抗ウイルス剤
【課題】新たな抗ウイルス剤を提供すること。
【解決手段】緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【解決手段】緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤に関する。具体的には、本発明は、緑茶成分を有効成分とする抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新興ウイルス等がパンデミックに蔓延することもあり、ウイルス感染症が世界的な問題となっている。
中でも、インフルエンザウイルスによるインフルエンザは、世界で最も広く存在する人獣共通感染症の一つであり、新型インフルエンザウイルスがひとたび出現すると、短期間で人命が失われるだけでなく社会機能に甚大な影響を与える。
加えて、近年、ブタインフルエンザの国内発症、死者が認められ、更なる感染拡大が予想されている。
【０００３】
インフルエンザの予防としては、ワクチン接種が主なものであり、インフルエンザの治療としては、ノイラミニダーゼ阻害薬やアマンタジン等が用いられている。
また、特許文献１には、抗ウイルス活性を持つ、カテキン等のフラボノイド単位を含む構造を持つプロアントシアニジンポリマー組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３４４８０５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、インフルエンザワクチン等のウイルスに対するワクチンは、抗原の絶えざる変異に対応する必要があり、その開発に時間と手間がかかるのが現状である。
また、従来の抗ウイルス剤に対しては、耐性を持つウイルスが出現している。
【０００６】
そこで、抗原性に依存せずウイルスの感染を防ぎ、さらに人体に対し、有害な副作用を持たず安定して使用できる薬剤の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、緑茶成分を有効成分とする新規な抗ウイルス剤を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
［１］
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
［２］
前記緑茶成分が、エラジタンニン、エピガロカテキンガレート、及びそれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］
前記エラジタンニンがストリクチニンである、［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
［５］
前記インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１型である、［４］に記載の抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新たな抗ウイルス剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ストリクチニンの構造式を示す。
【図２】ストリクチニンの抗インフルエンザウイルス活性の測定方法のプロトコールを示す。図中、プロトコール１〜４については、ストリクチニンを加えて反応を行った部分のみを示しており、ストリクチニンを加えていない部分は、全てｃｏｎｔｒｏｌと同条件で反応を行った。
【図３】図３Ａは、プロトコール１（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）及びプロトコール２（Ｅｎｔｒｙ）により反応した際の、抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。 図３Ｂは、プロトコール３により反応した際の、抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。
【図４】プロトコール１により反応した際の、ストリクチニン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、阻害率を、横軸は各化合物の濃度を示す。
【図５】ｖｅｒｏ細胞に感染させた場合の抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。
【図６】Ｂ型株（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）に対する抗インフルエンザ活性の測定結果を示す。縦軸は、感染率を、横軸は、ストリクチニンの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
本発明の抗ウイルス剤は、緑茶成分を有効成分として含有するものである。
本発明において、緑茶成分とは、緑茶に含まれる成分をいい、緑茶原料（例えば、茶葉）から抽出して得られた成分である。
緑茶成分として、エピガロカテキンガレートやストリクチニンのように緑茶に含まれる成分としての化合物であってもよく、緑茶原料から従来公知の方法により抽出して得られた緑茶抽出物であってもよい。緑茶自体を本発明の抗ウイルス剤として用いることもできる。また、緑茶成分として、エピガロカテキンガレートやストリクチニン以外のフラボノイド等の緑茶含有成分を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明において、「エピガロカテキンガレート」とは、エピガロカテキンと、没食子酸とのエステルであり、エピガロカテキンガレートの薬学的に許容可能な塩とは、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム等のアルカリ土類金属とエピガロカテキンガレートとの塩、エピガロカテキンガレートのアンモニウム塩等の４級アンモニウム塩などが挙げられる。
エピガロカテキンガレートとしては、生体内においてエピガロカテキンガレートを放出するプロドラッグであってもよい。
【００１４】
本発明において、「エラジタンニン」とは、糖類と、没食子酸の二量体であるエラグ酸とを加水分解産物として分子内に有する化合物を意味し、加水分解性タンニンとも呼ばれる。
エラジタンニンとしては、例えば、ストリクチニン、ゲラニイン、ケブリン酸、エラエオカルプシン、ケブラグ酸、コリラギン、エンブリカニン、プニグルコニン、ペデュンキュラギン、コルヌシイン Ａ、アグリモニイン、テリマグランジン、カスアリクチン、ルゴシン Ｃ、カスアリニン等が挙げられる。
エラジタンニンの薬学的に許容可能な塩とは、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム等のアルカリ土類金属とエラジタンニンとの塩、エラジタンニンのアンモニウム塩等の４級アンモニウム塩などが挙げられる。
エラジタンニンとしては、生体内においてエラジタンニンを放出するプロドラッグであってもよい。
【００１５】
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶等に広く含まれている成分であり、安全性が高い。
