抗ウイルス剤
本発明は，キナーゼを調節することにより，特にウイルス感染の媒介に関与する宿主細胞キナーゼを阻害することにより，ウイルス，特にポックスウイルスによる感染を阻害または治療する方法を提供する。ウイルス感染を阻害しうる薬剤を選択するために，感染の間にウイルスが必要とする宿主細胞の細胞蛋白質を同定し，評価し，および分類する方法が開示される。システムバイオロジーの方法を用いることにより，到来したウイルスの細胞表面への最初の接着から，侵入，転写，複製，生合成，および子孫粒子のアセンブリまで，ウイルス／宿主細胞相互作用を調べる。この方法は，ｓｉＲＮＡスクリーニングプラットフォームを利用し，遺伝子サイレンシングを用いて，「ウイルスインフェクトーム」，すなわち，ウイルスが感染を確立し，および感染サイクルを進行させるのに必要とする細胞蛋白質の集合をマッピングする。インフェクトームをチャート分析することにより，ウイルス感染に関与する宿主細胞蛋白質の同定によりウイルスの生物学に関する情報が提供され，ウイルスが細胞において増殖感染を確立することを防止する新規な抗ウイルス剤の開発が可能となる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
クロスリファレンス
本出願は，米国特許仮出願６０／９４５，７４０（２００７年６月２２日出願，その全体は参照として本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗ウイルス剤は，ウイルス感染の治療に用いられる一群の医薬品である。抗ウイルス剤は，抗微生物剤の１種であり，その大部分は抗生物質，抗真菌剤および抗寄生虫剤を含む。広範囲の病原菌をカバーしうる抗菌剤とは異なり，抗ウイルス剤はスペクトルが狭く，限定された効力しか持たない傾向にある。
【０００３】
抗ウイルス剤の出現は，生物の遺伝子および分子機能に関する知識が拡大して，生物医学の研究者がウイルスの構造および機能を理解できるようになったこと，新規薬剤を発見する技術が進歩したこと，および致死性のある後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の流行の原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を扱うように医療専門家に圧力がかけられたことの産物である。
【０００４】
季節性ヒトインフルエンザについての継続する問題および将来のパンデミックの脅威のため，インフルエンザに対する抗ウイルス剤の開発は高い優先度を有する（Ｆａｕｃｉ ２００６）。ワクチン接種はなお予防の基礎であるが，抗ウイルス剤は流行およびパンデミックの可能性に対する世界的規模の戦いにおける要素を構成する（Ｐｌｅｓｈｋａ ｅｔ ａｌ．２００６）。抗ウイルス剤の有用性はウイルス中の抗原の変化により影響を受けないため，抗ウイルス剤はワクチンに比べて利点を有する。このことは，出現した種に対してワクチンが入手可能となる前にこれらを用いることができることを意味する。また，これらは成立した病気に対しても有効である。予防においては，これらは感染に対して防御し，ウイルスの広がりを減少させ，免疫感作に対して有用な補完として作用する。これらの利点のため，インフルエンザパンデミックのリスクに関するいくつかの米国政府系委員会は，このウイルスに対する新規な抗ウイルス剤を開発する研究を推奨してきた。
【０００５】
インフルエンザに対する現在入手可能な抗ウイルス剤は，ウイルスＭ２−チャネル（アマンチジン，リマンチジン）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）（オセルタミビルおよびザナミビル）のいずれかを阻害するものである（Ｐｌｅｓｈｋａ ｅｔ ａｌ．２００６）。前者はヒトインフルエンザＡ株に対する予防および治療用に安全かつ有用であるが，ほとんど処方されない。ＮＡ阻害剤は最も一般的に使用されている。これらはトリＨ５Ｎ１を含むインフルエンザＡ株に対して活性があり，インフルエンザＢに対しても作用する。オセルタミビルは予防および治療に用いられているが，ザナミビル（吸入用）は予防用としてはまだ認可されていない。
【０００６】
現在の抗ウイルス薬剤（および一般にウイルス蛋白質を標的とする薬剤）にともなう主要な問題点は，ウイルス遺伝子中の点突然変異による耐性の出現である。Ｍ２チャネルブロッカーについては，完全耐性の出現は急速である。ＮＡ阻害剤の場合には，耐性株は出現するが，幸運なことにこれまでのところこれらは野生型と比較して適応度および病原性が低い。しかし，耐性株が発生する可能性は問題として残っている。
【０００７】
ウイルスそれ自体および標的としてのその蛋白質に焦点が当てられているが，ウイルス感染に関与する宿主細胞蛋白質に干渉する新世代の抗ウイルス剤を開発することは有用である。これらの蛋白質の活性を阻害することにより，子孫ウイルスの複製および産生を阻害することが可能となるであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は，ウイルス感染において役割を果たす宿主細胞蛋白質を同定する方法を提供する。これらの宿主細胞標的蛋白質を同定することにより，これらを標的とするウイルス感染の治療的介入のための薬剤の同定が可能となる。また，これらの宿主細胞蛋白質を調節してウイルス感染を治療および／または予防する薬剤および方法も提供される。本発明は，宿主細胞蛋白質を調節することにより，宿主細胞においてウイルス感染を阻害または低減させる薬剤を提供する。さらに，本発明は，ウイルス感染の治療に用いることができるキットを提供する。
【０００９】
１つの観点においては，本発明は，ポックスウイルス感染を治療する方法を提供し，この方法は，治療を必要とする被検動物に有効量のキナーゼ調節剤を投与することを含む。１つの態様においては，被検動物はヒトである。１つの態様においては，前記マクロピノサイトーシス経路の前記阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼの阻害剤である。１つの態様においては，前記キナーゼ調節剤は宿主細胞キナーゼ調節剤である。１つの態様においては，キナーゼ調節剤は，キナーゼを標的とするドミナント・ネガティブ分子，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，抗体または小分子である。１つの態様においては，キナーゼ調節剤はｓｉＲＮＡである。１つの態様においては，キナーゼ調節剤はＣＥＰ−１３４７である。１つの態様においては，前記宿主細胞キナーゼ調節剤は宿主細胞キナーゼ阻害剤である。１つの態様においては，前記宿主細胞キナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼの阻害剤である。１つの態様においては，ポックスウイルスは天然痘ウイルスである。１つの態様においては，ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。１つの態様においては，感染は呼吸器感染である。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，ウイルス感染を治療する方法を提供し，この方法は，治療を必要とする被検動物に有効量のマクロピノサイトーシス経路の調節剤を投与することを含む。１つの態様においては，被検動物はヒトである。１つの態様においては，マクロピノサイトーシス経路の前記調節剤は前記マクロピノサイトーシス経路の阻害剤である。１つの態様においては，前記阻害剤はキナーゼ阻害剤である。１つの態様においては，前記阻害剤は宿主細胞キナーゼ阻害剤である。１つの態様においては，前記宿主細胞キナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼの阻害剤である。１つの態様においては，阻害剤はＣＥＰ−１３４７である。１つの態様においては，前記ウイルスはポックスウイルスである。１つの態様においては，前記ウイルスは天然痘ウイルスである。１つの態様においては，前記ウイルスはワクシニアウイルスである。
【００１１】
別の観点においては，本発明は，細胞をキナーゼ阻害剤およびウイルスと接触させ，キナーゼ阻害剤がウイルスによる細胞の感染を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。１つの態様においてはキナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼを阻害する。別の態様においては，キナーゼ阻害剤は，キナーゼを標的とするドミナント・ネガティブ分子，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，抗体または小分子からなる群より選択される。別の態様においては，ウイルスはインフルエンザウイルスまたはポックスウイルス，例えばワクシニアまたは天然痘ウイルスである。別の態様においては，接触はインビトロで行われる。
【００１２】
参照
本明細書において言及されるすべての刊行物，特許および特許出願は，個々の刊行物，特許および特許出願が特定的にかつ個別に本明細書に参照として取り込まれるように，本明細書に参照として取り込まれる。
【００１３】
本発明の新規な特徴は，特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の原理を用いる例示的態様を記載する下記の詳細な説明および添付の図面を参照することにより，本発明の特徴および利点をより理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は，成熟ビリオン侵入の間のサーフィンおよび膜摂動を示す。
【図２】図２は，ｐ２１活性化キナーゼ−１（ＰＡＫ１）がＭＶ侵入に必要であることを示す。
【図３】図３は，ワクシニアＭＶが細胞に侵入するためにマクロピノサイトーシスを利用することを示す。
【図４】図４は，ワクシニアＭＶが内在化にＰＳを必要とすることを示す。
【図５】図５は，ＰＡＫ１の活性化はＡｄ３エンドサイトーシスおよび感染に必要であるが，Ａｄ５には必要ではないことを示す。
【図６】図６は，マクロピノサイトーシスを用いるＡｄ３感染の経路を示す。
【図７】図７は，ＭＶをＨｅＬａ細胞に加えた後のＥＧＦＲ活性化を示す。
【図８】図８は，ＥＧＦＲ阻害剤３２４６７４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）がＭＶ侵入を遮断し，これは低ｐＨ融合によりバイパスされることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の多くの態様が本明細書に示され記載されるが，当業者にはそのような態様は例示のためにのみ提供されていることが明らかであろう。当業者は本発明から逸脱することなく多くの改変，変更および置き換えをなすことができる。本発明の実施に際しては，本明細書に記載される本明細書の態様の種々の代替物を用いることができることが理解される。下記の特許請求の範囲は本発明の範囲を規定し，これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造およびそれらの均等物もカバーすることが意図される。
【００１６】
本発明の方法は，ウイルスが感染，複製および／または伝播に利用する宿主細胞遺伝子を同定することを含む。また，同定された宿主細胞遺伝子によりコードされる特異的宿主細胞蛋白質を標的とする薬剤を同定する方法も開示される。さらに，本発明は，同定された宿主細胞標的を調節するための薬剤および方法を含む。そのような薬剤および方法は，ウイルス感染の治療に適している。そのような宿主細胞標的の調節は，宿主細胞標的の活性化または阻害のいずれかを含むことができる。したがって，非ウイルス蛋白質，例えばキナーゼ等の宿主細胞蛋白質の活性を調節，例えば阻害する化合物を，抗ウイルス医薬製剤として用いる。
【００１７】
１つの態様においては，本発明の方法は，被検動物，例えば多数のウイルスのいずれかによるヒトの感染を阻害する抗ウイルス剤の開発に用いることができる。１つの態様においては，本発明の方法は，呼吸器ウイルスによる宿主の感染を阻害する抗ウイルス剤の開発に用いられる。呼吸器ウイルスは，最も一般的には，浮遊する飛沫または鼻汁により伝染し，広範な種類の病気につながりうる。呼吸器ウイルスとしては，呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ），インフルエンザウイルス，コロナウイルス，例えばＳＡＲＳ，アデノウイルス，パラインフルエンザウイルスおよびライノウイルスが挙げられる。
【００１８】
Ｉ．ウイルス
１つの態様においてはウイルス，例えば，ポックスウイルス，アデノウイルスまたは本明細書に記載される任意のウイルスが感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。アデノウイルスは，最も一般的には呼吸器疾患を引き起こす。アデノウイルス感染により引き起こされる呼吸器疾患の症状は，一般的な風邪症候群から肺炎，クループ，および気管支炎まで様々である。免疫系に障害をもつ患者は特にアデノウイルス感染の重篤な合併症を起こしやすい。急性呼吸器疾患（ＡＲＤ）は，第二次世界大戦の間に軍隊入隊者の間で最初に認められ，混雑およびストレスの状態の中でアデノウイルス感染により引き起こされうる。アデノウイルスは，中程度のサイズ（９０−１００ｎｍ）の，二本鎖ＤＮＡを含むエンベロープを有さない正二十面体ウイルスである。ヒト感染を引き起こしうる４９種の免疫学的に区別しうるタイプ（６種の亜属：Ａ−Ｆ）がある。アデノウイルスは，化学的または物理的作用および不利なｐＨ条件に対して非常に安定であり，身体の外で長期間生存することが可能である。ある種のアデノウイルス，例えばＡＤ２およびＡｄ５（Ｃ種）は，感染性侵入にクラスリン媒介性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスを利用する。他のアデノウイルス，例えばＡｄ３（Ｂ種）は，感染性侵入にダイナミン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスを利用する。
【００１９】
１つの態様においては，ポックスウイルスが感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。ポックスウイルスは，一般にエンベロープを有する。このウイルスは，約２００ｎｍｘ３００ｎｍのサイズを有する。ＤＮＡは直鎖状の二本鎖である。ウイルスファミリーＰｏｘｖｉｒｉｄａｅは，オルトポックスウイルス属を含み，これは天然痘の原因であるＶａｒｉｏｌａｖｅｒａ種を含む。このウイルスには２つの形態，すなわち大痘瘡と小痘瘡がある。天然痘は，典型的には，通常は感染したヒトの呼吸器系から浮遊した天然痘ウイルスの吸入によりヒトからヒトに伝染する。したがって，これらのウイルスの阻害はバイオテロに対する防御として有用である。ワクシニアもまた感染性ポックスウイルスである。
【００２０】
１つの態様においては，呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。ＲＳＶは新生児および１歳未満の小児における細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。最も頻繁には，病気は発熱，鼻水，咳，および時には喘鳴から始まる。最初のＲＳＶ感染の間，２５％から４０％の新生児および年少の小児は細気管支炎または肺炎の兆候または症状を有しており，０．５％から２％は入院を必要とする。ほとんどの小児は８から１５日間で病気から回復する。ＲＳＶ感染で入院する小児の大部分は，生後６か月未満である。ＲＳＶはまた一生の間に反復感染を引き起こし，通常は中程度から重症の風邪様症状と伴う。しかし，いずれの年齢の間でも，特に老齢者および心臓，肺または免疫系に障害を有する者の間で，重症の下部呼吸管疾患を引き起こしうる。ＲＳＶはネガティブセンスのエンベロープＲＮＡウイルスである。ビリオンは様々な形状およびサイズであり（平均直径は１２０−３００ｎｍ），環境中で不安定であり（環境表面上では数時間しか生存しない），石けん水および消毒剤で容易に不活性化する。
【００２１】
１つの態様においては，ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）が感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。ＨＰＩＶは，呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）についで２番目に一般的な幼い小児における下部呼吸管疾患の原因である。ＲＳＶと同様に，ＨＰＩＶは，一生の間に反復感染を引き起こし，通常は上部呼吸管疾患（例えば，風邪および／または咽喉炎）として現れる。ＨＰＩＶはまた，特に老齢者および免疫系の障害をもつ患者の間で，反復感染により重篤な下部呼吸管疾患（例えば，肺炎，気管支炎，および細気管支炎）を引き起こしうる。４種のＨＰＩＶのそれぞれは，異なる臨床的および疫学的特徴を有する。ＨＰＩＶ−１およびＨＰＩＶ−２の最も独特の臨床的特徴はクループ（すなわち，喉頭気管気管支炎）である。ＨＰＩＶ−１は小児のクループの主な原因であり，一方ＨＰＩＶ−２はあまり頻繁に検出されない。ＨＰＩＶ−１および−２の両方とも他の上部および下部呼吸管疾患を引き起こしうる。ＨＰＩＶ−３はしばしば細気管支炎および肺炎に関連している。ＨＰＩＶ−４はあまり頻繁に検出されず，これはおそらく重篤な疾患を引き起こさないためであろう。ＨＰＩＶのインキュベーション期間は一般に１−７日間である。ＨＰＩＶは，ネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスであり，その表面にＦ蛋白質およびヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ糖蛋白質の"スパイク"を持つ。ＨＰＩＶには４つの血清型（１から４）および２つのサブタイプ（４ａおよび４ｂ）がある。ビリオンは様々なサイズ（平均直径は１５０から３００ｎｍ）および形状であり，環境中で不安定であり（環境表面上で数時間の生存），石けん水により容易に不活性化される。
【００２２】
１つの態様においては，コロナウイルスが感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。コロナウイルスはＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーに属する動物ウイルスの属である。コロナウイルスは，エンベロープを持つウイルスであり，ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムおよびらせん対称を有する。コロナウイルスのゲノムサイズは約１６から３１キロベースの範囲であり，ＲＮＡウイルスとしては異常に大きい。"コロナウイルス"との名称は，ラテン語のｃｏｒｏｎａ（王冠を意味する）に由来する。これは，ウイルスエンベロープが電子顕微鏡下で小さな球状構造の特徴的な環の王冠を持つように見えるためである。この形態学は，実際にウイルスのスパイクペプロマーにより形成させており，これはウイルスの表面に存在して宿主指向性を決定する蛋白質である。コロナウイルスはニドウイルス目に分類され，この目のすべてのウイルスは感染の間に３’末端を共有する入れ子集合のサブゲノムｍＲＮＡを生成するため，巣を意味するラテン語のｎｉｄｕｓから名付けられている。すべてのコロナウイルスの全体構造に寄与する蛋白質は，スパイク，エンベロープ，膜およびヌクレオカプシドである。ＳＡＲＳの特定の場合においては，Ｓ上の規定されたレセプター結合ドメインがウイルスのその細胞性レセプターであるアンジオテンシン変換酵素２への結合を媒介する。
【００２３】
１つの態様においては，ライノウイルスが感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。ライノウイルス（"鼻"を意味するギリシャ語のｒｈｉｎ−に由来）はＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスの属である。ライノウイルスはヒトに感染性をもつ最も一般的なウイルスであり，一般的な風邪の原因ウイルスである。風邪の症状を引き起こすウイルス血清型は１０５を越えており，ライノウイルスは全症例の約５０％の原因である。ライノウイルスは７．２から８．５ｋｂの長さの一本鎖のポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。ゲノムの５’末端にはウイルスによりコードされる蛋白質があり，哺乳動物のｍＲＮＡと同様に，３’ポリＡテールが存在する。構造蛋白質はゲノムの５’領域にコードされており，末端は非構造性である。これはすべてのピコルナウイルスについて同じである。ウイルス粒子それ自体は，エンベロープをもたず，二十面体の構造を有する。
【００２４】
１つの態様においては，インフルエンザウイルスが感染または複製に必要とする宿主細胞蛋白質が同定される。インフルエンザウイルスはウイルスのオルトミクソウイルスファミリーに属する。このファミリーには，トゴトウイルスおよびドーリウイルスも含まれる。ヒトおよび他の種に感染するインフルエンザウイルスとしては，いくつかの型およびサブタイプが知られている。Ａ型インフルエンザ型インフルエンザウイルスは，ヒト，トリ，ブタ，ウマ，アザラシおよび他の動物に感染するが，野生の鳥類がこれらのウイルスの天然の宿主である。Ａ型インフルエンザウイルスはいくつかのサブタイプに分類され，ウイルスの表面上の２つの蛋白質，すなわちヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて命名されている。例えば，“Ｈ７Ｎ２ウイルス”はＨＡ７蛋白質およびＮＡ２蛋白質を有するインフルエンザＡサブタイプを表す。同様に，“Ｈ５Ｎ１”ウイルスはＨＡ５蛋白質およびＮＡ１蛋白質を有する。１６種のＨＡサブタイプおよび９種のＮＡサブタイプが知られている。ＨＡとＮＡ蛋白質との多くの異なる組み合わせが可能である。現在，いくつかのインフルエンザＡサブタイプ（すなわち，Ｈ１Ｎ１，Ｈ１Ｎ２，およびＨ３Ｎ２）のみがヒトの間で一般に流行している。他のサブタイプは主として他の動物種において見いだされる。例えば，Ｈ７Ｎ７およびＨ３Ｎ８ウイルスはウマに病気を引き起こし，またＨ３Ｎ８はイヌに病気を引き起こすことが最近示された（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm）。
【００２５】
インフルエンザ感染に関与する宿主細胞蛋白質を標的とする抗ウイルス剤を用いて，高リスク群（病院組織，高齢者ケア施設，免疫が抑制されている個体）をケースバイケースで保護することができる。抗ウイルス剤の可能性のある用途は，トリＨ５Ｎ１により引き起こされるかインフルエンザウイルスの他の株により引き起こされるかにかかわらず，将来のパンデミックの拡大および重篤性を制限することである。サブタイプＨ５およびＨ７のトリＡ型インフルエンザウイルス，例えばＨ５Ｎ１，Ｈ７Ｎ７，およびＨ７Ｎ３ウイルスは，高い病原性と関連づけられており，これらのウイルスによるヒトの感染は，軽症（Ｈ７Ｎ３，Ｈ７Ｎ７）から重症かつ致命的な疾患（Ｈ７Ｎ７，Ｈ５Ｎ１）まで様々である。病原性の低いウイルスの感染によるヒトの病気は，非常に軽い症状（例えば結膜炎）からインフルエンザ様の病気まで確認されている。ヒトに感染したことがある病原性の低いウイルスの例には，Ｈ７Ｎ７，Ｈ９Ｎ２，およびＨ７Ｎ２が含まれる。（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm）。
【００２６】
Ｂ型インフルエンザウイルスは通常はヒトに見いだされるが，アザラシにも感染しうる。Ａ型インフルエンザウイルスとは異なり，これらのウイルスはサブタイプにしたがって分類されていない。Ｂ型インフルエンザウイルスはヒトの間で罹患および死亡を引き起こしうるが，一般にＡ型インフルエンザウイルスと比べて重大な流行を伴わない。Ｂ型インフルエンザウイルスはヒトでの流行を引き起こしうるが，パンデミクスを引き起こしたことはない（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm）。
【００２７】
Ｃ型インフルエンザウイルスウイルスはヒトに軽い病気を引き起こし，流行またはパンデミックを引き起こさない。これらのウイルスはイヌおよびブタにも感染することができる。これらのウイルスはサブタイプにしたがって分類されていない（http://www.cdc.gov/flu/avian/gen-info/flu-viruses.htm）。
【００２８】
インフルエンザウイルスは，細胞表面レセプターの特異性および細胞指向性に関して互いに異なるが，共通する侵入経路を利用する。これらの経路を図表化し，ウイルスインフルエンザの伝染，侵入，複製，生合成，アセンブリ，または退出に関与する宿主細胞蛋白質を同定することにより，現存する，および出現するインフルエンザ種に対する一般的薬剤の開発が可能となる。薬剤はまた，同様の経路を利用する非関連ウイルスに対しても有用性を示すであろう。例えば，薬剤は，インフルエンザウイルスに加えて多数の異なるウイルスに対して気道上皮細胞を保護することができる。
【００２９】
