本発明は、ウイルス感染の阻害剤であり、および／または抗膜融合特性を示す、改善された水溶性を有しているＣ３４ペプチド誘導体に関する。具体的には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のそれぞれのウイルス感染を処置するための長期作用を持つ、これらのウイルスに対する阻害活性を有するＣ３４誘導体に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、共に２００７年５月１６日に出願されたＵ．Ｓ．第６０／９３８，３８０号およびＵ．Ｓ．第６０／９３８，３９４号への優先権を主張する。上記の出願の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
非感染細胞への１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の進入には主に３つの工程が含まれる：（ｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４受容体に対する結合、（ｉｉ）それに続く共受容体ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５に対する結合、そして（ｉｉｉ）ＨＩＶ−１膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１の細胞外ドメインの一連の立体構造の変化（これは、最終的に感染を起こさせる膜融合事象を誘発するために重要である）。ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のようなウイルスは、ｇｐ４１様タンパク質を含むＨＩＶと高度な構造的類似性および機能的類似性を示す。
【０００３】
いくつかの低分子薬物候補（ＣＤ４またはＣＣＲ５共受容体に対する結合を阻害するものを含む）は、ヒトの臨床試験の段階にあるか、または販売の認可が近いかのいずれかにある（非特許文献１；非特許文献２）。いくつかの合成のペプチドは、膜融合に関連する事象（非感染細胞へのレトロウイルスの感染の阻害を含む）を阻害するか、あるいは壊すことが知られている。例えば、合成ペプチドＣ３４、Ｔ１２４９、ＤＰ−１０７、およびＴ−２０（ＤＰ−１７８）（これらは、ｇｐ４１中の異なるドメインに由来する）はＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ−１に誘導される細胞と細胞の融合の強力な阻害剤である。
【０００４】
Ｔ−２０（ＤＰ−１７８、エンフュービルタイド、Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ／Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１のＣＨＲ配列をベースとする合成ペプチドであり、ｇｐ４１の立体構造の再編成を標的化すると考えられている。Ｔ−２０の阻害は、６ヘリックスの束状構造の形成の阻害を生じるｇｐ４１のＮＨＲ領域の疎水性溝に結合するその能力に起因すると広く考えられている（非特許文献３）。この考えとは対照的に、最近の研究では、Ｔ−２０がｇｐ４１およびｇｐ１２０中の複数の部位を標的化できることが示唆された（非特許文献４）。例えば、Ｔ−２０は膜の表面に結合してオリゴマーを形成し、それによって感染細胞の血漿膜でのｇｐ４１の動員とオリゴマー形成を阻害する（非特許文献５；非特許文献６）。さらに、ペプチド配列^６６６ＷＡＳＬＷＮＷＦ^６７３を有している膜貫通ドメインにすぐ隣接している領域内にあるｇｐ４１の細胞外ドメインが、ｇｐ４１のＮＨＲよりもＴ−２０に対してより親和性の高い部位を構成することもまた示されている（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
Ｔ−２０と重複しているがｇｐ４１のコイルドコイルキャビティ結合残基（ｃｏｌｉｅｄ−ｃｏｉｌ ｃａｖｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）^６２８ＷＭＥＷ^６３１を含むペプチド配列からなる別のＣ−ペプチドＣ３４は、ＮＨＲ領域の疎水性溝についてｇｐ４１のＣＨＲと競合することが公知である（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅａｎｗｅｌｌ ＮＡ，Ｋａｄｏｗ ＪＦ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ（２００３）６：４５１−４６１
【非特許文献２】Ｏｌｓｏｎ ＷＣ，Ｍａｄｄｏｎ Ｐ Ｊ、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｏｒｄ（２００３）３：２８３−２９４
【非特許文献３】Ｋｌｉｇｅｒ Ｙ，Ｓｈａｉ Ｙ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０００）２９５：１６３−１６８
【非特許文献４】Ｌｉｕ Ｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００５）２８０：１１２５９−１１２７３
【非特許文献５】Ｍｕｎｏｚ−Ｂａｒｒｏｓｏ Ｉら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９８）１４０：３１５−２３
【非特許文献６】Ｋｌｉｇｅｒ Ｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：１３９１−１３９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
当該分野で記載されている抗ウイルスペプチドまたは抗膜融合性ペプチドの多くは、強力な抗ウイルス活性および／または抗膜融合活性を示すが、これらのペプチドは生理学的ｐＨの水性処方物中での溶解度は低く、さらにインビボでの血漿半減期も短い。したがって、既存の抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの溶解度を増大させ、そして半減期を延長させ、それにより水溶性であり、インビボでの作用期間の長い抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドを提供するための方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改変前のペプチドと比較して生理学的ｐＨの水溶液中で高い溶解度を有する改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドに、少なくとも一部関係する。１つの実施形態においては、本発明のペプチドは、１つ以上の極性基または極性部分（例えば、１つ以上のシステイン酸）を含むように改変され、それによって水溶液中でのそれらの溶解度が増大する。改変されたペプチドにはさらに、改変されたペプチドが血液成分または担体タンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたは組み換え体アルブミン））上の利用できる官能基と反応できるように化学反応性部分を含めることができ、それによって改変されたペプチドのインビボでの安定性が増大する。複数の実施形態においては、改変されたペプチドは、血液成分または担体タンパク質（例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、組み換え体アルブミン、または他の担体タンパク質））に結合させられる。これらの改変されたペプチドまたはそれらの結合体は、それによって、例えば、より頻繁に、またはさらには持続的にペプチドを投与する必要性を低減する。本発明の改変されたペプチドは、多数のウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む）の感染を緩和するために、例えば、予防的および／または治療的に使用することができる。ウイルストランスフェクション（例えば、肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルスおよび他の関連するウイルス）に関与する他のペプチドの改変もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０００９】
したがって、本発明の１つの態様においては、改変前のペプチドと比較して、約５から８までの範囲のｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）で水溶液または水中で高い溶解度を有する、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドを特徴とする。１つの実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドは、濃縮された水溶液（例えば、水溶液（例えば、等張性または高塩濃度の水溶液）中で約１０ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから４００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから３００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから１８０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌから１８０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌから１８０ｍｇ／ｍｌ、または約９０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度）中で実質的に溶解したままである（例えば、約５から８までの範囲のｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ）では、約４０％未満、３０％、２０％、１０％が水または水溶液中に沈殿する）。複数の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドは、改変前のペプチドよりも少なくとも約１．３倍、１．５倍、１．８倍、２倍、２．３倍、２．５倍、２．８倍、３倍、または３．５倍大きい溶解限度（すなわち、透明な溶液を維持する最大濃度）を示す。複数の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドは、約５から８までの範囲のｐＨで、等張性水溶液中で少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、または４０ｍｇ／ｍｌの溶解限度を有する。「水溶液」としては、本明細書中で使用される場合は、水、生理食塩溶液（例えば、等張性の溶液）、水の中に作られた緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液）、水性ゲル、および対象（例えば、ヒト対象）への投与（例えば、皮下投与、静脈内投与、肺投与、筋肉内投与、もしくは腹腔内投与）に適しているｐＨの水性処方物；あるいは製造プロセスに適しているｐＨの処方物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
複数の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、１つ以上の極性部分が含まれる。１つの実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには１つ以上の極性部分が含まれ、これは、生理学的ｐＨで電荷を持つか、または生理学的ｐＨでは電荷を持たないかのいずれかである。いくつかの実施形態においては、側鎖は中性であり得、例えば、水素結合または他の非共有相互作用によって水溶液中での改変されたペプチドの全体的な溶解度を増大させることができる。例えば、特定の例においては、酸素基または窒素基を持つ中性の側鎖はバルク溶媒に水素結合することができ、ペプチドの全体的な溶解度を増大させるために使用することができる。いくつかの実施形態においては、側鎖は任意の自然界には存在しない極性の側鎖または中性の側鎖（例えば、２０種類の自然界に存在しているアミノ酸の中には見られない側鎖）であり得る。
【００１１】
複数の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの極性部分には以下の構造が含まれる：
【００１２】
【化１】

例えば、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、１つ以上のシステイン酸を含めることができる。複数の実施形態においては、システイン酸は以下の構造を有する：
【００１３】
【化２】

本明細書中に開示されるペプチドの溶解度を増大させることができるさらなる適切な側鎖は、本発明の開示の利点を前提として、当業者によって容易に選択されるであろう。
【００１４】
他の実施形態においては、１つ以上の極性部分（例えば、システイン酸）が抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に付加される。他の実施形態においては、１つ以上の極性部分が、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの内部配列に付加される。
【００１５】
１つの実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、ｇｐ４１のコイルドコイルキャビティ結合残基の少なくとも一部が含まれる。例えば、ペプチドには、残基^６２８ＷＭＥＷ^６３１（配列番号１）、またはそれらに対する１つまでのアミノ酸置換（例えば、保存的置換または非保存的置換）あるいは付加を有しているアミノ酸配列が含まれ得る。他の実施形態においては、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、アミノ酸配列^６２８ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ^６６１（アミノ酸Ｃ１からＣ３４に相当する）（配列番号２）、あるいはそれらに対して５個まで、４個、３個、２個、または１個のアミノ酸置換（例えば、保存的置換もしくは非保存的置換）、欠失、または付加を持つアミノ酸配列に由来する、天然のＣ３４のアミノ酸配列全体あるいは一部が含まれる。
【００１６】
他の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、ＤＰ１０７ペプチドおよびＤＰ１７８ペプチド、ならびにそれらのアナログのアミノ酸配列が含まれる。これには、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８が由来するＨＩＶのｇｐ４１領域に相当し、抗ウイルス活性および／または抗膜融合活性を示す他の（非ＨＩＶ）ウイルスに由来するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。さらに具体的には、これらのペプチドは、特に、ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に対して抗ウイルス活性を示すことができる。本発明はまた、引用により本明細書中に具体的に組み入れられるＵＳ０５／００７０４７５の配列番号１から配列番号８６の改変されたペプチドにも関する。
【００１７】
複数の実施形態においては、本発明の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドにはさらに、改変されたペプチドが血液成分または担体タンパク質上の利用できる官能基と反応して安定な共有結合を形成できるように１つ以上の化学反応性部分または基が含まれ得、それによって結合したペプチド形態が生じる。１つの実施形態においては、改変されたペプチドには、１つ以上の血液成分（例えば、アルブミン）上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基と反応して安定な共有結合を形成する１つ以上の反応性基が含まれる。例えば、ペプチド反応性基アルブミン結合体は、約１：１のアルブミンに対するペプチドのモル比であり得る。通常、結合は、反応性基とアルブミン（例えば、ヒトアルブミン）のアミノ酸３４（Ｃｙｓ^３４）との間での共有結合によって起こる。
【００１８】
別の実施形態においては、反応性基はマレイミド含有基（例えば、ＭＰＡ（マレイミドプロピオン酸）またはＧＭＢＡ（γ−マレイミド−ブチララミド））（これは、血液タンパク質（移動性の血液タンパク質（例えば、アルブミン）を含む）上のチオール基と反応する）であり得る。反応性の改変または反応性基にはさらに、１つ以上のリンカーを含めることができる。複数の実施形態においては、リンカーは、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）のうちの１つ以上；アルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ１０）、例えば、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、８−アミノプロパン酸（ＡＰＡ）、または４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）の１つ以上から選択される。リンカーを持つ反応性基、またはリンカーを持たない反応性基を、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に、通常は、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドのＣ末端に付加することができる。他の実施形態においては、反応性基は、改変されたペプチドの内部残基に結合させられる（例えば、内部リジン残基のεＮＨ_２基；内部セリン残基（例えば、Ｃ３４のセリン１３）のヒドロキシル基に結合させられる）。Ｃ３４の改変されたペプチドの限定ではない例は、ＷＯ０２／０９６９３５（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。
【００１９】
通常は、１つ以上の極性部分（例えば、システイン酸）が改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの一方の末端（例えば、Ｎ末端）に付加されれば、反応性基は反対側の末端（例えば、Ｃ末端）に付加される。例えば、改変されたペプチドは以下の立体配置のうちの１つを有し得る：
［極性部分（例えば、システイン酸）−改変されたペプチド−リンカー_ｎ−反応性基］（ＶＩ）；または
［反応性基−リンカー_ｎ−改変されたペプチド−極性部分（例えば、システイン酸）］（ＶＩＩ）。
式中、反応性基は、例えば、リンカーを持つマレイミド含有基またはリンカーを持たないマレイミド含有基であり得、例えば、ｎは、０、１、２、３、４、またはそれ以上のリンカーであり得る。１つ以上のリンカーが存在する場合は、リンカーは同じである（例えば、ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ）場合も、また異なる（例えば、ＡＥＥＡ−ＥＤＡもしくはＡＥＡ−ＡＥＥＡ）場合もある。
【００２０】
特定の複数の実施形態においては、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドに含められるさらなる基は以下の式（Ｉ）を有する化合物であり得る。
【００２１】
（ＶＩＩＩ）（Ｒ_１）_ｍ−Ｘ−（Ｒ_２）_ｎ
式（ＶＩＩＩ）中では、ｍとｎの和は少なくとも１であり、ｍとｎはそれぞれが０以上の整数である。例えば、ｍが０である場合は、ｎは１以上であり、ｎが０である場合は、ｍは１以上である。Ｘは、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド、例えば、Ｃ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、あるいは、それらのアナログまたは誘導体（例えば、それらのマレイミド誘導体を含む）である。Ｒ_１が存在し、Ｒ_２が存在しない場合は、Ｒ_１はＸ基のＮ末端に存在する。Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２が存在する場合は、Ｒ_２はＸ基のＣ末端に存在する。
【００２２】
特定の例においては、Ｒ_１とＲ_２はそれぞれ独立して、式（ＩＸ）を有する化合物から選択され得る。
【００２３】
【化３】

式（ＩＸ）のコア構造はアミノ酸のコア構造と類似しており、これにはアミノ基、α炭素、およびカルボキシル基が含まれる。ペプチド誘導体中のＲ_１基とＲ_２基の正確な位置に応じて、複数の基を式（ＩＸ）中の様々な原子を介してペプチドに結合させることができる。例えば、Ｒ_１が式（ＩＸ）を有する化合物である場合には、Ｒ_１を式（ＩＸ）のカルボキシル基を介してペプチドに結合させて、Ｒ_１のカルボキシル基とペプチドのアミノ基との間にペプチド結合をもたらすことができる。Ｒ_２が式（ＩＸ）を有する化合物である場合には、Ｒ_２を式（ＩＸ）のアミノ基を介してペプチドに結合させて、Ｒ_２のアミノ基とペプチドのカルボキシ基との間にペプチド結合をもたらすことができる。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、式（ＩＸ）のＲ_３基は、２０種類の自然界に存在しているアミノ酸の中に一般的に見られる極性の電荷を持たない基以外の、任意の極性の電荷を持たない基であり得る。例えば、Ｒ_３基は、スルホニル基（ＨＳ＝（Ｏ）_２）、スルホキシド基（ＨＳ＝Ｏ）、スルホン酸基（ＨＯ−Ｓ＝（Ｏ）_２）、ハロアルキル基、二級アミン、三級アミン、ヒドロキシル基、または極性であるかもしくは全くの中性であり、水溶液中でのペプチド誘導体の全体的な可溶性を増大させることができる他の側鎖基であり得るか、あるいは、それらを含み得る。例えば、水素結合することができる基を持つ側鎖は、ペプチドの全体的な溶解度を増大させるために使用され得る。特定の例においては、側鎖は、リンカーまたは他の種との望ましくない副反応が実質的な程度には起こらないように、非反応性であることが好ましい。いくつかの例においては、Ｒ_３についての上記基はα炭素から間隔をあけて、例えば、１〜３個の炭素原子の間隔をあけて存在し得る。特定の例においては、Ｒ_３は、式（Ｘ）−（ＸＶ）を有する化合物が提供されるように選択され得る。
【００２５】
【化４】

本明細書中に開示されるペプチドの溶解度を増大させることができるさらなる適切な側鎖は、本開示の利点を前提として、当業者によって容易に選択されるであろう。
【００２６】
特定の複数の実施形態においては、Ｒ_１基とＲ_２基は、ペプチド結合体の二次構造全体に、または特定の場合には三次構造には実質的には影響を及ぼさない。ペプチド結合体の二次構造に実質的には影響を及ぼさないことにより、ペプチド結合体の全体的な活性は、誘導体化されていないペプチドの全体的な活性よりも感知できるほどに下回ることはないはずである。
【００２７】
他の実施形態においては、ペプチド誘導体は、式（ＸＶＩ）に示されるような組成物の形態をとり得る。
【００２８】
（ＸＶＩ） Ｘ_１−（Ｒ_１）_ｍ−Ｘ_２−（Ｒ２）_ｎ
式（ＸＶＩ）においては、Ｘ_１とＸ_２は、互いに連結させられると、例えば、Ｃ３４、Ｔ２０、もしくはＴ１２４９、またはそれらの変異体を提供するであろうペプチドの部分を提示する。式（ＸＶＩ）においては、Ｒ_１とＲ_２は、式（ＩＸ）に関して上記で議論した基のうちの任意のものであり得、ｍとｎの和は１以上の整数であり、ｍまたはｎのいずれかが０であり得る可能性がある。式（ＸＶＩ）においては、ペプチド鎖の中央に基が挿入されている。そのような挿入は、ペプチドの酵素消化、それに続くＲ_１基もしくはＲ_２基またはそれらの両方の挿入、次いでペプチド断片を互いに結合させることを含む多くの様々な方法を使用して行われ得る。
【００２９】
特定の複数の実施形態においては、本明細書中に開示される化合物は、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端に、またはペプチドの１つ以上のアミノ酸の側鎖を介して、１つ以上のさらなる基に連結させられ得る。例えば、式（ＸＶＩＩ）−（ＸＸ）に模式的に示される組成物が作成され得る。
【００３０】
【化５】

式（ＸＶＩＩ）−（ＸＸ）においては、Ｌは、例えば、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ］エトキシ酢酸（ＡＥＡＡ）、アルキル鎖モチーフ（Ｃ１〜Ｃ１０）（例えば、グリシン）、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）などのようなリンカーであり、Ｒ_１とＲ_２は、本明細書中で議論された基のうちの任意のものであり得る。リンカーは、ペプチドの任意のアミノ酸を介して、例えば、リジンのアミノ基、チオール基、ペプチドの１つ以上のアミノ酸側鎖残基の中のヒドロキシル基を介してペプチドに対して結合させられ得るか、あるいはペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合させられ得る。Ｘ基、Ｘ_１基、およびＸ_２基は、ペプチド（Ｘ）またはペプチド断片（Ｘ_１およびＸ_２）である。式（ＸＩＸ）および式（ＸＸ）中に示されるＰ基は、リンカーＬを介して誘導されたペプチドに結合させることができるタンパク質を示す。例示的なタンパク質としては、血液タンパク質または担体タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、組み換え体アルブミン、免疫グロブリンもしくはその断片、トランスフェリン、または他の適切なタンパク質）が挙げられる。
【００３１】
タンパク質結合体（式（ＸＩＸ）および式（ＸＸ））は、エキソビボまたはインビボで生産され得る。インビボでの生産が行われる場合には、化合物（例えば、式（ＸＶＩＩ）および式（ＸＶＩＩＩ）に示されるもの）が対象に導入され得、インビボタンパク質（例えば、アルブミン）と反応させられ得る。
【００３２】
本発明の抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドは、１つ以上のアミノ酸の置換または付加を有し得る。例えば、ペプチドは、１つ以上の保存的置換もしくは非保存的置換を有し得る。特定の複数の実施形態においては、改変されたペプチドにはさらに、１つ以上のアミノ酸残基を含めることができる。例えば、Ｃ３４の改変されたペプチドは、任意に、２８位の本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換を有することができ、そして／あるいは、Ｌｙｓ残基（またはＣ末端に本明細書中に記載される反応性基（例えば、ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）に対して直接または間接的に共有結合させられるそのε−窒素原子で修飾されたリジン残基）を付加することができる。基Ｌｙｓ（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）においては、ＡＥＥＡ−ＭＰＡは、リジンのεＮＨ_２基に結合させられることが理解されるはずである。
【００３３】
本発明のＣ３４の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または改変された抗膜融合性ペプチドの限定ではない例としては、以下の配列が挙げられる：
ＣＡ化合物Ｉ：（Ｃ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４とも呼ばれる（配列番号３））。
【００３４】
【化６】

ＣＡ化合物ＩＩ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）とも呼ばれる（配列番号４））。
【００３５】
【化７】

ＣＡ化合物ＩＩＩ：（３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる（配列番号５））。
【００３６】
【化８】

および
ＣＡ化合物ＩＶ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換；３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる（配列番号６））。
【００３７】
【化９】

