抗ウイルス蛋白質、そのＤＮＡコード配列およびその使用
【課題】抗ウイルス蛋白質（集合的にシアノビリンと称する）、その複合物、このような薬剤をコードするＤＮＡ配列、このようなＤＮＡ配列を含む宿主細胞、このような薬剤に対する抗体、このような薬剤を含む組成物およびこのような薬剤の取得および使用方法を提供する。
【解決手段】ノストック・エリプソスポラム由来の単離された抗ウィルスタンパク質、特にシアノピリン−Ｎとして知られる抗ウィルスタンパク質及びシュードモナス外毒素、ウィルスエンベロープタンパク質との複合物からなるウィルス感染阻害剤の提供。
【解決手段】ノストック・エリプソスポラム由来の単離された抗ウィルスタンパク質、特にシアノピリン−Ｎとして知られる抗ウィルスタンパク質及びシュードモナス外毒素、ウィルスエンベロープタンパク質との複合物からなるウィルス感染阻害剤の提供。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウイルス蛋白質（集合的にシアノビリンと称する）およびその複合物、それに対する抗体、それをコードするＤＮＡ配列、それを含む組成物、それを産生するように形質転換された宿主細胞、該細胞を含む組成物、並びにその使用方法および取得方法、特に抗ウイルス治療および予防などの臨床応用における当該方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は死に至る病であり、その報告症例は過去２０年間で劇的に増加した。ＡＩＤＳを引き起こすウイルスは１９８３年に初めて同定された。それはいくつかの名前と頭字語で知られている。ＡＩＤＳウイルスは３番目に知られたＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ-III）であり、免疫系の細胞内で複製する能力を有し、容赦のない細胞破壊を引き起こす。ＡＩＤＳウイルスはレトロウイルス、すなわち、複製中に逆転写酵素を使用するウイルスである。この特定のレトロウイルスはまた、リンパ腺症随伴ウイルス（ＬＡＶ）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）および、現在ではヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）としても知られている。現在までに際だって区別される２つのＨＩＶのファミリー、すなわち、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が記載されている。ここではＨＩＶという頭字語を、ＨＩＶウイルスを包括的に指すのに用いる。
【０００３】
ＨＩＶはＣＤ４陽性ヘルパー／インデューサーＴ細胞に対して激しい細胞変性効果を示し、それによって免疫系を激しく傷つける。ＨＩＶ感染はまた、結果として神経に悪化をきたし、最終的には感染した個体を死に至らしめる。世界中で何千万人もの人々がＨＩＶに感染し、有効な治療法がないので、それらのほとんどの人が死亡する運命にある。長い潜伏期間、最初の感染から症状が表れるまで、もしくはＡＩＤＳによる死亡までの期間に、感染者は、性的接触、静注薬物乱用中における汚染針交換、血液または血液製剤の点滴、あるいは胎児または新生児へのＨＩＶの母子感染によってさらに感染を拡大させる。したがって、既に感染した個体におけるＨＩＶ疾患の進行を妨げる有効な治療薬だけでなく、感染者から非感染者へのＨＩＶ感染の拡大を防ぐ方法が緊急に必要とされている。実際、世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＡＩＤＳの世界的流行のさらなる拡大を抑えるのに役立つ有効な抗ＨＩＶ性予防的殺ウイルス剤の探索を、緊急に国際的に優先させている（Balter，Science 266，1312-1313，1994; Merson，Science 260，1266-1268，1993; Taylor，J．NIH Res. 6，26-27，1994; Rosenberg ら，Sex．Transm．Dis. 20，41-44，1993; Rosenberg，Am．J．Public Health 82，1473-1478，1992）。
【０００４】
ウイルス治療学の分野は、レトロウイルス、とりわけＨＩＶに対して有効な薬剤の必要性に応じて発達してきた。ある薬剤が抗レトロウイルス活性を示す様式は数多くある（例えば、DeClercq，Adv．Virus Res. 42，1-55，1993; DeClercq,J．Acquir．Immun．Def．Synd. 4，207-218，1991; Mitsuyaら，Science 249，1533-1544，1990を参照）。ＡＺＴのようにウイルス逆転写酵素を阻害するヌクレオシド誘導体は、抗ＨＩＶ治療に現在市販されている数少ない臨床上有効な薬剤の中の一つである。ＡＺＴおよび関連化合物はある患者においては非常に有用であるが、その毒性と、十分に適した治療を行うには治療指針が不十分であることのために、その有用性には限度がある。また、より最近、ＨＩＶ感染のダイナミックスが明らかになったので（Coffin，Science 267，483-489，1995; Cohen，Science 267，179，1995; Perelson ら，Science 271，1582-1586，1996）、ウイルスにより誘導される感染細胞の殺傷に応答して生体中に生じる新生の非感染免疫細胞の感染を阻害するには、ウイルスの複製サイクルのできるだけ早い時期に作用する薬剤が必要であることが今だんだん明らかになってきている。また、感染細胞によって産生される感染力のある新しいウイルスを中和または阻害することが不可欠である。
【０００５】
ＨＩＶ−１および関連の霊長類免疫不全ウイルスによるＣＤ陽性細胞の感染は、各ウイルスエンベロープ糖蛋白質（集合的に「ｇｐ１２０」と称する）と細胞表面受容体ＣＤ４の相互作用に始まり、融合および侵入と続く（Sattentau，AIDS 2，101-105，1988; Koenigら，PNAS USA 86，2443-2447，1989）。生産的に感染したウイルス産生細胞はその細胞表面にｇｐ１２０を発現し、感染細胞のｇｐ１２０と非感染細胞上のＣＤ４の相互作用の結果、機能障害的な多細胞性のシンシチウムが形成され、さらにウイルス感染を拡大させる（Freed ら，Bull．Inst．Pasteur 88，73，1990）。したがって、ｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用は、最初のウイルスと細胞の結合を防ぐか、あるいは細胞と細胞の融合をブロックすることでＨＩＶ感染および細胞の発病を妨げる上で、特に魅力ある標的である（Capon ら，Ann．Rev．Immunol. 9，649-678，1991）。インビボでウイルスまたは感染細胞から流出したウイルスフリー即ち「可溶性の」ｇｐ１２０は、そうでなければ、中枢神経系を含めた全身での非感染性の免疫発病プロセスに寄与するかもしれないので、それもまた重要な治療上の標的である。（Capon ら，1991，上述; Lipton，Nature 367，113-114，1994）。多くのワクチン研究がｇｐ１２０に焦点を当ててきたが、ｇｐ１２０中和決定基の超可変性およびその結果として起こるｇｐ１２０指向性抗体に対するウイルスの感受性の著しい株依存性によって進歩が阻まれている。（Berzofsky，J．Acq．Immun．Def．Synd. 4，451-459，1991）。ｇｐ１２０に特に焦点を絞った薬剤の発見および開発研究は比較的少ない。顕著な例外は、切り詰められた組換え「ＣＤ４」蛋白質（「可溶性ＣＤ４」または「ｓＣＤ４」）に充てられてきた注目に値する努力であるが、それらはｇｐ１２０に結合してインビトロでのＨＩＶ感染力を阻害する（Capon ら，1991，上述; Schooleyら，Ann．Int．Med. 112，247-253，1990; Husson ら，J．Pediatr. 121，627-633，1992）。しかしながら、ＨＩＶの研究室株とは対照的に、臨床上の分離株はｓＣＤ４による中和に高い抵抗性を示すことが明らかになっている（Orloffら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 11，335-342，1995; Moore ら，J．Virol．66，235-243，1992）。ｓＣＤ４（Schooleyら，1990，上述; Hussonら，1992，上述）およびｓＣＤ４に連結された免疫グロブリン（Langner ら，Arch．Virol.130，157-170，1993）、さらにウイルス発現細胞に結合してそれを破壊するように設計されたｓＣＤ４に連結された毒素（Davey ら，J．Infect．Dis. 170，1180-1188，1994; Ramachandranら，J．Infect．Dis. 170，1009-1013，1994）の初期の臨床試験は期待に反するものであった。インビボで直接ｓＣＤ４を作りだそうとするより新しい遺伝子治療のアプローチ（Morganら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 10，1507-1515，1994）も同様に挫折を経験するであろう。
【０００６】
それ故、単独で、あるいはＡＺＴおよび／または他の利用可能な抗ウイルス剤との併用で用いられる新規抗ウイルス剤が、ＡＩＤＳに対する有効な抗ウイルス治療には必要である。ＨＩＶ感染を防ぐのに使用し得る新薬はまた予防にも重要である。必要とされるどちらの領域においても、理想的な新薬とは、ウイルスの生活環のできるだけ早い時期に作用し、できるだけウイルス特異的であり（すなわち、ウイルスに特異的な分子標的を攻撃するが、感染したまたは感染し得る動物宿主に特異的な分子標的を攻撃しない）、無傷ウイルスの感染力を無くし、ウイルスに感染した哺乳動物細胞の死または機能障害を防ぎ、感染細胞からのさらなるウイルス産生を防ぎ、非感染哺乳動物細胞へのウイルス感染の拡大を防ぎ、可能な限り広い範囲のＨＩＶの株および分離株に対して非常に強力で活性があり、生理学的および厳しい環境条件下で分解しにくく、容易に且つ安価に大量生産されるものであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前述の特に有利な特性を少なくとも幾つか有する抗ウイルス蛋白質およびその複合物、さらにそれを含有する組成物並びにその製造および使用方法を提供することを目的とする。本発明のこれらのおよび他の目的、並びに発明のさらなる特徴はここに与えられる記載から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗ウイルス剤、特に抗ウイルス蛋白質（集合的にシアノビリンと称する）およびその複合物を提供する。本発明はまた、シアノビリンおよびその複合物の取得方法、シアノビリンおよびその複合物をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む宿主細胞、シアノビリンを使用してエフェクター分子をウイルスにターゲッティングする方法および実質的に純粋なシアノビリンおよびその複合物の取得方法を提供する。シアノビリン、その複合物およびシアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞は、医薬組成物のように、さらに１またはそれ以上の他の抗ウイルス剤を含有することができる組成物中で使用することができる。本発明はまた、ウイルスに感染したかあるいは感染の危険のある動物、例えばヒトの治療的および／または予防的処置、並びにヒトなどの動物のウイルス感染を防ぐための、対象無生物（例えば医療用および実験用の装置および備品）さらに懸濁液および溶液（例えば血液、血液製剤および組織）の処置における、シアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞およびそれらの組成物の単独または他の抗ウイルス剤と組み合わせた使用を提供する。さらに本発明は、１またはそれ以上のシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞および／またはそれらの組成物の投与または適用を含む、ウイルスに感染したかあるいは感染の危険のある動物、例えばヒトの治療的または予防的処置方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、培養シアノバクテリア（藍藻）からのある特定の抽出物が抗ＨＩＶスクリーニングにおいて抗ウイルス活性を示したという観察に基づいている。該抗ＨＩＶスクリーニングは１９８６年に考案され（国立衛生研究所のＭ．Ｒ．ボイドによる）、１９８８年から合衆国国立ガン研究所（ＮＣＩ）で開発・実施されている（Boyd，in AIDS，Etiology，Diagnosis，Treatment and Prevention，DeVitaら編，Philadelphia: Lippincott，1988，pp．305-317 を参照）。
【００１０】
シアノバクテリア（藍藻）は構造的に独特で且つ生物学的に活性な、非常に多様な窒素を含まない、アミノ酸から誘導される天然産物を産生することが知られていたので、抗ＨＩＶスクリーニングに特に選ばれた（Faulkner，Nat．Prod．Rep. 11，355-394，1994; Glombitzaら，in Algal and Cyanobacterial Biotechnology，Cresswell，R.C.ら編，1989，pp．211-218）。これらの光合成原核生物は、しばしば肝臓毒性または抗微生物性を示す（Okino ら，Tetrahedron Lett．34，501-504，1993; Krishnamurthyら，PNAS USA 86，770-774，1989; Sivonen ら，Chem．Res．Toxicol. 5，464-469，1992; Carterら，J．Org．Chem. 49，236-241，1984; Frankmolle ら，J．Antibiot. 45，1451-1457，1992）環状および直鎖状ペプチド（分子量は一般に＜３ｋＤａ）の重要な産生体である。高分子量シアノバクテリア蛋白質の配列決定研究は、一般に基礎代謝プロセスに関連するものまたは系統分類学的マーカーとして役立ち得るものに焦点が絞られていた（Suter ら，FEBS Lett. 217，279-282，1987; Rumbeliら，FEBS Lett. 221，1-2,1987; Swanson ら，J．Biol．Chem. 267，16146-16154，1992; Michalowskiら，Nucleic Acids Res. 18，2186，1990; Shermanら，in The Cyanobacteria，Fay ら編，Elsevier: New York，1987，pp．1-33; Rogers，in The Cyanobacteria，Fay ら編，Elsevier: New York，1987，pp．35-67）。一般的にいって、抗ウイルス特性を有する蛋白質はシアノバクテリア源と結びつかない。
【００１１】
本発明を導くシアノバクテリア抽出物は、上記の抗ＨＩＶスクリーニングにおいて最初にランダムに選ばれ、やみくもに試験された何千もの異なる抽出物の中の一つであった。ＮＣＩのスクリーニングにおいて、これらの抽出物の多くが予備測定で抗ウイルス活性を示していた（Patterson ら，J．Phycol. 29，125-130，1993）。この群から、記載通りに（Patterson，1993,上述）調製され、ＮＣＩの一次スクリーニングにおいて異常に高い抗ＨＩＶ能およびインビトロでの「治療指数」を示したノストック・エリプソスポラム由来の水性抽出物を詳細な調査のために選んだ。ＨＩＶに対して非常に高活性な均質蛋白質を単離・精製するために、特定のバイオアッセイを指標とした戦略を用いた。
【００１２】
このバイオアッセイを指標とした戦略において、分画のための抽出物の最初の選択、さらに適用する全体的な化学的単離方法およびその中での個々の工程の性質についての決定は、生物学的試験のデータを解釈して取り決めた。単離および精製プロセスを導くのに用いられた抗ＨＩＶスクリーンアッセイ（例えばBoyd，1988，上述; Weislow ら，J．Natl．Cancer Inst. 81，577-586，1989）は、ＨＩＶの細胞変性効果からヒトＴ芽球様細胞を防御する度合を測定するものである。目的の抽出物の画分を多様な化学的手段を用いて調製し、一次スクリーニングにおいてはやみくもに試験する。活性画分をさらに分離して、得られた下位画分を同様にスクリーニングにおいてやみくもに試験する。このプロセスを活性化合物、すなわち、純粋な化合物に相当する抗ウイルス性画分を取得するのに必要なだけ何度も繰り返し、次いでそれを詳細な化学分析および構造解明に供することができる。
【００１３】
この戦略を用いると、ノストック・エリプソスポラムの水性抽出物は抗ウイルス蛋白質を含んでいることがわかった。本発明を記載するためにここで用いる「蛋白質」という語はいかなる特定の長さのアミノ酸配列にも限定されず、１００またはそれ以上のアミノ酸を含む分子、並びに１００より少ないアミノ酸を含む分子（時折、「ペプチド」と称される）が含まれることに留意すべきである。
【００１４】
したがって、本発明はノストック・エリプソスポラム由来の単離精製された抗ウイルス蛋白質、特にシアノビリン−Ｎとして知られる単離精製された抗ウイルス蛋白質を提供する。本発明はまた他のシアノビリンを提供する。「シアノビリン」という語は、ここでは、ノストック・エリプソスポラムから単離される天然の抗ウイルス蛋白質（「ネイティブシアノビリン」）およびあらゆる機能的に等価な蛋白質またはその誘導体を包括的にいうのに用いられる。
【００１５】
本発明において、このような機能的に等価な蛋白質またはその誘導体とは、（ａ）ネイティブシアノビリン（とりわけシアノビリン−Ｎ）中に含まれる９個の隣接するアミノ酸下位配列のいずれかと直接に相同な（好ましくは同一の）、少なくとも９個（好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも５０個）のアミノ酸配列を含み、（ｂ）抗ウイルス性である、詳細にはウイルス、特に霊長類免疫不全ウイルス、就中ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＳＩＶに特異的に結合し得るか、あるいは各ウイルスの１またはそれ以上のウイルス抗原、特にｇｐ１２０のようなエンベロープ糖蛋白質を発現する感染宿主細胞に特異的に結合し得るものである。さらに、このような機能的に等価な蛋白質またはその誘導体は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１，２，３，４または５個および最も好ましくは１または２個のアミノ酸が、ネイティブシアノビリンの一端または両端から、好ましくは一端のみから、最も好ましくはアミノ末端から除去されたネイティブシアノビリン、特にシアノビリン−Ｎ（配列番号２を参照）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のシアノビリンは、好ましくはノストック・エリプソスポラム由来の抗ウイルス蛋白質、特にネイティブシアノビリン、就中シアノビリン−Ｎのアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含む。本発明のシアノビリンに関し、「実質的に相同な」とは、シアノビリンを抗ウイルス性にするのに十分な相同性、好ましくはノストック・エリプソスポラムから単離された抗ウイルス蛋白質に特有の抗ウイルス活性を有するようにするのに十分な相同性を意味する。好ましくは少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７５％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在することである。
【００１７】
したがって、本発明は、特に配列番号１の配列を含む核酸分子、配列番号３の配列を含む核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子または配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質のように、シアノビリンのコード配列を含む核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、毒素または免疫学的試薬のような、１またはそれ以上の選ばれたエフェクター分子に連結されたシアノビリンを含むシアノビリン複合物を提供する。「免疫学的試薬」という語は、ここでは抗体、免疫グロブリンおよび免疫学的な認識要素をいうのに用いられる。免疫学的な認識要素とは、ペプチド、例えば組換えシアノビリン−ＦＬＡＧ融合蛋白質のＦＬＡＧ配列のように、免疫学的な認識を通じてそれが接着する蛋白質の単離および／または精製および／または解析を容易にする要素である。シアノビリン融合蛋白質はシアノビリン複合体の一類型であり、そこではシアノビリンは、望ましい特性またはエフェクター機能（例えば細胞毒性または免疫学的特性、あるいは該融合蛋白質の単離、精製もしくは解析を容易にするなどの他の望ましい特性）のいずれかを有する１またはそれ以上の他の蛋白質に連結されている。
【００１９】
本発明はまた、ノストック・エリプソスポラムからのシアノビリンの取得方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）抗ウイルス活性を含むノストック・エリプソスポラムの抽出物を同定し、（ｂ）該抽出物から任意に高分子量の生体高分子を除去し、（ｃ）抗ウイルスバイオアッセイをガイドに該抽出物を分画してシアノビリンの部分精製された抽出物を得、および（ｄ）部分精製された抽出物を逆相ＨＰＬＣによりさらに精製してシアノビリンを得ることを含む（実施例１を参照）。好ましくは、該方法は抽出物から高分子量の生体高分子を除去するためのエタノールの使用および該抽出物の分画を導くための抗ＨＩＶバイオアッセイの使用を含む。
【００２０】
シアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）のように、本発明の方法に従って単離および精製されたシアノビリンは、得られた純粋な蛋白質のアミノ酸配列を決定するのに典型的に用いられる慣用の手順に供することができる。すなわち、該シアノビリンは無傷蛋白質およびエンドプロテイナーゼ消化により生じる重複したペプチド断片のＮ末端エドマン分解によって配列決定することができる。アミノ酸分析はこの演繹された配列と一致するのが望ましい。同様に、還元されたＨＰＬＣ精製シアノビリン−ＮのＥＳＩ質量スペクトル分析は、計算値と一致した分子イオン値を示すのが望ましい。
【００２１】
これらの研究より、ノストック・エリプソスポラム由来のシアノビリン−Ｎが、以前に記載された蛋白質または公知のヌクレオチド配列の転写産物とほとんどもしくは全く有意な相同性を有しない１０１アミノ酸の独特な配列を含むことがわかった。シアノビリン由来のせいぜい８個の隣接するアミノ酸配列が公知蛋白質由来のアミノ酸配列のいくつかに見出されるにすぎず、シアノビリン−Ｎと１３％を越える配列相同性を含むいかなる起源のいかなる蛋白質も知られていない。シアノビリン−Ｎの化学的に演繹されたアミノ酸配列が得られたので、対応する組換えシアノビリン−Ｎ（ｒ−シアノビリン−Ｎまたはｒ−ＣＶ−Ｎ）が創製および使用されて、演繹されたアミノ酸配列が実際にＨＩＶのようなウイルスに対して有効であることが明確に証明された（実施例２〜５を参照）。
【００２２】
本発明はさらに、シアノビリン（特にネイティブシアノビリン、就中シアノビリン−Ｎ）をコードする配列を含む単離精製された核酸分子および合成核酸分子を提供する。このような核酸分子としては、配列番号１の配列を含む単離精製された核酸分子、配列番号３の配列を含む単離精製された核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離精製された核酸分子、配列番号４のアミノ酸配列をコードする単離精製された核酸分子および前記核酸分子のいずれか１つまたはそれ以上と実質的に相同な核酸分子が挙げられる。本発明の核酸分子に関して、「実質的に相同な」という語は、該核酸分子にコードされる蛋白質を抗ウイルス性にするのに十分な相同性、好ましくはノストック・エリプソスポラムから単離された抗ウイルス蛋白質に特有の抗ウイルス活性を有するようにするのに十分な相同性を意味する。好ましくは少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７５％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在することである。
【００２３】
本発明の核酸分子は、望ましくは配列番号２のアミノ酸配列の、少なくとも９個（好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも５０個）の隣接するアミノ酸をコードする核酸配列を含む。本発明の核酸分子はまた、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１，２，３，４または５個および最も好ましくは１または２個のアミノ酸が、ネイティブシアノビリンの一端または両端から、好ましくは一端のみから、最も好ましくはアミノ末端から除去されたネイティブシアノビリン、特にシアノビリン−Ｎのアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸配列を含む。
【００２４】
本開示によれば、部分的なシアノビリン−Ｎ遺伝子のコドン配列が、完全に機能的な、すなわち、抗ＨＩＶのような抗ウイルス性のシアノビリンをコードするにおそらく十分であろうことが当業者には明らかであろう。機能的なシアノビリンの最小の必須ＤＮＡコード配列は、例えばネイティブシアノビリンを含む下部配列を合成して評価したり、シアノビリン−ＮのＤＮＡコード配列の部位特異的突然変異誘発を研究することによって、当業者が容易に決定することができる。
【００２５】