本発明で用いられるエピガロカテキンガレートやエラジタンニンとしては、安全性の観点から、緑茶葉の抽出物としてのエピガロカテキンガレートやエラジタンニンであってもよい。エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、市販品を用いてもよく、従来公知の方法により緑茶原料から抽出したものを用いてもよい。また、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含む緑茶葉抽出物として用いてもよい。さらに、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶葉以外の他の植物体などから得られたものであってもよい。
【００１６】
本発明の抗ウイルス剤は、飲食品又は医薬品として用いることができる。
【００１７】
エラジタンニンやエピガロカテキンガレートなどの緑茶成分は、飲食品として、特定保健用食品、栄養機能性食品、健康食品、機能性食品、健康補助食品等として利用できる他、清涼飲料水や食品の配合剤などとして利用することができる。また、既存の食品に緑茶成分を添加した強化食品であってもよい。
飲食品は、抗ウイルス作用を有する旨の表示を付した飲食品であってもよい。
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶に多く含まれており、安全性の高い抗ウイルス剤として用いることができ、中でも、インフルエンザウイルスの型、亜型に依存せずに抗インフルエンザウイルス剤として、幅広く用いることができる。緑茶中のエピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、新型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型）を含めた種々の型のウイルスに対し、感染予防作用を示し、型に関係なくウイルス感染に有効であることから、緑茶がインフルエンザの予防に有効であることが示唆される。
【００１８】
飲食品として好ましい形態は、飴、ゼリー、錠菓、飲料、スープ、麺、煎餅、和菓子、冷菓、焼き菓子等の食品や飲料であり、好ましくは、果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料（緑茶飲料を含む）、コーヒー飲料、スポーツドリンク等の容器詰飲料である。
【００１９】
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含め緑茶成分は、飲食品として、液状又は固形形態で経口投与により摂取することが可能であり、それ自体又は適宜製剤上の都合で賦形剤等と混合して粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の形態で投与することができる。
【００２０】
該緑茶成分を飲料に含有させる場合は、緑茶成分を添加した飲料であってもよく、緑茶抽出物として、緑茶葉から抽出した液を飲料として用いてもよい。該緑茶成分の含有量としては、特に限定されるものではないが、有効成分含量として、例えば、５ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであることが好適であるが、好ましくは５ｐｐｍ〜５００００ｐｐｍ、より好ましくは２０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍである。
緑茶成分の植物体からの抽出方法としては、特に限定されないが、例えば、植物体が茶である場合を例示すると、熱水等に茶葉を浸すことにより抽出する方法や、植物体の乾燥粉末を熱水等に懸濁させることにより抽出する方法が挙げられる。抽出液自体をそのまま茶飲料として抗ウイルス剤として用いてもよく、また、抽出液からエピガロカテキンガレートやエラジタンニンなどの緑茶成分を分離・精製して抗ウイルス剤として用いてもよい。
【００２１】
緑茶成分は、医薬品として、薬学的に許容可能な賦形剤を添加して、医薬製剤として用いることができる。
医薬製剤としては、粉末、顆粒、錠剤等の公知の剤型に製剤化して用いることができ、液体、ペースト等の液剤として用いることもできる。
【００２２】
医薬製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、チュアブル、トローチ等の経口剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤等の外用剤、注射剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、坐剤などの剤型として用いることができる。
【００２３】
医薬製剤は、動物、中でも哺乳類において、抗ウイルス剤として有用であり、動物、中でも哺乳類に投与することができる。
哺乳類としては、ヒトや、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等の家畜動物などが挙げられ、ヒトであることが好ましい。
【００２４】
本発明の緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤は、緑茶成分の下記摂取量又は投与量を達成できるように、飲食品として又は医薬品として、他の添加物と適宜混合した抗ウイルス組成物とすることができる。
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含め、緑茶成分の摂取量又は投与量は、用途に応じて適宜調整することができるが、好ましくは１回１ｍｇ〜１００００ｍｇであり、より好ましくは１回５ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１回１０ｍｇ〜５００ｍｇである。
摂取回数又は投与回数は、特に限定されないが、好ましくは１日１〜３回であり、必要に応じて摂取回数を増減してもよい。
【００２５】
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤は、ウイルス性疾患の予防又は治療に用いることができる。
ウイルスとしては、ヒトパラインフルエンザウイルスや、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等のエンベロープを持つウイルスなどが挙げられる。
中でも、本発明の抗ウイルス剤は、抗インフルエンザウイルス剤としてインフルエンザの予防又は治療に用いることができる。緑茶成分は、茶に含まれる成分でもあるので、インフルエンザの予防作用を有する安全性が高い抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として用いることができる。また、本発明における緑茶成分を含有する飲食品、例えば、緑茶等を、日常的に摂取することにより、インフルエンザの予防に有効である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
以下の実験で用いたインフルエンザウイルスは、以下のように調製した。
１０日目の発育鶏卵の漿尿腔にウイルスを接種し、３４℃で２日間培養し、さらに４℃で一晩放置後、ウイルスを含む漿尿液を得た。この漿尿液を４℃、３０００ｒｐｍ(日立ＳＣＲ２０Ｂ遠心機，ＲＰＲ９ローター)で細胞片を除去後、上清を４℃、８５００ｒｐｍ(日立ＳＣＲ２０Ｂ遠心機，ＲＰＲ９ローター)で３時間遠心分離した。上清を除去して得られたペレットをリン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ，１４ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，２．７ｍＭ ＫＣｌをｐＨ７．２で含む。以下、該リン酸緩衝液を「ＰＢＳ」と記載する場合がある。)で懸濁して濃縮ウイルスを得た。この濃縮ウイルスを５０％（ｖ／ｖ）グリセロール−ＰＢＳ溶液に重層したショ糖密度勾配遠心法により、４℃、３８０００ｒｐｍ(日立ＣＰ６５Ｂ超遠心機，Ｐ４０ＳＴローター)で２時間遠心して、ウイルスのバンドを分離した。分離して得られた精製ウイルスを以下の実験で用いた。
