抗インフルエンザウイルス剤
【課題】安全性の高い天然物由来の成分を用いて、有効な抗インフルエンザウイルス剤を提供すること。および、コンブの仮根部、特に養殖コンブ仮根部のさらなる利用法を提供すること。
【解決手段】コンブ仮根部由来、特に養殖コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分とする、抗インフルエンザウイルス剤。フコイダンは、コンブ仮根部からの抽出により得ることができる。
【解決手段】コンブ仮根部由来、特に養殖コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分とする、抗インフルエンザウイルス剤。フコイダンは、コンブ仮根部からの抽出により得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して感染抑制効果を有する抗インフルエンザウイルス剤に関し、詳しくは、従来は利用されずに廃棄されていたコンブ仮根部、特に養殖コンブ仮根部を用い、これから抽出した有効成分を抗インフルエンザウイルス剤として利用するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされるウイルス性呼吸器感染症である。このウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらし、突然の発熱、頭痛、関節痛などの症状を伴う。下気道にまで感染が広がると重篤な肺炎を引き起こすことがあり、また、高齢者や妊婦、基礎疾患を有する患者などのハイリスク患者においては死亡に至る場合がある。
【０００３】
インフルエンザウイルスはオルソミクソ科に属する、エンペロープをもつＲＮＡウイルスであり、その抗原性の違いからＡ、ＢおよびＣ型に分類されるが、主にＡ型およびＢ型、特にＡ型において新しい血清型が出現し、抗原性が異なるウイルスにより毎年のように流行を繰り返す。インフルエンザウイルスの流行を抑えるにはワクチン接種が有効な手段であるが、このようにウイルスの抗原性の変化が頻繁であるため、ワクチンだけで予防するのは難しい。
【０００４】
インフルエンザは、飛沫により放出されたウイルスがヒトの上気道の粘膜上皮細胞に感染し増殖することにより生じるため、感染の抑制には、細胞への吸着、膜融合、ウイルスゲノム RNAの転写・複製、ウイルス粒子の出芽などの増殖過程を標的として抗ウイルス薬が開発されている。現在、インフルエンザに罹患した患者に対しては、ウイルスの出芽時のノイラミニダーゼの機能を阻害する、オセルタミビル（タミフル）やザナミビル（リレンザ）などの抗ウイルス剤が治療に用いられているが、これらの抗ウイルス薬には副作用や耐性ウイルス株の出現の問題がある。
【０００５】
また、安全性の点から天然物由来の物質を用いた各種抗インフルエンザウイルス薬が報告されている。例えば、センダンの抽出物を含有するインフルエンザ予防・治療剤（特許文献１）、各種植物の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤（特許文献２）などがある。
【０００６】
一方、本発明者らは、先に、養殖昆布において、それまで費用をかけて廃棄していた仮根部の利用法を検討し、食品素材として利用できることを見出した（特許文献３）。即ち、養殖コンブの仮根部は、古くから食品として利用されてきたコンブ葉状体とは異なり、カリウムと食物繊維を多量に含んでいることを見出し、減塩や食物繊維補給のために有用な食品素材を提供したものである。また、養殖コンブの仮根部が有効な抗腫瘍成分を含有していることも見出している（特許文献４）。しかし、コンブ仮根部から抽出したフコイダンのアディポネクチン産生促進作用についてはこれまで全く知られていない。
【０００７】
コンブは褐藻類コンブ科コンブ属の海藻の葉状体を乾燥したものであり、通常、葉状体の先端部と下端部および仮根部は除いて製品化される。また、根昆布と称して販売されているものは、コンブの仮根ではなく、コンブ仮根部に近い葉状体の下端部である。天然のコンブでは、仮根部は岩盤に強く付着しており、採取の際に岩石、土砂との分離が難しい。養殖昆布では、受精した幼胞子体を付着させたロープを、太いロープに結び付けて海中に入れて栽培するため採取が容易である。上記の本発明者等による発明前は、養殖昆布の仮根部の海への投棄は汚染の問題を生じるため、陸揚げして埋め立てなどの手段で廃棄処分していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２５４３１９号公報
【特許文献２】特開２００４−５９４６３号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９６３号公報
【特許文献４】特開２００３−８１８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全性の高い天然物由来の成分を用いて、有効な抗インフルエンザウイルス剤を提供することである。また、コンブの仮根部、特に養殖コンブ仮根部のさらなる利用法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、養殖コンブ仮根の利用を検討する過程で、養殖コンブ仮根由来の成分の中でフコイダンに着目し、これを投与したマウスにおいて抗インフルエンザウイルス効果を確認し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の通りである。
１．コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分とする、抗インフルエンザウイルス剤。
２．フコイダンが、コンブ仮根部からの抽出により得られたものである、上記１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
３．コンブが養殖コンブである、上記１または２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、抗インフルエンザウイルス作用に優れていると共に、安全性の確認された食品素材由来の成分を利用するので、安全性の面でも優れている。また、本発明はコンブ仮根、特に養殖コンブ仮根の別の利用方法を見出した点でも有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンブの各部位の名称とその位置を示す図である。
【図２】マウスでのインフルエンザウイルス感染の予備実験の結果を示す。
【図３】インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重変化を示す図である。
【図４】コンブ仮根部由来フコイダン投与群および対象群におけるマウス生存曲線を示す。
【図５】肺中のウイルス力価を示す図である。
【図６】コンブ仮根部由来フコイダン投与群および対象群におけるサイトカイン産生量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で使用するフコイダンは、コンブ仮根部、特に好ましくは養殖コンブ仮根部由来のフコイダンである。フコイダンは海藻などに含まれる、フコースを主成分とした硫酸化多糖類の総称であり、原料の違いにより成分や構造に違いがみられる。コンブ仮根部から得られるフコイダンは、Ｌ−フコイダンおよびＧａ−フコイダンからなる。Ｌ−フコイダンは葉状体にも含まれているフコイダンであり、フコースおよびガラクトースを構成糖として含む。Ｇａ−フコイダンは仮根部特有のフコイダンであり、糖としてはフコースを主体とし、その他にマンノース、ガラクトース、キシロース、グルコースで構成されている。コンブ仮根部由来フコイダンにはＬ−フコイダンとＧａ−フコイダンが１：１〜２：１の割合で含まれる。