本明細書に記載される方法は，任意のウイルス，例えば，アベルソン白血病ウイルス，アベルソンネズミ白血病ウイルス，アベルソンウイルス，急性喉頭気管気管支炎ウイルス，アデレード川ウイルス，アデノ随伴ウイルス群，アデノウイルス，アフリカウマ病ウイルス，アフリカブタ熱ウイルス，ＡＩＤＳウイルス，アリューシャンミンク病パルボウイルス，アルファレトロウイルス，アルファウイルス，ＡＬＶ関連ウイルス，アマパリウイルス，アフタウイルス，アクアレオウイルス，アルボウイルス，アルボウイルスＣ，アルボウイルス群Ａ，アルボウイルス群Ｂ，アレナウイルス群，アルゼンチン出血熱ウイルス，アルゼンチン出血熱ウイルス，アーテリウイルス，アストロウイルス，アテリネヘルペスウイルス群，オジェッキー病ウイルス，オーラウイルス，オースダック病ウイルス，オーストラリアコウモリリッサウイルス，トリアデノウイルス，トリ赤芽球症ウイルス，トリ感染性気管支炎ウイルス，トリ白血病ウイルス，トリ白血病ウイルス，トリリンパ腫症ウイルス，トリ骨髄芽球症ウイルス，トリパラミクソウイルス，トリ気脳炎ウイルス，トリ細網内皮症ウイルス，トリ肉腫ウイルス，トリＣ型レトロウイルス群，トリヘパドナウイルス，トリ痘ウイルス，Ｂウイルス，Ｂ１９ウイルス，ババンキウイルス，ヒヒヘルペスウイルス，バキュロウイルス，バーマー森林ウイルス，ベラルウイルス，ベリマーウイルス，ベータレトロウイルス，バーナウイルス，ビトナーウイルス，ＢＫウイルス，ブラッククリーク運河ウイルス，ブルータングウイルス，ボリビア出血熱ウイルス，ボマ病ウイルス，ヒツジボーダー病ウイルス，ボルナウイルス，ウシアルファヘルペスウイルス１，ウシアルファヘルペスウイルス２，ウシコロナウイルス，ウシ一過性熱ウイルス，ウシ免疫不全ウイルス，ウシ白血病ウイルス，ウシ白血病ウイルス，ウシ乳頭炎ウイルス，ウシパピローマウイルス，ウシ丘疹口内炎ウイルス，ウシパルボウイルス，ウシ合胞体ウイルス，ウシＣ型オンコウイルス，ウシウイルス下痢ウイルス，バギークリークウイルス，弾丸形ウイルス群，ブニヤンウエラウイルス超群，ブニヤウイルス，バーキットリンパ腫ウイルス，ブワンバ熱，ＣＡウイルス，カリシウイルス，カリフォルニア脳炎ウイルス，ラクダ痘ウイルス，カナリ痘ウイルス，イヌヘルペスウイルス，イヌコロナウイルス，イヌジステンパーウイルス，イヌヘルペスウイルス，イヌ微小ウイルス，イヌパルボウイルス，カノデルガディトウイルス，ヤギ関節炎ウイルス，ヤギ脳炎ウイルス，ヤギヘルペスウイルス，ヤギ痘ウイルス，カルジオウイルス，テンジクネズミヘルペスウイルス１，オナガザルヘルペスウイルス１，オナガザルヘルペスウイルス１，オナガザルヘルペスウイルス２，チャンジプラウイルス，チャンギノラウイルス，ブチナマズウイルス，シャルルビルウイルス，ニワトリ痘ウイルス，チクングンヤウイルス，チンパンジーヘルペスウイルス，チャブレオウイルス，シロザケウイルス，コカルウイルス，ギンザケレオウイルス，媾疹ウイルス，コロラドダニ熱ウイルス，コルチウイルス，コロンビアＳＫウイルス，風邪ウイルス，感染性膿瘡ウイルス，感染性膿疱性皮膚炎ウイルス，コロナウイルス，コリパルタウイルス，鼻風邪ウイルス，牛痘ウイルス，コクサッキーウイルス，ＣＰＶ（細胞質多角体病ウイルス），コオロギ麻痺ウイルス，クリミア−コンゴ出血熱ウイルス，クループ関連ウイルス，クリプトウイルス，サイポウイルス，サイトメガロウイルス，サイトメガロウイルス群，細胞質多角体病ウイルス，シカパピローマウイルス，デルタレトロウイルス，デングウイルス，デンソウイルス，デペンドウイルス，ドーリウイルス，ディプロルナウイルス，ショウジョウバエＣウイルス，カモＢ型肝炎ウイルス，カモ肝炎ウイルス１，カモ肝炎ウイルス２，デュオウイルス，デュベンヘージウイルス，変形ウイングウイルスＤＷＶ，東部ウマ脳炎ウイルス，東部ウマ脳脊髄炎ウイルス，ＥＢウイルス，エボラウイルス，エボラ様ウイルス，エコーウイルス，エコーウイルス，エコーウイルス１０，エコーウイルス２８，エコーウイルス９，欠肢症ウイルス，ＥＥＥウイルス，ＥＩＡウイルス，ＥＩＡウイルス，脳炎ウイルス，脳心筋炎群ウイルス，脳心筋炎ウイルス，エンテロウイルス，酵素上昇ウイルス，酵素上昇ウイルス（ＬＤＨ），流行性出血熱ウイルス，流行性出血病ウイルス，エプスタインバーウイルス，ウマ科アルファヘルペスウイルス１，ウマ科アルファヘルペスウイルス４，ウマ科ヘルペスウイルス２，ウマ流産ウイルス，ウマ動脈炎ウイルス，ウマ脳症ウイルス，ウマ感染性貧血ウイルス，ウマ麻疹ウイルス，ウマ鼻肺炎ウイルス，ウマライノウイルス，ユーベナングウイルス，ヨーロッパエルクパピローマウイルス，ヨーロッパブタ熱ウイルス，エバーグレイズウイルス，ヤッチウイルス，ネコヘルペスウイルス１，ネコカリシウイルス，ネコ線維肉腫ウイルス，ネコヘルペスウイルス，ネコ免疫不全ウイルス，ネコ感染性腹膜炎ウイルス，ネコ白血病／肉腫ウイルス，ネコ白血病ウイルス，ネコ汎白血球減少症ウイルス，ネコパルボウイルス，ネコ肉腫ウイルス，ネコ合胞体ウイルス，フィロウイルス，フランダーズウイルス，フラビウイルス，口蹄疫ウイルス，フォートモーガンウイルス，フォーコーナーズハンタウイルス，家禽アデノウイルス１，家禽痘ウイルス，フレンドウイルス，ガンマレトロウイルス，ＧＢ肝炎ウイルス，ＧＢウイルス，ドイツ麻疹ウイルス，ゲタウイルス，テナガザル白血病ウイルス，腺熱ウイルス，ヤギ痘ウイルス，ゴールデンシンナーウイルス，ゴノメタウイルス，ガチョウパルボウイルス，顆粒病ウイルス，グロスウイルス，ジリスＢ型肝炎ウイルス，群Ａアルボウイルス，グアナリトウイルス，テンジクネズミサイトメガロウイルス，テンジクネズミＣ型ウイルス，ハンターンウイルス，ハンタウイルス，ホンビノスガイレオウイルス，野ウサギ線維腫ウイルス，ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス），赤血球吸着ウイルス２，日本の赤血球凝集ウイルス，出血熱ウイルス，ヘンドラウイルス，ヘニパウイルス，肝炎ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス群，Ｃ型肝炎ウイルス，Ｄ型肝炎ウイルス，デルタ肝炎ウイルス，Ｅ型肝炎ウイルス，Ｆ型肝炎ウイルス，Ｇ型肝炎ウイルス，非Ａ非Ｂ肝炎ウイルス，肝炎ウイルス，肝炎ウイルス（非ヒト），肝脳脊髄炎レオウイルス３，肝ウイルス，ヘロンＢ型肝炎ウイルス，ヘルペスＢウイルス，ヘルペス単純ウイルス，ヘルペス単純ウイルス１，ヘルペス単純ウイルス２，ヘルペスウイルス，ヘルペスウイルス７，ヘルペスウイルスクモザル，ヘルペスウイルスヒト，ヘルペスウイルス感染，ヘルペスウイルスリスザル，ヘルペスウイルスブタ，ヘルペスウイルス水痘，ハイランドＪウイルス，ヒラメラブドウイルス，ブタコレラウイルス，ヒトアデノウイルス２，ヒトアルファヘルペスウイルス１，ヒトアルファヘルペスウイルス２，ヒトアルファヘルペスウイルス３，ヒトＢリンパ球指向性ウイルス，ヒトベータヘルペスウイルス５，ヒトコロナウイルス，ヒトサイトメガロウイルス群，ヒト泡沫状ウイルス，ヒトガンマヘルペスウイルス４，ヒトガンマヘルペスウイルス６，ヒトＡ型肝炎ウイルス，ヒトヘルペスウイルス１群，ヒトヘルペスウイルス２群，ヒトヘルペスウイルス３群，ヒトヘルペスウイルス４群，ヒトヘルペスウイルス６，ヒトヘルペスウイルス８，ヒト免疫不全ウイルス，ヒト免疫不全ウイルス１，ヒト免疫不全ウイルス２，ヒトパピローマウイルス，ヒトＴ細胞白血病ウイルス，ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ，ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ，ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ，ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ，ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩＩ，１型ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス，２型ヒトＴ細胞リンパ球指向性ウイルス，ヒトＴリンパ球指向性ウイルスＩ，ヒトＴリンパ球指向性ウイルスＩＩ，ヒトＴリンパ球指向性ウイルスＩＩＩ，生痕ウイルス，新生児胃腸炎ウイルス，感染性ウシ鼻気管炎ウイルス，感染性造血壊死ウイルス，感染性膵臓壊死ウイルス，インフルエンザウイルスＡ，インフルエンザウイルスＢ，インフルエンザウイルスＣ，インフルエンザウイルスＤ，インフルエンザウイルスｐｒ８，昆虫虹色ウイルス，昆虫ウイルス，イリドウイルス，日本Ｂウイルス，日本脳炎ウイルス，ＪＣウイルス，フニンウイルス，カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス，ケメロボウイルス，キラムラットウイルス，クラマスウイルス，コロンゴウイルス，韓国出血熱ウイルス，クンバウイルス，キサヌール森林病ウイルス，キジラガーシュウイルス，ラクロスウイルス，乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス，乳酸デヒドロゲナーゼウイルス，ラゴスコウモリウイルス，ラングールウイルス，ウサギパルボウイルス，ラッサ熱ウイルス，ラッサウイルス，潜在的ラットウイルス，ＬＣＭウイルス，リーキーウイルス，レンチウイルス，ウサギ痘ウイルス，白血病ウイルス，白血病ウイルス，ランピースキン病ウイルス，リンパ節症関連ウイルス，リンパ球クリプトウイルス，リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス，リンパ増殖ウイルス群，マシュポウイルス，マッドイッチウイルス，哺乳動物Ｂ型オンコウイルス群，哺乳動物Ｂ型レトロウイルス，哺乳動物Ｃ型レトロウイルス群，哺乳動物Ｄ型レトロウイルス，乳癌ウイルス，マプエラウイルス，マールブルグウイルス，マールブルグ様ウイルス，メイソンファイザーサルウイルス，マストアデノウイルス，マヤロウイルス，ＭＥウイルス，麻疹ウイルス，メナングルウイルス，メンゴウイルス，メンゴウイルス，ミデルブルグウイルス，乳牛結節ウイルス，ミンク腸炎ウイルス，マウスの微小ウイルス，ＭＬＶ関連ウイルス，ＭＭウイルス，モコラウイルス，軟体動物痘ウイルス，伝染性軟属腫ウイルス，サルＢウイルス，サル痘ウイルス，モノネガウイルス，麻疹ウイルス，マウントエルゴンコウモリウイルス，マウスサイトメガロウイルス，マウス脳脊髄炎ウイルス，マウス肝炎ウイルス，マウスＫウイルス，マウス白血病ウイルス，マウス乳癌ウイルス，マウス微小ウイルス，マウス肺炎ウイルス，マウスポリオウイルス，マウスポリオーマウイルス，マウス肉腫ウイルス，マウス痘ウイルス，モザンビークウイルス，ムカンボウイルス，粘膜病ウイルス，ムンプスウイルス，ネズミベータヘルペスウイルス１，ネズミサイトメガロウイルス２，ネズミサイトメガロウイルス群，ネズミ脳脊髄炎ウイルス，ネズミ肝炎ウイルス，ネズミ白血病ウイルス，ネズミ結節誘発ウイルス，ネズミポリオーマウイルス，ネズミ肉腫ウイルス，ムーロメガロウイルス，マリーバレー脳炎ウイルス，粘液腫ウイルス，ミクソウイルス，多形性ミクソウイルス，ミクソウイルスパロチチディス，ナイロビヒツジ病ウイルス，ナイロウイルス，ナニルナウイルス，ナリバウイルス，デュモウイルス，ニースリングウイルス，ネルソン湾ウイルス，神経指向性ウイルス，新世界アレナウイルス，新生児肺炎ウイルス，ニューカッスル病ウイルス，ニパウイルス，非細胞変性ウイルス，ノーウォークウイルス，核多角体病ウイルス（ＮＰＶ），ニップルネックウイルス，オニョンニョンウイルス，オッケルボウイルス，発癌性ウイルス，発癌性ウイルス様粒子，オンコルナウイルス，オルビウイルス，伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス，オロポーシェウイルス，オルトヘパディナウイルス，オルトミクソウイルス，オルトポックスウイルス，オルトレオウイルス，オロンゴ，ヒツジパピローマウイルス，ウシカタル熱ウイルス，ヨザルヘルペスウイルス，パリアンウイルス，パピローマウイルス，パピローマウイルスシルビラギ，パポバウイルス，パラインフルエンザウイルス，パラインフルエンザウイルス１型，パラインフルエンザウイルス２型，パラインフルエンザウイルス３型，パラインフルエンザウイルス４型，パラミクソウイルス，パラポックスウイルス，パラワクシニアウイルス，パルボウイルス，パルボウイルスＢ１９，パルボウイルス群，ペスチウイルス，静脈ウイルス，アザラシジステンパーウイルス，ピコディナウイルス，ピコルナウイルス，ブタサイトメガロウイルス，ハト痘ウイルス，ピリーウイルス，ピクサナウイルス，
マウスの肺炎ウイルス，肺炎ウイルス，ポリオウイルス，ポリオウイルス，ポリディナウイルス，多角体病ウイルス，ポリオーマウイルス，ポリオーマウイルス，ウシポリオーマウイルス，オナガザルポリオーマウイルス，ヒトポリオーマウイルス２，ポリオーマウイルスマッカカエ１，ネズミポリオーマウイルス１，ネズミポリオーマウイルス２，ヒヒポリオーマウイルス１，ヒヒポリオーマウイルス２，ポリオーマウイルスシルビラギ，ポンギンヘルペスウイルス１，ブタ流行性下痢ウイルス，ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス，ブタパルボウイルス，ブタ伝染性胃腸炎ウイルス，ブタＣ型ウイルス，ポックスウイルス，ポックスウイルス，天然痘ポックスウイルス，プロスペクトヒルウイルス，プロウイルス，偽牛痘ウイルス，仮性狂犬病ウイルス，オウム痘ウイルス，ウズラ痘ウイルス，ウサギ線維腫ウイルス，ウサギ腎臓空胞化ウイルス，ウサギパピローマウイルス，狂犬病ウイルス，アライグマパルボウイルス，アライグマ痘ウイルス，ラニケートウイルス，ラットサイトメガロウイルス，ラットパルボウイルス，ラットウイルス，ラウシャーウイルス，組換えワクシニアウイルス，組換えウイルス，レオウイルス，レオウイルス１，レオウイルス２，レオウイルス３，爬虫類Ｃ型ウイルス，呼吸器感染ウイルス，呼吸器合胞体ウイルス，呼吸器ウイルス，細網内皮症ウイルス，ラブドウイルス，ラブドウイルスカルピア，ラジノウイルス，ライノウイルス，リジディオウイルス，リフトバレー熱ウイルス，ライリーウイルス，牛疫ウイルス，ＲＮＡ腫瘍ウイルス，ロス川ウイルス，ロタウイルス，ルージョールウイルス，ラウス肉腫ウイルス，風疹ウイルス，麻疹ウイルス，ルビウイルス，ロシア秋脳炎ウイルス，ＳＡ１１サルウイルス，ＳＡ２ウイルス，サビアウイルス，サギヤマウイルス，サイミリンヘルペスウイルス１，唾液腺ウイルス，サシチョウバエ熱ウイルス群，サンジンバウイルス，ＳＡＲＳウイルス，ＳＤＡＶ（唾液腺涙腺炎ウイルス），アザラシ痘ウイルス，セムリキ森林熱ウイルス，ソウルウイルス，ヒツジ痘ウイルス，ショープ線維腫ウイルス，ショープパピローマウイルス，サル泡沫状ウイルス，サルＡ型肝炎ウイルス，サルヒト免疫不全ウイルス，サル免疫不全ウイルス，サルパラインフルエンザウイルス，サルＴ細胞リンパ球指向性ウイルス，サルウイルス，サルウイルス４０，シンプレックスウイルス，シンモンブレウイルス，シンドビスウイルス，天然痘ウイルス，南アメリカ出血熱ウイルス，スズメ痘ウイルス，スプマウイルス，リス線維腫ウイルス，リスザルレトロウイルス，ＳＳＶ１ウイルス群，ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球指向性ウイルス）Ｉ型，ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球指向性ウイルス）ＩＩ型，ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球指向性ウイルス）ＩＩＩ型，口内炎丘疹ウイルス，下顎ウイルス，イノシシアルファヘルペスウイルス１，ブタヘルペスウイルス２，スイポックスウイルス，沼地熱ウイルス，豚痘ウイルス，スイスマウス白血病ウイルス，ＴＡＣウイルス，タカリベウイルス群，タカリベウイルス，タナポックスウイルス，タテラポックスウイルス，テンチレオウイルス，タイラー脳脊髄炎ウイルス，タイラーウイルス，トゴトウイルス，トッタパレイヤンウイルス，ダニ媒介性脳炎ウイルス，チオマンウイルス，トガウイルス，トロウイルス，腫瘍ウイルス，ツパイアウイルス，シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス，シチメンチョウ痘ウイルス，Ｃ型レトロウイルス，Ｄ型オンコウイルス，Ｄ型レトロウイルス群，潰瘍性疾患ラブドウイルス，ウナウイルス，ウクニエミウイルス群，ワクシニアウイルス，空胞化ウイルス，水痘帯状疱疹ウイルス，水痘ウイルス，バリコラウイルス，大痘瘡ウイルス，天然痘ウイルス，バシンギシュー病ウイルス，ＶＥＥウイルス，ベネズエラウマ脳炎ウイルス，ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス，ベネズエラ出血熱ウイルス，水疱性口内炎ウイルス，小胞性ウイルス，ビリュイスクウイルス，毒ヘビレトロウイルス，ウイルス出血性敗血症ウイルス，ビスナマエディウイルス，ビスナウイルス，ハタネズミ痘ウイルス，ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス），ウォーラルウイルス，ウォリゴウイルス，いぼウイルス，ＷＥＥウイルス，西ナイルウイルス，西部ウマ脳炎ウイルス，西部ウマ脳脊髄炎ウイルス，ワタロアウイルス，冬季嘔吐症ウイルス，ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス，ウーリーモンキー肉腫ウイルス，創傷腫瘍ウイルス，ＷＲＳＶウイルス，ヤバサル腫瘍ウイルス，ヤバウイルス，ヤタポックスウイルス，黄熱ウイルス，およびヤグボダノバックウイルスにより引き起こされる感染の治療用の薬剤の開発および／または同定に有用である。１つの態様においては，各ウイルスについて，ウイルス感染の特定の段階，例えば細胞侵入または複製サイクルの間にウイルス感染に関与する宿主細胞遺伝子の一覧を含むインフェクトームが作成される。
【００３０】
ＩＩ．ウイルス感染経路
本明細書に開示される宿主細胞標的は，好ましくはウイルス複製および／または感染経路において役割を果たす。そのような宿主細胞標的を標的とすることにより，ウイルスの複製および／または感染経路を調節することができる。好ましい態様においては，同定された宿主細胞標的は，適当な薬剤を用いて直接的にまたは間接的に調節される。そのような適当な薬剤としては，小分子治療剤，蛋白質治療剤，または核酸治療剤が挙げられる。そのような宿主細胞標的の調節はまた，宿主細胞標的の上流または下流のシグナリング経路の物質を標的とすることにより行うこともできる。
【００３１】
他のウイルスと同様に，インフルエンザウイルスの複製には６つの相が含まれる；伝染，侵入，複製，生合成，アセンブリ，および退出。侵入は，エンドサイトーシスにより起こり，複製およびｖＲＮＰアセンブリは核で生じ，ウイルスは細胞膜から発芽する。感染した患者においては，ウイルスは気道上皮細胞を標的とする。好ましくは，本明細書に記載される方法においては，そのような経路に関与する少なくとも１つの宿主細胞標的が調節される。
【００３２】
あるウイルスについては，宿主細胞の感染の間に関与する段階の解明において大きな進歩があった。例えば，１９８０年代初期に開始された実験では，インフルエンザウイルスは，他のウイルス，例えばアルファ−およびラブドウイルスと共有する要素を用いる段階的なエンドサイトーシスの侵入プログラムにしたたうことが示された（Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ １９８９；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００６）。段階は次のとおりである：１）細胞表面上のシアル酸含有複合糖質レセプターへの最初の付着；２）ウイルス粒子により誘導されるシグナリング；３）クラスリン依存性およびクラスリン非依存性の細胞メカニズムによるエンドサイトーシス；４）後期エンドソームからの酸誘導性，ヘマグルチニン（ＨＡ）媒介性浸透；５）酸により活性化されるＭ２およびマトリクス蛋白質（Ｍ１）依存性のカプシドの被覆の除去；および，６）ｖＲＮＰのサイトゾル間輸送および核内輸送。これらの工程は，宿主細胞から，ソーティングレセプター，ベシクル形成機構，キナーゼ媒介性制御，オルガネラの酸性化，およびおそらくは細胞骨格の活性の形での支援に依存する。
【００３３】
インフルエンザの細胞表面への付着は，ＨＡ１サブユニットが末端シアル酸残基をもつオリゴ糖成分を有する細胞表面の糖蛋白質および糖脂質に結合することにより生ずる（Ｓｋｅｈｅｌ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ２０００）。シアル酸と次の糖を連結する結合は種特異性に寄与する。Ｈ５Ｎ１等のトリの種は，ａ−（２，３）−結合を好み，ヒト種はａ−（２，６）−結合を好む（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ２００６）。上皮細胞においては，結合は頂端表面上の微絨毛に優先的に生じ，エンドサイトーシスはこれらの拡大の基部において生ずる（Ｍａｔｌｉｎ １９８２）。レセプターの結合が細胞を侵襲用に用意するシグナルを誘導するか否かはまだ明らかではないが，おそらくそうであろう。これは，蛋白質キナーゼＣの活性化およびホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩ３Ｐ）の合成が有効な侵入に必要であるからである（Ｓｉｅｃｚｋａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００６）。
【００３４】
エンドサイトーシスの内在化は，結合から数分以内に生ずる（Ｍａｔｌｉｎ １９８２；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｏｈｎｉｓｈｉ １９８４）。組織培養細胞においては，インフルエンザウイルスは，３つの異なるタイプの細胞プロセスを利用する：１）予め存在するクラスリンにより被覆されたくぼみ，２）ウイルスにより誘導されるクラスリンにより被覆されたくぼみ，および３）見える被覆をもたないベシクル中のエンドサイトーシス（Ｍａｔｌｉｎ １９８２；Ｓｉｅｃｚｋａｒｓｋｉ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００２；Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．２００４），結果を参照）。蛍光ウイルスを用いるビデオ顕微鏡は，ウイルス粒子が細胞周辺でアクチン媒介性の急速な動きを示した後，微小管により媒介されるマイナス末端に向けて細胞の核周辺部へと輸送されることを示した。生きた細胞のイメージングは，ウイルス粒子が最初に移動性の周辺初期エンドソームの小集団に入り，これがウイルス粒子を細胞質中のより深い位置に運んだ後，浸透が生ずることを示した（Ｌａｋａｄａｍｙａｌｉ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．２００４）。エンドサイトーシスのプロセスは，蛋白質キナーゼおよび脂質キナーゼ，プロテアソーム，ならびにＲａｂｓおよびユビキチン依存性輸送因子により制御されている（Ｋｈｏｒ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００６）。
【００３５】
膜浸透段階は，三量体の準安定性ＨＡの低ｐＨ−媒介性活性化，およびこのＩ型ウイルスＦ蛋白質の膜融合可能コンフォメーションへの変換により媒介される（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９８２）。これは内在化の約１６分後に起こり，ｐＨ閾値は株によって様々であり，５．０−５．６の範囲である。標的膜は中期または後期エンドソームの限定膜である。融合のメカニズムはよく研究されている（Ｋｉｅｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｅｙ ２００６）。さらに，融合それ自体は，脂質二重膜以外および機能的酸性化システム以外には宿主細胞成分を必要としないことが観察された（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．１９８１；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９８２）。浸透段階は，リソソーム指向性弱塩基，カルボン酸イオノフォア，およびプロトンポンプ阻害剤等の薬剤により阻害される（Ｍａｔｌｉｎ １９８２；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００６）。
【００３６】
侵入するｖＲＮＰの核内輸送を可能とするためには，カプシドが解体される必要がある。この段階は，アマンタジン感受性のＭ２チャネルによるウイルス内部の酸性化を含み，ｖＲＮＰからのＭｌの解離を引き起こす（Ｂｕｋｒｉｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．１９８２；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ １９９１；Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９２）。個々のｖＲＮＰの核膜孔複合体への輸送および核内への移行は，細胞性核輸送レセプターに依存する（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９５；Ｃｒｏｓ ｅｔ ａｌ．２００５）。ウイルスＲＮＡ（正鎖および負鎖の合成）の複製および転写は，核内のクロマチンと密に会合した複合体中で生ずる。これらの段階の多くはウイルスポリメラーゼにより触媒されるが，細胞性因子，例えばＲＮＡポリメラーゼ活性化因子，シャペロンＨＳＰ９０，ｈＣＬＥ，およびヒトスプライシング因子ＵＡＰ５６が関与していることが明らかである。ウイルス遺伝子発現は，細胞性キナーゼに依存する制御系である，転写レベルにおける複雑な細胞制御を受けている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ２００６）。
【００３７】
インフルエンザ粒子の最終的なアセンブリは，細胞膜における発芽プロセスの間に行われる。上皮細胞においては，発芽は頂端膜ドメインにおいてのみ生ずる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌａｎ １９８３）。まず，子孫ｖＲＮＰが核質の中の核エンベロープに，次に核から細胞質に輸送され，最後に細胞周辺に蓄積する。核からの退出はウイルス蛋白質ＮＥＰおよびＭ１，および種々の細胞蛋白質，例えばＣＲＭ１（核外輸送レセプター），カスパーゼ，およびおそらくはある種の核蛋白質シャペロンに依存する。リン酸化は，Ｍ１およびＮＥＰ合成を制御することにより，およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ系を介して，核外輸送において役割を果たす（Ｂｕｉ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｌｕｄｗｉｇ ２００６）。
【００３８】
ウイルスの３つの膜蛋白質は，ＥＲ中で合成され，フォールディングされ，アセンブリされてオリゴマーとなる（Ｄｏｍｓ ｅｔ ａｌ．１９９３）。これらはゴルジ複合体を通過し，その炭水化物成分の修飾および蛋白質分解酵素による切断により成熟する。これらは細胞膜に到達した後，発芽プロセスにおいてＭ１およびｖＲＮＰと会合し，その結果，８つすべてのｖＲＮＰを取り込み，脂質を除くほとんどの宿主細胞成分を排出する。
【００３９】
インフルエンザ感染は，いくつかのシグナリングカスケード，例えば，ＭＡＰＫ経路（ＥＲＫ，ＪＮＫ，ｐ３８およびＢＭＫ−１／ＥＲＫ５），ＩｋＢ／ＮＦ−ｋＢシグナリングモジュール，Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫカスケード，およびプログラムされた細胞死の活性化を伴う（Ｌｕｄｗｉｇ ２００６）。その結果，感染の進行を制限する種々の影響，例えば，ＩＦＮｂの転写的活性化，アポトーシス性細胞死，および後期エンドソームからのウイルスの脱出の妨害が生ずる（Ｌｕｄｗｉｇ ２００６）。
【００４０】
ウイルスと細胞との相互作用の最も先の研究は，組織培養または卵に適合したウイルス株を用いる組織培養において行われた。これらの例におけるウイルスは，レセプター結合および指向性に影響を与える変化が誘導されるよう適合された（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ２００６）。野生型の病原性の株の感染はウイルスと宿主蛋白質との相互作用のより自然の状況を提供する。ヒト気道においては，インフルエンザＡおよびＢは主として上部呼吸管のＮｅｕＳＡｃａ−（２，６）−Ｇａｌを有する非繊毛上皮細胞に感染し，一方，トリ種は気道のより深くでａ−（２，３）−結合シアル酸を有する繊毛上皮細胞に感染することが知られている（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００４ａ）。
【００４１】
ＩＩＩ．マクロピノサイトーシスによるウイルスの細胞内への侵入
本発明の１つの観点は，マクロピノサイトーシスによるウイルス侵入経路に関与する蛋白質を標的とする抗ウイルス療法である。好ましくは，標的蛋白質は宿主細胞蛋白質である。好ましい標的は，キナーゼおよびキナーゼ経路の蛋白質である。好ましい標的としては，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；ＧＰＲＫ２Ｌ；Ｃｄｃ４２；および／またはＲａｃ１が挙げられる。好ましくは，マクロピノサイトーシス経路をポックスウイルス感染の治療の標的とする。好ましいポックスウイルスは，天然痘の原因ウイルスである天然痘ウイルスである。
【００４２】
単一の作用メカニズムに限定されることを意図するものではないが，ポックスウイルス，例えば，ワクシニアウイルスは，宿主細胞に侵入するためにマクロピノサイトーシスおよびアポトーシス擬態を利用することが見いだされた（図６）。マクロピノサイトーシスは，大量の液体が封入され内在化されるプロセスである。この経路には，細胞膜再編成，エンドサイトーシスベシクルの形成，および膜の波打ち部位における葉状仮足の閉鎖が関与し，マクロピノソームが形成される（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ（１９９６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８３４８−３５４；Ｓｉｅｃｚｋａｒｓｋｉ ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１５３５−１５４５）。Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １０：８３９−８４８），ＡＲＦ６（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３４：９３５−９４７），および１型ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）（Ｈｏｏｓｈｍａｎｄ−Ｒａｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ２３４：４３４−４４１）が，マクロピノサイトーシスに関与している。さらに，２つのＲａｂ，ＧＴＰａｓｅであるＲａｂ５およびＲａｂ３４／Ｒａｈは，マクロピノソームの形成における関与が示唆されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２：１０３３７−１０３４０；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４０６３−４０７１）。Ｒａｂ３４／Ｒａｈはアクチンとともに膜の波打ちおよび新生マクロピノソームに局在することができ，その過剰発現はマクロピノサイトーシスを促進しうる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４０６３−４０７１）。Ｒａｂ５はＲａｂ３４／Ｒａｈとともにマクロピノソームに局在することができる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：４０６３−４０７１）。