精製濃縮したウイルスは、ＨＳＦＭ（場合により、ストリクチニン等を含んでもよい）に懸濁させて以下用いた。
ヒトインフルエンザウイルス株として、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（以下、「Ａ／ＰＲ／８／３４」と記載する場合がある。）を使用した。トリインフルエンザウイルス株として、Ａ／ｄｕｃｋ／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）を、豚インフルエンザウイルス株として、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１０／８５を使用した。
【００２８】
赤血球凝集活性（ＨＡＵ）の測定は以下のとおりに行った。
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３９１１ Ｔｅｓｔ３ＴＭ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ）にＰＢＳ（５０μＬ）を加え精製ウイルスを倍々希釈した。０．５％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球−ＰＢＳ懸濁液（５０μＬ）を加え、３０秒間振とう後、４℃で２時間静置して凝集像を観察した。赤血球凝集活性（ＨＡＵ）は赤血球の凝集が認められた最高希釈倍数で表した。
【００２９】
（１−１．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＡ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性を、以下のプロトコール１〜４の方法に従って反応させて、感染細胞からの上清中のウイルス感染価をｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。プロトコール１〜４の詳細を、図２及び以下に示す。
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞（国立遺伝学研究所より分与されたものを用いた。）を５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（バイオロジカルインダストリー）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ：ニッスイ製薬）で培養した。
【００３０】
プロトコール１では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、３７℃で、１２時間培養して、該細胞をプレートに接着させた。ＰＢＳを加え、上清を除去することにより３回洗浄を行った。洗浄後、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニン（長良サイエンス）を含有するＨＳＦＭ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＰＭ，インビトロジェン）とウイルスの混合液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、０−５０μＭの同濃度のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭで同様に洗浄し、次いで、０−５０μＭの同濃度のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１２時間反応させた。
【００３１】
プロトコール２では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭとウイルスの混合液を加え、ウイルス吸着のために、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、プロトコール１での０μＭのストリクチニンの場合と同様に（ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭで）、３７℃で１時間、次いで、洗浄後、３７℃で１２時間反応させた。
【００３２】
プロトコール３では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭとウイルスの混合液（１００μＬ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、ウイルス取り込みのために、３７℃で１時間反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で同様に洗浄し、次いで、ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１２時間反応させた。
【００３３】
プロトコール４では、１２ｗｅｌｌプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ストリクチニンを含有しない、ＨＳＦＭとウイルスの混合液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１時間、反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で同様に洗浄し、次いで、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、ウイルス複製のために、３７℃で１２時間反応させた。
【００３４】
ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイは、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２００９，３２，１１８８−１１９２の方法により、.以下のように行った。
ウイルスと反応させたＭＤＣＫ細胞を３０秒間、氷冷メタノールで固定化し、メタノールを除去後、ＰＢＳで４倍に希釈した抗ＮＰモノクローナル抗体溶液（ＭＡｂ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００８，８２，５９４０−５９５０に記載の方法により、マウスにインフルエンザウイルスを免疫し、脾臓細胞を採取し、一般的な方法でハイブリドーマを作製し、ＭＡｂを得た。）と３０分間反応した。次いで、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・イムノ・リサーチ、ＰＢＳで３０００倍希釈した。）を加え、室温で３０分間培養した。ウイルス感染した細胞を、ＤＥＰＤＡ発色液（１．２ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩、０．００３％ 過酸化水素、２ｍＭ ４−クロロ−１−ナフトールを含む１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を５０μＬ添加して検出した。全ての画像は、ＯＬＹＭＰＵＳ ＳＺＸ７を用いて、拡大倍率１２倍で、フォトショップソフトウェアを用いてウイルス感染細胞をカウントした。