適当なＤＮＡコード配列を用いて、組換えシアノビリンを遺伝子工学技術により作ることができる（例えば、一般的な背景については、Nicholl，in An Introduction to Genetic Engineering，Cambridge University Press: Cambridge，1994，pp．1-5および127-130; Steinbergら，in Recombinant DNA Technology Concepts and Biomedical Applications，Prentice Hall: Englewood Cliffs，NJ, 1993，pp．81-124 および150-162; Sofer，in Introduction to Genetic Engineering，Butterworth-Heinemann，Stoneham，MA，1991，pp．1-21 および103-126; Oldら，in Principles of Gene Manipulation，Blackwell Scientific Publishers: London，1992，pp．1-13 および108-221; Emtage，in Delivery Systemsfor Peptide Drugs, Davisら編，Plenum Press: New York，1986，pp．23-33 を参照）。例えば、シアノビリンをコードするノストック・エリプソスポラム遺伝子またはｃＤＮＡを同定しサブクローニングすることができる。次いで該遺伝子またはｃＤＮＡを適当な発現ベクター中に組み込み、適当な蛋白質合成生物（例えば、大腸菌、Ｓ．セレビシエ、Ｐ．パストリスまたは他の細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞）中に送達し、そこで該遺伝子を内因性または外因性プロモーターの制御下に適当に転写および翻訳させることができる。このような発現ベクター（ファージ、コスミド、ウイルスおよびプラスミドベクターを含むがこれに限定されない）は、遺伝子導入に適した試薬および技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、形質導入、マイクロインジェクション、形質転換、その他）と同様、当業者に知られている。その後、組換え生産された蛋白質を当該技術分野で公知の標準的技術（例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、溶解度分画法、等電点電気泳動、その他）を用いて単離および精製し、抗ウイルス活性を調べることができる。
【００２６】
あるいは、非組換え法（例えば、実施例１および前述の解説）によってネイティブシアノビリンをノストック・エリプソスポラムから取得し、慣用の技術により配列を決定することができる。次いで、該配列を用いて対応するＤＮＡを合成し、適当な発現ベクター中にサブクローニングして、所望の蛋白質の大量組換え生産用の蛋白質合成細胞中に送達することができる。
【００２７】
この点に関して、本発明はまた、本発明の核酸分子、例えばノストック・エリプソスポラムのシアノビリン遺伝子、シアノビリンをコードするｃＤＮＡまたはシアノビリンをコードする合成ＤＮＡ配列のようなＤＮＡ配列を含むベクターを提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞、並びにこのような宿主細胞を用いてシアノビリンを製造する方法を提供する。
【００２８】
単離精製されたものであれ合成であれ、シアノビリンをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡはシアノビリン全体またはその一部（望ましくはその抗ウイルス活性な部分）をコードしていればよい。該ＤＮＡまたはｃＤＮＡがネイティブシアノビリンの全コード配列を含まない場合、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡを遺伝子融合の一部としてサブクローニングすることができる。転写の際の遺伝子融合において、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡは蛋白質の適当な産生を指示する自身の制御配列（例えばリボソーム結合部位、翻訳開始コドン、その他）を含み、転写制御配列（例えば、プロモーター要素および／またはエンハンサー）はベクターによって提供されるであろう。翻訳の際の遺伝子融合においては、転写制御配列および翻訳制御排列の少なくとも幾つか（すなわち、翻訳開始コドン）がベクターによって提供されるであろう。翻訳の際の遺伝子融合の場合はキメラ蛋白質が産生されるだろう。
【００２９】
遺伝子はまた、機能的なシアノビリン成分に加えて複合蛋白質に付加的な所望の特性を与える融合成分を含む特定の融合蛋白質用に構築することもできる。例えば、上で定義した、毒素または免疫学的試薬の融合配列を、（例えば、実施例２〜５に記載されるＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質のような）機能的蛋白質の精製および解析を容易にするために付加することができる。
【００３０】
遺伝子は、ウイルス感染（例えばＨＩＶおよび／またはＨＩＶ感染）細胞に特異的にターゲッティングさせるために、毒素や免疫学的試薬のようなエフェクター蛋白質に連結されたシアノビリンを含む融合蛋白質をコードするように、特に構築することができる。このような例において、シアノビリン部分は中和剤として働くだけでなく、これらの分子のエフェクター活性をＨＩＶのような所定のウイルスに対して選択的に方向づけるターゲッティング剤としても働く。したがって、例えば、機能的シアノビリンのＨＩＶターゲッティング機能を感染力のあるウイルスの中和を目的とする毒素と組み合わせることにより、および／またはＨＩＶのような感染力のあるウイルスを産生する細胞を破壊することにより、治療薬を得ることができる。同様に、シアノビリンのウイルスターゲッティング機能を種々の免疫グロブリンサブクラスの多価性およびエフェクター機能と組み合わせた治療薬を得ることができる。実施例６は、さらにシアノビリンのウイルスターゲッティング、特にｇｐ１２０ターゲッティング特性を実証している。
【００３１】
同様の論理的根拠により、ｓＣＤ４のＨＩＶ ｇｐ１２０ターゲッティング特性を利用する広範な開発的治療努力が成されている。例えば、ｓＣＤ４をシュードモナス外毒素成分（Chaudhary ら，in The Human Retrovirus，Galloら編，Academic Press: San Diego，1991，pp．379-387; Chaudhary ら，Nature 335，369-372，1988）、ジフテリア毒素成分（Aullo ら，EMB0 J. 11，575-583，1992）
またはリシンＡ鎖成分（Tillら，Science 242，1166-1167，1988）に連結したｓＣＤ４−毒素複合物が調製されている。同様に、機能的ｓＣＤ４活性のインビボでのクリアランス速度を減少させ、胎盤による移送を増大させ、病原体除去（例えば、食作用的吸引および抗体依存的細胞媒介細胞毒性による殺傷）の免疫学的機構に的を絞った補強をもたらしてＨＩＶ感染細胞およびウイルスを殺傷および／または除去するために、ｓＣＤ４−免疫グロブリン複合物が調製されている（Capon ら，Nature 337，525-531，1989; Traunecker ら，Nature 339，68-70，1989; Langnerら，1993，上述）。このようなＣＤ４−免疫グロブリン複合物（時々「免疫接合体」と呼ばれる）は、実際インビボで有利な薬物動態学的および分布的特性を、またインビトロで抗ＨＩＶ効果を示したが、臨床試験は失望させるものであった（Schooleyら，1990，上述; Hussonら，1992，上述; Langner ら，1993，上述）。ＨＩＶの臨床上の分離株は研究室株とは反対にｓＣＤ４による結合および中和に対して非常に抵抗力があるので（Orloffら，1995，上述; Moore ら，1992，上述）、これは驚くべきことではない。それ故、機能的シアノビリンの異常に広範な抗ウイルス活性、並びにウイルス、例えば、一般に霊長類レトロウイルスおよび、特に臨床および研究室株へターゲッティングする特性（例えば、実施例７を参照）は、毒素、免疫グロブリンおよび他の選ばれたエフェクター蛋白質と組み合わせるのにとりわけ有利である。
【００３２】
ウイルスにターゲッティングされる複合物は、遺伝子工学技術（例えば、Chaudhary ら，1988，上述）またはターゲッティングさせる成分とエフェクター成分との化学的な連結によって調製することができる。所定のシアノビリン複合物または融合蛋白質を構築するのに用いられる最も実現可能で且つ適当な技術は、シアノビリンに連結するのに選択された特定のエフェクター分子の特性を考慮して選択されるであろう。例えば、非蛋白性のエフェクター分子と連結する場合には、遺伝子工学技術よりもむしろ化学的な連結が所望のシアノビリン複合物を創製するのに最もふさわしい選択である。
【００３３】
本発明はしたがって、シアノビリン融合蛋白質自身に加えてシアノビリン融合蛋白質をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は配列番号３およびそれと実質的に相同な配列を含む核酸分子を提供する。本発明はまた、シアノビリン融合蛋白質をコードする核酸配列を含むベクターおよびシアノビリン融合蛋白質をコードするベクターを上述の蛋白質合成生物中で発現させることによるシアノビリン融合蛋白質の取得方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、上述のような毒素または免疫学的試薬のようなエフェクター蛋白質をコードする第二の核酸に連結された、本発明の蛋白質をコードする第一の核酸配列、例えば、前述の本発明の核酸のうちの一つのようなシアノビリンのコード配列、を含む単離精製された核酸分子を提供する。本発明はまた、さらにこのような核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質を提供する。
【００３５】
連結された分子（複合物）は、望ましくはウイルスを、より好ましくはＨＩＶを、最も好ましくは糖蛋白質ｇｐ１２０をターゲッティングする。該連結は、上述のようにＤＮＡレベルでまたは化学的連結によりなされ得る。例えば、本発明のシアノビリン−エフェクター蛋白質複合物は、（ａ）所望のエフェクター蛋白質を選択し、（ｂ）エフェクター蛋白質、例えば毒素または免疫学的試薬の第二のＤＮＡコード配列に連結された、機能的シアノビリンをコードする前記核酸分子配列の一つを含む第一のＤＮＡコード配列を含む、複合ＤＮＡコード配列を合成し、（ｃ）適当な蛋白質合成生物中で該複合ＤＮＡコード配列を発現させ、（ｄ）所望の融合蛋白質を実質的に純粋な形態にまで精製することによって得ることができる。あるいは、本発明のシアノビリン−エフェクター分子複合物は、（ａ）所望のエフェクター分子およびシアノビリンまたはシアノビリン融合蛋白質を選択し、（ｂ）シアノビリンまたはシアノビリン融合蛋白質をエフェクター分子に化学的に連結し、（ｃ）所望のシアノビリン−エフェクター分子複合物を実質的に純粋な形態で単離することにより得ることができる。毒素、免疫学的試薬または他の機能的試薬のような所望のエフェクター成分に連結された機能的シアノビリンを含む複合物は、以下の観察にしたがえば、シアノビリンのユニークなｇｐ１２０ターゲッティング特性を利用してより特異的に設計することさえできる。
【００３６】
実施例６より、シアノビリンの新規ｇｐ１２０指向効果が明らかとなる。固相ＥＬＩＳＡ実験からさらなる洞察を得ることができる（Boydら，1996，未刊）。例えば、ｇｐ１２０のＣ末端ｇｐ１２０エピトープ特異的な捕捉あるいはＣＤ４受容体による捕捉はどちらも、ポリクローナルＨＩＶ−１−Ｉｇか免疫学的に優性な三番目の超可変（Ｖ３）エピトープ（Matsushitaら，J．Virol. 62，2107-2114，1988）に対するマウスＭＡｂのいずれかで検出されれば、シアノビリン−Ｎによって著しく阻害されることがわかるだろう。一般に、ＣＤ４受容体の使用はＶ３エピトープの抗体認識を妨げないし、その逆もまたしかりである（Moore ら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 4，369-379，1988; Matsushita ら，1988，上述）。しかしながら、複数の際だって区別される非重複エピトープにおける免疫反応性の消失により示されるように、シアノビリン−Ｎは、見かけ上ｇｐ１２０に対してより全体的な配座における効果を及ぼし得る。
【００３７】
種々の標的細胞における多様なＣＤ４陽性反応性免疫不全ウイルス株に対するシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性（Boydら，1996，上述）は顕著である。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの多様な株が同様にシアノビリン感受性であることを示すことができる。臨床上の分離株と研究室株とは典型的に、本質的に等価な感受性を示すであろう（さらなる説明については実施例７を参照）。慢性的に感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞および非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞をシアノビリン−Ｎと共培養することにより、該蛋白質はウイルス複製を阻害するのではなく、細胞と細胞の融合およびウイルス伝達の濃度依存的な阻害を引き起こすことがわかる。ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−ｂ−ガラクトシダーゼ細胞を用いた結合および融合阻害アッセイから得られた同様の結果は、ウイルスと細胞および／または細胞と細胞の結合のシアノビリン−Ｎによる阻害と一致することがわかるだろう（Boydら，1996，上述）。実施例８では、ＨＩＶ感染細胞を選択的にターゲッティングし、それを殺傷するシアノビリン−毒素複合物を与えるための、複合物のＤＮＡコード配列の構築およびその発現について説明する。
【００３８】
本発明のシアノビリンおよびその複合物の抗ウイルス、例えば抗ＨＩＶ活性は、ヒトにおける抗ウイルス活性を合理的に予測させる、相互に関係を持つ一連のインビトロ抗ウイルスアッセイにおいてさらに実証することができる（Gulakowskiら，J．Virol．Methods 33，87-100，1991）。これらのアッセイは、ヒト標的細胞におけるＨＩＶの複製および／またはＨＩＶの細胞変性効果を化合物が妨げる能力を測定するものである。これらの測定は、インビボでのＨＩＶが誘導する疾患の発病と直接相関がある。実施例５で説明し、また、図８，９および１０に示したシアノビリンまたは複合物の抗ウイルス活性の分析結果は、ヒトにおけるインビボでのこれらの産物の抗ウイルス活性を予見させるものであり、したがって、本発明の利用性をさらに証明するものである。また、本発明はシアノビリンまたは複合物の生体外（ex vivo）での使用方法を提供するので（例えば、実施例５および図６および７で説明される結果を参照）、シアノビリンおよびその複合物はより広範な利用性をも有する。
【００３９】
本発明のシアノビリンおよびその複合物は、ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス、すなわちＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のようなレトロウイルスを阻害することができるのがわかるだろう。本発明のシアノビリンおよび複合物は、他のレトロウイルスおよび他のウイルスを阻害するのにも用いることができる。本発明にしたがって処理することのできるウイルスの例としては、Ｃ型およびＤ型レトロウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ、ＦＬＶ、ＳＩＶ、ＭＬＶ、ＢＬＶ、ＢＩＶ、ウマ伝染性ウイルス、貧血症ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のようなトリ肉腫ウイルス、Ａ型、Ｂ型および非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス、アルボウイルス、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよび風疹ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
シアノビリンおよびその複合物は蛋白質を含んでおり、そのせいで特にアミド結合の加水分解（例えばペプチダーゼにより触媒される）および必須のジスルフィド結合の破壊または不活性化させるかもしくは望ましくないジスルフィド結合の形成を起こしやすい（Caroneら，J．Lab．Clin．Med. 100，1-14，1982）。必要であれば、シアノビリンおよびその複合物の安定性を増大させるために、分子構造を変化させる種々の方法があり（Wunsch，Biopolymers 22，493-505，1983;Samanen,in Polymeric Materials in Medication，Gebeleinら編，Plenum Press:New York，1985，pp．227-242）、幾つかの状況下においては、ウイルス、例えばＨＩＶに対する治療的および予防的適用のためにはシアノビリンまたはその複合物を含有する医薬組成物の調製および使用に、それが不可欠かもしれない。シアノビリンまたはその複合物の有用な化学修飾についての可能性のある選択として以下のもの（Samanen，J.M.，1985,上述を改変）が挙げられるが、それらに限定されない：（ａ）オレフィン置換、（ｂ）カルボニル還元、（ｃ）Ｄ−アミノ酸置換、（ｄ）Ｎ α−メチル置換、（ｅ）Ｃ α−メチル置換、（ｆ）Ｃ α−Ｃ’−メチレン挿入、（ｇ）デヒドロアミノ酸挿入、（ｈ）逆反転修飾、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への環状化および（ｊ）チオメチレン修飾。シアノビリンおよびその複合物はまた、安定性および蛋白質分解に対する抵抗性を増大させると期待される、炭水化物およびポリオキシエチレン誘導体の共有結合的付着によっても修飾することができる（Abuchowskiら，in Enzymes as Drugs,Holcenbergら編，John Wiley: New York，1981，pp．367-378）。
【００４１】
シアノビリンおよびその複合物のような蛋白質薬剤の送達システムおよび組成の設計、並びに投与経路の設計のための、他の重要な一般的考慮もまた当てはまる(Eppstein，CRC Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier Systems 5，99-139，1988; Siddiquiら，CRC Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier Systems 3，195-208，1987); Bangaら，Int．J．Pharmaceutics 48，15-50，1988; Sanders，Eur．J．Drug Metab．Pharmacokinetics 15，95-102，1990; Verhoef，Eur．J．Drug Metab．Pharmacokinetics15，83-93，1990）。所定のシアノビリンまたはその複合物に適当な送達システムは、その特定の性質、特定の臨床応用および薬剤の作用部位による。いかなる蛋白質薬剤もそうであるように、おそらくシアノビリンまたはその複合物の経口的送達にも、主として胃腸管における不安定性および無傷の生物活性のある薬剤のそこからの吸収および生物学的利用可能性の低さによる、特別な問題点が生じるであろう。したがって、とりわけ経口的送達の場合、しかしまた他の投与経路の時もそうなのだが、所定のシアノビリンまたはその複合物と組み合わせて吸収促進剤を使用する必要があるだろう。非常に多様な吸収促進剤が、経口的送達および他の経路での送達のために、蛋白質薬剤と組み合わせて調査および／または適用されている（Verhoef，1990,上述; van Hoogdalem，Pharmac．Ther. 44，407-443，1989; Davis，J．Pharm．Pharmacol. 44(Suppl．1)，186-190，1992）。きわめて一般的には、典型的な促進剤は（ａ）ＥＤＴＡ、サリチル酸塩およびコラーゲンのＮ−アシル誘導体のようなキレート剤、（ｂ）ラウリル硫酸塩およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルのような界面活性剤、（ｃ）グリコレート（glycholate）およびタウロコール酸塩のような胆汁酸塩、並びにタウロジヒドロフシジン酸塩のような誘導体、（ｄ）オレイン酸、カプリン酸のような脂肪酸、並びにアシルカルニチン類、モノグリセリド類およびジグリセリド類のようなそれらの誘導体、（ｅ）不飽和環状尿素類のような非界面活性剤、（ｆ）サポニン類、（ｇ）シクロデキストリン類および（ｈ）リン脂質類といった一般的な範疇に収まる。
【００４２】
本発明のシアノビリンおよびその複合物のような蛋白質薬剤の経口的送達を増大させる他のアプローチとして、胃腸の酵素に対する安定性および／または親油性を増大させる前記の化学修飾が挙げられる。あるいは、該蛋白質薬剤は、プロテアーゼおよび／または他の蛋白質の酵素的分解源の可能性のあるものを直接阻害する他の薬剤または物質と組み合わせて投与することができる。シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤の胃腸吸収を防ぐかあるいは遅らせるための、さらにもう一つの代替的アプローチは、該蛋白質を腸内腔の蛋白質分解酵素との接触から保護し、その吸収に適した領域に到達した時にのみ無傷蛋白質を放出するように設計された送達システム中に該薬剤を組み込むというものである。この戦略のより詳細な例は、攻撃を受けやすい薬剤を分解から保護し、さらに活性薬剤の放出を延長するための、生分解性マイクロカプセルまたはマイクロスフェアの使用である（Deasy，in Microencapsulation and Related Processes，Swarbrick 編，Marcell Dekker，Inc.: New York，1984，pp．1-60，88-89，208-211）。マイクロカプセルはまた、シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤の、注射後の送達を延長するのにも有用な方法を提供し得る（Maulding，J.Controlled Release 6，167-176，1987）。
【００４３】
蛋白質薬剤を首尾よく経口的に送達させるには、前記のような複雑さが考えられるので、多くの場合においては、本発明のシアノビリンおよびその複合物を、数多くの他の可能性のある蛋白質薬剤送達経路の一つにより送達させることが好ましい。このような経路としては、静脈内、動脈内、くも膜下、脳槽内、経口腔、経直腸、経鼻腔、経肺、経皮、経膣、経眼等が挙げられる（Eppstein，1988，上述; Siddiquiら，1987，上述; Banga ら，1988，上述; Sanders，1990,上述; Verhoef，1990,上述; Barry，in Delivery Systems for Peptide Drugs，Davis ら編，Plenum Press: New York，1986，pp．265-275; Patton ら，Adv．Drug Delivery Rev. 8，179-196，1992）。これらのいかなる経路について、あるいは、実際のところ、他のいかなる投与または適用経路についても、シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤は免疫原性反応を起こす可能性がある。このような状況においては、免疫原性のある基をマスクするために分子を修飾する必要がある。製剤化方法および／または投与方法を慎重に選択することによって望ましくない免疫応答を防御することも可能である。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、アルブミン等のようないわゆる寛容源の使用または付着により免疫系から認識部位をマスクするだけでなく（Abuchowskiら，1981，上述; Abuchowskiら，J．Biol．Chem. 252，3578-3581，1977; Lisi ら，J．Appl．Biochem. 4，19-33，1982; Wileman ら，J．Pharm．Pharmacol. 38，264-271，1986）、部位特異的な送達を用いることができる。このような修飾は生体内および生体外（ex vivo）の両方での安定性および半減期にも有利な効果を有し得る。都合の悪い免疫応答を避けるための他の戦略として、最初に非常に低用量を投与することによる寛容誘導も挙げることができる。いずれにしても、シアノビリンまたはその複合物のいかなる特定の所望の医療的適用または使用についても、当業者は非常に多様な可能性のある組成、投与経路または適用部位のうちのいずれかの中から、有利なものを何でも選択し得ることが、当業者には本開示から明らかであろう。
【００４４】
したがって、本発明の抗ウイルス性シアノビリンおよびその複合物は、ウイルス、例えばＨＩＶに感染した個体の治療的処置方法または非感染個体のウイルス、例えばＨＩＶ感染に対する予防方法のいずれかにおける使用のために、種々の組成物に製剤化することができる。
【００４５】
したがって、本発明は本発明のシアノビリンまたはその複合物を含有する組成物、特に抗ウイルス有効量の単離精製されたシアノビリンまたはその複合物と医薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物を提供する。前述の単離精製されたシアノビリンまたはその複合物の代わりに、あるいはそれに加えて、該組成物はインビボで直接シアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された生宿主細胞を含有していてもよい。該組成物は、さらに少なくとも１つのシアノビリンまたはその複合物以外の付加的抗ウイルス性化合物の抗ウイルス有効量を含んでいてもよい。適当な抗ウイルス性化合物としては、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシクロビル、フッ素化ジデオキシヌクレオシド、ネビラピン、Ｒ８２９１３、Ｒｏ３１−８９５９、ＢＩ−ＲＪ−７０、アシクロビル、α−インターフェロン、組換えｓＣＤ４、ミケラミン類、カラノライド類、ノノキシノール−９、ゴッシポールおよびその誘導体、およびグラミシジンが挙げられる。該医薬組成物に使用されるシアノビリンは、天然に存在する生物または遺伝子工学的に作られた生物から単離精製することができる。同様に、シアノビリン複合物は、遺伝子工学的に作られた生物または化学的連結から誘導することができる。
【００４６】