なお別の態様においては、本発明は、１つ以上の血液成分上の利用できる官能基に結合させられた１つ以上の化学反応性の改変を有している、本明細書中に記載される改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの結合体を特徴とする。本発明の１つの実施形態においては、改変されたペプチドには、血液成分上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に結合させられて安定な共有結合を形成する反応性基が含まれる。マレイミド基は改変されたペプチドに直接結合させることができ、また、例えばリンカー（例えば、本明細書中に記載されるようなリンカー）を介して間接的に結合させることもできる。本発明の別の実施形態においては、反応性基は血液タンパク質（アルブミンのような移動性の血液タンパク質を含む）上のチオール基と反応するマレイミドであり得る。ペプチド−反応性基アルブミン結合体は、約１：１のアルブミンに対するペプチドのモル比であり得る。通常、結合は、反応性基とヒトアルブミンのアミノ酸３４（Ｃｙｓ^３４）との間での共有結合によって起こる。
【００３８】
改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、結合体を形成するように１つ以上の血液成分（例えば、血清アルブミン）に共有結合する能力を有している反応性部分（例えば、マレイミド含有基）が含まれ得る。結合工程は、インビボで、例えば、対象に対する改変されたペプチドの投与後に起こり得る。あるいは、結合工程は、エキソビボまたはインビトロで、例えば、反応性基を含む改変されたペプチドが血液成分（例えば、アルブミン）と接触させられることによって起こり得る。Ｃ３４、ＤＰ１０７、ＤＰ１７８などの結合体の調製と使用は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられるＷＯ０２／０９６９３５およびＵＳ０５／００７０４７５に開示されている。インビボまたはエキソビボで形成させられた結合体は、対象（例えば、ヒト対象）においてＨＩＶ、ＲＳＶ、ＨＰＶ、ＭｅＶ、またはＳＩＶのようなウイルスのウイルス活性および／または膜融合性活性を阻害することにおいて有用である。
【００３９】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載される抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドあるいは改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドと薬学的に許容される担体を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を特徴とする。複数の実施形態においては、組成物は、注射（例えば、皮下注射または血管内注射）、ならびに肺送達、筋肉内送達、および／または腹腔内送達に適している。他の実施形態においては、組成物は製造プロセスに適している。
【００４０】
他の実施形態においては、組成物は濃縮され、例えば、約５から８までの範囲のｐＨの水溶液（例えば、等張性水溶液または高塩濃度の水溶液）中で、約１０ｍｇ／ｍｌから５００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから４００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから３００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから２００ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌから１８０ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌから１５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌから１２５ｍｇ／ｍｌ、または約９０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００４１】
別の態様においては、本発明は、本明細書中に記載される改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドあるいはそれらの結合体を含む、ウイルス感染の予防および／または処置に使用される方法と組成物を特徴とする。この方法には、ウイルス感染に伴う１つ以上の症状を軽減するために、本明細書中に記載される改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド、あるいはそれらの結合体の有効量（例えば、予防量または治療量）を処置が必要な対象（例えば、ヒト対象）に投与する工程が含まれる。処置または予防することができる例示的なウイルス感染としては、ＡＩＤＳ、ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。したがって、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド、あるいはそれらの結合体を使用してウイルスが関係している疾患または障害の１つ以上の症状を軽減する、または阻害する、あるいはその発症を防ぐ、または遅らせるための方法が開示される。予防的（例えば、疾患もしくは障害の１つ以上の症状の発症または再発を防ぐ、軽減する、あるいは遅らせるための）使用の場合には、対象は、疾患または障害の１つ以上の症状を有している場合も、また有していない場合もある。例えば、改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドあるいはそれらの結合体は、何らかの検出可能な症状の発現の前に、または全てではなく少なくとも一部の症状が検出された後に投与することができる。治療的使用の場合には、処置によって、対象の疾患または障害が改善する、治癒する、維持される、またはその期間が短くなり得る。治療的使用においては、対象は、症状の一部が発現している場合も、また症状が完全に発現している場合もある。典型的な場合には、処置によって、医師が検出可能な程度に対象の疾患または障害が改善するか、あるいは、疾患または障害の悪化が防がれる。
【００４２】
対象（例えば、ヒト対象）においてＨＩＶ、ＲＳＶ、ＨＰＶ、ＭｅＶ、またはＳＩＶの１つ以上の活性を阻害するための方法と組成物が開示される。この方法には、本明細書中に記載される改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド、あるいはそれらの結合体の有効量（例えば、予防量または治療量）を処置が必要な対象に投与する工程が含まれる。
【００４３】
本発明の改変されたペプチドはまた、精製と製造プロセスを容易にすることにおいても有用である。なぜなら、改変されたペプチドの高い溶解度によってより濃縮された反応溶液が可能となり、ひいては大規模な製造プロセスが容易となるからである。したがって、本発明はまた、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの溶解度を増大させるための方法も特徴とする。この方法には、１つ以上の極性部分（例えば、１つ以上のシステイン酸）を含む改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド（例えば、本明細書中に記載される改変されたペプチド）を提供する工程；および改変されたペプチドの溶液（例えば、本明細書中に記載される薬学的組成物、または製造調製物（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ））を調製する工程が含まれる。この方法には、任意に、溶液中の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの溶解度を決定する工程（例えば、溶液中の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの試料を得、そして試料の濁度および／または乳白光（ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ）を評価することによる）が含まれ得る。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドの調製（例えば、結合（例えば、大規模な結合））を促進するための方法を特徴とする。この方法には、１つ以上の極性部分（例えば、１つ以上のシステイン酸）を含む改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド（例えば、本明細書中に記載される改変されたペプチド）を提供する工程；および高濃度（例えば、本明細書中に記載されるような高濃度）の改変されたペプチドを有している改変されたペプチドの溶液を調製する工程が含まれる。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、冠詞「ａ」と「ａｎ」は、１つまたは２つ以上（例えば、少なくとも１つ）のその冠詞の文法上の対象物をいう。
【００４６】
用語「または」は、特段明記されない限りは、用語「および／または」を意味するように本明細書中で使用され、そして「および／または」と互換的に使用される。
【００４７】
用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は本明細書中では互換的に使用される。
【００４８】
「約」と「およそ」は、一般的には、測定の性質または精度を前提とした、測定された量についての許容される誤差の程度を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、提供される値または値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、通常は１０％以内、より典型的には５％以内である。
【００４９】
本出願全体を通じて引用される全ての刊行物、係属中の特許出願、公開された特許出願（ＷＯ０２／０９６９３５およびＵＳ０５／００７０４７５を含む）、および公開された特許の内容は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【００５０】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書と図面から、そして特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、天然のＣ３４（白四角）と比較した、対照の存在下の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中でのＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害（黒菱形）を示している線グラフである。
【図２】図２は、ヒト血清アルブミンに結合させたＣ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）（Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）：ＨＳＡ）（白四角）と比較した、対照の存在下でのＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害（黒菱形）を示している線グラフである。
【図３】図３は、Ｎ末端にシステイン酸を、そしてＣ末端に付加されたリジンのεＮＨ_２に結合させられたＡＥＥＡ−ＭＰＡ有しているＣ３４のアルブミン結合体（ヒト血清アルブミンに結合させられたＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）（ＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）：ＨＳＡ））（白四角）と比較した、対照の存在下でのＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害（黒菱形）を示している線グラフである。
【図４】図４は、ＭＰＡ−ＡＥＥＡリンカーによってＣ３４のトリプトファンのＮ末端αアミノ基に結合させられたアルブミンの結合体（本明細書中ではＰＣ−１５０５とも呼ばれる；ＭＰＡ−（ＡＥＥＡ）−Ｃ３４）（白四角）と比較した、対照の存在下でのＰＢＭＣ中のＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害（黒菱形）を示している線グラフである。
【図５】図５Ａは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与または皮下投与のいずれかの後の、Ｃ３４ペプチドと化合物ＶＩＩＩ（本明細書中ではＰＣ−１５０５；ＭＰＡ−（ＡＥＥＡ）−Ｃ３４；およびＡＣ−ＣｐｄＶＩＩＩとも呼ばれる）の薬物動態曲線を示す。図５Ｂは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットへの静脈内投与または皮下投与のいずれかの後のｒＨＡの薬物動態曲線と比較した、化合物ＶＩＩＩの薬物動態曲線を示す。曲線を重ねあわすことにより、ヒト血清アルブミンのシステイン３４に対する化学結合連結マレイミド−化合物ＶＩＩＩの安定性、さらには、腎臓でのクリアランスとペプチダーゼ消化に対する化合物ＶＩＩＩの安定性についての明白なサポートする証拠が提供される。
【図６】図６は、ＨＩＶ_ＩＩＩｂを使用したＰＢＭＣ中でのいくつかの改変された抗膜融合性ペプチドの活性の結果をまとめている表である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（発明の詳細な説明）
改変前のペプチドと比較して、生理学的ｐＨの水溶液中で高い溶解度を有している改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドが開示される。１つの実施形態においては、本発明のペプチドは、１つ以上の極性部分（例えば、１つ以上のシステイン酸）を含むように改変され、それにより水溶液中でのそれらの溶解度が増大する。改変されたペプチドにはさらに、改変されたペプチドが血液成分または担体タンパク質（例えば、アルブミン）上の利用できる官能基と反応できるように化学反応性部分を含めることができ、これにより改変されたペプチドのインビボでの安定性が増大する。本発明の改変されたペプチドは、多数のウイルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む）の感染を緩和するために、例えば、予防的および／または治療的に使用することができる。
【００５３】
特定の用語は以下のように定義される：
抗ウイルスペプチド：本明細書中で使用される場合は、「抗ウイルスペプチド」は、例えば、細胞−細胞融合または遊離ウイルス感染を阻害することにより、細胞のウイルス感染を阻害するペプチドをいうものとする。感染の経路には、膜融合（外被ウイルスの場合に生じる場合）またはウイルス構造および細胞構造に関与するいくつかの他の融合事象が含まれ得る。特定のウイルスによるウイルス感染を阻害するペプチドは、特定のウイルス（例えば、特に抗ＨＩＶペプチド、抗ＲＳＶペプチドなど）に関して言及され得る。
【００５４】
抗膜融合性ペプチド：「抗膜融合性ペプチド」は、ペプチドが存在しない場合に起こる膜融合のレベルと比較して、２つ以上の要素の間（例えば、ウイルス−細胞または細胞−細胞）での膜融合事象のレベルを阻害するかまたは減少させる能力を示すペプチドである。
【００５５】
ＨＩＶおよび抗ＨＩＶペプチド：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（これは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となる）は、レトロウイルスのレンチウイルファミリーのメンバーである。ＨＩＶには２つの一般的なタイプ：ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２があり、それぞれについて様々な株が同定されている。ＨＩＶは、ＣＤ−４＋細胞を標的化し、そしてウイルスの進入は、ＨＩＶタンパク質ｇｐ４１のＣＤ−４＋細胞表面受容体に対する結合に依存する。抗ＨＩＶペプチドは、ＨＩＶに対する抗ウイルス活性（遊離ウイルスによるＣＤ−４＋細胞感染の阻害、および／または感染したＣＤ−４＋細胞と非感染ＣＤ−４＋細胞との間でのＨＩＶに誘導される合胞体形成の阻害を含む）を示すペプチドをいう。
【００５６】
ＳＩＶおよび抗ＳＩＶペプチド：サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）は、感受性のあるサルにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）様の疾病を引き起こすレンチウイルスである。抗ＳＩＶペプチドは、ＳＩＶに対する抗ウイルス活性（ＳＩＶウイルスによる細胞の感染の阻害、および感染した細胞と非感染細胞との間での合胞体形成の阻害を含む）を示すペプチドである。
【００５７】
ＲＳＶおよび抗ＲＳＶペプチド：ＲＳウイルス（ＲＳＶ）は呼吸器病原体であり、このウイルスが細気管支炎（小通気道の炎症）および肺炎を引き起こす可能性がある乳児および小児においては特に危険である。ＲＳＶは逆鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ）の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルスのＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである。ＲＳＶの感染の経路は、通常は、気道（すなわち、鼻、喉頭、気管および気管支ならびに細気管支）により粘膜を介する。抗ＲＳＶペプチドは、ＲＳＶに対する抗ウイルス活性（遊離ＲＳＶウイルスによる粘膜細胞感染および感染した細胞と非感染細胞との間での合胞体形成の阻害を含む）を示すペプチドである。
【００５８】
ＨＰＶおよび抗ＨＰＶペプチド：ＲＳＶと同様に、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶまたはＨＰＶ）は呼吸器疾患の別の主原因であり、ＲＳＶと同様に、ウイルスのＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーである、逆鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＰＩＶには４種類の認識されている血清型（ＨＰＩＶ−１、ＨＰＩＶ−２、ＨＰＩＶ−３、およびＨＰＩＶ−４）がある。ＨＰＩＶ−１は、小児のクループの主原因であり、ＨＰＩＶ−１およびＨＰＩＶ−２の両方は、呼吸器上部および呼吸器下気の疾病を引き起こす。ＨＰＩＶ−３は、より頻繁に細気管支炎および肺炎に関与する。抗ＨＰＶペプチドは、ＨＰＶに対する抗ウイルス活性（遊離ＨＰＶウイルスによる感染および感染した細胞と非感染細胞との間での合胞体形成の阻害を含む）を示すペプチドである。
【００５９】
Ｍｅｖおよび抗Ｍｅｖペプチド：麻疹ウイルス（ＶＭまたはＭｅＶ）は、ウイルスのＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属する、外被逆鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶおよびＨＰＶと同様に、ＭｅＶは呼吸器疾患を引き起こし、そしてまた、さらなる日和見感染の原因となる免疫抑制も生じる。場合によっては、ＭｅＶは、脳の感染を確立し、重篤な神経性合併症を導く可能性がある。抗ＭｅＶペプチドは、Ｍｅｖに対する抗ウイルス活性（遊離Ｍｅｖウイルスによる感染および感染した細胞と非感染細胞との間での合胞体形成の阻害を含む）を示すペプチドである。
【００６０】
Ｃ３４およびＣ３４アナログ：用語「Ｃ３４」は、ｇｐ４１コイルドコイルキャビティ結合残基の部分をいう。例えば、このペプチドにはｇｐ４１の残基^６２８ＷＭＥＷ^６３１（配列番号１）、またはｇｐ４１の残基^６２８ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ^６６１（配列番号２）が含まれ得る。
【００６１】
Ｃ３４のアナログには、それらの短縮型、欠失型、挿入型、および／またはアミノ酸置換型（例えば、保存的置換もしくは非保存的置換）が含まれ得る。欠失は、Ｃ３４ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の除去からなり得、これには、ペプチド配列の１つの連続する部分、または複数の部分の除去が含まれる場合もある。挿入には、１つのアミノ酸残基またはひとつづきの残基が含まれ得、挿入は、Ｃ３４ペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端、またはペプチドの内部位置に作製され得る。
【００６２】
ＤＰ−１７８およびＤＰ１７８アナログ：特段明記されるか、または文脈により明らかにされない限りは、ＤＰ−１７８は、ＨＩＶ−１単離物ＬＡＩ（ＨＩＶ_ＬＡＩ）のｇｐ４１糖タンパク質のアミノ酸残基６３８-６７３に相当し、配列：ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号７）を有する３６アミノ酸のＤＰ−１７８ペプチドを意味する。
【００６３】
ＤＰ１７８のアナログには、それらの短縮型、欠失型、挿入型、および／またはアミノ酸置換型（例えば、保存的置換もしくは非保存的置換）が含まれ得る。ペプチドの短縮には、３〜３６の間のアミノ酸のペプチドが含まれ得る。欠失は、ＤＰ１７８ペプチドからの１つ以上のアミノ酸残基の除去からなり得、これには、ペプチド配列の１つの連続する部分または複数の部分の除去が含まれる場合もある。挿入には、１つのアミノ酸残基またはひとつづきの残基が含まれ得、挿入は、ＤＰ１７８ペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端、またはペプチドの内部位置に作製され得る。
【００６４】
ＤＰ１７８ペプチドアナログは、そのアミノ酸配列がＤＰ１７８が由来するｇｐ４１領域に対応するＨＩＶ−１_ＬＡＩ以外のウイルスのペプチド領域、ならびにそれらの短縮型、欠失型、または挿入型のアミノ酸配列からなるペプチドである。このような他のウイルスとしては、他のＨＩＶ単離物（例えば、ＨＩＶ−２_ＮＩＨＺ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）および麻疹ウイルス（ＭｅＶ））が挙げられるがこれらに限定されない。ＤＰ１７８アナログはまた、ＡＬＬＭＯＴＩ５、１０７×１７８×４およびＰＬＺＩＰ検索モチーフ（米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号および同第６，０２０，４５９号に記載されており、そして本明細書中に引用される）により同定されるかまたは認識されるこれらのペプチド配列をいい、これらは、ＤＰ１７８に対して構造的類似性および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有する。ＤＰ１７８アナログはさらに、この用語が米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号、および同第６，０２０，４５９号において定義されているように、「ＤＰ１７８様」と記載されるペプチドをいう。
【００６５】
ＤＰ１０７およびＤＰ１０７アナログ：特段明記されないか、または文脈によって明らかにされない限りは、ＤＰ１０７は、ＨＩＶ−１単離物ＬＡＩ（ＨＩＶ_ＬＡＩ）のｇｐ４１タンパク質のアミノ酸残基５５８〜５９５に相当し、配列：ＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＱＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号８）を有する、３８アミノ酸のＤＰ１０７ペプチドを意味する。
【００６６】
ＤＰ１０７のアナログには、その短縮型、欠失型、挿入型、および／またはアミノ酸置換型（例えば、保存的置換もしくは非保存的置換）が含まれ得る。ペプチドの短縮には、３〜３８の間のアミノ酸のペプチドが含まれ得る。欠失は、ＤＰ１０７ペプチドからの１つ以上のアミノ酸残基の除去からなり得、これには、ペプチド配列の１つの連続する部分または複数の部分の除去が含まれる場合もある。挿入には、１つのアミノ酸残基またはひとつづきの残基が含まれ得、挿入は、ＤＰ１０７ペプチドのカルボキシ末端もしくはアミノ末端、またはペプチドの内部位置に作製され得る。
【００６７】
ＤＰ１０７ペプチドアナログは、これらのアミノ酸配列が、ＤＰ１０７が由来するｇｐ４１領域に対応するＨＩＶ−１_ＬＡ１、ならびにそれらの短縮型、欠失型、および／または挿入型以外のウイルスのペプチド領域のアミノ酸配列からなるペプチドである。このような他のウイルスとしては、他のＨＩＶ単離物（例えば、ＨＩＶ−２_ＮＩＨＺ、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、および麻疹ウイルス（ＭｅＶ））を挙げることができるが、これらに限定されない。ＤＰ１０７アナログはまた、米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号および６，０２０，４５９号に記載されており、そして本明細書中に引用されるＡＬＬＭＯＴＩ５、１０７×１７８×４およびＰＬＺＩＰ検索モチーフによって同定されたかまたは認識されたこれらのペプチド配列をいい、これらはＤＰ１０７に対して構造的類似性および／またはアミノ酸モチーフ類似性を有する。ＤＰ１０７アナログは、この用語が、米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号および６，０２０，４５９号に定義されているように、さらに、「ＤＰ１０７様」と記載されるペプチドもいう。
【００６８】
反応性基：反応性基は、共有結合を形成することができる化学基である。このような反応性基は、Ｃ３４、ＤＰ−１０７、ＤＰ−１７８、もしくはＴ−１２４９ペプチドまたはそれらのアナログ、あるいは目的の他の抗ウイルスペプチドまたは抗膜融合性ペプチドに連結させられるか、または結合させられる。反応性基は、一般的には、水性環境中で安定であり、そして通常は、カルボキシ基、ホスホリル基、または従来のアシル基であり、エステルまたは混合無水物のいずれか、あるいはイミデートとして存在し、それによって、移動性の血液成分上の標的部位の、アミノ基、ヒドロキシまたはチオールのような官能基と共有結合を形成することができる。大部分については、これらのエステルは、フェノール性化合物を含むか、またはチオールエステル、アルキルエステル、リン酸エステルなどである。
【００６９】
官能基：官能基は、改変された抗ウイルスペプチド上の反応性基が反応して共有結合を形成する、血液成分上の基である。官能基としては、通常、エステル反応性部分に結合するためのヒドロキシル基、マレイミド、イミデート、およびチオエステル基に結合するためのチオール基；カルボキシ基、ホスホリル基、またはアシル基に結合するためのアミノ基、およびアミノ基に結合するためのカルボキシル基が挙げられる。
【００７０】
血液成分または担体タンパク質：血液成分は、固定されている場合も、また移動性である場合もある。固定された血液成分は非移動性の血液成分であり、これには、組織、膜受容体、間質タンパク質、フィブリンタンパク質、コラーゲン、血小板、内皮細胞、上皮細胞、およびそれらが結合した膜および膜受容体、身体の細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｂｏｄｙ ｃｅｌｌ）、骨格細胞および平滑筋細胞、神経成分、骨細胞および破骨細胞、ならびに全ての身体組織（特に、循環系およびリンパ系に関連するもの）が含まれる。移動性の血液成分は、任意の長い期間にわたって（一般的には５分を超えない、より通常は１分間）固定された状態にはない血液成分である。これらの血液成分は、膜結合しておらず、そして長期間にわたって血液中に存在し、そして少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で存在する。移動性の血液成分には担体タンパク質が含まれる。移動性の血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチン、および免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭおよびＩｇＧ）が挙げられる。移動性の血液成分の半減期は、少なくとも約１２時間である。血液成分のさらなる例としては、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、およびα−２−マクログロブリンが挙げられる。通常は、血清アルブミンおよびＩｇＧがより好ましく、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）が最も好ましい。アルブミンはまた、組み換えによって、またはゲノム供給源（例えば、酵母、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、トランスジェニック植物、トランスジェニック動物）に由来する場合もある。したがって、用語「血液成分」には、対象から生化学的に精製されたタンパク質、ならびに組み換えによって作製されたタンパク質が含まれる。
【００７１】
保護基：保護基は、ペプチド誘導体をそれ自体と反応しないよう保護するために利用される化学部分である。様々な保護基が、本明細書中に開示され、そして米国特許第５，４９３，００７号（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）にも開示されている。このような保護基としては、アセチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）などが挙げられる。特定の保護されたアミノ酸が表１に示される。
【００７２】
【表１】

連結基：連結（スペーサー）基は、反応性部分を抗ウイルスペプチドまたは抗膜融合性ペプチドに連結させるかまたは接続する、化学部分である。連結基には、１つ以上のアルキル部分、アルコキシ部分、アルケニル部分、アルキル部分で置換されたアルキニル部分またはアミノ部分、シクロアルキル部分、多環式部分、アリール部分、ポリアリール部分、置換されたアリール部分、複素環式部分、および置換された複素環式部分が含まれ得る。連結基には、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）；１つ以上のアルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ１０）（例えば、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、８−アミノプロパン酸（ＡＰＡ）、または４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ））が含まれ得る。
【００７３】
感受性官能基：感受性官能基は、抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチド上に可能性のある反応部位を提示する原子の群である。存在する場合には、感受性官能基は、リンカー−反応性基改変のための付着点として選択され得る。感受性官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、およびヒドロキシル基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
改変されたペプチド：改変されたペプチドは、反応性基の付着によって改変された抗ウイルスおよび／または抗膜融合性ペプチドである。反応性基は、連結基を介して、または任意に連結基を使用することなくのいずれかで、ペプチドに付着させられ得る。１つ以上のさらなるアミノ酸がペプチドに付加されて、反応性部分の付着が容易にされ得ることもまた想定される。改変されたペプチドは、血液成分との結合がインビボで起こるように、インビボで投与され得るか、またはこれらは、最初に血液成分または担体タンパク質に対してインビトロで結合させられ（例えば、組み換えによって生産されたタンパク質（例えば、組み換え体アルブミン、免疫グロブリン、またはトランスフェリン）を使用して）、そして得られた結合ペプチド（以下に定義される）が、インビボで投与され得る。
【００７５】
結合ペプチド：結合ペプチドは、改変されたペプチドの反応性基と血液成分の官能基との間で形成された（連結基を伴うか、または伴わないで）共有結合を介して血液成分に結合させられた、改変されたペプチドである。本出願全体を通じて使用される場合には、用語「結合ペプチド」は、特定の結合ペプチド（例えば、「結合Ｃ３４」または「結合ＤＰ１０７」）をいうように、より特化され得る。
【００７６】
複数の実施形態においては、本発明の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドには、結合体を形成するように血液成分（より具体的には、血清アルブミン）に共有結合する能力を有しているマレイミド含有基が含まれる。対象への抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドのマレイミド誘導体の投与によって、血液成分（例えば、血清アルブミン）に対するペプチドのインビボでの結合が生じ得る。改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドを血液成分または担体タンパク質（例えば、アルブミン）と接触させることによって、エキソビボ（またはインビボ）で結合体を調製することもまた本発明に含まれる。この場合は、アルブミンは、様々な供給源から（例えば、血液試料中、精製されたアルブミン、組み換え体アルブミン（アルブミンの改変された形態（例えば、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する形態）を含む）など）提供することができる。Ｃ３４とアルブミンの結合体の調製と使用は、ＷＯ０２／０９６９３５に十分に開示されており、同様の調製と使用が本発明の結合体に適用される。対象の中でインビボで形成させられた結合体とエキソビボで調製された結合体はいずれも、対象に投与される場合には、対応する融合ペプチド阻害剤（ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の抗膜融合活性を示すために、したがって、対象においてＨＩＶ、ＲＳＶ、ＨＰＶ、ＭｅＶ、またはＳＩＶの活性を阻害するために有用である。
【００７７】
これらの定義を考慮すると、本発明は、存在する抗ウイルスペプチドおよび抗膜融合性ペプチドの特性を利用する。ペプチドによって阻害され得るウイルスとしては、例えば、米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号および同第６，０２０，４５９号において表Ｖ〜ＶＩＩおよびＩＸ〜ＸＩＶに列挙されたウイルスのすべての種が挙げられるが、これらに限定されない。これらのウイルスとしては、例えば、ヒトレトロウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびヒトＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ）を含む）、および非ヒトレトロウイルス（ウシ白血症ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ白血症ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サル肉腫ウイルス、サル白血病、およびヒツジ進行性肺炎ウイルスを含む）が挙げられる。非レトロウイルスウイルスはまた、本発明のペプチドによって阻害され得、これには以下が含まれる：ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）、イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルマソン−ファイザーウイルス。非外被ウイルスはまた本発明のペプチドによって阻害され得、そして非外被ウイルスとしては、ピコルナウイルス（例えば、ポリオウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス）、パルボウイルス、アデノウイルス、およびレオウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
一例として、本出願の背景のセクションで議論されたように、ＨＩＶ融合タンパク質の作用機構が記載されており、そしてペプチドの抗ウイルス特性および抗膜融合特性は十分に確立されている。カルボキシ末端の外部ドメイン配列に対応する合成ペプチド（例えば、ＬＡＩ株のＨＩＶ−１クラスＢのアミノ酸残基６４３〜６７８、または類似する株に由来する残基６３８〜６７３、ならびに残基５５８〜５９５）は、低濃度でウイルスに媒介される細胞と細胞の融合を完全に阻害することが示されている。本発明のペプチドは、天然のウイルスｇｐ４１のロイシンジッパー領域と競合し、それによりウイルスの細胞内への融合／感染の干渉が生じる。
【００７９】
本発明によってはさらに、ＤＡＣ（商標）（Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ）技術を用いて、選択された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドを改変し、タンパク質担体上へのペプチドの選択的結合を通じて、このペプチドに対して生体利用性、半減期の延長、およびより優れた分布を付与するために使用される、ペプチドの抗ウイルス特性を改変することのない方法と試薬が提供される。本発明のために選択されたる担体（しかし、これに限定されない）は、マレイミド部分で改変された抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドによるその遊離のチオールを通じて結合させられたアルブミンである。
【００８０】
抗ウイルス阻害剤および／または抗膜融合性阻害剤
いくつかのペプチド配列は、ＨＩＶ−１融合／感染の予防について極めて強力であると文献に記載されている。例として、ペプチドＣ３４、ＤＰ１０７、ＤＰ１７８は、融合に関係があるｇｐ４１の立体構造に結合する。従って、本発明の１つの実施形態においては、Ｃ３４様、ＤＰ１７８様、およびＤＰ１７８様ペプチドが改変される。同様に、本発明の他の実施形態には、ＨＩＶに対して使用されるＣ３４様、ＤＰ１０７様、およびＤＰ１０７様ペプチド、ならびにＲＳＶ、ＨＰＶ、ＭｅＶおよびＳＩＶウイルス中に見られるＤＰ１０７およびＤＰ１７８のペプチドアナログの改変が含まれる。
【００８１】
改変されたＣ３４ペプチドまたはアナログ
特定の複数の実施形態においては、本発明の改変されたＣ３４ペプチドには、以下の式（Ｉ）を有する化合物であり得る、ペプチドに含められるさらなる基が含まれる。
【００８２】
（ＶＩＩＩ）（Ｒ_１）_ｍ−Ｘ−（Ｒ_２）_ｎ
式（ＶＩＩＩ）においては、ｍとｎの和は少なくとも１であり、ｍとｎはそれぞれが０以上の整数である。例えば、ｍが０である場合は、ｎは１以上であり、ｎが０である場合は、ｍは１以上である。Ｘは、ペプチド、ペプチド断片、またはタンパク質、例えば、Ｃ３４、Ｔ２０、Ｔ１２４９、あるいは、それらの誘導体（例えば、それらのマレイミド誘導体を含む）である。Ｒ_１が存在し、Ｒ_２が存在しない場合は、Ｒ_１はＸ基のＮ末端に存在する。Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２が存在する場合は、Ｒ_２はＸ基のＣ末端に存在する。
【００８３】
特定の例においては、Ｒ_１とＲ_２はそれぞれ独立して、式（ＩＸ）を有する化合物から選択され得る。
【００８４】
【化１０】