【００３５】
プロトコール１−３でのウイルス価の測定結果（ｎ数＝３）を、図３に示す。
【００３６】
ＥＧＣＧ（長良サイエンス）とストリクチニンを用いてプロトコール１の方法と同様に培養を行って、抗インフルエンザウイスル活性を測定した。
プロトコール１での、ストリクチニン、ＥＧＣＧの測定結果（ｎ数＝３）を図４に示す。
【００３７】
プロトコール１に従い、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）に代えて他のインフルエンザウイルスを用いて測定したストリクチニンの阻害活性を表１に示す。また、ストリクチニンに代えて、ＥＧＣＧ、アマンタジンについても同様にの抗インフルエンザウイルス活性を測定した。その結果を表１に示す。測定はそれぞれ３回行った。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（１−２．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＡ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性をｖｅｒｏ細胞を用いて、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。
ｖｅｒｏ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターから入手したものを用いた）を５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（バイオロジカルインダストリー）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ培地（ニッスイ製薬）で培養した。
１２ｗｅｌｌプレートに、培養したｖｅｒｏ細胞を約１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ｖｅｒｏ細胞は、ウイルスと共に、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭと３７℃で４８時間反応させた。
ウイルス感染した細胞を、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。測定結果を図５に示す。測定はそれぞれ２回行った。
【００４０】
（１−３．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＢ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性をｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。
１２ｗｅｌｌプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．０×１０5細胞／ｗｅｌｌで加え、Ｂ型株（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）を０．００１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ＭＤＣＫ細胞は、ウイルスを含むプレ培養混合物と共に、様々な濃度（０−３０μＭ）のストリクチニンと３４℃で１時間反応させた。ＨＳＦＭでＭＤＣＫ細胞を洗浄した。そして、０−３０μＭの同濃度のストリクチニン、１．２％のアビセル（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、２μｇ／ｍＬのアセチル化トリプシンを含有するＨＳＦＭで３４℃で４８時間培養した。
ウイルス感染した細胞を、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。測定結果（ｎ数＝３）を図６に示す。
【００４１】
ストリクチニンのＭＤＣＫ細胞に対する細胞障害性は、死細胞から放出されるラクトースデヒドロゲナーゼ活性を測定することにより測定した。
ストリクチニンは、０−２００μＭの用量範囲でＭＤＣＫ細胞に対して、細胞障害性を示さなかった。
【００４２】
上記実験により、緑茶成分である、エピガロカテキンガレートや、エラジタンニンの１種であるストリクチニンが抗インフルエンザウイルス阻害活性を有することが分かった。また、ストリクチニンは、細胞へのウイルス感染時に添加することにより、Ａ型インフルエンザウイルスの複製を用量依存的に阻害することが分かった。また、ストリクチニンは、インフルエンザウイルス細胞への付着・侵入時の感染初期の段階を阻害すると考えられ、斯かる阻害作用によりストリクチニンは従来にない強力な阻害活性を有するものである。また、ストリクチニンを用いて該作用を利用した抗インフルエンザウイルス阻害作用を有する化合物のスクリーニングにおいても用いることができる。また、ストリクチニンは、Ｂ型インフルエンザウイルスに対しても阻害活性を有することが確認された。ストリクチニン及びエピガロカテキンガレートなどの緑茶成分は、表１に示されているように、広範な亜型のインフルエンザウイルスに対しても阻害活性を有するので、高病原性トリインフルエンザのＨ５Ｎ１型ウイルスや、ブタインフルエンザのＨ１Ｎ１型ウイルス等に対しても阻害活性を有すると考えられる。また、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれの型に対してもインフルエンザの阻害活性を有するものであり、かつ、感染初期の段階を阻害する作用メカニズムから、インフルエンザ予防剤として有効である。
また、本実施例により、緑茶がインフルエンザの予防に有効であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明において、緑茶成分は抗ウイルス作用を有する。中でも、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、医薬品及び食品用の抗インフルエンザ予防・治療剤として産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤に関する。具体的には、本発明は、緑茶成分を有効成分とする抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新興ウイルス等がパンデミックに蔓延することもあり、ウイルス感染症が世界的な問題となっている。
中でも、インフルエンザウイルスによるインフルエンザは、世界で最も広く存在する人獣共通感染症の一つであり、新型インフルエンザウイルスがひとたび出現すると、短期間で人命が失われるだけでなく社会機能に甚大な影響を与える。
加えて、近年、ブタインフルエンザの国内発症、死者が認められ、更なる感染拡大が予想されている。
【０００３】
インフルエンザの予防としては、ワクチン接種が主なものであり、インフルエンザの治療としては、ノイラミニダーゼ阻害薬やアマンタジン等が用いられている。
また、特許文献１には、抗ウイルス活性を持つ、カテキン等のフラボノイド単位を含む構造を持つプロアントシアニジンポリマー組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３４４８０５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、インフルエンザワクチン等のウイルスに対するワクチンは、抗原の絶えざる変異に対応する必要があり、その開発に時間と手間がかかるのが現状である。