本発明の組成物は、ウイルスに感染した、ヒトなどの動物を治療するのに使用することができる。本発明の組成物は、ウイルス、例えばレトロウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス、就中ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の増殖または複製を阻害するのに特に有用である。該組成物は、ウイルスに感染しているかあるいはウイルス感染の危険のある、ヒトなどの動物の治療的または予防的処置のそれぞれにおいて有用である。該組成物はまた、ヒトなどの動物のウイルス感染を防ぐために、医療用装置、備品、あるいは血液、血液製品および組織のような生物学的流体を含む流体などの、対象物または材料を処理するのに用いることもできる。このような組成物はまた、ウイルス感染、例えばＨＩＶの、性的伝達を防ぐのにも有用である。性的伝達は世界のＡＩＤＳ症例の主要な罹患様式である（Merson,1993，上述）。
【００４７】
ＨＩＶの性的伝達に対して使用されるまたは適用を考慮される可能性のある殺ウイルス剤は非常に限定されている。このような範疇にある現存の薬剤としては、例えばノノキシノール−９（Bird，AIDS 5，791-796，1991）、ゴッシポールおよびその誘導体（Polskyら，Contraception 39，579-587，1989; Lin，Antimicrob．Agents Chemother. 33，2149-2151，1989; Royer，Pharmacol．Res. 24，407-412，1991）並びにグラミシジン（Bourinbair，Life Sci./Pharmacol．Lett. 54，PL5-9，1994; Bourinbair ら，Contraception 49，131-137，1994）が挙げられる。
【００４８】
合衆国国立アレルギーおよび感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の援助の下に現在開始されている抗ＨＩＶ予防の新しいアプローチ（例えば、Painter，USA Today,February 13，1996 により伝えられたように）において、生乳酸菌培養の膣坐薬浸透が９００人の女性を対象にした研究で評価されつつある。この研究は、特に、ある特定の過酸化水素産生乳酸菌がインビトロで抗ＨＩＶ効果を示すとの観察に基づいている（例えば、「ＡＩＤＳワクチン開発の進歩」，ベセスダ、メリーランド州，２月１１日〜１５日，１９９６年におけるＮＩＡＩＤ後援の会議からのHilierによる刊行された要旨を参照）。乳酸菌は膣に容易に定着し、実際、ほとんどの健康な女性において支配的な菌集団である（Redondo-Lopez ら，Rev．Infect．Dis. 12，856-872，1990; Reid ら，Clin．Microbiol．Rev. 3，335-344，1990; Bruce とReid，Can．J．Microbiol. 34，339-343，1988; reu ら，J．Infect．Dis. 171，1237-1243，1995; Hilierら，Clin．Infect．Dis. 16(Suppl 4),S273-S281; Agnewら，Sex．Transm．Dis. 22，269-273，1995）。乳酸菌はまた、口、鼻咽腔、上部および下部胃腸管、並びに直腸などの他の体腔の主要な非病原性の常在菌でもある。
【００４９】
乳酸菌を、利用可能な遺伝子工学技術を用いて容易に形質転換して所望の外来ＤＮＡコード配列を組み込み得ること、並びにこのような乳酸菌を対応する所望の外来蛋白質を発現するようにし得ることは十分確立されている（例えば、Holsら，Appl．and Environ．Microbiol. 60，1401-1413，1994 を参照）。したがって、本開示によれば、本発明のＤＮＡ配列またはベクターを含み、本発明の蛋白質を発現する生宿主細胞を、インビボで所望の部位にシアノビリンまたはその複合物を送達する媒体として直接使用し得ることが、当業者には理解されるだろう。このようにシアノビリンまたはその複合物を、例えば選ばれた体腔のような所望の部位に直接送達するのに好適な宿主細胞には、細菌が含まれる。より詳細には、このような宿主細胞は、乳酸菌、エンテロコッカスまたは大腸菌のようにその通常の菌株が体腔に一般的に常在することが知られている他のありふれた細菌の、適当に工作された菌株を含み得る。さらにより詳細には、このような宿主細胞は、Andreuら（1995，上述）により記載されるもののような、乳酸菌の選ばれた非病原性株、特に、例えば膣上皮細胞への接着のような上皮細胞への高い接着特性を有し、且つ本発明のＤＮＡ配列を用いて適当に形質転換されたものの１またはそれ以上を含み得る。
【００５０】
McGroarty（FEMS Immunol．Med．Microbiol. 6，251-264，1993）により概説されるように、泌尿生殖管、特に女性の泌尿生殖管の病原性細菌または酵母感染を治療または予防するために、「プロバイオティック（probiotic）」、すなわち生きた細菌、特に通常天然に存在する細菌、就中乳酸菌を直接的に治療に用いることはよく確立された概念である。最近、ＨＩＶの性的伝達を阻害するために、慣用のプロバイオティック戦略の使用、特に生乳酸菌の使用が提案されているが、これはある通常の乳酸菌株が殺ウイルスレベルの過酸化水素および／または乳酸および／またはウイルスを殺する可能性のある他の物質を、通常内因的に産生していることに基づいている（例えば、Hilier，1996，上述）。しかしながら、抗ウイルス物質、より詳細には蛋白質、さらにより詳細にはシアノビリンを発現するように、外来遺伝子、より詳細にはシアノビリン遺伝子で特に操作された本発明の非哺乳動物細胞、特に細菌、就中乳酸菌を本発明によって使うことは、ウイルス、詳細にはレトロウイルス、より詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染を防ぐための、動物、特にヒトの治療方法として、これまでに前例のないものである。
【００５１】
Elmer ら（JAMA 275，870-876，1996）は最近、「遺伝子工学は、特定の作用または産物を結腸または他の粘膜表面に送達するのに、微生物を用いる可能性を提供する（中略）将来研究される他の不毛な領域は、活性を増大させるために遺伝子工学を適用する可能性のある種々の生物治療剤の作用機構を明らかにすることを含む。」と予測した。Elmer ら（1996，上述）はさらに、「プロバイオティック」および「生物治療剤」という語は、該文献中では、インビボで病原体に対するアンタゴニスト活性を有する微生物を記載するために用いていると指摘する。該著者らは、「特定の治療的特性を有する微生物」を意味するのに、「生物治療剤」という語をとりわけ好んで用いている。
【００５２】
本開示を考慮すれば、当業者は、本発明が、天然には存在しない、ここで提供された特別に操作された微生物菌株を用いた、全く新規なタイプの「プロバイオティック」または「生物治療的」処置を教示することを理解するであろう。にもかかわらず、慣用のプロバイオティックまたは生物治療的な適用のために最適な微生物菌株、特に細菌株の選択に関して利用可能な教示を、本発明に関しても使用することができる。例えば、ＨＩＶ感染を治療または防止するための、遺伝子操作、形質転換、シアノビリンまたはその複合物の直接的発現、および直接的なプロバイオティックまたは生物治療的適用に最適な乳酸菌株の選択は、Elmer ら（1996，上述）に記載されたもののように、慣用のプロバイオティックまたは生物治療的な治療のための、通常の内因性すなわち「操作されていない」細菌株を選択するのに典型的に用いられるのと同一もしくは類似の基準に基づけばよい。
さらに、McGroarty が教示する推奨および特徴、特に、女性の泌尿生殖器の感染に対する慣用のプロバイオティック使用のために最適な乳酸菌の選択に関する推奨および特徴は、本発明に関連がある。すなわち、「・・・プロバイオティック製剤に組み入れるために選ばれる乳酸菌は、容易に且つ、可能ならば安価で培養できるべきである・・・菌株は安定で、凍結乾燥後も生存力を保持し、そしてもちろん宿主に対して非病原性であるべきである・・・プロバイオティック製剤中での使用のために選ばれる乳酸菌は、膣上皮によく接着することが不可欠である・・・人工的に移植された乳酸菌は、膣上皮に接着し、元来存在する微生物と統合して増殖することが理想的である」（McGroarty，1993 上述）。McGroarty の教示は、特に、女性の泌尿生殖管の病原性細菌または酵母感染に対するプロバイオティック使用のための、「通常の」乳酸菌株の選択を述べているが、遺伝子操作および本発明に特に包含されるようなウイルス感染に対する「プロバイオティック」または「生物治療的な」適用のために最適な細菌株の選択にも、同様の考慮が当てはまるであろう。
【００５３】
したがって、ウイルス感染、例えばＨＩＶ感染の性的伝達を防ぐ本発明の方法は、抗ウイルス有効量のシアノビリンおよび／またはシアノビリン複合物、および／またはシアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された生宿主細胞を単独で、あるいは別の抗ウイルス化合物（例えば、上記の通り）と組み合わせて、経膣的、経直腸的、経口的、経陰茎的、または他の局所的な挿入的または点滴の治療をすることを含む。ここで、本発明の予防または治療方法に使用される本発明の組成物は、１またはそれ以上のシアノビリン、その複合物、またはシアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された宿主細胞、および医薬上許容され得る担体を含むことができる。適当な投与方法がそうであるように、医薬上許容され得る担体も当業者によく知られている。担体の選択は、部分的には特定のシアノビリンもしくはその複合物、あるいは宿主細胞によって、さらに該組成物の投与に使用される特定の方法に応じて決定されるだろう。
【００５４】
当業者には、種々の薬剤投与経路が利用でき、２つ以上の経路が特定の薬剤を投与するのに使用できるが、ある特定の経路が他の経路よりもより直接的でより効果的な反応を提供し得ることが理解されるだろう。さらに当業者には、使用される特定の医薬上の担体が、使用される特定のシアノビリン、その複合物または宿主細胞に、および選択される投与経路に部分的に依っていることがわかるだろう。したがって、本発明の組成物には非常に多様な適当な処方例がある。
【００５５】
経口、直腸または膣投与に好適な製剤は、例えば、（ａ）液剤または懸濁液剤、例えば水、培地または生理食塩水のような希釈剤中に溶解または懸濁された有効量の純粋化合物および／またはシアノビリンまたはその複合物を直接産生するように操作された宿主細胞、（ｂ）それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤、顆粒剤または凍結乾燥細胞として含むカプセル剤、坐薬、サッシェ剤、錠剤、トローチまたは香錠、および（ｃ）水中油型または油中水型乳液剤からなり得る。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する担体のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。トローチは、有効成分を香味成分、例えばシュクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に含み得るが、一方、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み得る。経口または直腸送達に適した製剤はまた、合成および天然ポリマーのマイクロスフェア、あるいは本発明の薬剤を胃腸管内での分解から保護するための他の手段に組み込むこともできる（例えば、Wallace ら，Science 260，912-915，1993を参照）。直腸またまたは膣投与用の製剤は、適当な水性または非水性の基剤（後者には、例えばココアバターやサリチル酸塩が含まれる）を有する坐薬として提供され得る。さらに、膣投与に適した製剤は、例えば、本発明のシアノビリンまたはその複合物を直接産生するように遺伝子操作された凍結乾燥乳酸菌のような有効成分に加えて、当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。同様に、有効成分をコンドーム上のコーティングとしての潤滑剤と組み合わせることができる。
【００５６】
シアノビリン、その複合物、あるいはシアノビリンまたはその複合物を発現する宿主細胞は、単独で、あるいは他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容され得る推進ガス中におくことができる。
【００５７】
シアノビリンまたはその複合物は、単独で、あるいは他の抗ウイルス化合物ままたは吸収調節剤と組み合わせて、皮膚への適用および吸収に適した製剤とすることができる（Wallace ら，1993，上述）。経皮的なエレクトロポーレーションまたはイオントフォレーシスもまた、本発明の化合物および／または組成物の皮膚を通じた全身送達を促進および／または制御するのに用いることができる（例えば、Theissら，Meth．Find．Exp．Clin．Pharmacol. 13，353-359，1991 を参照）。
【００５８】
局所投与に適した製剤としては、有効成分に加えて、当該技術分野で公知の担体を含むクリーム、乳液剤、ゲル等、並びに有効成分を適当な液状担体中に含むうがい薬が挙げられる。
【００５９】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００６０】
医療用備品または装置、実験用装置および備品、道具、装置等のような対象無生物の殺ウイルス（例えば、ＨＩＶに対する）滅菌に適した、シアノビリンまたはシアノビリン複合物を含有する製剤は、例えば、前記の組成物または製剤のいずれかから、当業者が適当なものを選択して適合させることができる。シアノビリンまたはその複合物は、組換えＤＮＡ技術またはシアノビリンと上述のようなエフェクター分子との化学的連結によって製造することができる。好ましくは、シアノビリンまたはシアノビリン複合物は組換えＤＮＡ技術により製造される。同様に、血液、血液製剤、精液もしくは身体からの他の産物または組織、あるいは他のすべての溶液、懸濁液、乳液または医療行為において患者に投与され得る他のすべての材料の生体外（ex vivo）での殺ウイルス滅菌に適したシアノビリンおよび／またはその複合物の製剤は、前記の組成物または製剤のいずれかから、当業者が選択して適合させることができる。しかしながら、このような生体外での適用または対象無生物の殺ウイルス処理のための製剤は、前記の製剤または組成物のいずれかに決して限定されるものではない。当業者は、手元にある特定の適用に基づいて、適当なまたは適切な製剤を選択し、適合させ、発展させることができるとわかるだろう。
【００６１】
無生物の対象物もしくは材料、血液もしくは血液製剤、または組織の殺ウイルス処理のような生体外での使用では、使用されるシアノビリンもしくは複合物またはそれらの組成物の量は、存在するウイルスもしくはウイルス産生細胞がいずれも感染力をなくすか、あるいは破壊されるのに十分であるべきである。例えば、ＨＩＶであれば、ウイルスおよび／またはウイルス産生細胞を０．１〜１０００ｎＭの濃度範囲のシアノビリン−Ｎに曝露することが必要であろう。同様の考慮はインビボでの適用にも当てはまる。したがって、「抗ウイルス有効量」または「殺ウイルス有効量」という語句は、いずれの所定の適用においても、抗ウイルス効果を示すのに必要とされる特定のシアノビリン、その複合物またはそれらの組成物の量を表現するのに一般的に用いられる。
【００６２】
本発明によれば、インビボでの使用に関して、動物、特にヒトに投与されるシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞またはそれらの組成物の用量は、妥当な時間枠にわたって個体に予防的および／または治療的応答をもたらすのに十分であるべきである。インビボでの所望の殺ウイルス濃度（例えば、０．１〜１０００ｎＭ）は特定のシアノビリンまたはその複合物の力価、あるいは使用される宿主細胞のシアノビリンおよび／または複合物生産能力、感染個体の病状の重篤度、さらに全身投与の場合には感染個体の体重および年齢によって決定されるだろう。有効な、あるいは殺ウイルス用量はまた、用いられる特定のシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞またはそれらの組成物の投与に伴う可能性のあるいかなる不利な副作用の存在によっても決定されるだろう。可能なときはいつでも、不利な副作用を最小限に保つことがいずれにせよ望ましい。
【００６３】
用量は、錠剤やカプセル剤のように単位用量形態にすることができる。ここで用いられる「単位用量形態」という語は、被験者および被験動物に対する単位用量として適した物理的にはっきりと区別される単位をいい、各々の単位は、予め決められた量のシアノビリン、その複合物、あるいはシアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞を、単独もしくは他の抗ウイルス剤と組み合わせて含有し、医薬上許容され得る担体、希釈剤または媒体とともに所望の効果を生み出すのに十分な量となるよう計算されている。
【００６４】
本発明の単位用量形態の設計は、使用される特定のシアノビリン、複合物、宿主細胞またはそれらの組成物および達成されるべき効果、さらに治療される動物中での各シアノビリン、複合物、宿主細胞またはそれらの組成物に伴う薬動力学に依存する。投与される用量は、「抗ウイルス有効量」もしくは「殺ウイルス有効量」であるか、あるいは個々の動物、例えばヒト患者において「効果的な殺ウイルスレベル」を達成するのに必要な量であるべきである。
【００６５】
「効果的な殺ウイルスレベル」は投薬の好ましい終了点として用いられるので、実際の用量およびスケジュールは、薬動学における個体差、薬物分布および薬物代謝によって変動し得る。「効果的な殺ウイルスレベル」は、例えば、化学化合物および生物学的薬剤の臨床上の抗ウイルス活性を予見させることが知られているアッセイにおいて、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のようなウイルスを阻害する１またはそれ以上のシアノビリンまたはその複合物の濃度に対応する、患者において所望される血液または組織レベル（例えば、０．１〜１０００ｎＭ）と定義することができる。本発明の薬剤の「効果的な殺ウイルスレベル」はまた、シアノビリン、複合物またはそれらの組成物をＡＺＴまたは他の公知の抗ウイルス化合物、あるいはそれらを組み合わせたものと組み合わせて用いても変動し得る。
【００６６】
当業者は、個々の患者において所望の「効果的な殺ウイルスレベル」を達成するために、使用される組成物の正確な製剤に適した用量、スケジュールおよび投与方法を容易に決定することができるだろう。当業者はまた、本発明の化合物の「エフェクター濃度」の適当な指示薬を、適切な患者の試料（例えば、血液および／または組織）を直接的（例えば、分析的化学分析）または（例えば、ｐ２４やＲＴのような代替指示薬を用いて）間接的に分析することによって容易に決定し、使用することができるだろう。
【００６７】
ウイルスに感染した個体の治療においては、大用量の選択されたシアノビリンまたはその複合物を投与し、その後該薬剤が作用する時間を置き、しかるべき後に適当な試薬を投与して該薬剤を不活性化する「大量投薬」養生法を利用することが望ましい場合もあるだろう。
【００６８】
該医薬組成物は、ＡＩＤＳを引き起こすようなウイルス感染を治療するのに用いられる場合、シアノビリン、その複合物、またはシアノビリンもしくはその複合物を産生する宿主細胞とともに他の医薬を含んでいてもよい。このような付加的な医薬の代表例としては、抗ウイルス化合物、殺ウイルス剤、免疫モジュレーター、免疫刺激剤、抗生物質および吸収促進剤が挙げられる。代表的な抗ウイルス化合物としてはＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシクロビル、フッ素化ジデオキシヌクレオシド、ネビラピンのような非ヌクレオシド類縁体化合物（Shihら，PNAS 88，9878-9882，1991）、Ｒ８２９１３のようなＴＩＢＯ誘導体（White ら，Antiviral Res. 16，257-266，1991）、ＢＩ−ＲＪ−７０（Merigan，Am．J．Med. 90(Suppl.4A)，8S-17S，1991）、ミケラミン類（Boydら，J．Med．Chem. 37,1740-1745，1994）およびカラノライド類（Kashman ら，J．Med．Chem. 35，2735-2743，1992）、ノノキシノール−９、ゴッシポールおよび誘導体、並びにグラミシジン（Bourinbairら，1994，上述）が挙げられる。代表的な免疫モジュレーターおよび免疫刺激剤としては、種々のインターロイキン、ｓＣＤ４、サイトカイン、抗体製剤、輸血、細胞注入が挙げられる。代表的な抗生物質としては、抗真菌剤、抗（細）菌剤および抗ニューモシスチス・カリニ剤が挙げられる。代表的な吸収促進剤としては、胆汁酸塩および他の界面活性剤、サポニン類、シクロデキストリン類およびリン脂質が挙げられる（Davis，1992,上述）。
【００６９】
シアノビリンまたはその複合物を他の抗レトロウイルス化合物、特にｄｄＣ、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＡのような公知のＲＴ阻害剤、あるいは他のＨＩＶ蛋白質に作用する他の阻害剤、例えば抗ＴＡＴ剤とともに投与すると、該ウイルスの生活環のほとんどもしくはすべての複製段階を阻害すると期待される。ＡＩＤＳまたはＡＲＣ患者に使用されるｄｄＣおよびＡＺＴの用量は発表されている。ｄｄＣがウイルス増殖を阻止する範囲は、一般に０．０５μＭから１．０μＭまでの間である。約０．００５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲ではほとんどの患者においてウイルス増殖を阻止する。経口投与用の予備的な用量範囲はそれよりもいくぶん広く、例えば、０．００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇが１回または２，４，６，８，１２時間またはその他の時間間隔をおいて２回以上与えられる。現在のところ、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重のｄｄＣを８時間毎に与えるのが好ましい。併用治療で与えられる場合、他の抗ウイルス化合物は、例えばシアノビリンまたはその複合物と同時に与えてもよいし、あるいは所望により投薬時期をずらしてもよい。異なる薬剤を一つの組成物中で組み合わせることもできる。併用する場合、各々の用量は、単独で使用する場合よりも少なくすることができる。
【００７０】
当業者はまた、本発明のシアノビリンまたはその複合物のＤＮＡ配列を、所定の動物、特にヒトから前もって除去した哺乳動物細胞に生体外で挿入することができるとわかるだろう。該動物またはヒトに再導入されたこのような形質転換された自己または同種の宿主細胞は、インビボで対応するシアノビリンまたはその複合物直接発現するだろう。治療量の薬剤を所望の標的細胞および病原体に（例えば、ウイルス、より詳細にはレトロウイルス、特にＨＩＶおよびそのエンベロープ糖蛋白質であるｇｐ１２０に）きわめて近接して送達する治療戦略の可能性が、生体外でｓＣＤ４を発現するように操作された細胞を用いた研究で実証されている（Morganら，1994，上述）。本発明のＤＮＡ配列を生体外で挿入する代替として、このような配列を適切なウイルスまたは他の適当なベクターの使用などによりインビボで直接細胞に挿入することができる。インビボでトランスフェクトされたこのような細胞は、インビボで直接抗ウイルス量のシアノビリンまたはその複合物を産生することが期待されるだろう。実施例９では、哺乳動物細胞による形質転換およびシアノビリンの発現について説明する。
【００７１】
本開示によれば、さらに、シアノビリンまたはその複合物に対応するＤＮＡ配列を適当な非哺乳動物宿主細胞に挿入することができ、このような宿主細胞は、動物、特にヒトの所望の身体の小区画内で、治療または予防量のシアノビリンまたはその複合物をインビボで直接発現するだろうと理解されよう。実施例３では、非哺乳動物細胞、より詳細には細菌細胞での効果的な殺ウイルス量のシアノビリンの形質転換および発現について説明する。実施例１０では、非哺乳動物細胞、特に酵母細胞でのシアノビリンの形質転換および発現について説明する。
【００７２】
本発明の好適な態様において、女性により管理できるＨＩＶ感染に対する予防方法は、効果的な殺ウイルスレベルのシアノビリンまたはその複合物を、長時間にわたって膣および／または頸管および／または子宮粘膜上または内部に直接提供するための、本発明のコード配列で形質転換された乳酸菌の膣内投与および／またはヒト女性における持続的な膣内定着の確立を含む。世界保健機関(ＷＨＯ)および合衆国国立アレルギーおよび感染症研究所の両方が、ＨＩＶの伝達をブロックするのに適した、女性が管理する局所殺菌剤の開発の必要性を、緊急の世界的優先課題として指摘していることは注目に値する（Lange ら，Lancet 341，1356，1993; Fauci，NIAID News，April 27，1995）。
【００７３】
本発明はまた、本発明の蛋白質に対する抗体を提供する。いかなる所定の蛋白質もそれに対する抗体が入手できることは、非常に多様な定性的および定量的分析方法、分離精製方法および対象の蛋白質に対する他の有用な適用を提供するので非常に有利である。したがって、本開示および本発明の蛋白質によれば、抗体、特に本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体は、（例えば、Harlowと Lane，in Antibodies． A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988，pp．1-725により詳述された方法論のような）十分確立された方法論を用いて調製することができることが当業者には容易に明らかになるだろう。このような抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含み得る。さらに、このような抗体は溶液相中か所望の液相マトリックスに連結させるかして取得し使用することができる。本発明により提供されるような抗体を取得すると、当業者はさらに、このような抗体は、（例えば、Harlowと Lane（1988，上述）に記載されるような）十分確立された手法とともに使えば、シアノビリン、その複合物またはシアノビリンもしくはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞の有用な検出、定量または精製方法になるとわかるだろう。実施例１１では、シアノビリンに特異的に結合する抗体についてさらに説明する。
【００７４】
