抗ウイルス剤組成物
【課題】高度の抗癌活性を示し、かつ有害な副作用を引き起こさない抗癌剤組成物、およびウイルスによる疾病の治療に有用に用いられる抗ウイルス剤組成物を提供する。
【解決手段】治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛及びＬ−アルギニンを、薬剤学的に許容可能な担体とともに含有し、抗癌剤の強い毒性により正常細胞に深刻な損傷を被るなどの副作用がなく、優れた抗癌効果または抗ウイルス効果を示す、抗癌剤組成物、または抗ウイルス剤組成物。
【解決手段】治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛及びＬ−アルギニンを、薬剤学的に許容可能な担体とともに含有し、抗癌剤の強い毒性により正常細胞に深刻な損傷を被るなどの副作用がなく、優れた抗癌効果または抗ウイルス効果を示す、抗癌剤組成物、または抗ウイルス剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌または抗ウイルス剤組成物に関し、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛及びＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗癌または抗ウイルス剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法の発達につれて、癌患者の生存率と治癒率は改善されているが、抗癌剤の強い毒性により正常細胞に深刻な損傷を被ることが大きな問題点となっている。このような抗癌剤の副作用を防ぐために、癌細胞の増殖のみを特異的に抑制可能な物質が望まれており、これによって、現在、多くの抗癌剤が開発されている。このような抗癌剤としては、国際特許公開ＷＯ９６／４０１４２号、ＷＯ９７／１３７７１号およびＷＯ９５／２３１４１号に記述された化合物が挙げられる。しかしながら、これらの化合物は、癌細胞の増殖のみを特異的に抑制することができるものの、化学的に合成されたものであるため、人体内において多くの副作用を引き起こすおそれがあった。
【０００３】
したがって、多くの研究者等は、副作用を減らし、かつ優れた抗癌効果を有する抗癌剤を開発しようとしており、このため、天然成分からなる抗癌剤が多く開発されていることが現状である。そこで、本発明者等は、天然成分として、上皮性卵巣癌においてヒトの精液成分が抗癌効果があることに着目した。
【０００４】
上皮性卵巣癌は、卵巣癌のうち最もありふれた類型であるのみならず、婦人科医学において悪性による主な死亡の原因となっている。上皮性卵巣癌患者の致死率が最も高く現れた理由は、上皮性卵巣癌が潜行性で進行するため、大体、癌が相当進行してから患者が認識するからである（Ozols，R.F. Semin. Oncol.，1995, Vol.22, p61.）。たとえ腫瘍を手術により除去しまたは積極的な化学療法により卵巣癌を治療するとしても、卵巣癌患者の生存率は、薬物耐性によってわずか２０〜３０％に過ぎない。
【０００５】
これまでも、上皮性卵巣癌の危険要素と原因についてよく知られていないことが現状である。しかしながら、多くの研究によって、排卵の頻度と上皮性卵巣癌の進展との間に密接な関係があることが明らかになっており、これは、上皮性卵巣癌の発生率が、若い女性と年取った女性（早い初経と遅い閉経期）、未婚および未出産の女性において増えていることから理解される（Franceshi et al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p57; Taylor et al. Cancer, 1959, Vol.12, p1207; Fraumeni et al. J. Natl. Cancer Inst., 1969, Vol.42, p455; Weiss et al. J. Natl. Cancer Inst., 1977, Vol.58, p913; Nergriet al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p50; Stanford, J. L. Contraception 43, 1991, p543; Franceshi et al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p61）。従って、経口用避妊薬は、一般に上皮性卵巣癌の進展に対して防護効果を示すものと知られている。
【０００６】
上皮性卵巣癌の発病を説明する有力な学説は、排卵の間、卵巣上皮表面が繰り返して分裂し回復するからであるとのことである（Fathalla, M. F. Lancet., 1971, Vol.2, p163）。上皮表面が回復する過程において変形した上皮細胞は自発的に突然変異し、腫瘍抑制遺伝子が不活性化し、発癌物質によって腫瘍遺伝子が活性化しやすい。
【０００７】
一方、公知された精液の機能および抗癌効果として、ヒトの精液は、リンパ球の細胞の毒性による性交後の精子の免疫学的な損傷を、精液の精漿（seminal plasma）成分が保護するものと知られており（Stities et al. Nature, 1975, Vol.253, p727; James et al.Immunol., 1985, Vol.6, p61）、体液性免疫の発達と生体内腫瘍の成長を抑制させることができると報告されている（Anderson et al., Immunol., 1985, Vol.128, P535; Michaelis et al. Anticancer Drugs, 2000, Vol.11, p369）。また、子宮頸部の上皮性癌腫細胞において、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２およびＭＭＰ−９のｍＲＮＡが生成するのに影響するので、性行為の際に精液により子宮頸部癌の進行に影響を及ぼすことがあると知られている（Jeremias et al. Am. J. Obstet. Gynecol., 1999, Vol.181, p591）。最近、ウシ精液リボヌクレアーゼ（Bovine Seminal Ribonuclease；BS-RNase）が、ヒトリンパ球とヒト腫瘍細胞に露出する時間と濃度により、アポトーシス（細胞自殺）を誘導することが明らかになった。ウシ精液リボヌクレアーゼは、化学治療学的な薬物に対して耐性的な神経芽細胞種（neuroblastoma；NB）に対して高い効能を示す物質である（Cinatl et al. Anticancer Res., 2000, Vol.20, p853; Cinatl et al. Int. J. Oncol., 1999, Vol.15, p1001）。
【０００８】
また、Gjorgov等は、生態学的な研究を通じた精液の抗癌効果について、様々な事例−対照研究を行い、ヒト精液への減少した露出と乳癌の発生との相互関係を調査したことがある。調査方法は、精液に対してバリア型避妊具（コンドーム）を用いた女性と、ノンバリア型避妊具［避妊薬、子宮内装置（Intra Uterine Device；IUD）、リズムまたは卵管結紮］を用いた女性とを対象として乳癌の発生危険度を比較した結果、バリア型避妊具（コンドーム）を用いた女性において、乳癌の発生危険度が５．２倍高いという結果が報告されたことがある（Gjorgov et al. Folia Med., 1998, Vol.40, p17）。
【０００９】
前述した抗癌効果を示す精液の主要成分は、アルブミン、ラクトフェリン、伝達因子、免疫グロブリン、酸ホスファターゼ、Ｌ−カルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、クエン酸、フルクトース、マグネシウム、亜鉛、プロスタグランジン、およびグリセロリン酸コリンである。
【００１０】
従って、本発明者等は、上述したヒト精液成分が抗癌効果を有するという点を利用して、副作用を減らし、かつ優れた抗癌効果を示すことのできる抗癌剤を開発しようとした。
【００１１】
また、本発明者等は、パピローマウイルスが子宮癌を引き起こす因子である点に注目した。
【００１２】
パピローマウイルスは、動物の様々な組織の上皮細胞に感染して、手、足、皮膚、喉頭にイボと呼ばれる陽性腫瘍を引き起こすものと知られている。これらのパピローマウイルスは、現在、人間において１００余種の遺伝子型が明らかになっているが、様々な遺伝子型がその感染組織に対して特異性を示し、様々な疾病を引き起こすものと報告されたことがある（Broker et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, p17）。このような様々な遺伝子型の殆どのパピローマウイルスは、治療がうまく進まなく、感染患者に酷い痛みを引き起こすものの、致命的な疾病を引き起こさないため注目されていなかった。しかし、最近、このウイルスの特定型、特にヒトパピローマウイルスの１６型と１８型は、男女の生殖器、口腔、皮膚での悪性腫瘍と関連して、女性子宮癌の９０％以上を占める子宮頸部癌を引き起こす主要因子として作用するだけでなく、６ｂ型と１１型は、尖圭コンジローマ（または生殖器疣、condyloma acuminata）と命名された男女の生殖器の陽性腫瘍を引き起こすものと明らかになった。また、疫学調査の結果、子宮癌が主に性的接触により伝播する因子のため生じることが提示されており（Durst et al. Natl. Acad. Sci., 1983, Vol.80, p3812）、子宮頸部上皮内腫瘍（cervical intraepithelial neoplasma, CIN）と命名された前癌病変の８５〜１００％が、パピローマウイルスによる感染から引き起こされる点など、パピローマウイルスによる感染のため子宮癌が引き起こされるという多くの証拠が提示されている（Hansen, H., Science, 1991, Vol.254, p1173）。
【００１３】
また、子宮癌患者においてヒトパピローマウイルスの１６型と１８型の感染率は、一般に１６型が５０〜７０％、１８型が１５〜２５％に至るものと報告されている。しかし、転移癌の場合は、１６型に感染した癌患者の２５％、また１８型に感染した癌患者の５０％以上が、転移癌患者であるものと調査された（Lorincz et al. Obstetrics and Gynecology, 1992, Vol.79, p328）。
【００１４】
従って、本発明者等は、パピローマウイルスにより子宮癌が引き起こされることに着目して、抗癌効果のあるヒトの精液成分中に、抗ウイルス効果がある物質であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを加えて、ウイルスの感染により発生する様々な疾病を予防および治療しようとした。
【発明の概要】
【００１５】
本発明者等は、上皮性卵巣癌において、排卵期間の間ヒト精液に対する減少した露出が、上皮性卵巣癌の進行に病因学的な危険要素のうち一つであることを見つけ、これによって、ヒトの精液成分を用いると、悪性形質転換された上皮細胞を除去するのに効果的に寄与するという結論に至った。また、前記抗癌効果のあるヒトの精液成分を含む組成物が、パピローマウイルスによる感染のため子宮癌が引き起こされた細胞において発現されるパピローマウイルスの蛋白質を減少させることを見つけた。
【００１６】
従って、本発明は、次のような抗癌または抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一つの観点によると、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗癌組成物を提供する。
【００１８】
本発明の他の観点によると、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗ウイルス組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）およびヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７（◆：黒菱型）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図２】活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）およびヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７（◆：黒菱型）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図３】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）、ヒト卵巣腺腫ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（◆：黒菱型）およびヒト卵巣表面正常上皮細胞ＮＯＳＥ（黒四角）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図４】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ（黒三角）、ＨｅＬａ（◆：黒菱型）およびＣ−３３ Ａ（黒四角）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図５】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図６】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＨｅＬａの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図７】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣ−３３ Ａの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図８】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、培養させて抽出したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した写真である。
【図９】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＰ５３蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１０】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＰ２１蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１１】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＣ−Ｍｙｃ蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１２】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、ＤＡＰＩ染色を用いて癌細胞の核を観察した写真である。
【図１３】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａに処理した後、免疫ブロット法を用いて、ヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６蛋白質とＥ７蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１４】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、尖圭コンジローマが引き起こされた女性患者の外陰部に塗って尖圭コンジローマの治療を観察した写真である。
【図１５】活性成分としてクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、エンテロウイルスに感染した細胞に処理して細胞病変が抑制されることを分析したグラフである。
【図１６】活性成分としてクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、ポリオウイルスに感染した細胞に処理して細胞病変が抑制されることを分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一様態によると、活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２１】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜５重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２２】
本発明の他の様態によると、活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２３】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２４】