【００４３】
本発明者らは，原型ポックスウイルスであるワクシニアウイルスがその宿主細胞に侵入する際に用いるメカニズムを分析した。ウイルスは組織培養細胞の糸状偽足に結合し，これに沿って細胞体に向かって移動し，アクチンおよびアクチン付随蛋白質を含む大きな，過渡的な膜ブレブの突出を誘導することが認められた。ブレブが引っ込むにつれて，ウイルスは細胞内小胞中に内在化された。ブレブ形成を阻害する阻害剤，例えばブレビスタチン，ＥＩＰＡ，またはＰＡＫ１のドミナント・ネガティブコンストラクトは，感染もブロックした。阻害プロファイルから，ＭＶは，アポトーシス後の細胞残存物の排除に関与するエンドサイトーシスプロセスであるマクロピノサイトーシスを誘導することが明らかになった。マクロピノサイトーシスによるアポトーシス体の内在化の決定因子はホスファチジルセリン（ＰＳ）の暴露であることから，ならびにＭＶの膜はこのリン脂質が非常に豊富であることから，異なる脂質組成を有するウイルスを調製した。ＰＳの存在はブレブ形成マクロピノサイトーシス，および感染能において役割を果たす。この結果は，ワクシニアウイルスは，ウイルス誘導性マクロピノサイトーシスおよびアポトーシス擬態を用いることを示す。
【００４４】
別の態様においては，アデノウイルス，好ましくは流行性結膜炎，ぜんそく状態の増悪，罹患率および死亡率に関連するＢ種ヒトアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）の治療のために，マクロピノサイトーシス経路を標的とする。好ましくは，アデノウイルスに対する治療薬は，アクチン，蛋白質キナーゼＣ，ナトリウム−プロトン交換体，Ｒａｃ１，ＰＡＫ１，およびＣ末端アデノウイルスＥ１Ａ結合蛋白質−１（ＣｔＢＰ１）を標的とする。
【００４５】
単一の作用のメカニズムに限定されることを意図するものではないが，Ａｄ３は上皮および造血細胞に侵入するためにダイナミン非依存性マクロピノサイトーシスを利用することが認められた。感染性のＡｄ３マクロピノサイトーシスは，アクチン，蛋白質キナーゼＣ，ナトリウム−プロトン交換体，およびＲａｃ１を標的とする阻害剤に対して感受性であるが，Ｃｄｃ４２に対してはそうではない。これは，ｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１），および先天的な免疫応答を含む膜通過および転写抑制に関与する二機能性蛋白質であるＣ末端アデノウイルスＥ１Ａ結合蛋白質−１（ＣｔＢＰ１）のウイルス活性化を必要とする。ＣｔＢＰ１はＰＡＫ１によりリン酸化され，細胞膜およびマクロピノソームにリクルートされ，同時に転写抑制解除が生ずる。これらを合わせて，Ａｄ３は，抗原提示用に設計された，転写的抗ウイルス宿主遺伝子活性化によりウイルス宿主範囲を広げる，先天的なエンドサイトーシスの免疫経路を妨害する。
【００４６】
ＩＶ．ウイルス感染において役割を果たす宿主細胞蛋白質を同定するための方法および装置
ウイルスによる細胞侵入および増殖感染には，段階的なプログラムが関与しており，ここでは，わずかの事象がウイルス蛋白質および酵素により媒介され，残りの事象は細胞性機能に依存する。関与する細胞性蛋白質の完全な目録を得るためには，システムバイオロジーのアプローチを利用する態様が非常に有用である。組織培養細胞におけるインフルエンザ感染に関与する必須遺伝子の系統的同定を含む態様は，発見の有益な手段を提供する。ｓｉＲＮＡのゲノムワイドなライブラリおよびハイスループット装置プラットフォームを含むシステムバイオロジーのアプローチは，ウイルス感染に関与する宿主細胞蛋白質を大量の候補物質蛋白質から迅速かつ効率的に同定することができる。
【００４７】
１つの態様においては，自動化ハイスループットｓｉＲＮＡスクリーニング技術をゲノムデータベース情報と組み合わせて用いて，宿主細胞蛋白質の系統的同定を行う。ここでは，ゲノムデータベースは，そのゲノム配列が知られている任意の種，例えば，ヒト，マウス，またはトリ種に由来するものであることができる。ある態様においては，高度なロボティクスおよびスクリーニング技術，例えば，ｔｈｅ ＲＮＡｉ Ｉｍａｇｅ−ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（ＲＩＳＣ）をもつスクリーニングプラットフォームを用いることができる。ｓｉＲＮＡスクリーニングは，任意の適当な宿主細胞または細胞株，例えば，マウスまたはヒト宿主細胞，例えば，気道上皮細胞，またはＨｅＬａ ＭＺ細胞，ＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞，またはＡ５４９細胞等の宿主細胞株を用いて行うことができる。他の適当な細胞株としては，１６ＨＢＥと称される気管支細胞株，ＴＨＥと称される気管細胞株，ならびに空気−液体界面（いわゆるＡＬＩ培養）でよく分化した培養多列粘液線毛上皮を形成する市販のヒト気道上皮細胞培養物（ＨＢＥｐＣ，Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙから購入）が挙げられる。そのような細胞はインフルエンザ感染のモデルとして用いることができることが知られている（Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００４）。ある態様においては，関連するかまたは必要なウイルス侵入レセプター（例えば，ＨＩＶ−１についてはＣＤ４およびＣＸＣＲ４）を発現するようトランスフォームされている安定な宿主細胞株を作製することができる。宿主細胞は，機能的効力について予め確認されているｓｉＲＮＡのゲノムライブラリを用いてスクリーニングすることができる。ある態様においては，ｓｉＲＮＡのゲノムライブラリは，商業的供給元，例えばＱｉａｇｅｎから入手することができる。
【００４８】
１つの態様においてはＨｅＬａ細胞を宿主細胞として用いる。ＨｅＬａ細胞は，ｓｉＲＮＡトランスフェクションによる有効なサイレンシングが可能である。インフルエンザウイルスの試験を含む態様は，単一のインフルエンザウイルスが細胞膜の被覆されたまたは被覆されていないくぼみの両方に結合することを示す。１０分後，ウイルスは被覆されたおよび被覆されていない小さいベシクル中に存在し，３０分後にはエンドソームと一致する見かけのより大きいベシクル中で多くが検出される。すなわち，ウイルス侵入の形態学は，内在化がゆっくりであることを除き，ＭＤＣＫ細胞において観察されたものと似ている。さらに，インフルエンザウイルスがエンドソーム構造に入って出る軌跡を，初期エンドソームを緑に標識するＲａｂ５−ＧＦＰおよび後期エンドソームを赤に標識するＲａｂ７−ＲＦＰを発現するＨｅｌａ細胞を用いて追跡した。さらに，ＨｅＬａ細胞を用いて，感染，転写，およびウイルス蛋白質合成の初期段階を研究し，または後期段階のいくつか，例えばｖＲＮＰの核外輸送の障害についてスクリーニングすることができる。
【００４９】
別の態様においてはＡ５４９細胞を宿主細胞として用いる。Ａ５４９細胞は，呼吸器ウイルス，例えばインフルエンザウイルス感染の研究を含む態様において特に有用である。Ａ５４９細胞は気管支起源の上皮細胞株であり，インフルエンザ感染研究において広く用いられている（Ｅｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．２００６）。Ａ５４９細胞は，インフルエンザ疾患の間にインサイチューで感染した宿主細胞に非常に類似した系を提供する。さらに，Ａ５４９細胞は，子孫ウイルスの放出および二次感染を含む全複製サイクルを分析する可能性を提供する。インフルエンザ研究およびアッセイにおいてしばしば用いられるＭＤＣＫ細胞とは異なり，Ａ５４９細胞はヒト起源であり，ｓｉＲＮＡにより容易にトランスフェクションすることができる（Ｇｒａｅｓｅｒ ２００４）。さらに別の態様においては，次の２つのインフルエンザウイルスを試験して，培養Ａ５４９細胞におけるウイルスの伝播および二次感染を自動化ハイスループットフォーマットで分析する：１）トリＨ７Ｎ７ウイルス，ほとんどの細胞株においてそのＨＡはセクレターゼ切断により活性化される（Ｗｕｒｚｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）；および２）ヒトインフルエンザ株，例えばＸ３１／Ａｉｃｈｉ／６８，および９６，３８４，７６８，１１５２，１４４０，１５３６，３０７２ウエルプレート，または他のマルチウエルプレートのフォーマットと適合するトリプシン重層方式。
【００５０】
さらに，本発明の態様は自動化スクリーニングプラットフォームを用いて実施しうることが企図される。ここでは，スクリーニングプラットフォームは，液体を操作するロボット，例えばＴｅｃａｎおよび２つの自動化顕微鏡，例えばＣｅｌｌ Ｗｏｒｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を含むことができる。自動化スクリーニングプラットフォームを用いてハイスループット実験手順を実施しうることが理解される。さらに，コンピュータおよび実験的努力を平行に組み合わせて，ｓｉＲＮＡアッセイを最適に適用し，完全に自動化されたデータトラッキング，画像分析，定量，および統計学的分析のためのソフトウエアを設定することができる。
【００５１】
大規模の態様においては，宿主細胞株の全ゲノムをカバーするｓｉＲＮＡを用いてスクリーニングを行う。別の態様においては，宿主細胞株のゲノムのサブセット（例えば，少なくとも６００，１００，２０００，３０００，４０００，５０００，６０００，７０００，８０００，９０００，１００００，１５０００，２００００，２５０００，または３００００の遺伝子）をカバーするｓｉＲＮＡを用いてスクリーニングを行う。例えば，１つの可能な態様においては，ヒトゲノムの少なくとも７，０００の遺伝子をカバーするｓｉＲＮＡを用いてスクリーニングを行う。ＲＩＳＣプラットフォームにより，調べるべき各ウイルス株について２つの異なる細胞株を用いて７，０００遺伝子のスクリーニングを２−４週間以内に完了することが可能である。次に，ユーザ仕様のＭａｔＬａｂプラグインを用いて，データセットを詳しく分析して管理する。ＭａｔＬａｂプラグインは，生成された画像中でデータを自動的に定量することができ，低品質の画像を自動的に廃棄し，データ分析の構造安定性および再現性を判定する品質管理アルゴリズムを含むことができる。分析が完了すれば，結果からウイルス侵入に関与する宿主蛋白質を同定することができる。ウイルスインフェクトームライブラリは，元々はｃＤＮＡマイクロアレイの分析用に作成されたがＲＮＡｉデータセットとともに用いるように大幅に改変されたバイオインフォマティクスのツール上に構築する。大きなデータセットの強固な統計学は，ほとんどの重みが非常に顕著な表現型に与えられることを確実にする。特定の表現型は，試験する各遺伝子について少なくとも３つのｓｉＲＮＡを用い，ある遺伝子に対する３つのｓｉＲＮＡのうち２つが同様の効果を示すことを必要とすることにより重み付けされる。
【００５２】
ある態様では，画像に基づくアッセイを利用することができる。これはプレートリーダーより感度が高く，したがってウイルス感染の背後にある細胞生物学に関する追加の情報が得られる。これらの態様においては，平静対照では平均で１０−２０％の細胞しか感染しないため，高い感度が望ましい。低い「ベースライン」は，より効率的なｓｉＲＮＡサイレンシングと関連しており，感染における増加と減少との間を区別することができる。この判定は，感染経路に関する最適な情報を提供する。
【００５３】
大きなフォーマットのｓｉＲＮＡスクリーニング（例えば宿主細胞ゲノムのサブセットまたは全体をカバーする大きな遺伝子セット）を含むある態様においては，自動化液体操作ロボット，例えば，９６，３８４，７６８，１１５２，１４４０，１５３６，３０７２ウエルプレート，または他のマルチウエルプレートを操作しうるＴｅｃａｎを用いる。生成したデータ（ウエルあたり９個の画像；スクリーンあたり１，４３０，７８４個の画像，約３．８ＴＢに対応）をＮＡＳサーバに自動的に動かすアルゴリズムを用いる。さらに別の態様においては，高いバッファー容量，例えば１，２，３，４，５，６，７，８，９，または１０ＴＢは，一次的なネットワーク障害により分析プロセスが遅れないことを保証する。さらに別の態様においては，これらの大きな画像のセットの中から分析されていない画像を連続的に探すアルゴリズムは，自動的に画像を分析待ち行列に配置する。これらの態様のいくつかにおいては，ＭａｔＬａｂ画像分析プラグインを用いる。さらに，スクリーニングからの「生の」データについてバイオインフォマティクス評価を行って擬陽性を排除することにより，複雑なプロセスに関与する細胞システムを再構築することができる。このことにより，各侵入経路および他の感染関連プロセスに特異的な分子機構の鍵となる標的宿主細胞蛋白質の定義が可能となる。ある態様においては，用いられる基準には，強いＲＮＡｉ表現型および広い細胞タイプ依存性が含まれる。
【００５４】
上述の方法は，ｓｉＲＮＡについて実施されてきた。しかし，他の適当な分子種，例えば，有機または無機化合物，抗体等の蛋白質，またはアンチセンスＲＮＡ等の核酸種も用いることができる。
【００５５】
本発明の核酸療法は，天然の核酸であっても，修飾された核酸であっても，核酸の類似体であってもよい。核酸類似体としては，例えば，ペプチド核酸（ＰＮＡ），ロック核酸（ＬＮＡ），トレオース核酸（ＴＮＡ），拡大塩基ＤＮＡ（ｘＤＮＡまたはｙＤＮＡ）が挙げられる。同様に，ホスホロチオエートまたはホスホネート骨格修飾核酸も包含される。
【００５６】
Ｖ．キナーゼ
ある態様においては，ウイルス感染を調節するとして同定される宿主細胞蛋白質はキナーゼである。さらに別の態様においては，宿主細胞蛋白質は，ＰＡＫ１，Ｃｄｃ４２，Ｒａｃ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌである。数百種のヒトキナーゼが知られており，これらはいくつかの異なるファミリーに分類され，種々の疾患状態において役割を果たすことが知られている（Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２）。
【００５７】
キナーゼの阻害剤としては，例えば，ドミナント・ネガティブ分子，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，抗体および小分子が挙げられる。ドミナント・ネガティブ分子には，例えば，分子内または分子間の蛋白質−蛋白質相互作用のインターフェースをブロックすることにより，インビトロまたはインビボで蛋白質の機能を妨害する分子が含まれる。ドミナント・ネガティブ分子としては，例えば，蛋白質標的のフラグメント（変異体フラグメントを含む）および標的蛋白質の非機能的変異体が挙げられる。抗体としては，例えば，完全イムノグロブリン，一本鎖抗体およびイムノグロブリンの特定の結合部位が挙げられる。小分子としては，例えば，約５０００Ｄａまで，約２０００Ｄａまで，または約１０００Ｄａまでの質量を有する有機または無機の非ポリマー性分子が挙げられる。
【００５８】
Ａ．ＰＡＫ１
ＰＡＫ１機能の分子メカニズムについては多くの見識が存在する（概説として，Ｐａｒｒｉｎｉ，ＭＣ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３３：６４６−６４８）。ＰＡＫ１は自己阻害ホモダイマーとして存在することができる（Ｌｅｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ １０２，３８７−３９７）。１つのＰＡＫ１分子のＮ末端制御ドメインは別のＰＡＫ１分子のＣ末端の触媒ドメインに結合してこれを阻害することができる。ＰＡＫ１はＧＴＰ結合形のＣｄｃ４２およびＲａｃ１に結合することにより活性化されることができる。これらの分子への結合は，制御ドメインのフォールディングを変化させることができ，これはＰＡＫ１ホモダイマーの解離につながる（Ｌｅｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲；Ｐａｒｒｉｎｉ，ＭＣ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．９，７３−８３．）。ＰＡＫ１はまた，ＧＴＰａｓｅであるＲａｃ２，Ｒａｃ３，ＴＣ１０，ＣＨＰ，およびＷｒｃｈ−１に結合し，活性化されることができる（概説として，Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｍａｎｓｅｒ（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８６，２０１−２１４）。これらのＧＴＰａｓｅによる結合および活性化は，Ｎ末端制御ドメインないしＰＢＤ（ｐ２１結合ドメイン）中の残基が媒介することができる。Ｃｄｃ４２およびＲａｃはＣｄｃ４２およびＰＡＫ１のＲａｃ相互作用結合ドメイン（ＣＲＩＢ）（アミノ酸７５−９０）（Ｂｕｒｂｅｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．８，２９０７１−２９０７４）にわずかに結合することができ，キナーゼ阻害ドメイン（ＫＩ）を挟む配列は結合親和性に寄与しうる（Ｋｎａｕｓ ａｎｄ Ｂｏｋｏｃｈ（１９９８）Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３０，８５７−８６２；Ｓｅｌｌｓ，ＭＡ ａｎｄ Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ｊ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７，１６２−１６７；Ｌｅｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲）。ＣＲＩＢドメインのＮ末端の短いリジンリッチセグメント（ＰＡＫ１アミノ酸６６−６８）は，Ｒａｃ ＧＴＰａｓｅの結合を媒介することができる（Ｋｎａｕｓ，ＵＧ ａｎｄ ＢｏｋｏｃｈＧＭ（１９９８）上掲）。
【００５９】
ＫＩドメインは，約９０ｎＭのＫｉで触媒ドメインを阻害することができる（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２１５３−２１６３）。ＰＡＫ１のＫＩドメインの残基Ｌｅｕ−１０７，ならびにＫＩドメインの他のアミノ酸が，この阻害の接点として寄与しうる（Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲）。ＰＡＫ１のＫＩ領域は，活性部位の２つの構造成分（ヘリックスＣおよび活性化ループ）を安定化することができる。ＫＩセグメントのリジンは，触媒に役割を果たす２つのアスパラギン酸残基とともに塩架橋を形成することにより，活性部位をブロックすることができる。このＫＩポリペプチドは，ＰＡＫ活性化をブロックすることができる（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）上掲）。ＰＡＫ１のＰＢＤを含むペプチドのＣｄｃ４２への結合における結合定数は１０−５０ｎＭの範囲であることが報告されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：７８８５−７８９１）。
【００６０】
ＰＡＫ１のＮ末端制御ドメインも，ＰＡＫ相互作用交換因子（ＰＩＸ）に結合することができる２つの保存されたＰＸＸＰ ＳＨ３（Ｓｒｃホモロジー３）結合モチーフおよび保存ＳＨ３結合部位を含む（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １：１８３−１９２）。１番目の保存ＳＨ３結合部位は，アダプター蛋白質であるＮｃｋに結合することができ（Ｂｏｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２５７４６−２５７４９），２番目の部位はＧｒｂ２に結合することができる（Ｐｕｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９３８８−９３９３）。
【００６１】
ＧＴＰａｓｅの結合は，ＫＩドメインの触媒ドメインとの相互作用を破壊するコンフォメーションの変化を引き起こすことができ，キナーゼ活性に寄与しうる自己リン酸化を可能とすることが示唆されている（Ｌｅｉ，Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲）。自己リン酸化は，ＰＡＫ１を活性状態へとスイッチすることができる。ＰＡＫ１の触媒ドメインの活性化ループ中のＴｈｒ−４２３の自己リン酸化は，自己阻害からの解除および外因性基質に対する触媒機能を維持することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：１２１−１３１；Ｇａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８０２２−８０２８；Ｚｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３２５６５−３２５７３）。ＰＡＫ１はＰＤＫ１（３−ホスホイノシチド依存性キナーゼ１）により修飾されることができる（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４１２０１−４１２０９）。Ｓｅｒ−１４４（ＫＩドメイン中の保存残基）におけるαＰＡＫの自己リン酸化はキナーゼ活性化に寄与することができるが（Ｃｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７３４７−１７３５３），一方，ＰＡＫ１の自己リン酸化部位Ｓｅｒ−１９８／２０３はＰＩＸ−ＰＡＫ相互作用を下方制御することができる。
【００６２】
ＰＡＫ１は，ＲａｃおよびＣｄｃ４２ ＧＴＰａｓｅとは独立して活性化されることができる。限定されたプロテアーゼ媒介性切断は，ＰＡＫキナーゼの自己リン酸化および活性を刺激することができる（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１１２１−２１１２８；Ｒｏｉｇ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．６２，１６７−１９８）。ＳＨ３含有ＮｃｋおよびＧｒｂ２アダプター蛋白質を介するＰＡＫ１の膜リクルートメントは，キナーゼ活性を刺激することができる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７８５−９４；Ｄａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．２７４：６０４７−６０５０）。この活性化は，重要なＴｈｒ−４２３残基におけるＰＤＫ１によるリン酸化（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４１２０１−４１２０９）またはスフィンゴシン等の脂質との相互作用を含むことができ，これはＧＴＰａｓｅ非依存性様式でキナーゼを活性化することができる（Ｂｏｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８１３７−８１４４）。ＰＩＸを介してＰＡＫと間接的に関連しうるＧＩＴ１（Ｇ−蛋白質共役レセプターキナーゼ−相互作用標的１）もまた，Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅを必要としないメカニズムによりＰＡＫを活性化することができる（Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３８４９−３８５９）。
【００６３】
ＰＡＫ１はまた，焦点接着関連蛋白質ＰＩＸ（Ｃｏｏｌとも称される）と複合体を形成することができる。２つの異なる遺伝子（αＰＩＸおよびβＰＩＸ）に由来する複数のＰＩＸ蛋白質は，そのＳＨ３ドメインを介してＰＡＫに結合することができる（Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１：１８３−１９２；Ｂａｇｒｏｄｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２３９３−２２４００）。αＰＩＸを欠失した細胞の分析から，走化性白血球のＣｄｃ４２媒介性方向センシングにおけるＰＩＸ−ＰＡＫ複合体の役割が示唆されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ １１４：２１５−２２７）。ＰＩＸのＧＩＴ１（ＰＫＬ／ＣＡＴ１としても知られる（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：８５１−８６３；Ｂａｇｒｏｄｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）上掲）との会合は，パキシリンに結合することにより焦点接着を標的とすることができる（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）上掲）。ＧＩＴ１の過剰発現により，焦点接着の分解およびパキシリンの喪失が生じうる（Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３８４９−３８５９）。すなわち，ＧＩＴ１およびＰＩＸは両方とも運動性細胞および細胞−細胞接合の前縁の焦点接着に局在してＰＡＫを活性化することができる（Ｚｅｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ Ｊ．２２：４１５５−４１６５；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：６３５４−６３６３；Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１１５：１４９７−１５１０）。
【００６４】
２つの関連するヒト蛋白質ホスファターゼは，ＰＡＫ１を例えばＴｈｒ−４２３で脱リン酸化することができる（Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：３１７−３２１）。これらのホスファターゼは，ＰＯＰＸ１（ＰＩＸ１のパートナー）およびＰＯＰＸ２であり，これらは様々な形のＰＩＸに結合して，ＰＡＫを含む多量体複合体を形成するすることができる。活性なＰＡＫ１の細胞における効果は，これらのホスファターゼのいずれかの過剰発現により拮抗されうる（Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）上掲）。
【００６５】
他の蛋白質キナーゼはＰＡＫ機能を下方制御するかもしれない。ＡｋｔはＰＡＫ１をＳｅｒ−２１でリン酸化することができ，この修飾は，ＮｃｋのＰＡＫ１Ｎ−末端への結合を低下させることができるが，キナーゼ活性は増加する（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）上掲；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：９１０６−９１０９）。
【００６６】
ＰＡＫ１は，マクロピノサイトーシスの制御に関与している。活性化されたＰＡＫ１変異体（Ｔ４２３Ｅ）は，ストレス線維および焦点接着複合体の崩壊，および葉状仮足の形成（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７：２０２−２１０；Ｍａｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７：１１２９−１１４３），およびアクチン骨格の再編成を誘発しうる。ＰＡＫ１が関与するキナーゼ活性および蛋白質−蛋白質相互作用は，アクチン細胞骨格に影響を及ぼしうる（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７：２０２−２１０；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：８５１−８６３）。
