５に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１０の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードする、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
医薬としての使用または診断における使用のための、各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記医薬が血液凝固障害を抑制または予防するように適合している、請求項９に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項１１】
血液凝固障害を治療するための医薬の調製のための、任意選択で誘導体化済みの、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
前記医薬が、血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを抑制または予防するように適合している、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の使用。
【請求項１３】
血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかを治療する方法であって、各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれかに記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたは機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
血液凝固障害を有する個体を治療または診断するためのキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチド、またはポリヌクレオチドに特異的な抗原の有無を検出するように適した検出手段をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかに対する個体の感受性を決定するための方法であって、
（ｉ）個体から試料を得る工程、および
（ｉｉ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用して、該試料中の抗原のレベルを検出する工程
を含む方法。
【請求項１８】
特定されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の各々を含んでなる、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項１９】
１価であることを特徴とする、請求項１〜４または請求項１８のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２０】
１価の免疫グロブリンまたはその機能的断片として直接作製されることを特徴とする、請求項１〜４、１８または１９のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２１】
抗原がインテグリンを含んでなることを特徴とする、請求項１、２および１８〜２０のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２２】
前記抗原が、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２１のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２３】
前記抗原がβ３インテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２４】
前記抗原が、αＶβ３、αＩＩｂβ３およびαＩｂβ３からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２３のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２５】
前記抗原がＧＰＩＩβ／ＩＩＩαを含んでなる、請求項１、２および１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２６】
アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している、請求項１〜４および１８〜２５のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２７】
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合を実質的に阻害するように適合している、請求項１〜４および１８〜２６のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２８】
体細胞変異によって誘導されることを特徴とする、請求項１〜４および１８〜２７のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２９】
親和性成熟によって誘導されることを特徴とする、請求項１〜４および１８〜２８のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３０】
配列番号１３の残基３１〜３３によって規定される抗原結合領域がアミノ酸配列「ＲＳＤ」からなる、請求項１、３および１８〜２９のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３１】
配列番号１３の残基３０〜３８によって規定される前記結合領域が「ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ」のアミノ酸配列からなる、請求項１、３および１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３２】
免疫グロブリンの機能的断片が、該ヒト免疫グロブリンと実質的に同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する断片を含む、請求項１〜４および１８〜３１のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３３】
機能的断片がインテグリン特異的である、請求項１〜４および１８〜３２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３４】
請求項１〜４および１８〜３３のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、機能的断片は、結合領域配列のうち少なくとも１つが前記免疫グロブリンの結合領域配列と実質的に同じアミノ酸配列である断片を含む、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３５】
機能的断片が、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片からなる群から独立に選択される断片のうちいずれかを含む、請求項１〜４および１８〜３４のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３６】
請求項７もしくは請求項８に記載のポリヌクレオチドまたはその誘導体を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組換えＤＮＡ分子を含む細胞。
【請求項３８】
組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を調製する方法であって、
（ｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を発現し得る、請求項３７に記載の細胞を少なくとも１つ培養する工程、および
（ｉｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む方法。
【請求項３９】
標的インテグリンに結合する能力を有する組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法であって、
（ｉ）請求項１〜４および１８〜３５のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を突然変異させて変異体を生成する工程、および
（ｉｉ）標的インテグリンに対する活性について変異体を選択する工程
を含む方法。
【請求項４０】
前記突然変異させる工程がランダム変異誘発を含む、請求項３９に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４１】
前記突然変異させる工程が、前記組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の少なく