式（ＩＸ）のコア構造はアミノ酸のコア構造と類似しており、これにはアミノ基、α炭素、およびカルボキシル基が含まれる。ペプチド誘導体中のＲ_１基とＲ_２基の正確な位置に応じて、複数の基を式（ＩＸ）中の様々な原子を介してペプチドに結合させることができる。例えば、Ｒ_１が式（ＩＸ）を有する化合物である場合には、Ｒ_１を式（ＩＸ）のカルボキシル基を介してペプチドに結合させて、Ｒ_１のカルボキシル基とペプチドのアミノ基との間にペプチド結合をもたらすことができる。Ｒ_２が式（ＩＸ）を有する化合物である場合には、Ｒ_２を式（ＩＸ）のアミノ基を介してペプチドに結合させて、Ｒ_２のアミノ基とペプチドのカルボキシ基との間にペプチド結合をもたらすことができる。
【００８５】
いくつかの例においては、式（ＩＸ）のＲ_３基は、２０種類の自然界に存在しているアミノ酸の中に一般的に見られる極性の電荷を持たない基以外の、任意の極性の電荷を持たない基であり得る。例えば、Ｒ_３基は、スルホニル基（ＨＳ＝（Ｏ）_２）、スルホキシド基（ＨＳ＝Ｏ）、スルホン酸基（ＨＯ−Ｓ＝（Ｏ）_２）、ハロアルキル基、二級アミン、三級アミン、ヒドロキシル基、または極性であるかもしくは全くの中性であり、水溶液中でのペプチド誘導体の全体的な可溶性を増大させることができる他の側鎖基であり得るか、あるいは、それらを含み得る。例えば、水素結合することができる基を持つ側鎖は、ペプチドの全体的な溶解度を増大させるために使用され得る。特定の例においては、側鎖は、リンカーまたは他の種との望ましくない副反応が実質的な程度には起こらないように、非反応性であることが好ましい。いくつかの例においては、Ｒ_３についての上記基はα炭素から間隔をあけて、例えば、１〜３個の炭素原子の間隔をあけて存在し得る。
【００８６】
特定の例においては、Ｒ_３は、式（Ｘ）−（ＸＶ）を有する化合物が提供されるように選択され得る。
【００８７】
【化１１】

本明細書中に開示されるペプチドの溶解度を増大させることができるさらなる適切な側鎖は、本開示の利点を前提として、当業者によって容易に選択されるであろう。
【００８８】
特定の複数の実施形態においては、Ｒ_１基とＲ_２基は、ペプチド結合体の二次構造全体に、または特定の場合には三次構造には実質的には影響を及ぼさない。ペプチド結合体の二次構造に実質的には影響を及ぼさないことにより、ペプチド結合体の全体的な活性は、誘導体化されていないペプチドの全体的な活性よりも感知できるほどに下回ることはないはずである。
【００８９】
他の実施形態においては、ペプチド誘導体は、式（ＸＶＩ）に示されるような組成物の形態をとり得る。
【００９０】
（ＸＶＩ） Ｘ_１−（Ｒ_１）_ｍ−Ｘ_２−（Ｒ２）_ｎ
式（ＸＶＩ）においては、Ｘ_１とＸ_２は、互いに連結させられると、例えば、Ｃ３４、Ｔ２０、もしくはＴ１２４９を提供するであろうペプチドの部分を提示する。式（ＸＶＩ）においては、Ｒ_１とＲ_２は、式（ＩＸ）に関して上記で議論された基のうちの任意のものであり得、ｍとｎの和は１以上の整数であり、ｍまたはｎのいずれかが０であり得る可能性がある。式（ＸＶＩ）においては、ペプチド鎖の中央に基が挿入されている。そのような挿入は、ペプチドの酵素消化、それに続くＲ_１基もしくはＲ_２基またはそれらの両方の挿入、次いでペプチド断片を互いに結合させることを含む多くの様々な方法を使用して行われ得る。
【００９１】
本明細書中に記載されるＣ３４のシステイン酸誘導体の合成は、ペプチドの作製の間の手作業による介入を伴うＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒの自動化された固相手順を使用して行われる（本明細書中の実施例１〜５を参照のこと）。合成は、Ｆｍｏｃ保護されたＲａｍａｇｅアミドリンカー樹脂上で、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用して行った。カップリングは、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を活性化因子の混合物としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中で使用することによって行った。Ｆｍｏｃ保護基を２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。ペプチドが樹脂から切り離されると遊離のＮ_α末端が生じるように、Ｂｏｃ保護されたアミノ酸をＮ末端に使用した。シグマコーティッドガラス反応容器を合成の際に使用した。
【００９２】
特定の複数の実施形態においては、ペプチドの部分は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８６．Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３２：３４１−３４７によって記載されているように従来の固相合成技術を使用して合成され得る。簡単に説明すると、ブロッキング基がアミノ酸のＮ末端に付加され、アミノ酸のカルボキシル基はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）との反応によって活性化され得る。活性化されたアミノ酸は、遊離のＮ末端と樹脂またはビーズに結合させられたＣ末端を有しているアミノ酸と反応させられ得る。アミノブロックされたジペプチジル化合物の形成の後、酸処理によってイソブチレン、二酸化炭素、および樹脂もしくはビーズに結合させられたジペプチドの生産が生じる。さらなるアミノ酸が、これらの工程を繰り返すことによってジペプチドビーズに対して付加され得る。加えて、本明細書中に開示されるアミノ酸誘導体はまた、類似する反応を使用して鎖に沿った任意の点でペプチド鎖に付加される場合もある。したがって、式（ＩＸ）を有する化合物を提供するために所望されるペプチド中のどの位置にでもＲ_１基またはＲ_２基を挿入することが可能である。
【００９３】
特定の複数の実施形態においては、本明細書中に開示される化合物は、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端に、またはペプチドの１つ以上のアミノ酸の側鎖を介して、１つ以上のさらなる基に連結させられ得る。例えば、式（ＸＶＩＩ）−（ＸＸ）に模式的に示される組成物が作成され得る。
【００９４】
【化１２】

式（ＸＶＩＩ）−（ＸＸ）においては、Ｌは、例えば、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、２−［２−（２−アミノ）エトキシ］エトキシ酢酸（ＡＥＡＡ）、アルキル鎖モチーフ（Ｃ１〜Ｃ１０）（例えば、グリシン）、３−アミノプロピオン酸（ＡＰＡ）、８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）などのようなリンカーであり、Ｒ_１とＲ_２は、本明細書中で議論された基のうちの任意のものであり得る。リンカーは、ペプチドの任意のアミノ酸を介して、例えば、ペプチド中のリジンのεアミノ基を介して、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合させられ得る。Ｘ基、Ｘ_１基、およびＸ_２基は、ペプチド（Ｘ）またはペプチド断片（Ｘ_１およびＸ_２）である。式（ＸＩＸ）および式（ＸＸ）中に示されるＰ基は、リンカーＬを介して誘導されたペプチドに結合させることができるタンパク質を示す。例示的なタンパク質としては、血液タンパク質、ヒト血清アルブミン、組み換え体アルブミン、または他の適切なタンパク質が挙げられる。
【００９５】
タンパク質結合体（式（ＸＩＸ）および式（ＸＸ））は、エキソビボまたはインビボで生産され得る。インビボでの生産が行われる場合には、化合物（例えば、式（ＸＶＩＩ）および式（ＸＶＩＩＩ）に示されるもの）が対象に導入され得、インビボタンパク質（例えば、アルブミン）と反応させられ得る。
【００９６】
本発明のＣ３４の改変された抗ウイルスペプチドおよび／または改変された抗膜融合性ペプチドの限定ではない例としては、以下の配列が挙げられる：
ＣＡ化合物Ｉ：（Ｃ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４とも呼ばれる（配列番号３））。
【００９７】
【化１３】

ＣＡ化合物ＩＩ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）とも呼ばれる（配列番号４））。
【００９８】
【化１４】

ＣＡ化合物ＩＩＩ：（３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる（配列番号５））。
【００９９】
【化１５】

ＣＡ化合物ＩＶ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換；３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる（配列番号６））。
【０１００】
【化１６】

本出願の教示に従って改変することができる改変されたＣ３４ペプチドのさらなる例にはまた、以下のアミノ酸配列も含まれる：
【０１０１】
【化１７】

【０１０２】
【化１８】

改変されたＣ３４ペプチドの限定ではない例は、以下に示される式Ｉ〜式ＶＩＩＩの化合物であり、これらはインビボまたはエキソビボのいずれかで血液成分上のチオール基と反応させて安定な共有結合を形成させることができる。これらの化合物の合成はＷＯ０２／０９６９３５（その内容は引用により本明細書中に具体的に組み入れられる）に記載されている。
【０１０３】
【化１９】

【０１０４】
【化２０】

ＤＰ１７８およびＤＰ１０７
ＤＰ１７８ペプチド
ＤＰ１７８ペプチドは、ＨＩＶ−１_ＬＡＩ単離物に由来する膜貫通タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸残基６３８から６７３に相当し、３６アミノ酸の配列を有する（アミノ末端からカルボキシ末端に向かって読まれる）：
ＮＨ_２−ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ−ＣＯＯＨ（配列番号７）
全長のＤＰ１７８（３６マー）に加えて、本発明のペプチドには３個から３６個の間のアミノ酸残基のペプチドを含むＤＰ１７８ペプチドの短縮型（すなわち、トリペプチドから３６マーのポリペプチドまでの範囲のペプチド）が含まれる。これらの短縮型ペプチドは表２および表３に示される。
【０１０５】
加えて、ＤＰ１７８ペプチドのアミノ酸置換型もまた本発明の範囲内にある。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２外被タンパク質は構造的には異なるが、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のＤＰ１７８に対応する領域内には著しいアミノ酸保存が存在する。アミノ酸の保存は、周期性の性質であり、これは構造および／または機能のいくらかの保存を示唆している。従って、アミノ酸置換の１つの可能なクラスには、本発明のＤＰ１７８ペプチドの構造を安定化させると推定さられるこれらのアミノ酸の変化が含まれる。本明細書中に記載されるＤＰ１７８およびＤＰ１７８アナログの配列を利用して、当業者は容易にＤＰ１７８コンセンサス配列を作製し、そして好ましいアミノ酸置換を提示する保存されたアミノ酸残基を、これらから確定することができる。
【０１０６】
アミノ酸置換は保存された性質の置換である場合も、また保存されていない性質の置換である場合もある。保存されたアミノ酸置換は、類似する電荷、大きさ、および／または疎水性特性のアミノ酸での、ＤＰ１７８ペプチド配列の１以上のアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）へのアミノ酸置換）からなる。非保存的置換は、類似していない電荷、大きさ、および／または疎水性特性を有しているアミノ酸での、ＤＰ１７８ペプチド配列の１以上のアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）のバリン（Ｖ）への置換）からなる。
【０１０７】
ＤＰ１７８のアミノ酸の挿入は、１つのアミノ酸残基または残基のひとつづきの残基からなり得る。挿入は、ＤＰ１７８またはＤＰ１７８短縮ポリペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端に、ならびにペプチドに対する内部位置に作製され得る。
【０１０８】
このような挿入は、一般的には２〜１５アミノ酸の長さの範囲であろう。目的のペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに作製された挿入はより広い大きさの範囲の挿入であり得、約２〜約５０アミノ酸の挿入が好ましいことが意図される。１つ以上のそのような挿入は、そのような挿入が上記の１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５またはＰＬＺＩＰ検索モチーフによってなおも認識されされ得るペプチドを生じる限りは、ＤＰ１７８またはＤＰ１７８短縮型に導入され得る。
【０１０９】
好ましいアミノ末端への挿入またはカルボキシ末端への挿入は、約２〜約５０のアミノ酸残基の長さの範囲のペプチドであり、これらは、実際のＤＰ１７８ ｇｐ４１アミノ酸配列に対して、それぞれアミノまたはカルボキシのいずれかのｇｐ４１タンパク質領域に対応する。従って、好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端へのアミノ酸の挿入には、ｇｐ４１タンパク質のＤＰ１７８領域に対してすぐアミノ側またはカルボキシ側に見られるｇｐ４１アミノ酸配列が含まれるであろう。
【０１１０】
ＤＰ１７８またはＤＰ１７８短縮型の欠失もまた本発明の範囲に含まれる。このような欠失は、ＤＰ１７８またはＤＰ１７８様ペプチド配列からの１以上のアミノ酸の除去からなり、得られるペプチド配列の長さの下限は、４〜６アミノ酸である。
【０１１１】
このような欠失には、ペプチド配列の１つの連続する部分または１つより多くの不連続な部分が含まれ得る。１以上のこのような欠失は、このような欠失が上記の１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５またはＰＬＺＩＰ検索モチーフによって、なおも認識されされ得るペプチドを生じる限りは、ＤＰ１７８またはＤＰ１７８短縮型に導入され得る。
【０１１２】
ＤＰ１０７ペプチド
ＤＰ１０７は３８アミノ酸のペプチドであり、これは強力な抗ウイルス活性を示し、そしここに示されるＨＩＶ−１_ＬＡ１単離体膜貫通（ＴＭ）ｇｐ４１糖タンパク質の残基５５８〜５９５に対応する：
ＮＨ_２−ＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＱＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ−ＣＯＯＨ（配列番号１７）。
【０１１３】
全長のＤＰ１０７の３８マーに加えて、ＤＰ１０７ペプチドには、３個から３８個の間のアミノ酸残基のペプチドを含むＤＰ１０７ペプチドの短縮（すなわち、トリペプチドから３８マーのポリペプチドまでの大きさの範囲のペプチド）が含まれる。これらのペプチドは、ＵＳ２００５／００７０４７５の表４および表５に示される。
【０１１４】
加えて、ＤＰ１７８ペプチドのアミノ酸置換体もまた本発明の範囲に含まれる。ＤＰ１７８と同様に、これもまた周期性の性質のものである、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のＤＰ１０７に対応する領域内にもまた高度なアミノ酸保存が存在し、これは、構造および／または機能の保存を示唆している。従って、アミノ酸置換の１つの可能なクラスには、本発明のＤＰ１０７ペプチドの構造を安定化させると推定されるこれらのアミノ酸の変化が含まれる。本明細書中に記載されるＤＰ１０７およびＤＰ１０７アナログ配列を利用して、当業者は、容易にＤＰ１０７コンセンサス配列を作製し、そして好ましいアミノ酸置換を提示するであろう保存されたアミノ酸残基を、これらから確定することができる。
【０１１５】
アミノ酸置換は保存された性質の置換である場合も、また保存されていない性質の置換である場合もある。保存的アミノ酸置換は、類似する電荷、大きさ、および／または疎水性特性のアミノ酸での、ＤＰ１０７ペプチド配列の１以上のアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）のアスパラギン酸（Ｄ）へのアミノ酸置換）からなる。非保存的置換は、類似していない電荷、大きさ、および／または疎水性特性を有しているアミノ酸での、ＤＰ１０７ペプチド配列の１以上のアミノ酸の置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）のバリン（Ｖ）への置換）からなる。
【０１１６】
アミノ酸の挿入は、単一のアミノ酸残基またはひとつづきの残基からなり得る。挿入は、ＤＰ１０７またはＤＰ１０７短縮型ペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端に、ならびにペプチドに対して内部位置に作製され得る。
【０１１７】
このような挿入は、一般的には、２〜１５アミノ酸の長さの範囲であろう。目的のペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに作製された挿入はより広い大きさの範囲の挿入であり得、約２〜約５０アミノ酸が好ましいことが意図される。１以上のこのような挿入は、このような挿入が上記の１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５またはＰＬＺＩＰ検索モチーフによってなおも認識されされ得るペプチドを生じる限りは、ＤＰ１０７またはＤＰ１０７短縮型に導入され得る。
【０１１８】
好ましいアミノ末端への挿入またはカルボキシ末端への挿入は、約２〜約５０までのアミノ酸残基の長さの範囲のペプチドであり、実際のＤＰ１０７ ｇｐ４１アミノ酸配列に対して、それぞれアミノまたはカルボキシのいずれかでｇｐ４１タンパク質領域に対応する。従って、好ましいアミノ末端またはカルボキシ末端へのアミノ酸の挿入には、ｇｐ４１タンパク質のＤＰ１０７領域に対してすぐアミノ側またはカルボキシ側に見られるｇｐ４１アミノ酸配列が含まれる。
【０１１９】
ＤＰ１０７またはＤＰ１０７短縮型の欠失もまた本発明の範囲に含まれる。このような欠失は、ＤＰ１０７またはＤＰ１０７様ペプチド配列からの１以上のアミノ酸の除去からなり、得られるペプチド配列の長さの下限は、４〜６アミノ酸である。
【０１２０】
このような欠失には、ペプチド配列の１つの連続する部分または１つより多くの不連続な部分が含まれ得る。１以上のこのような欠失は、このような欠失が上記の１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５またはＰＬＺＩＰ検索モチーフによってなおも認識されされ得るペプチドを生じる限りは、ＤＰ１０７またはＤＰ１０７短縮型に導入され得る。
【０１２１】
ＤＰ１０７およびＤＰ１０７短縮型は、米国特許第５，６５６，４８０号にさらに十分に記載されている。
【０１２２】
ＤＰ１０７およびＤＰ１７８アナログ
上記の本発明のＤＰ１７８、ＤＰ１７８短縮型、ＤＰ１０７およびＤＰ１０７短縮型配列のアナログに対応するペプチドは、他のウイルス（例えば、非ＨＩＶ−１外被ウイルス、非外被ウイルスおよび他の非ウイルス性生物を含む）中に見ることができる。
【０１２３】
このようなＤＰ１７８アナログおよびＤＰ１０７アナログは、例えば、外被化されたウイルスの膜貫通（「ＴＭ」）タンパク質中に存在するペプチド配列に対応し得、そして非外被生物および非ウイルス性生物中に存在するペプチド配列に対応し得る。このようなペプチドは、抗膜融合性活性、抗ウイルス活性、最も具体的には天然の配列が見られるウイルスに特異的である抗ウイルス活性を示す場合があり、また、コイルドコイルペプチド構造が関与している細胞間プロセスを調節する能力を示す場合もある。
【０１２４】
ＤＰ１７８アナログ
ＤＰ１７８アナログは、そのアミノ酸配列が、例えば、ＤＰ１７８が誘導されたｇｐ４１ペプチド領域に対応する他の（すなわち、ＨＩＶ−１以外の）ウイルスのペプチド領域のアミノ酸配列からなるペプチドである。そのようなウイルスとしては、他のＨＩＶ−１単離物およびＨＩＶ−２単離物を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２５】
他の（すなわち、非ＨＩＶ−１ＬＡＩ）ＨＩＶ−１単離体の対応するｇｐ４１ペプチド領域由来のＤＰ１７８アナログとしては、例えば、以下に示されるペプチド配列を挙げることができる。
【０１２６】
【化２１】