【００６７】
本発明の方法および組成物において用いることができるＰＡＫ１の阻害剤としては，例えば，内皮細胞移動を調節することができるＰＡＫ１の残基１−７４（ＭＳＮＮＧＬＤＩＱＤＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭＩＧＡＧＳＫＤＡＧＴＬＮＨＧＳＫＰＬＰＰＮＰＥＥＫＫＫＫＤＲＦＹＲＳＩＬＰＧＤＫＴＮＫＫＫＥＫＥＲＰＥ；（配列番号１）を含むドミナント・ネガティブＰＡＫ１（Ｋｉｏｓｓｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７：８３１−８４３）；ＰＡＫ１の最初のプロリンリッチドメインの１３アミノ酸（ＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ；（配列番号２））；ＨＩＶ ｔａｔ蛋白質のポリ塩基性配列に融合させたこれらの残基（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＫＰＰＡＰＰＭＲＮＴＳＴＭ；（配列番号３））（Ｋｉｏｓｓｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：６９７−７０２）；ＰＡＫ１自己阻害ドメインを含み，マクロピノサイトーシスをブロックすることができるＰＡＫ１のアミノ酸８３−１４９のフラグメント，ＨＴＩＨＶＧＦＤＡＶＴＧＥＦＴＧＭＰＥＱＷＡＲＬＬＱＴＳＮＩＴＫＳＥＱＫＫＮＰＱＡＶＬＤＶＬＥＦＹＮＳＫＫＴＳＮＳＱＫＹＭＳＦＴＤＫＳ（配列番号４）（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ１１：３３４１−３３５２；Ｂａｒｒａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．米国特許７，３６４，８８７）；ＰＡＫ１との結合に影響をおよぼしうる一酸化窒素シンターゼ（ＤＬＣ１／ＰＩＮ）のダイニン軽鎖−１／蛋白質阻害剤のペプチド（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．米国特許７，０６７，６３３）；ドミナント・ネガティブＰＡＫ１（ＰＡＫ１（Ｋ２９９Ｒ））（Ｎａｏｒ，米国特許公開２００５００９０４７４）が挙げられる。
【００６８】
本発明の方法および組成物において用いることができるＰａｋ１の間接的阻害剤としては，例えば，ＰＡＫ１キナーゼ活性を低下させることができるヒストン脱アセチル化阻害剤ＦＫ２２８（Ｈｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：９５６−９６０）；それぞれＳｒｃファミリーキナーゼおよびＥＴＫを阻害することによりＰＡＫ１の活性化を低下させることができるチロシン−キナーゼ阻害剤ＰＰ１およびＡＧ８７９（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：９６−１０１；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．米国特許公開２００３０１５３００９）；およびＰＡＫ１活性を低下させるＰＰ１とＡＧ８７９，ＧＬ−２００３の水溶性誘導体との組み合わせ（Ｈｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２４５：２４２−２５１）が挙げられる。
【００６９】
本発明の方法および組成物において用いることができるＰＡＫ１の別の阻害剤には，インビトロおよびインビボでのＰＡＫ１の直接阻害剤であるＣＥＰ−１３４７（Ｎｈｅｕ，ＴＶ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．８，３２８−３３６）が含まれる。
【００７０】
本発明の方法および組成物において用いることができるＰＡＫ１のさらに別の阻害剤には，ＶａｎＥｙｋら（米国特許６，２４８，５４９）に開示されるものが含まれる。
【００７１】
本発明の方法および組成物において用いることができるさらに別の阻害剤としては，ＰＡＫ１に対するｓｉＲＮＡが挙げられる：ｓｉＰＡＫ１−０ＡＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡ（配列番号６），ｓｉＰＡＫ１−１ＧＡＣＡＵＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＡ（配列番号７），ｓｉＰＡＫ１−２ＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡ（配列番号８），ｈＰＡＫ１−６ＵＡＣＣＡＧＣＡＣＵＡＵＧＡＵＵＧＧＡ（配列番号９），ｓｉＰＡＫ１−７ＵＣＵＧＵＡＵＡＣＡＣＡＣＧＧＵＣＵＧ（配列番号１０）（Ｎａｓｏｆｆ ｅｔ ａｌ．２００７米国特許公開ＵＳ２００７０１２８２０４（２００６年１２月１日出願），およびＱｉａｇｅｎから入手可能な３つのｓｉＲＮＡオリゴ（ＰＡＫ１＿ｐ１，ＰＡＫ１＿ｐ２，およびＰＡＫ１＿ｐ３）（表１）。これらのｓｉＲＮＡは，ＯｉａｇｅｎによりＲＴ−ＰＣＲを用いて評価され，約７０％以上の標的遺伝子ｍＲＮＡのノックダウンを与えることが示されている。これらのｓｉＲＮＡは対称の２ｂｐの３’オーバーハングをもつ２１ｂｐデュープレックスである。
【００７２】
【表１】

【００７３】
Ｂ．ＤＹＲＫ３
哺乳動物ＤＹＲＫ３（ＲＥＤＫ，ｈＹＡＫ３）は，Ｓｅｒ／Ｔｈｒ部位を標的としうるＭＡＰＫ関連蛋白質キナーゼである。ＤＹＲＫ３は，コンセンサスキナーゼサブドメインＶＩＩとＶＩＩＩとの間の保存ＹＸＹモチーフ（ないしループ）におけるチロシン（自己）リン酸化により活性化されることができる。ＤＹＲＫ３は赤血球リニアージの造血細胞で選択的に高レベルで発現されることができる（Ｇｅｉｇｅｒ，ＪＮ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｌｏｏｄ ９７：９０１−９１０；Ｌｏｒｄ，ＫＡ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：２８３８−２８４６）。初代ネズミおよびヒト造血系前駆細胞においてＤＹＲＫ３をアンチセンスオリゴヌクレオチドで阻害すると，コロニー形成単位−赤血球（赤芽球の最後から２番目の前駆細胞）の産生に影響を及ぼしうる。ＤＹＲＫ３活性は，その予想（自己）リン酸化ループ中のＴｙｒ³³³の存在に依存することができ，ループの酸性化は活性化でありうる（Ｌｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４９，４７０５２−４７０６０）。ＤＹＲＫ３はキナーゼドメインならびにユニークなＣ末端ドメイン依存性が関与するメカニズムにより作用して，ＰＫＡに依存する経路によりＣＲＥＢおよびＣＲＥ応答経路を制御することができる（Ｌｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００２）上掲）。ＦＤＣ造血系前駆細胞におけるＤＹＲＫ３の発現はアポトーシスを制御しうる（Ｌｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００２）上掲）。
【００７４】
本発明の方法および組成物において用いることができるＤＹＲＫ３の阻害剤としては，ＤＹＲＫ３／ｈＹＡＫ３のキノリン阻害剤（米国特許７，０８７，７５８），ＹＡＫ３／ＤＹＲＫ３の阻害剤であるＧＳＫ６２６６１６ＡＣ，（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００４４３１７０），３−カルボキシキノリン誘導体ＤＹＫＲ３／ＹＡＫ３（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．米国特許公開２００６０１０６０５８），およびＱｉａｇｅｎから入手しうる３つのｓｉＲＮＡオリゴ（ＤＹＲＫ３＿ｐ１，ＤＹＲＫ３＿ｐ２，およびＤＹＲＫ３＿ｐ３）（表２）が挙げられる。これらのｓｉＲＮＡは，ＯｉａｇｅｎによりＲＴ−ＰＣＲを用いて評価され，約７０％以上の標的遺伝子ｍＲＮＡのノックダウンを与えることが示されている。これらのｓｉＲＮＡは対称の２ｂｐの３’オーバーハングをもつ２１ｂｐデュープレックスである。
【００７５】
【表２】

【００７６】
Ｃ．ＰＴＫ９（ＴＷＦ１）
ツインフィリン１は，短いリンカー領域により連結される２つのＡＤＦ／コフィリン様（ＡＤＦ−Ｈ）ドメインおよびそれに続く２０残基のＣ末端テールから構成される。２つのＡＤＦ−Ｈドメインは互いに約２０％のホモロジーを有する（Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ９：１９５１−１９５９．）。
【００７７】
ヒトツインフィリンは，元々はチロシンキナーゼとして同定されたが（Ｂｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：９８２−９８８），研究により，これはキナーゼ活性を持たず（Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１７７２−１７８３；Ｒｏｈｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３：５１８−５２５），ツインフィリンは既知の蛋白質キナーゼに対して配列ホモロジーを持たないことが示された。むしろ，ツインフィリンは，アクチンモノマーに結合することができる（Ｇｏｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１４２：７２３−７３３；Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）上掲；Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５５：７８７−７９６）。ツインフィリンの機能に関する情報は，部分的には，酵母およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのホモログの研究から得られた。ツインフィリンはアクチンモノマーと１：１の複合体を形成するようである。ツインフィリンはアクチンモノマーを有効に隔離することができる（Ｇｏｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）上掲；Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）上掲；Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，（２００１）上掲）。ツインフィリンは，ＡＤＰ−アクチンモノマーと相互作用して，そのヌクレオチド交換およびフィラメントのアセンブリを阻害することができる（Ｐａｌｍｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５５：２５１−２６０）。ツインフィリンは新たに脱重合したアセンブリ不能ＡＤＰ−アクチンモノマーと相互作用するかもしれない。
【００７８】
ツインフィリンは点状の細胞質染色パターンを有し，培養哺乳動物細胞においてアクチンモノマーおよびフィラメントを含む細胞性プロセスに局在することができる（Ｖａｒｔｉａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）上掲）。ツインフィリンとキャッピング蛋白質との間の直接相互作用は，ツインフィリンの急速なアクチンフィラメントアセンブリの部位への局在化を媒介することができる（Ｐａｌｍｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）上掲）。
【００７９】
本発明の方法および組成物において用いることができるＴＷＦ１／ＰＴＫ９の阻害剤としては，ｓｈＲＮＡ，例えば，ＳｉｇｍａＴＲＣ（Ｔｈｅ ＲＮＡｉ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）＃：ＴＲＣＮ ０００００１１０１３；クローンＩＤ：ＮＭ＿００２８２２．３−９０７ｓ１ｃ１；受託番号：ＮＭ＿１９８９７４．１，ＮＭ＿００２８２２．３；ＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３０）；Ｓｉｇｍａ ＴＲＣ＃ＴＲＣＮ ００００００６３６４；クローンＩＤ：ＮＭ＿００２８２２．３−２０１４ｓ１ｃ１；受託番号：ＮＭ＿１９８９７４．１，ＮＭ＿００２８２２．３；ＣＣＧＧＣＣＧＡＧＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＣＴＧＡＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号３１）；Ｓｉｇｍａ ＴＲＣ＃ＴＲＣＮ ００００００６３６５；クローンＩＤ：ＮＭ＿００２８２２．３−３６４ｓ１ｃ１；受託番号：ＮＭ＿１９８９７４．１，ＮＭ＿００２８２２．３；ＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号３２）；Ｓｉｇｍａ ＴＲＣ＃ＴＲＣＮ ００００００６３６６；クローンＩＤ：ＮＭ＿００２８２２．３−４７４ｓ１ｃ１；受託番号：ＮＭ＿１９８９７４．１，ＮＭ＿００２８２２．３；ＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＧＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号３３）；Ｓｉｇｍａ ＴＲＣ＃：ＴＲＣＮ ００００００６３６７；クローンＩＤ：ＮＭ＿００２８２２．３−９６２ｓ１ｃ１；受託番号：ＮＭ＿１９８９７４．１，ＮＭ＿００２８２２．３；ＣＣＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＴＧＴＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＣＴＡＧＣＡＧＡＣＧＴＴＴＴＴ（配列番号３４）が挙げられる。
【００８０】
また，本発明の方法および組成物において用いることができるＰＴＫ９／ＴＷＦ１の阻害剤には，ＰＴＫ９既設計キメラＲＮＡｉ（Ｃａｔ．＃Ｈ００００５７５６−Ｒ０４，Ａｂｎｏｖａ）およびＰＴＫ９評価済みＳｔｅａｌｔｈ（商標）Ｄｕｏ Ｐａｋ（Ｃａｔ．＃１２９３８０６８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００８１】
Ｄ．ＧＰＲＫ２Ｌ（ＧＲＫ４）
Ｇ−蛋白質共役レセプター（ＧＰＣＲ）キナーゼ（ＧＲＫ）は，３つのファミリーに体系づけられるセリン／トレオニンキナーゼである（Ｐｅｎｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １５：９７３−９８１）。１つのファミリーはＧＲＫ４ファミリーであり，これはＧＲＫ４，ＧＲＫ５，およびＧＲＫ６から構成される。ＧＲＫ４サブファミリーの特徴としては，以下のものが挙げられる：ａ）Ｃ末端システイン残基のパルミトイル化（ＧＲＫ４／６について）または負に荷電した膜リン脂質とＣ末端近くの正に荷電したドメインとの相互作用（ＧＲＫ５について）による膜局在化，ｂ）ホスファチジルイノシトールビスホスフェート結合（Ｎ末端ドメインへの）による活性化，およびｃ）カルシウムセンサー蛋白質，例えばカルモジュリンによる阻害（Ｐｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８２７３−１８２８０；Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３−６９２；Ｋｏｈｏｕｔ ａｎｄ Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，（２００３）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：９−１８；Ｗｉｌｌｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２４：６２６−６３３）。
【００８２】
ＧＲＫ４には４つのＲＮＡスプライシング変種が同定されている：α，β，γおよびδ（Ｐｒｅｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６４０３−６４１０）。ＧＲＫ４αは全長型である。ＧＲＫ４βは，エクソン２によりコードされる配列を欠失しており，このためＮ末端近くのホスファチジルイノシトールビスホスフェート結合ドメインを含む３２アミノ酸が欠失している。ＧＲＫ４γはエクソン１５によりコードされる配列を欠失しており，このため，Ｃ末端近くの４６アミノ酸が欠失している。最も短い型のＧＲＫ４δは，選択的にスプライシングされたエクソンの両方によりコードされる配列を欠失している。
【００８３】
ＧＲＫはＧＣＰＲ脱感作において役割を果たしている。ＧＰＣＲはアゴニストによる活性化によって脱感作を生じうる；このプロセスにより，連続的アゴニスト刺激下でのレセプター応答が減少しうる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：１０９５−１１１０；Ｇａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：１０７−１４４）。ＧＲＫ媒介性リン酸化は，レセプター／Ｇ蛋白質相互作用を低下させ，アレスチン結合を開始させることができる。アレスチンとの会合はさらにＧ蛋白質カップリングを減少させ，レセプターのエンドサイトーシスを増強することができる。内在化されたＧＰＣＲは，さらに別のシグナリング経路に関与することができ，細胞膜へのリサイクル用に選別され，または分解の標的となる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７４：１０９５−１１１０；Ｐｅｎｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １５：９７３−９８１；Ｇａｉｎｅｔｄｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：１０７−１４４）。
【００８４】
ＧＲＫ４はまた，ＧＰＣＲのアゴニスト非依存性リン酸化を刺激することができる。例えば，ＧＲＫ４をＤ１レセプターと共発現させると，アゴニストを加えてもわずかにしか増加しなかったレセプターがリン酸化される（Ｒａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：７５９−７６９）。アゴニスト結合の非存在下におけるＧＲＫ４αによるＤ１レセプターのリン酸化により，アゴニスト誘導性ｃＡＭＰ蓄積の減少，基底レセプター内在化の増加，および全レセプターの数の減少が生じうる。
【００８５】
本発明の方法および組成物において用いることができるＧＲＫ４の阻害剤としては，例えば，アンチセンス−オリゴヌクレオチド（Ａｓ−Ｏｄｎ），２０９ ５’−ＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡＴ−３’ １８９（配列番号１９）（Ｓａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ４７：１１３１−１１３９），カルモジュリン（Ｉａｃｏｖｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３：１−８），ヘパリン（ＧＲＫ４αの阻害剤；Ｓａｌｌｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０１８８−１０１９８），およびＱｉａｇｅｎから入手しうる３つのｓｉＲＮＡオリゴ（ＧＰＲＫ２Ｌ＿ｐ１，ＧＰＲＫ２Ｌ＿ｐ２，およびＧＰＲＫ２Ｌ＿ｐ３）（表３）が挙げられる。これらのｓｉＲＮＡは，ＯｉａｇｅｎによりＲＴ−ＰＣＲを用いて評価され，約７０％以上の標的遺伝子ｍＲＮＡのノックダウンを与えることが示されている。これらのｓｉＲＮＡは対称の２ｂｐの３’オーバーハングをもつ２１ｂｐデュープレックスである。
【００８６】
【表３】

【００８７】
Ｅ．Ｒａｃ１
Ｒａｃ１は小さいシグナリングＧ蛋白質であり，ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのメンバーである。Ｒａｃ１はＰＡＫ１の標的である。本発明の方法および組成物において用いることができるＲａｃ１の阻害剤としては，例えば，Ｒａｃ１阻害剤Ｗ５６（ＭＶＤＧＫＰＶＮＬＧＬＷＤＴＡＧ；（配列番号４４）；Ｃａｔ．Ｎｏ．２２２１；Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），Ｒａｃ１阻害剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５３５０２；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），Ｒａｃ１阻害剤ＮＳＣ２３７６６，Ｎ６−［２−［［４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル］アミノ］−６−メチル−４−ピリミジニル］−２−メチル−４，６−キノリンジアミン三塩酸塩（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１６１；Ｔｏｃｒｉｓ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。
【００８８】
Ｆ．Ｃｄｃ４２
Ｃｄｃ４２はＲｈｏ−サブファミリーの小さいＧＴＰａｓｅであり，細胞形態，移動，エンドサイトーシスおよび細胞サイクル進行を管理するシグナリング経路を制御することができる。本発明の方法および組成物において用いることができるＣｄｃ４２の阻害剤としては，例えば，セクラミンＢ（Ｐｅｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７１：１７２０−１７２６）；セクラミンＡ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ４：４１４９−４１５７）；およびＡＣＫ４２（Ｎｕｒ−Ｅ−Ｋａｍａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７７８７−７７９３）が挙げられる。
【００８９】
ＶＩ．トランスジェニック細胞および非ヒト哺乳動物
トランスジェニック動物モデル，例えば組換えおよびノックアウト動物は，本明細書に記載される宿主核酸から生成することができる。トランスジェニック非ヒト哺乳動物の例としては，限定されないが，マウス，ラット，トリ，ウシおよびブタが挙げられる。ある例においては，トランスジェニック非ヒト哺乳動物はキナーゼに関連する標的配列の１またはそれ以上がノックアウトされており，ウイルス感受性，例えばインフルエンザまたはポックスウイルスによる感染の感受性が低下している。そのようなノックアウト動物は，ウイルス感染の段階の研究に，および動物からヒトへのウイルスの伝染の低下に有用である。さらに，本明細書に記載されるものと同じ標的を利用する動物ウイルスを動物において分析することができる。
【００９０】
所望の遺伝子をノックアウトまたは機能的に欠失させるために用いられる配列の発現は，適切なプロモーター配列を選択することにより制御することができる。例えば，構成的プロモーターは機能的に欠失した遺伝子が動物により決して発現されないことを確実にするために用いることができる。これに対し，誘導可能なプロモーターは，トランスジェニック動物が目的とする遺伝子を発現するかまたは発現しない時を制御するために用いることができる。誘導可能なプロモーターの例には，組織特異的プロモーターおよび特定の刺激（例えば，光，酸素，化学物質濃度）に応答性または非応答性のプロモーターが含まれ，例えば，テトラサイクリン／ドキシサイクリン制御プロモーター（ＴＥＴ−ｏｆｆ，ＴＥＴ−ｏｎ），エクダイソン誘導性プロモーター，およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が挙げられる。
【００９１】
１つの態様においては，ヒトキナーゼ遺伝子を持つかまたは内因性キナーゼ遺伝子が破壊されているトランスジェニックマウスを，インフルエンザまたはポックスウイルス等の種々の哺乳動物ウイルスに暴露した後に試験することができる。比較データは，そのウイルスおよび関連するウイルスのライフサイクルについての知見を提供することができる。さらに，さもなくば感染（例えばインフルエンザ）に対して感受性であるノックアウト動物（例えばブタ）を作製して，遺伝子の破壊によって付与される感染に対する耐性を判定することができる。
【００９２】
別の態様においては，ヒトキナーゼ遺伝子を持つかまたは内因性キナーゼ遺伝子が破壊されているトランスジェニックブタを作製し，これを動物モデルとして用いて，インフルエンザまたはポックスウイルス感染等のウイルス感染に対する感受性を判定することができる。トランスジェニック動物，ならびにトランスジェニック動物を製造し使用する方法は，種々の特許および公開特許，例えば，ＷＯ０１／４３５４０；ＷＯ０２／１９８１１；米国特許公開２００１−００４４９３７および２００２−００６６１１７；および米国特許５，８５９，３０８；６，２８１，４０８；および６，３７６，７４３（これらは参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００９３】
ＶＩＩ．キナーゼ阻害剤の合理的設計
本発明の１つの観点は，蛋白質キナーゼ，例えば宿主細胞のウイルス感染に関与する蛋白質キナーゼを調節する薬剤に関する。ある態様においては，薬剤は，抗体，無機化合物，有機化合物，蛋白質／ペプチド薬剤または小分子，例えばｓｉＲＮＡであることができる。好ましくは，薬剤は，ＰＡＫ１，Ｃｄｃ４２，Ｒａｃ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌを阻害することができる。ある態様においては，そのような薬剤は，インビトロでおよびインビボで抗ウイルス効果を発揮する。
【００９４】
本発明のさらに別の観点は，宿主キナーゼを阻害する組成物を得るおよび／または作製する方法に関し，この方法は，阻害剤を設計し；その薬剤が宿主キナーゼを阻害するか否かを試験し；これを用いて宿主キナーゼを阻害する組成物を作製することを含む。ある態様においては，本発明は，キナーゼ調節剤であり，２以上の宿主キナーゼを阻害することができる薬剤を設計し，試験する方法に関する。
【００９５】
本発明の合理的設計方法は，ＰＡＫ１，Ｃｄｃ４２，Ｒａｃ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌの構造についての現在の理解の助けを受けている。好ましくはキナーゼのＸ線構造を用いて，試験阻害剤のキナーゼへの結合を調べる。典型的には，候補物質の酵素への結合の「強さ」と，その薬剤のインビトロでの細胞活性との間には直接の相関がある。
【００９６】
薬剤が無機または有機化合物である態様においては，前記化合物は，完全にコンピュータによる方法を用いて設計し試験することができ，または，そのような設計および試験の一部をコンピュータによって行い，残りをウエットラボ技術を用いて行うことができる。
【００９７】
宿主細胞のウイルス感染に関与する蛋白質キナーゼを阻害するリード化合物は，種々の方法を用いて同定することができる。１つの態様においては，コンピュータを使用した“インシリコ”方法論により，標的宿主細胞キナーゼを阻害するようリード化合物を設計する。ケモゲノミクスのツール，例えばＫｉｎａｓｅ Ｔｏｏｌ ｋｉｔ（商標）を用いて，バイオインフォマティクス，医薬化学およびコンピュータによる知識源の組み合わせを用いて，ＡＴＰ部位特異的キナーゼ阻害剤を設計することができる。モデリングおよびディスプレイ手法を用いて，Ｘ線結晶構造の重ね合わせとサブポケット類似性分析により，この情報を増強することができる。既知のキナーゼ阻害剤の大部分はＡＴＰ拮抗性であり，触媒ドメイン中の結合部位を標的とする。しかし，有用な阻害剤はまた，結合部位中の結合したＡＴＰによって占められていない領域を占めるものであってもよい。利用可能な結晶構造について蛋白質データバンクを調査すると，結合した阻害剤のまわりのＡＴＰ部位の活性化されたまたは部分的に活性化されたコンフォメーションが，広くすべてのキナーゼについて同じであることが認められた（Ｂｉｒａｕｌｔ ２００６）。さらに，一致した限定された数の一次残基が小分子の結合に関与していることが明らかである。系統発生学的に異なるキナーゼ，例えば，ｐ３８αおよびＦＧＦ−１は，ＡＴＰ結合部位において三次元構造上の共通性を示す。この構造的類似性は，特定の個々のキナーゼ，ならびにより大きな分類の後続的に関連するキナーゼを阻害する新規なキナーゼ阻害剤を同定するのに有用な基盤を提供する。