以下の実施例により、本発明の核酸配列、シアノビリン、複合物、宿主細胞、抗体、組成物および方法をさらに説明する。これらの実施例は本発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
この実施例において、抗ＨＩＶバイオアッセイによって導き出される、培養シアノバクテリア、ノストック・エリプソスポラムの水性抽出物由来の純粋なシアノビリンの単離と解明について詳細に述べる。単離および精製工程を測定し管理するために、Weislow ら（1989，上述）に記載の方法を用いた。シアノバクテリアの培養条件、培地、および分類は以前に述べた（Patterson，J．Phycol. 27，530-536，1991）ものと同様である。簡単にいえば、ノストック・エリプソスポラム（カルチャー Ｑ６８Ｄ１７０）の単藻株由来の細胞のかたまりを濾過により集菌し、凍結乾燥し、ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）で、続いてＨ2Ｏで抽出した。バイオアッセイはＨ2Ｏ抽出物のみがＨＩＶ阻害活性を有していることを示した。該水性抽出物の溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を等量のエタノール（ＥｔＯＨ）の添加によって処理した。得られた１：１のＨ2Ｏ−ＥｔＯＨ溶液を−２０℃で１５時間保存した。そして、該溶液を遠心分離して、沈澱した物質（恐らく、高分子量のバイオポリマー類）を除去した。得られたＨＩＶ阻害性の上清を溶媒留去し、ワイドポアＣ4パッキング（３００Å，BakerBond ＷＰ−Ｃ4）での逆相真空液体クロマトグラフィー（Collら，J．Nat．Prod. 49，934-936，1986; Pelletierら，J．Nat．Prod. 49，802-900，1986）によって分画し、Ｈ2Ｏ中のメタノール（ＭｅＯＨ）濃度を上昇させて溶出した。抗ＨＩＶ活性はＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ（２：１）で溶出した物質中で濃縮された。この画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、およそ１０ｋＤａの相対分子量（Ｍｒ）を有する、一つの主要な蛋白質のバンドを示した。１．９×１５ｃｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ18（Waters Associates）カラムを用いた、Ｈ2Ｏ中で徐々に高くなるアセトニトリル濃度の勾配で溶出させる逆相ＨＰＬＣを繰り返して最終的に精製した。移動相は０．０５％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ、ｐＨ＝２を含有した。溶出された蛋白質は、急速（rapid）スペクトル検出器（Pharmacia ＬＫＢ モデル２１４０）を用いて、２０６、２８０、および２９４ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。ＵＶクロマトグラムに基づいて個々の画分を集めてプールし、凍結乾燥した。プールしたＨＰＬＣ画分を還元状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli，Nature 227，680-685，1970）、通常のアミノ酸解析、および抗ＨＩＶ活性試験に付した。
【００７６】
図１Ａは時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフであり、２８−３８％ＣＨ3ＣＮからの直線ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ勾配（０．０５％ＴＦＡで緩衝化）で溶出された非還元のシアノビリンのμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ18ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図１Ｄは時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフであり、最初にβ−メルカプトエタノールで還元し、次いで同じＨＰＬＣ条件下で分離したシアノビリンのクロマトグラムを示している。２回の試行からのＨＰＬＣ画分を述べたようにして集めた。各画分の１０％アリコートを凍結乾燥し、３：１Ｈ2Ｏ／ＤＭＳＯ１００μｌに構成し、ＸＴＴアッセイで抗ＨＩＶ活性を調べた。図１ＢはＨＰＬＣ画分に対する、５０％防御の最大希釈についての棒グラフであり、非還元のシアノビリンＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果に対して５０％防御を与える各画分の最大希釈を示している。対応する、還元したシアノビリンからのＨＰＬＣ画分についての抗ＨＩＶの結果を図１Ｅに示す。該図は、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の為の最大希釈の棒グラフである。選択したＨＰＬＣ画分の２０％アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。非還元のＨＰＬＣ画分での結果を図１Ｃに、還元したＨＰＬＣ画分での結果を図１Ｆに示す。
【００７７】
３０−５０％ＣＨ3ＣＮからの直線勾配を用いた最初のＨＰＬＣ分離においては、抗ＨＩＶ活性は、およそ３３％ＣＨ3ＣＮで、主要なＵＶ吸収ピークと一緒に溶出した。該活性ピークに対応する画分をプールし、２つのアリコートにわけた。２８−３８％ＣＨ3ＣＮからの直線勾配を用いる以外は、同様のＨＰＬＣ条件下で最初のアリコート再注入することにより、該活性物質を３３．４および３４．０％ＣＨ3ＣＮでの、２つの近接した溶出ピークに分けた。このＨＰＬＣ試行の間に回収された画分の抗ＨＩＶ活性のプロフィール（図１Ｂに示すように）は２つのＵＶピークに対応していた（図１Ａに示すように）。個々のピークのもとに回収した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは単一の蛋白質のバンドを示した（図１Ｃに示すように）。もとのＨＰＬＣ分離由来の２つめのアリコートを、ＨＰＬＣに再注入する前にβ−メルカプトエタノールで還元した。同じ２８−３８％勾配を用いると、還元した物質は、３６．８％ＣＨ3ＣＮでの試行において後で溶出される１つの主要なピーク（図１Ｄに示されるように）を与えた。還元した物質からのＨＰＬＣ画分においては、ただ一つわずかな抗ＨＩＶ活性が検出された（図１Ｅに示されるように）。非還元の物質の２つの近接して溶出するＨＰＬＣピーク（図１Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元状態下での試行）においては単一の同じバンドを与え（図１Ｃ）、β−メルカプトエタノールでの還元は結果として非還元のピークのどちらよりもより長い保持時間を有するＨＰＬＣピークを生じた（図１Ｆ）。これは、ネイティブな蛋白質にはジスルフィドが存在していることを示した。２つの活性ピークのアミノ酸解析は、それらが実質的に同じ組成を有していることを示した。該２つのＨＰＬＣピークはプロリン残基の周囲でのシス／トランス異性から生じたものか、あるいはアミノ酸解析又はシークエンシングの間のどちらにおいても検出されなかった蛋白質試料中の微細異種状態性(microheterogeneity)から生じたものである可能性がある。さらなる解析の為に２つのＨＩＶ阻害性ピークとして回収された物質を併せ、シアノビリン−Ｎと命名した。
【００７８】
実施例２
この実施例において、シアノビリン遺伝子の合成について述べる。
シアノビリン−Ｎの化学的に類推されるアミノ酸配列をバックトランスレートし、ＤＮＡコード配列を得た。組換えシアノビリン−Ｎの最初の生産および精製を容易にするために、アフィニティー精製や検出のための試薬が入手可能な市販の発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−１、International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT より）を選択した。ｐＦＬＡＧ−１に連結するための好適な制限サイト、および停止コドンをＤＮＡ配列に含めた。図２は合成シアノビリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列の一例である。このＤＮＡ配列設計は、シアノビリンのＮ−末端でシアノビリン−Ｎをコードする領域を“ＦＬＡＧ”オクタペプチドのコドンに連結し、ＦＬＡＧ−シアノビリン融合蛋白質を与える。このＤＮＡ配列の合成の為のフローチャートを以下に示す。
【００７９】
【化１】
【００８０】
１３のオーバーラップしている、相補的なオリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ配列を合成し、２本鎖のコード配列を形成するように組み立てた。合成ＤＮＡコード配列のオリゴヌクレオチド要素は二元カラム(dual-colum)核酸合成機（モデル３９２、Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA）を用いて合成した。完成したオリゴヌクレオチドはカラムから切り出して濃アンモニウムヒドロキシド中、５６℃で一晩インキュベートすることによって脱保護した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理する前に、３３−６６ｍｅｒｓを蒸留水に対してドロップ透析した。１３のオリゴヌクレオチド調製品は各々ＨＰＬＣによって精製し、各１０ｎｍｏｌ量をＴ４リガーゼを用いて３２７ｂｐの２本鎖ＤＮＡ配列へと連結した。フェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈澱、およびさらにエタノールで洗浄することによって、反応バッファーからＤＮＡを回収し精製した。個々のオリゴヌクレオチド調製品はプールし、変性を確実にするために１０分間煮沸した。ついで、相補鎖のアニーリングの為に、該混合物の温度を７０℃にまで下げた。２０分後、該チューブを氷上で冷却し、２，０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを追加のリガーゼバッファーとともに添加した。ライゲーションを１６℃で一晩行った。フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈澱および洗浄によって該ライゲーション反応混合物から、ＤＮＡを回収し、精製した。
【００８１】
次いで、精製した２本鎖合成ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型として用いた。ライゲーション反応混合物を精製して得られたＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として用いた。熱サイクリングはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ装置を用いて行った。“Ｖｅｎｔ”熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびポリヌクレオチドキナーゼはNew England Biolabs，Beverly,MAより入手した。通常のＴａｑ酵素に比較して正確さにおいて優れているということなので、Ｖｅｎｔポリメラーゼがこの適用のために選択された。ＰＣＲ反応産物をＴＢＥバッファー中、２％アガロースゲルにかけた。ついで３２７ｂｐ構築物をゲルから切り出し、電気的溶出によって精製した。該構築物はHind IIIおよびXho I 制限酵素による消化に比較的耐性が認められたので、はじめにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ｓｙｓｔｅｍ(Stratagene)を用いて該構築物をクローニングした。これらのクローンのうちのひとつからのプラスミド調製品を消化してコード配列を得、該配列をｐＦＬＡＧ−１ベクターのマルチクローニングサイトに連結した。
【００８２】
ｐＦＬＡＧ−１構築物で大腸菌を形質転換し、組み換えクローンをプラスミドＤＮＡの制限消化の解析によって同定した。これらの選択されたクローンのうちの一つの配列解析は、意図していたコード配列からは４塩基はずれていることを示した。これは該蛋白質に含まれている４つのシステイン残基のうちの一つをコードしている３塩基の欠失、およびその前のコドンにおける３番目の変更を含んでいた（図２のボックスによって示されている）。恐らく合成鋳型のＰＣＲ増幅の間に起こったであろうこれらの“変異”を修正するために、該変異の隣の制限サイト（これらのBst XIおよびEsp1サイトもまた図２に示される。）に連結されうる２本鎖の“パッチ”を合成した。該パッチを適用し、該修復をＤＮＡ配列解析によって確認した。
【００８３】
ネイティブシアノビリンをコードしているＤＮＡ配列の調製には、ＦＬＡＧオクタペプチドのコドンを排除し、同時にユニークなHind III制限サイトを排除する為に、上述のＦＬＡＧ−シアノビリン構築物を部位特異的突然変異誘発に付した。この手法を図３に説明する。該図は、ＦＬＡＧオクタペプチドのコドンおよびHind III制限サイトを図２の配列から排除するため用いられる部位特異的突然変異誘発工作を説明するものである。Ｏｍｐ分泌ペプチドおよびシアノビリンのコドンの部分を含有し、ＦＬＡＧペプチドのコドンを欠いた、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。鋳型鎖におけるＤＮＡヘアピンの発生を伴った、この変異原性のプライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長は、結果としてＦＬＡＧコドン配列およびHind IIIサイト（詳細は図２を参照）の両方を欠いている新しいプラスミドＤＮＡを生成した。該プラスミドＤＮＡのHind IIIでの消化は、“変異型”鎖ではなく“野性型”鎖の鎖状化を生じた。大腸菌の形質転換は環状ＤＮＡでより効率よく起こるので、Ｏｍｐ分泌ペプチドのすぐ後にネイティブシアノビリン−Ｎの産生が指定されている変更されたコード配列を有するクローンは容易に選択することができた。ＤＮＡ配列決定(sequencing)により意図する配列の存在が立証された。部位特異的突然変異誘発反応はPharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ から入手した材料（ポリメラーゼ、バッファー等）を用いて行った。
【００８４】
実施例３
この実施例において、合成シアノビリン遺伝子の発現について述べる。
以下のフローチャートに示すようにして行った。
【００８５】
【化２】
【００８６】
大腸菌（ＤＨ５α株）を、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質のコード配列を含有するｐＦＬＡＧ−１ベクターで形質転換（エレクトロポレーションによる）した（ＤＮＡ配列の詳細は図２参照）。選択したクローンを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む（ＬＢ）増殖培地の入った小スケールの振とうフラスコに接種し、３７℃でインキュベートすることにより拡大した。次いで、大スケールのエルレンマイヤーフラスコ（０．５−３．０リッター）に接種し、０．５−０．７ＯＤ600単位の密度になるまで増殖させた。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質の発現はＩＰＴＧを最終濃度が１．７ｍＭになるように添加し、３０℃で３−６時間インキュベーションを続けることにより誘導した。ペリプラズムの蛋白質を採取するためには、細菌をペレット化し、洗浄し、そしてシュクロースによる処理、それに続く蒸留水中での再懸濁によって浸透圧的にショックを与えた。ペリプラズムの蛋白質は、細菌を沈澱させ、ついで水性の上清をWhatman 紙で濾過することにより得た。粗ペリプラズム抽出物は抗ＨＩＶ活性およびウエスタンあるいはスポット−ブロッティングによるＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質の存在の両方を示した。
実施例２に記載されたネイティブシアノビリン−Ｎの構築物を用いて、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質について記載した方法と同様の方法で細菌を形質転換した。クローニング、拡大、ＩＰＴＧでの誘導、および採取は同様にして行った。粗ペリプラズム抽出物はバイオアッセイにおいて強い抗ＨＩＶ活性を示した。
【００８７】
実施例４
この実施例において、組換えシアノビリン蛋白質の精製について述べる。
抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)に基づいたアフィニティーカラムを用いて、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質を以下のようにして精製することができた。
【００８８】
【化３】
【００８９】
実施例３に記載されるようにして調製した、個々のペリプラズム抽出物を、アフィニティーマトリックスを含有する２−２０ｍｌの重力カラム(gravity column)にロードし、混入している蛋白質を除去するために、ＣＡ++を含有するＰＢＳで徹底的に洗浄した。ＦＬＡＧペプチドの該抗体への結合はＣa++依存性であるので、カラムにＥＤＴＡを通すことにより融合蛋白質を溶出することができた。カラム分画および洗浄容量は同じ抗ＦＬＡＧ抗体を用いたスポット−ブロット解析によって監視制御した。融合蛋白質を含有する画分をプールし、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥した。
【００９０】
該組換えネイティブシアノビリン−Ｎの精製については、実施例３の対応するペリプラズム抽出物をステップ勾配Ｃ4逆相真空液体クロマトグラフィーに付して次の３つの画分を得た：（１）１００％Ｈ2Ｏで溶出される、（２）ＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ（２：１）で溶出される、および（３）１００％ＭｅＯＨで溶出される。抗ＨＩＶ活性は画分（２）で濃縮された。組換えシアノビリン−Ｎの精製は１．９×１５ｃｍ μＢｏｎｄａｐａｋ（Waters Associates）Ｃ18カラムを用いた、Ｈ2Ｏ（移動相中で０．０５％ＴＦＡ、Ｖ／Ｖ）中で徐々に高くなるＣＨ3ＣＮ濃度の勾配で溶出されるＨＰＬＣによって行った。１×１０ｃｍ（Cohensive Thchnologies，Inc.）Ｃ4カラムを用いた最終的なＨＰＬＣ精製の、２８０ｎｍで測定したクロマトグラムを図４に示した。該図は、組換えネイティブシアノビリンの精製の間の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムである。１００％Ｈ2ＯからＨ2Ｏ−ＣＨ3ＣＮ（７：３）のグラジエント溶離（５ｍｌ／分）は０．０５％ＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）の移動相で２３分にわたって行った。
【００９１】
実施例５
この実施例において、天然、および組換えシアノビリン−ＮおよびＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの抗ＨＩＶ活性について述べる。はじめに純粋な蛋白質の抗ウイルス活性を、以前に述べられたＸＴＴ−テトラゾリウム 抗ＨＩＶアッセイ（Boyd，in AIDS，Etiology，Diagnosis，Treatment and Prevention，1988，上述；Gustafson ら，J．Med．Chem．35，1978-1986,1992；Weislow，1989,上述；Gulakowski，1991，上述）を用いて評価した。全てのアッセイで使用されるＣＥＭ−ＳＳヒトリンパ球性標的細胞株は、フェノールレッドを含有せず、５％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったＲＰＭＩ１６５０培地（Gibco，Grand Island,NY）（完全培地）中で維持した。指数的に増殖している細胞を沈澱とし、完全培地で２．０×１０5細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ＨＩＶのＨａｉｔｉａｎ変異株であるＨＴＬＶ−ＩＩＩRF（３．５４×１０6ＳＦＵ／ｍｌ）を一貫して使用した。凍結したウイルスのストック溶液を使用直前に解凍し、１．２×１２5ＳＦＵ／ｍｌとなるように完全培地で再懸濁した。抗ＨＩＶ評価の為に、適当な量の純粋な蛋白質をＨ2Ｏ−ＤＭＳＯ（３：１）に溶解し、ついで完全培地で所望の初期濃度に希釈した。全ての薬剤の逐次的な希釈、試薬の添加、およびプレートからプレートへの移動はオートメーション化されたＢｉｏｍｅｋ１０００ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Beckman Instruments，Palo Alto，CA）を用いて行った。
【００９２】
図５Ａ−５Ｃは濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフであり、該図はノストック・エリプソスポラム由来のネイティブシアノビリン（Ａ）、組換えネイティブな（Ｂ）、および組換えＦＬＡＧ−融合シアノビリンの抗ウイルス活性を説明している。該グラフは、培養６日後に測定した、ＨＩＶ−１（●）で感染されたＣＥＭ−ＳＳ細胞における各シアノビリンの濃度範囲の影響を示している。データポイントは、個々の非感染の、薬剤未処理のコントロール値のパーセントを表している。３種のシアノビリン全てが、低ナノモル領域でＥＣ50を有し、最も高い被検濃度（１．２μＭまで）において宿主細胞に直接的な細胞毒性の顕著な形跡を示さない、強力な抗ＨＩＶ活性を示した。
【００９３】
純粋なシアノビリン−Ｎの抗ＨＩＶ活性のさらなる証明の一例として、詳細は他で記載されている方法（Gulakowski，1991，上述）を用いて９６ウエルマイクロタイタープレートの個々のウエル中で、相互に関係のある一連の抗ＨＩＶアッセイを行った。簡単に説明すると、該方法は以下のとおりである。シアノビリン溶液を完全培地で逐次的に希釈し、９６ウエルテストプレートに添加した。非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞を５０μｌ完全培地中１×１０4細胞の密度で撒きこんだ。ついで希釈したＨＩＶ−１を、感染多重度０．６となるように適当なウエルに容量５０μｌで添加した。適当な細胞、ウイルス、および薬剤コントロールを各実験に取り入れた。各マイクロタイターウエル中の最終容量は２００μｌであった。ウイルス感染細胞については４つ組のウエルを用いた。プレートを５％ＣＯ2を含有する雰囲気下、３７℃で４、５、あるいは６日間インキュベートした。
【００９４】
続いて、無細胞の上清のアリコートをＢｉｏｍｅｋを用いて各ウエルから移し、逆転写酵素活性、ｐ２４抗原産生、および感染性のウイルス粒子の合成について、記載された（Gulakowski，1991，上述）ようにして解析した。ついで、細胞の増殖あるいは生存度を記載された（Gulakowskiら，1991，上述）ＸＴＴ（Weislow ら，1989，上述）、ＢＣＥＣＦ（Rinkら，J．Cell Biol. 95，189-196，1982）およびＤＡＰＩ（McCaffrey ら，In Vitro Cell Develop．Biol. 24，247-252，1988）アッセイを用いて、各ウエルに残存している内容物で評価した。データのグラフ表示や比較を容易にする為に、個々の実験のアッセイ結果（少なくとも各々について４つ組の測定の結果）は平均をとり、そして適当なコントロールに関して割合を算出するためにその平均値を用いた。これらの計算において用いた平均値の標準誤差は、通常平均して個々の平均値の１０％以下であった。
【００９５】
図６Ａ−６Ｄは濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフであり、該図はマルチパラメーターアッセイフォーマット（multiparameter assay format）におけるシアノビリンの抗ＨＩＶ活性を説明している。グラフ６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、培養６日後に測定した非感染のＣＥＭ−ＳＳ細胞（○）、ＨＩＶ−１で感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞（●）におけるシアノビリンの濃度範囲の影響を示している。グラフ６Ａは、ＢＣＥＣＦアッセイによって測定された、生きているＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示している。グラフ６Ｂは、各培養物の相対ＤＮＡ量を示している。グラフ６Ｃは、ＸＴＴアッセイによって測定された、生きているＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示している。グラフ６Ｄは、培養４日後に測定した、感染性ウイルスあるいはウイルス複製の指数におけるシアノビリンの濃度範囲の影響を示している。これらの指数はウイルスの逆転写酵素（▲）、ウイルスのコア蛋白質ｐ２４（◆）、およびシンシチウム形成単位（■）を含む。グラフ６Ａ、６Ｂおよび６Ｃでは、該データを、非感染、薬剤未処理のコントロール値のパーセントとして表している。グラフ６Ｄでは、該データを、感染、薬剤未処理のコントロール値のパーセントとして表している。
【００９６】
図６に示されるように、シアノビリン−Ｎは、in vitroで、ＣＥＭ−ＳＳヒトリンパ芽球様標的細胞に対してＨＩＶ−１の細胞変性効果の完全阻害が可能であった；該蛋白質の、標的細胞に対する直接的な細胞毒性は最も高い被検濃度でも認められなかった。シアノビリン−Ｎは又ＨＩＶ−１で感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞内でのＲＴ、ｐ２４、およびＳＦＵの生産を、これらの同じ阻害効果濃度内で著しく阻害し、該蛋白質がウイルスの複製を停止させたことを示した。
【００９７】