配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０のペプチドは、それぞれ、ＨＩＶ−ｌ_ＳＦ２、ＨＩＶ−１_ＲＦ、およびＨＩＶ−１_ＭＮに由来する。他のＤＰ１７８アナログとしてはＨＩＶ−２から誘導されたアナログが挙げられ、これには、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号６および配列番号７のペプチドが含まれる（これらはそれぞれ、ＨＩＶ−２_ＲＯＤおよびＨＩＶ−２_ＮＩＨＺに由来する）。さらに別の有用なアナログとしては、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号８および配列番号９のペプチドが挙げられ、これらは、抗ウイルス活性を示すことが明らかにされている。
【０１２７】
本発明においては、ＤＰ１７８アナログは、そのアミノ酸配列がｇｐ４１タンパク質のＤＰ１７８領域に対応するペプチドを提示することが好ましく、本明細書中に開示されるペプチドにはさらに、約２〜約５０までのアミノ酸残基の長さの範囲であり、実際のＤＰ１７８アミノ酸配列に対するアミノまたはカルボキシのいずれかのｇｐ４１タンパク質領域に対応するアミノ酸配列が含まれ得ることもまた意図される。
【０１２８】
ＵＳ２００５／００７０４７５の表６および表７には、ＨＩＶ−２_ＮＩＨＺＤＰ１７８アナログのいくつかの可能な短縮が示されており、これには、３個から３６個の間のアミノ酸残基のペプチド（すなわち、トリペプチドから３６マーのポリペプチドまでの大きさの範囲のペプチド）が含まれ得る。ペプチド配列は、これらの表中ではアミノ末端（左）からカルボキシ末端（右）方向で列挙されている。
【０１２９】
さらなるＤＰ１７８アナログおよびＤＰ１０７アナログ
ＤＰ１７８およびＤＰ１０７アナログは、例えば、上記の１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５またはＰＬＺＩＰのコンピューター補助の検索ストラテジーのうちの１つ以上を利用することによって、認識されるかまたは同定される。この検索ストラテジーは、ＤＰ１０７および／またはＤＰ１７８の構造的特徴および／またはアミノ酸配列特徴と類似した、構造的特徴および／またはアミノ酸配列特徴を有すると予想されるさらなるペプチド領域を同定する。
【０１３０】
検索ストラテジーは、米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号および同第６，０２０，４５９号の第９節に示される例に完全に記載されている。この検索ストラテジーは、一部が、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８から推定される一次アミノ酸モチーフに基づくが、一次アミノ酸配列の相同性の検索だけに基づくものではない。なぜなら、そのようなタンパク質配列の相同性は存在するが、主要なウイルス群の間ではないからである。例えば、一次アミノ酸配列の相同性は、ＨＩＶ−１の異なる株のＴＭタンパク質内、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の異なる単離物のＴＭタンパク質内で高い。
【０１３１】
米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号、および同第６，０２０，４５９号に開示されるコンピューター検索ストラテジーでは、ＤＰ１０７またはＤＰ１７８に類似するタンパク質の領域の同定に成功した。この検索ストラテジーは、市販の配列データベースパッケージ（好ましくはＰＣ／Ｇｅｎｅ）を用いて使用されるように設計されている。
【０１３２】
米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号、および同第６，０２０，４５９号においては、一連の検索モチーフ（１０７×１７８×４、ＡＬＬＭＯＴＩ５、およびＰＬＺＩＰモチーフ）は、厳密な範囲から幅広い範囲までストリンジェンシーの範囲が設計され、操作されたが、１０７×１７８×４が好ましい。配列は、米国特許第６，０１３，２６３号、同第６，０１７，５３６号、および同第６，０２０，４５９号のそのような検索モチーフ（例えば、表Ｖ〜表ＸＩＶに列挙されたようなモチーフ）を介して同定され、抗膜融合性（例えば、抗ウイルス）活性を強く示し、抗膜融合性（例えば、抗ウイルス）化合物の同定においてさらに有用であり得る。
【０１３３】
他の抗ウイルスペプチド
抗ＲＳＶペプチド
抗ＲＳＶペプチドには、ＲＳＶによるウイルス感染を阻害することがさらに同定されている、ＲＳＶ中の対応するペプチド配列から同定されたＤＰ１７８および／またはＤＰ１０７アナログが含まれる。目的のそのようなペプチドには、ＵＳ２００５／００７０４７５の表１６のペプチドおよび配列番号１０〜配列番号３０のペプチドが含まれる。これらのペプチドを合成するための詳細なプロトコールはＵＳ２００５／００７０４７５に開示されており、その内容は引用により本明細書中に具体的に組み入れられる。特に興味深いのは、以下のペプチドである：
【０１３４】
【化２２】

ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号１０のペプチドは、ＲＳＶのＦ２領域に由来し、そして、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８ペプチドに対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１０７／１７８様」）を使用して、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号２１〜配列番号２３のペプチドはそれぞれ、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号１０のペプチドの中に含まれるアミノ酸配列を有し、そして各々が、抗ＲＳＶ活性を示し、特に、５０μｇ／ｍｌ未満の濃度でＲＳＶ感染Ｈｅｐ−２細胞と非感染Ｈｅｐ−２細胞との間での融合および合胞体形成を阻害することが示されている。
【０１３５】
ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号１１のペプチドは、ＲＳＶのＦ１領域に由来し、そして、ＤＰ１０７に対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１０７様」）を使用して、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号２４のペプチドには、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号１０のペプチドの中に含まれるアミノ酸配列が含まれ、同様に、抗ＲＳＶ活性を示し、特に、５０μｇ／ｍｌ未満の濃度でＲＳＶ感染Ｈｅｐ−２細胞と非感染Ｈｅｐ−２細胞との間での融合および合胞体形成を阻害することが示されている。
【０１３６】
抗ＨＰＩＶペプチド
抗ＨＰＩＶペプチドには、ＨＰＩＶ中の対応するペプチド配列から同定されたＤＰ１７８および／またはＤＰ１０７アナログが含まれ、そしてＨＰＩＶによるウイルス感染を阻害することがさらに同定されている。目的のそのようなペプチドには、ＵＳ２００５／００７０４７５の表１７および配列番号３１〜配列番号６２のペプチドが含まれる。これらのペプチドを合成するための詳細なプロトコールはＵＳ２００５／００７０４７５に開示されており、その内容は引用により本明細書中に具体的に組み入れられる。特に興味深いのは、以下のペプチドである：
【０１３７】
【化２３】

ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号３１のペプチドは、ＨＰＩＶ−３のＦ１領域に由来し、そして、ＤＰ１０７に対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１０７様」）を用いて、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号２５および配列番号２６のペプチドはそれぞれ、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号３０のペプチドの中に含まれるアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれが、抗ＨＰＩＶ−３活性を示し、特に、１μｇ／ｍｌ未満の濃度でＨＰＩＶ−３感染Ｈｅｐ２細胞と非感染ＣＶ−１Ｗ細胞との間での融合および合胞体形成を阻害することが示されている。
【０１３８】
ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号３２のペプチドもまた、ＨＰＩＶ−３のＦ１領域に由来し、そして、ＤＰ１７８に対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１７８様」）を用いて、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号２７および配列番号２８〜配列番号３２のペプチドはそれぞれ、ＵＳ２００５／００７０４７５の配列番号３２のペプチドの中に含まれるアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれがまた、抗ＨＰＩＶ−３活性を示し、特に、１μｇ／ｍｌ未満の濃度でＨＰＩＶ−３感染Ｈｅｐ２細胞と非感染ＣＶ−１Ｗ細胞のと間での融合および合胞体形成を阻害することが示されている。
【０１３９】
抗ＭｅＶペプチド
抗ＭｅＶペプチドは、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）によるウイルス感染を阻害することがさらに同定されている、麻疹ウイルス中の対応するペプチド配列から同定されたＤＰ１７８および／またはＤＰ１０７アナログである。特定の目的のそのようなペプチドには、ＵＳ２００５／００７０４７５の表１９のペプチドおよび配列番号７４〜配列番号８６のペプチドが含まれる。これらのペプチドを合成するための詳細なプロトコールはＵＳ２００５／００７０４７５に開示されており、その内容は引用により本明細書中に具体的に組み入れられる。特に興味深いのは、以下に列挙されるペプチドである：
【０１４０】
【化２４】

麻疹ウイルス由来の配列は、ＤＰ１７８に対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１７８様」）を使用して、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６のペプチドはそれぞれ、そのように同定されたアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれが、抗ＭｅＶ活性を示し、特に、１μｇ／ｍｌ未満の濃度でＭｅＶ感染Ｈｅｐ２と非感染Ｖｅｒｏ細胞との間での融合および合胞体形成を阻害することが示されている。
【０１４１】
抗ＳＩＶペプチド
抗ＳＩＶペプチドは、ＳＩＶによるウイルス感染を阻害することがさらに同定されている、ＳＩＶ中の対応するペプチド配列から同定されたＤＰ１７８および／またはＤＰ１０７アナログである。目的のそのようなペプチドには、ＵＳ２００５／００７０４７５の表１８のペプチドおよび配列番号６３〜配列番号７３までのペプチドが含まれる。これらのペプチドを合成するための詳細なプロトコールはＵＳ２００５／００７０４７５に開示されており、その内容は引用により本明細書中に具体的に組み入れられる。特に興味深いのは、以下のペプチドである：
【０１４２】
【化２５】

【０１４３】
【化２６】

ＳＩＶ膜貫通融合タンパク質由来の配列は、ＤＰ１７８に対応していると記載されている検索モチーフ（すなわち、「ＤＰ１７８様」）を使用して、米国特許第６，１０３，２３６号、および同第６，０２０，４５９号の中で同定された。配列番号３７〜配列番号４６のペプチドはそれぞれ、そのように同定されたアミノ酸配列を有し、そしてそれぞれが、粗ペプチドとして強力な抗ＳＩＶ活性を示すことが示されている。
【０１４４】
さらなるウイルス阻害剤（ｖｉｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および融合阻害剤（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｏｔｏｒ）
表現「ウイルス阻害剤誘導体」は、抗膜融合性化合物または侵入阻害剤（または非抗膜融合性）化合物から選択されたウイルス阻害剤の任意の改変体あるいは誘導体を意味するように意図される。
【０１４５】
抗膜融合性化合物としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：エンフュービルタイド；Ｃ３４；Ｔ−１２４９；ＴＲＩ−８９９；ＴＲＩ−９９９；５−ヘリックス；Ｎ３６ Ｍｕｔ（ｅ．ｇ）；ＮＣＣＧ−ｇｐ４１；ＤＰ−１０７；Ｍ４１−Ｐ；Ｎ３６；Ｍ８７ｏ；ＦＭ−００６；ＡＤＳ−Ｊ１；Ｃ１４リンクミド（Ｃ１４ ｌｉｎｋｍｉｄ）；Ｃ３４コイル；ヘモリジンＡ；ＩＱＮ１７；ＩＱＮ２３；ＳＣ３４ＥＫ；ＳＰＩ−３０，０１４；ＳＰＩ−７０，０３８；Ｔ−１２４９−ＨＳＡ；Ｔ−６４９；Ｔ−６５１；ＴＲＩ−１１４４；Ｃ１４；ＭＢＰ−１０７；ｓｃＣ３４；ＳＪ−２１７６；Ｔ−１２４９−トランスフェリン；ｐ２６；ｐ３８；ＡＤＳ−Ｊ２；Ｃ５２Ｌ；クローン３抗体；Ｄ５ ＩｇＧ；Ｄ５ ｓｃＦｃ；Ｆ２４０ ｓｃＦｖ；シフュービルタイド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）；ＩＺＮ−３６；Ｔ−１２４９ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）；Ｎ−３６−Ｅ；ＮＢ−２；ＮＢ−６４；Ｓ−２９−Ｉ；テアフラビン−３，３’−ジガラート；ＶＩＲＩＰ；シアマイシンＩ；シアマイシンＩＩ。
【０１４６】
侵入阻害剤（または非抗膜融合性）化合物としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＭＤ−０７０；ＳＰＣ−３；ＫＲＨ−２７３１；ＡＭＤ−８６６４；ＦＣ−１３１；ＨＩＶ−１ Ｔａｔアナログ；ＫＲＨ−１１２０；ＫＲＨ−１６３６；ＰＯＬ−２４３８；Ｔ−１３４；Ｔ−１４０；ストローマ細胞由来因子１；ＡＬＸ４０−４Ｃ；ＡＭＤ−３１００；Ｔ−２２；ＴＪＮ−１５１；ＡＭ−１４０１；ＥｒａｄｉｃＡｉｄｅウイルスマクロファージ炎症タンパク質ＩＩ；ＡＭＤ−３４５１；コノクルボン；マラビロック；ビクリビロック；ＩＮＣＢ−９４７１；ＩＮＣＢ−１５，０５０；ＤＡＰＴＡ；ＰＲＯ−１４０；ＨＧＳ−００４；ＳＣＨ−Ｃ；ＴＡＫ−６５２；ＴＡＫ−２２０；ニフェビロック（ｎｉｆｅｖｉｒｏｃ）；ＡＭＤ−８８７；抗ＣＤ６３ ＭＡｂ；ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ；ＣＰＭＤ−１６７；Ｅ−９１３；ＦＬＳＣ Ｒ／Ｔ−ＩｇＧ１；ＨＧＳ−１０１；ＮＩＢＲ−１２８２；ノナカイン（ｎｏｎａｋｉｎｅ）；ＰＳＣ−ＲＡＮＴＥＳ；ｓＣＤ４−１７ｂ；ＳＣＨ−３５０，６３４；ＭＩＰ−１α；ＭＩＰ−１β；ＲＡＮＴＥＳ；アプラビロック；ペプチドＴ；ＴＡＫ−７７９；ｐＣＬＸＳＮベクター；ＵＣＢ−３５，６２５；Ｊ−１１３，８６３；ＣＬＩＶ；Ｉ−３０９；ＥＧＣＧ；エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｈｅｃｈｉｎ ｇａｌｌａｔｅ）；ＨＢ−１９；λ−カラギーナン；ＰＣ−５１５；カードラン硫酸塩；ＯＫＵ−４０；ＯＫＵ−４１；ＶＧＶ−１；ジンテルビル（Ｚｉｎｔｅｖｉｒ）；ＡＲ−１７７；Ｔ−３０，１７７；コハク酸化アルブミン；ＮＳＣ０−６５８，５８６；ＩＳＩＳ−５３２０；ＲＰ−４００ｃ；ＳＡ−１０４２；Ｃ３１Ｇ；サヴィ（Ｓａｖｖｙ）；ＰＲＯ−５４２；ｒＣＤ４−ＩｇＧ２；ＢＭＳ−４８８，０４３；ＢＭＳ−３７８，８０６；ＤＥＳ−６；１２ｐ１；アクチノヒビン；ＢｌｏｃｋＡｉｄｅ／ＶＰ；ＣＤ４Ｍ３３；ＣＴ−３１９；ＣＴ−３２６；シアノビリン−Ｎ；ＤＣＭ−２０５；ＤＥＳ−１０；グリフィスシン；ＨＮＧ−１０５；ＮＢＤ−５５６；ＮＢＤ−５５７；ＰＥＧ−シアノビリン−Ｎ；シトビリン（ｓｃｙｔｏｖｉｒｉｎ）；ｓＣＤ４；デキストリン−２−硫酸塩；Ｆ−１０５；ＦＰ−２１，３９９；ＴＮＸ−３５５；Ｂ４ ＭＡｂ；Ｒ−１５−Ｋ；ｓＣＤ３８（５１−７５）ＭＢＰ；ＰＲＯ−２０００；ＮＳＣ−１３，７７８；ＳＢ−６７３，４６１Ｍ；ＳＢ−６７３，４６２Ｍ；ｒｓＣＤ４；Ａｃ（Ａｌａ１０，１１）ＲＡＮＴＥＳ（２−１４）；ＩＣ−９５６４；ＲＰＲ−１０３，６１１；Ｉｍｍｕｄｅｌ−ｇｐ１２０；スリゴビル；ＩＱＰ−０４１０；アセチル化トリヨードサイロニン；ＳＰ−０１Ａ；ＤＥＢ−０２５；ＣＳＡ−５４；ＨＧＳ−Ｈ／Ａ２７；ＳＰ−１０；ＶＩＲ−５１０３；ＢＭＳ−４３３，７７１；ＴＭＣ−３５３，１２１；ＮＳＣ−６５０，８９８；ミケラミンＢ；ＮＳＣ−６９２，９０６；ＴＧ−１０２；ＶＩＲ−５７６；ＭＥＤＩ−４８８；ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ；ＣＮＩ−Ｈ０２９４。
【０１４７】
抗ウイルスおよび抗膜融合性ペプチドの改変
本発明では、抗ウイルス活性および／または抗膜融合性活性を示すペプチドを改変することが意図され、ＤＰ−１０７およびＤＰ−１７８ならびにそれらのアナログのそのような改変が含まれる。そのような改変されたペプチドは、共有結合を介して血液成分上の利用可能な反応性官能基と反応することができる。本発明はまた、そのような改変、血液成分とのそのような組合せ、およびそれらの使用のための方法に関する。これらの方法には、非結合ペプチドの患者への投与と比較して、結合させられた抗ウイルスペプチド誘導体の有効な治療薬の寿命を延長させる工程が含まれる。改変されたペプチドは、ＤＡＣ（商標）（薬物親和性複合体）として設計されたタイプのペプチドであり、これには、抗ウイルスペプチド分子と、移動性の血液タンパク質の反応性官能基と反応することができる化学反応基を伴う連結基が含まれる。血液成分またはタンパク質との反応によって、改変されたペプチド、すなわちＤＡＣを、血液を介して適切な部位または受容体に送達することができる。
【０１４８】
タンパク質上の官能基と共有結合を形成させるためには、反応性基として多種多様な活性なカルボキシル基、特にエステルを使用することができ、この場合、ヒドロキシル部分は、ペプチドを改変するために必要とされるレベルで生理学的に許容される。多数の異なるヒドロキシル基がこれらの反応性基に使用され得るが、最も便利なものは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（すなわち、ＮＨＳ）、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）であろう。本発明の好ましい実施形態においては、タンパク質上の官能基はチオール基であり、そして反応性基はマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミド−ブチラールアミド（ＧＭＢＡ）またはマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）であろう。
【０１４９】
第一級アミンは、ＮＨＳエステルについての重要な標的である。タンパク質のＮ末端上に存在する接近することができるα−アミン基はＮＨＳエステルと反応する。しかし、タンパク質のα−アミノ基は、ＮＨＳカップリングには望ましくもない場合があり、また、利用可能できない場合もある。５種類のアミノ酸はそれらの側鎖中に窒素を有するが、リジンのε−アミンだけが有意にＮＨＳエステルと反応する。以下の反応スキームに示されるように、ＮＨＳエステルの結合反応が第一級アミンと反応してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する場合には、アミド結合が形成される。
【０１５０】
【化２７】

本発明の好ましい実施形態において、このタンパク質上の官能基はチオール基であり、化学反応性基はマレイミド含有基（例えば、ＭＰＡまたはＧＭＢＡ（γ−マレイミド−ブチラールアミド）であろう。マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４の間に維持される場合には、ペプチド上のスルフヒドリル基について最も選択的である。ｐＨ７．０では、マレイミド基のスルフヒドリルとの反応の速度は、アミンとの反応の速度よりも１０００倍速い。以下の反応スキームに示されるように、マレイミド基とスルフヒドリルとの間で安定なチオエーテル結合が形成され、これは、生理学的な条件下では切断され得ない。
【０１５１】
【化２８−１】