また、従来の抗ウイルス剤に対しては、耐性を持つウイルスが出現している。
【０００６】
そこで、抗原性に依存せずウイルスの感染を防ぎ、さらに人体に対し、有害な副作用を持たず安定して使用できる薬剤の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、緑茶成分を有効成分とする新規な抗ウイルス剤を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
［１］
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
［２］
前記緑茶成分が、エラジタンニン、エピガロカテキンガレート、及びそれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］
前記エラジタンニンがストリクチニンである、［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、［１］〜［３］のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
［５］
前記インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１型である、［４］に記載の抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新たな抗ウイルス剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ストリクチニンの構造式を示す。
【図２】ストリクチニンの抗インフルエンザウイルス活性の測定方法のプロトコールを示す。図中、プロトコール１〜４については、ストリクチニンを加えて反応を行った部分のみを示しており、ストリクチニンを加えていない部分は、全てｃｏｎｔｒｏｌと同条件で反応を行った。
【図３】図３Ａは、プロトコール１（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）及びプロトコール２（Ｅｎｔｒｙ）により反応した際の、抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。 図３Ｂは、プロトコール３により反応した際の、抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。
【図４】プロトコール１により反応した際の、ストリクチニン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、阻害率を、横軸は各化合物の濃度を示す。
【図５】ｖｅｒｏ細胞に感染させた場合の抗インフルエンザウイルス活性の測定結果を示す。縦軸は、ウイルス価を、横軸はストリクチニンの濃度を示す。
【図６】Ｂ型株（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）に対する抗インフルエンザ活性の測定結果を示す。縦軸は、感染率を、横軸は、ストリクチニンの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
本発明の抗ウイルス剤は、緑茶成分を有効成分として含有するものである。
本発明において、緑茶成分とは、緑茶に含まれる成分をいい、緑茶原料（例えば、茶葉）から抽出して得られた成分である。
緑茶成分として、エピガロカテキンガレートやストリクチニンのように緑茶に含まれる成分としての化合物であってもよく、緑茶原料から従来公知の方法により抽出して得られた緑茶抽出物であってもよい。緑茶自体を本発明の抗ウイルス剤として用いることもできる。また、緑茶成分として、エピガロカテキンガレートやストリクチニン以外のフラボノイド等の緑茶含有成分を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明において、「エピガロカテキンガレート」とは、エピガロカテキンと、没食子酸とのエステルであり、エピガロカテキンガレートの薬学的に許容可能な塩とは、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム等のアルカリ土類金属とエピガロカテキンガレートとの塩、エピガロカテキンガレートのアンモニウム塩等の４級アンモニウム塩などが挙げられる。
エピガロカテキンガレートとしては、生体内においてエピガロカテキンガレートを放出するプロドラッグであってもよい。
【００１４】
本発明において、「エラジタンニン」とは、糖類と、没食子酸の二量体であるエラグ酸とを加水分解産物として分子内に有する化合物を意味し、加水分解性タンニンとも呼ばれる。
エラジタンニンとしては、例えば、ストリクチニン、ゲラニイン、ケブリン酸、エラエオカルプシン、ケブラグ酸、コリラギン、エンブリカニン、プニグルコニン、ペデュンキュラギン、コルヌシイン Ａ、アグリモニイン、テリマグランジン、カスアリクチン、ルゴシン Ｃ、カスアリニン等が挙げられる。
エラジタンニンの薬学的に許容可能な塩とは、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム等のアルカリ土類金属とエラジタンニンとの塩、エラジタンニンのアンモニウム塩等の４級アンモニウム塩などが挙げられる。
エラジタンニンとしては、生体内においてエラジタンニンを放出するプロドラッグであってもよい。
【００１５】
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶等に広く含まれている成分であり、安全性が高い。
本発明で用いられるエピガロカテキンガレートやエラジタンニンとしては、安全性の観点から、緑茶葉の抽出物としてのエピガロカテキンガレートやエラジタンニンであってもよい。エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、市販品を用いてもよく、従来公知の方法により緑茶原料から抽出したものを用いてもよい。また、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含む緑茶葉抽出物として用いてもよい。さらに、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶葉以外の他の植物体などから得られたものであってもよい。
【００１６】
本発明の抗ウイルス剤は、飲食品又は医薬品として用いることができる。
【００１７】
エラジタンニンやエピガロカテキンガレートなどの緑茶成分は、飲食品として、特定保健用食品、栄養機能性食品、健康食品、機能性食品、健康補助食品等として利用できる他、清涼飲料水や食品の配合剤などとして利用することができる。また、既存の食品に緑茶成分を添加した強化食品であってもよい。
飲食品は、抗ウイルス作用を有する旨の表示を付した飲食品であってもよい。
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、緑茶に多く含まれており、安全性の高い抗ウイルス剤として用いることができ、中でも、インフルエンザウイルスの型、亜型に依存せずに抗インフルエンザウイルス剤として、幅広く用いることができる。緑茶中のエピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、新型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１型）を含めた種々の型のウイルスに対し、感染予防作用を示し、型に関係なくウイルス感染に有効であることから、緑茶がインフルエンザの予防に有効であることが示唆される。