シアノビリンの抗ＨＩＶ活性は、過酷な環境の挑戦に対して極めて弾力性がある。例えば、緩衝化していないシアノビリン−Ｎ溶液は、繰り返される凍結融解サイクルあるいは有機溶媒（１００％ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ、あるいはＣＨ3ＣＮに及ぶ）での溶解に活性の損失なしによく耐えた。シアノビリン−Ｎは、ＨＩＶ阻害活性の顕著な損失なしに、界面活性剤（０．１％ＳＤＳ）、高塩（６Ｍ塩酸グアニジン）、および熱処理（Ｈ2Ｏ中で１０分、煮沸）に抵抗性であった。β−メルカプトエタノールでのジスルフィドの還元、その直後のＣ18ＨＰＬＣ精製はシアノビリン−Ｎの細胞保護作用を急激に低下させた。しかしながら、還元したシアノビリン−Ｎの溶液は長期保存している間に抗ＨＩＶ阻害活性を回復した。シアノビリン−Ｎを還元する（β−メルカプトエタノール、６Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ８．０）が、Ｃ18ＨＰＬＣを通さず、そのかわりに単に脱塩、再構成して測定した時は、実質的に完全な活性を維持していた。
【００９８】
実施例６
この実施例において、ＨＩＶウイルスのエンベロープｇｐ１２０がシアノビリン−Ｎの主要な分子標的であることを述べる。ＸＴＴ−テトラゾリウムアッセイ（Weislow ら，1989，上述）を用いた最初の実験では、シアノビリンでプレインキュベート（１０ｎＭ、１時間）し次いでシアノビリン−Ｎのない状態に遠心分離した宿主細胞は、ＨＩＶ感染に対する通常の感受性を維持したが、対照的に、濃縮ウイルスを同様に前処理し次いで阻害性のない濃度にまでシアノビリン−Ｎを希釈すると、感染性が本質的になくなった。このことはシアノビリン−Ｎが直接ウイルスそのものに作用している、すなわちウイルスが宿主細胞に侵入しうる前でもウイルス感染を防ぐために直接的な“殺ウイルス剤”として働いていることを示した。このことはＸＴＴ−テトラゾリウムアッセイ（Weislow ら，1989，上述）の試行と同様、添加時期実験においても確認された。該実験は、最大の抗ウイルス活性を得るためには、図７〔添加の時期（時間）に対する％非感染コントロールのグラフであり、該図は、ＨＩＶ−１RFで感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞において抗ＨＩＶ活性を示すシアノビリンの、添加時期実験の結果を示している〕に示されるようにシアノビリン−Ｎをウイルスの添加前、あるいは添加後可能な限り速やかに添加しなくてはならないことを示した。はじめのインキュベーションのあと、種々の時期で遅れてシアノビリン（●）あるいはｄｄｃ（■）（各々１０ｎＭおよび５μＭ濃度）を導入し、ついで６日間インキュベートし、細胞の生存度（線グラフ）およびＲＴ（棒グラフ（オープンバー）、挿入図）のアッセイを行った。ポイントは少なくとも３つの測定の平均（±Ｓ．Ｄ）を表している。逆転写酵素阻害剤であるｄｄｃとは極めて対照的に、たった３時間のシアノビリン−Ｎの添加の遅れは、結果として抗ウイルス活性を無くすかほとんど無くすかした（図７）。前述の結果は、シアノビリン−Ｎがウイルスの細胞との最初の相互作用の妨害によってＨＩＶ感染性を阻害したことを示唆した；したがって、これはおそらくシアノビリン−Ｎのウイルスｇｐ１２０との直接的な相互作用を意味している。このことは限外濾過の実験やドット−ブロットアッセイによって確認された。
【００９９】
可溶性のｇｐ１２０およびシアノビリン−Ｎが直接的に結合できるかどうかを決定するために、５０ｋＤａカットオフの限外濾過機によるシアノビリンの通過の阻害によって測定する、限外濾過の実験を行った。シアノビリン（３０μｇ）のＰＢＳ溶液を種々の濃度のｇｐ１２０で１時間３７℃で処理し、ついで５０ｋＤａカットオフの遠心分離限外濾過機（Amicon）によって濾過した。ＰＢＳで３回洗浄後、濾液を３ｋＤａの限外濾過機で脱塩し；保留分を凍結乾燥し、１００μｌＨ2Ｏに再構成し、抗ＨＩＶ活性を測定した。
【０１００】
図８Ａはシアノビリン濃度（μｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフであり、該図はｇｐ１２０をシアノビリンの主要分子標的として定義づけする、シアノビリン／ｇｐ１２０相互作用を示している。濾液中のシアノビリン−Ｎの生物活性の完全な回収によって証明されるように、遊離のシアノビリン−Ｎは容易に溶離された。対照的に、ｇｐ１２０で処理したシアノビリン−Ｎ溶液からの濾液は、濾液の生物活性の濃度依存的な損失を示し；さらに該５０ｋＤａ濾過機の保留分は全て不活性であり、シアノビリン−Ｎと可溶性のｇｐ１２０とが直接相互作用し、完全なウイルスのｇｐ１２０との結合が不可能な複合体を形成することを示した。
【０１０１】
ＰＶＤＦ膜ドット−ブロットアッセイにおけるシアノビリン−Ｎとｇｐ１２０との直接的な相互作用のさらなる証拠があった。ＰＶＤＦ膜に５μｇのＣＤ４（ＣＤ）、１０μｇのアプロチニン（ＡＰ）、１０μｇのウシグロブリン（ＢＧ）、および次第に量を減少させたシアノビリン：６μｇ〔１〕、３μｇ〔２〕、１．５μｇ〔３〕、０．７５μｇ〔４〕、０．３８μｇ〔５〕、０．１９μｇ〔６〕、０．０９μｇ〔７〕、および０．０５μｇ〔８〕をスポットし、ついでＰＢＳＴで洗浄し、製造者の推奨に従って可視化した。図８はシアノビリンとｇｐ１２０−ＨＲＰ結合体（Invitrogen）との結合のドットブロットであり、該図はシアノビリン−Ｎが、濃度依存的な挙動で特異的にｇｐ１２０のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ｇｐ１２０−ＨＲＰ）に結合したことを示している。
【０１０２】
実施例７
この実施例において、ヒトのあるいはヒト以外の霊長類の免疫不全性レトロウイルスの、研究室向けの、および臨床上の様々な株に対する極めて広範囲にわたる抗レトロウイルス活性について述べる。下の表１は種々の宿主細胞において広範囲のウイルス株に対して調べた、シアノビリン−Ｎ及びｓＣＤ４の抗免疫不全性ウイルス活性の比較範囲を示している。特に注目すべきことは、シアノビリン−Ｎがラボ向けのＨＩＶ株およびＨＩＶの臨床分離株の両方に対して同等の能力を有することである。このことはｓＣＤ４が臨床的分離株に対してその活性を欠いていることとは明らかに対照的であった。
【０１０３】
ＥＣ50値（表１）は８とおりに希釈した被検薬剤の濃度応答曲線から決定した（１種の濃度あたり３つのウエルからの平均）；Ｇ９１０−６はＡＺＴ−耐性株であり；Ａ１７はピリジノン耐性株であり；ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌは、ヒトの末梢血マクロファージ（ＰＢＭ）培養中で、上清の逆転写酵素の活性によって調べ；すべての他のアッセイはＸＴＴ−テトラゾリウム（Gulakowskiら，1991，上述）を使用した。ウイルス株、細胞系統、臨床分離株、およびアッセイ方法の詳細は発表されている（Buckheitら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 10，1497-1506，1994; Buckheitら，Antiviral Res. 25，43-56，1994; およびそれらに含まれる引例）。表１において、Ｎ．Ｄ．は測定していないことである。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
実施例８
この実施例において、選択的にＨＩＶ−感染細胞を標的とし、死滅させるシアノビリン−毒素蛋白質コンジュゲートを得るための、コンジュゲートＤＮＡコード配列の構築およびその発現についてさらに述べる。より具体的には、この実施例に、ウイルスのｇｐ−１２０を発現している宿主細胞を選択的に殺すシアノビリン／シュードモナス−外毒素のコンジュゲートＤＮＡコード配列の構築および発現について述べる。
ＦＬＡＧ−シアノビリン−ＮをコードしているＤＮＡ配列（配列表配列番号３）およびシュードモナスの外毒素のＰＥ３８断片をコードするＤＮＡ配列（Kreitmanら，Blood 83，426-434，1994）をｐＦＬＡＧ−１発現ベクター内で結合させた。ＰＥ３８コード配列をプラスミドから切り出し、適合させ、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列のＣ末端の位置に、標準的な組換えＤＮＡの手法を用いて連結した。この構築物を図９に模式的に示した。この構築物での大腸菌の形質転換、クローンの選択、およびＩＰＴＧでの遺伝子発現の誘導により、予測される分子量ならびに抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタンブロット解析における免疫反応性を有するコンジュケート蛋白質を産生した。キメラ分子をＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製し（例えば実施例４のように）、ＨＩＶで感染されたヒトリンパ芽球様細胞（Ｈ９／ＩＩＩＢ細胞）およびそれらの非感染の対照物（Ｈ９およびＣＥＭ−ＳＳ細胞）に対する毒性で評価した。細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートに撒きこみ、種々の濃度のコンジュゲート蛋白質（ＰＰＥと名付けた）に暴露した。３日後、ＸＴＴアッセイ（Gulakowskiら.，1991,上述）を用いて生存度を測定した。図１０はこの実験の結果を示している。予期したように、細胞表面ｇｐ１２０を発現している、感染されているＨ９／ＩＩＩＢ細胞は、非感染のＨ９あるいはＣＥＭ−ＳＳ細胞よりも劇的にＰＰＥの該毒性効果により感受性であった。濃度−効果曲線から決定されたＩＣ50は、Ｈ９およびＣＥＭ−ＳＳに対してそれぞれ０．４８および０．４２ｎＭであったのに対して、Ｈ９／ＩＩＩＢに対しては０．０１４ｎＭであった。
【０１０６】
実施例９
この実施例において、その中でシアノビリンを発現するための、哺乳動物細胞の形質転換について述べる。哺乳動物細胞中でのシアノビリンの発現の証明に適した遺伝子構築物をＦＬＡＧ−シアノビリン−ＮをコードするＤＮＡ配列をｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現ベクター（IBI-Kodak，Rochester，NY）に連結させることによって調製した。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列（配列表配列番号３）をあらかじめ構築したプラスミドから切り出し、ｐＦＬＡＧ ＣＭＶ−１ベクターに標準的な組換えＤＮＡの手法を用いて連結した。アフリカミドリザル細胞（ＣＯＳ−７細胞、American Type Culture Collection，Rockville，MD から入手）をＤＥＡＥデキストラン溶液中で該構築物に暴露することによって形質転換した。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの発現を測定するために、細胞を７２時間後に溶解し、ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に付した。図１１に示されるように、大腸菌中で産生されるネイティブ組換え ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎに比べて実質的により大きなみかけ分子量ではあるが、形質転換されたＣＯＳ−７細胞において抗ＦＬＡＧ免疫反応性の物質が容易に検出された。以下の実施例１０と同じ方法で行った消化産物の診断的解析は、この分子量の増加がＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの翻訳後の修飾（Ｎ結合型オリゴサッカライド）によるものであることを示した。
【０１０７】
実施例１０
この実施例において、哺乳動物のものではない細胞、より具体的には酵母細胞内での形質転換およびシアノビリン発現について述べる。ピキア・パストリス中でのシアノビリンの発現を証明するために適した遺伝子の構築物を、シアノビリン−ＮをコードするＤＮＡ配列をｐＰＩＣ９発現ベクター（Invitrogen Corporation，San Diego，CA）に連結することによって調製した。シアノビリン−Ｎコード配列（配列表配列番号１）をあらかじめ構築したプラスミドから切り出し、標準的な組換えＤＮＡの手法を用いてベクターに連結した。酵母細胞をエレクトロポレーションによって形質転換し、特徴づけのためにクローンを選択した。いくつかのクローンが、抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体（例えば実施例１１参照）に反応する物質を発現し、培養培地中に分泌していることがわかった。実施例９に記載されている哺乳動物フォームでの観察と同様に、酵母由来の産物のＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析におけるみかけ分子量の上昇はこの発現システムにおいて、シアノビリン−Ｎの翻訳後の修飾が起こっていることを示唆した。
【０１０８】
この修飾をさらに明確にするために、２つのクローン由来の分泌産物をペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼで消化した。この酵素は、New England Biolabs（Beverly，MA）から入手され、アスパラギン残基に結合したオリゴサッカライド部分を特異的に開裂する。図１２に示されるように、この処理は該産物のみかけ分子量を、大腸菌中で発現されるネイティブ組換えシアノビリン−Ｎと同じにまで減少させた。シアノビリンのアミノ酸配列の精査は唯１つのＮ−結合型修飾の認識部位（ポジション３０に位置するアスパラギンに結合する）を明らかにした。これをグリコシル化の部位としてさらに立証するために、この位置で変異を導入し、アスパラギン残基をグルタミンに変えた（Ｎ３０Ｑ）。この変異型の発現は、結果的にネイティブ組換えＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎのそれに一致する分子量を有する免疫反応性の物質を産生した。
【０１０９】
実施例１１
この実施例において、シアノビリンに特異的に結合する抗体についてさらに述べる。３羽の２月齢のニュージーランド白ウサギ（１．８−２．２ｋｇ）を以下の免疫手順に付した：全量１００μｇのシアノビリン−Ｎをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）とフロインドの不完全アジュバントとの１：１の懸濁液１００μｌに溶解し、各々の後肢の２か所で筋肉内注射によって投与し；最初の注射から８−１６カ月で、ウサギ１羽あたり最終ブースト５０μｇのシアノビリン−ＮをＰＢＳとフロインドの不完全アジュバントとの１：１の懸濁液１０００μｌに溶解し、腹腔内注射によって投与し；４２、７０、９８および１２２日目に、１０ｍｌの血液を各ウサギの耳静脈から取り；最後の腹腔内ブーストの１４日後に該ウサギを屠殺して放血させた。上述のウサギから得られた免疫血清のＩｇＧ画分を、Goudswaardら（Scand．J．Immunol. 8，21-28，1978）の方法によってプロテイン−Ａセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。このポリクローナル抗体調製品のシアノビリン−Ｎに対する反応性を、ウサギＩｇＧ画分の１：１０００から１：５０００希釈物を用いてウエスタンブロット解析によって証明した。
【０１１０】
図１３は、上述の方法によって調製された該抗体が本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体であることをさらに示している。シアノビリン−Ｎを産生するように設計した大腸菌株ＤＨ５αからの全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Laemmeli（Nature 227，680-685，1970）に従って、１８％のポリアクリルアミドが溶解しているゲルおよび通常の不連続な緩衝液系を用いて行った。蛋白質はクマシーブリリアントブルーで染色することによって可視化した（図１３）。ウエスタンブロット解析については、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜上に電気的に溶出した。膜上の非特異的な結合部位を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で洗浄することによってブロックした。ついで、該膜をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で１：３０００に希釈した上述のウサギ抗シアノビリン−Ｎ免疫血清由来のＩｇＧ画分の溶液中でインキュベートした。続いて、該膜を１：１００００に希釈されたヤギ−抗ウサギ−ペルオキシダーゼ結合体（Sigma）を含有する２次抗体溶液中でインキュベートした。結合した２次抗体複合体を、該膜をケミルミネッセンス基質中でインキュベートし、Ｘ線フィルムに露出することによって可視化した（図１３Ｂ）。
【０１１１】
さらに当業者は、十分に立証された、ルーティンの手法（例えばHarlowとLane，1988，上述，参照）によっても同様に、本発明の蛋白質を抗原として用いてモノクローナル抗体を作製しうること、そしてそのようにして得られたモノクローナル抗体が同様に本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体であることを示すことができるということがわかるだろう。ここに挙げた全ての引例は、言及することによってそっくりそのままそれにより組み入れられるものである。本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、当業者には好ましい蛋白質、コンジュゲート、宿主細胞、組成物、方法などのバリエーションが使用され得ること、本発明がここで具体的に記載された以外によっても実施されてもよいことが意図されるものであることが自明であろう。従って、本発明は添付の請求の範囲によって定義される該発明の精神と範囲に包含されるすべての変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】図１Ａは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣクロマトグラムを表す、時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果を５０％防御した各ＨＰＬＣ画分の最大希釈を示す、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の最大希釈の棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣクロマトグラムを表す、時間(分)に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果を５０％防御した各画分の最大希釈を示す、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の最大希釈の棒グラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図２】図２は、合成シアノビリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を例示している。
【図３】図３は、図２の配列からＦＬＡＧオクタペプチドのコドンおよびHindIII 制限部位を除くために用いられた部位特異的突然変異誘発作戦を示している。
【図４】図４は、組換えネイティブシアノビリン−Ｎの精製から得られる特有のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、ノストック・エリプソスポラム（Nostoc ellipsosporum）由来のネイティブシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、組換えシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、組換えＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢＣＥＣＦアッセイにおけるＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ培養細胞の相対的ＤＮＡ量を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＸＴＴアッセイにおけるＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、感染力のあるウイルスまたはウイルス複製の指数に及ぼすシアノビリン−Ｎの濃度範囲の効果を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図７】図７は、シアノビリン−Ｎの遅延添加研究の結果を示す、添加時間（時間）に対する％非感染コントロールのグラフであって、ＨＩＶ−１ＲＦに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞における抗ＨＩＶ活性を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、ｇｐ１２０をシアノビリンの主要な分子標的と確定するシアノビリン／ｇｐ１２０相互作用を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（μｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｇｐ１２０のシアノビリン−Ｎが西洋ワサビペルオキシダーゼ複合物（ｇｐ１２０−ＨＲＰ）に濃度依存的に特異的に結合したことを示す、シアノビリン−Ｎとｇｐ１２０−ＨＲＰ複合物との結合のドットブロットである。
【図９】図９は、シュードモナス外毒素コード配列に連結されたＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列を含むＤＮＡコード配列を模式的に示す。
【図１０】図１０は、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ／シュードモナス外毒素蛋白質複合物（ＰＰＥ）によるウイルスｇｐ１２０発現（Ｈ９／III Ｂ）細胞の選択的殺傷を示す、ＰＰＥ濃度（ｎＭ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフである。
【図１１】図１１は、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎを発現するように操作され、形質転換された溶解ＣＯＳ−７細胞のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像のウェスタンブロットである（検出は抗ＦＬＡＧ抗体による）。
【図１２】図１２は、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼによって消化された、シアノビリンを産生するように操作され形質転換されたピキア・パストリスからの分泌産物の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像のウェスタンブロットである（検出は抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体による）。
【図１３】図１３は、シアノビリン−Ｎを産生するように操作された大腸菌の全細胞溶解物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）である（検出は抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体による）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウイルス蛋白質（集合的にシアノビリンと称する）およびその複合物、それに対する抗体、それをコードするＤＮＡ配列、それを含む組成物、それを産生するように形質転換された宿主細胞、該細胞を含む組成物、並びにその使用方法および取得方法、特に抗ウイルス治療および予防などの臨床応用における当該方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は死に至る病であり、その報告症例は過去２０年間で劇的に増加した。ＡＩＤＳを引き起こすウイルスは１９８３年に初めて同定された。それはいくつかの名前と頭字語で知られている。ＡＩＤＳウイルスは３番目に知られたＴリンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ-III）であり、免疫系の細胞内で複製する能力を有し、容赦のない細胞破壊を引き起こす。ＡＩＤＳウイルスはレトロウイルス、すなわち、複製中に逆転写酵素を使用するウイルスである。この特定のレトロウイルスはまた、リンパ腺症随伴ウイルス（ＬＡＶ）、ＡＩＤＳ関連ウイルス（ＡＲＶ）および、現在ではヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）としても知られている。現在までに際だって区別される２つのＨＩＶのファミリー、すなわち、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が記載されている。ここではＨＩＶという頭字語を、ＨＩＶウイルスを包括的に指すのに用いる。
【０００３】
ＨＩＶはＣＤ４陽性ヘルパー／インデューサーＴ細胞に対して激しい細胞変性効果を示し、それによって免疫系を激しく傷つける。ＨＩＶ感染はまた、結果として神経に悪化をきたし、最終的には感染した個体を死に至らしめる。世界中で何千万人もの人々がＨＩＶに感染し、有効な治療法がないので、それらのほとんどの人が死亡する運命にある。長い潜伏期間、最初の感染から症状が表れるまで、もしくはＡＩＤＳによる死亡までの期間に、感染者は、性的接触、静注薬物乱用中における汚染針交換、血液または血液製剤の点滴、あるいは胎児または新生児へのＨＩＶの母子感染によってさらに感染を拡大させる。したがって、既に感染した個体におけるＨＩＶ疾患の進行を妨げる有効な治療薬だけでなく、感染者から非感染者へのＨＩＶ感染の拡大を防ぐ方法が緊急に必要とされている。実際、世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＡＩＤＳの世界的流行のさらなる拡大を抑えるのに役立つ有効な抗ＨＩＶ性予防的殺ウイルス剤の探索を、緊急に国際的に優先させている（Balter，Science 266，1312-1313，1994; Merson，Science 260，1266-1268，1993; Taylor，J．NIH Res. 6，26-27，1994; Rosenberg ら，Sex．Transm．Dis. 20，41-44，1993; Rosenberg，Am．J．Public Health 82，1473-1478，1992）。
【０００４】