とも１つの抗原結合領域中に、標的インテグリンに対する免疫特異性を有する少なくとも１つのリガンドを導入する工程を含む、請求項３９または請求項４０に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのリガンドが、ＲＤＧ、ＲＳＧ、ＲＳＤ、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＧＰＲ、ＲＰＧ、ＡＥＩＤＧＩＥＬ、ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ、ＱＩＤＳ、ＬＤＴ、ＩＤＡＰＳ、ＤＬＸＸＬおよびＧＦＯＧＥＲからなる一群のリガンドから独立に選択される、請求項４１に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記免疫グロブリンまたはその機能的断片の重鎖の抗原結合領域のうちいずれかの中に導入される、請求項４１または請求項４２に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記免疫グロブリンまたはその機能的断片の第１の結合領域中に導入される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４５】
請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法を使用して作製される、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片のライブラリーまたはパネル。
【請求項４６】
抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの完全な血小板に対して少なくとも１種の免疫グロブリンまたはその機能的断片を接触させる工程、および
（ｉｉ）該完全な血小板に対する結合特異性を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む方法。
【請求項４７】
抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片が、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合を実質的に阻害するように適合している、請求項４６に記載の抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項１】
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１２の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる抗原結合領域を少なくとも１つ含んでなる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１３に示されるとおりのアミノ酸配列を有し、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１１に示されるとおりのアミノ酸配列を有する、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項４】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のうち少なくともいずれかを含んでなる組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、該軽鎖可変領域は実質的に配列番号１２に示されるとおりのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされ、該重鎖可変領域は実質的に配列番号１０に示されるとおりのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１１の残基３１〜３５；
（ｉｉ）配列番号１１の残基５０〜６６；
（ｉｉｉ）配列番号１１の残基１００〜１１０；
（ｉｖ）配列番号１３の残基３１〜３３；
（ｖ）配列番号１３の残基３０〜３８；
（ｖｉ）配列番号１３の残基２４〜４０；
（ｖｉｉ）配列番号１３の残基５６〜６１；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１３の残基９５〜１０２
からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチド。
【請求項６】
インテグリンに結合するように適合している、請求項５に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
（ｉ）配列番号１０の残基９１〜１０５；
（ｉｉ）配列番号１０の残基１４８〜１９８；
（ｉｉｉ）配列番号１０の残基２９８〜３３０；
（ｉｖ）配列番号１２の残基９１〜９９；
（ｖ）配列番号１０の残基８８〜１１４；
（ｖｉ）配列番号１２の残基７０〜１２０；
（ｖｉｉ）配列番号１２の残基１６６〜１８３；および
（ｖｉｉｉ）配列番号１２の残基２８３〜３０６
からなる群から独立に選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片をコードする、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
医薬としての使用または診断における使用のための、各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記医薬が血液凝固障害を抑制または予防するように適合している、請求項９に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項１１】
血液凝固障害を治療するための医薬の調製のための、任意選択で誘導体化済みの、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
前記医薬が、血栓塞栓性の障害および炎症のうち少なくともいずれかを抑制または予防するように適合している、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の使用。
【請求項１３】
血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかを治療する方法であって、各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれかに記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
各々任意選択で誘導体化された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたは機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤または安定剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
血液凝固障害を有する個体を治療または診断するためのキットであって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンもしくはその機能的断片、ペプチド、またはポリヌクレオチドに特異的な抗原の有無を検出するように適した検出手段をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
血液凝固障害および炎症のうち少なくともいずれかに対する個体の感受性を決定するための方法であって、
（ｉ）個体から試料を得る工程、および
（ｉｉ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその断片、請求項５または請求項６のいずれか１項に記載のペプチド、あるいは請求項７または請求項８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを使用して、該試料中の抗原のレベルを検出する工程
を含む方法。
【請求項１８】
特定されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の各々を含んでなる、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項１９】
１価であることを特徴とする、請求項１〜４または請求項１８のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２０】
１価の免疫グロブリンまたはその機能的断片として直接作製されることを特徴とする、請求項１〜４、１８または１９のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２１】
抗原がインテグリンを含んでなることを特徴とする、請求項１、２および１８〜２０のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２２】
前記抗原が、αＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、αＭβ２、α１β１、α２β１、αＩｂβ３、α５β１、α８β１、α９β１、αＶβ６、αＥβ７、α３β１、α４β１、α４β７、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ８、αＸβ２、αＬβ２、α６β１、α７β１およびα６β４からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２１のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２３】