特異的標識
好ましくは、本発明の改変されたペプチドは、移動性の血液タンパク質上のチオール基と特異的に反応するように設計される。このような反応は、好ましくは、移動性血液タンパク質（例えば、血清アルブミンまたはＩｇＧ）上のチオール基へのマレイミドの連結（例えば、ＧＭＢＳ、ＭＰＡまたは他のマレイミドから調製される）で改変されたこのペプチドの共有結合によって確立される。
【０１５２】
特定の状況では、マレイミドでの特異的標識は、ＮＨＳおよびｓｕｌｆｏ−ＮＨＳのような基での移動性タンパク質の非特異的な標識化を上回るいくつかの利点をもたらす。チオール基は、インビボではアミノ基よりも少ない量で存在する。従って、本発明のマレイミドで改変されたペプチド（すなわち、マレイミドペプチド）は、より少ないタンパク質に共有結合するであろう。例えば、アルブミン（最も豊富な血液タンパク質）中には、チオール基が１つだけ存在する。従って、ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体は、約１：１のモル比でペプチド対アルブミンを含む傾向があるだろう。アルブミンに加えて、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）もまた遊離のチオールを有する。ＩｇＧ分子と血清アルブミンが、血液中の可溶タンパク質の大部分を構成するので、これらはまた、マレイミド改変ペプチドに共有結合させるために利用できる血液中の遊離のチオール基の大部分を構成する。
【０１５３】
さらに、遊離のチオール含有血液タンパク質（ＩｇＧを含む）の間でさえ、アルブミン自体の特有の特徴が原因で、マレイミドでの特異的標識はペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の優先的な形成を導く。アルブミンの単一の遊離のチオール基は種間で高度に保存されており、アミノ酸残基３４（Ｃｙｓ^３４）に位置する。最近、アルブミンのＣｙｓ^３４が、他の遊離チオール含有タンパク質上の遊離のチオールと比べて、高い反応性を有することが明らかにされていた。これは、アルブミンのＣｙｓ^３４に対する非常に低いｐＫ値（５．５）に一部原因がある。これは、一般的にシステイン残基についての典型的なｐＫ値（典型的には約８）よりもはるかに低い。この低いｐＫが原因で、正常な生理学的条件下では、アルブミンのＣｙｓ^３４は主にイオン化された形態であり、これはその反応性を劇的に高める。Ｃｙｓ^３４の低いｐＫ値に加えて、Ｃｙｓ^３４の反応性を高める別の因子はその位置であり、この位置は、アルブミンの領域Ｖの一つのループの表面に近い間隙の中にある。この位置は、Ｃｙｓ^３４を全ての種類のリガンドに対して極めて利用しやすくし、そしてこの位置は、遊離ラジカルトラップおよび遊離チオールスカベンジャーとしてのＣｙｓ^３４の生物学的役割において重要な因子である。これらの特性は、Ｃｙｓ^３４をマレイミド−ペプチドに非常に反応性にし、反応速度の加速は、他の遊離のチオール含有タンパク質とのマレイミド−ペプチドの反応速度に比べて、１０００倍であり得る。
【０１５４】
ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、詳細にはＣｙｓ^３４において、ペプチド対アルブミンを１：１で含むことに関連する再現性である。他の技術（例えば、グルタルアルデヒド、ＤＣＣ、ＥＤＣおよび例えば、遊離のアミンの他の化学活性化）には、この選択性が欠けている。例えば、アルブミンには５２個のリジン残基が含まれ、このうちの２５〜３０個は、アルブミンの表面に位置し、したがって結合のために接近することができる。これらのリジン残基の活性化、あるいはこれらのリジン残基を介するカップリングのためのペプチドの別の改変によっては、結合体の不均一な集団が生じる。ペプチド対アルブミンの１：１のモル比が使用される場合でもなお、生成物は、複数の結合体産物からなり、そのいくつかには、アルブミン１分子当たり０、１、２以上のペプチドが含まれており、それぞれが、２５〜３０個の利用可能なリジン部位のうちの任意１つ以上に無作為に結合させられたペプチドを有する。多数の可能な組み合わせが提供される場合には、正確な組成および個々の結合体のバッチの特性決定は困難になり、バッチ間の再現性はほとんど不可能であり、このような結合体の治療薬としての望ましさを低下させてしまう。加えて、アルブミンのリジン残基を介する結合は、アルブミン１分子当たりにより多くの治療薬を送達するという利点を少なくとも有するようであるが、複数の研究によって、治療薬対アルブミンの１：１の比が好ましいことが示されている。Ｓｔｅｈｌｅらによる論文「Ｔｈｅ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒａｔｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−Ａｌｂｕｍｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｔｓ」、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，第８巻，６７７−６８５頁（１９８８）では、著者らは、グルタルアルデヒドを介して結合させられたアルブミンに対する抗癌剤メトトレキサートの１：１の比が最も有望な結果を生じたことを報告した。これらの結合体は腫瘍細胞によって優先的に取り込まれたが、５：１〜２０：１のメトトレキサート分子を保有している結合体は、変化したＨＰＬＣプロフィールを有し、そしてインビボで肝臓に迅速に取り込まれた。これらの高い比では、アルブミンに対する立体構造の変化は、治療用担体としてのその有効性を低下させると推論された。
【０１５５】
マレイミド−ペプチドのインビボでの制御された投与を通じて、アルブミンとＩｇＧのインビボでの特異的標識を制御することができる。典型的な投与においては、投与されたマレイミド−ペプチドのうちの８０〜９０％がアルブミンを標識し、５％未満はＩｇＧを標識するであろう。グルタチオンのような遊離のチオールの微量標識もまた起こるであろう。このような特異的標識は、インビボでの使用に好ましい。なぜなら、これにより、投与された薬剤の概算された半減期の正確な計算が可能となるからである。
【０１５６】
制御された特異的なインビボ標識化を提供することに加えて、マレイミド−ペプチドは、血清アルブミンとＩｇＧのエキソビボでの特異的標識を提供することができる。このようなエキソビボでの標識には、血清アルブミンおよび／またはＩｇＧを含む、血液、血清または生理食塩溶液へのマレイミド−ペプチドの添加が含まれる。一旦、マレイミド−ペプチドとの結合がエキソビボで起こると、血液、血清、または生理食塩溶液は、インビボ処置のために患者の血液に再投与することができる。
【０１５７】
ＮＨＳ−ペプチドとは対照的に、マレイミド−ペプチドは、一般的には、水溶液の存在下および遊離のアミンの存在下では極めて安定である。マレイミド−ペプチドが遊離のチオールとだけ反応するので、保護基は、一般的には、マレイミド−ペプチドがそれ自体と反応することを防ぐ必要はない。加えて、改変されたペプチドの高い安定性によって、インビボでの使用に適している高度に精製された産物を調製するためのＨＰＬＣのようなさらなる精製工程の使用が可能となる。最後に、高い化学的安定性によって、製品の有効期間をより長くすることができる。
【０１５８】
非特異的標識
本発明の抗ウイルスペプチドはまた、血液成分の非特異的標識のために改変される場合もある。アミノ基に対する結合、特に非特異的標識のためのアミド結合の形成を伴う結合もまた使用されるであろう。そのような結合を形成させるためには、化学反応基として多種多様な活性カルボキシル基、特にエステルが使用され得、この場合、ヒドロキシル部分は、必要とされるレベルで生理学的に許容される。多数の異なるヒドロキシル基がこれらの結合剤において使用され得るが、最も便利なものはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）であろう。
【０１５９】
利用され得る他の結合剤は、米国特許第５，６１２，０３４号に記載されている。
【０１６０】
改変されたペプチドの化学反応基がインビボで反応し得る様々な部位としては、細胞、特に赤血球（成熟赤血球）および血小板、ならびにタンパク質（例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、サイロキシン結合タンパク、α−２−マクログロブリンなど）が挙げられる。改変されたペプチドが反応するそれらの受容体（これは、長期間生存しない）は、一般的に、約３日以内にヒト宿主から排除されるであろう。上記に示されるタンパク質（細胞のタンパク質を含む）は、血中濃度に基づいて、特に半減期に関しては、少なくとも３日間残存し、そして５日間以上残存する場合もあるであろう（通常は、６０日間を超えず、より通常は３０日間を超えない）。
【０１６１】
ほとんどの部分について、反応は、血液中の移動性の成分、具体的には血液タンパク質および細胞、さらに具体的には血液タンパク質および成熟赤血球との反応であろう。「移動性」によっては、その成分が、任意の延長された期間（一般的には５分間を超えない、より通常は１分間）固定された状況にはないことが意図されるが、血液成分のうちのいくつかは、延長された期間比較的固定された状態で存在し得る。最初は、機能化されたタンパク質および細胞の比較的不均質な集団が存在するであろう。しかし、ほとんどの部分については、数日以内の集団は、血流中の機能化されたタンパク質の半減期に依存して、最初の集団から実質的に変化するであろう。従って、通常は約３日以内またはそれ以後には、ＩｇＧは、血流において優勢な機能化されたタンパク質となるであろう。
【０１６２】
通常は、投与後５日までに、ＩｇＧ、血清アルブミンおよび成熟赤血球は、血液中の結合成分の少なくとも約６０モル％、通常は少なくとも約７５モル％を占め、ＩｇＧ、ＩｇＭ（実質的により少ない程度まで）および血清アルブミンは、非細胞性結合成分の少なくとも約５０モル％、通常は少なくとも約７５モル％、より通常は約８０モル％となるであろう。
【０１６３】
血液成分に対する非特異的な改変されたペプチドの所望される結合体は、患者への改変されたペプチドの投与によってインビボで調製され得る。患者はヒトまたは他の哺乳動物であり得る。その投与は、ボーラスの形態で行われる場合も、また、流れを計器で調節して注入することなどによって、ゆっくりと経時的に導入される場合もある。
【０１６４】
所望される場合、目的の結合体はまた、血液を本発明の改変されたペプチドと組み合わせ、これにより血液成分上の反応性官能基への改変されたペプチドの共有結合が可能となること、次いで、宿主に結合させられた血液を戻すかまたは投与することによってエキソビボで調製され得る。さらに、これはまた、初めに、個々の血液成分または限られた数の成分（例えば、赤血球、免疫グロブリン、血清アルブミンなど）を精製し、そしてその成分または複数の成分をエキソビボで化学的に反応性の改変されたペプチドと組み合わせることによって達成され得る。次いで、機能化された血液または血液成分は、目的の治療的に有効な結合体をインビボで提供するために宿主に戻され得る。血液はまた、エキソビボでの操作の際の凝固を防ぐために処理され得る。
【０１６５】
改変された抗ウイルスペプチドおよび抗膜融合性ペプチドの合成
Ａ．ペプチド合成
本発明の抗ウイルスペプチドおよび／または抗膜融合性ペプチドは、当業者に公知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって合成され得る。例えば、ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して、Ｓｔｅｗａｒｄ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，（１９８４））によって記載された手順に従って固相化学技術によって合成され得る。次いで、同様に、複数のペプチド断片が合成され、その後、互いに連結させられることによって、より大きなペプチドが形成させられる。これらの合成ペプチドはまた、特定の位置にアミノ酸置換を有して作製することもできる。
【０１６６】
固相ペプチド合成について、多くの技術の概要が、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），１９６３、およびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，第２巻 ４６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９７３に見ることができる。伝統的な溶液合成については、Ｇ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｋ．Ｌｕｐｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，第１巻、Ａｃａｃｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。一般的には、これらの方法には、１つ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の、成長しつつあるペプチド鎖への連続的付加が含まれる。通常、第１のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。次いで、保護されたアミノ酸または誘導されたアミノ酸は、不活性な固体支持体に付着させられるか、あるいは、アミド結合を形成させるために適している条件下で、適切に保護された相補性（アミノもしくはカルボキシル）基を有している配列中に次のアミノ酸を付加することによって溶液中で利用されるかのいずれかである。次いで、保護基がこの新たに付加されたアミノ酸残基から除去され、そして（適切に保護された）次のアミノ酸が付加されるなどが行われる。
【０１６７】
全ての所望されるアミノ酸が、適切な配列内に連結させられた後、任意の残っている保護基（および任意の固体支持体）が連続的に、または同時に除去されて、最終的なポリペプチドにされる。この一般的手順の単純な改変によって、２つ以上のアミノ酸を一度に成長しつつある鎖に対して、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドと（キラル中心をラセミ化させない条件下で）カップリングさせることによって付加させることが可能であり、脱保護の後に、ペンタペプチドが形成させられる。
【０１６８】
本発明の化合物を調製する特に好ましい方法には固相ペプチド合成が含まれる。この場合、アミノ酸α−Ｎ−末端は、酸感受性基または塩基感受性基によって保護される。そのような保護基は、ペプチド結合形成の条件に対して安定であるという特性を有するべきであり、一方、成長しつつあるペプチド鎖の破壊またはその中に含まれる任意のキラル中心のラセミ化を伴わずに容易に除去できる。適切な保護基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどである。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、本発明のペプチドの合成に特に好ましい。他の好ましい側鎖保護基は、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基については、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）基、ニトロ基、ｐ−トルエンスルホニル基、４−メトキシベンゼン−スルホニル基、Ｃｂｚ基、Ｂｏｃ基、およびアダマンチルオキシカルボニル基であり；チロシンについては、ベンジル基、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２，６−ジクロロベンジル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、シクロヘキシル基、シクロペニル基およびアセチル（Ａｃ）基であり；セリンについては、ｔ−ブチル基、ベンジル基およびテトラヒドロピラニル基であり；ヒスチジンについては、トリチル基、ベンジル基、Ｃｂｚ基、ｐ−トルエンスルホニル基および２，４−ジニトロフェニル基であり；トリプトファンについては、ホルミル基であり；アスパラギン酸およびグルタミン酸については、ベンジル基およびｔ−ブチル基であり、さらに、システインについては、トリフェニルメチル（トリチル）基である。
【０１６９】
固相ペプチド合成方法において、α−Ｃ−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹脂に付着させらる。上記合成に有用な適切な固体支持体は、段階的な縮合−脱保護反応の試薬および反応条件に対して不活性であり、さらに、使用される媒体に不溶性である材料である。α−Ｃ−末端カルボキシペプチドの合成のための好ましい固体支持体は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）である。α−Ｃ−末端アミドペプチドに好ましい固相支持体は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手することができる４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチル樹脂である。α−Ｃ−末端アミノ酸は、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（ＢＯＰＣｌ）を伴ってまたは伴わずに、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート（ＨＢＴＵ）によって樹脂に結合させられ、結合は、溶媒（例えば、ジクロロメタンまたはＤＭＦ）中で１０℃から５０℃の間の温度で約１時間〜２４時間の間媒介される。
【０１７０】
固体支持体が、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、Ｆｍｏｃ基は、上記のα−Ｃ−末端アミノ酸とのカップリングの前に、第二級アミン、好ましくはピペリジンで切断される。脱保護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂へのカップリングのための好ましい方法は、ＤＭＦ中のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウムヘキサフロオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。保護されたアミノ酸の連続的なカップリングは、当該分野で周知であるように、自動ポリペプチド合成装置の中で行わせることができる。好ましい実施形態においては、成長しつつあるペプチド鎖のα−Ｎ−末端アミノ酸はＦｍｏｃで保護される。成長しつつあるペプチドのα−Ｎ−末端側からのＦｍｏｃ保護基の除去は、第二級アミン、好ましくはピペリジンでの処理によって達成される。次いで、個々の保護されたアミノ酸は、約３倍のモル過剰量で導入され、そして好ましくは、カップリングはＤＭＦ中で行われる。カップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルウロニウム−ヘキサフロオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。
【０１７１】
固相合成の終点において、このポリペプチドは、連続的または１回の操作のいずれかで、樹脂から取り出され、脱保護される。ポリペプチドの取り出しと脱保護は、チオアニソール、水、エタンジチオールおよびトリフルオロ酢酸を含む切断試薬（ｃｌｅａｖａｇｅ
ｒｅａｇｅｎｔ）で樹脂が結合したポリペプチドを処理することによって１回の操作で達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ−末端がアルキルアミドである場合は、樹脂は、アルキルアミンを用いてアミノ分解によって切断される。あるいは、ペプチドは、例えば、メタノールを用いるエステル交換反応、それに続くアミノ分解、または直接的なアミド基交換によって取り出され得る。保護されたペプチドは、この時点で精製され得るか、または次の工程に直接使用され得る。側鎖保護基の除去は、上記の切断カクテル（ｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用して達成される。完全に脱保護されたペプチドは、任意または全ての以下の型：弱塩基樹脂上のイオン交換（酢酸塩の形態）；非誘導体化ポリスチレン−ジビニルベンゼン上の疎水性吸着クロマトグラフィー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ）；シリカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、ＬＨ−２０）または向流分配；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（特に、オクチル−もしくはオクタデシルシリル−シリカ結合相充填剤上での逆相ＨＰＬＣ）を利用する一連のクロマトグラフィー工程によって精製される。これらのＩＴＰの分子量は、Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ＦＡＢ）Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを使用して決定される。
【０１７２】
Ｎ−末端保護基
上記で議論されたように、用語「Ｎ−保護基」とは、アミノ酸もしくはペプチドのα−Ｎ−末端を保護すること、あるいはアミノ酸もしくはペプチドのアミノ基を、合成手順の間の望ましくない反応から保護することが意図される基をいう。一般的に、使用されるＮ−保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８１））（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。加えて、保護基を、例えば、酵素的加水分解によってインビボで容易に切断されて生物学的に活性なペアレント（ｐａｒｅｎｔ）を放出するるプロドラッグとして使用することができる。α−Ｎ−保護基には、低級アルカノイル基（例えば、ホルミル基、アセチル基（「Ａｃ」）、プロピオニル基、ピバロイル基、ｔ−ブチルアセチル基など；他のアシル基（２−クロロアセチル基、２−ブロモアセチル基、トリフルオロアセチル基、トリクロロアセチル基、フタリル基、ｏ−ニトロフェノキシアセチル基、クロロブチリル基、ベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基などを含む）；スルホニル基（例えば、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基など）；カルバメート形成基（例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、４−エトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル基、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシカルボニル基、α，α−ジメチル−３，５−ジ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、フェノキシカルボニル基、４−ニトロフェノキシカルボニル基、フルオレニル−９−メトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基など）；アリールアルキル基（例えば、ベンジル基、トリフェニルメチル基、ベンジルオキシメチル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）など）、ならびにシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）が含まれる。
【０１７３】
カルボキシ保護基
上記で議論されたように、用語「カルボキシ保護基」とは、化合物の他の機能性部位に関する反応が実施されながらカルボン酸官能基をブロックもしくは保護するために使用されるカルボン酸保護エステル基またはアミド基をいう。カルボキシ保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１５２〜１８６頁（１９８１）（これは引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。加えて、カルボキシ保護基はプロドラッグとして使用することができ、それによってカルボキシ保護基は、例えば、酵素的加水分解によって容易にインビボで切断されて、生物学的に活性なペアレントを放出することができる。そのようなカルボキシ保護基は当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号および同第３，７１９，６６７号にて記載されているように、ペニシリンおよびセファロスポリンの分野におけるカルボキシル基の保護において広く使用されている。これらの開示は引用により本明細書中に組み入れられる。代表的なカルボキシ保護基は、Ｃ_１〜Ｃ_８低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基またはｔ−ブチル基など）；アリールアルキル基（例えば、フェネチル基またはベンジル基、ならびに、アルコキシベンジル基またはニトロベンジル基などのようなそれらの置換誘導体）；アリールアルケニル基（例えば、フェニルエテニル基など）；アリールおよびその置換された誘導体（例えば、５−インダニル基など）；ジアルキルアミノアルキル基（例えば、ジメチルアミノエチル基など）；アルカノイルオキシアルキル基（例えば、アセトキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、バレリルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、イソバレリルオキシメチル基、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル基、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル基、１−メチル−１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル基、ピバロイルオキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基など）；シクロアルカノイルオキシアルキル基（例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル基、シクロブチルカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルカルボニルオキシメチル基、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル基など）；アロイルオキシアルキル基（例えば、ベンゾイルオキシメチル基、ベンゾイルオキシエチル基など）；アリールアルキルカルボニルオキシアルキル基（例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル基、２−ベンジルカルボニルオキシエチル基など）；アルコキシカルボニルアルキル基またはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル基（例えば、メトキシカルボニルメチル基、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル基、１−メトキシカルボニル−１−エチル基など）；アルコキシカルボニルオキシアルキル基またはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基（例えば、メトキシカルボニルオキシメチル基、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル基、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル基、１−シクロへキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチル基など）；アリールオキシカルボニルオキシアルキル基（例えば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル基、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）エチル基など）；アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル基（例えば、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ）エチル基など）；アリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基（例えば、２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル基など）；アリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル基（例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル基など）；アルコキシカルボニルアミノアルキル基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル基など）；アルキルアミノカルボニルアミノアルキル基（例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル基など）；アルカノイルアミノアルキル基（例えば、アセチルアミノメチル基など）；複素環式カルボニルオキシアルキル基（例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル基など）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル基（例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル基、ジエチルアミノカルボニルメチル基など）；（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル基（例えば、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基など）；ならびに、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル基（例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基など）である。
【０１７４】
代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカルボニル基である。
【０１７５】
本発明の好ましいカルボキシ保護された化合物には複数の化合物があり、ここでは、その保護されたカルボキシ基は、低級アルキルエステル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど）、またはアルカノイルオキシアルキルエステル、シクロアルカノイルオキシアルキルエステル、アロイルオキシアルキルエステル、もしくはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルである。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキルアミノカルボニル基である。例えば、アスパラギン酸は、酸不安定基（例えば、ｔ−ブチル基）によってα−Ｃ−末端で保護され得、そして水素化不安定基（例えば、ベンジル基）によってβ−Ｃ−末端で保護され得、次いで、合成の間に選択的に脱保護され得る。
【０１７６】
ペプチドの改変
本発明の改変されたペプチドの生産様式は、そのペプチドを含む種々の要素の性質に応じて広く変化するであろう。合成手順は、単純であるように、高収率を提供するように、そして高度に精製された安定な生成物を可能とするように選択されるであろう。通常は、化学反応基は、合成の最終段階で、例えば、カルボキシル基を用いて作製され、エステル化されて活性エステルが形成させられるであろう。本発明の改変されたペプチドの生産のための特定の方法が以下に記載される。
【０１７７】
具体的には、選択されたペプチドは、抗ウイルス活性について最初にアッセイされ、次いでペプチドのＮ末端、Ｃ末端または内部のいずれかのみで、連結基を用いて改変される。その後、この改変されたペプチド連結基の抗ウイルス活性がアッセイされる。抗ウイルス活性が劇的に低下（すなわち、１０分の１未満に低下）しない場合は、その後、改変されたペプチド連結基の安定性がそのインビボ寿命によって測定される。この安定性が所望されるレベルにまで改善されていなければ、次いでペプチドは、別の部位で改変され、そして所望されるレベルの抗ウイルスおよび安定性が得られるまでこの手順が繰り返される。
【０１７８】
さらに具体的には、リンカーおよび反応基での改変を受けさせるために選択された個々のペプチドが、以下の基準に従って改変されるであろう：末端のカルボン酸基がペプチド上で利用可能であり、そしてこの末端のカルボン酸基が抗ウイルス活性の保持に重要ではなく、他の感受性官能基がペプチド上に存在しない場合は、このカルボン酸が、リンカー反応基改変のための結合点として選択されるであろう。末端のカルボン酸基が抗ウイルス活性に関与している場合、またはカルボン酸が利用できない場合は、抗ウイルス活性の保持に重要ではない任意の他の感受性官能基が、リンカー反応要素の改変のための結合点として選択されるであろう。いくつかの感受性官能基をペプチド上で利用できる場合は、リンカー／反応要素の付加および保護された全ての感受性官能基の脱保護後に、抗ウイルス活性の保持がなおも得られるような様式で、保護基の組み合わせが使用されるであろう。利用できる感受性官能基がペプチド上にない場合、またはより単純な改変経路が所望される場合は、合成による試みにより、抗ウイルス活性の保持が維持されるような様式で、もともとのペプチドの改変が可能となるであろう。この場合、改変はペプチドの反対側の末端で起こるであろう。
【０１７９】
ＮＨＳ誘導体は、ペプチド中に他の感受性官能基が存在しない場合にカルボン酸から合成され得る。特に、このようなペプチドは、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＥＤＣ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させられ、そしてこの生成物は、クロマトグラフィーによって精製されるか、またはＮＨＳ誘導体を生じさせるための適切な溶媒系から再結晶化させられる。
【０１８０】
あるいは、ＮＨＳ誘導体は、アミノ基および／またはチオール基と、カルボン酸を含むペプチドから合成され得る。分子中に遊離のアミノ基またはチオール基が存在する場合は、ＮＨＳ誘導体の付加が行われる前に、これらの感受性官能基が保護されることが好ましい。例えば、分子に遊離のアミノ基が含まれる場合は、Ｆｍｏｃ保護されたアミンまたは好ましくはｔＢｏｃ保護されたアミンへのアミンの変換が、上記化学反応が行われる前に必要とされる。アミン官能基は、ＮＨＳ誘導体の調製後も脱保護されないであろう。従って、この方法は、所望される抗ウイルス効果を誘導するために、そのアミン基が遊離状態であることが必要ではない化合物に対してのみ適用される。アミノ基が分子のもともとの特性を保持するために遊離状態であることが必要とされる場合は、以下に記載される別のタイプの化学反応が行われなければならない。
【０１８１】
加えて、ＮＨＳ誘導体は、アミノ基またはチオール基が含まれ、そしてカルボン酸が含まれていないペプチドから合成され得る。選択された分子にカルボン酸が含まれていない場合は、一連の二官能性リンカーを使用して、その分子を反応性ＮＨＳ誘導体へと変換させることができる。例えば、ＤＭＦ中に溶解させられ、そして遊離アミノ含有分子に付加させられたエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）およびトリエチルアミン（ＥＧＳの方が有利なように１０：１の比で）は、モノＮＨＳ誘導体を生じるであろう。チオールで誘導された分子からＮＨＳ誘導体を生じさせるためには、ＤＭＦ中のＮ−［−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）とトリエチルアミンを使用することができる。マレイミド基は遊離のチオールと反応し、そしてＮＨＳ誘導体は、シリカ上でのクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによって反応混合物から精製されるであろう。
【０１８２】
ＮＨＳ誘導体はまた、複数の感受性官能基を含むペプチドからも合成され得る。それぞれの場合について、異なる様式で分析と解明がなされなければならないであろう。しかし、市販されている多量の保護基および二官能性リンカーのお陰で、本発明は、ペプチドを改変するために、好ましくはわずか１つの化学的工程で（上記に記載されるように）、または２工程（上記に記載されたように、感受性基の事前の保護を含む）もしくは３工程（保護、活性化、および脱保護）で任意のペプチドに適用することができる。例外的な状況下でのみ、ペプチドを活性なＮＨＳまたはマレイミド誘導体に変換させるために、複数の（３工程を超える）合成工程が必要であろう。
【０１８３】
マレイミド誘導体はまた、遊離のアミノ基と遊離のカルボン酸を含むペプチドからも合成され得る。アミノ誘導された分子からマレイミド誘導体を生じさせるためには、ＤＭＦ中のＮ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）とトリエチルアミンを使用することができる。スクシンイミドエステル基は遊離のアミノと反応し、そしてマレイミド誘導体は、結晶化によって、またはシリカ上でのクロマトグラフィーによって、またはＨＰＬＣによって、反応混合物から精製されるであろう。
【０１８４】
最後に、マレイミド誘導体は、複数の他の感受性官能基を含み、そして遊離のカルボン酸を含まないペプチドから合成され得る。選択された分子にカルボン酸が含まれていない場合は、一連の二官能性架橋試薬を使用して、分子を反応性ＮＨＳ誘導体へと変換させることができる。例えば、ＤＭＦ中でのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化を使用して、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）を遊離のアミンにカップリングさせて、遊離のアミンとＭＰＡのカルボン酸基との反応を通してマレイミド誘導体を生じさせることができる。
【０１８５】
多くの他の市販されているヘテロ二官能性架橋試薬を、必要とされる場合には代替的に使用することができる。多数の二官能性化合物を要素への架橋のために利用することができる。例示的な試薬としては、以下が挙げられる：アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピイミデート、ジスクシンイミジル酒石酸塩、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、およびスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート。
【０１８６】
改変された抗ウイルスペプチドの使用
本発明の改変された抗ウイルスペプチドは、ウイルス感染に罹患している患者の処置において治療薬として使用され得、そして以下に記載される方法および当該分野で公知の他の方法に従って患者に投与することができる。改変されたペプチドの有効な治療的投薬量は、当業者に周知の手順によって決定され得、そしてこのペプチドの潜在的な毒性に関する任意の懸念が考慮されるであろう。
【０１８７】
改変されたペプチドはまた、これまでには感染していない個体に対して予防的に投与することもできる。このことは、個体がウイルス伝染の危険性が高い感染した個体と接触した場合に起こり得るように、個体がウイルスに曝される高い危険性に供されている場合に有利であり得る。このことは、ウイルス（例えば、ＨＩＶウイルス）に対する公知の治療法がある場合には特に有利であり得る。一例として、改変された抗ＨＩＶペプチドの予防的な投与は、医療施設の労働者がＨＩＶ感染個体に由来する血液に曝されている状況において、または個体をＨＩＶウイルスに曝す可能性があるリスクの高い活動にその個体が従事している他の状況において有利であろう。
【０１８８】
改変された抗ウイルスペプチドおよび抗膜融合性ペプチドの投与
一般的に、改変されたペプチドは、生理学的に許容される媒体（例えば、脱イオン水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血漿、タンパク様溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など）の中で投与される。含まれ得る他の添加物としては、緩衝液（この場合、媒体は、約５〜１０の範囲のｐＨで一般的に緩衝化され、緩衝液は一般的には約５０〜２５０ｍＭの濃度の範囲であろう）、塩（塩濃度は、一般的には約５〜５００ｍＭの範囲であろう）、生理的に許容される安定剤などが挙げられる。組成物は、保存および輸送に便利なように凍結乾燥させられる場合がある。
【０１８９】
本発明の改変されたペプチドは、大部分について、非経口的に（例えば、静脈内に（ＩＶ）、動脈内に（ＩＡ）、筋肉内に（ＩＭ）、皮下に（ＳＣ）など）投与される。投与は、適切な状況では、輸注により得る。官能基の反応が比較的遅いいくつかの場合には、投与は、経口的、経鼻的、直腸的、経皮的またはエーロゾルであり得、この場合、結合体の性質により脈管系への移動が可能となる。通常は、一回の注入が使用されるが、所望される場合には、２回以上の注入が使用される場合がある。改変されたペプチドは、任意の都合のよい手段（注射器、トロカール、カテーテルなどを含む）によって投与され得る。
【０１９０】
特定の実施形態においては、改変されたペプチドは、当該分野で公知の方法によって肺手段によって投与されるであろう。ペプチドまたはタンパク質のエアゾール乾燥粉末形態の肺深部への送達のための技術は、Ｐａｔｔｏｎら（１９９７）Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ２７（１２）：３４−３８に開示されている。ペプチドの肺投与を開示しているさらなる参考文献としては、Ｓｅｎｉｏｒ，Ｋ．ら（２０００）ＰＳＴＴ，第３巻：２８１−２８２；Ｇｕｍｂｌｅｔｏｎ，Ｍ．（２００６）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：９９３−９９５；「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」と題されたＮｅｗｈｏｕｓｅ，Ｍ．Ｔ．（２００６）Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；およびＬａｂｉｒｉｓ，Ｎ．Ｒ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６：６００−６１２が挙げられる。これらの参考文献の全ての内容が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０１９１】
投与の特定の様式は、投与される量、１回のボーラスであるかまたは継続的な投与であるかなどに依存して変化するであろう。好ましくは、投与は静脈内であり、この場合、導入の部位は、本発明にとって重要ではなく、好ましくは急速な血流が存在する部位（例えば、静脈内、末梢静脈または中心静脈）である。他の経路は、投与が、遅延性放出技術または保護マトリックスと結びつけられる使用を見出し得る。この意図は、改変されたペプチドが血液中で効率的に分布されることであり、その結果、血液成分と反応することができる。結合体の濃度は、一般的には、約１ｐｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌまでの範囲で広範に変化するであろう。静脈内に投与される総量は、一般的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、あるいは、約１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であろう。
【０１９２】
血液の長期間にわたり生存する成分（例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板）に結合させることにより、多数の利点が結果として生じる。ペプチドの活性は、数日〜数週間延長される。この期間に投与は１回のみ必要である。活性化合物は、大きい分子に主に結合されるので（ここでは、他の生理学的プロセスを妨げるように細胞内に取り込まれる可能性は低い）、より優れた特異性を得ることができる。
【０１９３】
改変されたペプチドの存在のモニタリング
哺乳動物宿主の血液は、１回以上、改変されたペプチド化合物の存在についてモニターされ得る。宿主の血液の一部または試料を採取することにより、ペプチドが治療的に活性であるために十分な量で長期間生存する血液成分に結合されているかどうかを決定することができ、そしてその後、血液中のペプチド化合物のレベルを決定することができる。所望される場合は、ペプチドがどの血液成分に結合されるかもまた決定することができる。これは、非特異的改変ペプチドが使用される場合に特に重要である。特定のマレイミドで改変されたペプチドに関して、血清アルブミンおよびＩｇＧの半減期を算出することは、はるかに簡単である。
【０１９４】
免疫アッセイ
本発明の別の態様は、抗ウイルスペプチドおよび／もしくはアナログ、またはそれらの誘導体および結合体の、生物学的試料（例えば、血液）における濃度を、これらのペプチド、ペプチドアナログ、またはそれらの誘導体および結合体に対して特異的な抗体を用いて決定するための方法、ならびにこのようなペプチド、アナログおよび／またはこれらの誘導体もしくは結合体に強く関係している毒性についての処置としてのこのような抗体の使用に関する。患者におけるインビボでのこのペプチドの高い安定性と寿命は、処置の際に新しい問題（毒性に関する高い可能性を含む）を導く可能性があるので、このことは有利である。
【０１９５】
特定のペプチド、そのペプチドアナログまたは誘導体に対して特異性を有している抗治療薬剤抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか）の使用は、任意のこのような問題を媒介する手助けをし得る。抗体は、特定のペプチド、そのアナログもしくは誘導体を用いて、またはその因子の免疫原性断片、あるいはこの因子の抗原決定基に対応する合成された免疫原を用いて免疫された宿主から作製され得るか、またはそれらから導かれ得る。好ましい抗体は、ペプチド、ペプチドアナログ、もしくは誘導体の天然の形態、改変された形態、および結合させられた形態に対して、高い特異性と親和性を有するであろう。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素、または放射性標識で標識することもできる。
【０１９６】
改変されたペプチドに特異的な抗体は、ペプチド特異的抗体の誘導のために精製されたペプチドを使用するすることにより作製され得る。抗体の誘導によっては、動物中への注射による免疫応答の刺激だけではなく、合成抗体または他の特異的結合分子の作製における類似の工程（例えば、組換え免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング）も意図される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、当該分野で周知の手順により作成され得る。
【０１９７】
抗ペプチド抗体が、改変されたペプチド、そのアナログまたは誘導体の投与によって誘導された毒性を処置するために使用され得、そしてエキソビボでも、またインビボでも使用され得る。エキソビボでの方法には、固体支持体に固定された抗治療薬剤抗体を使用する、毒性に対する免疫透析処置が含まれるであろう。インビボでの方法には、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するために有効な量の抗治療薬剤抗体の投与が含まれる。
【０１９８】
抗体は、無菌条件下で抗体と血液を接触させることによって、エキソビボで患者の血液から、改変されたペプチド、そのアナログまたは誘導体、およびその結合体を除去するために使用され得る。例えば、抗体は、カラムマトリックス上に固着、あるいは固定することができ、そして患者の血液を患者から取り出して、マトリックス上を通過させることができる。改変されたペプチド、ペプチドアナログ、誘導体または結合体は抗体に結合し、そして低濃度のペプチド、アナログ、誘導体または結合体を含む血液が、その後、患者の循環系に戻され得る。除去されるペプチド化合物の量は、圧力および流速を調整することによって制御することができる。
【０１９９】
患者の血液の血漿成分からのペプチド、アナログ、誘導体および結合体の優先的な除去は、例えば、半透膜の使用によって、またはそうでなければ、抗治療薬抗体を含むマトリックス上に血漿成分を通過させる前に、当該分野で公知の方法により細胞成分から血漿成分をまず分離することによって行うことができる。あるいは、ペプチドが結合させられた血球（赤血球細胞を含む）の優先的な除去は、患者の血液中の血球を回収し、濃縮し、そして患者の血液の血清成分の排除のためにそれらの細胞を固着させられた抗治療薬抗体と接触させることによって行うことができる。
【０２００】
抗治療薬抗体は、処置のためにペプチド、アナログ、誘導体または結合体が投与された患者に、インビボで非経口的に投与することができる。抗体は、ペプチド化合物および結合体に結合するであろう。一旦ペプチドに結合されると、活性は、完全にはブロックされないとしても、妨害され、それによって患者の血流中のペプチド化合物の生物学的有効濃度が低下し、そして有害な副作用が最少となるであろう。加えて、結合させられた抗体−ペプチド複合体は、患者の血流からのペプチド化合物と結合体のクリアランスを容易にするであろう。
【０２０１】
十分に記載されてきた本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、さらに認識され、そして理解することができる。
【実施例】
【０２０２】
（実施例１〜５）
Ｃ３４のシステイン酸誘導体の合成と精製
Ｃ３４のシステイン酸誘導体の合成は、ペプチドの作製の間に手作業による介入を伴うＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上での自動化された固相手順を使用して行った。合成は、Ｆｍｏｃ保護されたＲａｍａｇｅアミドリンカー樹脂上で、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用して行った。カップリングは、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を活性化因子の混合物としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中で使用することによって行った。Ｆｍｏｃ保護基を２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。ペプチドが樹脂から切り離されると遊離のＮ_α末端が生じるように、Ｂｏｃ保護されたアミノ酸をＮ末端に使用した。シグマコーティッドガラス反応容器を合成の際に使用した。
【０２０３】
（実施例２）
ＣＡ−Ｃ３４の合成
ＣＡ−Ｃ３４は以下のアミノ酸配列を有する：
【０２０４】
【化２８−２】