本発明のさらに他の様態によると、活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２５】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜５重量％で含有し、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２６】
前記各様態の活性成分として選択的に用いられるクエン酸；亜鉛；およびＬ−アルギニンは、下記のような形態で本発明の抗癌剤組成物に用いられ得るが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明で用いるクエン酸は、様々な植物の種または果汁中に遊離状態で存在するクエン酸を抽出して用いられる。またクエン酸はカビである黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）を用いた表面発酵方式または水中発酵方式によっても製造されるが、これもまた本発明の組成物に用いられる。前記クエン酸の生産工程には、糖蜜が糖含有原料源として用いられ、ノズル型遠心分離機、自動排出型遠心分離機、デカンターのような様々な遠心分離機が活用されている。
【００２８】
本発明で用いる亜鉛は、カキ、甲殻類、魚、赤肉のような動物性食品、および穀物と豆類、堅果類、種のような様々な植物性食品に十分な濃度で含有されているものを抽出して用いられる。本発明の組成物に含有される亜鉛の形態としては、極めて多様であり、多くの臨床研究では硫酸塩亜鉛を用いてきたが、人体はその他の形態もうまく吸収して利用する。例えば、ピコリネートと酢酸塩、クエン酸塩、グリセリン酸塩またはモノメチオニンと亜鉛の結合形態が挙げられる。
【００２９】
本発明で用いるＬ−アルギニンは、発酵または蛋白質からの抽出により製造されたものが用いられるが、好ましくは、発酵方法により製造されたものを用いることができる。発酵によるＬ−アルギニン酸の製造方法としては、アルギニン類似体に対する耐性を有する菌株を用いる製造方法（Agricultural Biological Chemistry, 1972, Vol.36, p1675; Journal of General Applied Microbiology, 1973, Vol.19, p339; 日本国特公昭48-3391号および米国特許第3723249号）、炭素源、窒素源から直接Ｌ−アルギニンを産生する方法であって、グルタミン酸産生菌株であるブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属微生物から誘導された変異株を用いる方法（日本国特開昭57-163487号、日本国特開昭60-83593号および日本国特開昭62-265988号）、細胞融合で生育改善されたアミノ酸産生菌株を用いる方法（日本国特開昭58-158185号）、およびＬ−アルギニン生合成経路に属する遺伝子およびベクターＤＮＡを含有する組替えＤＮＡを保有する菌株を用いる製造方法（日本国特開昭63-79597号、日本国特開昭60-66989号および米国特許第4,775,623号）が挙げられる。
【００３０】
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のアポトーシスを誘導することにより、癌細胞死滅または癌細胞の増殖を抑制する活性を有している。アポトーシスは、病理学的な細胞死を意味する壊死とは異なり、遺伝子において先天的にプログラム化された細胞死であって、特定の外部または内部因子によりアポトーシスを計画通り進行する遺伝子が活性化することにより生じる。このような遺伝子が活性化することにより、次いでプログラム化された死滅遺伝子蛋白質がその自体細胞内で生合成されて分解され、これによって結局死滅が生じる。アポトーシスは、一般に、生化学的方法であるＤＮＡ断片を観察して測定するかまたは分子生物学的方法であるアポトーシスと関連した蛋白質の発現を測定して評価するが、最近、公開された多くの研究報告によると、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する物質は、腫瘍細胞の死滅を調節することができ、各種の癌を効果的に抑制することができるとされている。
【００３１】
本発明では、本発明の抗癌剤組成物が癌細胞に特異的に作用して細胞を死滅させる機序がアポトーシスであるということを証明するために、前述した方法を用いた。即ち、本発明の抗癌剤組成物によるＤＮＡ断片を、癌細胞のＤＮＡを抽出することにより観察することができ（図８参照）、本発明の抗癌剤組成物によるアポトーシスと関連した蛋白質の発現を観察することができた（図９、１０および１１参照）。本発明において発現が確認されたアポトーシスと関連した蛋白質としては、Ｐ２１、Ｐ５３およびＣ−Ｍｙｃ蛋白質である。Ｐ５３およびＰ２１蛋白質は、Ｐ５３蛋白質が発現すると、細胞分裂促進因子の活性を阻害させるＰ２１蛋白質の合成を誘導することにより、結局、細胞分裂を抑制させる癌抑制蛋白質であり、Ｃ−Ｍｙｃ蛋白質は、癌細胞内でＤＮＡの分裂を促進させて癌細胞の分裂を活性化させる癌誘発蛋白質であり、当業界によく知られている。
【００３２】
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のアポトーシスを誘導することにより抗癌効果を示すので、当業者であれば、本願に例示的に記載された子宮癌または上皮性卵巣癌に対する本発明の抗癌剤組成物の効果に基づいて、他の類型の癌に対しても同様に適用され得ることを認識すべきものである。
【００３３】
従って、本発明の抗癌剤組成物は、これらに限定されるものではないが、以下のような数種の癌を治療するのに有用である：膀胱、乳房、腸、腎臓、肝、肺（小細胞肺癌を含む）、脳、食道、胆嚢、子宮、卵巣、膵臓、胃、頸部、甲状腺、前立腺、および皮膚（扁平上皮細胞癌を含む）のような癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系列の造血性腫瘍；急性慢性骨髄性白血病、骨髄異型性症候群、および急性前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血性腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉種を含む間充織発源の腫瘍星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；および黒色腫、精上皮腫、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、およびカポシ肉腫を含むその他の腫瘍。
【００３４】
好ましくは、肺癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、子宮癌、妊娠性絨毛上皮癌または上皮性卵巣癌の抑制または治療に有用であり、最も好ましくは、子宮癌または上皮性卵巣癌の抑制または治療に有用である。
【００３５】
他の観点では、本発明は、活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００３６】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００３７】
また他の観点では、本発明は、活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００３８】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００３９】
さらに他の観点では、本発明は、活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００４０】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％で含有し、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００４１】
本発明の抗ウイルス剤組成物の活性は、癌細胞株において発現するウイルスの蛋白質を分析して証明することができる。即ち、本発明の抗ウイルス剤組成物を癌細胞株に処理した後、前記癌細胞に発現した蛋白質を抽出して、通常、当業界によく知られている分子生物学的方法により分析することができる。また、本発明の抗ウイルス剤組成物の活性は、身体のウイルス感染部位に直接前記抗ウイルス剤組成物を処理して、感染症状が予防また治療されることを確認することにより証明できる。
【００４２】
本発明の一実施例として、本発明において分析しようとするパピローマウイルスの蛋白質は、ヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７で子宮癌を引き起こす抗原蛋白質としてよく知られている。ここに、本発明者等は、子宮癌細胞株において前記蛋白質が減少する機序が、本発明による抗ウイルス剤組成物の処理によることであるのを証明することができた（図１３参照）。また、ヒトパピローマウイルスに感染して、生殖器の周辺に尖圭コンジローマが引き起こされた女性の患者に、本発明の抗ウイルス剤組成者を処理することにより、尖圭コンジローマが治療されることを観察することができ（図１４参照）、また、エンテロウイルスまたはポリオウイルスに感染した細胞に、本発明の抗ウイルス剤組成者を処理することにより、ウイルスの増殖を抑制して細胞病変現象が起こらないのを確認することができた（図１５、図１６参照）。
【００４３】
本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスによる感染から引き起こされる様々な疾病を予防または治療することができる。従って、本発明の抗ウイルス剤組成物で治療または予防可能なウイルスによる感染から引き起こされる疾病としては、以下のものに限定されるものではないが、パピローマウイルスにより感染した表皮が局所的に増殖して皮膚が肥厚する腫瘍であるイボ、パピローマウイルスにより感染した生殖器や肛門の周囲で引き起こされる尖圭コンジローマ等を治療することができる。また、本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスの増殖を抑制する効果があり、後天性免疫不全症候群を引き起こすエイズウイルス、インフルエンザウイルス、脳膜炎を引き起こすエンテロウイルス、小児麻痺を引き起こすポリオウイルスの増殖を抑制させることができる。
【００４４】
好ましい様態として、本発明の抗ウイルス剤組成物は、パピローマウイルス、エンテロウイルスまたはポリオウイルスによる感染から引き起こされる疾病を予防または治療することができる。
【００４５】
本発明の抗癌または抗ウイルス剤組成物（以下、“本発明の組成物”という）に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含んでおり、総括的に“薬剤学的に許容可能な担体”という。本発明の組成物に用いられ得る薬剤学的に許容可能な担体”としては、これらに限定されるものではないが、イオン交換、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、緩衝化剤（例えば、各種のリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセライド混合物）、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および亜鉛塩）、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基質、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック共重合体、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が挙げられる。
【００４６】
本発明の組成物は、目的とする組織が得られる限り、全ての一般の経路を介して投与され得る。従って、本発明の組成物は、局所、経口、非経口、眼内、経皮、直腸、腸管を通じて投与され得、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、軟膏剤、またはクリーム剤に剤形化することができる。本願の明細書に用いられた用語の“非経口”とは、皮下、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、心臓内、硬膜内、病変内、および頭蓋内への注射または注入技術を含む。
【００４７】
一様態において、本発明の組成物を経口用固形剤に剤形化する場合、活性成分とともに希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、セルロース、トウモロコシ澱粉またはジャガイモ澱粉）、滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール）、結合剤（例えば、澱粉、アラビアゴム、ゼラチンメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン）、崩壊剤（澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩またはグリコール酸澱粉ナトリウム）、フォーマル混合物、染料、甘味剤、湿潤剤（例えば、レシチン、ポリソルビン酸、ラウリル硫酸）、および一般的に薬剤に用いられる薬物学的不活性物質を含有することができる。これらの薬剤は、公知の方法、例えば、混合、顆粒化、打錠、糖衣、または被膜工程の手段により製造することができる。
【００４８】
他の様態において、本発明の組成物は、溶液、乳濁液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルの経口投与用液状組成物に剤形化する場合、通常用いられる不活性希釈剤（例えば、蒸留水、エタノール）を含むことができる。必要に応じて、液状組成物は、その他の補助剤、例えば湿潤剤、懸濁剤、香料、芳香剤、および防腐剤を含むことができる。
【００４９】
さらに他の様態において、本発明の組成物は、非経口的投与のための水溶性溶液で製造することができる。好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または緩衝生理食塩水のような適切な緩衝溶液を用いることができる。水溶性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させることができる物質を添加することができる。さらに、活性成分の懸濁液は、適合したオイルの注入懸濁液であって、適合した脂溶性溶媒または担体は、ゴマ油のような脂肪酸またはオレイン酸エチル、トリグリセライドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。多価陽イオン性非脂質アミノポリマーもビヒクルとして用いられ得る。必要に応じて、懸濁液は、化合物の溶解度を増加させ、高濃度の溶液を製造するために適合した安定化剤または薬剤を用いることができる。
【００５０】
さらに他の様態において、本発明の組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液として、滅菌注射用製剤の形態で製造することができる。このような懸濁液は、適合した分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）および懸濁化剤を用いて、本分野に公知の技術により剤形化することができる。また、滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であってもよい。用いられ得るビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。また、通常、滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁化媒質として用いられる。このような目的のため、合成モノまたはジグリセライドを含んで刺激性の少ないものであれば、いずれの不揮発性油も用いることができる。オレイン酸およびそのグリセライド誘導体のような脂肪酸が、薬剤学的に許容可能な天然油（例えば、オリーブ油またはひまし油）、特に、これらのポリオキシエチル化したものと同様に注射製剤にも有用である。
【００５１】
このように製造された液相組成物は、殆どバクテリア捕獲フィルタを通じたろ過によって、殺菌剤または放射線を混入させることにより殺菌される。殺菌された組成物は、例えば凍結乾燥により固形組成物を得て固形化することができ、使用の際にこれを無菌水または無菌希釈液に溶解させる。
【００５２】
他の観点として、本発明の組成物のうち抗ウイルス剤組成物の好ましい剤形は、治療学的有効量の前記活性成分を薬剤学的に許容可能な担体とともに経皮投与用として剤形化することができる。ここで“経皮投与”とは、薬剤学的組成物を局所的に皮膚に投与して、薬剤学的組成物に含有された治療学的に有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【００５３】