【００１５】
本発明で使用するコンブ仮根部由来のフコイダンは、メカブ、オキナワモズクなどの他の海藻由来のフコイダン、また葉状体由来のフコイダンとは、構成糖の点で異なる。特にＧａフコイダンは、他の海藻や葉状体には存在せず、コンブ仮根部のみに存在するという特徴を有する。
【００１６】
メカブから得られるフコイダンについては、Ｆｒ−ＩおよびＦｒ−ＩＩの２種類が分離されており、微量成分を除く構成糖は、Ｆｒ−Ｉではフコース、ガラクトース、アラビノース、キシロースであり、Ｆｒ−ＩＩではフコースおよびガラクトースである。オキナワモズクから得られるフコイダンは、フコースおよびグルクロン酸から構成されている。ガゴメコンブ（葉状体）から得られるフコイダンは、フコースから構成されるＦ−フコイダン、フコース、マンノースおよびグルクロン酸から構成されるＵ−フコイダン、ガラクトースとフコースから構成されるＧフコイダンを含む。
【００１７】
本発明においてフコイダンを得るために用いるコンブ仮根とは、図１に示したコンブの部位のうち、仮根 (holdfast) を主とし、葉柄 (stipe)を含んでいてもよい部分を指し、以前は食用として利用されず廃棄されていた部分である。通常のコンブ製品は葉状体 (frond)の先端部と下端部を除いた部分から製造され、葉状体の下端部は根昆布と称されて利用されている。本発明で仮根を使用するコンブの種類には、マコンブ、ミツイシコンブ、リシリコンブなどがあり、特に限定されないが、採取が容易であることなどから養殖コンブであるのが好ましい。
【００１８】
本発明で用いるコンブ仮根部由来のフコイダンとしては、コンブ仮根部より抽出した粗フコイダンでも、それを精製したフコイダンでもよい。
コンブ仮根からフコイダンを得る方法は、既知のフコイダン調製方法が使用でき特に限定されないが、例えば、コンブ仮根やその粉末に、熱水抽出、無機酸による抽出、有機酸による抽出などの抽出操作、あるいは、塩化カルシウム等の２価の陽イオンを含む水溶液による抽出操作、およびこれらを組み合わせた方法を適用する。また、抽出液から粗フコイダンを得るために、エタノール等の低級アルコールによる凝集、あるいは限外ろ過器を用いることによる、ナトリウム等の無機塩類の除去を行う。
【００１９】
さらに、クロマトグラフィーなどの精製手段により粗フコイダンを精製してもよい。また、得られるフコイダンをイオン交換やゲルろ過クロマトグラフなどの方法でＧａ−フコイダンやＬ−フコイダンに分離してもよい。
【００２０】
好ましくは、コンブ仮根を乾燥後、粉砕機で粉砕する等の通常の粉末化手段を用いて粉末化し、得られるコンブ仮根粉末より塩酸などの無機酸によりフコイダンを抽出する。フコイダン抽出および精製方法の好適な一態様は以下の通りである。
（水溶性成分の抽出）
養殖コンブ仮根を乾燥して粉砕して得られる粉末に、塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水を10〜13倍量加え、70〜80℃で２〜３時間程度抽出を行う。抽出操作を２〜３回繰り返し、上澄を採取し遠心分離を行う。得られた上清をろ紙等で濾過し清澄液を得る。その後の操作を容易にするために、清澄液をエバポレーターを用い減圧濃縮する。濃縮の際は、沈澱が析出すると沈澱に粗フコイダンが含まれてしまうため、なるべく沈澱が析出しないようにするのが望ましい。濃縮後の溶液を遠心分離し、沈澱を除去する。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄液にエタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥し、これを約７〜10倍量の塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水に溶解し、６〜12時間程度静置する。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、エタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥させる。この操作を１〜２回程度繰り返して粗フコイダンを得る。
【００２１】
また、別法として、上記で得られた清澄液を分角分子量10,000の限外ろ過器を用いて、清澄液に存在するナトリウム等を排除して、粗フコイダンを得る方法が挙げられる。
（フコイダンの精製）
乾燥させた沈澱（粗フコイダン）を、クロマトグラフィーなどの方法により精製する。好ましくは、陰イオン樹脂を用いた液体クロマトグラフにより、コンブ仮根部由来の精製フコイダンを得ることができる。
【００２２】
上述のようにして得られるフコイダンは、後出の試験例において実証するように、インフルエンザウイルスを接種したマウスに対して生存率を向上させることができた。具体的には、コンブ仮根部由来のフコイダンを、ウイルス接種前から経口投与してマウスの生存率を調べた結果、対象群と比較して有意差が見られた。従って、本発明のコンブ仮根部由来フコイダンを投与することにより、インフルエンザウイルス感染に対して予防効果や重症化を防ぐ効果が期待できる。
【００２３】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分としてコンブ仮根部由来フコイダンを含み、必要に応じ、製剤化の際に慣用される物質、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、矯味剤、着香剤などの補助剤を添加して、錠剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤などの適宜形態に製剤化すればよい。投与方法としては、経口投与が好ましく、投与量は、フコイダン量として成人で体重１kg当たり10〜100mg ／日程度が好ましい。
【００２４】
また、本発明の抗インフルエンザ剤の有効成分は天然物由来であり、安全性が高いので、食品に添加して用いても、または栄養補助食品や健康食品などの経口組成物として利用することもできる。
【００２５】
経口組成物とする場合、上述のようにして得たフコイダンに、必要に応じて食品分野で慣用の賦形剤、甘味料、香料、着色剤などの添加剤を配合することにより製造できる。この組成物は、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ゼリーなどの各種形態に常法により製剤化して、例えば栄養補助食品や健康食品などとして経口摂取することができる。また、本発明経口組成物は、フコイダンを、通常の飲食品に配合したものであってもよい。
【００２６】
以下に本発明をさらに詳しく説明するため実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。以下では、コンブ仮根部として養殖コンブ仮根部を用いた場合について具体的に説明する。
【実施例】
【００２７】
（参考例１）