前記抗原がβ３インテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２４】
前記抗原が、αＶβ３、αＩＩｂβ３およびαＩｂβ３からなる群から独立に選択されるインテグリンを含んでなる、請求項１、２および１８〜２３のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２５】
前記抗原がＧＰＩＩβ／ＩＩＩαを含んでなる、請求項１、２および１８〜２４のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２６】
アゴニストに応答したヒト血小板の凝集を実質的に阻害するように適合している、請求項１〜４および１８〜２５のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２７】
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合を実質的に阻害するように適合している、請求項１〜４および１８〜２６のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２８】
体細胞変異によって誘導されることを特徴とする、請求項１〜４および１８〜２７のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項２９】
親和性成熟によって誘導されることを特徴とする、請求項１〜４および１８〜２８のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３０】
配列番号１３の残基３１〜３３によって規定される抗原結合領域がアミノ酸配列「ＲＳＤ」からなる、請求項１、３および１８〜２９のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３１】
配列番号１３の残基３０〜３８によって規定される前記結合領域が「ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ」のアミノ酸配列からなる、請求項１、３および１８〜３０のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３２】
免疫グロブリンの機能的断片が、該ヒト免疫グロブリンと実質的に同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する断片を含む、請求項１〜４および１８〜３１のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３３】
機能的断片がインテグリン特異的である、請求項１〜４および１８〜３２のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３４】
請求項１〜４および１８〜３３のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片であって、機能的断片は、結合領域配列のうち少なくとも１つが前記免疫グロブリンの結合領域配列と実質的に同じアミノ酸配列である断片を含む、組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３５】
機能的断片が、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｃ断片からなる群から独立に選択される断片のうちいずれかを含む、請求項１〜４および１８〜３４のいずれか１項に記載の組換えヒト免疫グロブリンまたはその機能的断片。
【請求項３６】
請求項７もしくは請求項８に記載のポリヌクレオチドまたはその誘導体を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の組換えＤＮＡ分子を含む細胞。
【請求項３８】
組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を調製する方法であって、
（ｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を発現し得る、請求項３７に記載の細胞を少なくとも１つ培養する工程、および
（ｉｉ）免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む方法。
【請求項３９】
標的インテグリンに結合する能力を有する組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法であって、
（ｉ）請求項１〜４および１８〜３５のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を突然変異させて変異体を生成する工程、および
（ｉｉ）標的インテグリンに対する活性について変異体を選択する工程
を含む方法。
【請求項４０】
前記突然変異させる工程がランダム変異誘発を含む、請求項３９に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４１】
前記突然変異させる工程が、前記組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片の少なく
とも１つの抗原結合領域中に、標的インテグリンに対する免疫特異性を有する少なくとも１つのリガンドを導入する工程を含む、請求項３９または請求項４０に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのリガンドが、ＲＤＧ、ＲＳＧ、ＲＳＤ、ＨＨＬＧＧＡＫＱＡＧＤＶ、ＧＰＲ、ＲＰＧ、ＡＥＩＤＧＩＥＬ、ＡＲＳＤＧＶＳＬＭ、ＱＩＤＳ、ＬＤＴ、ＩＤＡＰＳ、ＤＬＸＸＬおよびＧＦＯＧＥＲからなる一群のリガンドから独立に選択される、請求項４１に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記免疫グロブリンまたはその機能的断片の重鎖の抗原結合領域のうちいずれかの中に導入される、請求項４１または請求項４２に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記免疫グロブリンまたはその機能的断片の第１の結合領域中に導入される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【請求項４５】
請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法を使用して作製される、組換え免疫グロブリンまたはその機能的断片のライブラリーまたはパネル。
【請求項４６】
抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの完全な血小板に対して少なくとも１種の免疫グロブリンまたはその機能的断片を接触させる工程、および
（ｉｉ）該完全な血小板に対する結合特異性を有する免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する工程
を含む方法。
【請求項４７】
抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片が、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａまたはそのエピトープに対するフィブリノゲンの結合を実質的に阻害するように適合している、請求項４６に記載の抗血小板免疫グロブリンまたはその機能的断片を単離する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５２７２０１（Ｐ２００７−５２７２０１Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２２３６（Ｐ２００６−５０２２３６）
【出願日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００４４４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９８７５
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（３９９０１６８３５）ユニバーシティ・オブ・ブラッドフォード (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＢＲＡＤＦＯＲＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月５日（２００４．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００４４４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９８７５
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ウィンドウズ
【出願人】（３９９０１６８３５）ユニバーシティ・オブ・ブラッドフォード (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＢＲＡＤＦＯＲＤ
【Ｆターム（参考）】
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