本発明による経皮製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、ペースト剤、塗布剤、外用散剤、エアゾール剤、および経皮吸収剤を含む。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般に公知された薬局方である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mark Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18042, Chapter 87:Blaug, Seymour）に記述されている。
【００５４】
代表的に、本発明のクリーム剤は、コールドクリーム、皮膚軟化用クリーム、シェービングクリーム、バニシングクリーム、およびハンドクリームが含まれ、一般に、ステアリン酸と水を含有する水中油型基剤（ｏ／ｗ）で塗布した後、水は蒸発し、ステアリン酸の薄い膜を残すバニシングクリームが好適に用いられる。また、コールドクリームが好適に用いられるが、この製剤は、セチルアルコール、蜜蝋、白蝋、流動パラフィン、ホウ酸ナトリウム、および蒸留水で調剤された半固形の白色の水中油型基剤（ｏ／ｗ）状態の製剤である。本発明の軟膏剤は、これに用いられる基剤の種類により、炭化水素基剤、吸収基剤、水洗が可能な基剤および水溶性基剤に分類されるが、これらは全て剤形分野の専門家によく知られているものとして本発明に含まれる。本発明のローション剤は、懸濁性と乳濁性に分けられるが、通常、乳化剤または他の適切な安定剤を用いて製造する。これらは全て剤形分野の専門家によく知られているものとして本発明に含まれる。
【００５５】
以下、上述した内容を参考として、本発明による経皮剤の製造方法についてクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、およびペースト剤を挙げて説明する。
【００５６】
経皮剤として用いられる代表的なものとしてはクリーム剤があるが、このクリーム剤は、アルコール類、蜜蝋、ソルビタンモノオレエートのような油相と、ソルビトール溶液、ポリソルベート、メチルパラベン、プロピルパラベン、グリセリン、水酸化カリウム、および蒸留水等の混合溶液で構成された水相とを、別途に６５〜７５℃で加熱し、油相を水相に徐々に加えながら攪拌させて粗エマルジョンを形成する。このようにして形成されたエマルジョンを、揮発および分解が生じない温度に冷却させて均質化した後、凝固するまで一定の速度で攪拌することにより得ることができる。
【００５７】
軟膏剤は、大規模または小規模で製造することができ、特殊な調剤法を取る場合は、その成分の性状に大きく依存するようになる。軟膏剤の小規模の製造時は、均一な製剤が得られるまで軟膏成分をいくつかの方法を用いて混合する軟化法が用いられ、また大規模の製造時は、軟膏の全部または一部の成分を溶融させた後、凝固するまで一定の速度で攪拌しながら冷却させて混合する溶融法が用いられている。このとき、融解しない成分は、通常、冷却しながら混合する過程が必要となる。一般に、熱に不安定な物質や揮発性物質は、混合物の温度が成分の分解や揮発を生じない低温の範囲で軟膏剤を製造するようになる。
【００５８】
ゲル剤は、８０〜９０℃で加熱された蒸留水にメトセルを分散させた後、約１２時間の間静置し、静置した蒸留水にゲル剤組成物を分散させて分散液を製造する。その後、水酸化ナトリウム溶液を分散液に添加して中性ｐＨに調節する。このようにして製造された分散液に、メチルパラベン、メトセル、カルボポル、およびプロピレングリコールを混合することによってゲルが得られる。
【００５９】
ペースト剤は、ペースト剤の組成物を乳鉢に入れて粉末化した後、ワセリン等に均一に混合して製造することができる。
【００６０】
本発明の経皮剤形において、活性成分のクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンは、公知の物理的方法および化学的方法により皮膚内への吸収を促進することができる。主に、熱、電気および超音波エネルギーを用いる物理的方法が適合するが、好ましくは、化学的方法を用いることができる。本発明による化学的方法において用いられる経皮吸収促進剤としては、下記表１に記載のものが含まれる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
本発明の組成物と関連して用いられる用語の“治療学的有効量”とは、本発明の組成物が適用される癌またはウイルスによる感染から引き起こされる疾病に対して、改善または治療の効果を示す活性成分の量を意味する。本発明による組成物の治療学的有効量は、患者の年齢、性別、適用部位、投与回数、投与時間、剤形、補助剤の種類により変わるものの、注射剤の場合、一般に５０〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜４０００ｍｇ、最も好ましくは２５０〜３０００ｍｇを１日１〜５回投与することができ、経口投与剤の場合、一般に１〜２０００ｍｇ、好ましくは２５０〜１０００ｍｇ、最も好ましくは３００〜５００ｍｇを１日１〜５回投与することができる。また、経皮剤の場合、一般に約２〜３週間の間１日１回または２回、患部に５００〜２０００ｍｇを塗ることにより、予防または治療の効果が得られる。
【００６３】
本発明は、下記実施例によりさらに具体的に例示される。しかし、これらの実施例は、単に本発明の具現例であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
実施例１：注射剤の製造
クエン酸（Sigma, U.S.A.）、亜鉛（Sigma, U.S.A.）およびＬ−アルギニン（Sigma, U.S.A.）を、下記の表２に記載の本発明の組成物による活性成分を選んで配合した後、滅菌水を１００％の組成量として、それぞれの活性成分とともに混合した後、これをバイアル（１００ｍｇ）に充填して本発明の組成物を製造した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実施例２：錠剤の製造
クエン酸（Sigma, U.S.A.）、亜鉛（Sigma, U.S.A.）およびＬ−アルギニン（Sigma, U.S.A.）を上記の表２による活性成分を選んで配合した後、ラクトース３０重量％、ステアリン酸マグネシウム５重量％、グリコール酸澱粉ナトリウム１０重量％、および滅菌水を１００％の組成量として、それぞれの活性成分とともに混合した後、これを３０〜６０℃に維持しながら、１時間の間攪拌して室温で冷却させた後、通常の錠剤の製造方法により打錠して組成物３５０ｍｇずつを含有する錠剤を製造した。
【００６７】
実施例３：経皮剤の製造
本発明の組成物のうち抗ウイルス剤組成物を経皮剤形に製造するために、クエン酸２重量％、亜鉛０．１重量％およびＬ−アルギニン５重量％を、１Ｌのエタノールが満たされたビーカーに溶解させた後、−２０℃で２４時間冷凍保管した。その後、前記ビーカーで凝固物を得て、これを経皮剤形の活性成分として用いた。前記凝固物は、約１０倍の濃縮率を有する。
【００６８】
（１）クリーム剤
油相
ステアリン酸 １３重量％
ステアリルアルコール １重量％
エチルアルコール １重量％
製造された凝固物 ５重量％
水相
グリセリン １０重量％
メチルパラベン ０．１重量％
プロピルパラベン ０．０５重量％
水酸化カリウム ０．９重量％
蒸留水 １００％組成量
油相と水相を別途に６５℃に加熱し、油相を水相に徐々に加えながら攪拌させることによって粗エマルジョンを形成した。形成されたエマルジョンを約５０℃に冷却させて均質化した。均質化物が凝結するまで振盪させながら冷却させることによって、クリーム剤を得た。
【００６９】
（２）軟膏剤
ワセリン ８０重量％
ステアリルアルコール ３重量％
白蝋 ９重量％
コレステロール ３重量％
製造された凝固物 ５重量％
ステアリルアルコール、白蝋、コレステロールおよび前記製造された凝固物をスチームバスで溶かし、ワセリンを添加した後、液体が形成するまで徐々に加熱し続けた。攪拌冷却させて凝結することにより、軟膏剤を得た。
【００７０】
（３）ゲル剤
メトセル90H.C.4000 ０．８重量％
カルボポル934 ０．２４重量％
プロピレングリコール １６．７重量％
メチルパラベン ０．０１５重量％
製造された凝固物 ５重量％
水酸化ナトリウム ｐＨ７調整量
蒸留水 １００％組成量
メトセルを熱水（８０〜９０℃）に分散させ、一夜冷蔵庫で冷却させて溶液化した。カルボポル９３４、前記凝固物を水に分散させ、分散液に十分な量の水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨを７．０に調節した。蒸留水を添加して容量を４０ｍｌとした。メチルパラベンをプロピレングリコール中に溶解させた。メトセル、カルボポル９３４およびプロピレングリコールを混合してゲルを得た。
【００７１】
（４）ペースト剤
酸化亜鉛 ２５重量％
澱粉 ２５重量％
カラミン ５重量％
製造された凝固物 ５重量％
ワセリン １００％組成量
カラミンを酸化亜鉛、前記凝固物および澱粉で滴定し、乳鉢で粉末化してワセリンに均一に入れてペースト剤を得た。
【００７２】
実施例４：クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸とＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表３）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３（ヒト卵巣腺腫（複数）、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７７）とＵ８７（ヒト神経膠芽腫細胞、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１４）を用いた。
【００７３】
前記細胞を３×１０３細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、１２時間の間培養した。培養培地としては、熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１０％（ｖ／ｖ）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、およびＬ−グルタミン１００μｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ（Dulbecco'smodified Eagle's medium, Life Technology, Inc., U.S.A.）を用いた。
【００７４】
培養したそれぞれの細胞株に、クエン酸とＬ−アルギンの含量を異にしたことを除いては、実施例１と同様にして製造された組成物を処理して分類した後、これを３７℃で二酸化炭素５％と酸素９５％が供給される状態において２４時間の間培養した後、細胞の生存率を測定した。
【００７５】
【表３】
【００７６】
細胞の生存率は、公知されたＭＴＴ（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド）検定法で測定した（Hansen, M.B. et al., J. Immunol. Methods, 172, 203-210(1989)）。２０μｌＭＴＴ溶液［ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のうち１０ｍｇ／ｍｌであるＭＴＴ］をそれぞれのウェルに添加し、平板を３７℃で４時間培養した。培地を除去した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）２００μｌにホルマザン結晶を溶解させて、それぞれのウェルに添加した。これを１０分間室温で振盪して混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄモデル３５５０マイクロプレートリーダ（Richmond, C.A.）を用いて５４０ｎｍで測定した。このとき、ＤＭＥＭ−ＦＢＳとＭＴＴが添加され、前記組成物を添加しなかったウェルを対照群として用いた。図１に実験の結果を示した。
【００７７】
図１から明らかなように、クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）とＵ８７（◆：黒菱型）に処理したときの細胞生存率は、活性成分であるクエン酸とＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が６０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。
【００７８】
実施例５：亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、亜鉛とＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表４）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３とＵ８７を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図２に実験の結果を示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
図２から明らかなように、亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）とＵ８７（◆：黒菱型）に処理したときの細胞生存率は、活性成分である亜鉛とＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が５０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。
【００８１】
実施例６：クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表５）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ヒト卵巣腺腫、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１６１）およびＮＯＳＥ（ヒト卵巣表面正常上皮細胞）を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図３に実験の結果を示した。
【００８２】
【表５】
【００８３】
図３から明らかなように、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（◆：黒菱型）およびＮＯＳＥ（黒四角）に処理したときの細胞生存率については、活性成分であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより、癌細胞の細胞生存率は減少し、正常細胞株は特異的な変化を示さなかった。特に、組成物６を癌細胞株のＳＫＯＶ−３、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３に処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。これに対し、組成物６と７を正常細胞株のＮＯＳＥに処理したとき、細胞の生存率が５０％以上であった。このような結果から、前記抗癌剤組成物が癌細胞に特異的に作用して癌細胞のみを死滅させることが認められた。
【００８４】
実施例７：クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を異にして実施例５で製造した組成物（表５）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５５０）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２）およびＣ−３３ Ａ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−３１）を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図４に実験の結果を示した。
【００８５】
図４から明らかなように、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株Ｃａ Ｓｋｉ（黒三角）、ＨｅＬａ（◆：黒菱型）およびＣ−３３ Ａ（黒四角）に処理したときの細胞生存率については、活性成分であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより、癌細胞の細胞生存率は減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が６０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率は２０％以下に減少した。
【００８６】
実施例８：本発明の抗癌剤組成物の処理によるフローサイトメトリー分析
実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物が細胞内ＤＮＡ分裂に及ぼす影響をフローサイトメトリーにより分析した。