(養殖コンブ仮根からのフコイダンの抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。養殖コンブ仮根粉末500gに、水5000mLを加え、塩酸でpH３に調整して、75℃で３時間抽出した。この操作を３回繰り返した後、固形分を取り除き、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。得られた上清をろ過し、清澄液を得た。後の操作を容易にするために、清澄液をなるべく沈澱が析出しないように、約10分の１の液量となるまで減圧濃縮した。濃縮後の液を遠心分離し沈澱を除いた。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液にエタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後、沈澱を乾燥し、これを約７倍量の水に溶解し、塩酸でpHを２に調整して約１時間静置した。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、再度エタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後沈澱を乾燥した。この操作を２回程度繰り返して粗フコイダン16.3ｇを得た。
（参考例２）
養殖コンブ仮根由来フコイダンの分析
(1) Ga- フコイダン、L-フコイダンの分離
上記のようにして得た粗フコイダン4.5 ｇを水500mL に溶解し、DEAE-TOYOPEARL 650M を500mL 充填したカラムにマウントした。500mL の水で洗浄した後、0.5M NaCl 500mL (Ga-フコイダンが抽出される) 、さらに1.0M NaCl 500mL (L- フコイダンが抽出される) でフコイダンを溶離した。上記溶離液を流すとき、カラム出口から溶出する液をフラクションコレクターで20mLずつ分取し、各フラクションの一部をサンプリングし、HPLCで分析した。HPLC分析条件は次の通りである。カラム：Asahipak GS-520H、検出器：示差屈折、溶離液：0.3M NaNO3、流速：1.0mL ／分、カラム温度：60℃。各フコイダンのピークのあるフラクションを回収し、エバポレーターで濃縮後、分画分子量1000の透析膜で透析を25時間行った後、さらに濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥した。
(2) フコイダン中の構成糖
各フコイダン30mgに１mol/L 硫酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (110 ℃、2.5 時間) した。炭酸バリウムで中和後 (pH試験紙で中和を確認) 、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。上澄みを濾過し、エパポレーターで溶媒を留去した後、さらに55℃の電気乾燥機で３時間乾燥した。その後、水を加えて４mLに定容し、これを試料溶液とした。
【００２８】
別に、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、マンノースを各々10mg量り、水を加えて８mLに定容し標準溶液とした。
標準溶液および試料溶液20μL につき、次の条件で高速液体クロマトグラフィーにて各糖のピーク高さを測定し、標準溶液および試料溶液のピーク比から各糖の濃度を算出した。
【００２９】
カラム：ポリスフェア CHPB
検出器：示差屈折
カラム温度：80℃
流速：0.4 mL／分
溶離液：H2O
各フコイダンの構成糖の分析結果を表１に示す。
(3) フコイダン中のウロン酸
Ga- フコイダン、L-フコイダンをそれぞれ10mg量り水に溶解後、Ga- フコイダン溶液は50mLに、L-フコイダン溶液は10mLに定容する。
【００３０】
試料溶液１mLを９mLスクリュー管に入れ、冷却しながら試薬１ (濃硫酸60mLに四ホウ化ナトリウム0.57ｇを溶解) を５mL加え沸騰水浴中で10分間加熱する。室温に冷却後、試薬２( 99.5％エタノール20mLにカルバゾール0.025 ｇを溶解) を0.2mL 加え、再び沸騰水浴中で15分間加熱する。室温に冷却後、吸光度を530nm で測定しグルクロン酸ナトリウムで作成した検量線から定量する。
【００３１】
各フコイダンのウロン酸の測定結果を表１に示す。
(4)Ga-フコイダン、L-フコイダン中の硫酸基
各フコイダン10mgに１mol/L 塩酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (105 ℃、５時間) した。冷却後、水を加えて100mL に定容し試料溶液とした。別に硫酸ナトリウムを147.9mg 量り水を加えて正確に100mL とした (1000ppm SO4 標準液) 。調製した標準液を１mL、３mLおよび５mL採り、水を加えて正確に100mL とし、それぞれ10ppm 、30ppm および50ppm のSO4 標準溶液とした。
【００３２】
試料溶液および標準溶液10μL につき、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにて硫酸基のピーク高さを測定した。
標準溶液のピーク高さから検量線を作成し、試料溶液のピーク高さと検量線から試料溶液中の硫酸基の濃度を求め硫酸基の含有量を算出した。
【００３３】
カラム：Shodex IC I-525A
カラム温度：40℃
溶離液：2.3mM フタル酸＋2.5mM トリス混合溶液
流速：1.5mL ／分
検出器：電気伝導度
各フコイダンの硫酸基の分析結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
(5) コンブ仮根部由来フコイダンの組成
表１に示す結果から、コンブ仮根部由来のフコイダンに特有のGaフコイダンは、構成糖としてフコース以外にガラクトース、キシロース、マンノースおよびグルコースを含むことが分かる。
（参考例３）
(養殖コンブ仮根からのフコイダン抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。試料360 ｇを0.25w/v ％クエン酸−水和物溶液4680mLに加え攪拌した。75℃の水浴に浸し、懸濁液が70℃に達してから３時間加熱した。冷却後、4500rpm で20分間遠心分離を行い、上清を吸引ろ過した。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液を分画分子量10,000のフィルターを取り付けた限外ろ過機で10倍濃縮した。次いで、濃縮液と同量の水を加え２倍濃縮し、さらにこの操作を２回行った後、濃縮液を90℃で20分間加熱した。冷却後、凍結乾燥を行い、その重量を測定し粗フコイダンを11.7ｇ得た。
【実施例１】
【００３６】
（錠剤）
成分 １錠当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン ２５０mg
ソルビトール ２００mg
ステアリン酸Ｍｇ ８mg
サッカリンＮａ ２mg
合計 ４６０mg
【実施例２】
【００３７】
（顆粒剤）
成分 １包当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
Ｄ−マンニトール ８００mg
マクロゴール ２００mg
ポリビニルピロリドン ５０mg
サッカリンＮａ ５mg
香料 適量
合計 ２０５５mg
【実施例３】
【００３８】
（液剤）
成分 １回分当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
パラオキシ安息香酸エチル １０mg
パラオキシ安息香酸メチル ５mg
サッカリンＮａ １０mg
香料 適量
水 適量
合計 ５０mL
（試験例１）
(1) 予備試験