【００９８】
別の態様においては，リード化合物は，コンピュータのフィルタを用いて，既知の化合物のデータベースからリード化合物を同定することにより発見される。これらのデータベースのいくつかは，数百万種類の化合物を含みうる。フィルタは，適当なＡＤＭＥＴ（吸収，分布，代謝，排泄，毒性）特性を組み込むよう設計される。これらの医薬化学的取り扱い用のフィルタは，所望の化学的特性のリストに基づく。ＡＤＭＥＴモデリングを化合物の最適化の間に用いて，所望の特性を持つと思われる化合物を含む許容可能な特性空間を定義する。ある態様においては，２以上のコンピュータフィルタを適用して既知の化合物を分析する。適用しうるフィルタとしては，限定されないが，ｔｈｅ Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｆｉｌｔｅｒ（５のルール），ｔｈｅ Ｖｅｂｅｒ（２のルール）ｆｉｌｔｅｒ，Ｃｈｅｍ ＧＰＳ，ＭＤＤＲ ｆｉｌｔｅｒ，Ｓｈｏｉｃｈｅｔ’ｓ Ａｇｇｒｅｇａｔｏｒｓ，Ｍａｒｔｉｎｆｉｌｔｅｒ，Ｇｈｏｓｅｆｉｌｔｅｒ，Ｅｇａｎｆｉｌｔｅｒ，Ｍｅｄ Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｉｂｉｌｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒ，Ｌｅａｄｌｉｋｅｎｅｓｓ，Ｃａｃｏ−２ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒおよびｔｈｅ Ｍｕｅｇｇｅ ｆｉｌｔｅｒが挙げられる。これらのフィルタを，所望の特性，例えば，水溶性，分子量，ＳｌｏｇＰ，およびＨ結合ドナーまたはアクセプターの数を有する任意の化合物をスクリーニングするよう設定することができる。
【００９９】
別の態様においては，特定のファミリーのキナーゼを阻害することが知られているかまたは予測される薬剤，例えば無機または有機化合物のライブラリを，ウイルス感染を調節する宿主細胞蛋白質を同定するために用いたものと同じ系を用いて，ウイルス感染を阻害する能力について試験する。ある態様においては，スクリーニングは，ｓｉＲＮＡのライブラリを化合物のライブラリで置き換えて，同様にして行う。それぞれのウイルスについて化学物質のスクリーニングの結果をｓｉＲＮＡスクリーニングの結果と比較して，ランク付けした化合物のリストを作成する。さらに別の態様においては，化合物スクリーニングにおいてウイルス感染を阻害する能力を示した上位のヒット化合物，例えば上位５，１０，１５，２０または２５種の化合物についてインビトロ酵素アッセイを行う。ここでは，上位の化合物が宿主細胞標的キナーゼ，またはキナーゼシグナリング経路の上流または下流のキナーゼを阻害する能力についてプロファイリングする。さらに別の態様においては，ウイルス感染の阻害において，および／または宿主細胞キナーゼ標的化の特異性において最も高い有効性を示すトップ化合物を，ウイルス感染の動物モデルを用いて毒性およびインビボ効力について試験する。
【０１００】
ある態様においては，特定のキナーゼ，例えば，ＰＡＫ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌ，またはキナーゼシグナリング経路においてＰＡＫ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌの上流または下流にあるキナーゼまたは他の物質を標的とする薬剤が同定され，または開発される。
【０１０１】
試験は，設計された薬剤を宿主細胞キナーゼに対する阻害活性について評価することを含む。ある態様においては，設計された薬剤の集合をコンピュータによる方法により評価して，物理的に薬剤を合成することなく，宿主細胞キナーゼを阻害するその活性を推定する。そのようなコンピュータによる方法は，薬剤の他の特性，例えば，溶解性，膜浸透性，代謝および毒性を推定するためにも用いることができる。
【０１０２】
ある態様においては，試験は，設計した薬剤を合成し，ウエットラボ手法の１またはそれ以上の生物学的アッセイにおいて，宿主細胞キナーゼを阻害するか，および／またはウイルス感染を阻害するその活性について評価することを含む。
【０１０３】
次に，合成された薬剤の活性を，宿主細胞キナーゼの阻害，および／またはウイルス感染の阻害を直接的にまたは間接的に反映する生物学的アッセイにより評価することができる。代表的な生物学的アッセイとしては，限定されないが，１）キナーゼ阻害の無細胞実験；２）ウイルス阻害の無細胞実験３）ウイルス感染の阻害の全細胞実験（例えば，ウイルスの伝染，侵入，複製，生合成，アセンブリ，または退出）；および４）ウイルス感染に対する効力のインビボ動物モデル，例えば，特定のウイルスに感染したマウス，トリ，霊長類またはブタモデルが挙げられる。
【０１０４】
インビトロでアッセイに関しては，候補薬剤が宿主細胞キナーゼを阻害する能力は，薬剤を宿主細胞キナーゼの活性測定用のアッセイ混合物と接触させ，薬剤の存在下および非存在下における酵素の活性を測定することにより評価することができる。宿主細胞キナーゼの活性が薬剤の存在下で非存在下におけるより低いことは宿主細胞キナーゼ阻害剤であることを示す。
【０１０５】
無細胞宿主細胞キナーゼアッセイの一例は，Ｃｌｅｒｋ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２６：９３−９６（１９９８）（本明細書に参照として取り込まれる）に記載されるものである。別の例示的システムは，キナーゼプロファイリング技術であるＡＭＢＩＴプラットフォーム（Ｋｉｎｏｍｅｓｃａｎ）である。プラットフォームを用いて，分子相互作用を同定し，連結されていない小分子の複数のキナーゼのＡＴＰ部位への結合の定量的測定特異性を決定することができる。例えば，プラットフォームを用いて阻害剤を分析し，薬剤が他の「オフターゲット」キナーゼと比較していかに強くその目的とするキナーゼ標的に結合するかを明らかにする。この「オフターゲット」結合を用いて，阻害剤の副作用を同定することができ，またはある種の阻害剤を他のウイルスについて評価することを正当化することができる。
【０１０６】
ウイルス感染に対する応答を反映するために用いられる動物モデルを用いて，インビボでの宿主細胞キナーゼ阻害活性を評価することができる。動物モデルの例としては，限定されないが，マウス，ラット，フェレット，テンジクネズミ，ブタ（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ），ウマ，霊長類，およびウマが挙げられる。
【０１０７】
ある態様においては，薬剤の活性ないし効力は，全細胞および／またはＩＣ５０またはＥＤ５０値のインビボアッセイにより測定して，複数の宿主キナーゼに対して同様であり，これは下記に詳細に説明する。ある態様においては，複数の宿主細胞キナーゼに対する単一の薬剤の効力の相違は，約１０００倍以下である。さらに別の態様においては，効力の相違は約１００倍以下である。さらに別の特定の態様においては，効力の相違は約１０倍以下である。
【０１０８】
ＶＩＩＩ．治療方法
本発明の１つの態様は，キナーゼを阻害してウイルス感染を阻害するかまたは低減させる薬剤を含む医薬組成物およびキットを用いる方法に関する。本発明の別の態様は，被検動物を治療するための方法，医薬組成物およびキットを提供する。本明細書において用いる場合，"被検動物"との用語は，ヒトならびに他の哺乳動物を含む。本明細書において用いる場合，"治療する"との用語は治療上の有益性および／または予防上の有益性を達成することを含む。治療上の有益性とは，原因となるウイルス感染の根絶または軽減を意味する。また，治療上の有益性は，被検動物がなお原因となるウイルスに罹患しているにもかかわらず被検動物において改善が観察されるように，原因となるウイルス感染に伴う生理学的症状の１またはそれ以上を根絶または軽減することによっても達成される。
【０１０９】
予防上の有益性が望ましい態様においては，本発明の医薬組成物を，ウイルス感染，例えば，インフルエンザ，またはＨＩＶ感染を発病するリスクを有する患者，またはまだ病気の診断がされていなくてもウイルス感染の生理学的症状の１またはそれ以上を訴える患者に投与することができる。投与によりウイルス感染が発症することを予防することができ，または，発症するウイルス感染を低下させ，減少させ，短期にし，および／またはさもなくば軽減することができる。医薬組成物は，標的キナーゼ活性を調節することができる。ここでは，調節するとの用語は，標的キナーゼの阻害，あるいは標的キナーゼの活性化を含む。
【０１１０】
蛋白質キナーゼの活性を低下させることはまた，キナーゼを"阻害する"とも表される。"阻害する"との用語，およびその文法的活用形，例えば"阻害的"とは，完全な阻害は必要ではないが，キナーゼ活性の低下を表す。ある態様においては，そのような低下は，阻害効果がない場合，例えば阻害剤の非存在下における酵素の活性の少なくとも５０％，少なくとも７５％，少なくとも９０％，および少なくとも９５％であることができる。逆に，"阻害しない"との語句およびその文法的活用形は，薬剤の存在下で酵素活性の２０％未満，１０％未満，および５％未満の低下がある状況を表す。さらに，"実質的に阻害しない"との語句およびその文法的活用形は，薬剤の存在下で酵素活性の３０％未満，２０％未満，およびある態様においては１０％未満の低下がある状況を表す。
【０１１１】
蛋白質キナーゼの活性を増加させることは，キナーゼを"活性化する"とも称される。"活性化される"との用語，およびその文法的活用形，例えば，"活性化する"とは，完全に活性化される必要はないが，キナーゼ活性の増加を表す。ある態様においては，そのような増加は，活性化効果がない場合に，例えば，アクチベータの非存在下で，酵素の活性の少なくとも５０％，少なくとも７５％，少なくとも９０％，および９５％であることができる。逆に，"活性化しない"との語句およびその文法的活用形は，薬剤の存在下において酵素活性の２０％未満，１０％未満，および５％未満の増加がある状況を表す。さらに，"実質的に活性化しない"との語句およびその文法的活用形は，薬剤の存在下において酵素活性の３０％未満，２０％未満，およびある態様においては１０％未満の増加がある状況を表す。
【０１１２】
酵素活性を低下させる能力は，薬剤または薬剤の組み合わせの酵素に向けたまたはこれに対する効力または活性の尺度である。効力は，無細胞，全細胞および／またはインビボアッセイにより，ＩＣ５０，Ｋ_iおよび／またはＥＤ５０値として測定することができる。ＩＣ５０値は，所定の条件下で酵素活性を半分（５０％）阻害するのに必要な薬剤の濃度を表す。Ｋ_i価は阻害剤の酵素への結合の平衡アフィニティー定数を表す。ＥＤ５０値は，生物学的アッセイにおいて最大の半分の応答を引き起こすのに必要な薬剤の用量を表す。当業者はこれらの尺度の詳細を理解することができ，生化学，酵素学等の標準的な教科書に見いだすことができる。
【０１１３】
本発明はまた，ウイルス感染を治療するために用いることができるキットを含む。これらのキットは，キナーゼを阻害する薬剤または薬剤の組み合わせを含み，ある態様においては，本明細書に記載される種々の方法およびアプローチにしたがってキットを使用する方法を教示する指示を含む。そのようなキットはまた，薬剤の活性および／または利点を示す情報，例えば，科学参考文献，パッケージ挿入材料，臨床的結果，および／またはこれらの概要を含んでいてもよい。そのような情報は，種々の実験，例えば，インビボモデルを含む実験動物を用いた実験およびヒトの臨床試験に基づく実験の結果に基づくものでありうる。本明細書に記載されるキットは，健康管理者，例えば，医師，看護師，薬剤師，処方薬剤職員等に提供し，販売し，および／または販売促進することができる。
【０１１４】
Ａ．ｓｉＲＮＡ療法
二本鎖オリゴヌクレオチドは，一方の鎖のオリゴヌクレオチド配列が第２の鎖のオリゴヌクレオチド配列に相補的である２つの別々のオリゴヌクレオチド配列のアセンブリによって形成される。そのような二本鎖オリゴヌクレオチドは一般に，２つの別々のオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）から，またはそれ自体でフォールディングして二本鎖構造を形成する単一の分子（例えば，ｓｈＲＮＡないし短ヘアピンＲＮＡ）から組み立てられる。当該技術分野において知られるこれらの二本鎖オリゴヌクレオチドはすべて，デュープレックスの各鎖は異なるヌクレオチド配列を有し，一方のヌクレオチド配列領域（ガイド配列またはアンチセンス配列）のみが標的核酸配列に相補的であり，他方の鎖（センス配列）は標的核酸配列に相同のヌクレオチド配列を含むという，共通の特徴を有する。
【０１１５】
二本鎖ＲＮＡにより誘導される遺伝子サイレンシングは，少なくとも３つの異なるレベルで生じうる：（ｉ）転写不活性化，すなわちＲＮＡによりガイドされるＤＮＡまたはヒストンメチル化；（ｉｉ）ｓｉＲＮＡにより誘導されるｍＲＮＡ分解；および（ｉｉｉ）ｍＲＮＡにより誘導される転写減衰。ＲＮＡ哺乳動物細胞における誘導性サイレンシング（ＲＮＡ干渉ないしＲＮＡｉ）の主要なメカニズムはｍＲＮＡ分解であると一般に考えられている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は，遺伝子発現を翻訳の段階で阻害するか，または特定の遺伝子の転写を立体的に妨害するメカニズムである。特定のＲＮＡｉ経路蛋白質は，ｄｓＲＮＡにより誘導されて標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に向かい，ここで標的を"切断"する，すなわち，これをもはや蛋白質に翻訳されない小さい部分に分解する。ＲＮＡｉを哺乳動物細胞において用いる最初の試みは，ｄｓＲＮＡの長鎖の使用に焦点が当てられていた。しかし，ＲＮＡｉを誘導しようとするこれらの試みはほとんど成功しなかった。これは，部分的には，インターフェロン応答が誘導され，標的特異的ではなく一般的な蛋白質合成の阻害が生じたためである。すなわち，長いｄｓＲＮＡは哺乳動物系においては実行可能なＲＮＡｉの選択肢ではない。別の結果は，遺伝子が転写される程度に影響を及ぼす遺伝子のエピジェネティックな変化，すなわち，ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化の変化である。
【０１１６】
最近，短い（１８−３０ｂｐ）ＲＮＡデュープレックスを哺乳動物培養細胞に導入すると，インターフェロン応答を誘導することなく標的ｍＲＮＡの配列特異的阻害が実現可能であることが示された。これらの短いｄｓＲＮＡのある種のものは，小阻害ＲＮＡ（"ｓｉＲＮＡ"）と称され，モル濃度以下で触媒的に作用して，細胞中で標的ｍＲＮＡの９５％以上を切断することができる。ｓｉＲＮＡ活性のメカニズムの説明，ならびにその用途のいくつかは，下記に記載されている：Ｐｒｏｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｃｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｂ．Ｏ．Ｊ．，２００２ Ｎｏｖ．１；２１（２１）：５８６４−５８７４；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＤＥ−４ Ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＲＤＥ−１，ＤＣＲ−１ ａｎｄ ａ ＤｅｘＨ−ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＲＮＡｉ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｊｕｎｅ ２８；１０９（７）：８６１−７１；Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｉｍｉｎｇ ｉｎ Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡ Ｇｕｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ，Ｃｅｌｌ ２００２，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ．６；１１０（５）：５６３；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ＆Ｚａｍｏｒｅ，Ａｍｉｃｒｏ ＲＮＡ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ ＲＮＡｉ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９７：２０５６。
【０１１７】
機構的な観点からは，長い二本鎖ＲＮＡを植物および無脊椎動物細胞に導入すると，Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより分解されてｓｉＲＮＡとなる（Ｓｈａｒｐ，ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−−２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５．Ｄｉｃｅｒ，ａ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ＩＩＩ−ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ，ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ ｉｎｔｏ １９−２３ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｔｗｏ ｂａｓｅ ３’ ｏｖｅｒｈａｎｇｓ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｃａｕｄｙ，Ｈａｍｍｏｎｄ，＆Ｈａｎｎｏｎ，Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａ ｂｉｄｅｎｔａｔｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４０９：３６３）。次にｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に取り込まれ，ここで１またはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡデュープレックスをほどき，相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドできるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ｈａｌｅｙ，＆Ｚａｍｏｒｅ，ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ，Ｃｅｌｌ ２００１，１０７：３０９）。適当な標的ｍＲＮＡに結合すると，ＲＩＳＣ中の１またはそれ以上のエンドヌクレアーゼは標的を切断して，サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，＆Ｔｕｓｃｈｌ，ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１−ａｎｄ ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１，１５：１８８，ＦＩＧ．１．）。
【０１１８】
一般に，アンチセンス配列は活性なＲＩＳＣ複合体中に保持され，配列特異的ＲＮＡ干渉を媒介するためにアンチセンス配列と標的配列との相補的塩基対形成によりＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列へとガイドする。当該技術分野においては，細胞培養系によってはある種の未修飾ｓｉＲＮＡが"オフターゲット"効果を示す場合があることが知られている。このオフターゲット効果にはＲＩＳＣ複合体中のｓｉＲＮＡのアンチセンス配列ではなくセンス配列が関与しているとの仮説がある（例えば，Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照）。この場合，センス配列はＲＩＳＣ複合体を意図した標的配列とは異なる配列（オフターゲット配列）に向かわせ，その結果，オフターゲット配列が阻害されると考えられている。これらの二本鎖核酸分子においては，各鎖は異なる標的核酸配列に相補的である。しかし，これらのｄｓＲＮＡにより影響を受けるオフターゲットは完全に予測可能なわけではなく，非特異的である。
【０１１９】
"ｓｉＲＮＡ"との用語は，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小さい阻害性ＲＮＡデュープレックスを表す。これらの分子は，種々の長さであることができ（一般に１８−３０塩基対），アンチセンス鎖中の標的ｍＲＮＡに対して種々の程度の相補性を含む。すべてではないがある種のｓｉＲＮＡは，センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端に塩基対形成しないオーバーハング塩基を有する。"ｓｉＲＮＡ"との用語は，２つの別々の鎖のデュープレックス，ならびにデュープレックス領域を含むヘアピン構造を形成しうる一本鎖を含む。小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は，短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られており，生物学において種々の役割を果たす２０−２５ヌクレオチドの長さの一群の二本鎖ＲＮＡ分子である。
【０１２０】
２つのＲＮＡ鎖は完全に相補的である必要はないが，鎖はハイブリダイズしてデュープレックス構造を形成するのに十分に相補的でなければならない。ある場合には，相補的ＲＮＡ鎖は，３０ヌクレオチド未満，好ましくは２５ヌクレオチド未満の長さであり，より好ましくは１９−２４ヌクレオチドの長さ，より好ましくは２０−２３ヌクレオチドの長さ，さらにより好ましくは２２ヌクレオチドの長さである。本発明のｄｓＲＮＡはさらに，少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。本発明のｄｓＲＮＡはさらに，置換されるかまたは化学的に修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。下記に詳細に説明するように，ｄｓＲＮＡは当該技術分野において知られる標準的な方法により合成することができる。
【０１２１】
ｓｉＲＮＡは，これらが培養細胞株において誘導するサイレンシングのレベルまたは程度に基づいて，５つの群に分類することができる（非機能的，準機能的，機能的，高機能的，および超機能的）。本明細書において用いる場合，これらの定義は，ｓｉＲＮＡが１００ｎＭの濃度で前記細胞株にトランスフェクトされ，トランスフェクションのおよそ２４時間後であって，トランスフェクション後７２時間を越えない時点でサイレンシングのレベルが試験される一連の状態に基づく。この文脈において，"非機能的ｓｉＲＮＡ"とは，５０％未満（＜５０％）の標的サイレンシングを誘導するｓｉＲＮＡとして定義される。"準機能的ｓｉＲＮＡ"は５０−７９％の標的サイレンシングを誘導する。"機能的ｓｉＲＮＡ"は８０−９５％の遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。"高機能的ｓｉＲＮＡ"は，９５％より高い遺伝子サイレンシングを誘導する分子である。"超機能的ｓｉＲＮＡ"は，特定の群の分子である。この書面の目的のために，超機能的ｓｉＲＮＡは，以下の分子として定義される：（１）ナノモル以下の濃度（例えば，１ナノモル未満）でトランスフェクションしたときに特定の標的の９５％より高いサイレンシングを誘導する；および／または（２）９６時間を越えて機能的（またはより高い）レベルのサイレンシングを誘導する。これらの相対的機能性（絶対的であることを意図するものではないが）を用いて，機能ゲノミクス，標的同定および治療などの用途のために，ｓｉＲＮＡを特定の標的と比較することができる。
【０１２２】
Ａ．マイクロＲＮＡ療法
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は約２１−２３ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡ分子であり，遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは，遺伝子によりコードされ，ＤＮＡから転写されるが，蛋白質には翻訳されない（非コーディングＲＮＡ）。その代わりに，これはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からプロセシングされて，ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと称される短いステム−ループ構造となり，最後に機能的ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は，１またはそれ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であり，その主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。
【０１２３】
ＩＸ．製剤，投与の経路，および有効量
本発明のさらに別の観点は，本発明の薬剤またはその組み合わせを含む医薬組成物の製剤，投与経路および有効投与量に関する。そのような医薬組成物は，上述のように，ウイルス感染の治療に用いることができる。
【０１２４】
薬剤またはその薬学的に許容しうる塩は，単独で，または１またはそれ以上の他の薬剤との組み合わせで，または１またはそれ以上の他の形態との組み合わせで提供することができる。例えば，製剤は，各薬剤の相対的効力および意図される適応症に応じて，１またはそれ以上の薬剤を特定の比率で含んでいてもよい。例えば，２つの異なる宿主標的を標的とする組成物において，効力が類似する場合，約１：１比の薬剤を用いることができる。２つの形態は，同じ単位投与形態中で，例えば１つのクリーム，座剤，錠剤，カプセル，エアロゾルスプレイ，または飲料に溶解すべき粉体包中に一緒に製剤することができる。あるいは，それぞれの形態を，例えば２つのクリーム，２つの座剤，２つの錠剤，２つのカプセル，錠剤と錠剤を溶解するための液体，２つのエアロゾルスプレイ，または粉体包と粉体を溶解するための液体等の，別々の単位として製剤してもよい。
【０１２５】
“薬学的に許容しうる塩”との用語は，本発明において用いられる薬剤の生物学的有効性および特性を維持し，生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない塩を意味する。例えば，薬学的に許容しうる塩は，本発明の薬剤がキナーゼ，例えば，ＰＡＫ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼを阻害する有益な効果を妨害しない。
【０１２６】
典型的な塩は，無機イオン，例えば，ナトリウム，カリウム，カルシウム，マグネシウムイオン等の塩である。そのような塩には，無機または有機酸，例えば，塩酸，臭化水素酸，リン酸，硝酸，硫酸，メタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，酢酸，フマル酸，コハク酸，乳酸，マンデル酸，リンゴ酸，クエン酸，酒石酸またはマレイン酸との塩が含まれる。さらに，薬剤がカルボキシ基または他の酸性の基を持つ場合，これを無機または有機塩基との薬学的に許容しうる付加塩に変換することができる。適当な塩基の例としては，水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，アンモニア，シクロヘキシルアミン，ジシクロヘキシルアミン，エタノールアミン，ジエタノールアミン，トリエタノールアミン等が挙げられる。
【０１２７】