ＣＡ−Ｃ３４の改変されたペプチドを以下のように合成した：
工程１：１００μモルスケールでのＣＡ−Ｃ３４の固相ペプチド合成を、手作業による固相合成、自動化された固相合成、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＲａｍａｇｅ樹脂を使用して行った。以下の保護されたアミノ酸を順番に樹脂に付加させた：
【０２０５】
【化２８−３】

これらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化させた。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して２０分間行った（工程１）。
【０２０６】
工程２：ペプチドを、８５％のＴＦＡ／５％のＴＩＳ／５％のチオアニソールおよび５％のフェノールを使用して樹脂から切断し、続いてドライアイス冷（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿させ、回収した。
【０２０７】
（実施例３）
ＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）の合成
ＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）は以下のアミノ酸配列を有する：
【０２０８】
【化２８−４】

工程１：１００μモルスケールでのＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）の固相ペプチド合成を、手作業による固相合成、自動化された固相合成、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＲａｍａｇｅ樹脂を使用して行った。以下の保護されたアミノ酸を順番に樹脂に付加させた：
【０２０９】
【化２８−５】

これらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化させた。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して２０分間行った（工程１）。
【０２１０】
工程２：ペプチドを、８５％のＴＦＡ／５％のＴＩＳ／５％のチオアニソールおよび５％のフェノールを使用して樹脂から切断し、続いてドライアイス冷（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿させ、回収した。
【０２１１】
（実施例４）
ＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）の合成
ＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）は以下のアミノ酸配列を有する：
【０２１２】
【化２８−６】

工程１：１００μモルスケールでのＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）の固相ペプチド合成を、手作業による固相合成、自動化された固相合成、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＲａｍａｇｅ樹脂を使用して行った。以下の保護されたアミノ酸を順番に樹脂に付加させた：
【０２１３】
【化２８−７】

これらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化させた。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して２０分間行った（工程１）。
【０２１４】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を手作業で、そして５ｍＬのＣ_６Ｈ_６：ＣＨＣｌ_３（１：１）：２．５％のＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％のＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解させた３等量のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４の溶液で樹脂を２時間処理することによって行った（工程２）。その後、樹脂をＣＨＣｌ_３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％のＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。
【０２１５】
工程３：その後、合成をＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨと３−マレイミドプロピオン酸の付加のために再度自動化した（工程３）。ＡＥＥＡ上の保護基（Ｆｍｏｃ）を先に記載したように除去し、それぞれのカップリングの間に、樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回、そしてイソプロパノールで３回洗浄した。
【０２１６】
工程４：ペプチドを８５％のＴＦＡ／５％のＴＩＳ／５％のチオアニソールおよび５％のフェノールを使用して樹脂から切断し、続いてドライアイス冷（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿させ（工程４）、回収した。
【０２１７】
（実施例５）
ＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）
ＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）は以下の配列を有する：
【０２１８】
【化２８−８】

工程１：１００μモルスケールでのＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）の固相ペプチド合成を、手作業による固相合成、自動化された固相合成、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＲａｍａｇｅ樹脂を使用して行った。以下の保護されたアミノ酸を順番に樹脂に付加させた：
【０２１９】
【化２８−９】

これらをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用して活性化させた。Ｆｍｏｃ保護基の除去は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジンの溶液を使用して２０分間行った（工程１）。
【０２２０】
工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護を手作業で、そして５ｍＬのＣ_６Ｈ_６：ＣＨＣｌ_３（１：１）：２．５％のＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％のＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解させた３等量のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４の溶液で樹脂を２時間処理することによって行った（工程２）。その後、樹脂をＣＨＣｌ_３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中の２０％のＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）で洗浄した。
【０２２１】
工程３：その後、合成をＦｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨと３−マレイミドプロピオン酸の付加のために再度自動化した（工程３）。ＡＥＥＡ上の保護基（Ｆｍｏｃ）を先に記載したように除去し、それぞれのカップリングの間に、樹脂をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で３回、そしてイソプロパノールで３回洗浄した。
【０２２２】
工程４：ペプチドを８５％のＴＦＡ／５％のＴＩＳ／５％のチオアニソールおよび５％のフェノールを使用して樹脂から切断し、続いてドライアイス冷（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿させ（工程４）、回収した。
【０２２３】
精製手順：
Ｃ３４の改変されたペプチドをそれぞれ、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）分取バイナリーＨＰＬＣシステムを使用して、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０２２４】
例示的な誘導体の精製は、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ_２Ｏ中の０．１％のＴＦＡ；溶媒Ａ）とアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ_３ＣＮ中の０．１％のＴＦＡ；溶媒Ｂ）で平衡化させたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０μフェニル−ヘキシル、５０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（粒子１０μ）を使用して行った。溶離は、２８〜３８％のＢ勾配を１８０分間にわたって５０ｍＬ／分で流すことによって行った。ペプチドを含む画分を、２１４ｎｍと２５４ｎｍのＵＶ吸光度（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）によって検出した。
【０２２５】
画分を２５ｍＬのアリコートの中に回収した。所望される生成物を含む画分を、ＬＣ／ＭＳ上への直接の注入後の質量の検出によって同定した。選択した画分をその後、分析用ＨＰＬＣ（２０分間にわたる２０〜６０％のＢ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５μフェニル−ヘキシル、１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、０．５ｍＬ／分）によって分析して、≧９０％の純度を有している画分をプールするために同定した。プールを液体窒素を使用して凍結乾燥させ、その後、少なくとも２日間凍結乾燥させて白色粉末を得た。
【０２２６】
ＩＶ−フローチャート：
同じ合成反応スキームを全ての誘導体に使用した。ＣＡ−Ｃ３４とＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）についての反応スキームを以下のフローチャートにおいて説明する。もちろん、ＡＥＥＡおよびＭＰＡの付加に伴うＡｌｏｃ除去工程はＣＡ−Ｃ３４については省略した。
【０２２７】
【化２９】

（実施例６）
Ｃ３４のシステイン酸誘導体の溶解度アッセイ
ａ．溶解度アッセイは、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（開始時ｐＨ８）水溶液中で行った。高い緩衝液濃度がＨＰＬＣによる精製の後にＣ３４誘導体とともに残っている過剰量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を中和するために有用であることが明らかにされている。
【０２２８】
５．８〜７．０の最終的なｐＨが様々なＣ３４誘導体の溶解度を維持するためには適している。したがって、開始緩衝液をｐＨ８．０で調製し；そしてＣ３４誘導体の可溶化によりおよそ６．３の最終的なｐＨが生じた。表２は、Ｎ末端にシステイン酸（ＣＡ）を持つかまたは持たない、そしてＣ末端にＬｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を持つかまたは持たないＣ３４の溶解限度を示す。さらに、表１に示す最終的なオスモル濃度は、これらの最終的な溶液が等張性であることを明らかにしている。
【０２２９】
【表２】

天然のＣ３４は１５．７５ｍｇ／ｍｌでは溶解性であることが明らかであり、得られる溶液は数分以内にゲルを形成する。Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）は、これが溶液に投入されると直ちにゲルを形成し、さらに緩衝液を加えても決して化合物を可溶化させることはできない。表１から注目され得るように、これらの化合物の両方のＮ末端でのシステイン酸の付加は、Ｃ３４に対して有意に高い溶解度（すなわち、それぞれ２９．３ｍｇ／ｍｌおよび３３．８ｍｇ／ｍｌ）を付与する。
【０２３０】
ｂ．５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で３０ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌのＣ３４に連結させられたＮ末端が改変されたＡＥＥＡ−ＭＰＡ（Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４）、およびＡＥＥＡリンカーを介してＭＰＡに連結させられた３５位にリジン付加を有しているＮ末端システイン酸が改変されたＣ３４（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））の溶解度
１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
Ａ−２Ｍのリン酸二水素ナトリウム、無水物、ＵＱＡＭ、ＯＭ−２７、Ｓ１８３５ １Ｍ＝１４１．９６ｇ／１Ｌ、２Ｍ＝１３．３５６８ｇ／４０ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ Ｈ_２Ｏ。
Ｂ−２Ｍのリン酸一ナトリウム、一水和物、ＵＱＡＭ、ＯＭ−２７、Ｓ１８２０ １Ｍ＝１３７．９９ｇ／１Ｌ、２Ｍ＝１１．０３９２ｇ／４０ｍｌのｎａｎｏｐｕｒｅ Ｈ_２Ｏ
Ｃ−Ｍｉｘ ３０ｍｌ ｎａｎｏｐｕｒｅ Ｈ_２Ｏ＋およそ２８ｍｌのリン酸二水素ナトリウム＋１．５ｍｌのリン酸一ナトリウム。ｐＨが８．０であるかどうかを確認する。容量をリン酸二水素ナトリウムで調整する
Ｄ−最終ｐＨを８に（実際には７．９８）に調整する。
【０２３１】
５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を等量のｎａｎｏｐｕｒｅ Ｈ_２Ｏ（濾過していない）と混合する。最終的なｐＨは８．０である。
【０２３２】
ｃ．５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中で１００ｍｇ／ｍｌでのＷ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４および（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））の溶解度
化合物：
Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４ Ｂａｔｃｈ Ｂ，ロット番号ＪＣ−２０５−１２，Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｎｏ １１３９．
塩を含む１Ｍ＝４７６９．１＝１２．６４ｍｇ重量
塩を含まない１Ｍ＝４５４１．１＝１２．０３５７ｍｇ
純度＝９０．８％＝１００ｍｇ／ｍｌについて１０９．３ｕｌの５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中の１０．９２８ｍｇ。
【０２３３】
注釈：ガラスバイアル中の粉末に対して緩衝液を加えた。１分間のボルテックス（中速）後は可溶性であった。３つの粒子が残った。最終的なｐＨは６．８２であった（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔによるｐＨメーターで測定した、５００ｍＭのＮａＰ ｐＨ８緩衝液は８．１であった）。
【０２３４】
（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））Ｂａｔｃｈ Ｂ，ロット番号ＰＢ−２６２−０１，Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｎｏ １３５２．
塩を含む１Ｍ＝５１６５．２＝１２．１１ｍｇ重量
塩を含まない１Ｍ＝４８２０．２＝１１．３０ｍｇ
純度＝９２．８％＝１００ｍｇ／ｍｌについて１０４．９ｕｌの５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中１０．４８７ｍｇ。
【０２３５】
注釈：ガラスバイアルの中の粉末に対して緩衝液を加えた。１分３０秒間のボルテックス（中速）後はほとんど可溶性であった。２つの小さいペレットがガラスバイアルの底にあった。３分後、これらの２つの小さいペレットは溶解した。最終的なｐＨは６．７５であった（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔによるｐＨメーターで測定した、５００ｍＭのＮａＰ ｐＨ８緩衝液は８．１であった）。
【０２３６】
Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４と（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））は、一度溶解すれば黄色である。Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４はさらに濃い色である。
【０２３７】
結論：
Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４化合物と（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））化合物は、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で１００ｍｇ／ｍｌでは可溶性である。それらの最終的なｐＨは許容される限度、すなわち６．８を上回る。これらの化合物についてのｐＨの許容限度は６．２である。
【０２３８】
ｄ．５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中の１５０ｍｇ／ｍｌでのＷ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４および（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））の溶解度
Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４ Ｂａｔｃｈ Ｂ，ロット番号ＪＣ−２０５−１２，Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｎｏ １１３９．
塩を含む１Ｍ＝４７６９．１＝１１．９７ｍｇ重量
塩を含まない１Ｍ＝４５４１．１＝１１．３９８ｍｇ
純度＝９０．８％＝１５０ｍｇ／ｍｌについて６９ｕｌの５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中の１０．３５ｍｇ。
【０２３９】
注釈：緩衝液をガラスバイアル中の粉末に対して加えた。１分間のボルテックス（中速〜高速）後は可溶性であった。最終的なｐＨは６．６０であった（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔによるｐＨメーターで測定した、５００ｍＭのＮａＰ ｐＨ８緩衝液は８．２３であった）。
【０２４０】
（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））Ｂａｔｃｈ Ｂ，ロット番号ＰＢ−２６２−０１，Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ ｎｏ １３５２．
塩を含む１Ｍ＝５１６５．２＝１２．４８ｍｇ重量
塩を含まない１Ｍ＝４８２０．２＝１１．６４ｍｇ
純度＝９２．８％＝１５０ｍｇ／ｍｌについて７２．０５ｕｌの５００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中の１０．８０８ｍｇ。
【０２４１】
注釈：ガラスバイアルの中の粉末に対して緩衝液を加えた。１分間のボルテックス（中速〜高速）後はほとんど可溶性であった。１つの小さいペレットがガラスバイアルの底にあった。１０分後、この小さいペレットは溶解した。最終的なｐＨは６．５７であった（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔによるｐＨメーターで測定した、５００ｍＭのＮａＰ ｐＨ８緩衝液は８．２３であった）。
【０２４２】
Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４と（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））は一度溶解すると黄色である。Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４はさらに濃い色である。
【０２４３】
結論：Ｗ１（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）−Ｃ３４と（ＣＡ Ｋ３５（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ−Ｃ３４））はいずれも、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中では１５０ｍｇ／ｍｌで可溶性である。
【０２４４】
（実施例７）
Ｃ３４のシステイン酸誘導体の活性アッセイ
第１の活性アッセイ：抗ＨＩＶ−１に誘導される細胞と細胞の融合のアッセイ
様々な抗膜融合性化合物とそれぞれの予め形成させたアルブミン結合体の効力を、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，３１０ Ｅａｓｔ ６７^ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００２１においてＳｈｉｂｏ Ｊｉａｎｇ博士と共同研究者らによって設計されたＨＩＶ−１に誘導される細胞と細胞の融合のアッセイを使用して評価した。ＨＩＶに誘導される細胞と細胞の融合に対するＣ３４の阻害活性は以前に記載されているように検出した（Ｊｉａｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２０００）Ａ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ＨＩＶ Ｅｎｔｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ ３９２６：２１２−２１９）。
【０２４５】
簡単に説明すると、化合物を最初に、ストック溶液としてリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に１００μＭに稀釈し、その後、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭに培養培地中にさらに稀釈した。５０μｌのこの化合物溶液をカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識した５０μｌのＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ感染Ｈ９細胞（Ｈ９／ＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ）と、２×１０^５細胞／ｍｌで混合した。３７℃で２時間の共培養の後、カルセインで標識されたＨ９／ＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ細胞を、ＭＴ−２細胞と融合したものまたは融合していないものを両方、それぞれ、４８５ｎＭおよび５３５ｎｍのフィルター励起波長を使用して、接眼ミクロメーターディスク（１０×１０ｍｍ ｓｑ．）と２０×の対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｎｎａｎｙ）下でカウントした。融合した細胞は融合していない細胞よりもはるかに大きく（少なくとも２倍）、したがって、融合した細胞中での蛍光の強度は、１つの細胞から２つ以上の細胞へのカルセインの拡散が原因で、融合していない細胞中での蛍光強度よりも弱い。１ウェルあたり４つの領域を試験し、細胞融合の割合を以下の式によって計算した：融合した細胞／（融合した細胞＋融合していない細胞）×１００％。
【０２４６】
ポジティブ対照のウェルに、５０μｌのカルセインで標識したＨＩＶ感染細胞を添加した。ネガティブ対照のウェルには、培養培地と、カルセインで標識した非感染Ｈ９細胞を添加した。細胞融合の阻害率（％）を以下の式を使用して計算した：［１−（Ｅ−Ｎ）／（Ｐ−Ｎ）］×１００％、式中、「Ｅ」は実験グループにおける細胞融合の割合（％）を示し、「Ｐ」は、試験化合物を添加しなかったポジティブ対照グループにおける融合の割合（％）を示し、「Ｎ」は、カルセインで標識したＨ９／ＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ細胞をカルセインで標識したＨ９細胞で置換したネガティブ対照グループにおける融合の割合（％）を意味する。抗ウイルス化合物による細胞融合の５０％の阻害のための濃度（ＩＣ_５０）を、Ｔ．Ｃ．Ｃｈｏｕ博士から懇意によって提供されたコンピュータープログラム（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ Ｈａｙｂａｌｌ，Ｍ．Ｐ．，ＣａｌｃｕＳｙｎ：Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｄｏｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９１）Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，ＭＯ６３１３５，ＵＳＡ，ＢＩＯＳＯＦＴ）を使用して計算した。
【０２４７】
表３は、Ｎ末端にシステイン酸を持つかまたは持たない、そして基Ｌｙｓ（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介してヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合させられているかまたは結合させられていないＣ３４の抗膜融合活性を示す。
【０２４８】
【表３】