ウイルス治療学の分野は、レトロウイルス、とりわけＨＩＶに対して有効な薬剤の必要性に応じて発達してきた。ある薬剤が抗レトロウイルス活性を示す様式は数多くある（例えば、DeClercq，Adv．Virus Res. 42，1-55，1993; DeClercq,J．Acquir．Immun．Def．Synd. 4，207-218，1991; Mitsuyaら，Science 249，1533-1544，1990を参照）。ＡＺＴのようにウイルス逆転写酵素を阻害するヌクレオシド誘導体は、抗ＨＩＶ治療に現在市販されている数少ない臨床上有効な薬剤の中の一つである。ＡＺＴおよび関連化合物はある患者においては非常に有用であるが、その毒性と、十分に適した治療を行うには治療指針が不十分であることのために、その有用性には限度がある。また、より最近、ＨＩＶ感染のダイナミックスが明らかになったので（Coffin，Science 267，483-489，1995; Cohen，Science 267，179，1995; Perelson ら，Science 271，1582-1586，1996）、ウイルスにより誘導される感染細胞の殺傷に応答して生体中に生じる新生の非感染免疫細胞の感染を阻害するには、ウイルスの複製サイクルのできるだけ早い時期に作用する薬剤が必要であることが今だんだん明らかになってきている。また、感染細胞によって産生される感染力のある新しいウイルスを中和または阻害することが不可欠である。
【０００５】
ＨＩＶ−１および関連の霊長類免疫不全ウイルスによるＣＤ陽性細胞の感染は、各ウイルスエンベロープ糖蛋白質（集合的に「ｇｐ１２０」と称する）と細胞表面受容体ＣＤ４の相互作用に始まり、融合および侵入と続く（Sattentau，AIDS 2，101-105，1988; Koenigら，PNAS USA 86，2443-2447，1989）。生産的に感染したウイルス産生細胞はその細胞表面にｇｐ１２０を発現し、感染細胞のｇｐ１２０と非感染細胞上のＣＤ４の相互作用の結果、機能障害的な多細胞性のシンシチウムが形成され、さらにウイルス感染を拡大させる（Freed ら，Bull．Inst．Pasteur 88，73，1990）。したがって、ｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用は、最初のウイルスと細胞の結合を防ぐか、あるいは細胞と細胞の融合をブロックすることでＨＩＶ感染および細胞の発病を妨げる上で、特に魅力ある標的である（Capon ら，Ann．Rev．Immunol. 9，649-678，1991）。インビボでウイルスまたは感染細胞から流出したウイルスフリー即ち「可溶性の」ｇｐ１２０は、そうでなければ、中枢神経系を含めた全身での非感染性の免疫発病プロセスに寄与するかもしれないので、それもまた重要な治療上の標的である。（Capon ら，1991，上述; Lipton，Nature 367，113-114，1994）。多くのワクチン研究がｇｐ１２０に焦点を当ててきたが、ｇｐ１２０中和決定基の超可変性およびその結果として起こるｇｐ１２０指向性抗体に対するウイルスの感受性の著しい株依存性によって進歩が阻まれている。（Berzofsky，J．Acq．Immun．Def．Synd. 4，451-459，1991）。ｇｐ１２０に特に焦点を絞った薬剤の発見および開発研究は比較的少ない。顕著な例外は、切り詰められた組換え「ＣＤ４」蛋白質（「可溶性ＣＤ４」または「ｓＣＤ４」）に充てられてきた注目に値する努力であるが、それらはｇｐ１２０に結合してインビトロでのＨＩＶ感染力を阻害する（Capon ら，1991，上述; Schooleyら，Ann．Int．Med. 112，247-253，1990; Husson ら，J．Pediatr. 121，627-633，1992）。しかしながら、ＨＩＶの研究室株とは対照的に、臨床上の分離株はｓＣＤ４による中和に高い抵抗性を示すことが明らかになっている（Orloffら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 11，335-342，1995; Moore ら，J．Virol．66，235-243，1992）。ｓＣＤ４（Schooleyら，1990，上述; Hussonら，1992，上述）およびｓＣＤ４に連結された免疫グロブリン（Langner ら，Arch．Virol.130，157-170，1993）、さらにウイルス発現細胞に結合してそれを破壊するように設計されたｓＣＤ４に連結された毒素（Davey ら，J．Infect．Dis. 170，1180-1188，1994; Ramachandranら，J．Infect．Dis. 170，1009-1013，1994）の初期の臨床試験は期待に反するものであった。インビボで直接ｓＣＤ４を作りだそうとするより新しい遺伝子治療のアプローチ（Morganら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 10，1507-1515，1994）も同様に挫折を経験するであろう。
【０００６】
それ故、単独で、あるいはＡＺＴおよび／または他の利用可能な抗ウイルス剤との併用で用いられる新規抗ウイルス剤が、ＡＩＤＳに対する有効な抗ウイルス治療には必要である。ＨＩＶ感染を防ぐのに使用し得る新薬はまた予防にも重要である。必要とされるどちらの領域においても、理想的な新薬とは、ウイルスの生活環のできるだけ早い時期に作用し、できるだけウイルス特異的であり（すなわち、ウイルスに特異的な分子標的を攻撃するが、感染したまたは感染し得る動物宿主に特異的な分子標的を攻撃しない）、無傷ウイルスの感染力を無くし、ウイルスに感染した哺乳動物細胞の死または機能障害を防ぎ、感染細胞からのさらなるウイルス産生を防ぎ、非感染哺乳動物細胞へのウイルス感染の拡大を防ぎ、可能な限り広い範囲のＨＩＶの株および分離株に対して非常に強力で活性があり、生理学的および厳しい環境条件下で分解しにくく、容易に且つ安価に大量生産されるものであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前述の特に有利な特性を少なくとも幾つか有する抗ウイルス蛋白質およびその複合物、さらにそれを含有する組成物並びにその製造および使用方法を提供することを目的とする。本発明のこれらのおよび他の目的、並びに発明のさらなる特徴はここに与えられる記載から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗ウイルス剤、特に抗ウイルス蛋白質（集合的にシアノビリンと称する）およびその複合物を提供する。本発明はまた、シアノビリンおよびその複合物の取得方法、シアノビリンおよびその複合物をコードする核酸分子、前記核酸分子を含む宿主細胞、シアノビリンを使用してエフェクター分子をウイルスにターゲッティングする方法および実質的に純粋なシアノビリンおよびその複合物の取得方法を提供する。シアノビリン、その複合物およびシアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞は、医薬組成物のように、さらに１またはそれ以上の他の抗ウイルス剤を含有することができる組成物中で使用することができる。本発明はまた、ウイルスに感染したかあるいは感染の危険のある動物、例えばヒトの治療的および／または予防的処置、並びにヒトなどの動物のウイルス感染を防ぐための、対象無生物（例えば医療用および実験用の装置および備品）さらに懸濁液および溶液（例えば血液、血液製剤および組織）の処置における、シアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞およびそれらの組成物の単独または他の抗ウイルス剤と組み合わせた使用を提供する。さらに本発明は、１またはそれ以上のシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞および／またはそれらの組成物の投与または適用を含む、ウイルスに感染したかあるいは感染の危険のある動物、例えばヒトの治療的または予防的処置方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、培養シアノバクテリア（藍藻）からのある特定の抽出物が抗ＨＩＶスクリーニングにおいて抗ウイルス活性を示したという観察に基づいている。該抗ＨＩＶスクリーニングは１９８６年に考案され（国立衛生研究所のＭ．Ｒ．ボイドによる）、１９８８年から合衆国国立ガン研究所（ＮＣＩ）で開発・実施されている（Boyd，in AIDS，Etiology，Diagnosis，Treatment and Prevention，DeVitaら編，Philadelphia: Lippincott，1988，pp．305-317 を参照）。
【００１０】
シアノバクテリア（藍藻）は構造的に独特で且つ生物学的に活性な、非常に多様な窒素を含まない、アミノ酸から誘導される天然産物を産生することが知られていたので、抗ＨＩＶスクリーニングに特に選ばれた（Faulkner，Nat．Prod．Rep. 11，355-394，1994; Glombitzaら，in Algal and Cyanobacterial Biotechnology，Cresswell，R.C.ら編，1989，pp．211-218）。これらの光合成原核生物は、しばしば肝臓毒性または抗微生物性を示す（Okino ら，Tetrahedron Lett．34，501-504，1993; Krishnamurthyら，PNAS USA 86，770-774，1989; Sivonen ら，Chem．Res．Toxicol. 5，464-469，1992; Carterら，J．Org．Chem. 49，236-241，1984; Frankmolle ら，J．Antibiot. 45，1451-1457，1992）環状および直鎖状ペプチド（分子量は一般に＜３ｋＤａ）の重要な産生体である。高分子量シアノバクテリア蛋白質の配列決定研究は、一般に基礎代謝プロセスに関連するものまたは系統分類学的マーカーとして役立ち得るものに焦点が絞られていた（Suter ら，FEBS Lett. 217，279-282，1987; Rumbeliら，FEBS Lett. 221，1-2,1987; Swanson ら，J．Biol．Chem. 267，16146-16154，1992; Michalowskiら，Nucleic Acids Res. 18，2186，1990; Shermanら，in The Cyanobacteria，Fay ら編，Elsevier: New York，1987，pp．1-33; Rogers，in The Cyanobacteria，Fay ら編，Elsevier: New York，1987，pp．35-67）。一般的にいって、抗ウイルス特性を有する蛋白質はシアノバクテリア源と結びつかない。
【００１１】
本発明を導くシアノバクテリア抽出物は、上記の抗ＨＩＶスクリーニングにおいて最初にランダムに選ばれ、やみくもに試験された何千もの異なる抽出物の中の一つであった。ＮＣＩのスクリーニングにおいて、これらの抽出物の多くが予備測定で抗ウイルス活性を示していた（Patterson ら，J．Phycol. 29，125-130，1993）。この群から、記載通りに（Patterson，1993,上述）調製され、ＮＣＩの一次スクリーニングにおいて異常に高い抗ＨＩＶ能およびインビトロでの「治療指数」を示したノストック・エリプソスポラム由来の水性抽出物を詳細な調査のために選んだ。ＨＩＶに対して非常に高活性な均質蛋白質を単離・精製するために、特定のバイオアッセイを指標とした戦略を用いた。
【００１２】
このバイオアッセイを指標とした戦略において、分画のための抽出物の最初の選択、さらに適用する全体的な化学的単離方法およびその中での個々の工程の性質についての決定は、生物学的試験のデータを解釈して取り決めた。単離および精製プロセスを導くのに用いられた抗ＨＩＶスクリーンアッセイ（例えばBoyd，1988，上述; Weislow ら，J．Natl．Cancer Inst. 81，577-586，1989）は、ＨＩＶの細胞変性効果からヒトＴ芽球様細胞を防御する度合を測定するものである。目的の抽出物の画分を多様な化学的手段を用いて調製し、一次スクリーニングにおいてはやみくもに試験する。活性画分をさらに分離して、得られた下位画分を同様にスクリーニングにおいてやみくもに試験する。このプロセスを活性化合物、すなわち、純粋な化合物に相当する抗ウイルス性画分を取得するのに必要なだけ何度も繰り返し、次いでそれを詳細な化学分析および構造解明に供することができる。
【００１３】
この戦略を用いると、ノストック・エリプソスポラムの水性抽出物は抗ウイルス蛋白質を含んでいることがわかった。本発明を記載するためにここで用いる「蛋白質」という語はいかなる特定の長さのアミノ酸配列にも限定されず、１００またはそれ以上のアミノ酸を含む分子、並びに１００より少ないアミノ酸を含む分子（時折、「ペプチド」と称される）が含まれることに留意すべきである。
【００１４】
したがって、本発明はノストック・エリプソスポラム由来の単離精製された抗ウイルス蛋白質、特にシアノビリン−Ｎとして知られる単離精製された抗ウイルス蛋白質を提供する。本発明はまた他のシアノビリンを提供する。「シアノビリン」という語は、ここでは、ノストック・エリプソスポラムから単離される天然の抗ウイルス蛋白質（「ネイティブシアノビリン」）およびあらゆる機能的に等価な蛋白質またはその誘導体を包括的にいうのに用いられる。
【００１５】
本発明において、このような機能的に等価な蛋白質またはその誘導体とは、（ａ）ネイティブシアノビリン（とりわけシアノビリン−Ｎ）中に含まれる９個の隣接するアミノ酸下位配列のいずれかと直接に相同な（好ましくは同一の）、少なくとも９個（好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも５０個）のアミノ酸配列を含み、（ｂ）抗ウイルス性である、詳細にはウイルス、特に霊長類免疫不全ウイルス、就中ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２またはＳＩＶに特異的に結合し得るか、あるいは各ウイルスの１またはそれ以上のウイルス抗原、特にｇｐ１２０のようなエンベロープ糖蛋白質を発現する感染宿主細胞に特異的に結合し得るものである。さらに、このような機能的に等価な蛋白質またはその誘導体は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１，２，３，４または５個および最も好ましくは１または２個のアミノ酸が、ネイティブシアノビリンの一端または両端から、好ましくは一端のみから、最も好ましくはアミノ末端から除去されたネイティブシアノビリン、特にシアノビリン−Ｎ（配列番号２を参照）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のシアノビリンは、好ましくはノストック・エリプソスポラム由来の抗ウイルス蛋白質、特にネイティブシアノビリン、就中シアノビリン−Ｎのアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含む。本発明のシアノビリンに関し、「実質的に相同な」とは、シアノビリンを抗ウイルス性にするのに十分な相同性、好ましくはノストック・エリプソスポラムから単離された抗ウイルス蛋白質に特有の抗ウイルス活性を有するようにするのに十分な相同性を意味する。好ましくは少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７５％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在することである。
【００１７】
したがって、本発明は、特に配列番号１の配列を含む核酸分子、配列番号３の配列を含む核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子または配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質のように、シアノビリンのコード配列を含む核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、毒素または免疫学的試薬のような、１またはそれ以上の選ばれたエフェクター分子に連結されたシアノビリンを含むシアノビリン複合物を提供する。「免疫学的試薬」という語は、ここでは抗体、免疫グロブリンおよび免疫学的な認識要素をいうのに用いられる。免疫学的な認識要素とは、ペプチド、例えば組換えシアノビリン−ＦＬＡＧ融合蛋白質のＦＬＡＧ配列のように、免疫学的な認識を通じてそれが接着する蛋白質の単離および／または精製および／または解析を容易にする要素である。シアノビリン融合蛋白質はシアノビリン複合体の一類型であり、そこではシアノビリンは、望ましい特性またはエフェクター機能（例えば細胞毒性または免疫学的特性、あるいは該融合蛋白質の単離、精製もしくは解析を容易にするなどの他の望ましい特性）のいずれかを有する１またはそれ以上の他の蛋白質に連結されている。
【００１９】
本発明はまた、ノストック・エリプソスポラムからのシアノビリンの取得方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）抗ウイルス活性を含むノストック・エリプソスポラムの抽出物を同定し、（ｂ）該抽出物から任意に高分子量の生体高分子を除去し、（ｃ）抗ウイルスバイオアッセイをガイドに該抽出物を分画してシアノビリンの部分精製された抽出物を得、および（ｄ）部分精製された抽出物を逆相ＨＰＬＣによりさらに精製してシアノビリンを得ることを含む（実施例１を参照）。好ましくは、該方法は抽出物から高分子量の生体高分子を除去するためのエタノールの使用および該抽出物の分画を導くための抗ＨＩＶバイオアッセイの使用を含む。
【００２０】
シアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）のように、本発明の方法に従って単離および精製されたシアノビリンは、得られた純粋な蛋白質のアミノ酸配列を決定するのに典型的に用いられる慣用の手順に供することができる。すなわち、該シアノビリンは無傷蛋白質およびエンドプロテイナーゼ消化により生じる重複したペプチド断片のＮ末端エドマン分解によって配列決定することができる。アミノ酸分析はこの演繹された配列と一致するのが望ましい。同様に、還元されたＨＰＬＣ精製シアノビリン−ＮのＥＳＩ質量スペクトル分析は、計算値と一致した分子イオン値を示すのが望ましい。
【００２１】
これらの研究より、ノストック・エリプソスポラム由来のシアノビリン−Ｎが、以前に記載された蛋白質または公知のヌクレオチド配列の転写産物とほとんどもしくは全く有意な相同性を有しない１０１アミノ酸の独特な配列を含むことがわかった。シアノビリン由来のせいぜい８個の隣接するアミノ酸配列が公知蛋白質由来のアミノ酸配列のいくつかに見出されるにすぎず、シアノビリン−Ｎと１３％を越える配列相同性を含むいかなる起源のいかなる蛋白質も知られていない。シアノビリン−Ｎの化学的に演繹されたアミノ酸配列が得られたので、対応する組換えシアノビリン−Ｎ（ｒ−シアノビリン−Ｎまたはｒ−ＣＶ−Ｎ）が創製および使用されて、演繹されたアミノ酸配列が実際にＨＩＶのようなウイルスに対して有効であることが明確に証明された（実施例２〜５を参照）。
【００２２】
本発明はさらに、シアノビリン（特にネイティブシアノビリン、就中シアノビリン−Ｎ）をコードする配列を含む単離精製された核酸分子および合成核酸分子を提供する。このような核酸分子としては、配列番号１の配列を含む単離精製された核酸分子、配列番号３の配列を含む単離精製された核酸分子、配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離精製された核酸分子、配列番号４のアミノ酸配列をコードする単離精製された核酸分子および前記核酸分子のいずれか１つまたはそれ以上と実質的に相同な核酸分子が挙げられる。本発明の核酸分子に関して、「実質的に相同な」という語は、該核酸分子にコードされる蛋白質を抗ウイルス性にするのに十分な相同性、好ましくはノストック・エリプソスポラムから単離された抗ウイルス蛋白質に特有の抗ウイルス活性を有するようにするのに十分な相同性を意味する。好ましくは少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７５％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在することである。
【００２３】
本発明の核酸分子は、望ましくは配列番号２のアミノ酸配列の、少なくとも９個（好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、最も好ましくは少なくとも５０個）の隣接するアミノ酸をコードする核酸配列を含む。本発明の核酸分子はまた、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１，２，３，４または５個および最も好ましくは１または２個のアミノ酸が、ネイティブシアノビリンの一端または両端から、好ましくは一端のみから、最も好ましくはアミノ末端から除去されたネイティブシアノビリン、特にシアノビリン−Ｎのアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸配列を含む。
【００２４】
本開示によれば、部分的なシアノビリン−Ｎ遺伝子のコドン配列が、完全に機能的な、すなわち、抗ＨＩＶのような抗ウイルス性のシアノビリンをコードするにおそらく十分であろうことが当業者には明らかであろう。機能的なシアノビリンの最小の必須ＤＮＡコード配列は、例えばネイティブシアノビリンを含む下部配列を合成して評価したり、シアノビリン−ＮのＤＮＡコード配列の部位特異的突然変異誘発を研究することによって、当業者が容易に決定することができる。
【００２５】
適当なＤＮＡコード配列を用いて、組換えシアノビリンを遺伝子工学技術により作ることができる（例えば、一般的な背景については、Nicholl，in An Introduction to Genetic Engineering，Cambridge University Press: Cambridge，1994，pp．1-5および127-130; Steinbergら，in Recombinant DNA Technology Concepts and Biomedical Applications，Prentice Hall: Englewood Cliffs，NJ, 1993，pp．81-124 および150-162; Sofer，in Introduction to Genetic Engineering，Butterworth-Heinemann，Stoneham，MA，1991，pp．1-21 および103-126; Oldら，in Principles of Gene Manipulation，Blackwell Scientific Publishers: London，1992，pp．1-13 および108-221; Emtage，in Delivery Systemsfor Peptide Drugs, Davisら編，Plenum Press: New York，1986，pp．23-33 を参照）。例えば、シアノビリンをコードするノストック・エリプソスポラム遺伝子またはｃＤＮＡを同定しサブクローニングすることができる。次いで該遺伝子またはｃＤＮＡを適当な発現ベクター中に組み込み、適当な蛋白質合成生物（例えば、大腸菌、Ｓ．セレビシエ、Ｐ．パストリスまたは他の細菌、酵母、昆虫もしくは哺乳動物細胞）中に送達し、そこで該遺伝子を内因性または外因性プロモーターの制御下に適当に転写および翻訳させることができる。このような発現ベクター（ファージ、コスミド、ウイルスおよびプラスミドベクターを含むがこれに限定されない）は、遺伝子導入に適した試薬および技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、形質導入、マイクロインジェクション、形質転換、その他）と同様、当業者に知られている。その後、組換え生産された蛋白質を当該技術分野で公知の標準的技術（例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、溶解度分画法、等電点電気泳動、その他）を用いて単離および精製し、抗ウイルス活性を調べることができる。
【００２６】
あるいは、非組換え法（例えば、実施例１および前述の解説）によってネイティブシアノビリンをノストック・エリプソスポラムから取得し、慣用の技術により配列を決定することができる。次いで、該配列を用いて対応するＤＮＡを合成し、適当な発現ベクター中にサブクローニングして、所望の蛋白質の大量組換え生産用の蛋白質合成細胞中に送達することができる。
【００２７】
この点に関して、本発明はまた、本発明の核酸分子、例えばノストック・エリプソスポラムのシアノビリン遺伝子、シアノビリンをコードするｃＤＮＡまたはシアノビリンをコードする合成ＤＮＡ配列のようなＤＮＡ配列を含むベクターを提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞、並びにこのような宿主細胞を用いてシアノビリンを製造する方法を提供する。
【００２８】
単離精製されたものであれ合成であれ、シアノビリンをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡはシアノビリン全体またはその一部（望ましくはその抗ウイルス活性な部分）をコードしていればよい。該ＤＮＡまたはｃＤＮＡがネイティブシアノビリンの全コード配列を含まない場合、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡを遺伝子融合の一部としてサブクローニングすることができる。転写の際の遺伝子融合において、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡは蛋白質の適当な産生を指示する自身の制御配列（例えばリボソーム結合部位、翻訳開始コドン、その他）を含み、転写制御配列（例えば、プロモーター要素および／またはエンハンサー）はベクターによって提供されるであろう。翻訳の際の遺伝子融合においては、転写制御配列および翻訳制御排列の少なくとも幾つか（すなわち、翻訳開始コドン）がベクターによって提供されるであろう。翻訳の際の遺伝子融合の場合はキメラ蛋白質が産生されるだろう。
【００２９】
遺伝子はまた、機能的なシアノビリン成分に加えて複合蛋白質に付加的な所望の特性を与える融合成分を含む特定の融合蛋白質用に構築することもできる。例えば、上で定義した、毒素または免疫学的試薬の融合配列を、（例えば、実施例２〜５に記載されるＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質のような）機能的蛋白質の精製および解析を容易にするために付加することができる。