薬学的に許容しうるエステルまたはアミドとは，本発明において用いられる薬剤の生物学的有効性および特性を維持し，生物学的にまたは他の点で望ましくないものではないエステルまたはアミドを表す。例えば，エステルまたはアミドは，本発明の薬剤がキナーゼ，例えば，ＰＡＫ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼを阻害する有益な効果を妨害しない。典型的なエステルとしては，エチル，メチル，イソブチル，エチレングリコール等が挙げられる。典型的なアミドとしては，未置換アミド，アルキルアミド，ジアルキルアミド等が挙げられる。
【０１２８】
ある態様においては，薬剤は，１またはそれ以上の他の化合物，形態，および／または薬剤，例えば上述したものと組み合わせて投与することができる。キナーゼ阻害剤と１またはそれ以上の他の活性薬剤との組み合わせを含む医薬組成物は，ある一定のモル比を含むよう製剤することができる。例えば，約９９：１から約１：９９のモル比のキナーゼ阻害剤：他の活性薬剤を用いることができる。この態様の一部においては，キナーゼ阻害剤：他の活性薬剤のモル比の範囲は，約８０：２０−約２０：８０；約７５：２５−約２５：７５，約７０：３０−約３０：７０，約６６：３３−約３３：６６，約６０：４０−約４０：６０；約５０：５０；および約９０：１０−約１０：９０から選択される。キナーゼ阻害剤：他の活性薬剤のモル比は，約１：９であってもよく，ある態様においては約１：１であってもよい。２つの薬剤，形態および／または化合物は，同じ投与単位として，例えば，１つのクリーム，座剤，錠剤，カプセル，または飲料に溶解すべき粉体パケット中で一緒に製剤してもよく，またはそれぞれの薬剤，形態，および／または化合物を別々の単位として，例えば，２つのクリーム，座剤，錠剤，２つのカプセル，錠剤と錠剤を溶解するための液体，エアロゾルスプレイ，粉体のパックおよび粉体を溶解するための液体等で製剤してもよい。
【０１２９】
必要であるかまたは望ましい場合には，薬剤および／または薬剤の組み合わせは，さらに別の薬剤とともに投与してもよい。本発明の薬剤および／または薬剤の組み合わせとともに投与することができる薬剤の選択は，少なくとも部分的には，治療すべき状態によって異なる。本発明の製剤において有用な特定の薬剤としては，例えば，ウイルス感染に治療効果を有する任意の薬剤，例えば，炎症性状態を治療するために用いられる薬剤が挙げられる。例えば，インフルエンザの治療用には，ある態様においては，本発明の組成物はさらに，１またはそれ以上のＮＳＡＩＤ等の抗炎症剤，例えば，イブプロフェン，ナプロキセン，アセトミノフェン，ケトプロフェン，またはアスピリンを含んでいてもよい。インフルエンザの治療用の別の態様においては，本発明の製剤はさらに，１またはそれ以上の慣用の抗インフルエンザウイルス薬，例えば，アマンタジン，リマンタジン，ザナミビル，およびオセルタミビルを含んでいてもよ。ＨＩＶ等のレトロウイルス感染の治療においては，本発明の製剤はさらに，１またはそれ以上の慣用の抗ウイルス剤，例えば，プロテアーゼ阻害剤（ロピナビル／リトナビル｛Ｋａｌｅｔｒａ｝，インジナビル｛Ｃｒｉｘｉｖａｎ｝，リトナビル｛Ｎｏｒｖｉｒ｝，ネルフィナビル｛Ｖｉｒａｃｅｐｔ｝，サキナビルハードゲルカプセル｛Ｉｎｖｉｒａｓｅ｝，アタザナビル｛Ｒｅｙａｔａｚ｝，アンプレナビル｛Ａｇｅｎｅｒａｓｅ｝，フォサンプレナビル｛Ｔｅｌｚｉｒ｝，チプラナビル｛Ａｐｔｉｖｕｓ｝），リバーストランスクリプターゼ阻害剤，例えば，非ヌクレオシドおよびヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（ＡＺＴ｛ジドブジン，Ｒｅｔｒｏｖｉｒ｝，ｄｄＩ｛ジダノシン，Ｖｉｄｅｘ｝，３ＴＣ｛ラミブジン，Ｅｐｉｖｉｒ｝，ｄ４Ｔ｛スタブジン，Ｚｅｒｉｔ｝，アバカビル｛Ｚｉａｇｅｎ｝，ＦＴＣ｛エントリシタビン，Ｅｍｔｒｉｖａ｝，テノフォビル｛Ｖｉｒｅａｄ｝，エファビレンツ｛Ｓｕｓｔｉｖａ｝およびネビラピン｛Ｖｉｒａｍｕｎｅ｝），融合阻害剤Ｔ２０｛エンフビルチド，Ｆｕｚｅｏｎ｝，インテグラーゼ阻害剤（ＭＫ−０５１８およびＧＳ−９１３７），および成熟阻害剤（ＰＡ−４５７｛Ｂｅｖｉｒｉｍａｔ｝）を含んでいてもよい。別の例としては，製剤はさらに１またはそれ以上のサプリメント，例えばビタミンＣ，Ｅまたは他の抗酸化剤を含んでいてもよい。
【０１３０】
薬剤（またはその薬学的に許容しうる塩，エステルまたはアミド）は，それ自体で投与してもよく，活性薬剤が１またはそれ以上の薬学的に許容しうる担体との混合剤ないし混合物である医薬組成物の形で投与してもよい。
【０１３１】
本明細書において用いる場合，医薬組成物とは，被験者に投与すべく調製された任意の組成物でありうる。本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，例えば，賦形剤，希釈剤，および／または，例えば活性な薬剤を投与可能な調製物に加工することを容易にする助剤を含むよう，慣用の手法で製剤することができる。適当な製剤は，少なくとも部分的には，選択される投与経路によって異なるであろう。本発明において有用な薬剤，またはその薬学的に許容しうる塩，エステルまたはアミドは，投与の多くの経路ないしモードを用いて，例えば，経口，頬，局所，経直腸，経皮，経粘膜，皮下，静脈内，および筋肉内適用，ならびに吸入により，患者にデリバリーすることができる。
【０１３２】
経口投与用には，薬剤は，活性薬剤を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより容易に製剤することができる。そのような担体は，本発明の薬剤を，錠剤として，例えば，チュアブル錠，丸薬，糖衣錠，カプセル，トローチ，硬質キャンディー，液体，ゲル，シロップ，スラリー，粉体，懸濁液，エリキシル，ウエハス等として，治療すべき患者が経口で摂取できるように製剤することを可能とする。そのような製剤は，薬学的に許容しうる担体，例えば，固形希釈剤または増量剤，滅菌水性媒体および種々の無毒性有機溶媒を含むことができる。一般に，本発明の薬剤は，経口投与用形態の全組成の約０．５％，約５％，約１０％，約２０％，または約３０％から約５０％，約６０％，約７０％，約８０％または約９０重量％の範囲の濃度レベルで，所望の単位投与形態を与えるのに十分な量で含まれる。
【０１３３】
経口で使用するための水性懸濁液は，本発明の薬剤を，薬学的に許容しうる賦形剤，例えば，懸濁剤（例えば，メチルセルロース），湿潤剤（例えば，レシチン，リソレシチンおよび／または長鎖脂肪族アルコール），ならびに着色剤，保存剤，甘味料等とともに含むことができる。
【０１３４】
ある態様においては，例えば大きな親油性成分の存在のため，薬剤を溶液とするために油または非水性溶媒が必要であるかもしれない。あるいは，乳濁液，懸濁液，または他の調製物，例えば，リポソーム調製物を用いてもよい。リポソーム製剤に関しては，病気の治療用のリポソームを製造するための既知の任意の方法を用いることができる。例えば，Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８−２５２（１９６５）およびＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８（１９７８）（本明細書に参照として取り込まれる）を参照。リポソームにリガンドを結合させて，これらの組成物が特定の作用部位に向かうようにしてもよい。本発明の薬剤はまた食品，例えばクリームチーズ，バター，サラダドレッシング，またはアイスクリーム中に組み込んで，可溶化，投与，および／またはある患者集団におけるコンプライアンスを容易にすることができる。
【０１３５】
経口使用用の医薬製剤は，固体賦形剤として得ることができ，得られた混合物を任意にすりつぶし，顆粒の混合物を加工し，所望の場合には適当な助剤を加えた後，錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な賦形剤は，特に，糖等の増量剤，例えばラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール；香味要素，セルロース調製物，例えば，トウモロコシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，ジャガイモデンプン，ゼラチン，トラガガントガム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望の場合には，崩壊剤，例えば，架橋ポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその塩，例えばアルギン酸ナトリウムを加えてもよい。薬剤はまた，持続放出製剤として製剤してもよい。
【０１３６】
糖衣錠のコアは，適当なコーティングとともに提供することができる。この目的のために，濃縮糖溶液を用いることができ，これは任意にアラビアゴム，タルク，ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。活性薬剤の異なる組み合わせの識別または特徴付けのために，染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに加えてもよい。
【０１３７】
経口で使用することができる医薬製剤としては，ゼラチンから形成されるプッシュフィットカプセル，ならびにゼラチンと可塑剤，例えばグリセロールまたはソルビトールから形成される柔らかい密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは，活性成分を，ラクトース等の増量剤，スターチ等の結合剤，および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，および任意に，安定剤等との混合物として含むことができる。軟カプセルにおいては，活性薬剤は適当な液体，例えば油脂，液体パラフィン，または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁することができる。さらに，安定剤を加えてもよい。経口投与用のすべての製剤は，投与に適した用量でなければならない。
【０１３８】
注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，例えば，限定されないが，生理学的に適合性のバッファ，例えば，ハンクス溶液，リンゲル，または生理学的食塩水バッファ中で製剤することができる。そのような組成物はまた，１またはそれ以上の賦形剤，例えば，保存剤，溶解剤，増量剤，潤滑剤，安定剤，アルブミン等を含むことができる。製剤の方法は当該技術分野において知られており，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐに開示されている。
【０１３９】
上述した製剤に加えて，薬剤はまた，デポ調製物として製剤してもよい。そのような長期作用性製剤は，移植または経皮デリバリー（例えば皮下または筋肉内），筋肉内注射または経皮パッチの使用により投与することができる。すなわち，例えば，薬剤は，適当なポリマー性または疎水性材料（例えば，許容しうる油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂とともに，または溶けにくい誘導体として，例えば溶けにくい塩として製剤することができる。
【０１４０】
ある態様においては，本発明の１またはそれ以上の薬剤を含む医薬組成物は，局所的に投与したとき，または感染の特定の部位またはその近くに注射したとき，局所的および領域的効果を発揮する。例えば，粘稠液体，ゲル，ゼリー，クリーム，ローション，軟膏，座剤，泡状物，またはエアロゾルスプレイの直接局所投与を局所投与用に用いて，例えば，局所的および／または領域的効果を生じさせてもよい。そのような製剤用の薬学的に適したベヒクルとしては，例えば，低級脂肪族アルコール，ポリグリコール（例えば，グリセロールまたはポリエチレングリコール），脂肪酸のエステル，油，脂肪，シリコーン等が挙げられる。そのような製剤はまた，保存剤（例えば，ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル）および／または抗酸化剤（例えば，アスコルビン酸およびトコフェロール）を含んでいてもよい。Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，Ｂａｒｒｙ（Ｅｄ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃｌ，１９８３も参照。ある態様においては，キナーゼ阻害剤を含む局部／局所製剤を用いて，表皮または粘膜のウイルス感染を治療する。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は，化粧品用のまたは皮膚科学的に許容しうる担体を含んでいてもよ。そのような担体は，皮膚，爪，粘膜，組織および／または頭髪と適合性であり，これらの要件を満たす慣用的に用いられている任意の化粧品用のまたは皮膚科学的担体を含むことができる。そのような担体は，当業者が容易に選択することができる。皮膚用軟膏の製剤に際しては，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせを油性炭化水素基剤，無水吸収基剤，油中水吸収基剤，水中油の水除去可能基剤および／または水溶性基剤中で製剤することができる。
【０１４２】
本発明にしたがう組成物は，局所適用に適した任意の形態，例えば，水性，水性−アルコール性または油性溶液，ローションまたは血清分散物，水性，無水または油性ゲル，油脂相を水性相中に分散させることにより得られる乳濁液（Ｏ／Ｗないし水中油）またはその逆（Ｗ／Ｏないし油中水），マイクロ乳濁液，あるいはマイクロカプセル，マイクロ粒子または脂質ベシクルのイオン性および／または非イオン性分散物であることができる。これらの組成物は，一般的な方法にしたがって製造することができる。本発明の薬剤の他，本発明にしたがう組成物の種々の構成成分の量は，当該技術分野において慣用的に用いられている量である。特に，これらの組成物は，保護，治療またはケア用の，または皮膚洗浄用の顔面，手，身体および／または粘膜用のクリーム，ミルク，ローション，ゲルまたは泡状物を構成する。組成物はまた，石けんまたはクレジングバーを構成する固体調製物からなるものであってもよい。
【０１４３】
本発明の組成物はまた，化粧品および皮膚科学の分野で一般的な助剤，例えば，親水性または親油性ゲル化剤，親水性または親油性の活性薬剤，保存剤，抗酸化剤，溶媒，香料，増量剤，サンスクリーン，臭い吸収剤および染料を含んでいてもよい。これらの種々の助剤の量は，該当する分野において一般的に用いられている量であり，例えば，組成物の総重量の約０．０１％−約２０％である。これらの助剤は，その性質によって，油脂相に，水性相に，および／または脂質ベシクル中に導入することができる。
【０１４４】
ある態様においては，眼のウイルス感染は，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせを含む眼科溶液，懸濁液，軟膏または挿入物を用いて有効に治療することができる。
【０１４５】
ある態様においては，耳のウイルス感染は，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせを含む耳用溶液，懸濁液，軟膏または挿入物を用いて有効に治療することができる。
【０１４６】
ある態様においては，本発明の薬剤は，懸濁液の形ではなく，可溶化形でデリバリーし，このことにより，作用部位へのより速く定量的な吸収が可能となる。一般に，ゼリー，クリーム，ローション，座剤および軟膏等本発明の薬剤により長く暴露される領域を提供することができるが，一方，溶液中の製剤，例えば，スプレイは，より迅速な短時間の暴露を提供する。
【０１４７】
局部／局所適用に関連するある態様においては，医薬組成物は，１またはそれ以上の浸透促進剤を含むことができる。例えば，製剤は，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせが透過バリア，例えば皮膚を越える浸透を増加させるかまたはそのデリバリーを助ける適当な個体またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。これらの浸透促進化合物の多くは局所用製剤の分野で知られており，例えば，水，アルコール類（例えば，メタノール，エタノール，２−プロパノール等のテルペン），スルホキシド類（例えば，ジメチルスルホキシド，デシルメチルスルホキシド，テトラデシルメチルスルホキシド），ピロリドン類（例えば，２−ピロリドン，Ｎ−メチル−２−ピロリドン，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピロリドン），ラウロカプラム，アセトン，ジメチルアセトアミド，ジメチルホルムアミド，テトラヒドロフルフリルアルコール，Ｌ−α−アミノ酸，アニオン性，カチオン性，両イオン性または非イオン性界面活性剤（例えば，ミリスチン酸イソプロピルおよびラウリル硫酸ナトリウム），脂肪酸，脂肪族アルコール（例えばオレイン酸），アミン，アミド，クロフィブリン酸アミド，ヘキサメチレンラウラミド，蛋白質分解酵素，α−ビスアボロール，ｄ−リモネン，尿素およびＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド等が含まれる。さらに別の例としては，保湿剤（例えば尿素），グリコール（例えば，プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール），グリセロールモノラウレート，アルカン，アルカノール，ＯＲＧＥＬＡＳＥ，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖類，デンプン，セルロース誘導体，ゼラチン，および／または他のポリマーが挙げられる。ある態様においては，医薬組成物は，１またはそれ以上のそのような浸透促進剤を含むことができる。
【０１４８】
ある態様においては，局部／局所に適用するための医薬組成物は，１またはそれ以上の抗微生物性保存剤，例えば，四級アンモニウム化合物，有機水銀剤，ｐ−ヒドロキシ安息香酸，芳香族アルコール，クロロブタノール等を含むことができる。
【０１４９】
胃腸のウイルス感染は，経口または経直腸でデリバリーされる，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせを含む溶液，懸濁液，軟膏，浣腸剤および／または座剤を用いて有効に治療することができる。
【０１５０】
呼吸器ウイルス感染は，本発明の薬剤または薬剤の組み合わせを含むエアロゾル溶液，懸濁液または乾燥粉体を用いて有効に治療することができる。吸入による投与は，肺のウイルス感染，例えばインフルエンザの治療に特に有用である。エアロゾルは，呼吸器系または鼻腔経路を通して投与することができる。例えば，当業者は，本発明の組成物を適当な担体，例えば，薬学的に許容しうる噴射剤に懸濁するかまたは溶解し，経鼻スプレイまたは吸入を用いて肺に直接投与しうることを理解するであろう。例えば，キナーゼ阻害剤を含むエアロゾル製剤は，例えば鼻スプレイまたは吸入剤として投与するための噴射剤または溶媒と噴射剤との混合物に溶解し，懸濁し，または乳化することができる。エアロゾル製剤は，当該技術分野において一般に用いられているように，任意の許容可能な噴射剤，例えば化粧品用のまたは皮膚科学的にまたは薬学的に許容しうる噴射剤を加圧下に含むことができる。
【０１５１】
鼻腔投与用のエアロゾル製剤は，一般に液滴またはスプレイの形で鼻腔に投与するよう設計された水性溶液である。鼻腔溶液は一般に等張であり約５．５から約６．５のｐＨを維持するようわずかに緩衝されている点において鼻分泌物と類似しうるが，この範囲外のｐＨ値を用いることもできる。抗微生物剤または保存剤を製剤中に含めてもよい。
【０１５２】
吸入用のエアロゾル製剤および吸入抗原は本発明の薬剤または薬剤の組み合わせが鼻腔または口腔呼吸器経路で投与されたときに被験者の呼吸器樹中に運ばれるよう設計することができる。吸入溶液は，例えば，ネブライザにより投与することができる。細かく粉砕したまたは液体の薬剤を含む吸入剤または送気剤は，薬剤または薬剤の組み合わせの溶液または懸濁液が，例えば吹き出しを助けるために噴射剤に含まれる医薬エアロゾルとして呼吸器系にデリバリーすることができる。噴射剤は，液化ガス，例えば，ハロカーボン，例えば，フッ化炭素，例えばフッ化塩化炭化水素，ヒドロクロロフルオロカーボン，およびヒドロクロロカーボン，ならびに炭化水素および炭化水素エーテルであることができる。
【０１５３】
本発明において有用なハロカーボン噴射剤としては，すべての水素がフッ素で置き換えられているフッ化炭素噴射剤，すべての水素が塩素および少なくとも１つのフッ素で置き換えられている塩化フッ化炭素噴射剤，水素含有フッ化炭素噴射剤，および水素含有塩化フッ化炭素噴射剤が挙げられる。ハロカーボン噴射剤は，Ｊｏｈｎｓｏｎ，米国特許５，３７６，３５９（１９９４年１２月２７日発行）；Ｂｙｒｏｎら，米国特許５，１９０，０２９（１９９３年５月２日発行）；およびＰｕｒｅｗａｌら，米国特許５，７７６，４３４（１９９８年７月７日発行）に記載されている。本発明において有用な炭化水素噴射剤としては，例えば，プロパン，イソブタン，ｎ−ブタン，ペンタン，イソペンタンおよびネオペンタンが挙げられる。炭化水素のブレンドもまた噴射剤として用いることができる。エーテル噴射剤は，例えば，ジメチルエーテルおよびエーテルが挙げられる。本発明のエアロゾル製剤はまた，２以上の噴射剤を含んでいてもよい。例えば，エアロゾル製剤は，同じクラスからの２種以上の噴射剤，例えば，２種またはそれ以上のフッ化炭素を含んでいてもよく；または異なるクラスからの２種以上，３種以上，または４種以上の噴射剤，例えば，フッ化炭化水素および炭化水素を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物はまた，圧縮ガス，例えば，二酸化炭素，亜酸化窒素または窒素等の不活性ガスとともに調剤してもよい。
【０１５４】
エアロゾル製剤はまた，他の成分，例えば，エタノール，イソプロパノール，プロピレングリコール，ならびに界面活性剤または他の成分，例えば，油および界面活性剤を含んでいてもよい。これらの成分は，製剤を安定化させ，および／または，バルブ部材を潤滑化させるよう作用することができる。
【０１５５】
エアロゾル製剤は，加圧下で充填して，溶液，懸濁液，乳濁液，粉体および半固体調製物を用いてエアロゾルとして製剤することができる。例えば，溶液エアロゾル製剤は，本発明の薬剤，例えば，キナーゼ阻害剤の溶液を，（実質的に）純粋な噴射剤中に，または噴射剤と溶媒との混合物として含むことができる。溶媒は，薬剤を溶解するために，および／または噴射剤の蒸発を遅延させるために用いることができる。本発明において有用な溶媒としは，例えば，水，エタノールおよびグリコールが挙げられる。適当な溶媒の任意の組み合わせを用いることができ，任意にこれを保存剤，抗酸化剤，および／または他のエアロゾル成分と組み合わせてもよい。
【０１５６】
エアロゾル製剤はまた，分散液または懸濁液であってもよい。懸濁液エアロゾル製剤は，本発明の薬剤，例えばキナーゼ阻害剤の懸濁液または本発明の薬剤の組み合わせ，および分散剤を含むことができる。本発明において有用な分散剤としては，例えば，ソルビタントリオレエート，オレイルアルコール，オレイン酸，レシチンおよびコーン油が挙げられる。懸濁エアロゾル製剤はまた，潤滑剤，保存剤，抗酸化剤，および／または他のエアロゾル成分を含んでいてもよい。
【０１５７】
エアロゾル製剤は，乳濁液と同様にして製剤することができる。乳濁液エアロゾル製剤は，例えば，エタノール等のアルコール，界面活性剤，水および噴射剤，ならびに本発明の薬剤，例えばキナーゼ阻害剤または薬剤の組み合わせを含むことができる。用いることができる界面活性剤は，非イオン性，アニオン性またはカチオン性であってもよい。乳濁液エアロゾル製剤の１つの例は，例えば，エタノール，界面活性剤，水および噴射剤を含む。乳濁液エアロゾル製剤の別の例は，例えば，植物油，モノステアリン酸グリセリルおよびプロパンを含むことができる。
【０１５８】
本発明において用いるのに適した医薬組成物には，活性成分が有効量で，すなわち，少なくとも１つのウイルス感染を有する宿主において治療的および／または予防的有益性を達成するのに有効な量で存在する組成物が含まれる。特定の用途に有効な実際の量は，治療している状態，被験者の状態，製剤，および投与の経路，ならびに当業者に知られる他の因子によって異なるであろう。有効量のキナーゼ阻害剤の決定は，本明細書の開示に鑑みて十分に当業者の能力の範囲内であり，日常的な最適化手法を用いて決定される。
【０１５９】
ヒトにおいて用いるための有効量は，動物モデルから決定することができる。例えば，動物において有効であることが見いだされた循環，肝臓，局所，および／または胃腸濃度を達成するよう，ヒト用の投与量を製剤することができる。当業者は，特に本明細書に記載される動物モデル実験データに鑑みて，ヒトにおいて用いるための有効量を決定することができる。当業者は，動物データ，および他のタイプの同様のデータに基づいて，ヒトに適した本発明の組成物の有効量を決定することができる。
【０１６０】
本発明の薬剤または薬剤の組み合わせについて述べる場合，有効量とは一般に，医療または医薬品の分野における種々の規制機関ないし諮問機関（例えば，ＦＤＡ，ＡＭＡ）のいずれかにより，または製造元または供給元により推奨または認可された投与量範囲，投与のモード，処方物等を表す。
【０１６１】
さらに，キナーゼ阻害剤の適切な投与量は，インビトロの実験結果に基づいて決定することができる。例えば，ある薬剤がキナーゼ，例えばＰＡＫ１，ＤＹＲＫ３，ＰＴＫ９，およびＧＰＲＫ２Ｌを阻害するインビトロの効力は，同様の生物学的効果を達成するのに有効なインビボ投与量の開発に有用な情報を提供する。
【０１６２】
ある態様においては，本発明の薬剤の投与は間欠的であってもよく，例えば，２日に１回，３日に１回，５日に１回，１週間に１回，１か月に１または２回等の投与であってもよい。ある態様においては，量，形態，および／または種々の形態の量は，投与の異なる時点で様々であってもよい。
【０１６３】
当業者は，患者において特定の薬剤の投与の効果をモニタリングすることができる。例えば，ＨＩＶウイルスの負荷レベルは，当該技術分野において標準的な手法，例えば，ＣＤ４細胞のカウントの測定，および／またはＰＣＲによるウイルスレベルの検出により測定することができる。他の手法も当業者には明らかである。
【０１６４】
バイオテロリズム
本発明は，バイオテロリストの攻撃により引き起こされるウイルス感染の治療に用いることができる。バイオテロリストの攻撃に用いることができるウイルスとしては，例えば，天然痘を引き起こす大痘瘡ウイルス；脳炎ウイルス，例えば西部ウマ脳炎ウイルス，東部ウマ脳炎ウイルス，ベネズエラウマ脳炎ウイルス，およびアレナウイルス（Ｌａｓｓａ，Ｍａｃｈｕｐｏ），ブンヤウイルス，フィロウイルス（Ｅｂｏｌａ，Ｍａｒｂｕｒｇ），および出血熱を引き起こすフラビウイルスが挙げられる。本発明は，バイオテロリストの攻撃により引き起こされるウイルス感染の治療において用いて，対応医療を強化するために備蓄することができる。
【実施例】
【０１６５】
実施例１
ワクシニアウイルスの侵入メカニズムの評価
ワクシニアウイルスの細胞内への侵入について研究するため，まず，コア蛋白質の１つであるＡ５のＮ末端に単量体黄色蛍光蛋白質（ｍＹＦＰ−ＭＶ）のタグを付けた組換え成熟ウイルス粒子（ＭＶ）を作製した。これをＥＧＦＰタグ付きアクチンを発現するＨｅＬａ細胞に加えると，明るく蛍光を発する多くのウイルスが糸状仮足に結合し，糸状偽足に沿って細胞体に向かって移動する（「サーフィンする」）ことが見いだされた（図１Ａ）。この移動は，一般に滑らかであり，中断されず，アクチンの逆行の流れとほぼ同じ速度であった（約１μｍ／分；図１Ｂ）。ＭＶが細胞体に到達すると，劇的な変化が起こった。すなわち，細胞膜のウイルスと接触した位置から大きなブレブが突出した。この拡張は３０＋／−４秒間続き，ブレブは１０＋／−２秒間拡張したままでであり，その後ウイルスとともに引っ込められた（図１Ｃ）。ブレブ形成のピークはウイルス添加後３０分間続き，細胞の４０％が１またはそれ以上のブレブを示した（図１Ｄ）。
【０１６６】