【００８７】
Ｃａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した。各癌細胞の対照群は、前記抗癌剤組成物を処理しなかった。培養が完了すると、細胞を回収し、これを冷たいＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を４℃で２４時間の間１００％エタノールを透過させて固定した。これをＰＢＳ５００μｌに懸濁し、３７℃で３０分間ＲＮａｓｅ２０μｇ／ｍｌで処理した後、１０分間氷で冷却させた。このような方法で分離したＤＮＡにＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液５０μｇ／ｍｌを添加して染色し、ＤＮＡ分裂をフローサイトメトリー分析器（Becton Dickinson FACS system, U.S.A.）で測定した。このとき、プロピジウム蛍光は、冷却さけたアルゴンイオンレーザ１５ｍＷを用いて発色させ、発色する光を６１７ロングパス光学フィルタを用いて集めた。ＤＮＡのモデリングは、細胞周期解析ソフトウエア（ModFit, Verity Software House, Topsham, ME, U.S.A.）を用いた。図５、図６および図７に実験の結果を示した。
【００８８】
図５、図６および図７から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物で処理したＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株は、培養時間が経過することにより、Ｇ１段階が停止した。また、細胞分裂段階のうちＧ０−Ｇ１（ｓｕｂ−Ｇ１部分）段階において細胞の百分率が増加し、Ｓ（ＤＮＡ合成時期）段階とＧ２−Ｍ（類似分裂）段階において細胞が有意に減少し、これから細胞死滅が誘導されたことが認められた。
【００８９】
実施例９：本発明の抗癌剤組成物の処理によるＤＮＡラダリング分析
前記実施例８の細胞死滅の機序を調査するためにＤＮＡラダリング分析を行った。ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した後、経時的に培養したそれぞれの細胞を回収して、細胞のＤＮＡを公知の方法により次のように変形して抽出した（Leszczynski D. et. al. Photochem. Photobiol., 1996, Vol.64, p936-.）。前記それぞれの細胞プレートを、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）０．５％、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）２ｍＭ、蛋白質加水分解酵素Ｋ１００ｍｇ／ｍｌ、およびトリス塩酸緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８．０）で構成された溶解緩衝液に懸濁させた。これを５５℃で３時間培養し、培養液と同量でフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加した。これに培養液の０．１体積％の酢酸アンモニウムと２．５体積％の冷たい無水エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で一夜間保管した。前記ＤＮＡをＴＥ（１Ｍトリス塩酸緩衝液のうち０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させ、３７℃でＲＮａｓｅ Ａ １００ｍｇ／ｍｌを添加して１時間培養した。前記試料を臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌが含まれた１．５％アガロスゲルで６０Ｖで１時間の間電気泳動し、紫外線（ＵＶ）に露出させた。図８に実験の結果を示した。
【００９０】
図８から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物をＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株にそれぞれ処理した後、経時的にＤＮＡを抽出して分析した結果、本発明の抗癌剤組成物の処理後、１２時間と２４時間が経過したそれぞれの細胞においてアポトーシスが観察された。一般に、アポトーシスは、ヌクレオソーム間の連結部位において約１００ｂｐ断片でＤＮＡが分裂するので、はしご状のＤＮＡラダーが観察された。従って、本発明の抗癌剤組成物の処理による癌細胞の死滅機序がアポトーシスであるということが認められた。
【００９１】
実施例１０：本発明の抗癌剤組成物の処理によるアポトーシスおよび発癌と関連した蛋白質の発現分析
癌細胞の細胞死滅の機序を調査するために、細胞死滅と関連した蛋白質であるＰ５３とＰ２１、および癌誘発蛋白質であるＣ−Ｍｙｃの発現を分析した。
【００９２】
Ｃａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株を、それぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した後、経時的に培養したそれぞれの細胞を回収した。経時的に回収されたそれぞれの細胞を溶解緩衝液（10mM Tris,1mM EDTA, 1mM DDT, 1mM PMSF, 蛋白質分解酵素抑制剤）を用いて細胞を分解し、溶解された試料を抽出した後、試料をＳＤＳ−電気泳動して、ＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ニトロセルロース膜（Amersham Life Science, U.K.）に蛋白質を移動させた。蛋白質が移動された膜にブロッキング溶液（５％ skin milk in TBST; 10mM Tris-HCl, pH8.0. 150mM NaCl, 0.1% Tween20）を処理して、４℃に維持しながら一夜間反応させた。その後、アポトーシスと関連した蛋白質の検出のために、免疫ブロット法を用いた。即ち、Ｐ２１、Ｐ５３およびＣ−Ｍｙｃの１次抗体を１：５００でブロッキング溶液に希釈し、４℃で一夜間反応させて膜に付着させ、２次抗体（goat anti-rabbit IgG-HRP; Santa CruzBiotechnology, U.S.A.）をフロッキング溶液に１：５０００で希釈して、１時間の間室温で反応させた。１次および２次抗体と反応した蛋白質を１５分間３回洗浄し、ＥＣＬハイパーフィルム（Amersham Life Science, U.K.）に露出させて確認した。図９、図１０および図１１に実験の結果を示した。
【００９３】
図９と図１０から明らかなように、細胞分裂を抑制する蛋白質であるＰ２１とＰ５３は、本発明の抗癌剤組成物を処理した後、経時的に発現様相が段々増加することが観察された。これに対し、図１１から明らかなように、癌細胞の分裂を活性化させる蛋白質であるＣ−Ｍｙｃは、本発明の抗癌剤組成物を処理した後、経時的に発現様相が段々減少することが観察された。従って、本発明の抗癌剤組成物が癌細胞の増殖を抑制させ、結局、癌細胞のアポトーシスを誘導することが認められた。
【００９４】
実施例１１：本発明の抗癌剤組成物の処理における染色による癌細胞核の観察
前記実施例８の細胞死滅の機序を調べるために、本発明の抗癌剤組成物で処理された細胞の染色された核を観察した。
【００９５】
直径６０ｍｍの皿に滅菌されたカバーガラスを置き、その上にＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ１×１０４個で注入して一夜間培養させた。その後、本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、２４時間後にＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで細胞を固定させた。さらにＰＢＳで３回洗浄し、４μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（4'6'-diamino-2-phenylinylindole）溶液（sigma, U.S.A.）を添加して、１０分間室温で反応させて染色した後、ＰＢＳで３回洗浄し、３次蒸留水で２回洗浄した後、固定溶液で固定した後、カバーガラスをスライド上に付着させ、蛍光顕微鏡（Olympus Optical Co., Ltd. U.S.A.）で観察した。図１２に実験の結果を示した。
【００９６】
図１２から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物で処理したＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株において、本発明の抗癌剤組成物で処理しなかった場合は、健康な核を観察することができるのに対し、本発明の抗癌剤組成物で処理した場合は、細胞死滅の機序による核の形態的変化（例えば、染色質凝縮、分裂及び核の収縮等）を観察することができる。具体的に、凝縮した染色質の塊の周縁が不完全に現われ、凝縮した染色質が核の周辺に不規則に分散している形態で現われた。従って、本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞に特異的に作用してアポトーシスを引き起こすことが認められた。
【００９７】
実施例１２：子宮癌細胞で発現するパピローマウイルスの蛋白質分析
本発明の抗ウイルス剤組成物が子宮癌細胞株において発現するパピローマウイルスの蛋白質を減少させるのかについて調べるために、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７の発現を分析した。
【００９８】
前記実施例４と同様の方法で培養したＣａ ＳｋｉとＨｅＬａ細胞株を、それぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗ウイルス剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを 処理した後、３７℃で二酸化炭素５％と酸素９５％が供給される状態で、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間培養した細胞を回収した。経時的に回収された細胞を溶解緩衝液（10mM Tris, 1mM EDTA, 1mM DDT, 1mM PMSF, 蛋白質分解酵素抑制剤）を用いて細胞を分解し、溶解された試料を抽出した後、試料をＳＤＳ−電気泳動して、ＥＣＬニトロセルロース膜（Amersham Life Science, U.K.）に蛋白質を移動させた。蛋白質が移動された膜にブロッキング溶液（５％ skin milk in TBST 10mM Tris-HCl, pH8.0. 150mM NaCl, 0.1% Tween20）を処理して、４℃に維持しながら一夜間反応させた。
【００９９】
その後、ヒトパピローマウイルスの１６型または１８型のＥ６とＥ７蛋白質の検出のために、免疫ブロット法を用いた。即ち、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６、Ｅ７およびヒトパピローマウイルス１８型のＥ６、Ｅ７と結合する１次抗体（Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.）を１：５００でブロッキング溶液に希釈し、４℃で一夜間反応させて膜に付着させ、２次抗体（goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.）をフロッキング溶液に１：５０００で希釈して、１時間の間室温で反応させた。１次および２次抗体と反応した蛋白質を１５分間３回洗浄し、ＥＣＬハイパーフィルム（Amersham Life Science, U.K.）に露出させて確認した。これを図１３に示した。
【０１００】
図１３から明らかなように、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型のＥ６は、本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した細胞株Ｃａ ＳｋｉとＨｅＬａにおいて、経時的に発現様相が段々減少することが観察され、また、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１８型のＥ７は、本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した細胞株Ｃａ Ｓｋｉにおいて、経時的に発現様相が段々減少することが観察された。従って、本発明の抗ウイルス剤組成物を子宮癌細胞に処理したとき、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７の発現を抑制させることが認められた。
【０１０１】
実施例１３：パピローマウイルスに起因する尖圭コンジローマの治療効果
外陰部に尖圭コンジローマが生じた６名の女性患者を対象として実施例３で製造した軟膏剤（実施例３の経皮剤（２））１ｇをそれぞれの患部に塗った。その結果、これらの患者は、１日２回適用することにより、病変の大きさに応じて２〜１２週間以内に治療された。これを図１４に示した。
【０１０２】
実施例１４：エンテロウイルスとポリオウイルスの細胞病変分析
本発明の抗ウイルス剤組成物がウイルス増殖を抑制させることを証明するために、エンテロウイルスとポリオウイルスにそれぞれ感染した細胞に本発明の抗ウイルス剤組成物を処理して細胞病変を分析した。
【０１０３】
ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞）を、１０％ＦＢＳを含有したＭＥＭ培地を用いて、３７℃のインキュベータで培養させた後、実験の１日前、４８−ウェルプレートに１０５となるように接種させて培養した。前記培養された細胞をエンテロウイルスとポリオウイルスに感染させる前にＰＢＳで洗浄した。エンテロウイルスとポリオウイルスは、プラーク分析を用いて力価を求めて−７０℃で保管して使用した。前記エンテロウイルスとポリオウイルスをｐｆｕ６で１時間の間３７℃インキュベータで恒温培養させた後、さらにＰＢＳで洗浄して前記培養された細胞の培地にそれぞれ添加して２４時間の間培養した。前記培養されたウイルスに感染した細胞に、本発明の抗ウイルス剤（表１の組成物）を処理して、細胞病変抑制率を測定した。対照群としてクエン酸単独、亜鉛単独および精液成分を含有する組成物を前記細胞に処理した。これを図１５と図１６に示した。
【０１０４】
本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した結果、細胞病変抑制率が６０％以上であった。これに対し、クエン酸単独、亜鉛単独および精液を含有する組成物をそれぞれ処理した結果、細胞病変抑制率は５０％以下であった。
【０１０５】
従って、本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスの増殖を抑制させてウイルスに感染した細胞の死滅が防止されることが認められた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌または抗ウイルス剤組成物に関し、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛及びＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗癌または抗ウイルス剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学療法の発達につれて、癌患者の生存率と治癒率は改善されているが、抗癌剤の強い毒性により正常細胞に深刻な損傷を被ることが大きな問題点となっている。このような抗癌剤の副作用を防ぐために、癌細胞の増殖のみを特異的に抑制可能な物質が望まれており、これによって、現在、多くの抗癌剤が開発されている。このような抗癌剤としては、国際特許公開ＷＯ９６／４０１４２号、ＷＯ９７／１３７７１号およびＷＯ９５／２３１４１号に記述された化合物が挙げられる。しかしながら、これらの化合物は、癌細胞の増殖のみを特異的に抑制することができるものの、化学的に合成されたものであるため、人体内において多くの副作用を引き起こすおそれがあった。
【０００３】
したがって、多くの研究者等は、副作用を減らし、かつ優れた抗癌効果を有する抗癌剤を開発しようとしており、このため、天然成分からなる抗癌剤が多く開発されていることが現状である。そこで、本発明者等は、天然成分として、上皮性卵巣癌においてヒトの精液成分が抗癌効果があることに着目した。
【０００４】
上皮性卵巣癌は、卵巣癌のうち最もありふれた類型であるのみならず、婦人科医学において悪性による主な死亡の原因となっている。上皮性卵巣癌患者の致死率が最も高く現れた理由は、上皮性卵巣癌が潜行性で進行するため、大体、癌が相当進行してから患者が認識するからである（Ozols，R.F. Semin. Oncol.，1995, Vol.22, p61.）。たとえ腫瘍を手術により除去しまたは積極的な化学療法により卵巣癌を治療するとしても、卵巣癌患者の生存率は、薬物耐性によってわずか２０〜３０％に過ぎない。