本試験の前に、予備試験として以下のようにして、インフルエンザウイルス接種後14日間にわたりマウスの死亡状況を確認し、本試験で使用するウイルス価を確認した。
【００３９】
６週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス30匹に対し、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) をそれぞれ10PFU 、100PFUおよび1000PFU/25μL で、エーテル麻酔下において点鼻接種し、14日間生死を観察した。
【００４０】
図２に示す結果を得たので、本試験では1000PFU (LD50 値) で行う。
(2) コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果試験
使用した動物は、４週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス75匹であり、使用ウイルスは、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) であった。
【００４１】
被験物質としては、上記参考例３で製造したフコイダンを用い、各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は25、50、100mg ／kg／日の３用量で行った。被験物質の投与回数はウイルス接種の２週間前から接種後３日目まで１日１回、計18回であった。
【００４２】
ウイルスの接種は、予備試験で得られたLD50値 (1000PFU)で点鼻接種により行った。群の構成は以下の５群であった。
１群：感染なしかつ非投与 (陰性対照) ；n ＝15、
２群：感染ありかつ非投与 (陽性対照) ；n ＝15、
３群：感染ありかつ被験物質25mg／kg／日投与；n ＝16、
４群：感染ありかつ被験物質50mg／kg／日投与；n ＝16、
５群：感染ありかつ被験物質100mg ／kg／日投与；n ＝16、
ウイルス投与の２週間前から被験物質を１日１回投与し、その後ウイルスを１回接種し、さらに前に被験物質を１日１回、３日間投与し、ウイルス感染後の10日間の生存状況を確認した。なお、ウイルス感染４日後にマウスが衰弱したため、投与を中止したが、これは全群一斉に行われたので、生存率には影響しないと判断した。
【００４３】
全症例について一般状態を毎日１回観察した。体重は全生存例について入荷時、被験物質投与開始時および１週間に２回の割合で測定した。
結果
・体重変化
各群の体重変化を図３に示した。図３に示すように、投与開始からウイルス接種の日までは、各群間に有意な差は認められなかった。ウイルス接種群 (２〜５群) では、陰性対照 (１群) と比較して体重が激減したが、ウイルス接種群の各群間には有意な差は認められなかった。なお、ウイルス接種後のデータは、生存例のみのデータである。
・生存率
各群の生存曲線を図４に示した。図４に示すように、ウイルス接種後５日目から８日目までにマウスは死亡した。ウイルス接種10日後の生存率は、対照群で26.7％、25mg／kg投与群で37.5％、50mg／kg投与群で56.3％、100 mg／kg投与群で62.5％であり、100 mg／kg投与群は対照群と比較して有意差が認められた (χ2 検定、Ｐ値0.0451) 。
（試験例２）
試験例１において、コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果について、マウスの生存率を指標に効果を確認したところ、用量依存的に生存率を高める効果が認められた。本試験例では、この効果の機序解明の一環として、ウイルス力価およびサイトカイン産生について検討した。
【００４４】
試験例１と同様の被験物質およびマウス (ただし94匹) を用いた。被験物質の投与はウイルス接種の２週間前から接種後２日目まで１日１回であった。各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は50および100 mg／kg／日とした。
【００４５】
ウイルス接種の２週間前から被験物質を経口投与し、ウイルス (A/PR/8/34(HINI))接種を行い、接種２日目まで被験物質の投与を継続した。陰性対照および陽性対照群には溶媒を投与した。接種３日目に採血を行い、肺を摘出した。
血液は血清を分画し、INF-γ、IL-4、IL-12 およびIL-6濃度を測定した。肺については、ウイルス力価およびサイトカインを測定した。さらに、肺の病理組織的観察を行った。試験進行および群構成は以下の通りとした。
【００４６】
【表２】
【００４７】
結果
・肺内ウイルス価
肺ホモジネート中のウイルス力価を測定するために、MDCK細胞を用いてプラークアッセイを行った。実験１では、高用量群において有意にウイルス価が減少していた (表３) 。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験２においては高用量群で感染２日後のウイルス力価が70％減少していた (図５) 。
・病理学的観察
感染１、２、３日後に肺の摘出を行って切片を作製し、インフルエンザ感染による肺の組織像の変化を観察した。対照群では、感染１日後の肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤が見られた。感染２日後では肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤がより顕著に見られるようになり、感染３日後では激しい炎症像を認められる部分が存在していた。フコイダン投与群では、炎症の軽減が認められた。
・サイトカイン
血清および肺ホモジネート中に含まれるTNF-α,INF- β, INF-γ, IL-6, IL-4, IL-12, IL-18をELISA よって定量した。血清中のINF-γ, IL-6, IL-4, IL-12 の量には違いは認められなかった (データ示さず) が、肺ホモジネート中では感染１日後のTNF-αと感染３日後のIL-12 、INF-γはフコイダン投与により有意に減少しており、IL-6および IL-18にも減少傾向が見られた。また、INF-βは対照群の感染２日後でのみ検出された (図６) 。
【００５０】
インフルエンザウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらす。下気道にまで感染が広がると、重篤な肺炎になる。ウイルス感染初期の防御応答としては、好中球による感染細胞の障害、感染細胞からのI 型IFN の産生などが起こり、感染後期ではCTL による細胞障害、形質細胞によるIgG2a などが起こる。
【００５１】
フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果を確かめるために行ったウイルス力価の測定の結果から、フコイダンは抗インフルエンザ効果を有することが分かった。肺内サイトカインを定量したところ、フコイダン投与群ではTNF-α,INF- γ, IL-12 に有意な減少が見られた。フコイダン投与群では対照群と比較して感染１日後のウイルス力価が減少していたため、サイトカイン産生量も減少したと考えられる。
【００５２】