間接免疫蛍光法は，ブレブは，アクチン−ＧＦＰに加えて，種々のアクチン付随蛋白質，例えば，Ｒａｃ１，ＲｈｏＡ，エズリンおよびコルタクチン（図１Ｅ）を含むことを示した。ミオシンＩＩ阻害剤であるブレビスタチン（Ｌｉｍｏｕｚｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）は，ブレブの形成を妨害し，ウイルス感染を６２％阻害した。このことは，ブレブ形成が増殖性侵入において役割を果たすことを示唆する（図１Ｆ）。複数のＨｅＬａおよびＢＳＣ４０ミドリザル腎臓細胞株において同様の結果が見られた。
【０１６７】
ウイルスの一部は糸状偽足を用いて細胞体に到達するのみならず，これらはシグナリングカスケードを誘発し，その結果，過渡的な膜ブレブが形成された。ブレブは，細胞運動，細胞質分裂，およびアポトーシスの間に観察されるものと似ていた（Ｃｈａｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｆｉｓｈｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０１６８】
図１は，成熟ビリオン侵入の間のサーフィンおよび膜摂動を示す。図１Ａは，糸状仮足に沿ったＭＶのサーフィンを示す。組換えＡ５−ＹＦＰ ＭＶを過渡的にトランスフェクトしたＧＦＰ−アクチンを発現するＨｅＬａ細胞に加えた。画像は，３７℃で１Ｈｚで２．５分間取得した。時点はビリオンのリアルタイム画像に対応する。矢印は個々のビリオンを示す。図１Ｂは，ＭＶのサーフィンの速度を示す。３６個の個別のビリオンの速度を，時間あたり移動した距離の相違により測定した（μｍ／分間）。図１Ｃは膜ブレブ形成の誘導を示す。組換えＡ５−ＹＦＰ ＭＶをＧＦＰ−アクチンを発現するＨｅＬａ細胞に加え，３７℃で１Ｈｚで２．５分間画像を取得した。矢印はブレブが崩壊した部位におけるアクチンパッチ形成を示す。図１Ｄは，ＭＶにより誘導される細胞のブレブ形成の経時変化を示す。ＭＶをＨｅＬａ細胞に４℃で１時間結合させた。細胞を洗浄し，示された時間３７℃にシフトした後，４％ＦＡで固定した。各時点につき５０個の細胞をブレブ形成について評点し，細胞のブレブ形成の未感染対照に対するパーセントとして示す。実験は三重に行い，結果を平均した。図１Ｅは，ブレブに局在化する細胞性因子の決定を示す。示される蛍光タグ付き蛋白質で過渡的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞にＭＶを感染させるか，または未処理のままにした。細胞を感染後３０分間固定し（ｍｐｉ），共焦点顕微鏡により分析した。細胞１個あたり１０個のＺステーク（Ｚ−ｓｔａｋｅｓ）を回収し，Ｚ投影で示した。図１Ｆはブレブ形成および感染能を示す。ＨｅＬａ細胞を種々の濃度のブレビスタチンで前処理した後，初期／後期ウイルスプロモーターからＥＧＦＰを発現する組換えＭＶ（ＥＧＦＰ−ＭＶ）に感染させた。感染した細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析により測定した。感染した細胞の対照感染に対するパーセンテージを示す。実験は三重に行い，結果を平均した。
【０１６９】
次に，関与する特定の細胞性キナーゼを同定するために，ＨｅＬａ細胞において干渉（ｓｉ）ＲＮＡを用いて５０種類のキナーゼをサイレンシングすることによりスクリーニングを行った。単一のｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後，早期／後期プロモーターからＥＧＦＰを発現する組換えＭＶ（ＥＧＦＰ−ＭＶ）を加え，１２時間後にＥＧＦＰ発現について細胞を分析した。各遺伝子につき３つの異なるｓｉＲＮＡを用い，模擬感染細胞または対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞と比較して３倍のＥＧＦＰシグナルの抑制を有意とした。５０種類のキナーゼのうち，ＰＡＫ１がＥＧＦＰ発現を阻害することが見いだされ，これは，ウイルスの結合，侵入，転写，または初期遺伝子の翻訳が抑制されたことを意味する。
【０１７０】
感染におけるＰＡＫ１の必要性を検証するために，まず，２つの追加のｓｉＲＮＡを用い，イムノブロッティングにより判定して，これらがＰＡＫ１の８２％および７６％のノックダウンを引き起こすことを見いだした（図２Ａ；上）。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）に基づく感染アッセイは，感染した細胞の数がそれぞれ７４％および６８％減少したことを示した（図２Ａ；下）。先の報告は，残基８３−１４９（ＡＩＤ，自己阻害ドメイン）を含むＰＡＫ１ドメインの過剰発現はマクロピノサイトーシスを阻害することを示している（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＨｅＬａ細胞においては，ＡＩＤの発現はｗｔＰＡＫ１を過剰発現する細胞と比較して感染を８０％阻害することが見いだされた。変異型のＡＩＤ（ＡＩＤＬ１０７Ｆ）の発現は影響を与えなかった（図２Ｂ）。
【０１７１】
ＰＡＫ１のトレオニン残基４２３のリン酸化は，マクロピノサイトーシスの活性化に役割を果たしている（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＭＶを細胞に加えると，１０分以内にリン酸化ＰＡＫ１が検出され，ＰＡＫ１は６０分間にわたって活性化されたままであった（図２Ｃ）。最大応答は，３０ｍｐｉに見られた。この結果は，ビリオン取り込みおよびウイルスコアのエンドソーム放出の経時変化と一致していた（Ｔｏｗｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これらを合わせると，この結果は，ＰＡＫ１活性がワクシニアＭＶの細胞内への増殖性侵入において役割を果たすことを示す。明らかに，ウイルスはＲａｃ１の活性化を誘発し，その結果，ＰＡＫ１およびアクチン動力学に関与する下流の他の因子が活性化される。
【０１７２】
図２は，ｐ２１活性化キナーゼ−１（ＰＡＫ１）がＭＶ侵入に必要であることを示す。図２Ａは，ＰＡＫ１のｓｉＲＮＡノックダウンがＭＶ感染に及ぼす影響を示す。ＨｅＬａ細胞をＰＡＫ１に対する２つの別々に確認したｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ；Ａ：ＴＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡ（配列番号１２）；Ｂ：ＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＡ（配列番号１３）でトランスフェクションした。処理の３６時間後，細胞にＥＧＦＰ−ＭＶをＭＯＩ＝１で感染させ，２ｈｐｉで回収して分析した。感染した細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ分析により求めた。実験は三重に行い，結果を平均した。ＰＡＫ１に対するイムノブロット分析（ａ−ＰＡＫ１；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を行って，ＰＡＫ１蛋白質レベルの低下を確認した（下パネル）。１レーンあたり合計５０μｇの細胞溶解物を負荷し，モック処理細胞（−−）に対する残存ＰＡＫ１蛋白質の％を求めた。アクチンに対するイムノブロットを負荷対照として用いた。図２Ｂは，ＭＶの感染能に及ぼすドミナント・ネガティブＰＡＫ１の影響を示す。ＨｅＬａ細胞を蛍光タグ付きの野生型ＰＡＫ１（ＷＴ），ＰＡＫ１自己阻害ドメイン（ＡＩＤ），または変異型ＡＩＤ（ＡＩＤＬ１０７Ｆ）で過渡的にトランスフェクションした。細胞をＥＧＦＰ−ＭＶでＭＯＩ＝１で感染させた。４ｈｐｉにおいて細胞を固定し，アクチンを染色した。細胞をトランスフェクションした蛋白質（赤），ウイルス感染（緑）およびアクチン（青）について共焦点顕微鏡により分析した。実験は三重に行い，１回の実験あたり１００個のトランスフェクトした細胞を感染について評点した。結果は，トランスフェクトした／感染細胞の平均パーセンテージとして示す。図２Ｃは，ＭＶ感染の間のＰＡＫ１の活性化を示す。ＭＶを４℃で１時間ＨｅＬａ細胞に結合させた。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。予熱した培地を加えて，感染物を３７℃にシフトした後，示された時点で回収した。ＰＡＫ１およびリン酸化ＰＡＫ１（ａ−ＰＡＫ１−Ｔｈｒ４２３；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）についてイムノブロット分析を行った。
【０１７３】
ＰＡＫ１はマクロピノサイトーシス，すなわち，多くの異なる細胞タイプにおいて大量の液体および細胞膜の内在化につながる，リガンドにより誘導されるエンドサイトーシスのプロセスに関与することが知られている（Ｆａｌｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。マクロピノサイトーシスは動的なアクチン再編成に依存し，これはコレステロール，ならびに小さいＧＴＰａｓｅであるＲａｃ１，ＣＤＣ４２，およびＡｒｆ６を必要とする（Ｋｉｒｋｈａｍ ａｎｄ Ｐａｒｔｏｎ，２００５）。さらに，ＰＡＫ１に加えて，Ｎａ⁺／Ｈ⁺交換体，チロシンキナーゼ，および少なくとも１つのセリントレオニンキナーゼ，ＰＫＣも関与する（Ｄｈａｒｍａｗａｒｄｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｇｒｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈｅｗｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｖｅｉｔｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ダイナミンは必要ではない（Ｄａｍｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
【０１７４】
ＭＶ侵入にマクロピノサイトーシスが関与しているか否かを試験するために，種々の広範な範囲のキナーゼ阻害剤を試験した。スタウロスポリン（セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤）は感染を６５％まで，ゲニステイン（チロシンキナーゼ阻害剤）は８２％まで，ワートマニン（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）は６３％まで阻害した（図３Ａ）。次に，アクチンアセンブリを防止する（サイトカラシンＤ），アクチンを脱重合させる（ラトルンクリンＡ），またはアクチンフィラメントを安定化させる（ジャスパキノリドＡ）薬剤も，感染の用量依存的阻害を４０％から９０％の範囲で引き起こすことを見いだした（図３Ｂ）。顕微鏡により，ＭＶにより誘導されるブレブの形成がこれらのアクチン阻害剤により阻害されることが示された。Ｎａ⁺／Ｈ⁺交換体およびマクロピノサイトーシスの阻害剤であるＥＩＰＡも感染を９０％阻害した（図３Ｃ）。構成的に活性なＡｒｆ６の発現は，ｗｔＡｒｆ６を過剰発現する細胞と比較して感染を７８％阻害したが（図３Ｄ），ドミナント・ネガティブダイナミン（Ｋ４４Ａ）の過剰発現は影響を与えなかった。ＭＶによる感染はコレステロール依存性であり，Ｒａｃ１を必要とすることは，すでに他の研究者により示されている（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。まとめると，阻害はマクロピノサイトーシスプロセスと完全に一致した。
【０１７５】
エンドサイトーシスプロセスのマクロピノサイトーシス的性質は，同時に生ずる液相マーカーの内在化とも一致した。蛍光ＭＶを含むエンドサイトーシスの小胞は，液相マーカーである５６８−デキストランについて陽性であったが，クラスリン媒介性エンドサイトーシスにより内在化されるリガンドである５６８−トランスフェリンについて陰性であった（図３Ｅ）。１００μＭのＥＩＰＡを含めると，ＭＶのＦＩＴＣ−デキストラン陽性小胞への内在化が防止された（図３Ｅ）。
【０１７６】
図３は，ワクシニアＭＶが細胞に侵入するのにマクロピノサイトーシスを利用することを示す。図３Ａおよび３Ｂは，ＭＶ感染に必要な一般的キナーゼおよびアクチン骨格を示す。一連のキナーゼ阻害剤およびアクチン作用性薬剤がＭＶの感染能に及ぼす影響をＦＡＣＳ分析により調べた。アッセイは，下記の材料および方法の節に概説するようにして行った。結果は，３回の実験の平均であり，未処理対照に対する感染細胞のパーセンテージで示す。図３Ｃは，ＥＩＰＡによるＭＶの感染能の阻害を示す。細胞をＮａ⁺／Ｈ⁺交換およびマクロピノサイトーシスの阻害剤であるＥＩＰＡ（５−Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルアミロリド；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で前処理し，次にＥＧＦＰ−ＭＶを感染させ，下記の材料および方法の節に記載されるようにしてＦＡＣＳにより分析した。実験は三重に行い，結果は薬剤非存在下における対照感染に対する感染細胞のパーセンテージで表す。図３ＤはＭＶの感染能に及ぼすドミナント・ネガティブＡｒｆ６の影響を示す。ＨｅＬａ細胞を蛍光タグ付き野生型Ａｒｆ６（ＷＴ）または構成的活性化型Ａｒｆ６（Ｃ／Ａ）で過渡的にトランスフェクションした。細胞はＥＧＦＰ−ＭＶでＭＯＩ＝１で感染させた。４ｈｐｉにおいて，細胞を固定し，アクチンを染色した。細胞を，トランスフェクションした蛋白質（赤），ウイルス感染（緑）およびアクチン（青）について共焦点顕微鏡により分析した。実験は三重に行い，１回の実験に１００個のトランスフェクションした細胞を用いて，感染について評点した。結果は，トランスフェクション／感染した細胞の平均パーセンテージとして示す。図３ＥはＭＶのエンドサイトーシスの小胞中への内在化を示す。細胞を１００μＭのＥＩＰＡで処理するかまたは未処理とした。細胞は，ｍＹＦＰ−ＭＶとＭＯＩ＝１で４℃で１時間結合させるか，または未感染とした。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し，３７℃に１５分間シフトした。次に細胞を液相マーカーである１０ｋＤａの５６８−デキストラン（０．５ｍｇ／ｍｌ）または５６８−トランスフェリン（Ｔｆｎ）（２００ｎｇ／ｍｌ）で，ＥＩＰＡの存在下または非存在下で１０分間パルスした。低ｐＨで軽く洗浄することにより表面に結合したデキストランおよびＴｆｎを除去した後，固定した。サンプルは共焦点顕微鏡で分析した。１つの画像あたり１０個のＺｓテークを集め，Ｚ投影として表示した。
【０１７７】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）の役割をさらに詳細に分析するため，単離したＭＶ粒子を０．５％ＮＰ４０を用いて抽出し，次に界面活性剤および抽出された脂質を除去した。これにより，感染能は劇的に低下したが（図４Ａ），ウイルス構造蛋白質の損失はなかった（データ示さず）。蛍光ＭＶを用いて，抽出したウイルスは細胞に結合するが，ブレブ形成およびエンドサイトーシスを誘導することができなかったことを示した。未処理のＭＶが細胞の内部にクラスター化している８時間後でさえも，抽出したビリオンはなお細胞表面に留まっており，このことは，エンドサイトーシスに欠陥があることを示唆する（図４Ｂ）。ＰＳの役割を試験するために，脱脂質化したウイルスを異なる脂質組成をもつリポソームの存在下でインキュベーションすることにより，脂質を戻し入れた（ａｄｄｂａｃｋ）。いずれの脂質を用いるかにかかわらず，再脂質化したウイルスは細胞に結合することができた（図４Ｃ）。しかし，ＰＳを有するもののみ，ブレブ形成およびエンドサイトーシスを誘導することができた。さらに，ＰＳを再び加えると，元の感染能の大部分（９０％）およびプラーク形成がレスキューされた（図４ＤおよびＥ）。
【０１７８】
ＰＳ結合蛋白質であるアネキシン−Ａ５（ＡＮＸ５）をＥＧＦＰタグ付きの形で用いて，ウイルスのＰＳが実際にウイルス膜の外葉に暴露されていることを示した。ウイルスは，この試薬に暴露したときにわずかに染色され（図４Ｆ），ウイルスＰＳをＡＮＸ５でマスキングすると，ＭＶの細胞への結合には影響を及ぼさずに感染が９５％阻害されることが見いだされた（図４Ｇ）。ウイルスを加える前に細胞をＡＮＸ５で処理すると，ウイルスの結合または感染能に及ぼす影響は観察されなかった。これらの結果は，マクロピノサイトーシスプロセスの開始にウイルス粒子中のＰＳが必要であることを示す。
【０１７９】
最後に，ＡＮＸ５を用いて，感染細胞からＭＶを放出する感染細胞の溶解が，アポトーシスまたは壊死のいずれにより引き起こされるかを判定した。細胞アポトーシスの特徴である表面暴露ＰＳの存在について，ウイルスプラークを分析した（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。ウイルスプラークを囲む細胞は大量の表面暴露ＰＳを含むが，非感染細胞またはプラーク間の細胞はこれを含まないことが見いだされた（図４Ｈ）。このことは，感染の後期において，ワクシニアウイルスはアポトーシスを誘導し，これがＭＶが退出する手段であることを示す。すなわち，ウイルスは，感染細胞からのアポトーシス体と一緒に，隣り合う非感染細胞に暴露される。
【０１８０】
図４は，ワクシニアＭＶは内在化にＰＳを必要とすることを示す。図４Ａは，ＭＶの感染能にはウイルス脂質が必要であることを示す。ビリオンから種々の濃度のＮＰ４０（０．１−１．０％）を用いて脂質を抽出した。補正後，ＢＳＣ４０細胞におけるタイター測定（ｐｆｕ／ｍｌ）によりビリオンの感染能を測定した。図４Ｂは，脂質を抽出したＭＶが細胞に結合しうるが細胞に侵入できないことを示す。０．５％ＮＰ４０で処理したかまたは未処理のｍＹＦＰ−ＭＶをＭＯＩ＝１で細胞に加えた。細胞は，３０ｍｐｉまたは８ｈｐｉで固定し，アクチンについて染色し，共焦点顕微鏡によりウイルスの結合および感染について可視化した。図４Ｃは，ＭＶの結合はビリオン膜の脂質構成成分には依存しないことを示す。１ｘ１０⁹個のｍＹＦＰ−ＭＶを，未処理で，または脂質を抽出して，または続いて異なる脂質（ＭおよびＭ’）とともに戻した。戻した後，ビリオンをＨｅＬａ細胞に４℃で１時間結合させ，冷ＰＢＳで２回洗浄し，下記の材料および方法の節にしたがって，ＦＡＣＳ分析により分析した。結果は３回の独立した実験として示す。図４Ｄは，ＭＶの感染能はビリオン膜中のＰＳに依存することを示す。１ｘ１０⁹個のＥＧＦＰ−ＭＶを脂質抽出するかまたは未処理で異なる脂質に戻した（下記の材料および方法の節を参照）。戻した後，ビリオンをＨｅＬａ細胞に４℃で１時間結合させた。ＰＢＳで２回洗浄し，３７℃で２時間感染を進行させた後に，ＦＡＣＳ分析を行った。３回の独立した実験の結果を示す。図４Ｅは，ＭＶによる増殖感染はビリオン膜中のＰＳに依存することを示す。１ｘ１０⁹個のＷＲ ＭＶを脂質抽出するかまたは未処理で異なる脂質に戻した。戻した後，ビリオンの感染能をＢＳＣ４０細胞におけるタイター評定（ｐｆｕ／ｍｌ）により測定した。結果は３回の独立した実験で示す。図４Ｆは，ウイルス膜ＰＳがＭＶの表面への暴露されることを示す。ウイルス膜上のＰＳの存在は，組換え４８８アネキシンＶ（ＡＮＸ５）を用いて示した。ビリオンは，Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）アポトーシスアッセイキット＃２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に提供されるプロトコルを適合させて分析した。簡単には，ビリオンを２５μｌの１Ｘアネキシン結合バッファ中で，２μｌの４８８ＡＮＸ５とともに室温で１５分間インキュベーションした。ビリオンをペレット化し，結合バッファで１回洗浄し，カバースリップに結合させた後，共焦点顕微鏡により可視化した。ｍＹＦＰ−ＭＶを可視化して陽性対照とした。図４Ｇは，ＭＶ膜ＰＳのマスキングは感染を妨害することを示す。結合：ＨｅＬａ細胞またはｍＹＦＰ−ＭＶをＡＮＸ５で，製造元の指針にしたがって（細胞）または上述の条件で（ＭＶ）前処理した。処理後，ＡＮＸ５と結合した細胞を未処理のビリオンとともに，またはＡＮＸ５処理ｍＹＦＰビリオンを未処理細胞とともにインキュベーションした。ｍＹＦＰ−ＭＶのＨｅＬａ細胞への結合を陽性対照として用いた。実験は三重に行い，結果は対照に対するビリオン結合細胞のパーセントとして示した。感染：実験は，ＥＧＦＰ−ＭＶを用いる結合と同様にして行った。図４Ｈは，アポトーシス性細胞についてウイルスプラークが濃縮されていることを示す。ＢＳＣ４０細胞単層をｗｔ−ＭＶに感染させ，感染は２４時間進行させた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し，製造元のプロトコルにしたがって，生存，アポトーシスおよび壊死細胞について分析した（Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）アポトーシスアッセイキット＃２；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。４８８ＡＮＸ５は緑で，ヨウ化プロピジウムは赤で示される。未感染細胞を染色対照として用いた。
【０１８１】
材料および方法：
細胞株およびウイルス
ＢＳＣ４０霊長類およびＨｅＬａ ＡＴＣＣ細胞の単層を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で３７℃で維持した。野生型（ｗｔ）ワクシニアウイルス（ＷＲ株），ＷＲＥ／ＬＥＧＦＰ（ＭＶ−ＥＧＦＰ）（Ｐａｕｌａ Ｔｒａｋｔｍａｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより供与），およびコア蛋白質の蛍光タイプを含むＷＲであるＡ５（ｍＹＦＰ−ＭＶ）を示されるようにして用いた。すべてのウイルスのストックは，ブレフェルジンＡの存在下で調製した。ウイルスは，細胞質溶解物から超遠心分離により２５−４０％のショ糖勾配中３６％ショ糖のバンドとして精製した。
【０１８２】
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
結合アッセイ：ｍＹＦＰ−ＭＶをＨｅＬａ細胞（ｗｔまたは処理済）に，無血清ＤＭＥＭ中で４℃で１時間，感染多重度（ＭＯＩ）＝１で結合させた。ビリオン結合細胞を４℃にシフトし，ＰＢＳで２回洗浄し，プレートからトリプシン処理し，ホルムアルデヒド（ＦＡ）で氷上で３０分間固定した。固定した細胞を遠心分離により回収し，ＰＢＳで１回洗浄し，再び回収し，ＰＢＳに懸濁してＦＡＣＳ分析を行った。各サンプルから合計で１０，０００事象を分析し，未結合およびｍＹＦＰ−ＭＶ結合対照に対する相対的ｍＹＦＰ発現について評点した。感染アッセイ：ＥＧＦＰ−ＭＶを無血清ＤＭＥＭ中で薬剤の存在下で４℃で１時間ＨｅＬａ細胞に結合させた。すべのアッセイはＭＯＩ＝１で行った。結合後，細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し，予熱した培地を加えた。細胞を３７℃にシフトし，感染を２時間進行させた後，固定し，上述のようにしてＦＡＣＳ用に調製した。薬剤スクリーニング：ＨｅＬａ細胞を感染前に種々の濃度の示された薬剤で１５分間前処理した。細胞を，無血清ＤＭＥＭ中で薬剤の存在下で，４℃で１時間ＥＧＦＰ−ＭＶに結合させた。すべてのアッセイはＭＯＩ＝１で行った。結合後，細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し，薬剤を含む予熱した培地を加えた。次に細胞を３７℃にシフトし，感染を２時間進行させた。細胞を固定し，上述のようにしてＦＡＣＳ分析用に調製した。すべてのＦＡＣＳ分析は，薬剤なしの対照感染に対する感染細胞のパーセンテージとして表した。
【０１８３】
ビリオンの界面活性剤抽出
合計で１．０ｘ１０⁹のワクシニアウイルスｗｔ，ＥＧＦＰ−ＭＶ，またはｍＹＦＰ−ＭＶビリオン（上述のようにして精製）を，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）および種々の濃度のＮＰ−４０：すなわち，０，０．１，０．５，および１．０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む反応混合物中で３７℃で６０分間インキュベーションした。抽出後，可溶性画分および粒子画分（それぞれビリオンの膜およびコア成分を表す）を沈降（１６，０００ｘｇ，３０分間，室温）により分離した。次にサンプルをＢＳＣ４０細胞上でタイターを測定して，ウイルスタイター（ＰＦＵ数／ミリリットル）を決定した。すべてのタイター測定は三重に行い，結果を平均した。
【０１８４】
ビリオン脂質の戻し入れ
種々の脂質組成をもつリポソームを調製し，Ｏｉｅ（Ｏｉｅ，１９８５＃２００８）の方法にしたがって，脂質を抽出したビリオンを再構築した。簡単には，脂質を抽出したビリオンを，種々の濃度のＰＳ（２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌ）またはＧＭ１（２０μｇ／ｍｌ）を組み込んだＰＣ系リポソーム（２００μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で２時間インキュベーションした。ビリオンを遠心分離により回収し，次に洗浄し，バッファーに再懸濁した。再構築ビリオンをＦＡＣＳおよび顕微鏡による結合および侵入アッセイに供し，ならびにウイルス収量のタイターを測定した。
【０１８５】
実施例２
アデノウイルス血清型３ウイルスの侵入メカニズムの評価
材料および方法
細胞およびウイルス
細胞は，記載されるようにして，１０％ＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含むＤＭＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で低い継代数で成長させた（Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ヒト黒色腫Ｍ２１ ｌｉｔｔｅｒ（表面発現αｖインテグリン陰性）およびＭ２１Ｌ細胞（細胞表面αｖインテグリン陽性）はＤｒ．Ｄ．Ｃｈｅｒｅｓｈ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）から供与された。Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞は記載されるようにして成長させた（Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＤ４６またはＣＡＲを安定して発現するＢＨＫ細胞は，ＣＤ４６またはＣＡＲのＢＣ１アイソフォームのいずれかをコードするプラスミドを安定的にトランスフェクトすることにより調製した（Ｓｉｒｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。Ａｄ３およびＡｄ２ｔｓ１は，記載されるようにして成長させ単離した（Ｇｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。Ａｄ３のテキサスレッドによる標識は公表されているようにして行った（Ｎａｋａｎｏ ａｎｄ Ｇｒｅｂｅｒ，２０００）。（３Ｈ）−チミジン標識Ａｄ３は，公表されているようにして製造した（Ｇｒｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【０１８６】
ｃＤＮＡ，蛋白質および化学物質