【０００５】
これまでも、上皮性卵巣癌の危険要素と原因についてよく知られていないことが現状である。しかしながら、多くの研究によって、排卵の頻度と上皮性卵巣癌の進展との間に密接な関係があることが明らかになっており、これは、上皮性卵巣癌の発生率が、若い女性と年取った女性（早い初経と遅い閉経期）、未婚および未出産の女性において増えていることから理解される（Franceshi et al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p57; Taylor et al. Cancer, 1959, Vol.12, p1207; Fraumeni et al. J. Natl. Cancer Inst., 1969, Vol.42, p455; Weiss et al. J. Natl. Cancer Inst., 1977, Vol.58, p913; Nergriet al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p50; Stanford, J. L. Contraception 43, 1991, p543; Franceshi et al. Int. J. Cancer, 1991, Vol.49, p61）。従って、経口用避妊薬は、一般に上皮性卵巣癌の進展に対して防護効果を示すものと知られている。
【０００６】
上皮性卵巣癌の発病を説明する有力な学説は、排卵の間、卵巣上皮表面が繰り返して分裂し回復するからであるとのことである（Fathalla, M. F. Lancet., 1971, Vol.2, p163）。上皮表面が回復する過程において変形した上皮細胞は自発的に突然変異し、腫瘍抑制遺伝子が不活性化し、発癌物質によって腫瘍遺伝子が活性化しやすい。
【０００７】
一方、公知された精液の機能および抗癌効果として、ヒトの精液は、リンパ球の細胞の毒性による性交後の精子の免疫学的な損傷を、精液の精漿（seminal plasma）成分が保護するものと知られており（Stities et al. Nature, 1975, Vol.253, p727; James et al.Immunol., 1985, Vol.6, p61）、体液性免疫の発達と生体内腫瘍の成長を抑制させることができると報告されている（Anderson et al., Immunol., 1985, Vol.128, P535; Michaelis et al. Anticancer Drugs, 2000, Vol.11, p369）。また、子宮頸部の上皮性癌腫細胞において、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−２およびＭＭＰ−９のｍＲＮＡが生成するのに影響するので、性行為の際に精液により子宮頸部癌の進行に影響を及ぼすことがあると知られている（Jeremias et al. Am. J. Obstet. Gynecol., 1999, Vol.181, p591）。最近、ウシ精液リボヌクレアーゼ（Bovine Seminal Ribonuclease；BS-RNase）が、ヒトリンパ球とヒト腫瘍細胞に露出する時間と濃度により、アポトーシス（細胞自殺）を誘導することが明らかになった。ウシ精液リボヌクレアーゼは、化学治療学的な薬物に対して耐性的な神経芽細胞種（neuroblastoma；NB）に対して高い効能を示す物質である（Cinatl et al. Anticancer Res., 2000, Vol.20, p853; Cinatl et al. Int. J. Oncol., 1999, Vol.15, p1001）。
【０００８】
また、Gjorgov等は、生態学的な研究を通じた精液の抗癌効果について、様々な事例−対照研究を行い、ヒト精液への減少した露出と乳癌の発生との相互関係を調査したことがある。調査方法は、精液に対してバリア型避妊具（コンドーム）を用いた女性と、ノンバリア型避妊具［避妊薬、子宮内装置（Intra Uterine Device；IUD）、リズムまたは卵管結紮］を用いた女性とを対象として乳癌の発生危険度を比較した結果、バリア型避妊具（コンドーム）を用いた女性において、乳癌の発生危険度が５．２倍高いという結果が報告されたことがある（Gjorgov et al. Folia Med., 1998, Vol.40, p17）。
【０００９】
前述した抗癌効果を示す精液の主要成分は、アルブミン、ラクトフェリン、伝達因子、免疫グロブリン、酸ホスファターゼ、Ｌ−カルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、クエン酸、フルクトース、マグネシウム、亜鉛、プロスタグランジン、およびグリセロリン酸コリンである。
【００１０】
従って、本発明者等は、上述したヒト精液成分が抗癌効果を有するという点を利用して、副作用を減らし、かつ優れた抗癌効果を示すことのできる抗癌剤を開発しようとした。
【００１１】
また、本発明者等は、パピローマウイルスが子宮癌を引き起こす因子である点に注目した。
【００１２】
パピローマウイルスは、動物の様々な組織の上皮細胞に感染して、手、足、皮膚、喉頭にイボと呼ばれる陽性腫瘍を引き起こすものと知られている。これらのパピローマウイルスは、現在、人間において１００余種の遺伝子型が明らかになっているが、様々な遺伝子型がその感染組織に対して特異性を示し、様々な疾病を引き起こすものと報告されたことがある（Broker et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, p17）。このような様々な遺伝子型の殆どのパピローマウイルスは、治療がうまく進まなく、感染患者に酷い痛みを引き起こすものの、致命的な疾病を引き起こさないため注目されていなかった。しかし、最近、このウイルスの特定型、特にヒトパピローマウイルスの１６型と１８型は、男女の生殖器、口腔、皮膚での悪性腫瘍と関連して、女性子宮癌の９０％以上を占める子宮頸部癌を引き起こす主要因子として作用するだけでなく、６ｂ型と１１型は、尖圭コンジローマ（または生殖器疣、condyloma acuminata）と命名された男女の生殖器の陽性腫瘍を引き起こすものと明らかになった。また、疫学調査の結果、子宮癌が主に性的接触により伝播する因子のため生じることが提示されており（Durst et al. Natl. Acad. Sci., 1983, Vol.80, p3812）、子宮頸部上皮内腫瘍（cervical intraepithelial neoplasma, CIN）と命名された前癌病変の８５〜１００％が、パピローマウイルスによる感染から引き起こされる点など、パピローマウイルスによる感染のため子宮癌が引き起こされるという多くの証拠が提示されている（Hansen, H., Science, 1991, Vol.254, p1173）。
【００１３】
また、子宮癌患者においてヒトパピローマウイルスの１６型と１８型の感染率は、一般に１６型が５０〜７０％、１８型が１５〜２５％に至るものと報告されている。しかし、転移癌の場合は、１６型に感染した癌患者の２５％、また１８型に感染した癌患者の５０％以上が、転移癌患者であるものと調査された（Lorincz et al. Obstetrics and Gynecology, 1992, Vol.79, p328）。
【００１４】
従って、本発明者等は、パピローマウイルスにより子宮癌が引き起こされることに着目して、抗癌効果のあるヒトの精液成分中に、抗ウイルス効果がある物質であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを加えて、ウイルスの感染により発生する様々な疾病を予防および治療しようとした。
【発明の概要】
【００１５】
本発明者等は、上皮性卵巣癌において、排卵期間の間ヒト精液に対する減少した露出が、上皮性卵巣癌の進行に病因学的な危険要素のうち一つであることを見つけ、これによって、ヒトの精液成分を用いると、悪性形質転換された上皮細胞を除去するのに効果的に寄与するという結論に至った。また、前記抗癌効果のあるヒトの精液成分を含む組成物が、パピローマウイルスによる感染のため子宮癌が引き起こされた細胞において発現されるパピローマウイルスの蛋白質を減少させることを見つけた。
【００１６】
従って、本発明は、次のような抗癌または抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一つの観点によると、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗癌組成物を提供する。
【００１８】
本発明の他の観点によると、治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有することを特徴とする抗ウイルス組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）およびヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７（◆：黒菱型）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図２】活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）およびヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７（◆：黒菱型）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図３】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト卵巣腺腫（複数）ＳＫＯＶ−３（黒三角）、ヒト卵巣腺腫ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（◆：黒菱型）およびヒト卵巣表面正常上皮細胞ＮＯＳＥ（黒四角）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図４】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ（黒三角）、ＨｅＬａ（◆：黒菱型）およびＣ−３３ Ａ（黒四角）に及ぼす影響を、ＭＴＴ検定を通じた細胞の生存率で示したグラフである。
【図５】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図６】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＨｅＬａの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図７】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物が、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣ−３３ Ａの細胞周期に及ぼす影響を示すフローサイトメトリーによる分析結果である。
【図８】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、培養させて抽出したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した写真である。
【図９】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＰ５３蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１０】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＰ２１蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１１】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、免疫ブロット法を用いてＣ−Ｍｙｃ蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１２】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗癌剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａに処理した後、ＤＡＰＩ染色を用いて癌細胞の核を観察した写真である。
【図１３】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａに処理した後、免疫ブロット法を用いて、ヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６蛋白質とＥ７蛋白質の発現を観察した写真である。
【図１４】活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、尖圭コンジローマが引き起こされた女性患者の外陰部に塗って尖圭コンジローマの治療を観察した写真である。
【図１５】活性成分としてクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、エンテロウイルスに感染した細胞に処理して細胞病変が抑制されることを分析したグラフである。
【図１６】活性成分としてクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを含有した本発明の抗ウイルス剤組成物を、ポリオウイルスに感染した細胞に処理して細胞病変が抑制されることを分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一様態によると、活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２１】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜５重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２２】
本発明の他の様態によると、活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２３】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２４】
本発明のさらに他の様態によると、活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗癌剤組成物を提供する。
【００２５】
前記抗癌剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜５重量％で含有し、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗癌剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００２６】
前記各様態の活性成分として選択的に用いられるクエン酸；亜鉛；およびＬ−アルギニンは、下記のような形態で本発明の抗癌剤組成物に用いられ得るが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明で用いるクエン酸は、様々な植物の種または果汁中に遊離状態で存在するクエン酸を抽出して用いられる。またクエン酸はカビである黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）を用いた表面発酵方式または水中発酵方式によっても製造されるが、これもまた本発明の組成物に用いられる。前記クエン酸の生産工程には、糖蜜が糖含有原料源として用いられ、ノズル型遠心分離機、自動排出型遠心分離機、デカンターのような様々な遠心分離機が活用されている。
【００２８】
本発明で用いる亜鉛は、カキ、甲殻類、魚、赤肉のような動物性食品、および穀物と豆類、堅果類、種のような様々な植物性食品に十分な濃度で含有されているものを抽出して用いられる。本発明の組成物に含有される亜鉛の形態としては、極めて多様であり、多くの臨床研究では硫酸塩亜鉛を用いてきたが、人体はその他の形態もうまく吸収して利用する。例えば、ピコリネートと酢酸塩、クエン酸塩、グリセリン酸塩またはモノメチオニンと亜鉛の結合形態が挙げられる。
【００２９】