このように、コンブ仮根部由来フコイダンの投与によりマウスの免疫が賦活化され、インフルエンザウイルスに対する免疫力が向上したと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して感染抑制効果を有する抗インフルエンザウイルス剤に関し、詳しくは、従来は利用されずに廃棄されていたコンブ仮根部、特に養殖コンブ仮根部を用い、これから抽出した有効成分を抗インフルエンザウイルス剤として利用するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスにより引き起こされるウイルス性呼吸器感染症である。このウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらし、突然の発熱、頭痛、関節痛などの症状を伴う。下気道にまで感染が広がると重篤な肺炎を引き起こすことがあり、また、高齢者や妊婦、基礎疾患を有する患者などのハイリスク患者においては死亡に至る場合がある。
【０００３】
インフルエンザウイルスはオルソミクソ科に属する、エンペロープをもつＲＮＡウイルスであり、その抗原性の違いからＡ、ＢおよびＣ型に分類されるが、主にＡ型およびＢ型、特にＡ型において新しい血清型が出現し、抗原性が異なるウイルスにより毎年のように流行を繰り返す。インフルエンザウイルスの流行を抑えるにはワクチン接種が有効な手段であるが、このようにウイルスの抗原性の変化が頻繁であるため、ワクチンだけで予防するのは難しい。
【０００４】
インフルエンザは、飛沫により放出されたウイルスがヒトの上気道の粘膜上皮細胞に感染し増殖することにより生じるため、感染の抑制には、細胞への吸着、膜融合、ウイルスゲノム RNAの転写・複製、ウイルス粒子の出芽などの増殖過程を標的として抗ウイルス薬が開発されている。現在、インフルエンザに罹患した患者に対しては、ウイルスの出芽時のノイラミニダーゼの機能を阻害する、オセルタミビル（タミフル）やザナミビル（リレンザ）などの抗ウイルス剤が治療に用いられているが、これらの抗ウイルス薬には副作用や耐性ウイルス株の出現の問題がある。
【０００５】
また、安全性の点から天然物由来の物質を用いた各種抗インフルエンザウイルス薬が報告されている。例えば、センダンの抽出物を含有するインフルエンザ予防・治療剤（特許文献１）、各種植物の抽出物を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤（特許文献２）などがある。
【０００６】
一方、本発明者らは、先に、養殖昆布において、それまで費用をかけて廃棄していた仮根部の利用法を検討し、食品素材として利用できることを見出した（特許文献３）。即ち、養殖コンブの仮根部は、古くから食品として利用されてきたコンブ葉状体とは異なり、カリウムと食物繊維を多量に含んでいることを見出し、減塩や食物繊維補給のために有用な食品素材を提供したものである。また、養殖コンブの仮根部が有効な抗腫瘍成分を含有していることも見出している（特許文献４）。しかし、コンブ仮根部から抽出したフコイダンのアディポネクチン産生促進作用についてはこれまで全く知られていない。
【０００７】
コンブは褐藻類コンブ科コンブ属の海藻の葉状体を乾燥したものであり、通常、葉状体の先端部と下端部および仮根部は除いて製品化される。また、根昆布と称して販売されているものは、コンブの仮根ではなく、コンブ仮根部に近い葉状体の下端部である。天然のコンブでは、仮根部は岩盤に強く付着しており、採取の際に岩石、土砂との分離が難しい。養殖昆布では、受精した幼胞子体を付着させたロープを、太いロープに結び付けて海中に入れて栽培するため採取が容易である。上記の本発明者等による発明前は、養殖昆布の仮根部の海への投棄は汚染の問題を生じるため、陸揚げして埋め立てなどの手段で廃棄処分していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２５４３１９号公報
【特許文献２】特開２００４−５９４６３号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９６３号公報
【特許文献４】特開２００３−８１８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、安全性の高い天然物由来の成分を用いて、有効な抗インフルエンザウイルス剤を提供することである。また、コンブの仮根部、特に養殖コンブ仮根部のさらなる利用法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、養殖コンブ仮根の利用を検討する過程で、養殖コンブ仮根由来の成分の中でフコイダンに着目し、これを投与したマウスにおいて抗インフルエンザウイルス効果を確認し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の通りである。
１．コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分とする、抗インフルエンザウイルス剤。
２．フコイダンが、コンブ仮根部からの抽出により得られたものである、上記１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
３．コンブが養殖コンブである、上記１または２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、抗インフルエンザウイルス作用に優れていると共に、安全性の確認された食品素材由来の成分を利用するので、安全性の面でも優れている。また、本発明はコンブ仮根、特に養殖コンブ仮根の別の利用方法を見出した点でも有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コンブの各部位の名称とその位置を示す図である。
【図２】マウスでのインフルエンザウイルス感染の予備実験の結果を示す。
【図３】インフルエンザウイルスを接種したマウスの体重変化を示す図である。
【図４】コンブ仮根部由来フコイダン投与群および対象群におけるマウス生存曲線を示す。
【図５】肺中のウイルス力価を示す図である。
【図６】コンブ仮根部由来フコイダン投与群および対象群におけるサイトカイン産生量の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で使用するフコイダンは、コンブ仮根部、特に好ましくは養殖コンブ仮根部由来のフコイダンである。フコイダンは海藻などに含まれる、フコースを主成分とした硫酸化多糖類の総称であり、原料の違いにより成分や構造に違いがみられる。コンブ仮根部から得られるフコイダンは、Ｌ−フコイダンおよびＧａ−フコイダンからなる。Ｌ−フコイダンは葉状体にも含まれているフコイダンであり、フコースおよびガラクトースを構成糖として含む。Ｇａ−フコイダンは仮根部特有のフコイダンであり、糖としてはフコースを主体とし、その他にマンノース、ガラクトース、キシロース、グルコースで構成されている。コンブ仮根部由来フコイダンにはＬ−フコイダンとＧａ−フコイダンが１：１〜２：１の割合で含まれる。
【００１５】
本発明で使用するコンブ仮根部由来のフコイダンは、メカブ、オキナワモズクなどの他の海藻由来のフコイダン、また葉状体由来のフコイダンとは、構成糖の点で異なる。特にＧａフコイダンは、他の海藻や葉状体には存在せず、コンブ仮根部のみに存在するという特徴を有する。
【００１６】
メカブから得られるフコイダンについては、Ｆｒ−ＩおよびＦｒ−ＩＩの２種類が分離されており、微量成分を除く構成糖は、Ｆｒ−Ｉではフコース、ガラクトース、アラビノース、キシロースであり、Ｆｒ−ＩＩではフコースおよびガラクトースである。オキナワモズクから得られるフコイダンは、フコースおよびグルクロン酸から構成されている。ガゴメコンブ（葉状体）から得られるフコイダンは、フコースから構成されるＦ−フコイダン、フコース、マンノースおよびグルクロン酸から構成されるＵ−フコイダン、ガラクトースとフコースから構成されるＧフコイダンを含む。