表３に示すように、Ｃ３４の抗膜融合活性とＣＡ−Ｃ３４の抗膜融合活性との間では有意な差は観察されなかった。したがって、Ｃ３４のＮ末端でのシステイン酸の付加は、Ｃ３４の抗膜融合活性に対してネガティブな影響は与えない。
【０２４９】
表２もまた、それらのＣ末端へのＣ３４およびＣＡ−Ｃ３４に対するＬｙｓ（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）のカップリング、それに続くＨＳＡに対するそれらの結合が、それらの抗膜融合活性に対して有意なネガティブな影響を持たないことを示している。
【０２５０】
（実施例８）
第２の活性のアッセイ：ヒトＰＢＭＣ中でのＨＩＶ_ＩＩＩｂの複製の阻害
化合物の抗ＨＩＶ効力と細胞傷害性を、ＨＩＶ−１株ＩＩＩＢを使用したＰＢＭＣをベースとするアッセイにおいて急性感染後に評価した。これらの実験は、以下に記載するプロトコールにしたがってＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，４３１ Ａｖｉａｔｉｏｎ Ｗａｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ．で行った。
【０２５１】
ａ．ＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染
ＨＩＶおよびＨＢＶについて血清反応陰性である新鮮なヒトＰＢＭＣを、スクリーニングしたドナーから単離し、そしてＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡからも商業的に提供された。細胞を低速での遠心分離とＰＢＳ中への再懸濁によって２〜３回ペレット化／洗浄して、混入している血小板を取り除いた。その後、白血球保有血をダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ＤＰＢＳ）で稀釈し、５０ｍＬの遠心管の中でＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によるＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）；密度１．０７８＋／−０．００２ｇ／ｍｌ；カタログ番号８５−０７２−ＣＬ）の上に積層させ、次いで遠心分離した。バフィーコート層を、得られた界面から穏やかに吸引し、その後、低速遠心分離によってＰＢＳで洗浄した。３回目の洗浄の後、細胞をウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁させた。細胞を３７℃でインキュベートした。２日間のインキュベーションの後、ＰＢＭＣを遠心分離し、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、および組み換え体ヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁させた。ＩＬ−２を、ＰＨＡ分裂刺激によって開始させた細胞分裂を維持するために培養培地中に含めた。細胞を最長で２週間培養物中で維持し、単球を組織培養フラスコへの接着の結果として培養物から枯渇させた。
【０２５２】
標準的なＰＢＭＣアッセイについては、少なくとも２人の正常なドナーに由来するＰＨＡ−Ｐで刺激した細胞をプールし、新鮮な培地中に稀釈し、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって開発された標準的な形式で９６ウェル丸底マイクロプレートの内部ウェルにプレートした。２人以上のドナーに由来するＰＢＭＣのプールを、ＨＩＶ感染の量的および質的相違と、初代リンパ球集団のＰＨＡとＩＬ−２に対する全体的な応答によって生じる個々のドナーの間で観察されるばらつきを最小にするために使用した。それぞれのプレートには、ウイルス／細胞対照ウェル（細胞＋ウイルス）、実験用ウェル（化合物＋細胞＋ウイルス）、および化合物対照ウェル（細胞傷害性のＭＴＳモニタリングに必要な、化合物＋培地、細胞なし）を含めた。試験化合物の希釈物をマイクロタイターチューブの中に調製し、それぞれの濃度を標準的な形式を使用して適切なウェルの中に置いた。次いで、ＰＢＭＣに対する化合物の稀釈物の添加後、予め決定した希釈率のウイルスストック溶液を、それぞれの試験ウェルの中に入れた（最終的なＭＯＩ約０．１）。ウイルスストック溶液は、ＮＩＡＩＤ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから入手した継代数の低い臨床的な単離物ＨＩＶ−１_ＩＩＩＢから調製した。−８０℃で保存したＨＩＶ−１_ＩＩＩＢの予め滴定したアリコートを、使用の直前に生物学的安全キャビネットの中で室温になるように迅速に融解させた。ＨＩＶ−１はＰＢＭＣに対して細胞変性性ではないので、同じアッセイプレートを抗ウイルス効力と細胞傷害性の測定の両方に使用することができる。ＰＢＭＣ培養物を、３７℃、５％のＣＯ_２で感染後７日間維持した。
【０２５３】
ｂ．逆転写活性アッセイ
マイクロタイタープレートをベースとする逆転写酵素（ＲＴ）反応を利用した（Ｂｕｃｋｈｅｉｔら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ７：２９５−３０２，１９９１）。滴定したチミジン三リン酸（^３Ｈ−ＴＴＰ、８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）を、１ｍＣｉ／ｍｌで１：１のｄＨ_２Ｏ：エタノール中に入れた。ポリｒＡ：オリゴｄＴ鋳型：プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、１５０μｌのポリｒＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌのオリゴｄＴ（２０単位／ｍｌ）および５．３５ｍｌの滅菌ｄＨ_２Ｏと一緒にし、続いてアリコートする（１．０ｍｌ）ことによってストック溶液として調製し、−２０℃で保存した。ＲＴ反応緩衝液は毎日新しく調製し、これは、１２５μｌの１．０ＭのＥＧＴＡ、１２５μｌのｄＨ_２Ｏ、１２５μｌの２０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５０μｌの１．０ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０μｌの１．０ＭのＤＴＴ、および４０μｌの１．０ＭのＭｇＣｌ_２からなる。最終的な反応混合物は、１部の^３Ｈ−ＴＴＰ、４部のｄＨ_２Ｏ、２．５部のポリｒＡ：オリゴｄＴストック、および２．５部の反応緩衝液を合わせることによって調製した。１０μｌのこの反応混合物を丸底マイクロタイタープレートに入れ、１５μｌのウイルスを含む上清を添加し、混合した。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応容量をＤＥ８１フィルターマット（Ｗａｌｌａｃ）上にスポットし、５％のリン酸ナトリウム緩衝液または２×ＳＳＣ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の中でそれぞれ５分間を５回、蒸留水中でそれぞれ１分間を２回、７０％のエタノール中でそれぞれ１分間を２回洗浄し、そしてその後乾燥させた。取り込まれた放射活性（カウント毎分（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）、ＣＰＭ）を、標準的な液体シンチレーション技術を使用して定量した。
【０２５４】
ｃ．細胞傷害性を測定するためのＰＢＭＣの生存性についてのＭＴＳ染色
アッセイの最後に、アッセイプレートを可溶性のテトラゾリウムをベースとする色素ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）で染色して、細胞の生存性を決定し、化合物の細胞傷害性を定量した。ＭＴＳは、代謝活性のある細胞のミトコンドリア酵素によって代謝されて、可溶性のホルマザン産物を生じ、それにより、細胞の生存性と化合物の細胞傷害性の迅速な定量的分析が可能となる。ＭＴＳは、使用の前に調製の必要のない安定な溶液である。アッセイの最後に、１ウェルあたり２０μｌのＭＴＳ試薬を添加した。ＨＩＶ ＰＢＭＣアッセイのために、ウェルを３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの間隔は、それぞれの細胞のタイプの中での最適な色素の還元について経験的に決定された時間に基づいて選択した。接着性のプレートシーラーをリッドの代わりに使用し、密閉したプレートを可溶性のホルマザン産物を混合するために数回反転させ、プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘプレートリーダーを用いて４９０／６５０ｎｍで分光光度測定によって読み取った。
【０２５５】
ｄ．データ分析
社内コンピュータープログラム（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して、ＩＣ_５０（ウイルスの複製の５０％の阻害）、ＩＣ_９０（ウイルスの複製の９０％の阻害）、ＴＣ_５０（５０％の細胞傷害性）、ＴＣ_９０（９０％の細胞傷害性）、および治療指数（ＴＩ＝ＴＣ_５０／ＩＣ_５０）を計算した。データのグラフ表示を伴う抗ウイルス活性と細胞傷害性の両方についての生データは、個々の化合物の活性をまとめている印刷物に提供される。ＡＺＴを抗ＨＩＶアッセイにおいて関連するポジティブ対照化合物と平行して評価した。
【０２５６】
ｅ．結果
図１は、天然のＣ３４によるＰＢＭＣ中でのＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害を示す（曲線◆を参照のこと）。この化合物は、以下に示すように、ＰＢＭＣに対して有意な細胞傷害性の影響を全く示さなかった（曲線□を参照のこと）。
【０２５７】
図２は、Ｃ末端に付加されたリジンのεＮＨ_２上にＡＥＥＡ−ＭＰＡを有しているＣ３４のアルブミン結合体（すなわち、Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）：ＨＳＡ）によるＰＢＭＣ中でのＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害を示す（曲線◆を参照のこと）。この化合物は、以下に示すように、ＰＢＭＣに対して細胞傷害性の影響を全く示さなかった（曲線□を参照のこと）。
【０２５８】
図３は、Ｎ末端にシステイン酸を有しており、Ｃ末端に付加されたリジンのεＮＨ_２上にＡＥＥＡ−ＭＰＡを有しているＣ３４のアルブミン結合体（すなわち、ＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）：ＨＳＡ）によるＰＢＭＣ中でのＨＩＶ−１_ＩＩＩＢ複製の阻害を示す（曲線◆を参照のこと）。この化合物は、以下に示すように、ＰＢＭＣに対して細胞傷害性の影響を全く示さなかった（曲線□を参照のこと）。
【０２５９】
図１、２、および３に説明するデータに基づいて、両方のアルブミン結合体のＩＣ５０値を、天然のＣ３４と比較して表４に提供する。
【０２６０】
【表４】

表４は、天然のＣ３４、Ｃ３４のアルブミン結合体、およびＣＡ−Ｃ３４のアルブミン結合体についての類似する抗ＨＩＶ活性を示す。結論として、Ｎ末端でのシステイン酸の付加と、その後のＬｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介するアルブミンへの結合は、このアッセイにおいてＣ３４の活性にネガティブな影響を与えることはない。
【０２６１】
（実施例８）
さらなる抗膜融合性ペプチド誘導体
実験手順
以下の手順を以下に詳細に議論するような結果を得るために行った実験全体を通じて使用した。
【０２６２】
ＣＨＲペプチドアナログの合成は、ペプチドの作成の間に手作業による介入を伴うＳｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ上での自動化された固相手順を使用して行った。合成は、Ｆｍｏｃ保護されたＲａｍａｇｅアミドリンカー樹脂上で、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用して行った。カップリングは、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を活性化因子の混合物としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中で使用することによって行った。Ｆｍｏｃ保護基を２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。ペプチドが樹脂から切り離された後の遊離のα−Ｎ末端を作成するために、Ｂｏｃ保護されたアミノ酸をＮ末端に使用した。シグマコーティッドガラス反応容器を合成の際に使用した。
【０２６３】
マレイミドを分子のＣ末端部分に配置する場合（表５、アルブミン結合化合物ＶＩＩ、およびアセチル化結合化合物Ｘ）は、ペプチドの固相合成は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）の付加によって開始した。Ａｌｏｃは酸性培地に対して安定な特異的な直交する保護基である。その後、ペプチド鎖を、それらの側鎖が酸性培地に対して不安定な基で保護されているアミノ酸の連続する付加によって固体支持体上で伸張させた。ペプチド鎖が完了したら、Ｃ末端リジン上のＡｌｏｃ保護基を、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムを使用して選択的に除去した。その後、Ｆｍｏｃ−アミノエトキシエトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）リンカーを保護されていないリジンに対して化学的にカップリングさせた。伝統的なＦｍｏｃの脱保護プロトコールにしたがって、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）をＡＥＥＡスペーサーに化学的にカップリングさせた。最後に、酸不安定性の保護基をペプチドから切り離し、その後ペプチドを固体支持体から強酸の混合物を使用して切断した。マレイミドを分子（表５、マレイミド−化合物ＶＩＩＩ、アルブミン結合化合物ＶＩＩＩ）、およびアルブミン結合ＭＰＡ−ＡＥＥＡ−化合物ＶＩＩＩのＮ末端部分に配置する場合は、ペプチドの固相合成は融合ペプチド阻害剤の天然のアミノ酸配列によって開始した。
【０２６４】
【表５−１】

【０２６５】
【表５−２】

ペプチドの精製
生成物をそれぞれ、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）分取バイナリーＨＰＬＣシステムを使用して、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。全てのＤＡＣペプチドの精製は、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ_２Ｏ中の０．１％のＴＦＡ；溶媒Ａ）とアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ_３ＣＮ中の０．１％のＴＦＡ；溶媒Ｂ）で平衡化させたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａフェニル−ヘキシル（１０ミクロン、５０ｍｍ×２５０ｍｍ）カラムを使用して行った。溶離は、様々な勾配の溶媒Ｂを１８０分間かけて５０ｍＬ／分で流すことによって行った。ペプチドを含む画分を、２１４ｎｍと２５４ｎｍのＵＶ吸光度（Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ ＵＶＤ ＩＩ）によって検出した。
【０２６６】
画分を２５ｍＬのアリコートの中に回収した。所望される生成物を含む画分を、ＬＣ／ＭＳ上への直接の注入後の質量の検出によって同定した。選択した画分をその後、分析用ＨＰＬＣ（２０分間にわたる２０〜６０％のＢ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ５ ｍｉｃｒｏｎフェニル−ヘキシル、１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、０．５ｍＬ／分）によって分析して、≧９０％の純度を有している画分をプールするために同定した。その後、このプールを液体窒素を使用して凍結乾燥させ、続いて、少なくとも２日間凍結乾燥させて白色粉末を得た。
【０２６７】
アルブミン結合体の調製
ＨＳＡのシステイン−３４に対するマレイミド−Ｃ３４およびマレイミド−Ｔ−２０誘導体の結合と、それに続く疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用した精製は、最近、有効なプロセスとなった。結合工程には、それぞれのマレイミド−ペプチドをＨＳＡの２５％溶液（Ｃｏｒｔｅｘ−Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と混合する工程、および３７℃で３０分間インキュベートする工程が含まれる。ＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、得られた混合物を、５ｍＭのオクタン酸ナトリウムと７５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４からなる２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中に平衡化させたブチルセファロース４ファストフロー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填した５０ｍｌのカラム上に直接、２．５ｍｌ／分の流速でロードした。これらの条件下では、Ｃ３４−ＨＳＡ結合体は疎水性樹脂上に吸着したが、原則として全ての結合しなかったＨＳＡはカラムの空隙容量の中に溶離した。それぞれの結合体を、４倍を超えるカラム容量の徐々に低下する（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度（７５０ｎＭ〜０ｍＭ）の直線的勾配をかけることによって遊離の（未反応の）マレイミド−Ｃ３４誘導体の全てからさらに精製した。それぞれの精製した結合体を、その後、脱塩し、１０ｋＤａの超遠心分離フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して水の中で濃縮した。最後に、それぞれの結合体の溶液を、ｐＨ７の等張性の緩衝溶液中に再度処方した。それぞれの精製した試料の質量スペクトルによって、最も豊富なタンパク質産物がそれぞれのマレイミド誘導体を持つＨＳＡの１：１の共有複合体に相当することを確認し、それぞれの精製した試料の逆相ＨＰＬＣ分析によって、原則として全ての結合しなかった（遊離の）マレイミド誘導体の除去を確認した。個々のアルブミン結合体を滅菌した０．９％のＮａＣｌを使用して処方し、Ｔ−２０（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｐｈａｒｍａｃｙから入手した）を注射用の滅菌水中に溶解させ、ＨＣｌでｐＨ７に調整した。
【０２６８】
新しいヒトＰＢＭＣ中での抗ＨＩＶ効力の評価
ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．Ｇａｌｌｏ博士の懇意によりＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨを通じて入手した（Ｐｏｐｏｖｉｃ ＭＥ，Ｒｅａｄ−Ｃｏｎｎｏｌｅ Ｅ，Ｇａｌｌｏ ＲＣ（１９８４）Ｔ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ａｎｄ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｆｏｒ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ．Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：１４７２−１４７３；Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍ，Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ ＭＧ，Ｒｅａｄ Ｅ，Ｇａｌｌｏ ＲＣ（１９８４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ ａｎｄ ｐｒｅ−ＡＩＤＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｒａｔｎｅｒ Ｌら（１９８５）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＩＤＳ ｖｉｒｕｓ，ＨＴＬＶ−ＩＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８３）．ＨＩＶおよびＨＢＶについて血清反応陰性である新しいヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をスクリーニングしたドナーの血液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｌｍａｒ，ＰＡ）から、製造業者の説明書にしたがって、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によるＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）；密度１．０７８＋／−０．００２ ｇ／ｍｌ）単離した。細胞を４μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ）中での４８〜７２時間のインキュベーションによって刺激した。分裂刺激を、２０Ｕ／ｍＬの組み換え体ヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓてｍｓ、Ｉｎｃ）の培養培地への添加によって維持した。少なくとも２人のドナーに由来するＰＨＡで刺激したＰＢＭＣをプールし、新鮮な培地中に稀釈し、９６ウェルプレートに対して５×１０^４細胞／ウェルで添加した。細胞を９種類の異なる試験化合物濃度（３連のウェル／濃度）の存在下で感染させ（最終的なＭＯＩ約０．１）、７日間インキュベートした。ウイルス阻害のレベルを決定するために、細胞を含まない上清試料を逆転写酵素活性の分析のために回収した（Ｂｕｃｋｈｅｉｔ ＲＷ，Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ Ｒ（１９９１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ ７：２９５−３０２）。上清試料の除去後、化合物の細胞傷害性を、製造業者の説明書にしたがって３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって測定した。社内コンピュータープログラムを使用して、ＩＣ_５０（ウイルスの複製の５０％の阻害）、ＩＣ_９０（ウイルスの複製の９０％の阻害）、ＴＣ_５０（細胞生存性の５０％の低下）、および選択性指数（ＩＣ_５０／ＴＣ_５０）を決定した。ＡＺＴ（ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）をアッセイ対照化合物として用いた。
【０２６９】
ウイルス
以下の試薬は、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨを通じて入手し：ｐＮＬ４−３はＭａｌｃｏｌｍ Ｍａｒｔｉｎから入手した（Ａｄａｃｈｉ Ａら（１９８６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ５９：２８４−２９１．）。
【０２７０】
ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＰｒｏｇｒａｍによるＮＬ４−３には、ｇｐ４１中に予想しなかった変異形ＤＩＶ（Ｇ３６Ｄ）変異が含まれており、これは、インビトロでＴ−２０に対して８倍の耐性を付与する。Ｔ−２０−感受性ＮＬ４−３（ＮＬ４−３Ｇ）を、ｇｐ４１のアミノ酸位置３６でコンセンサス配列と一致するように部位特異的突然変異誘発によって変更させた（アスパラギン酸をグリシンで置き換えた）。ＮＬ４−３ＧおよびＮＬ４−３Ｄ（もともとのクローン）のストックを、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションと３日目の上清の回収によって調製した。ウイルスストックは、ＥＬＩＳＡによるｐ２４検出を用いて、ＰＨＡで活性化させたＰＢＭＣ中での５０％終点アッセイによって滴定した。
【０２７１】
結果
ＰＢＭＣをベースとするアッセイを使用したインビトロでの抗ウイルス活性
それぞれのアルブミン結合体の抗ウイルス活性を、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢに対するＰＢＭＣをベースとするアッセイを使用してインビトロでもともとのペプチド阻害剤に対して比較した（Ｐｏｐｏｖｉｃ ＭＥ，Ｒｅａｄ−Ｃｏｎｎｏｌｅ Ｅ，Ｇａｌｌｏ ＲＣ（１９８４）Ｔ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ａｎｄ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｆｏｒ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ．Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：１４７２−１４７３；Ｐｏｐｏｖｉｃ Ｍ，Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ ＭＧ，Ｒｅａｄ Ｅ，Ｇａｌｌｏ ＲＣ（１９８４）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ ａｎｄ ｐｒｅ−ＡＩＤＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：４９７−５００；Ｒａｔｎｅｒ Ｌら（１９８５）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＩＤＳ ｖｉｒｕｓ，ＨＴＬＶ−ＩＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８３；Ｂｕｃｋｈｅｉｔ ＲＷ，Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ Ｒ（１９９１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＨＩＶ−１ ｉｓｏｌａｔｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒ ７：２９５−３０２）。興味深いことに、ＰＣ−１５０５（アルブミン結合化合物ＶＩＩＩ）、化合物Ｃ（アルブミン結合化合物ＶＩＩ）、および化合物Ｄ（アルブミン結合化合物ＶＩ）の抗ウイルス活性は全て、インビトロではＣ３４ペプチドおよびＴ−２０に対して本質的に等しい効力があった。すなわち、Ｃ３４ペプチドのＮ末端（ＰＣ−１５０５（アルブミン結合化合物ＶＩＩＩ）および化合物Ｃ（アルブミン結合化合物ＶＩＩ）またはＣ末端（化合物Ｄ（アルブミン結合化合物ＶＩ））のいずれかでの反応性マレイミド基の置換、それに続くアルブミンの結合は、融合阻害剤の抗ウイルス活性を変化させることはなかった（表７）。Ｔ−２０へのアルブミンの結合の後は、反応性ペプチドが、結合がペプチドのＮ末端で起こるように設計されている場合（化合物Ｅ アルブミン結合化合物ＩＩＩ）には、抗ウイルス活性は極めて良好に保存されていたが、ペプチドのＣ末端でアルブミンに対する結合が起こる場合には、このペプチドの抗ウイルス活性の有意な低下が観察された（化合物Ｆ 化合物Ｘ−ｄｏｅｓ ｃｐｄ Ｆは、Ｅｒｉｋｓｏｎにおいて同等であった（化合物Ｉ−ＶＩＩＩ））。
【０２７２】
【表６】