本発明で用いるＬ−アルギニンは、発酵または蛋白質からの抽出により製造されたものが用いられるが、好ましくは、発酵方法により製造されたものを用いることができる。発酵によるＬ−アルギニン酸の製造方法としては、アルギニン類似体に対する耐性を有する菌株を用いる製造方法（Agricultural Biological Chemistry, 1972, Vol.36, p1675; Journal of General Applied Microbiology, 1973, Vol.19, p339; 日本国特公昭48-3391号および米国特許第3723249号）、炭素源、窒素源から直接Ｌ−アルギニンを産生する方法であって、グルタミン酸産生菌株であるブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属微生物から誘導された変異株を用いる方法（日本国特開昭57-163487号、日本国特開昭60-83593号および日本国特開昭62-265988号）、細胞融合で生育改善されたアミノ酸産生菌株を用いる方法（日本国特開昭58-158185号）、およびＬ−アルギニン生合成経路に属する遺伝子およびベクターＤＮＡを含有する組替えＤＮＡを保有する菌株を用いる製造方法（日本国特開昭63-79597号、日本国特開昭60-66989号および米国特許第4,775,623号）が挙げられる。
【００３０】
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のアポトーシスを誘導することにより、癌細胞死滅または癌細胞の増殖を抑制する活性を有している。アポトーシスは、病理学的な細胞死を意味する壊死とは異なり、遺伝子において先天的にプログラム化された細胞死であって、特定の外部または内部因子によりアポトーシスを計画通り進行する遺伝子が活性化することにより生じる。このような遺伝子が活性化することにより、次いでプログラム化された死滅遺伝子蛋白質がその自体細胞内で生合成されて分解され、これによって結局死滅が生じる。アポトーシスは、一般に、生化学的方法であるＤＮＡ断片を観察して測定するかまたは分子生物学的方法であるアポトーシスと関連した蛋白質の発現を測定して評価するが、最近、公開された多くの研究報告によると、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する物質は、腫瘍細胞の死滅を調節することができ、各種の癌を効果的に抑制することができるとされている。
【００３１】
本発明では、本発明の抗癌剤組成物が癌細胞に特異的に作用して細胞を死滅させる機序がアポトーシスであるということを証明するために、前述した方法を用いた。即ち、本発明の抗癌剤組成物によるＤＮＡ断片を、癌細胞のＤＮＡを抽出することにより観察することができ（図８参照）、本発明の抗癌剤組成物によるアポトーシスと関連した蛋白質の発現を観察することができた（図９、１０および１１参照）。本発明において発現が確認されたアポトーシスと関連した蛋白質としては、Ｐ２１、Ｐ５３およびＣ−Ｍｙｃ蛋白質である。Ｐ５３およびＰ２１蛋白質は、Ｐ５３蛋白質が発現すると、細胞分裂促進因子の活性を阻害させるＰ２１蛋白質の合成を誘導することにより、結局、細胞分裂を抑制させる癌抑制蛋白質であり、Ｃ−Ｍｙｃ蛋白質は、癌細胞内でＤＮＡの分裂を促進させて癌細胞の分裂を活性化させる癌誘発蛋白質であり、当業界によく知られている。
【００３２】
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のアポトーシスを誘導することにより抗癌効果を示すので、当業者であれば、本願に例示的に記載された子宮癌または上皮性卵巣癌に対する本発明の抗癌剤組成物の効果に基づいて、他の類型の癌に対しても同様に適用され得ることを認識すべきものである。
【００３３】
従って、本発明の抗癌剤組成物は、これらに限定されるものではないが、以下のような数種の癌を治療するのに有用である：膀胱、乳房、腸、腎臓、肝、肺（小細胞肺癌を含む）、脳、食道、胆嚢、子宮、卵巣、膵臓、胃、頸部、甲状腺、前立腺、および皮膚（扁平上皮細胞癌を含む）のような癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫を含むリンパ系列の造血性腫瘍；急性慢性骨髄性白血病、骨髄異型性症候群、および急性前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血性腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉種を含む間充織発源の腫瘍星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；および黒色腫、精上皮腫、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、およびカポシ肉腫を含むその他の腫瘍。
【００３４】
好ましくは、肺癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、子宮癌、妊娠性絨毛上皮癌または上皮性卵巣癌の抑制または治療に有用であり、最も好ましくは、子宮癌または上皮性卵巣癌の抑制または治療に有用である。
【００３５】
他の観点では、本発明は、活性成分としてクエン酸およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００３６】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００３７】
また他の観点では、本発明は、活性成分として亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００３８】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００３９】
さらに他の観点では、本発明は、活性成分としてクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを含有する抗ウイルス剤組成物を提供する。
【００４０】
前記抗ウイルス剤組成物は、活性成分として、クエン酸を組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％で含有し、亜鉛を組成物の総重量に対し、０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％で含有し、Ｌ−アルギニンを組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％で含有し、これに薬剤学的に許容可能な担体を含有することを特徴とする。前記抗ウイルス剤組成物に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含む。
【００４１】
本発明の抗ウイルス剤組成物の活性は、癌細胞株において発現するウイルスの蛋白質を分析して証明することができる。即ち、本発明の抗ウイルス剤組成物を癌細胞株に処理した後、前記癌細胞に発現した蛋白質を抽出して、通常、当業界によく知られている分子生物学的方法により分析することができる。また、本発明の抗ウイルス剤組成物の活性は、身体のウイルス感染部位に直接前記抗ウイルス剤組成物を処理して、感染症状が予防また治療されることを確認することにより証明できる。
【００４２】
本発明の一実施例として、本発明において分析しようとするパピローマウイルスの蛋白質は、ヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７で子宮癌を引き起こす抗原蛋白質としてよく知られている。ここに、本発明者等は、子宮癌細胞株において前記蛋白質が減少する機序が、本発明による抗ウイルス剤組成物の処理によることであるのを証明することができた（図１３参照）。また、ヒトパピローマウイルスに感染して、生殖器の周辺に尖圭コンジローマが引き起こされた女性の患者に、本発明の抗ウイルス剤組成者を処理することにより、尖圭コンジローマが治療されることを観察することができ（図１４参照）、また、エンテロウイルスまたはポリオウイルスに感染した細胞に、本発明の抗ウイルス剤組成者を処理することにより、ウイルスの増殖を抑制して細胞病変現象が起こらないのを確認することができた（図１５、図１６参照）。
【００４３】
本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスによる感染から引き起こされる様々な疾病を予防または治療することができる。従って、本発明の抗ウイルス剤組成物で治療または予防可能なウイルスによる感染から引き起こされる疾病としては、以下のものに限定されるものではないが、パピローマウイルスにより感染した表皮が局所的に増殖して皮膚が肥厚する腫瘍であるイボ、パピローマウイルスにより感染した生殖器や肛門の周囲で引き起こされる尖圭コンジローマ等を治療することができる。また、本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスの増殖を抑制する効果があり、後天性免疫不全症候群を引き起こすエイズウイルス、インフルエンザウイルス、脳膜炎を引き起こすエンテロウイルス、小児麻痺を引き起こすポリオウイルスの増殖を抑制させることができる。
【００４４】
好ましい様態として、本発明の抗ウイルス剤組成物は、パピローマウイルス、エンテロウイルスまたはポリオウイルスによる感染から引き起こされる疾病を予防または治療することができる。
【００４５】
本発明の抗癌または抗ウイルス剤組成物（以下、“本発明の組成物”という）に用いられる担体は、製薬分野において通常用いられる担体、補助剤およびビヒクルを含んでおり、総括的に“薬剤学的に許容可能な担体”という。本発明の組成物に用いられ得る薬剤学的に許容可能な担体”としては、これらに限定されるものではないが、イオン交換、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、緩衝化剤（例えば、各種のリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセライド混合物）、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、および亜鉛塩）、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基質、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロック共重合体、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂が挙げられる。
【００４６】
本発明の組成物は、目的とする組織が得られる限り、全ての一般の経路を介して投与され得る。従って、本発明の組成物は、局所、経口、非経口、眼内、経皮、直腸、腸管を通じて投与され得、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、軟膏剤、またはクリーム剤に剤形化することができる。本願の明細書に用いられた用語の“非経口”とは、皮下、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、心臓内、硬膜内、病変内、および頭蓋内への注射または注入技術を含む。
【００４７】
一様態において、本発明の組成物を経口用固形剤に剤形化する場合、活性成分とともに希釈剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、セルロース、トウモロコシ澱粉またはジャガイモ澱粉）、滑剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール）、結合剤（例えば、澱粉、アラビアゴム、ゼラチンメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン）、崩壊剤（澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩またはグリコール酸澱粉ナトリウム）、フォーマル混合物、染料、甘味剤、湿潤剤（例えば、レシチン、ポリソルビン酸、ラウリル硫酸）、および一般的に薬剤に用いられる薬物学的不活性物質を含有することができる。これらの薬剤は、公知の方法、例えば、混合、顆粒化、打錠、糖衣、または被膜工程の手段により製造することができる。
【００４８】
他の様態において、本発明の組成物は、溶液、乳濁液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルの経口投与用液状組成物に剤形化する場合、通常用いられる不活性希釈剤（例えば、蒸留水、エタノール）を含むことができる。必要に応じて、液状組成物は、その他の補助剤、例えば湿潤剤、懸濁剤、香料、芳香剤、および防腐剤を含むことができる。
【００４９】
さらに他の様態において、本発明の組成物は、非経口的投与のための水溶性溶液で製造することができる。好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または緩衝生理食塩水のような適切な緩衝溶液を用いることができる。水溶性注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させることができる物質を添加することができる。さらに、活性成分の懸濁液は、適合したオイルの注入懸濁液であって、適合した脂溶性溶媒または担体は、ゴマ油のような脂肪酸またはオレイン酸エチル、トリグリセライドまたはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。多価陽イオン性非脂質アミノポリマーもビヒクルとして用いられ得る。必要に応じて、懸濁液は、化合物の溶解度を増加させ、高濃度の溶液を製造するために適合した安定化剤または薬剤を用いることができる。
【００５０】
さらに他の様態において、本発明の組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液として、滅菌注射用製剤の形態で製造することができる。このような懸濁液は、適合した分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）および懸濁化剤を用いて、本分野に公知の技術により剤形化することができる。また、滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であってもよい。用いられ得るビヒクルおよび溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。また、通常、滅菌不揮発性油が溶媒または懸濁化媒質として用いられる。このような目的のため、合成モノまたはジグリセライドを含んで刺激性の少ないものであれば、いずれの不揮発性油も用いることができる。オレイン酸およびそのグリセライド誘導体のような脂肪酸が、薬剤学的に許容可能な天然油（例えば、オリーブ油またはひまし油）、特に、これらのポリオキシエチル化したものと同様に注射製剤にも有用である。
【００５１】
このように製造された液相組成物は、殆どバクテリア捕獲フィルタを通じたろ過によって、殺菌剤または放射線を混入させることにより殺菌される。殺菌された組成物は、例えば凍結乾燥により固形組成物を得て固形化することができ、使用の際にこれを無菌水または無菌希釈液に溶解させる。
【００５２】
他の観点として、本発明の組成物のうち抗ウイルス剤組成物の好ましい剤形は、治療学的有効量の前記活性成分を薬剤学的に許容可能な担体とともに経皮投与用として剤形化することができる。ここで“経皮投与”とは、薬剤学的組成物を局所的に皮膚に投与して、薬剤学的組成物に含有された治療学的に有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【００５３】
本発明による経皮製剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、ペースト剤、塗布剤、外用散剤、エアゾール剤、および経皮吸収剤を含む。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般に公知された薬局方である文献（Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mark Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18042, Chapter 87:Blaug, Seymour）に記述されている。
【００５４】
代表的に、本発明のクリーム剤は、コールドクリーム、皮膚軟化用クリーム、シェービングクリーム、バニシングクリーム、およびハンドクリームが含まれ、一般に、ステアリン酸と水を含有する水中油型基剤（ｏ／ｗ）で塗布した後、水は蒸発し、ステアリン酸の薄い膜を残すバニシングクリームが好適に用いられる。また、コールドクリームが好適に用いられるが、この製剤は、セチルアルコール、蜜蝋、白蝋、流動パラフィン、ホウ酸ナトリウム、および蒸留水で調剤された半固形の白色の水中油型基剤（ｏ／ｗ）状態の製剤である。本発明の軟膏剤は、これに用いられる基剤の種類により、炭化水素基剤、吸収基剤、水洗が可能な基剤および水溶性基剤に分類されるが、これらは全て剤形分野の専門家によく知られているものとして本発明に含まれる。本発明のローション剤は、懸濁性と乳濁性に分けられるが、通常、乳化剤または他の適切な安定剤を用いて製造する。これらは全て剤形分野の専門家によく知られているものとして本発明に含まれる。
【００５５】
以下、上述した内容を参考として、本発明による経皮剤の製造方法についてクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、およびペースト剤を挙げて説明する。
【００５６】