【００１７】
本発明においてフコイダンを得るために用いるコンブ仮根とは、図１に示したコンブの部位のうち、仮根 (holdfast) を主とし、葉柄 (stipe)を含んでいてもよい部分を指し、以前は食用として利用されず廃棄されていた部分である。通常のコンブ製品は葉状体 (frond)の先端部と下端部を除いた部分から製造され、葉状体の下端部は根昆布と称されて利用されている。本発明で仮根を使用するコンブの種類には、マコンブ、ミツイシコンブ、リシリコンブなどがあり、特に限定されないが、採取が容易であることなどから養殖コンブであるのが好ましい。
【００１８】
本発明で用いるコンブ仮根部由来のフコイダンとしては、コンブ仮根部より抽出した粗フコイダンでも、それを精製したフコイダンでもよい。
コンブ仮根からフコイダンを得る方法は、既知のフコイダン調製方法が使用でき特に限定されないが、例えば、コンブ仮根やその粉末に、熱水抽出、無機酸による抽出、有機酸による抽出などの抽出操作、あるいは、塩化カルシウム等の２価の陽イオンを含む水溶液による抽出操作、およびこれらを組み合わせた方法を適用する。また、抽出液から粗フコイダンを得るために、エタノール等の低級アルコールによる凝集、あるいは限外ろ過器を用いることによる、ナトリウム等の無機塩類の除去を行う。
【００１９】
さらに、クロマトグラフィーなどの精製手段により粗フコイダンを精製してもよい。また、得られるフコイダンをイオン交換やゲルろ過クロマトグラフなどの方法でＧａ−フコイダンやＬ−フコイダンに分離してもよい。
【００２０】
好ましくは、コンブ仮根を乾燥後、粉砕機で粉砕する等の通常の粉末化手段を用いて粉末化し、得られるコンブ仮根粉末より塩酸などの無機酸によりフコイダンを抽出する。フコイダン抽出および精製方法の好適な一態様は以下の通りである。
（水溶性成分の抽出）
養殖コンブ仮根を乾燥して粉砕して得られる粉末に、塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水を10〜13倍量加え、70〜80℃で２〜３時間程度抽出を行う。抽出操作を２〜３回繰り返し、上澄を採取し遠心分離を行う。得られた上清をろ紙等で濾過し清澄液を得る。その後の操作を容易にするために、清澄液をエバポレーターを用い減圧濃縮する。濃縮の際は、沈澱が析出すると沈澱に粗フコイダンが含まれてしまうため、なるべく沈澱が析出しないようにするのが望ましい。濃縮後の溶液を遠心分離し、沈澱を除去する。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄液にエタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥し、これを約７〜10倍量の塩酸等の酸でpH2.0 〜2.5 に調整した水に溶解し、６〜12時間程度静置する。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、エタノール等の低級アルコールを２〜３倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離により得られる沈澱を回収・乾燥させる。この操作を１〜２回程度繰り返して粗フコイダンを得る。
【００２１】
また、別法として、上記で得られた清澄液を分角分子量10,000の限外ろ過器を用いて、清澄液に存在するナトリウム等を排除して、粗フコイダンを得る方法が挙げられる。
（フコイダンの精製）
乾燥させた沈澱（粗フコイダン）を、クロマトグラフィーなどの方法により精製する。好ましくは、陰イオン樹脂を用いた液体クロマトグラフにより、コンブ仮根部由来の精製フコイダンを得ることができる。
【００２２】
上述のようにして得られるフコイダンは、後出の試験例において実証するように、インフルエンザウイルスを接種したマウスに対して生存率を向上させることができた。具体的には、コンブ仮根部由来のフコイダンを、ウイルス接種前から経口投与してマウスの生存率を調べた結果、対象群と比較して有意差が見られた。従って、本発明のコンブ仮根部由来フコイダンを投与することにより、インフルエンザウイルス感染に対して予防効果や重症化を防ぐ効果が期待できる。
【００２３】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分としてコンブ仮根部由来フコイダンを含み、必要に応じ、製剤化の際に慣用される物質、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、矯味剤、着香剤などの補助剤を添加して、錠剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤などの適宜形態に製剤化すればよい。投与方法としては、経口投与が好ましく、投与量は、フコイダン量として成人で体重１kg当たり10〜100mg ／日程度が好ましい。
【００２４】
また、本発明の抗インフルエンザ剤の有効成分は天然物由来であり、安全性が高いので、食品に添加して用いても、または栄養補助食品や健康食品などの経口組成物として利用することもできる。
【００２５】
経口組成物とする場合、上述のようにして得たフコイダンに、必要に応じて食品分野で慣用の賦形剤、甘味料、香料、着色剤などの添加剤を配合することにより製造できる。この組成物は、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、ゼリーなどの各種形態に常法により製剤化して、例えば栄養補助食品や健康食品などとして経口摂取することができる。また、本発明経口組成物は、フコイダンを、通常の飲食品に配合したものであってもよい。
【００２６】
以下に本発明をさらに詳しく説明するため実施例を示すが、本発明はそれらによって限定されるものではない。以下では、コンブ仮根部として養殖コンブ仮根部を用いた場合について具体的に説明する。
【実施例】
【００２７】
（参考例１）
(養殖コンブ仮根からのフコイダンの抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。養殖コンブ仮根粉末500gに、水5000mLを加え、塩酸でpH３に調整して、75℃で３時間抽出した。この操作を３回繰り返した後、固形分を取り除き、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。得られた上清をろ過し、清澄液を得た。後の操作を容易にするために、清澄液をなるべく沈澱が析出しないように、約10分の１の液量となるまで減圧濃縮した。濃縮後の液を遠心分離し沈澱を除いた。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液にエタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後、沈澱を乾燥し、これを約７倍量の水に溶解し、塩酸でpHを２に調整して約１時間静置した。吸引ろ過により得られた溶液を濃縮し、再度エタノールを２倍量加えて沈澱を生じさせ、遠心分離後沈澱を乾燥した。この操作を２回程度繰り返して粗フコイダン16.3ｇを得た。
（参考例２）
養殖コンブ仮根由来フコイダンの分析
(1) Ga- フコイダン、L-フコイダンの分離