【００３０】
遺伝子は、ウイルス感染（例えばＨＩＶおよび／またはＨＩＶ感染）細胞に特異的にターゲッティングさせるために、毒素や免疫学的試薬のようなエフェクター蛋白質に連結されたシアノビリンを含む融合蛋白質をコードするように、特に構築することができる。このような例において、シアノビリン部分は中和剤として働くだけでなく、これらの分子のエフェクター活性をＨＩＶのような所定のウイルスに対して選択的に方向づけるターゲッティング剤としても働く。したがって、例えば、機能的シアノビリンのＨＩＶターゲッティング機能を感染力のあるウイルスの中和を目的とする毒素と組み合わせることにより、および／またはＨＩＶのような感染力のあるウイルスを産生する細胞を破壊することにより、治療薬を得ることができる。同様に、シアノビリンのウイルスターゲッティング機能を種々の免疫グロブリンサブクラスの多価性およびエフェクター機能と組み合わせた治療薬を得ることができる。実施例６は、さらにシアノビリンのウイルスターゲッティング、特にｇｐ１２０ターゲッティング特性を実証している。
【００３１】
同様の論理的根拠により、ｓＣＤ４のＨＩＶ ｇｐ１２０ターゲッティング特性を利用する広範な開発的治療努力が成されている。例えば、ｓＣＤ４をシュードモナス外毒素成分（Chaudhary ら，in The Human Retrovirus，Galloら編，Academic Press: San Diego，1991，pp．379-387; Chaudhary ら，Nature 335，369-372，1988）、ジフテリア毒素成分（Aullo ら，EMB0 J. 11，575-583，1992）
またはリシンＡ鎖成分（Tillら，Science 242，1166-1167，1988）に連結したｓＣＤ４−毒素複合物が調製されている。同様に、機能的ｓＣＤ４活性のインビボでのクリアランス速度を減少させ、胎盤による移送を増大させ、病原体除去（例えば、食作用的吸引および抗体依存的細胞媒介細胞毒性による殺傷）の免疫学的機構に的を絞った補強をもたらしてＨＩＶ感染細胞およびウイルスを殺傷および／または除去するために、ｓＣＤ４−免疫グロブリン複合物が調製されている（Capon ら，Nature 337，525-531，1989; Traunecker ら，Nature 339，68-70，1989; Langnerら，1993，上述）。このようなＣＤ４−免疫グロブリン複合物（時々「免疫接合体」と呼ばれる）は、実際インビボで有利な薬物動態学的および分布的特性を、またインビトロで抗ＨＩＶ効果を示したが、臨床試験は失望させるものであった（Schooleyら，1990，上述; Hussonら，1992，上述; Langner ら，1993，上述）。ＨＩＶの臨床上の分離株は研究室株とは反対にｓＣＤ４による結合および中和に対して非常に抵抗力があるので（Orloffら，1995，上述; Moore ら，1992，上述）、これは驚くべきことではない。それ故、機能的シアノビリンの異常に広範な抗ウイルス活性、並びにウイルス、例えば、一般に霊長類レトロウイルスおよび、特に臨床および研究室株へターゲッティングする特性（例えば、実施例７を参照）は、毒素、免疫グロブリンおよび他の選ばれたエフェクター蛋白質と組み合わせるのにとりわけ有利である。
【００３２】
ウイルスにターゲッティングされる複合物は、遺伝子工学技術（例えば、Chaudhary ら，1988，上述）またはターゲッティングさせる成分とエフェクター成分との化学的な連結によって調製することができる。所定のシアノビリン複合物または融合蛋白質を構築するのに用いられる最も実現可能で且つ適当な技術は、シアノビリンに連結するのに選択された特定のエフェクター分子の特性を考慮して選択されるであろう。例えば、非蛋白性のエフェクター分子と連結する場合には、遺伝子工学技術よりもむしろ化学的な連結が所望のシアノビリン複合物を創製するのに最もふさわしい選択である。
【００３３】
本発明はしたがって、シアノビリン融合蛋白質自身に加えてシアノビリン融合蛋白質をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は配列番号３およびそれと実質的に相同な配列を含む核酸分子を提供する。本発明はまた、シアノビリン融合蛋白質をコードする核酸配列を含むベクターおよびシアノビリン融合蛋白質をコードするベクターを上述の蛋白質合成生物中で発現させることによるシアノビリン融合蛋白質の取得方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、上述のような毒素または免疫学的試薬のようなエフェクター蛋白質をコードする第二の核酸に連結された、本発明の蛋白質をコードする第一の核酸配列、例えば、前述の本発明の核酸のうちの一つのようなシアノビリンのコード配列、を含む単離精製された核酸分子を提供する。本発明はまた、さらにこのような核酸分子によってコードされる単離精製された蛋白質を提供する。
【００３５】
連結された分子（複合物）は、望ましくはウイルスを、より好ましくはＨＩＶを、最も好ましくは糖蛋白質ｇｐ１２０をターゲッティングする。該連結は、上述のようにＤＮＡレベルでまたは化学的連結によりなされ得る。例えば、本発明のシアノビリン−エフェクター蛋白質複合物は、（ａ）所望のエフェクター蛋白質を選択し、（ｂ）エフェクター蛋白質、例えば毒素または免疫学的試薬の第二のＤＮＡコード配列に連結された、機能的シアノビリンをコードする前記核酸分子配列の一つを含む第一のＤＮＡコード配列を含む、複合ＤＮＡコード配列を合成し、（ｃ）適当な蛋白質合成生物中で該複合ＤＮＡコード配列を発現させ、（ｄ）所望の融合蛋白質を実質的に純粋な形態にまで精製することによって得ることができる。あるいは、本発明のシアノビリン−エフェクター分子複合物は、（ａ）所望のエフェクター分子およびシアノビリンまたはシアノビリン融合蛋白質を選択し、（ｂ）シアノビリンまたはシアノビリン融合蛋白質をエフェクター分子に化学的に連結し、（ｃ）所望のシアノビリン−エフェクター分子複合物を実質的に純粋な形態で単離することにより得ることができる。毒素、免疫学的試薬または他の機能的試薬のような所望のエフェクター成分に連結された機能的シアノビリンを含む複合物は、以下の観察にしたがえば、シアノビリンのユニークなｇｐ１２０ターゲッティング特性を利用してより特異的に設計することさえできる。
【００３６】
実施例６より、シアノビリンの新規ｇｐ１２０指向効果が明らかとなる。固相ＥＬＩＳＡ実験からさらなる洞察を得ることができる（Boydら，1996，未刊）。例えば、ｇｐ１２０のＣ末端ｇｐ１２０エピトープ特異的な捕捉あるいはＣＤ４受容体による捕捉はどちらも、ポリクローナルＨＩＶ−１−Ｉｇか免疫学的に優性な三番目の超可変（Ｖ３）エピトープ（Matsushitaら，J．Virol. 62，2107-2114，1988）に対するマウスＭＡｂのいずれかで検出されれば、シアノビリン−Ｎによって著しく阻害されることがわかるだろう。一般に、ＣＤ４受容体の使用はＶ３エピトープの抗体認識を妨げないし、その逆もまたしかりである（Moore ら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 4，369-379，1988; Matsushita ら，1988，上述）。しかしながら、複数の際だって区別される非重複エピトープにおける免疫反応性の消失により示されるように、シアノビリン−Ｎは、見かけ上ｇｐ１２０に対してより全体的な配座における効果を及ぼし得る。
【００３７】
種々の標的細胞における多様なＣＤ４陽性反応性免疫不全ウイルス株に対するシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性（Boydら，1996，上述）は顕著である。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの多様な株が同様にシアノビリン感受性であることを示すことができる。臨床上の分離株と研究室株とは典型的に、本質的に等価な感受性を示すであろう（さらなる説明については実施例７を参照）。慢性的に感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞および非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞をシアノビリン−Ｎと共培養することにより、該蛋白質はウイルス複製を阻害するのではなく、細胞と細胞の融合およびウイルス伝達の濃度依存的な阻害を引き起こすことがわかる。ＨｅＬａ−ＣＤ４−ＬＴＲ−ｂ−ガラクトシダーゼ細胞を用いた結合および融合阻害アッセイから得られた同様の結果は、ウイルスと細胞および／または細胞と細胞の結合のシアノビリン−Ｎによる阻害と一致することがわかるだろう（Boydら，1996，上述）。実施例８では、ＨＩＶ感染細胞を選択的にターゲッティングし、それを殺傷するシアノビリン−毒素複合物を与えるための、複合物のＤＮＡコード配列の構築およびその発現について説明する。
【００３８】
本発明のシアノビリンおよびその複合物の抗ウイルス、例えば抗ＨＩＶ活性は、ヒトにおける抗ウイルス活性を合理的に予測させる、相互に関係を持つ一連のインビトロ抗ウイルスアッセイにおいてさらに実証することができる（Gulakowskiら，J．Virol．Methods 33，87-100，1991）。これらのアッセイは、ヒト標的細胞におけるＨＩＶの複製および／またはＨＩＶの細胞変性効果を化合物が妨げる能力を測定するものである。これらの測定は、インビボでのＨＩＶが誘導する疾患の発病と直接相関がある。実施例５で説明し、また、図８，９および１０に示したシアノビリンまたは複合物の抗ウイルス活性の分析結果は、ヒトにおけるインビボでのこれらの産物の抗ウイルス活性を予見させるものであり、したがって、本発明の利用性をさらに証明するものである。また、本発明はシアノビリンまたは複合物の生体外（ex vivo）での使用方法を提供するので（例えば、実施例５および図６および７で説明される結果を参照）、シアノビリンおよびその複合物はより広範な利用性をも有する。
【００３９】
本発明のシアノビリンおよびその複合物は、ウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス、すなわちＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のようなレトロウイルスを阻害することができるのがわかるだろう。本発明のシアノビリンおよび複合物は、他のレトロウイルスおよび他のウイルスを阻害するのにも用いることができる。本発明にしたがって処理することのできるウイルスの例としては、Ｃ型およびＤ型レトロウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＩＶ、ＦＬＶ、ＳＩＶ、ＭＬＶ、ＢＬＶ、ＢＩＶ、ウマ伝染性ウイルス、貧血症ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のようなトリ肉腫ウイルス、Ａ型、Ｂ型および非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス、アルボウイルス、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスおよび風疹ウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
シアノビリンおよびその複合物は蛋白質を含んでおり、そのせいで特にアミド結合の加水分解（例えばペプチダーゼにより触媒される）および必須のジスルフィド結合の破壊または不活性化させるかもしくは望ましくないジスルフィド結合の形成を起こしやすい（Caroneら，J．Lab．Clin．Med. 100，1-14，1982）。必要であれば、シアノビリンおよびその複合物の安定性を増大させるために、分子構造を変化させる種々の方法があり（Wunsch，Biopolymers 22，493-505，1983;Samanen,in Polymeric Materials in Medication，Gebeleinら編，Plenum Press:New York，1985，pp．227-242）、幾つかの状況下においては、ウイルス、例えばＨＩＶに対する治療的および予防的適用のためにはシアノビリンまたはその複合物を含有する医薬組成物の調製および使用に、それが不可欠かもしれない。シアノビリンまたはその複合物の有用な化学修飾についての可能性のある選択として以下のもの（Samanen，J.M.，1985,上述を改変）が挙げられるが、それらに限定されない：（ａ）オレフィン置換、（ｂ）カルボニル還元、（ｃ）Ｄ−アミノ酸置換、（ｄ）Ｎ α−メチル置換、（ｅ）Ｃ α−メチル置換、（ｆ）Ｃ α−Ｃ’−メチレン挿入、（ｇ）デヒドロアミノ酸挿入、（ｈ）逆反転修飾、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端への環状化および（ｊ）チオメチレン修飾。シアノビリンおよびその複合物はまた、安定性および蛋白質分解に対する抵抗性を増大させると期待される、炭水化物およびポリオキシエチレン誘導体の共有結合的付着によっても修飾することができる（Abuchowskiら，in Enzymes as Drugs,Holcenbergら編，John Wiley: New York，1981，pp．367-378）。
【００４１】
シアノビリンおよびその複合物のような蛋白質薬剤の送達システムおよび組成の設計、並びに投与経路の設計のための、他の重要な一般的考慮もまた当てはまる(Eppstein，CRC Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier Systems 5，99-139，1988; Siddiquiら，CRC Crit．Rev．Therapeutic Drug Carrier Systems 3，195-208，1987); Bangaら，Int．J．Pharmaceutics 48，15-50，1988; Sanders，Eur．J．Drug Metab．Pharmacokinetics 15，95-102，1990; Verhoef，Eur．J．Drug Metab．Pharmacokinetics15，83-93，1990）。所定のシアノビリンまたはその複合物に適当な送達システムは、その特定の性質、特定の臨床応用および薬剤の作用部位による。いかなる蛋白質薬剤もそうであるように、おそらくシアノビリンまたはその複合物の経口的送達にも、主として胃腸管における不安定性および無傷の生物活性のある薬剤のそこからの吸収および生物学的利用可能性の低さによる、特別な問題点が生じるであろう。したがって、とりわけ経口的送達の場合、しかしまた他の投与経路の時もそうなのだが、所定のシアノビリンまたはその複合物と組み合わせて吸収促進剤を使用する必要があるだろう。非常に多様な吸収促進剤が、経口的送達および他の経路での送達のために、蛋白質薬剤と組み合わせて調査および／または適用されている（Verhoef，1990,上述; van Hoogdalem，Pharmac．Ther. 44，407-443，1989; Davis，J．Pharm．Pharmacol. 44(Suppl．1)，186-190，1992）。きわめて一般的には、典型的な促進剤は（ａ）ＥＤＴＡ、サリチル酸塩およびコラーゲンのＮ−アシル誘導体のようなキレート剤、（ｂ）ラウリル硫酸塩およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルのような界面活性剤、（ｃ）グリコレート（glycholate）およびタウロコール酸塩のような胆汁酸塩、並びにタウロジヒドロフシジン酸塩のような誘導体、（ｄ）オレイン酸、カプリン酸のような脂肪酸、並びにアシルカルニチン類、モノグリセリド類およびジグリセリド類のようなそれらの誘導体、（ｅ）不飽和環状尿素類のような非界面活性剤、（ｆ）サポニン類、（ｇ）シクロデキストリン類および（ｈ）リン脂質類といった一般的な範疇に収まる。
【００４２】
本発明のシアノビリンおよびその複合物のような蛋白質薬剤の経口的送達を増大させる他のアプローチとして、胃腸の酵素に対する安定性および／または親油性を増大させる前記の化学修飾が挙げられる。あるいは、該蛋白質薬剤は、プロテアーゼおよび／または他の蛋白質の酵素的分解源の可能性のあるものを直接阻害する他の薬剤または物質と組み合わせて投与することができる。シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤の胃腸吸収を防ぐかあるいは遅らせるための、さらにもう一つの代替的アプローチは、該蛋白質を腸内腔の蛋白質分解酵素との接触から保護し、その吸収に適した領域に到達した時にのみ無傷蛋白質を放出するように設計された送達システム中に該薬剤を組み込むというものである。この戦略のより詳細な例は、攻撃を受けやすい薬剤を分解から保護し、さらに活性薬剤の放出を延長するための、生分解性マイクロカプセルまたはマイクロスフェアの使用である（Deasy，in Microencapsulation and Related Processes，Swarbrick 編，Marcell Dekker，Inc.: New York，1984，pp．1-60，88-89，208-211）。マイクロカプセルはまた、シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤の、注射後の送達を延長するのにも有用な方法を提供し得る（Maulding，J.Controlled Release 6，167-176，1987）。
【００４３】
蛋白質薬剤を首尾よく経口的に送達させるには、前記のような複雑さが考えられるので、多くの場合においては、本発明のシアノビリンおよびその複合物を、数多くの他の可能性のある蛋白質薬剤送達経路の一つにより送達させることが好ましい。このような経路としては、静脈内、動脈内、くも膜下、脳槽内、経口腔、経直腸、経鼻腔、経肺、経皮、経膣、経眼等が挙げられる（Eppstein，1988，上述; Siddiquiら，1987，上述; Banga ら，1988，上述; Sanders，1990,上述; Verhoef，1990,上述; Barry，in Delivery Systems for Peptide Drugs，Davis ら編，Plenum Press: New York，1986，pp．265-275; Patton ら，Adv．Drug Delivery Rev. 8，179-196，1992）。これらのいかなる経路について、あるいは、実際のところ、他のいかなる投与または適用経路についても、シアノビリンまたはその複合物のような蛋白質薬剤は免疫原性反応を起こす可能性がある。このような状況においては、免疫原性のある基をマスクするために分子を修飾する必要がある。製剤化方法および／または投与方法を慎重に選択することによって望ましくない免疫応答を防御することも可能である。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、アルブミン等のようないわゆる寛容源の使用または付着により免疫系から認識部位をマスクするだけでなく（Abuchowskiら，1981，上述; Abuchowskiら，J．Biol．Chem. 252，3578-3581，1977; Lisi ら，J．Appl．Biochem. 4，19-33，1982; Wileman ら，J．Pharm．Pharmacol. 38，264-271，1986）、部位特異的な送達を用いることができる。このような修飾は生体内および生体外（ex vivo）の両方での安定性および半減期にも有利な効果を有し得る。都合の悪い免疫応答を避けるための他の戦略として、最初に非常に低用量を投与することによる寛容誘導も挙げることができる。いずれにしても、シアノビリンまたはその複合物のいかなる特定の所望の医療的適用または使用についても、当業者は非常に多様な可能性のある組成、投与経路または適用部位のうちのいずれかの中から、有利なものを何でも選択し得ることが、当業者には本開示から明らかであろう。
【００４４】
したがって、本発明の抗ウイルス性シアノビリンおよびその複合物は、ウイルス、例えばＨＩＶに感染した個体の治療的処置方法または非感染個体のウイルス、例えばＨＩＶ感染に対する予防方法のいずれかにおける使用のために、種々の組成物に製剤化することができる。
【００４５】
したがって、本発明は本発明のシアノビリンまたはその複合物を含有する組成物、特に抗ウイルス有効量の単離精製されたシアノビリンまたはその複合物と医薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物を提供する。前述の単離精製されたシアノビリンまたはその複合物の代わりに、あるいはそれに加えて、該組成物はインビボで直接シアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された生宿主細胞を含有していてもよい。該組成物は、さらに少なくとも１つのシアノビリンまたはその複合物以外の付加的抗ウイルス性化合物の抗ウイルス有効量を含んでいてもよい。適当な抗ウイルス性化合物としては、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシクロビル、フッ素化ジデオキシヌクレオシド、ネビラピン、Ｒ８２９１３、Ｒｏ３１−８９５９、ＢＩ−ＲＪ−７０、アシクロビル、α−インターフェロン、組換えｓＣＤ４、ミケラミン類、カラノライド類、ノノキシノール−９、ゴッシポールおよびその誘導体、およびグラミシジンが挙げられる。該医薬組成物に使用されるシアノビリンは、天然に存在する生物または遺伝子工学的に作られた生物から単離精製することができる。同様に、シアノビリン複合物は、遺伝子工学的に作られた生物または化学的連結から誘導することができる。
【００４６】
本発明の組成物は、ウイルスに感染した、ヒトなどの動物を治療するのに使用することができる。本発明の組成物は、ウイルス、例えばレトロウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス、就中ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の増殖または複製を阻害するのに特に有用である。該組成物は、ウイルスに感染しているかあるいはウイルス感染の危険のある、ヒトなどの動物の治療的または予防的処置のそれぞれにおいて有用である。該組成物はまた、ヒトなどの動物のウイルス感染を防ぐために、医療用装置、備品、あるいは血液、血液製品および組織のような生物学的流体を含む流体などの、対象物または材料を処理するのに用いることもできる。このような組成物はまた、ウイルス感染、例えばＨＩＶの、性的伝達を防ぐのにも有用である。性的伝達は世界のＡＩＤＳ症例の主要な罹患様式である（Merson,1993，上述）。
【００４７】
ＨＩＶの性的伝達に対して使用されるまたは適用を考慮される可能性のある殺ウイルス剤は非常に限定されている。このような範疇にある現存の薬剤としては、例えばノノキシノール−９（Bird，AIDS 5，791-796，1991）、ゴッシポールおよびその誘導体（Polskyら，Contraception 39，579-587，1989; Lin，Antimicrob．Agents Chemother. 33，2149-2151，1989; Royer，Pharmacol．Res. 24，407-412，1991）並びにグラミシジン（Bourinbair，Life Sci./Pharmacol．Lett. 54，PL5-9，1994; Bourinbair ら，Contraception 49，131-137，1994）が挙げられる。
【００４８】
合衆国国立アレルギーおよび感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）の援助の下に現在開始されている抗ＨＩＶ予防の新しいアプローチ（例えば、Painter，USA Today,February 13，1996 により伝えられたように）において、生乳酸菌培養の膣坐薬浸透が９００人の女性を対象にした研究で評価されつつある。この研究は、特に、ある特定の過酸化水素産生乳酸菌がインビトロで抗ＨＩＶ効果を示すとの観察に基づいている（例えば、「ＡＩＤＳワクチン開発の進歩」，ベセスダ、メリーランド州，２月１１日〜１５日，１９９６年におけるＮＩＡＩＤ後援の会議からのHilierによる刊行された要旨を参照）。乳酸菌は膣に容易に定着し、実際、ほとんどの健康な女性において支配的な菌集団である（Redondo-Lopez ら，Rev．Infect．Dis. 12，856-872，1990; Reid ら，Clin．Microbiol．Rev. 3，335-344，1990; Bruce とReid，Can．J．Microbiol. 34，339-343，1988; reu ら，J．Infect．Dis. 171，1237-1243，1995; Hilierら，Clin．Infect．Dis. 16(Suppl 4),S273-S281; Agnewら，Sex．Transm．Dis. 22，269-273，1995）。乳酸菌はまた、口、鼻咽腔、上部および下部胃腸管、並びに直腸などの他の体腔の主要な非病原性の常在菌でもある。
【００４９】
乳酸菌を、利用可能な遺伝子工学技術を用いて容易に形質転換して所望の外来ＤＮＡコード配列を組み込み得ること、並びにこのような乳酸菌を対応する所望の外来蛋白質を発現するようにし得ることは十分確立されている（例えば、Holsら，Appl．and Environ．Microbiol. 60，1401-1413，1994 を参照）。したがって、本開示によれば、本発明のＤＮＡ配列またはベクターを含み、本発明の蛋白質を発現する生宿主細胞を、インビボで所望の部位にシアノビリンまたはその複合物を送達する媒体として直接使用し得ることが、当業者には理解されるだろう。このようにシアノビリンまたはその複合物を、例えば選ばれた体腔のような所望の部位に直接送達するのに好適な宿主細胞には、細菌が含まれる。より詳細には、このような宿主細胞は、乳酸菌、エンテロコッカスまたは大腸菌のようにその通常の菌株が体腔に一般的に常在することが知られている他のありふれた細菌の、適当に工作された菌株を含み得る。さらにより詳細には、このような宿主細胞は、Andreuら（1995，上述）により記載されるもののような、乳酸菌の選ばれた非病原性株、特に、例えば膣上皮細胞への接着のような上皮細胞への高い接着特性を有し、且つ本発明のＤＮＡ配列を用いて適当に形質転換されたものの１またはそれ以上を含み得る。
【００５０】