【００１８】
飲食品として好ましい形態は、飴、ゼリー、錠菓、飲料、スープ、麺、煎餅、和菓子、冷菓、焼き菓子等の食品や飲料であり、好ましくは、果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料（緑茶飲料を含む）、コーヒー飲料、スポーツドリンク等の容器詰飲料である。
【００１９】
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含め緑茶成分は、飲食品として、液状又は固形形態で経口投与により摂取することが可能であり、それ自体又は適宜製剤上の都合で賦形剤等と混合して粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の形態で投与することができる。
【００２０】
該緑茶成分を飲料に含有させる場合は、緑茶成分を添加した飲料であってもよく、緑茶抽出物として、緑茶葉から抽出した液を飲料として用いてもよい。該緑茶成分の含有量としては、特に限定されるものではないが、有効成分含量として、例えば、５ｐｐｍ〜６００ｐｐｍであることが好適であるが、好ましくは５ｐｐｍ〜５００００ｐｐｍ、より好ましくは２０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍである。
緑茶成分の植物体からの抽出方法としては、特に限定されないが、例えば、植物体が茶である場合を例示すると、熱水等に茶葉を浸すことにより抽出する方法や、植物体の乾燥粉末を熱水等に懸濁させることにより抽出する方法が挙げられる。抽出液自体をそのまま茶飲料として抗ウイルス剤として用いてもよく、また、抽出液からエピガロカテキンガレートやエラジタンニンなどの緑茶成分を分離・精製して抗ウイルス剤として用いてもよい。
【００２１】
緑茶成分は、医薬品として、薬学的に許容可能な賦形剤を添加して、医薬製剤として用いることができる。
医薬製剤としては、粉末、顆粒、錠剤等の公知の剤型に製剤化して用いることができ、液体、ペースト等の液剤として用いることもできる。
【００２２】
医薬製剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、チュアブル、トローチ等の経口剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤等の外用剤、注射剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、坐剤などの剤型として用いることができる。
【００２３】
医薬製剤は、動物、中でも哺乳類において、抗ウイルス剤として有用であり、動物、中でも哺乳類に投与することができる。
哺乳類としては、ヒトや、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等の家畜動物などが挙げられ、ヒトであることが好ましい。
【００２４】
本発明の緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤は、緑茶成分の下記摂取量又は投与量を達成できるように、飲食品として又は医薬品として、他の添加物と適宜混合した抗ウイルス組成物とすることができる。
エピガロカテキンガレートやエラジタンニンを含め、緑茶成分の摂取量又は投与量は、用途に応じて適宜調整することができるが、好ましくは１回１ｍｇ〜１００００ｍｇであり、より好ましくは１回５ｍｇ〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１回１０ｍｇ〜５００ｍｇである。
摂取回数又は投与回数は、特に限定されないが、好ましくは１日１〜３回であり、必要に応じて摂取回数を増減してもよい。
【００２５】
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤は、ウイルス性疾患の予防又は治療に用いることができる。
ウイルスとしては、ヒトパラインフルエンザウイルスや、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等のエンベロープを持つウイルスなどが挙げられる。
中でも、本発明の抗ウイルス剤は、抗インフルエンザウイルス剤としてインフルエンザの予防又は治療に用いることができる。緑茶成分は、茶に含まれる成分でもあるので、インフルエンザの予防作用を有する安全性が高い抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として用いることができる。また、本発明における緑茶成分を含有する飲食品、例えば、緑茶等を、日常的に摂取することにより、インフルエンザの予防に有効である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
以下の実験で用いたインフルエンザウイルスは、以下のように調製した。
１０日目の発育鶏卵の漿尿腔にウイルスを接種し、３４℃で２日間培養し、さらに４℃で一晩放置後、ウイルスを含む漿尿液を得た。この漿尿液を４℃、３０００ｒｐｍ(日立ＳＣＲ２０Ｂ遠心機，ＲＰＲ９ローター)で細胞片を除去後、上清を４℃、８５００ｒｐｍ(日立ＳＣＲ２０Ｂ遠心機，ＲＰＲ９ローター)で３時間遠心分離した。上清を除去して得られたペレットをリン酸緩衝液（１３１ｍＭ ＮａＣｌ，１４ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4，１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，２．７ｍＭ ＫＣｌをｐＨ７．２で含む。以下、該リン酸緩衝液を「ＰＢＳ」と記載する場合がある。)で懸濁して濃縮ウイルスを得た。この濃縮ウイルスを５０％（ｖ／ｖ）グリセロール−ＰＢＳ溶液に重層したショ糖密度勾配遠心法により、４℃、３８０００ｒｐｍ(日立ＣＰ６５Ｂ超遠心機，Ｐ４０ＳＴローター)で２時間遠心して、ウイルスのバンドを分離した。分離して得られた精製ウイルスを以下の実験で用いた。
精製濃縮したウイルスは、ＨＳＦＭ（場合により、ストリクチニン等を含んでもよい）に懸濁させて以下用いた。
ヒトインフルエンザウイルス株として、Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈｉｚｕｏｋａ／８３８／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（以下、「Ａ／ＰＲ／８／３４」と記載する場合がある。）を使用した。トリインフルエンザウイルス株として、Ａ／ｄｕｃｋ／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）を、豚インフルエンザウイルス株として、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／１０／８５を使用した。
【００２８】
赤血球凝集活性（ＨＡＵ）の測定は以下のとおりに行った。
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３９１１ Ｔｅｓｔ３ＴＭ Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ）にＰＢＳ（５０μＬ）を加え精製ウイルスを倍々希釈した。０．５％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球−ＰＢＳ懸濁液（５０μＬ）を加え、３０秒間振とう後、４℃で２時間静置して凝集像を観察した。赤血球凝集活性（ＨＡＵ）は赤血球の凝集が認められた最高希釈倍数で表した。