上記のようにして得た粗フコイダン4.5 ｇを水500mL に溶解し、DEAE-TOYOPEARL 650M を500mL 充填したカラムにマウントした。500mL の水で洗浄した後、0.5M NaCl 500mL (Ga-フコイダンが抽出される) 、さらに1.0M NaCl 500mL (L- フコイダンが抽出される) でフコイダンを溶離した。上記溶離液を流すとき、カラム出口から溶出する液をフラクションコレクターで20mLずつ分取し、各フラクションの一部をサンプリングし、HPLCで分析した。HPLC分析条件は次の通りである。カラム：Asahipak GS-520H、検出器：示差屈折、溶離液：0.3M NaNO3、流速：1.0mL ／分、カラム温度：60℃。各フコイダンのピークのあるフラクションを回収し、エバポレーターで濃縮後、分画分子量1000の透析膜で透析を25時間行った後、さらに濃縮した。得られた濃縮液を凍結乾燥した。
(2) フコイダン中の構成糖
各フコイダン30mgに１mol/L 硫酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (110 ℃、2.5 時間) した。炭酸バリウムで中和後 (pH試験紙で中和を確認) 、遠心分離 (3000rpm 、20分) を行った。上澄みを濾過し、エパポレーターで溶媒を留去した後、さらに55℃の電気乾燥機で３時間乾燥した。その後、水を加えて４mLに定容し、これを試料溶液とした。
【００２８】
別に、グルコース、キシロース、ガラクトース、フコース、マンノースを各々10mg量り、水を加えて８mLに定容し標準溶液とした。
標準溶液および試料溶液20μL につき、次の条件で高速液体クロマトグラフィーにて各糖のピーク高さを測定し、標準溶液および試料溶液のピーク比から各糖の濃度を算出した。
【００２９】
カラム：ポリスフェア CHPB
検出器：示差屈折
カラム温度：80℃
流速：0.4 mL／分
溶離液：H2O
各フコイダンの構成糖の分析結果を表１に示す。
(3) フコイダン中のウロン酸
Ga- フコイダン、L-フコイダンをそれぞれ10mg量り水に溶解後、Ga- フコイダン溶液は50mLに、L-フコイダン溶液は10mLに定容する。
【００３０】
試料溶液１mLを９mLスクリュー管に入れ、冷却しながら試薬１ (濃硫酸60mLに四ホウ化ナトリウム0.57ｇを溶解) を５mL加え沸騰水浴中で10分間加熱する。室温に冷却後、試薬２( 99.5％エタノール20mLにカルバゾール0.025 ｇを溶解) を0.2mL 加え、再び沸騰水浴中で15分間加熱する。室温に冷却後、吸光度を530nm で測定しグルクロン酸ナトリウムで作成した検量線から定量する。
【００３１】
各フコイダンのウロン酸の測定結果を表１に示す。
(4)Ga-フコイダン、L-フコイダン中の硫酸基
各フコイダン10mgに１mol/L 塩酸10mLを加えて溶解し、オートクレーブ中で加水分解 (105 ℃、５時間) した。冷却後、水を加えて100mL に定容し試料溶液とした。別に硫酸ナトリウムを147.9mg 量り水を加えて正確に100mL とした (1000ppm SO4 標準液) 。調製した標準液を１mL、３mLおよび５mL採り、水を加えて正確に100mL とし、それぞれ10ppm 、30ppm および50ppm のSO4 標準溶液とした。
【００３２】
試料溶液および標準溶液10μL につき、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにて硫酸基のピーク高さを測定した。
標準溶液のピーク高さから検量線を作成し、試料溶液のピーク高さと検量線から試料溶液中の硫酸基の濃度を求め硫酸基の含有量を算出した。
【００３３】
カラム：Shodex IC I-525A
カラム温度：40℃
溶離液：2.3mM フタル酸＋2.5mM トリス混合溶液
流速：1.5mL ／分
検出器：電気伝導度
各フコイダンの硫酸基の分析結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
(5) コンブ仮根部由来フコイダンの組成
表１に示す結果から、コンブ仮根部由来のフコイダンに特有のGaフコイダンは、構成糖としてフコース以外にガラクトース、キシロース、マンノースおよびグルコースを含むことが分かる。
（参考例３）
(養殖コンブ仮根からのフコイダン抽出)
乾燥した養殖コンブ仮根を粗砕機（カッターミル）で粗く粉砕した後、微砕機（サンプルミル）で微粉末にして、養殖コンブ仮根粉末を得た。試料360 ｇを0.25w/v ％クエン酸−水和物溶液4680mLに加え攪拌した。75℃の水浴に浸し、懸濁液が70℃に達してから３時間加熱した。冷却後、4500rpm で20分間遠心分離を行い、上清を吸引ろ過した。
（粗フコイダンの抽出）
上で得られた清澄な液を分画分子量10,000のフィルターを取り付けた限外ろ過機で10倍濃縮した。次いで、濃縮液と同量の水を加え２倍濃縮し、さらにこの操作を２回行った後、濃縮液を90℃で20分間加熱した。冷却後、凍結乾燥を行い、その重量を測定し粗フコイダンを11.7ｇ得た。
【実施例１】
【００３６】
（錠剤）
成分 １錠当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン ２５０mg
ソルビトール ２００mg
ステアリン酸Ｍｇ ８mg
サッカリンＮａ ２mg
合計 ４６０mg
【実施例２】
【００３７】
（顆粒剤）
成分 １包当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
Ｄ−マンニトール ８００mg
マクロゴール ２００mg
ポリビニルピロリドン ５０mg
サッカリンＮａ ５mg
香料 適量
合計 ２０５５mg
【実施例３】
【００３８】
（液剤）
成分 １回分当たりの含有量
コンブ仮根部由来フコイダン １０００mg
パラオキシ安息香酸エチル １０mg
パラオキシ安息香酸メチル ５mg
サッカリンＮａ １０mg
香料 適量
水 適量
合計 ５０mL
（試験例１）
(1) 予備試験
本試験の前に、予備試験として以下のようにして、インフルエンザウイルス接種後14日間にわたりマウスの死亡状況を確認し、本試験で使用するウイルス価を確認した。
【００３９】
６週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス30匹に対し、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) をそれぞれ10PFU 、100PFUおよび1000PFU/25μL で、エーテル麻酔下において点鼻接種し、14日間生死を観察した。
【００４０】
図２に示す結果を得たので、本試験では1000PFU (LD50 値) で行う。
(2) コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果試験
使用した動物は、４週齢のBALB/c(SPF) 雌マウス75匹であり、使用ウイルスは、インフルエンザウイルスA/PR/8/34(HINI) であった。
【００４１】
被験物質としては、上記参考例３で製造したフコイダンを用い、各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は25、50、100mg ／kg／日の３用量で行った。被験物質の投与回数はウイルス接種の２週間前から接種後３日目まで１日１回、計18回であった。
【００４２】
ウイルスの接種は、予備試験で得られたLD50値 (1000PFU)で点鼻接種により行った。群の構成は以下の５群であった。