経皮剤として用いられる代表的なものとしてはクリーム剤があるが、このクリーム剤は、アルコール類、蜜蝋、ソルビタンモノオレエートのような油相と、ソルビトール溶液、ポリソルベート、メチルパラベン、プロピルパラベン、グリセリン、水酸化カリウム、および蒸留水等の混合溶液で構成された水相とを、別途に６５〜７５℃で加熱し、油相を水相に徐々に加えながら攪拌させて粗エマルジョンを形成する。このようにして形成されたエマルジョンを、揮発および分解が生じない温度に冷却させて均質化した後、凝固するまで一定の速度で攪拌することにより得ることができる。
【００５７】
軟膏剤は、大規模または小規模で製造することができ、特殊な調剤法を取る場合は、その成分の性状に大きく依存するようになる。軟膏剤の小規模の製造時は、均一な製剤が得られるまで軟膏成分をいくつかの方法を用いて混合する軟化法が用いられ、また大規模の製造時は、軟膏の全部または一部の成分を溶融させた後、凝固するまで一定の速度で攪拌しながら冷却させて混合する溶融法が用いられている。このとき、融解しない成分は、通常、冷却しながら混合する過程が必要となる。一般に、熱に不安定な物質や揮発性物質は、混合物の温度が成分の分解や揮発を生じない低温の範囲で軟膏剤を製造するようになる。
【００５８】
ゲル剤は、８０〜９０℃で加熱された蒸留水にメトセルを分散させた後、約１２時間の間静置し、静置した蒸留水にゲル剤組成物を分散させて分散液を製造する。その後、水酸化ナトリウム溶液を分散液に添加して中性ｐＨに調節する。このようにして製造された分散液に、メチルパラベン、メトセル、カルボポル、およびプロピレングリコールを混合することによってゲルが得られる。
【００５９】
ペースト剤は、ペースト剤の組成物を乳鉢に入れて粉末化した後、ワセリン等に均一に混合して製造することができる。
【００６０】
本発明の経皮剤形において、活性成分のクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンは、公知の物理的方法および化学的方法により皮膚内への吸収を促進することができる。主に、熱、電気および超音波エネルギーを用いる物理的方法が適合するが、好ましくは、化学的方法を用いることができる。本発明による化学的方法において用いられる経皮吸収促進剤としては、下記表１に記載のものが含まれる。
【００６１】
【表１】
【００６２】
本発明の組成物と関連して用いられる用語の“治療学的有効量”とは、本発明の組成物が適用される癌またはウイルスによる感染から引き起こされる疾病に対して、改善または治療の効果を示す活性成分の量を意味する。本発明による組成物の治療学的有効量は、患者の年齢、性別、適用部位、投与回数、投与時間、剤形、補助剤の種類により変わるものの、注射剤の場合、一般に５０〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜４０００ｍｇ、最も好ましくは２５０〜３０００ｍｇを１日１〜５回投与することができ、経口投与剤の場合、一般に１〜２０００ｍｇ、好ましくは２５０〜１０００ｍｇ、最も好ましくは３００〜５００ｍｇを１日１〜５回投与することができる。また、経皮剤の場合、一般に約２〜３週間の間１日１回または２回、患部に５００〜２０００ｍｇを塗ることにより、予防または治療の効果が得られる。
【００６３】
本発明は、下記実施例によりさらに具体的に例示される。しかし、これらの実施例は、単に本発明の具現例であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
実施例１：注射剤の製造
クエン酸（Sigma, U.S.A.）、亜鉛（Sigma, U.S.A.）およびＬ−アルギニン（Sigma, U.S.A.）を、下記の表２に記載の本発明の組成物による活性成分を選んで配合した後、滅菌水を１００％の組成量として、それぞれの活性成分とともに混合した後、これをバイアル（１００ｍｇ）に充填して本発明の組成物を製造した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
実施例２：錠剤の製造
クエン酸（Sigma, U.S.A.）、亜鉛（Sigma, U.S.A.）およびＬ−アルギニン（Sigma, U.S.A.）を上記の表２による活性成分を選んで配合した後、ラクトース３０重量％、ステアリン酸マグネシウム５重量％、グリコール酸澱粉ナトリウム１０重量％、および滅菌水を１００％の組成量として、それぞれの活性成分とともに混合した後、これを３０〜６０℃に維持しながら、１時間の間攪拌して室温で冷却させた後、通常の錠剤の製造方法により打錠して組成物３５０ｍｇずつを含有する錠剤を製造した。
【００６７】
実施例３：経皮剤の製造
本発明の組成物のうち抗ウイルス剤組成物を経皮剤形に製造するために、クエン酸２重量％、亜鉛０．１重量％およびＬ−アルギニン５重量％を、１Ｌのエタノールが満たされたビーカーに溶解させた後、−２０℃で２４時間冷凍保管した。その後、前記ビーカーで凝固物を得て、これを経皮剤形の活性成分として用いた。前記凝固物は、約１０倍の濃縮率を有する。
【００６８】
（１）クリーム剤
油相
ステアリン酸 １３重量％
ステアリルアルコール １重量％
エチルアルコール １重量％
製造された凝固物 ５重量％
水相
グリセリン １０重量％
メチルパラベン ０．１重量％
プロピルパラベン ０．０５重量％
水酸化カリウム ０．９重量％
蒸留水 １００％組成量
油相と水相を別途に６５℃に加熱し、油相を水相に徐々に加えながら攪拌させることによって粗エマルジョンを形成した。形成されたエマルジョンを約５０℃に冷却させて均質化した。均質化物が凝結するまで振盪させながら冷却させることによって、クリーム剤を得た。
【００６９】
（２）軟膏剤
ワセリン ８０重量％
ステアリルアルコール ３重量％
白蝋 ９重量％
コレステロール ３重量％
製造された凝固物 ５重量％
ステアリルアルコール、白蝋、コレステロールおよび前記製造された凝固物をスチームバスで溶かし、ワセリンを添加した後、液体が形成するまで徐々に加熱し続けた。攪拌冷却させて凝結することにより、軟膏剤を得た。
【００７０】
（３）ゲル剤
メトセル90H.C.4000 ０．８重量％
カルボポル934 ０．２４重量％
プロピレングリコール １６．７重量％
メチルパラベン ０．０１５重量％
製造された凝固物 ５重量％
水酸化ナトリウム ｐＨ７調整量
蒸留水 １００％組成量
メトセルを熱水（８０〜９０℃）に分散させ、一夜冷蔵庫で冷却させて溶液化した。カルボポル９３４、前記凝固物を水に分散させ、分散液に十分な量の水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨを７．０に調節した。蒸留水を添加して容量を４０ｍｌとした。メチルパラベンをプロピレングリコール中に溶解させた。メトセル、カルボポル９３４およびプロピレングリコールを混合してゲルを得た。
【００７１】
（４）ペースト剤
酸化亜鉛 ２５重量％
澱粉 ２５重量％
カラミン ５重量％
製造された凝固物 ５重量％
ワセリン １００％組成量
カラミンを酸化亜鉛、前記凝固物および澱粉で滴定し、乳鉢で粉末化してワセリンに均一に入れてペースト剤を得た。
【００７２】
実施例４：クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸とＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表３）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３（ヒト卵巣腺腫（複数）、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７７）とＵ８７（ヒト神経膠芽腫細胞、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１４）を用いた。
【００７３】
前記細胞を３×１０３細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、１２時間の間培養した。培養培地としては、熱不活性化ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）１０％（ｖ／ｖ）、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、およびＬ−グルタミン１００μｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭ（Dulbecco'smodified Eagle's medium, Life Technology, Inc., U.S.A.）を用いた。
【００７４】
培養したそれぞれの細胞株に、クエン酸とＬ−アルギンの含量を異にしたことを除いては、実施例１と同様にして製造された組成物を処理して分類した後、これを３７℃で二酸化炭素５％と酸素９５％が供給される状態において２４時間の間培養した後、細胞の生存率を測定した。
【００７５】
【表３】
【００７６】
細胞の生存率は、公知されたＭＴＴ（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド）検定法で測定した（Hansen, M.B. et al., J. Immunol. Methods, 172, 203-210(1989)）。２０μｌＭＴＴ溶液［ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のうち１０ｍｇ／ｍｌであるＭＴＴ］をそれぞれのウェルに添加し、平板を３７℃で４時間培養した。培地を除去した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）２００μｌにホルマザン結晶を溶解させて、それぞれのウェルに添加した。これを１０分間室温で振盪して混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄモデル３５５０マイクロプレートリーダ（Richmond, C.A.）を用いて５４０ｎｍで測定した。このとき、ＤＭＥＭ−ＦＢＳとＭＴＴが添加され、前記組成物を添加しなかったウェルを対照群として用いた。図１に実験の結果を示した。
【００７７】
図１から明らかなように、クエン酸とＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）とＵ８７（◆：黒菱型）に処理したときの細胞生存率は、活性成分であるクエン酸とＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が６０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。
【００７８】
実施例５：亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、亜鉛とＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表４）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３とＵ８７を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図２に実験の結果を示した。
【００７９】
【表４】
【００８０】
図２から明らかなように、亜鉛とＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）とＵ８７（◆：黒菱型）に処理したときの細胞生存率は、活性成分である亜鉛とＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が５０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。
【００８１】
実施例６：クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を異にして製造した組成物（表５）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ＳＫＯＶ−３、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ヒト卵巣腺腫、ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１６１）およびＮＯＳＥ（ヒト卵巣表面正常上皮細胞）を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図３に実験の結果を示した。
【００８２】
【表５】
【００８３】
図３から明らかなように、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株ＳＫＯＶ−３（黒三角）、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（◆：黒菱型）およびＮＯＳＥ（黒四角）に処理したときの細胞生存率については、活性成分であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより、癌細胞の細胞生存率は減少し、正常細胞株は特異的な変化を示さなかった。特に、組成物６を癌細胞株のＳＫＯＶ−３、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３に処理したとき、細胞の生存率が２０％以下に減少した。これに対し、組成物６と７を正常細胞株のＮＯＳＥに処理したとき、細胞の生存率が５０％以上であった。このような結果から、前記抗癌剤組成物が癌細胞に特異的に作用して癌細胞のみを死滅させることが認められた。
【００８４】
実施例７：クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した抗癌剤組成物の処理による細胞生存率の測定
クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した本発明の抗癌剤組成物が、癌細胞の成長と生存に及ぼす影響を調べるために、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を異にして実施例５で製造した組成物（表５）を癌細胞株に処理して、細胞生存率を測定した。細胞株としては、ヒト子宮頸部癌細胞であるＣａ Ｓｋｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５５０）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２）およびＣ−３３ Ａ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−３１）を用いた。これらの細胞の培養、前記組成物を癌細胞株に処理する方法、および細胞生存率の測定は、前記実施例４と同様の方法により行った。図４に実験の結果を示した。
【００８５】
図４から明らかなように、クエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンを活性成分として含有した組成物を細胞株Ｃａ Ｓｋｉ（黒三角）、ＨｅＬａ（◆：黒菱型）およびＣ−３３ Ａ（黒四角）に処理したときの細胞生存率については、活性成分であるクエン酸、亜鉛およびＬ−アルギニンの含量を増加させて処理することにより、癌細胞の細胞生存率は減少した。特に、組成物５で処理したとき、細胞の生存率が６０％以下に減少し、組成物７で処理したとき、細胞の生存率は２０％以下に減少した。
【００８６】
実施例８：本発明の抗癌剤組成物の処理によるフローサイトメトリー分析
実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物が細胞内ＤＮＡ分裂に及ぼす影響をフローサイトメトリーにより分析した。
【００８７】
Ｃａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した。各癌細胞の対照群は、前記抗癌剤組成物を処理しなかった。培養が完了すると、細胞を回収し、これを冷たいＰＢＳで２回洗浄した。その後、前記細胞を４℃で２４時間の間１００％エタノールを透過させて固定した。これをＰＢＳ５００μｌに懸濁し、３７℃で３０分間ＲＮａｓｅ２０μｇ／ｍｌで処理した後、１０分間氷で冷却させた。このような方法で分離したＤＮＡにＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液５０μｇ／ｍｌを添加して染色し、ＤＮＡ分裂をフローサイトメトリー分析器（Becton Dickinson FACS system, U.S.A.）で測定した。このとき、プロピジウム蛍光は、冷却さけたアルゴンイオンレーザ１５ｍＷを用いて発色させ、発色する光を６１７ロングパス光学フィルタを用いて集めた。ＤＮＡのモデリングは、細胞周期解析ソフトウエア（ModFit, Verity Software House, Topsham, ME, U.S.A.）を用いた。図５、図６および図７に実験の結果を示した。
【００８８】