【００２９】
（１−１．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＡ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性を、以下のプロトコール１〜４の方法に従って反応させて、感染細胞からの上清中のウイルス感染価をｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。プロトコール１〜４の詳細を、図２及び以下に示す。
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞（国立遺伝学研究所より分与されたものを用いた。）を５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（バイオロジカルインダストリー）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ：ニッスイ製薬）で培養した。
【００３０】
プロトコール１では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、３７℃で、１２時間培養して、該細胞をプレートに接着させた。ＰＢＳを加え、上清を除去することにより３回洗浄を行った。洗浄後、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニン（長良サイエンス）を含有するＨＳＦＭ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＰＭ，インビトロジェン）とウイルスの混合液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、０−５０μＭの同濃度のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、３７℃で１時間反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭで同様に洗浄し、次いで、０−５０μＭの同濃度のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１２時間反応させた。
【００３１】
プロトコール２では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭとウイルスの混合液を加え、ウイルス吸着のために、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、プロトコール１での０μＭのストリクチニンの場合と同様に（ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭで）、３７℃で１時間、次いで、洗浄後、３７℃で１２時間反応させた。
【００３２】
プロトコール３では、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭとウイルスの混合液（１００μＬ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、ウイルス取り込みのために、３７℃で１時間反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で同様に洗浄し、次いで、ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１２時間反応させた。
【００３３】
プロトコール４では、１２ｗｅｌｌプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．５×１０4細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ストリクチニンを含有しない、ＨＳＦＭとウイルスの混合液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を、氷浴で１時間、ＭＤＣＫ細胞と反応させた。未吸着のウイルスを除くために、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）でＭＤＣＫ細胞を３回以上洗浄した。そして、ストリクチンンを含有しない、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）と３７℃で１時間、反応させた。その後、ＭＤＣＫ細胞は、ＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）で同様に洗浄し、次いで、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭ（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え、ウイルス複製のために、３７℃で１２時間反応させた。
【００３４】
ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイは、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２００９，３２，１１８８−１１９２の方法により、.以下のように行った。
ウイルスと反応させたＭＤＣＫ細胞を３０秒間、氷冷メタノールで固定化し、メタノールを除去後、ＰＢＳで４倍に希釈した抗ＮＰモノクローナル抗体溶液（ＭＡｂ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００８，８２，５９４０−５９５０に記載の方法により、マウスにインフルエンザウイルスを免疫し、脾臓細胞を採取し、一般的な方法でハイブリドーマを作製し、ＭＡｂを得た。）と３０分間反応した。次いで、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・イムノ・リサーチ、ＰＢＳで３０００倍希釈した。）を加え、室温で３０分間培養した。ウイルス感染した細胞を、ＤＥＰＤＡ発色液（１．２ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩、０．００３％ 過酸化水素、２ｍＭ ４−クロロ−１−ナフトールを含む１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を５０μＬ添加して検出した。全ての画像は、ＯＬＹＭＰＵＳ ＳＺＸ７を用いて、拡大倍率１２倍で、フォトショップソフトウェアを用いてウイルス感染細胞をカウントした。
【００３５】
プロトコール１−３でのウイルス価の測定結果（ｎ数＝３）を、図３に示す。
【００３６】
ＥＧＣＧ（長良サイエンス）とストリクチニンを用いてプロトコール１の方法と同様に培養を行って、抗インフルエンザウイスル活性を測定した。
プロトコール１での、ストリクチニン、ＥＧＣＧの測定結果（ｎ数＝３）を図４に示す。
【００３７】