１群：感染なしかつ非投与 (陰性対照) ；n ＝15、
２群：感染ありかつ非投与 (陽性対照) ；n ＝15、
３群：感染ありかつ被験物質25mg／kg／日投与；n ＝16、
４群：感染ありかつ被験物質50mg／kg／日投与；n ＝16、
５群：感染ありかつ被験物質100mg ／kg／日投与；n ＝16、
ウイルス投与の２週間前から被験物質を１日１回投与し、その後ウイルスを１回接種し、さらに前に被験物質を１日１回、３日間投与し、ウイルス感染後の10日間の生存状況を確認した。なお、ウイルス感染４日後にマウスが衰弱したため、投与を中止したが、これは全群一斉に行われたので、生存率には影響しないと判断した。
【００４３】
全症例について一般状態を毎日１回観察した。体重は全生存例について入荷時、被験物質投与開始時および１週間に２回の割合で測定した。
結果
・体重変化
各群の体重変化を図３に示した。図３に示すように、投与開始からウイルス接種の日までは、各群間に有意な差は認められなかった。ウイルス接種群 (２〜５群) では、陰性対照 (１群) と比較して体重が激減したが、ウイルス接種群の各群間には有意な差は認められなかった。なお、ウイルス接種後のデータは、生存例のみのデータである。
・生存率
各群の生存曲線を図４に示した。図４に示すように、ウイルス接種後５日目から８日目までにマウスは死亡した。ウイルス接種10日後の生存率は、対照群で26.7％、25mg／kg投与群で37.5％、50mg／kg投与群で56.3％、100 mg／kg投与群で62.5％であり、100 mg／kg投与群は対照群と比較して有意差が認められた (χ2 検定、Ｐ値0.0451) 。
（試験例２）
試験例１において、コンブ仮根部由来フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果について、マウスの生存率を指標に効果を確認したところ、用量依存的に生存率を高める効果が認められた。本試験例では、この効果の機序解明の一環として、ウイルス力価およびサイトカイン産生について検討した。
【００４４】
試験例１と同様の被験物質およびマウス (ただし94匹) を用いた。被験物質の投与はウイルス接種の２週間前から接種後２日目まで１日１回であった。各被検物質を注射用蒸留水で至適濃度に溶解した。投与液量は10mL／kgとし、注射器および胃ゾンデを用いて強制経口投与した。用量は50および100 mg／kg／日とした。
【００４５】
ウイルス接種の２週間前から被験物質を経口投与し、ウイルス (A/PR/8/34(HINI))接種を行い、接種２日目まで被験物質の投与を継続した。陰性対照および陽性対照群には溶媒を投与した。接種３日目に採血を行い、肺を摘出した。
血液は血清を分画し、INF-γ、IL-4、IL-12 およびIL-6濃度を測定した。肺については、ウイルス力価およびサイトカインを測定した。さらに、肺の病理組織的観察を行った。試験進行および群構成は以下の通りとした。
【００４６】
【表２】
【００４７】
結果
・肺内ウイルス価
肺ホモジネート中のウイルス力価を測定するために、MDCK細胞を用いてプラークアッセイを行った。実験１では、高用量群において有意にウイルス価が減少していた (表３) 。
【００４８】
【表３】
【００４９】
実験２においては高用量群で感染２日後のウイルス力価が70％減少していた (図５) 。
・病理学的観察
感染１、２、３日後に肺の摘出を行って切片を作製し、インフルエンザ感染による肺の組織像の変化を観察した。対照群では、感染１日後の肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤が見られた。感染２日後では肺胞壁の肥厚および肺胞腔への白血球の浸潤がより顕著に見られるようになり、感染３日後では激しい炎症像を認められる部分が存在していた。フコイダン投与群では、炎症の軽減が認められた。
・サイトカイン
血清および肺ホモジネート中に含まれるTNF-α,INF- β, INF-γ, IL-6, IL-4, IL-12, IL-18をELISA よって定量した。血清中のINF-γ, IL-6, IL-4, IL-12 の量には違いは認められなかった (データ示さず) が、肺ホモジネート中では感染１日後のTNF-αと感染３日後のIL-12 、INF-γはフコイダン投与により有意に減少しており、IL-6および IL-18にも減少傾向が見られた。また、INF-βは対照群の感染２日後でのみ検出された (図６) 。
【００５０】
インフルエンザウイルスは主に気道上皮細胞に感染し、急性の呼吸器障害をもたらす。下気道にまで感染が広がると、重篤な肺炎になる。ウイルス感染初期の防御応答としては、好中球による感染細胞の障害、感染細胞からのI 型IFN の産生などが起こり、感染後期ではCTL による細胞障害、形質細胞によるIgG2a などが起こる。
【００５１】
フコイダンの抗インフルエンザウイルス効果を確かめるために行ったウイルス力価の測定の結果から、フコイダンは抗インフルエンザ効果を有することが分かった。肺内サイトカインを定量したところ、フコイダン投与群ではTNF-α,INF- γ, IL-12 に有意な減少が見られた。フコイダン投与群では対照群と比較して感染１日後のウイルス力価が減少していたため、サイトカイン産生量も減少したと考えられる。
【００５２】
このように、コンブ仮根部由来フコイダンの投与によりマウスの免疫が賦活化され、インフルエンザウイルスに対する免疫力が向上したと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分として含有する抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
フコイダンがコンブ仮根部からの抽出により得られたものである請求項１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
コンブが養殖コンブである請求項１または２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項１】
コンブ仮根部由来のフコイダンを有効成分として含有する抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
フコイダンがコンブ仮根部からの抽出により得られたものである請求項１記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項３】
コンブが養殖コンブである請求項１または２記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１６８５３３（Ｐ２０１１−１６８５３３Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３３６８８（Ｐ２０１０−３３６８８）
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（３９１０１０４６０）共成製薬株式会社 (4)
【出願人】（５９３１８３５２８）株式会社カイゲン (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【出願人】（３９１０１０４６０）共成製薬株式会社 (4)
【出願人】（５９３１８３５２８）株式会社カイゲン (5)
【Ｆターム（参考）】
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