Ｃ３４ペプチド、化合物ＶＩＩＩ、およびｒＨＡのラットでの薬物動態プロフィール
この研究で観察された抗ウイルス活性が、遊離のペプチド、あるいはマレイミドとシステイン−３４との間での共有結合の可逆性ではなく、アルブミン結合体の作用が原因であることを確認するために、全てのアルブミン結合体を試験前に精製してあらゆる結合していないペプチドを除去し、化合物ＶＩＩＩの薬物動態プロフィールを、ラットにおいてＣ３４ペプチド（図５Ａ）とｒＨＡ（図５Ｂ）に対して比較した。明らかに、Ｃ３４ペプチドの暴露はアルブミン結合の後に激的に改善され、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩの薬物動態プロフィールがｒＨＡの薬物動態プロフィールと重なり合うという事実によって、Ｃ３４ペプチドがアルブミンの半減期に近い半減期をとることを確認した。Ｃ３４ペプチドとＨＳＡについて測定した薬物動態曲線の重ね合わせはまた、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩの静脈内または皮下投与のいずれかの後、少なくとも３０時間、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用しても観察された（データは示さない、ラットでのアルブミンのＴ_１／２よりもマウスでのアルブミンのＴ_１／２は短い）。逆に、結合体からのＣ３４ペプチドのゆっくりとした持続的な放出は、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩの全暴露がｒＨＡのものよりも劣るので、２つの薬物動態プロフィールはもはや重なり合わななくなるであろう。さらに、結合体から放出されたＣ３４ペプチドは、インビボでは極めて短い半減期に曝され、長期持続型の予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩに対して比較すると、抗ウイルス有効性は限定される。したがって、システイン−３４に対してマレイミドを連結させる結合はインビボで極めて安定であり、Ｃ３４ペプチドは迅速な腎臓でのクリアランスとペプチダーゼによる分解に対してより安定となる。まとめると、インビトロおよびインビボでの全てのアルブミン結合体についての抗ウイルス活性は、マレイミド−システイン−３４結合の可逆性ではなく、化学的に安定な結合体の作用だけによると結論付けることができる。
【０２７３】
考察
ＨＩＶ ｇｐ４１のＮ末端ヘリックス領域（ＮＨＲ）とＣ末端ヘリックス領域（ＣＨＲ）の配列をベースとする合成のペプチドは、多段階の融合プロセスの間に露出させられたｇｐ４１結合部位について競合することによってＨＩＶの進入を阻害することが示されている（Ｃｈａｎ ＤＣ，Ｆａｓｓ Ｄ，Ｂｅｒｇｅｒ Ｊ Ｍ，Ｋｉｍ Ｐ Ｓ（１９９７）Ｃｏｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇｐ４１ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＨＩＶ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ ８９：２６３−２７３；Ｃｈａｎ ＤＣ，Ｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ ＣＴ，Ｋｉｍ ＰＳ（１９９８）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａ ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ ｃａｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｏｆ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｇｐ４１ ｉｓ ａｎ ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１５６１３−１５６１７）。臨床では、これらのペプチドのほとんどの成功は、ｇｐ４１のＣＨＲに由来するＴ−２０（Ｔｒｉｍｅｒｉｓ／Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｃｉｅｎｃｅｓによるＦｕｚｅｏｎ（登録商標））である。低分子と比較すると、ペプチドの商業的有用性は、多くの場合はそれらのコスト、ならびにそれらの短い半減期とインビトロでの低い分布によって限定される。本発明者らは、他のクラスのペプチドについてすでに行われているように、ヒトアルブミンのシステイン−３４に共有結合するようにＣＨＲペプチド（Ｃ３４およびＴ−２０）を操作することによって、これらの欠点に取り組もうと考えた（Ｈｏｌｍｅｓ ＤＬら（２０００）Ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ １：１ ｏｐｉｏｉｄ：ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｕｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １１：４３９−４４４；Ｌｅｇｅｒ Ｒら（２００３）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ ＆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １３：３５７１−３５７５；Ｌｅｇｅｒ Ｒら（２００４）Ｋｒｉｎｇｌｅ ５ ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｏｒｇ ＆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １４：８４１−８４５；Ｌｅｇｅｒ Ｒら（２００４）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＪＣ−１１３１−ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ＧＬＰ−１（７−３６）ａｎａｌｏｇ．Ｂｉｏｏｒｇ ＆ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １４：４３９５−４３９８；Ｊｅｔｔｅ Ｌら（２００５）Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ｈＧＲＦ）_１−２９ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ＧＲＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｉｎ ｒａｔｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＪＣ−１２９５ ａｓ ａ ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ＧＲＦ ａｎａｌｏｇ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４６：３０５２−３０５８；Ｔｈｉｂａｕｄｅａｕ Ｋら（２００５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １６：１０００−１００８）。すなわち、本発明者らは、ＣＨＲ−ペプチド−ＨＳＡ結合体がもともとの融合阻害剤のはるかに短い半減期とは反対に、アルブミンの半減期に近い体内での半減期となるであろうと仮定した。
【０２７４】
本明細書中に示した結果は、ｇｐ４１のＮＨＲが、もともと考えられていたよりも利用しやすいことを示唆している。例えば、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩを使用して示されるようにそのような競合阻害を利用できるようにするためには、ｇｐ４１は、標的細胞が存在しない条件で（すなわち、細胞を含まないウイルスまたは非感染細胞の状況下で）ＮＨＲ領域を露出させる配座平衡に関与し得るか、あるいは、「エントリークロウ（ｅｎｔｒｙ ｃｌａｗ）」の中に形成されるプレヘアピン中間体（Ｓｏｕｇｒａｔ Ｒら（２００７）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＳＩＶ／ＨＩＶ−１：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ３：０５７１−０５８１）が、６ヘリックスの束状構造の形成、その後の脂質の混合および膜貫通工程の前に十分に溶媒に露出させられる。すなわち、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩについて約７１ｋＤａのＭｗを用いた場合には、本発明者らの結果は、ｇｐ４１のＮＨＲ−三量体を評価するための分子量カットオフが、これまでに報告されている（すなわち、＜２５ｋＤａ）よりもはるかに大きいことを示唆している（１１）。第２に、Ｃ３４ペプチドのＮ末端セグメント^６２８ＷＭＥＷ^６３１は、ＨＩＶ−１の侵入を阻害するＣ３４ペプチドの能力に不可欠であると仮定されるｇｐ４１コイルドコイルキャビティ結合残基を提示する（１８，１９）。したがって、予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩ（ＡＥＥＡリンカーからなる）または化合物Ｃ予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩ（ＡＥＥＡリンカーが存在しない）のいずれかの場合においては、どのようにすれば、Ｃ３４ペプチドの^６２８ＷＭＥＷ^６３１セグメントをｇｐ４１のＮＨＲに到達させることが可能であるか、そして同時に、アルブミンの表面に対して永久的に結合し、近位に接近して配置されるか？予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩＩおよび化合物Ｃ予め形成させた結合体−化合物ＶＩＩの抗ウイルス活性の保持についての１つの可能性のある説明は、血清アルブミンがいくつかの立体構造状態をとるように誘導することができる高度に可撓性のタンパク質であるという事実である（Ｐｅｔｅｒｓ Ｔ，Ｊｒ（１９９６）Ａｌｌ ａｂｏｕｔ ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）。例えば、Ｃ３４ペプチドはアルブミンのシステイン−３４に永久的に結合させられるので、アルブミンの拘束されていないＮ末端ドメイン（すなわち、ジスルフィド結合が存在しない）内での局所立体構造転位は、ｇｐ４１のＮＨＲ領域上への融合阻害剤の正確な挿入を容易にするための部分的な巻き戻しを生じさせることができる。したがって、システイン−３４上以外のアルブミン分子内のほかの場所にＣ３４ペプチドを配置することにより、この融合阻害剤についての抗ウイルス活性の同様の保存が導かれるかどうか（例えば、リジン残基、Ｎ末端、またはＣ末端）、あるいは、抗ウイルス活性の同様の保存が、他の豊富に存在する高分子量の血清タンパク質（例えば、トランスフェリンまたはＩｇＧ）に対するＣ３４ペプチドの永久的な結合の後に観察されるであろうかどうかは明らかにはなっていない。したがって、アルブミン分子が、単にタンパク質貨物（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｇｏ）としての役割を担うだけではなく、活発な参加型の役割を担っている可能性もある。例えば、マレイル化（ｍａｌｅｙｌａｔｅｄ）−、アコニチニル化−、およびスクシニル化されたアルブミンは、インビトロで強力なＨＩＶ−１侵入阻害剤として機能する（３５〜３８）。
【０２７５】
加えて、Ｃ３４ペプチドの中に見られる３４個のアミノ酸残基のうちの２４個が、Ｔ−２０の中で見られるアミノ酸残基と重複すると仮定すると、Ｔ−２０は、このペプチドＣ末端での修飾後にアルブミン結合体についてより少ない候補となることが可能であるかどうか、一方では、抗ウイルス活性の保持の改善が、Ｔ−２０がそのＮ末端で改変された場合に観察されるかどうか？この知見についての１つの可能性のある説明は、Ｔ−２０が原因であるＨＩＶ−１の阻害機構がＣ３４ペプチドのものとは異なることを示唆している最近の証拠である（Ｌｉｕ Ｓら（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：１１２５９−１１２７３；Ｍｕｎｏｚ−Ｂａｒｒｏｓｏ Ｉ，ら（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４０：３１５−２３；Ｋｌｉｇｅｒ Ｙら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１３９１−１３９７）。例えば、Ｔ−２０はまた、血漿膜へのｇｐ４１の動員、その後の脂質混合工程後のオリゴマー形成を阻害することが示されているが、Ｃ３４ペプチドは６ヘリックスの束状構造の形成後はその阻害効果を発揮することができないことが明らかにされている（Ｌｉｕ Ｓら（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：１１２５９−１１２７３）。すなわち、Ｔ−２０は、血漿膜へのその挿入後にそのような阻害機能を行うこと、そしてＴ２０の疎水性Ｃ末端セグメント^６６６ＷＡＳＬＷＮＷＦ^６７３は、これらの疎水性相互作用の達成に重要と考えられることが提案されている（Ｍｕｎｏｚ−Ｂａｒｒｏｓｏ Ｉ，ら（１９９８）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４０：３１５−２３；Ｋｌｉｇｅｒ Ｙら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１３９１−１３９７）。さらに具体的には、Ｔ−２０は、血漿膜の近位に配置されるｇｐ４１中の対応する配列に結合することによって、ｇｐ４１の動員とオリゴマー形成を阻害する（Ｍｕｎｏｚ−Ｂａｒｒｏｓｏ Ｉ，Ｄｕｒｅｌｌ Ｓ，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ Ｋ，Ａｐｐｅｌｌａ Ｅ，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ Ｒ（１９９８）Ｄｉｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−１ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｒｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｇｐ４１．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４０：３１５−２３；Ｋｌｉｇｅｒ Ｙら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１３９１−１３９７）。したがって、^６６６ＷＡＳＬＷＮＷＦ^６７３配列がアルブミン分子にすぐ隣接して配置されている化合物Ｆ化合物Ｘについて観察された抗ウイルス活性の大幅な低下は、結合していない（遊離の）Ｔ−２０ペプチドと同程度に有効に、脂質混合工程後にこのペプチドが機能できないことに寄与している可能性がある。逆に、^６６６ＷＡＳＬＷＮＷＦ^６７３配列は、化合物Ｅ（化合物ＩＸ）の構成においては立体構造上の拘束が少ない。まとめると、本発明者らの結果は、Ｔ−２０とＣ３４ペプチドがＨＩＶ−１融合の同じ工程では機能していないことを示唆した報告を明白にサポートする証拠を提供する。
【０２７６】
本明細書中に示される結果は、膜融合とウイルスの侵入について類似する機構を採用するＨＩＶウイルスと他のウイルスの阻害のための、この新規のクラスのアルブミン−ペプチド結合体についての原理の証明を確立する。結合していない（遊離の）ペプチド阻害剤と比較すると、アルブミン結合体は、全ＨＩＶ感染細胞のおよそ９８％の解剖学上のホームを示すリンパ系に対する有意に改善された暴露を導き得る（Ｓｔｅｂｂｉｎｇ Ｊ，Ｇａｚｚａｒｄ Ｂ，Ｄｏｕｅｋ ＤＣ（２００４）Ｗｈｅｒｅ ｄｏｅｓ ＨＩＶ ｌｉｖｅ？ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０：１８７２−１８８０）。この改善は、血清アルブミンについて観察された血漿濃度比に対する有意な定常状態リンパに（Ｂｅｎｔ−Ｈａｎｓｅｎ Ｌ（１９９１）Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｏｆ ａｌｂｕｍｉｎ．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６０３：５−１０（Ｒｅｖｉｅｗ）；Ｐｏｒｔｅｒ ＣＪＨ，Ｃｈａｒｍａｎ ＳＡ（２０００）Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８９：２９７−３１０）、および１６〜２０ｋＤａより大きい皮下注射されたタンパク質について観察された効率的なリンパの取り込み、輸送、および透過性に（Ｐｏｒｔｅｒ ＣＪＨ，Ｃｈａｒｍａｎ ＳＡ（２０００）Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ８９：２９７−３１０）主に原因があると予想され得る。
【０２７７】
最後に、Ｃ３４ペプチドおよび多くの他の抗膜融合性ペプチド中に見られる疎水性残基の高い含有量が原因で、アルブミン結合体はまた、これらが皮下送達に適している単純な水性処方物中に入れられる場合には、ペプチドのこのファミリーについて一般的に観察される低い溶解限度の矯正をも助け得る。例えば、Ｃ３４ペプチドの溶解限度は、水性緩衝液中では１ｍｇ／ｍｌを超えないことが明らかであるが、ＰＣ−１５０５の溶解限度は、アルブミンの溶解限度と類似することが明らかにされており、これはＣ３４ペプチドのおよそ１６ｍｇ／ｍｌに相当する（すなわち、２５％（ｗ／ｖ）の溶液＝ＰＣ−１５０５の２５０ｍｇ／ｍｌ、およそＣ３４ペプチドの１６ｍｇ／ｍｌ）。
【０２７８】
まとめると、アルブミンのシステイン−３４を介する抗膜融合性ペプチドの結合によって、ｇｐ４１のＮＨＲトリマーに一般的に関係している立体的なブロックが克服され、それにより、強力であり、強い中和活性を示す新規のさらに分子量の大きい分子の発見の期待がもたらされる。アルブミン結合Ｃ３４ペプチドＨＩＶ−１融合阻害剤の一例であるＰＣ−１５０５は、Ｔ−２０よりも少ない投与頻度しか必要とせず、そしておそらく、ヒトにおいては、Ｔ−２０耐性ＨＩＶ−１に対する有効な薬剤である。
【０２７９】
（実施例９）
さらなる抗膜融合性ペプチド誘導体
図６は、記載した抗膜融合性のいくつかの結合体（ＰＣ（予め形成させた複合体）と示す）のインビトロでの抗ＨＩＶ活性を示している表を示す。アッセイは、本明細書中の実施例に記載したように行った。
【０２８０】
本発明の特定の実施形態が記載され、説明されてきたが、当業者は、本発明はこれらの実施形態の任意の詳細に限定されるように意図されるのではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解するであろう。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体であって、該ペプチドは、改変前の該ペプチドと比較して、約５から８までの範囲のｐＨの水溶液中で高い溶解度を有するように改変され、該改変されたペプチドは以下：
ａ）約１０ｍｇ／ｍｌ〜１８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、該水溶液において約１０％未満の沈殿を示す；
ｂ）改変前の該ペプチドよりも少なくとも約２．５倍高い溶解限度を有する；および
ｃ）該水溶液中で少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌの溶解限度を有する、
の特性を有する、改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項２】
前記改変されたペプチドに、生理学的ｐＨで電荷を持つかまたは電荷を持たないかのいずれかである１つ以上の極性部分が含まれている、請求項１に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項３】
前記改変されたペプチドの１つ以上の極性部分に、２０種類の天然に存在するアミノ酸の中には見られない１つ以上の極性側鎖または中性側鎖が含まれている、請求項２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項４】
前記改変されたペプチドの１つ以上の極性部分に１つ以上のシステイン酸が含まれている、請求項３に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項５】
前記改変されたペプチドの１つ以上のシステイン酸が、前記改変された抗膜融合性ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されている、請求項１または請求項４に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項６】
前記改変されたペプチドの１つ以上の極性部分が、該ペプチドの二次構造または三次構造に実質的に影響を与えない、請求項３に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項７】
前記改変されたペプチドにｇｐ４１コイルドコイルキャビティ結合残基の少なくとも一部分が含まれている、請求項１または請求項４に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項８】
前記改変されたペプチドにアミノ酸^６２８ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ^６６１（配列番号２）に由来するＣ３４のアミノ酸配列、またはそれに対する２個までのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失が含まれている、請求項７に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項９】
前記改変されたペプチドに、ＤＰ１０７およびＤＰ１７８のアミノ酸配列、またはそれに対する２個までのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失が含まれている、請求項７に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１０】
前記改変されたペプチドが血液成分または担体タンパク質上の利用可能な官能基と反応して前記結合体の安定な共有結合を形成することができるように、１つ以上の化学反応性部分がさらに含まれている、請求項７に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１１】
前記反応性部分がマレイミド含有基である、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１２】
以下：（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）；８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、８−アミノプロパン酸（ＡＰＡ）、および４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）のような１つ以上のアルキル鎖（Ｃ１−Ｃ１０）、
からなる群より選択される１つ以上のリンカーがさらに含まれている、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１３】
リンカーを持つかまたはリンカーを持たない前記反応性部分が、前記改変されたペプチドのＣ末端に付加されており、前記１つ以上の極性部分が、該改変された抗膜融合性ペプチドのＮ末端に付加されている、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１４】
リンカーを持つかまたはリンカーを持たない前記反応性部分が、前記改変されたペプチドのＮ末端に付加されており、前記１つ以上の極性部分が、該改変された抗膜融合性ペプチドのＣ末端に付加されている、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１５】
前記血液成分または担体タンパク質がアルブミンである、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１６】
前記アルブミンが組み換え体である、請求項１５に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１７】
前記アルブミンが共有結合させられている、請求項１６に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１８】
以下のような構造：
［（システイン酸）−改変されたペプチド−リンカー_ｎ−反応性基］；または、［反応性基−リンカー_ｎ−改変されたペプチド−（システイン酸）］
を有している、改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体であって、式中、
該反応性基は、例えば、リンカーを持つかまたはリンカーを持たない、ヒト血清アルブミンに共有結合させられたマレイミド含有基であり；
ｎは、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）、［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）；８−アミノオクタン酸（ＡＯＡ）、８−アミノプロパン酸（ＡＰＡ）、および４−アミノ安息香酸（ＡＰｈＡ）のような１つ以上のアルキル鎖（Ｃ１−Ｃ１０）からなる群より選択される０、１、２、３、４、またはそれ以上のリンカーであり得；そして
前記改変されたペプチドには、アミノ酸^６２８ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ^６６１（配列番号２）に由来するＣ３４のアミノ酸配列、またはそれに対する２個までのアミノ酸置換もしくは付加が含まれる、
改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項１９】
以下の式：
（Ｉ） （Ｒ_１）_ｍ−Ｘ−（Ｒ_２）_ｎ
を有している改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体であって、
式（Ｉ）において、ｍとｎの和は少なくとも１であり、ｍとｎはそれぞれが０以上の整数であり；
Ｘには、Ｃ３４、ＤＰ１０７、ＤＰ１７８、またはそれらのアナログのアミノ酸配列が含まれ；
Ｒ_１が存在し、Ｒ_２が存在しない場合は、Ｒ_１はＸ基のＮ末端に存在し、Ｒ_１が存在せず、Ｒ_２が存在する場合は、Ｒ_２はＸ基のＣ末端に存在する、
改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体であって、Ｒ_１とＲ_２はそれぞれ独立して、式（ＩＩ）：
【化３０】

を有する化合物から選択され、ここで、
式（ＩＩ）のコア構造はアミノ酸のコア構造と類似しており、これにはアミノ基、α炭素、およびカルボキシル基が含まれ；そして
ここでは、式（ＩＩ）のＲ_３基には、スルホニル基（ＨＳ＝（Ｏ）２）、スルホキシド基（ＨＳ＝Ｏ）、スルホン酸基（ＨＯ−Ｓ＝（Ｏ）_２）、ハロアルキル基、二級アミン、三級アミン、ヒドロキシル基、または極性であるかもしくは全くの中性であり、水溶液中でのペプチド誘導体の全体的な可溶性を増大させることができる他の側鎖基が含まれる、
改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項２１】
前記Ｒ_１基とＲ_２基が、前記ペプチドの二次構造または三次構造全体には実質的には影響を及ぼさない請求項２０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体であって、該ペプチド結合体の二次構造に実質的には影響を及ぼさないことにより、ペプチド結合体の全体的な活性が、誘導体化されていないペプチドの全体的な活性よりも感知できるほどに下回ることはないはずである、改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体。
【請求項２２】
以下：
ＣＡ化合物Ｉ：（Ｃ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４とも呼ばれる（配列番号３））：
【化３１】

ＣＡ化合物ＩＩ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）とも呼ばれる）（配列番号４）：
【化３２】

ＣＡ化合物ＩＩＩ：（３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）であって、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる）（配列番号５）：
【化３３】

および
ＣＡ化合物ＩＶ：（２８位に本来のリジン（Ｌｙｓ^２８）のアルギニンでの置換；３５位にさらなるリジン残基（Ｌｙｓ^３５）を有しているＣ３４に直接連結させられたシステイン酸（ＣＡ）であって、ここでは、リジンのεＮＨ_２基はリンカー（ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）を介して反応性基に結合させられる；本明細書中ではＣＡ−Ｃ３４（Ａｒｇ^２８）−Ｌｙｓ^３５（ε−ＡＥＥＡ−ＭＰＡ）とも呼ばれる）（配列番号６）
【化３４】

からなる群より選択される構造を有する、改変された抗膜融合性ペプチド。
【請求項２３】
請求項１、４、１８、１９、または２２のいずれかに記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２４】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項８に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２５】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項１０に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２６】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項１１に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２７】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項１２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２８】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項１３に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項２９】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項１５に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項３０】
安定な共有結合を形成させるためにアルブミン上の１つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基、またはチオール基に対して、リンカーを用いてまたはリンカーを用いることなく結合させられた、請求項２２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを含む結合体。
【請求項３１】
皮下投与、静脈内投与、または肺投与に適している、請求項８に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３２】
皮下投与、静脈内投与、または肺投与に適している、請求項２２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３３】
皮下投与、静脈内投与、または肺投与に適している、請求項２３に記載の結合体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３４】
皮下投与、静脈内投与、または肺投与に適している、請求項２４に記載の結合体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３５】
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択されるウイルスの処置または予防方法であって、
請求項８に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体を、該ウイルスを有しているかまたは該ウイルスを有するリスクがある該対象に対して投与し、それによって感染を処置または予防する工程を含む、方法。
【請求項３６】
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択されるウイルスの処置または予防方法であって、
請求項２２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体を、該ウイルスを有しているかまたは該ウイルスを有するリスクがある該対象に対して投与し、それによって感染を処置または予防する工程を含む、方法。
【請求項３７】
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択されるウイルスの処置または予防方法であって、
請求項２３に記載の結合体を、該ウイルスを有しているかまたは該ウイルスを有するリスクがある該対象に対して投与し、それによって感染を処置または予防する工程を含む、方法。
【請求項３８】
対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択されるウイルスの処置または予防方法であって、
請求項２４に記載の結合体を、該ウイルスを有しているかまたは該ウイルスを有するリスクがある対象に対して投与し、それによって感染を処置または予防する工程を含む、方法。
【請求項３９】
対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のうちの１つ以上の活性を阻害するための方法であって、処置が必要な該対象に対して有効量の請求項８に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体を投与する工程を含む、方法
【請求項４０】
対象においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ヒト３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ−３）、麻疹ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のうちの１つ以上の活性を阻害するための方法であって、処置が必要な該対象に対して有効量の請求項２２に記載の改変された抗膜融合性ペプチドまたはその結合体を投与する工程を含む、方法。
【請求項４１】
抗膜融合性ペプチドの大規模な調製を増進するための方法であって、該方法は：
請求項８に記載の改変された抗膜融合性ペプチドを提供する工程；および
少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの該改変されたペプチドの濃度を有する該改変されたペプチドの溶液を調製する工程、
を含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【公表番号】特表２０１０−５２７３７６（Ｐ２０１０−５２７３７６Ａ）
【公表日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０８６２１（Ｐ２０１０−５０８６２１）
【出願日】平成２０年５月１６日（２００８．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４０１０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４４５８４
【国際公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【出願人】（５０７３４０６３６）コンジュケム　バイオテクノロジーズ　インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】