図５、図６および図７から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物で処理したＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株は、培養時間が経過することにより、Ｇ１段階が停止した。また、細胞分裂段階のうちＧ０−Ｇ１（ｓｕｂ−Ｇ１部分）段階において細胞の百分率が増加し、Ｓ（ＤＮＡ合成時期）段階とＧ２−Ｍ（類似分裂）段階において細胞が有意に減少し、これから細胞死滅が誘導されたことが認められた。
【００８９】
実施例９：本発明の抗癌剤組成物の処理によるＤＮＡラダリング分析
前記実施例８の細胞死滅の機序を調査するためにＤＮＡラダリング分析を行った。ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した後、経時的に培養したそれぞれの細胞を回収して、細胞のＤＮＡを公知の方法により次のように変形して抽出した（Leszczynski D. et. al. Photochem. Photobiol., 1996, Vol.64, p936-.）。前記それぞれの細胞プレートを、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）０．５％、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）２ｍＭ、蛋白質加水分解酵素Ｋ１００ｍｇ／ｍｌ、およびトリス塩酸緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８．０）で構成された溶解緩衝液に懸濁させた。これを５５℃で３時間培養し、培養液と同量でフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加した。これに培養液の０．１体積％の酢酸アンモニウムと２．５体積％の冷たい無水エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で一夜間保管した。前記ＤＮＡをＴＥ（１Ｍトリス塩酸緩衝液のうち０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解させ、３７℃でＲＮａｓｅ Ａ １００ｍｇ／ｍｌを添加して１時間培養した。前記試料を臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌが含まれた１．５％アガロスゲルで６０Ｖで１時間の間電気泳動し、紫外線（ＵＶ）に露出させた。図８に実験の結果を示した。
【００９０】
図８から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物をＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株にそれぞれ処理した後、経時的にＤＮＡを抽出して分析した結果、本発明の抗癌剤組成物の処理後、１２時間と２４時間が経過したそれぞれの細胞においてアポトーシスが観察された。一般に、アポトーシスは、ヌクレオソーム間の連結部位において約１００ｂｐ断片でＤＮＡが分裂するので、はしご状のＤＮＡラダーが観察された。従って、本発明の抗癌剤組成物の処理による癌細胞の死滅機序がアポトーシスであるということが認められた。
【００９１】
実施例１０：本発明の抗癌剤組成物の処理によるアポトーシスおよび発癌と関連した蛋白質の発現分析
癌細胞の細胞死滅の機序を調査するために、細胞死滅と関連した蛋白質であるＰ５３とＰ２１、および癌誘発蛋白質であるＣ−Ｍｙｃの発現を分析した。
【００９２】
Ｃａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株を、それぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間、実施例４と同様の方法で培養した後、経時的に培養したそれぞれの細胞を回収した。経時的に回収されたそれぞれの細胞を溶解緩衝液（10mM Tris,1mM EDTA, 1mM DDT, 1mM PMSF, 蛋白質分解酵素抑制剤）を用いて細胞を分解し、溶解された試料を抽出した後、試料をＳＤＳ−電気泳動して、ＥＣＬ（Electrochemiluminescence）ニトロセルロース膜（Amersham Life Science, U.K.）に蛋白質を移動させた。蛋白質が移動された膜にブロッキング溶液（５％ skin milk in TBST; 10mM Tris-HCl, pH8.0. 150mM NaCl, 0.1% Tween20）を処理して、４℃に維持しながら一夜間反応させた。その後、アポトーシスと関連した蛋白質の検出のために、免疫ブロット法を用いた。即ち、Ｐ２１、Ｐ５３およびＣ−Ｍｙｃの１次抗体を１：５００でブロッキング溶液に希釈し、４℃で一夜間反応させて膜に付着させ、２次抗体（goat anti-rabbit IgG-HRP; Santa CruzBiotechnology, U.S.A.）をフロッキング溶液に１：５０００で希釈して、１時間の間室温で反応させた。１次および２次抗体と反応した蛋白質を１５分間３回洗浄し、ＥＣＬハイパーフィルム（Amersham Life Science, U.K.）に露出させて確認した。図９、図１０および図１１に実験の結果を示した。
【００９３】
図９と図１０から明らかなように、細胞分裂を抑制する蛋白質であるＰ２１とＰ５３は、本発明の抗癌剤組成物を処理した後、経時的に発現様相が段々増加することが観察された。これに対し、図１１から明らかなように、癌細胞の分裂を活性化させる蛋白質であるＣ−Ｍｙｃは、本発明の抗癌剤組成物を処理した後、経時的に発現様相が段々減少することが観察された。従って、本発明の抗癌剤組成物が癌細胞の増殖を抑制させ、結局、癌細胞のアポトーシスを誘導することが認められた。
【００９４】
実施例１１：本発明の抗癌剤組成物の処理における染色による癌細胞核の観察
前記実施例８の細胞死滅の機序を調べるために、本発明の抗癌剤組成物で処理された細胞の染色された核を観察した。
【００９５】
直径６０ｍｍの皿に滅菌されたカバーガラスを置き、その上にＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株をそれぞれ１×１０４個で注入して一夜間培養させた。その後、本発明の抗癌剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを前記細胞株にそれぞれ処理して、２４時間後にＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで細胞を固定させた。さらにＰＢＳで３回洗浄し、４μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（4'6'-diamino-2-phenylinylindole）溶液（sigma, U.S.A.）を添加して、１０分間室温で反応させて染色した後、ＰＢＳで３回洗浄し、３次蒸留水で２回洗浄した後、固定溶液で固定した後、カバーガラスをスライド上に付着させ、蛍光顕微鏡（Olympus Optical Co., Ltd. U.S.A.）で観察した。図１２に実験の結果を示した。
【００９６】
図１２から明らかなように、本発明の抗癌剤組成物で処理したＣａ Ｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＣ−３３ Ａ細胞株において、本発明の抗癌剤組成物で処理しなかった場合は、健康な核を観察することができるのに対し、本発明の抗癌剤組成物で処理した場合は、細胞死滅の機序による核の形態的変化（例えば、染色質凝縮、分裂及び核の収縮等）を観察することができる。具体的に、凝縮した染色質の塊の周縁が不完全に現われ、凝縮した染色質が核の周辺に不規則に分散している形態で現われた。従って、本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞に特異的に作用してアポトーシスを引き起こすことが認められた。
【００９７】
実施例１２：子宮癌細胞で発現するパピローマウイルスの蛋白質分析
本発明の抗ウイルス剤組成物が子宮癌細胞株において発現するパピローマウイルスの蛋白質を減少させるのかについて調べるために、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７の発現を分析した。
【００９８】
前記実施例４と同様の方法で培養したＣａ ＳｋｉとＨｅＬａ細胞株を、それぞれ２×１０６細胞／ウェルとなるように９６−ウェルプレートに入れた後、実施例１で製造した本発明の抗ウイルス剤組成物（表１の組成物３）１００ｍｌを 処理した後、３７℃で二酸化炭素５％と酸素９５％が供給される状態で、６時間、１２時間、２４時間および４８時間の間培養した細胞を回収した。経時的に回収された細胞を溶解緩衝液（10mM Tris, 1mM EDTA, 1mM DDT, 1mM PMSF, 蛋白質分解酵素抑制剤）を用いて細胞を分解し、溶解された試料を抽出した後、試料をＳＤＳ−電気泳動して、ＥＣＬニトロセルロース膜（Amersham Life Science, U.K.）に蛋白質を移動させた。蛋白質が移動された膜にブロッキング溶液（５％ skin milk in TBST 10mM Tris-HCl, pH8.0. 150mM NaCl, 0.1% Tween20）を処理して、４℃に維持しながら一夜間反応させた。
【００９９】
その後、ヒトパピローマウイルスの１６型または１８型のＥ６とＥ７蛋白質の検出のために、免疫ブロット法を用いた。即ち、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６、Ｅ７およびヒトパピローマウイルス１８型のＥ６、Ｅ７と結合する１次抗体（Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.）を１：５００でブロッキング溶液に希釈し、４℃で一夜間反応させて膜に付着させ、２次抗体（goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology, U.S.A.）をフロッキング溶液に１：５０００で希釈して、１時間の間室温で反応させた。１次および２次抗体と反応した蛋白質を１５分間３回洗浄し、ＥＣＬハイパーフィルム（Amersham Life Science, U.K.）に露出させて確認した。これを図１３に示した。
【０１００】
図１３から明らかなように、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型のＥ６は、本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した細胞株Ｃａ ＳｋｉとＨｅＬａにおいて、経時的に発現様相が段々減少することが観察され、また、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１８型のＥ７は、本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した細胞株Ｃａ Ｓｋｉにおいて、経時的に発現様相が段々減少することが観察された。従って、本発明の抗ウイルス剤組成物を子宮癌細胞に処理したとき、発癌蛋白質であるヒトパピローマウイルス１６型または１８型のＥ６とＥ７の発現を抑制させることが認められた。
【０１０１】
実施例１３：パピローマウイルスに起因する尖圭コンジローマの治療効果
外陰部に尖圭コンジローマが生じた６名の女性患者を対象として実施例３で製造した軟膏剤（実施例３の経皮剤（２））１ｇをそれぞれの患部に塗った。その結果、これらの患者は、１日２回適用することにより、病変の大きさに応じて２〜１２週間以内に治療された。これを図１４に示した。
【０１０２】
実施例１４：エンテロウイルスとポリオウイルスの細胞病変分析
本発明の抗ウイルス剤組成物がウイルス増殖を抑制させることを証明するために、エンテロウイルスとポリオウイルスにそれぞれ感染した細胞に本発明の抗ウイルス剤組成物を処理して細胞病変を分析した。
【０１０３】
ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞）を、１０％ＦＢＳを含有したＭＥＭ培地を用いて、３７℃のインキュベータで培養させた後、実験の１日前、４８−ウェルプレートに１０５となるように接種させて培養した。前記培養された細胞をエンテロウイルスとポリオウイルスに感染させる前にＰＢＳで洗浄した。エンテロウイルスとポリオウイルスは、プラーク分析を用いて力価を求めて−７０℃で保管して使用した。前記エンテロウイルスとポリオウイルスをｐｆｕ６で１時間の間３７℃インキュベータで恒温培養させた後、さらにＰＢＳで洗浄して前記培養された細胞の培地にそれぞれ添加して２４時間の間培養した。前記培養されたウイルスに感染した細胞に、本発明の抗ウイルス剤（表１の組成物）を処理して、細胞病変抑制率を測定した。対照群としてクエン酸単独、亜鉛単独および精液成分を含有する組成物を前記細胞に処理した。これを図１５と図１６に示した。
【０１０４】
本発明の抗ウイルス剤組成物を処理した結果、細胞病変抑制率が６０％以上であった。これに対し、クエン酸単独、亜鉛単独および精液を含有する組成物をそれぞれ処理した結果、細胞病変抑制率は５０％以下であった。
【０１０５】
従って、本発明の抗ウイルス剤組成物は、ウイルスの増殖を抑制させてウイルスに感染した細胞の死滅が防止されることが認められた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有し、ウイルスの蛋白質発現の減少を誘導することを特徴とする抗ウイルス剤組成物。
【請求項２】
前記抗ウイルス剤組成物が、前記組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％のクエン酸、および／または０．０００１〜５重量％の亜鉛、および０．００１〜２０重量％のＬ−アルギニンを含有することを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤組成物。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤組成物の適用対象が、パピローマウイルス；エイズウイルス；エンテロウイルス；ポリオウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の抗ウイルス剤組成物。
【請求項４】
前記抗ウイルス剤組成物の剤形が、経口投与用抗ウイルス剤、非経口投与用抗ウイルス剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤またはペースト剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗ウイルス剤組成物。
【請求項１】
治療学的有効量のクエン酸および／または亜鉛およびＬ−アルギニンを薬剤学的に許容可能な担体とともに含有し、ウイルスの蛋白質発現の減少を誘導することを特徴とする抗ウイルス剤組成物。
【請求項２】
前記抗ウイルス剤組成物が、前記組成物の総重量に対し、０．００１〜２０重量％のクエン酸、および／または０．０００１〜５重量％の亜鉛、および０．００１〜２０重量％のＬ−アルギニンを含有することを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤組成物。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤組成物の適用対象が、パピローマウイルス；エイズウイルス；エンテロウイルス；ポリオウイルスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の抗ウイルス剤組成物。
【請求項４】
前記抗ウイルス剤組成物の剤形が、経口投与用抗ウイルス剤、非経口投与用抗ウイルス剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤またはペースト剤からなる群から選択されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗ウイルス剤組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００９−２９８８００（Ｐ２００９−２９８８００Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８７８８８（Ｐ２００９−１８７８８８）
【出願日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【分割の表示】特願２００４−５４８１４７（Ｐ２００４−５４８１４７）の分割
【原出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【出願人】（５０５１６２１７９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【分割の表示】特願２００４−５４８１４７（Ｐ２００４−５４８１４７）の分割
【原出願日】平成１５年１０月３１日（２００３．１０．３１）
【出願人】（５０５１６２１７９）
【Ｆターム（参考）】
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