プロトコール１に従い、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）に代えて他のインフルエンザウイルスを用いて測定したストリクチニンの阻害活性を表１に示す。また、ストリクチニンに代えて、ＥＧＣＧ、アマンタジンについても同様にの抗インフルエンザウイルス活性を測定した。その結果を表１に示す。測定はそれぞれ３回行った。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（１−２．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＡ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性をｖｅｒｏ細胞を用いて、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。
ｖｅｒｏ細胞（理化学研究所バイオリソースセンターから入手したものを用いた）を５％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（バイオロジカルインダストリー）及び５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ培地（ニッスイ製薬）で培養した。
１２ｗｅｌｌプレートに、培養したｖｅｒｏ細胞を約１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌで加え、Ａ型Ｈ３Ｎ２株（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１）を１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ｖｅｒｏ細胞は、ウイルスと共に、様々な濃度（０−５０μＭ）のストリクチニンを含有するＨＳＦＭと３７℃で４８時間反応させた。
ウイルス感染した細胞を、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。測定結果を図５に示す。測定はそれぞれ２回行った。
【００４０】
（１−３．抗インフルエンザウイルス活性）
ストリクチニンのＢ型インフルエンザウイルスに対する抗インフルエンザウイルス活性をｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。
１２ｗｅｌｌプレートに培養したＭＤＣＫ細胞を約１．０×１０5細胞／ｗｅｌｌで加え、Ｂ型株（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）を０．００１ＦＦＵ／細胞で反応させた。
ＭＤＣＫ細胞は、ウイルスを含むプレ培養混合物と共に、様々な濃度（０−３０μＭ）のストリクチニンと３４℃で１時間反応させた。ＨＳＦＭでＭＤＣＫ細胞を洗浄した。そして、０−３０μＭの同濃度のストリクチニン、１．２％のアビセル（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、２μｇ／ｍＬのアセチル化トリプシンを含有するＨＳＦＭで３４℃で４８時間培養した。
ウイルス感染した細胞を、ｆｏｃｕｓ−ｆｏｒｍｉｎｇアッセイにより測定した。測定結果（ｎ数＝３）を図６に示す。
【００４１】
ストリクチニンのＭＤＣＫ細胞に対する細胞障害性は、死細胞から放出されるラクトースデヒドロゲナーゼ活性を測定することにより測定した。
ストリクチニンは、０−２００μＭの用量範囲でＭＤＣＫ細胞に対して、細胞障害性を示さなかった。
【００４２】
上記実験により、緑茶成分である、エピガロカテキンガレートや、エラジタンニンの１種であるストリクチニンが抗インフルエンザウイルス阻害活性を有することが分かった。また、ストリクチニンは、細胞へのウイルス感染時に添加することにより、Ａ型インフルエンザウイルスの複製を用量依存的に阻害することが分かった。また、ストリクチニンは、インフルエンザウイルス細胞への付着・侵入時の感染初期の段階を阻害すると考えられ、斯かる阻害作用によりストリクチニンは従来にない強力な阻害活性を有するものである。また、ストリクチニンを用いて該作用を利用した抗インフルエンザウイルス阻害作用を有する化合物のスクリーニングにおいても用いることができる。また、ストリクチニンは、Ｂ型インフルエンザウイルスに対しても阻害活性を有することが確認された。ストリクチニン及びエピガロカテキンガレートなどの緑茶成分は、表１に示されているように、広範な亜型のインフルエンザウイルスに対しても阻害活性を有するので、高病原性トリインフルエンザのＨ５Ｎ１型ウイルスや、ブタインフルエンザのＨ１Ｎ１型ウイルス等に対しても阻害活性を有すると考えられる。また、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のいずれの型に対してもインフルエンザの阻害活性を有するものであり、かつ、感染初期の段階を阻害する作用メカニズムから、インフルエンザ予防剤として有効である。
また、本実施例により、緑茶がインフルエンザの予防に有効であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明において、緑茶成分は抗ウイルス作用を有する。中でも、エピガロカテキンガレートやエラジタンニンは、医薬品及び食品用の抗インフルエンザ予防・治療剤として産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記緑茶成分が、エラジタンニン、エピガロカテキンガレート、及びそれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記エラジタンニンがストリクチニンである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
前記インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１型である、請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１】
緑茶成分を有効成分として含有する抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記緑茶成分が、エラジタンニン、エピガロカテキンガレート、及びそれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記エラジタンニンがストリクチニンである、請求項２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
前記インフルエンザウイルスがＨ１Ｎ１型である、請求項４に記載の抗ウイルス剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１２６８３４（Ｐ２０１１−１２６８３４Ａ）
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８８４３１（Ｐ２００９−２８８４３１）
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【出願人】（５９１０１４９７２）株式会社 伊藤園 (213)
【出願人】（５０７２１９６８６）静岡県公立大学法人 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１８日（２００９．１２．１８）
【出願人】（５９１０１４９７２）株式会社 伊藤園 (213)
【出願人】（５０７２１９６８６）静岡県公立大学法人 (63)
【Ｆターム（参考）】
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