ＣｔＢＰ１−Ｓ／ＢＡＲＳをコードするｃＤＮＡはＤｒ．Ａ．Ｃｏｌａｎｚｉ（Ｄｅｐ．Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｓ．ＭａｒｉａＩｍｂａｒｏ，Ｉｔａｌｙ）から入手した。ｐＣＭＶ−ｍｙｃ ＣｔＢＰ１−Ｓｗｔは，ＰＣＲ増幅ＣｔＢＰ１−Ｓｗｔ（それぞれＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断）をｐＣＭＶ骨格ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にライゲーションすることにより生成した。Ｍｙｃ−ＣｔＢＰ３ Ｄ３５５Ａは，Ｑｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｒ部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い，下記のプライマー５’−ＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧ−３’（配列番号２２）を用いて生成した（Ｂｏｎａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。得られたｃＤＮＡをシークエンシングにより確認した。Ｋ４４Ａ−ｄｙｎ２およびｄｙｎ２ｗｔ発現プラスミドはＤｒ．Ｃ．Ｌａｍａｚｅ（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より入手した。Ｐａｋ１ｗｔおよび阻害的ドメイン発現ベクターは，Ｊ．Ｃｈｅｒｎｏｆｆ（Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）より入手した。Ｔｏｘｉｎ Ｂ（０．５ｍｇ／ｍｌ）はＤｒｓ．Ｆ．ＨｏｆｍａｎｎおよびＫ．Ａｋｔｏｒｉｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。ＰＫＣ阻害剤Ｇｏ６９７６（１μＭ）およびＧｏ６９８３（１μＭ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｊｕｒｏ Ｓｕｐｐｌｙ）より購入し，Ｎａ⁺／Ｈ⁺交換阻害剤ＥＩＰＡ（１００μＭ）はＡｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入し，サイトカラシンＤ（５μＭ）およびジャスパラキノリド（５００ｎＭ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより購入した。メチル−ベータ−シクロデキストリン（５０ｍＭ）によるコレステロール飢餓は，先に公表されているようにして行った（Ｉｍｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。Ａｄ３可溶性ファイバーノブ（最終濃度５μｇ／ｍｌで使用）はＰ．Ｆｅｎｄｅｒ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。ダイナソールはＤｒ．Ｊ．Ｓ．Ｓｉｅｇｅｌ（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）の合成したものを用いた。ＣｔＢＰ１−Ｌ／Ｓに対する抗体は，ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから，ＰＡＫ１抗体（Ｃ−１９）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から，リン酸化ＰＡＫ１（Ｔ４２３）に対する抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０１８７】
エンドサイトーシスおよびＡｄ−ｅＧＦＰ形質導入
細胞を冷却下で，ＲＰＭＩ−０．２％ＢＳＡ中で（３Ｈ）チミジン標識Ａｄ３（１μｇ／ｍｌ；３Ｘ１０⁹粒子，３５ｍｍディッシュ上）とともに６０分間インキュベーションし，冷ＲＰＭＩ−ＢＳＡで洗浄し，ＲＰＭＩ−ＢＳＡとともに示された時間暖めた。細胞を冷ＲＰＭＩ−ＢＳＡおよび冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞外ウイルス粒子を細胞から除去するために，細胞を冷２％トリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）とともに冷却下で６０分間インキュベーションし，ＰＢＳ−２％ＦＣＳを加え，細胞を５００ｘｇで遠心分離した。洗浄工程を２回繰り返した。熱ＳＤＳ（０．４％）中に細胞溶解物を調製し，２０Ｇ医療シリンジで剪断し，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＬＳ３８０１を用いて，液体シンチレーションカウント（Ｒｅａｄｙ Ｓａｆｅ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により放射活性を測定した。トリプシンなしの対照細胞の計数を１００％対照として用いた。薬剤実験のためには，細胞をＲＰＭＩ−ＢＳＡ中の薬剤とともに３７℃で３０分間プレインキュベーションした。形質導入実験のためには，細胞を温ＲＰＭＩ−ＢＳＡで洗浄し，１μｇ／ｍｌのウイルスとともに６０分間インキュベーションし，ＲＰＭＩ−ＢＳＡで数回洗浄し，水浴中で４時間（Ａ５４９細胞），５時間（ＨｅＬａ細胞），８時間（Ｍ２１およびＭ２１Ｌ細胞）および１６時間（Ｋ５６２細胞）インキュベーションした。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し，冷却下で２％トリプシンで，次に２％ＰＢＳ−ＦＣＳで処理し，フローサイトメトリ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＣ５００ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。サンプル１つあたり少なくとも１００００個の生存細胞を計数した。薬剤実験のためには，細胞をＲＰＭＩ−ＢＳＡ中の阻害剤で３７℃で３０分間前処理した後，薬剤の存在下で６０分間温感染させ，次に薬剤を含まない培地で洗浄し，さらにインキュベーションした。
【０１８８】
デキストラン取り込み
細胞を，先に記載されるようにして（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２），５μｇ／ｍｌの冷Ａｄ３とともにプレインキュベーションし，温ＲＰＭＩ−ＢＳＡで洗浄し，０．５ｍｇ／ｍｌのデキストラン−ＦＩＴＣ（ｌｙｓｉｎｅ−ｆｉｘａｂｌｅ １０ｋＤａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含むＲＰＭＩ−ＢＳＡ中で３７℃で１０分間暖めた。デキストラン取り込みは，細胞を冷ＲＰＭＩ−ＢＳＡおよびＰＢＳで洗浄（３回繰り返し）することにより停止させた。表面に結合したデキストランは，冷０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５），０．０５Ｍ ＮａＣｌ中で１０分間酸処理することにより除去した。ＦＡＣＳ分析用には，細胞をＰＢＳ中２％トリプシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中で氷上で２５分間剥離させ，２ｍｌの７％ＦＣＳ／ＰＢＳを含む６ｍｌのポリプロピレンチューブ（ｎｏ２０６３；Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し，２９０ｘｇでペレット化し，２％ＦＣＳ／ＰＢＳに再懸濁した。サンプル１個あたり少なくとも１００００個の生存細胞をフローサイトメータで計数した（Ｂｅｃｋｍａｎ ＦＣ５００サイトメータ）。
【０１８９】
透過型電子顕微鏡，およびＢＳＡ−金の取り込み
冷Ａｄ３またはＡｄ２ｔｓ１（５０μｇ／ｍｌ，感染多重度［ＭＯＩ］５０００）で６０分間結合させた後，適宜洗浄および内在化を行い，細胞を０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファ，ｐＨ７．４（ＣａＣｏ）中２％ホルムアルデヒド−１．５％グルタルアルデヒドで一晩固定し，ＣａＣｏで数回洗浄し，二回蒸留水中の１％ＯｓＯ₄（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および１．５％フェリシアン化カリウム（ＦｅＫ₃Ｎ₆）で４℃で６０分間固定後処理を行った（Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ ａｎｄ Ｓｉｍｉｎｏｎｅｓｃｕの方法を改変）。標本を０．１Ｍカコジル酸ナトリウムですすぎ，０．０５Ｍカコジル酸ナトリウム中１％タンニン酸で室温で４５分間対比染色し，１％硫酸ナトリウムで洗浄し，Ｈ₂Ｏですすぎ，Ｈ₂Ｏ中２％酢酸ウラニルで一晩染色し，先に記載されるようにしてＥｐｏｎ中に包埋した（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ウイルス粒子は，細胞膜，エンドソームおよびサイトゾルの超薄切片を倍率５００００ｘで定量し，透過電子顕微鏡で加速電圧８０，０００Ｖで観察した（Ｚｅｉｓｓ ＥＭ９０２Ａ）。１５ｎｍのコロイド金は，ＨＡｕＣｌ₄のクエン酸還元により調製した（Ｆｒｅｎｓ，１９７３；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｓｅｔ，１９７７）。２０ｍｌのコロイド金溶液（ｐＨを５．９に調節）に，５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，無脂肪酸）溶液を加えた（ＤｅＲｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＢＳＡ金複合体を安定化させるために，１ｍｌの１％ＰＥＧ−２００００（Ｒｏｔｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を加え，サンプルを２８，０００ｇで６０分間遠心分離し，ペレットを２ｍｌの金バッファ（０．２％ＰＥＧ−２００００を含む滅菌濾過済みＰＢＳ）に溶解し，４℃で保存した。ＢＳＡ金内在化は，Ａｄ３またはＡｄ２−ｔｓ１の冷結合後に，ＢＳＡ金のＲＰＭＩ−ＢＳＡ（約０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中１：１希釈を用いて，３７℃で１０分間行った。
【０１９０】
蛍光顕微鏡および免疫蛍光
細胞を種々のＤＮＡコンストラクトで３０時間トランスフェクションした後，Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，製造元の指針にしたがう）を用いた実験を行った。細胞を，Ａｄ３−ｅＧＦＰまたはＡｄ５−ｅＧＦＰで３７℃で６０分間感染させ，洗浄し，３７℃で１５時間インキュベーションした。細胞を固定し，ＤＡＫＯを用いてマウントした。デキストランおよびトランスフェリン取り込み用には，細胞を５μｇ／ｍｌのＡｄ３で冷却下でシンクロナイズさせ，温洗浄し，ＲＰＭＩ−ＢＳＡ中の０．５ｍｇ／ｍｌデキストラン−ＴＲおよび２０μｇ／ｍｌのトランスフェリン−Ａｌｅｘａ６４７の混合物で３７℃で３０分間パルスし（水浴），次に５分間チェイスし，固定し，ＤＡＫＯを用いてマウントした。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）は，Ａｒ−ＡｒＫｒレーザー，Ｈｅ−Ｎｅ５４３−５９４レーザー，Ｈｅ−Ｎｅ６３３レーザー，４０５ｎｍのダイオードレーザーおよび６３ｘ油浸対物レンズ（Ｎ．Ａ．１．４ＰＬＡＰＯ）を備えたＬｅｉｃａ−ＤＭ ＳＰ２ ＲＸＡ２−ＴＣＳ−ＡＯＢＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。ピンホール値１．０，エアリー１，得られる光学切片約０．４８μｍ，ボクセル０．２３３ｘ０．２３３ｘ０．４８μｍ。ズーム倍率は２であった。画像のプロセシングはＬｅｉｃａａｎｄ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウエア（Ａｄｏｂｅ）を用いて行い，細胞の合計投影の蛍光強度はＩｍａｇｅ Ｊ（ｗｅｂｐａｇｅ：ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて決定した。デキストラン陽性エンドソームを用いるＣｔＢＰ１−Ｌ／Ｓ共局在用には，細胞をＡｄ３−ＴＲ（２μｇ／ｍｌ）で氷上で６０分間冷シンクロナイズさせ，温ＲＰＭＩ−ＢＳＡで洗浄し，０．５ｍｇ／ｍｌのデキストラン−ＦＩＴＣで３７℃で１０分間パルスした。細胞をＲＰＭＩ−ＢＳＡおよびＰＢＳでよく洗浄し，固定し，ＣｔＢＰ１−Ｌ／Ｓマウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および二次抗体としてＡｌｅｘａ６４７−コンジュゲート化ヤギ抗マウス抗体を用いて，免疫蛍光により分析した。
【０１９１】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｋ５６２細胞を，クラスリン重鎖（ＡＡＣＣＵＧＣＧＧＵＣＵＧＧＡＧＵＣＡＡＣ（配列番号２３）；Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｎｒｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３））およびＣｔＢＰ１／ＣｔＢＰ３（ＣＣＧＵＣＡＡＧＣＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＵＵ（配列番号２４）；ＧＧＡＵＡＧＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＡＧＵＵＵ（配列番号２５）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｂｏｎａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，２００５））に対するｓｉＲＮＡで，Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｉ（Ａｍａｘａ；ｐｒｏｇｒａｍＴ−０３）を製造元の指針にしたがって用いて，トランスフェクトした。非標的化ｓｉＲＮＡ配列（Ｑｉａｇｅｎ，またはＤｈａｒｍａｃｏｎ）のトランスフェクションを対照として用いた。トランスフェクションは第０日および第２日に行い，ウエスタンブロッティングおよび実験用の細胞溶解物は第４日に回収した。ＨｅＬａ細胞を，クラスリン重鎖，ＣｔＢＰ１／ＣｔＢＰ３，またはＰＡＫ１（確認済ｓｉＲＮＡＣａｔ．ＳＩ００６０５７０３およびＳＩ００６０５６９６；Ｑｉａｇｅｎ）に対するｓｉＲＮＡで，リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指針にしたがって用いてトランスフェクトした。トランスフェクションは第０日および第２日に２回行い，ウエスタンブロッティングおよび実験用の細胞溶解物は第４日に回収した。Ａ５４９細胞を，クラスリン重鎖，ＣｔＢＰ１／ＣｔＢＰ３，ＰＡＫ１またはダイナミン２｛ＧＡＣＡＵＧＡＵＣＣＵＧＣＡＧＵＵＣＡ（配列番号２６），Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｕａｎｇ，２００４＃１５５０９｝に対するｓｉＲＮＡで，リポフェクタミン２０００を上述のようにして用いてトランスフェクトした。
【０１９２】
ウエスタンブロッティング
細胞を３５ｍｍディッシュで成長させ，リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し，５００μｌの２％熱ＳＤＳ中で溶解した。溶解物を２０ゲージの針に数回通過させ，９５℃で３０秒間加熱した。１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した後，１５０μｌの上清を５０μｌのサンプルバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ６．８，８％ＳＤＳ，０．４％ブロモフェノールブルー，４０％グリセロール，１６７ｍＭジチオスレイトール）と混合し，９５℃で１０分間加熱した。抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移し，５０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭ塩化ナトリウム／０．１％Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ７．４（ＴＮＴ）中の５％ドライミルクでブロッキングした。免疫学的プロービング（ＰＡＫ１ブロットについては３％ミルク，ＣｔＢＰ１ブロットについては０．２％ＢＳＡ）の後，ＥＣＬＰｌｕｓ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨＲＰコンジュゲート化抗体を検出した。フィルタを，１００ｍＭβ−メルカプトエタノール，２％ＳＤＳ，６２．５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ６．７で５０℃で３０分間ストリッピングした後，ＴＮＴでよく洗浄し，５％ドライミルクでブロッキングし，３％ミルクを含むＴＮＴ中の抗カルネキシン抗体（Ｄｒ．Ａ．Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ｚｕｒｉｃｈより寄付）で再プローブした。
【０１９３】
図５は，Ａｄ３のエンドサイトーシスおよび感染にはＰＡＫ１の活性化が必要であるが，Ａｄ５には必要ではないことを示す。図５Ａは，Ａｄ３およびＡｄ５がＰＡＫ１を活性化することを示す。ＨｅＬａ細胞を０．５μｇ／ｍｌのＡｄ３，Ａｄ５またはｔｓ１（約５Ｘ１０⁵細胞）とともに，冷却中で６０分間インキュベーションし，洗浄し，異なる時間暖めた。細胞をホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含む冷ＰＢＳで洗浄し，ディッシュからはがし，阻害剤を含む１００μｌのＰＢＳに再懸濁し，ジチオスレイトールを含むＳＤＳサンプルバッファと混合し，加熱し，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１レーンあたり１０⁵個の細胞に相当）およびそれぞれＰＡＫ１およびリン酸化ＰＡＫ１（Ｔ４２３）に対するウエスタンブロッティングにより，ＥＣＬを検出法として用いて分析した。図５Ｂ：野生型またはドミナント・ネガティブＰＡＫ１（阻害ドメインＩＤ）を発現するＨｅＬａ細胞にＡｄ３−ｅＧＦＰまたはＡｄ５−ｅＧＦＰを形質導入するか，または，Ａｄ３感染の際のデキストラン−ＦＩＴＣまたはＡｌｅｘａ６４７で標識したトランスフェリンの取り込みについて評価した。図５Ｃ：ＨｅＬａ細胞を，ＰＡＫ１に対するｓｉＲＮＡであるＰ２およびＰ８またはｎｓ ｓｉＲＮＡで７２時間トランスフェクトし（ダブルトランスフェクション，２０ｐｍｏｌｅｓ／ｍｌ ｓｉＲＮＡ），Ａｄ３−ｅＧＦＰまたはＡｄ５−ｅＧＦＰを６時間感染させ，フローサイトメトリでｅＧＦＰ発現について分析した。１ｘ１０⁵個のトランスフェクトした細胞をウエスタンブロッティング（ＷＢ）によりＰＡＫ１含有量について分析した。図５Ｄ：Ａｄ３のエンドソームエスケープを，それぞれ抗ＰＡＫ１ ｓｉＲＮＡ Ｐ２およびｎｓ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞における薄片ＥＭにより測定した。結果は，細胞膜，エンドソーム中およびサイトゾル中にビリオンを示した。
【０１９４】
実施例３
ウイルス感染の間のＥＧＦＲの役割
Ｒａｃ１エフェクターであるＰＡＫ１は，ワクシニア成熟ビリオン（ＭＶ）の侵入に必要であり，ＲｈｏＡファミリーのＧＴＰａｓｅであるＲａｃ１およびＲｈｏＡは侵入プロセスの間に活性化される（Ｍｅｒｃｅｒ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２０：５３１−５３５）。次に，これらのＧＴＰａｓｅは，種々の細胞表面レセプターにより活性化されることができる（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ（２００６）Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １８：１８３４−１８４３）。その１つは表皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ，Ｅｒｂ１）である。これまでワクシニア侵入におけるＥＧＦＲの関与については意見が分かれている（Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ｅｐｐｓｔｅｉｎ（１９８７）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：２３９−２４５；Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６６３−６６５；Ｈｕｇｉｎ ａｎｄ Ｈａｕｓｅｒ（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：８４０９−８４１２）。
【０１９５】
ＭＶ感染の経時変化を用いて，ワクシニア感染の間のＥＧＦＲの活性化状態を評価した。ＥＧＦＲ活性化は，チロシン１１７３でリン酸化されたＥＧＦＲを認識する抗体を用いてモニターした。ＥＧＦＲはウイルスを加えてから５分以内に強く活性化され，そのピークは感染後１５分であった（図７）。
【０１９６】
ＥＧＦＲ阻害剤である３２４６７４（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は，ＭＶ侵入を有効に妨害し，低ｐＨ融合により容易にバイパスされた（図８）。
【０１９７】
これらの結果は，ワクシニアＭＶは感染の間にＥＧＦＲを活性化することができ，この活性化が侵入に必要であることを示す。さらに，ＭＶがＥＧＦＲの下流に存在するＰＡＫ１の活性化を誘導したことが示唆される。これらのデータは，ＭＶ侵入および感染に必要なシグナリング経路についてのさらなる洞察を提供し，他の潜在的細胞性抗ウイルス標的およびポックスウイルス感染に対する治療法を示唆する。
【０１９８】
材料および方法
蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）感染アッセイ
薬剤スクリーニング：ＨｅＬａ細胞は，感染前に，示される薬剤で種々の濃度で１５分間前処理した。ＥＧＦＰ発現ＭＶを，４℃で無血清ＤＭＥＭ中で薬剤の存在下で１時間結合させた。すべてのアッセイはＭＯＩ＝１で実施した。結合後，細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し，次に予温した薬剤含有培地を加えた。細胞を３７℃にシフトさせ，２時間感染させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し，プレートをトリプシン処理し，４％ホルムアミド（ＦＡ）中で氷上３０分間固定した。固定した細胞を遠心分離により回収し，ＰＢＳで洗浄し，再び回収し，ＰＢＳ中に懸濁して，ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるＦＡＣＳ分析を行った。すべてのＦＡＣＳ分析は，三重に行い，薬剤なしの対照感染に対する感染細胞の平均パーセンテージで表した。エラーバーは，実験間の標準偏差を表す。
【０１９９】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルス感染を治療する方法であって，治療を必要とする被検動物に，有効量のキナーゼ調節剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
被検動物はヒトである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
キナーゼ調節剤はＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼを調節する，請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記キナーゼ調節剤は宿主細胞キナーゼ調節剤である，請求項１記載の方法。
【請求項５】
キナーゼ調節剤は，キナーゼを標的とするドミナント・ネガティブ分子，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，抗体または小分子である，請求項１記載の方法。
【請求項６】
キナーゼ調節剤はｓｉＲＮＡである，請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞キナーゼ調節剤は宿主細胞キナーゼ阻害剤である，請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞キナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼの阻害剤である，請求項７記載の方法。
【請求項９】
キナーゼ調節剤はＣＥＰ−１３４７である，請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ポックスウイルスは天然痘ウイルスである，請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ポックスウイルスはワクシニアウイルスである，請求項１記載の方法。
【請求項１２】
感染は呼吸器感染である，請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス感染を治療する方法であって，治療を必要とする被検動物に有効量のマクロピノサイトーシス経路の調節剤を投与することを含む方法。
【請求項１４】
被検動物はヒトである，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マクロピノサイトーシス経路の前記調節剤は，前記マクロピノサイトーシス経路の阻害剤である，請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記阻害剤はキナーゼ阻害剤である，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記阻害剤は宿主細胞キナーゼ阻害剤である，請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞キナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼの阻害剤である，請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
阻害剤はＣＥＰ−１３４７である，請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスはポックスウイルスである，請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスは天然痘ウイルスである，請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスはワクシニアウイルスである，請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
ａ） 細胞をキナーゼ阻害剤およびウイルスと接触させ，そして
ｂ） キナーゼ阻害剤がウイルスによる細胞の感染を阻害するか否かを判定する，
ことを含む方法。
【請求項２４】
ウイルスはポックスウイルスである，請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスはインフルエンザウイルスである，請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスはワクシニアまたは天然痘である，請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
キナーゼ阻害剤は，ＰＡＫ１；ＤＹＲＫ３；ＰＴＫ９；およびＧＰＲＫ２Ｌからなる群より選択されるキナーゼを阻害する，請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
キナーゼ阻害剤は，キナーゼを標的とするドミナント・ネガティブ分子，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，抗体または小分子からなる群より選択される，請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
接触はインビトロで行われる，請求項２３記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【公表番号】特表２０１０−５３０８７０（Ｐ２０１０−５３０８７０Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２８１１（Ｐ２０１０−５１２８１１）
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００２６４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００１２２４
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０９３５１２０３）
【Ｆターム（参考）】