McGroarty（FEMS Immunol．Med．Microbiol. 6，251-264，1993）により概説されるように、泌尿生殖管、特に女性の泌尿生殖管の病原性細菌または酵母感染を治療または予防するために、「プロバイオティック（probiotic）」、すなわち生きた細菌、特に通常天然に存在する細菌、就中乳酸菌を直接的に治療に用いることはよく確立された概念である。最近、ＨＩＶの性的伝達を阻害するために、慣用のプロバイオティック戦略の使用、特に生乳酸菌の使用が提案されているが、これはある通常の乳酸菌株が殺ウイルスレベルの過酸化水素および／または乳酸および／またはウイルスを殺する可能性のある他の物質を、通常内因的に産生していることに基づいている（例えば、Hilier，1996，上述）。しかしながら、抗ウイルス物質、より詳細には蛋白質、さらにより詳細にはシアノビリンを発現するように、外来遺伝子、より詳細にはシアノビリン遺伝子で特に操作された本発明の非哺乳動物細胞、特に細菌、就中乳酸菌を本発明によって使うことは、ウイルス、詳細にはレトロウイルス、より詳細にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染を防ぐための、動物、特にヒトの治療方法として、これまでに前例のないものである。
【００５１】
Elmer ら（JAMA 275，870-876，1996）は最近、「遺伝子工学は、特定の作用または産物を結腸または他の粘膜表面に送達するのに、微生物を用いる可能性を提供する（中略）将来研究される他の不毛な領域は、活性を増大させるために遺伝子工学を適用する可能性のある種々の生物治療剤の作用機構を明らかにすることを含む。」と予測した。Elmer ら（1996，上述）はさらに、「プロバイオティック」および「生物治療剤」という語は、該文献中では、インビボで病原体に対するアンタゴニスト活性を有する微生物を記載するために用いていると指摘する。該著者らは、「特定の治療的特性を有する微生物」を意味するのに、「生物治療剤」という語をとりわけ好んで用いている。
【００５２】
本開示を考慮すれば、当業者は、本発明が、天然には存在しない、ここで提供された特別に操作された微生物菌株を用いた、全く新規なタイプの「プロバイオティック」または「生物治療的」処置を教示することを理解するであろう。にもかかわらず、慣用のプロバイオティックまたは生物治療的な適用のために最適な微生物菌株、特に細菌株の選択に関して利用可能な教示を、本発明に関しても使用することができる。例えば、ＨＩＶ感染を治療または防止するための、遺伝子操作、形質転換、シアノビリンまたはその複合物の直接的発現、および直接的なプロバイオティックまたは生物治療的適用に最適な乳酸菌株の選択は、Elmer ら（1996，上述）に記載されたもののように、慣用のプロバイオティックまたは生物治療的な治療のための、通常の内因性すなわち「操作されていない」細菌株を選択するのに典型的に用いられるのと同一もしくは類似の基準に基づけばよい。
さらに、McGroarty が教示する推奨および特徴、特に、女性の泌尿生殖器の感染に対する慣用のプロバイオティック使用のために最適な乳酸菌の選択に関する推奨および特徴は、本発明に関連がある。すなわち、「・・・プロバイオティック製剤に組み入れるために選ばれる乳酸菌は、容易に且つ、可能ならば安価で培養できるべきである・・・菌株は安定で、凍結乾燥後も生存力を保持し、そしてもちろん宿主に対して非病原性であるべきである・・・プロバイオティック製剤中での使用のために選ばれる乳酸菌は、膣上皮によく接着することが不可欠である・・・人工的に移植された乳酸菌は、膣上皮に接着し、元来存在する微生物と統合して増殖することが理想的である」（McGroarty，1993 上述）。McGroarty の教示は、特に、女性の泌尿生殖管の病原性細菌または酵母感染に対するプロバイオティック使用のための、「通常の」乳酸菌株の選択を述べているが、遺伝子操作および本発明に特に包含されるようなウイルス感染に対する「プロバイオティック」または「生物治療的な」適用のために最適な細菌株の選択にも、同様の考慮が当てはまるであろう。
【００５３】
したがって、ウイルス感染、例えばＨＩＶ感染の性的伝達を防ぐ本発明の方法は、抗ウイルス有効量のシアノビリンおよび／またはシアノビリン複合物、および／またはシアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された生宿主細胞を単独で、あるいは別の抗ウイルス化合物（例えば、上記の通り）と組み合わせて、経膣的、経直腸的、経口的、経陰茎的、または他の局所的な挿入的または点滴の治療をすることを含む。ここで、本発明の予防または治療方法に使用される本発明の組成物は、１またはそれ以上のシアノビリン、その複合物、またはシアノビリンまたはその複合物を発現するように形質転換された宿主細胞、および医薬上許容され得る担体を含むことができる。適当な投与方法がそうであるように、医薬上許容され得る担体も当業者によく知られている。担体の選択は、部分的には特定のシアノビリンもしくはその複合物、あるいは宿主細胞によって、さらに該組成物の投与に使用される特定の方法に応じて決定されるだろう。
【００５４】
当業者には、種々の薬剤投与経路が利用でき、２つ以上の経路が特定の薬剤を投与するのに使用できるが、ある特定の経路が他の経路よりもより直接的でより効果的な反応を提供し得ることが理解されるだろう。さらに当業者には、使用される特定の医薬上の担体が、使用される特定のシアノビリン、その複合物または宿主細胞に、および選択される投与経路に部分的に依っていることがわかるだろう。したがって、本発明の組成物には非常に多様な適当な処方例がある。
【００５５】
経口、直腸または膣投与に好適な製剤は、例えば、（ａ）液剤または懸濁液剤、例えば水、培地または生理食塩水のような希釈剤中に溶解または懸濁された有効量の純粋化合物および／またはシアノビリンまたはその複合物を直接産生するように操作された宿主細胞、（ｂ）それぞれ予め決められた量の有効成分を固形剤、顆粒剤または凍結乾燥細胞として含むカプセル剤、坐薬、サッシェ剤、錠剤、トローチまたは香錠、および（ｃ）水中油型または油中水型乳液剤からなり得る。錠剤型は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する担体のうちの１つまたはそれ以上を含み得る。トローチは、有効成分を香味成分、例えばシュクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に含み得るが、一方、香錠剤は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み得る。経口または直腸送達に適した製剤はまた、合成および天然ポリマーのマイクロスフェア、あるいは本発明の薬剤を胃腸管内での分解から保護するための他の手段に組み込むこともできる（例えば、Wallace ら，Science 260，912-915，1993を参照）。直腸またまたは膣投与用の製剤は、適当な水性または非水性の基剤（後者には、例えばココアバターやサリチル酸塩が含まれる）を有する坐薬として提供され得る。さらに、膣投与に適した製剤は、例えば、本発明のシアノビリンまたはその複合物を直接産生するように遺伝子操作された凍結乾燥乳酸菌のような有効成分に加えて、当技術分野において適当であると知られているような担体を含むペッサリー、坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー剤として提供され得る。同様に、有効成分をコンドーム上のコーティングとしての潤滑剤と組み合わせることができる。
【００５６】
シアノビリン、その複合物、あるいはシアノビリンまたはその複合物を発現する宿主細胞は、単独で、あるいは他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる。このようなエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容され得る推進ガス中におくことができる。
【００５７】
シアノビリンまたはその複合物は、単独で、あるいは他の抗ウイルス化合物ままたは吸収調節剤と組み合わせて、皮膚への適用および吸収に適した製剤とすることができる（Wallace ら，1993，上述）。経皮的なエレクトロポーレーションまたはイオントフォレーシスもまた、本発明の化合物および／または組成物の皮膚を通じた全身送達を促進および／または制御するのに用いることができる（例えば、Theissら，Meth．Find．Exp．Clin．Pharmacol. 13，353-359，1991 を参照）。
【００５８】
局所投与に適した製剤としては、有効成分に加えて、当該技術分野で公知の担体を含むクリーム、乳液剤、ゲル等、並びに有効成分を適当な液状担体中に含むうがい薬が挙げられる。
【００５９】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルのような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００６０】
医療用備品または装置、実験用装置および備品、道具、装置等のような対象無生物の殺ウイルス（例えば、ＨＩＶに対する）滅菌に適した、シアノビリンまたはシアノビリン複合物を含有する製剤は、例えば、前記の組成物または製剤のいずれかから、当業者が適当なものを選択して適合させることができる。シアノビリンまたはその複合物は、組換えＤＮＡ技術またはシアノビリンと上述のようなエフェクター分子との化学的連結によって製造することができる。好ましくは、シアノビリンまたはシアノビリン複合物は組換えＤＮＡ技術により製造される。同様に、血液、血液製剤、精液もしくは身体からの他の産物または組織、あるいは他のすべての溶液、懸濁液、乳液または医療行為において患者に投与され得る他のすべての材料の生体外（ex vivo）での殺ウイルス滅菌に適したシアノビリンおよび／またはその複合物の製剤は、前記の組成物または製剤のいずれかから、当業者が選択して適合させることができる。しかしながら、このような生体外での適用または対象無生物の殺ウイルス処理のための製剤は、前記の製剤または組成物のいずれかに決して限定されるものではない。当業者は、手元にある特定の適用に基づいて、適当なまたは適切な製剤を選択し、適合させ、発展させることができるとわかるだろう。
【００６１】
無生物の対象物もしくは材料、血液もしくは血液製剤、または組織の殺ウイルス処理のような生体外での使用では、使用されるシアノビリンもしくは複合物またはそれらの組成物の量は、存在するウイルスもしくはウイルス産生細胞がいずれも感染力をなくすか、あるいは破壊されるのに十分であるべきである。例えば、ＨＩＶであれば、ウイルスおよび／またはウイルス産生細胞を０．１〜１０００ｎＭの濃度範囲のシアノビリン−Ｎに曝露することが必要であろう。同様の考慮はインビボでの適用にも当てはまる。したがって、「抗ウイルス有効量」または「殺ウイルス有効量」という語句は、いずれの所定の適用においても、抗ウイルス効果を示すのに必要とされる特定のシアノビリン、その複合物またはそれらの組成物の量を表現するのに一般的に用いられる。
【００６２】
本発明によれば、インビボでの使用に関して、動物、特にヒトに投与されるシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞またはそれらの組成物の用量は、妥当な時間枠にわたって個体に予防的および／または治療的応答をもたらすのに十分であるべきである。インビボでの所望の殺ウイルス濃度（例えば、０．１〜１０００ｎＭ）は特定のシアノビリンまたはその複合物の力価、あるいは使用される宿主細胞のシアノビリンおよび／または複合物生産能力、感染個体の病状の重篤度、さらに全身投与の場合には感染個体の体重および年齢によって決定されるだろう。有効な、あるいは殺ウイルス用量はまた、用いられる特定のシアノビリン、その複合物、シアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞またはそれらの組成物の投与に伴う可能性のあるいかなる不利な副作用の存在によっても決定されるだろう。可能なときはいつでも、不利な副作用を最小限に保つことがいずれにせよ望ましい。
【００６３】
用量は、錠剤やカプセル剤のように単位用量形態にすることができる。ここで用いられる「単位用量形態」という語は、被験者および被験動物に対する単位用量として適した物理的にはっきりと区別される単位をいい、各々の単位は、予め決められた量のシアノビリン、その複合物、あるいはシアノビリンまたはその複合物を産生する宿主細胞を、単独もしくは他の抗ウイルス剤と組み合わせて含有し、医薬上許容され得る担体、希釈剤または媒体とともに所望の効果を生み出すのに十分な量となるよう計算されている。
【００６４】
本発明の単位用量形態の設計は、使用される特定のシアノビリン、複合物、宿主細胞またはそれらの組成物および達成されるべき効果、さらに治療される動物中での各シアノビリン、複合物、宿主細胞またはそれらの組成物に伴う薬動力学に依存する。投与される用量は、「抗ウイルス有効量」もしくは「殺ウイルス有効量」であるか、あるいは個々の動物、例えばヒト患者において「効果的な殺ウイルスレベル」を達成するのに必要な量であるべきである。
【００６５】
「効果的な殺ウイルスレベル」は投薬の好ましい終了点として用いられるので、実際の用量およびスケジュールは、薬動学における個体差、薬物分布および薬物代謝によって変動し得る。「効果的な殺ウイルスレベル」は、例えば、化学化合物および生物学的薬剤の臨床上の抗ウイルス活性を予見させることが知られているアッセイにおいて、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のようなウイルスを阻害する１またはそれ以上のシアノビリンまたはその複合物の濃度に対応する、患者において所望される血液または組織レベル（例えば、０．１〜１０００ｎＭ）と定義することができる。本発明の薬剤の「効果的な殺ウイルスレベル」はまた、シアノビリン、複合物またはそれらの組成物をＡＺＴまたは他の公知の抗ウイルス化合物、あるいはそれらを組み合わせたものと組み合わせて用いても変動し得る。
【００６６】
当業者は、個々の患者において所望の「効果的な殺ウイルスレベル」を達成するために、使用される組成物の正確な製剤に適した用量、スケジュールおよび投与方法を容易に決定することができるだろう。当業者はまた、本発明の化合物の「エフェクター濃度」の適当な指示薬を、適切な患者の試料（例えば、血液および／または組織）を直接的（例えば、分析的化学分析）または（例えば、ｐ２４やＲＴのような代替指示薬を用いて）間接的に分析することによって容易に決定し、使用することができるだろう。
【００６７】
ウイルスに感染した個体の治療においては、大用量の選択されたシアノビリンまたはその複合物を投与し、その後該薬剤が作用する時間を置き、しかるべき後に適当な試薬を投与して該薬剤を不活性化する「大量投薬」養生法を利用することが望ましい場合もあるだろう。
【００６８】
該医薬組成物は、ＡＩＤＳを引き起こすようなウイルス感染を治療するのに用いられる場合、シアノビリン、その複合物、またはシアノビリンもしくはその複合物を産生する宿主細胞とともに他の医薬を含んでいてもよい。このような付加的な医薬の代表例としては、抗ウイルス化合物、殺ウイルス剤、免疫モジュレーター、免疫刺激剤、抗生物質および吸収促進剤が挙げられる。代表的な抗ウイルス化合物としてはＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシクロビル、フッ素化ジデオキシヌクレオシド、ネビラピンのような非ヌクレオシド類縁体化合物（Shihら，PNAS 88，9878-9882，1991）、Ｒ８２９１３のようなＴＩＢＯ誘導体（White ら，Antiviral Res. 16，257-266，1991）、ＢＩ−ＲＪ−７０（Merigan，Am．J．Med. 90(Suppl.4A)，8S-17S，1991）、ミケラミン類（Boydら，J．Med．Chem. 37,1740-1745，1994）およびカラノライド類（Kashman ら，J．Med．Chem. 35，2735-2743，1992）、ノノキシノール−９、ゴッシポールおよび誘導体、並びにグラミシジン（Bourinbairら，1994，上述）が挙げられる。代表的な免疫モジュレーターおよび免疫刺激剤としては、種々のインターロイキン、ｓＣＤ４、サイトカイン、抗体製剤、輸血、細胞注入が挙げられる。代表的な抗生物質としては、抗真菌剤、抗（細）菌剤および抗ニューモシスチス・カリニ剤が挙げられる。代表的な吸収促進剤としては、胆汁酸塩および他の界面活性剤、サポニン類、シクロデキストリン類およびリン脂質が挙げられる（Davis，1992,上述）。
【００６９】
シアノビリンまたはその複合物を他の抗レトロウイルス化合物、特にｄｄＣ、ＡＺＴ、ｄｄＩ、ｄｄＡのような公知のＲＴ阻害剤、あるいは他のＨＩＶ蛋白質に作用する他の阻害剤、例えば抗ＴＡＴ剤とともに投与すると、該ウイルスの生活環のほとんどもしくはすべての複製段階を阻害すると期待される。ＡＩＤＳまたはＡＲＣ患者に使用されるｄｄＣおよびＡＺＴの用量は発表されている。ｄｄＣがウイルス増殖を阻止する範囲は、一般に０．０５μＭから１．０μＭまでの間である。約０．００５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲ではほとんどの患者においてウイルス増殖を阻止する。経口投与用の予備的な用量範囲はそれよりもいくぶん広く、例えば、０．００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇが１回または２，４，６，８，１２時間またはその他の時間間隔をおいて２回以上与えられる。現在のところ、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重のｄｄＣを８時間毎に与えるのが好ましい。併用治療で与えられる場合、他の抗ウイルス化合物は、例えばシアノビリンまたはその複合物と同時に与えてもよいし、あるいは所望により投薬時期をずらしてもよい。異なる薬剤を一つの組成物中で組み合わせることもできる。併用する場合、各々の用量は、単独で使用する場合よりも少なくすることができる。
【００７０】
当業者はまた、本発明のシアノビリンまたはその複合物のＤＮＡ配列を、所定の動物、特にヒトから前もって除去した哺乳動物細胞に生体外で挿入することができるとわかるだろう。該動物またはヒトに再導入されたこのような形質転換された自己または同種の宿主細胞は、インビボで対応するシアノビリンまたはその複合物直接発現するだろう。治療量の薬剤を所望の標的細胞および病原体に（例えば、ウイルス、より詳細にはレトロウイルス、特にＨＩＶおよびそのエンベロープ糖蛋白質であるｇｐ１２０に）きわめて近接して送達する治療戦略の可能性が、生体外でｓＣＤ４を発現するように操作された細胞を用いた研究で実証されている（Morganら，1994，上述）。本発明のＤＮＡ配列を生体外で挿入する代替として、このような配列を適切なウイルスまたは他の適当なベクターの使用などによりインビボで直接細胞に挿入することができる。インビボでトランスフェクトされたこのような細胞は、インビボで直接抗ウイルス量のシアノビリンまたはその複合物を産生することが期待されるだろう。実施例９では、哺乳動物細胞による形質転換およびシアノビリンの発現について説明する。
【００７１】
本開示によれば、さらに、シアノビリンまたはその複合物に対応するＤＮＡ配列を適当な非哺乳動物宿主細胞に挿入することができ、このような宿主細胞は、動物、特にヒトの所望の身体の小区画内で、治療または予防量のシアノビリンまたはその複合物をインビボで直接発現するだろうと理解されよう。実施例３では、非哺乳動物細胞、より詳細には細菌細胞での効果的な殺ウイルス量のシアノビリンの形質転換および発現について説明する。実施例１０では、非哺乳動物細胞、特に酵母細胞でのシアノビリンの形質転換および発現について説明する。
【００７２】
本発明の好適な態様において、女性により管理できるＨＩＶ感染に対する予防方法は、効果的な殺ウイルスレベルのシアノビリンまたはその複合物を、長時間にわたって膣および／または頸管および／または子宮粘膜上または内部に直接提供するための、本発明のコード配列で形質転換された乳酸菌の膣内投与および／またはヒト女性における持続的な膣内定着の確立を含む。世界保健機関(ＷＨＯ)および合衆国国立アレルギーおよび感染症研究所の両方が、ＨＩＶの伝達をブロックするのに適した、女性が管理する局所殺菌剤の開発の必要性を、緊急の世界的優先課題として指摘していることは注目に値する（Lange ら，Lancet 341，1356，1993; Fauci，NIAID News，April 27，1995）。
【００７３】
本発明はまた、本発明の蛋白質に対する抗体を提供する。いかなる所定の蛋白質もそれに対する抗体が入手できることは、非常に多様な定性的および定量的分析方法、分離精製方法および対象の蛋白質に対する他の有用な適用を提供するので非常に有利である。したがって、本開示および本発明の蛋白質によれば、抗体、特に本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体は、（例えば、Harlowと Lane，in Antibodies． A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988，pp．1-725により詳述された方法論のような）十分確立された方法論を用いて調製することができることが当業者には容易に明らかになるだろう。このような抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含み得る。さらに、このような抗体は溶液相中か所望の液相マトリックスに連結させるかして取得し使用することができる。本発明により提供されるような抗体を取得すると、当業者はさらに、このような抗体は、（例えば、Harlowと Lane（1988，上述）に記載されるような）十分確立された手法とともに使えば、シアノビリン、その複合物またはシアノビリンもしくはその複合物を産生するように形質転換された宿主細胞の有用な検出、定量または精製方法になるとわかるだろう。実施例１１では、シアノビリンに特異的に結合する抗体についてさらに説明する。
【００７４】
以下の実施例により、本発明の核酸配列、シアノビリン、複合物、宿主細胞、抗体、組成物および方法をさらに説明する。これらの実施例は本発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
この実施例において、抗ＨＩＶバイオアッセイによって導き出される、培養シアノバクテリア、ノストック・エリプソスポラムの水性抽出物由来の純粋なシアノビリンの単離と解明について詳細に述べる。単離および精製工程を測定し管理するために、Weislow ら（1989，上述）に記載の方法を用いた。シアノバクテリアの培養条件、培地、および分類は以前に述べた（Patterson，J．Phycol. 27，530-536，1991）ものと同様である。簡単にいえば、ノストック・エリプソスポラム（カルチャー Ｑ６８Ｄ１７０）の単藻株由来の細胞のかたまりを濾過により集菌し、凍結乾燥し、ＭｅＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）で、続いてＨ2Ｏで抽出した。バイオアッセイはＨ2Ｏ抽出物のみがＨＩＶ阻害活性を有していることを示した。該水性抽出物の溶液（３０ｍｇ／ｍｌ）を等量のエタノール（ＥｔＯＨ）の添加によって処理した。得られた１：１のＨ2Ｏ−ＥｔＯＨ溶液を−２０℃で１５時間保存した。そして、該溶液を遠心分離して、沈澱した物質（恐らく、高分子量のバイオポリマー類）を除去した。得られたＨＩＶ阻害性の上清を溶媒留去し、ワイドポアＣ4パッキング（３００Å，BakerBond ＷＰ−Ｃ4）での逆相真空液体クロマトグラフィー（Collら，J．Nat．Prod. 49，934-936，1986; Pelletierら，J．Nat．Prod. 49，802-900，1986）によって分画し、Ｈ2Ｏ中のメタノール（ＭｅＯＨ）濃度を上昇させて溶出した。抗ＨＩＶ活性はＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ（２：１）で溶出した物質中で濃縮された。この画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、およそ１０ｋＤａの相対分子量（Ｍｒ）を有する、一つの主要な蛋白質のバンドを示した。１．９×１５ｃｍ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ18（Waters Associates）カラムを用いた、Ｈ2Ｏ中で徐々に高くなるアセトニトリル濃度の勾配で溶出させる逆相ＨＰＬＣを繰り返して最終的に精製した。移動相は０．０５％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ、ｐＨ＝２を含有した。溶出された蛋白質は、急速（rapid）スペクトル検出器（Pharmacia ＬＫＢ モデル２１４０）を用いて、２０６、２８０、および２９４ｎｍでのＵＶ吸収によって検出した。ＵＶクロマトグラムに基づいて個々の画分を集めてプールし、凍結乾燥した。プールしたＨＰＬＣ画分を還元状態下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemmli，Nature 227，680-685，1970）、通常のアミノ酸解析、および抗ＨＩＶ活性試験に付した。
【００７６】
図１Ａは時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフであり、２８−３８％ＣＨ3ＣＮからの直線ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ勾配（０．０５％ＴＦＡで緩衝化）で溶出された非還元のシアノビリンのμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ18ＨＰＬＣクロマトグラムを示している。図１Ｄは時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフであり、最初にβ−メルカプトエタノールで還元し、次いで同じＨＰＬＣ条件下で分離したシアノビリンのクロマトグラムを示している。２回の試行からのＨＰＬＣ画分を述べたようにして集めた。各画分の１０％アリコートを凍結乾燥し、３：１Ｈ2Ｏ／ＤＭＳＯ１００μｌに構成し、ＸＴＴアッセイで抗ＨＩＶ活性を調べた。図１ＢはＨＰＬＣ画分に対する、５０％防御の最大希釈についての棒グラフであり、非還元のシアノビリンＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果に対して５０％防御を与える各画分の最大希釈を示している。対応する、還元したシアノビリンからのＨＰＬＣ画分についての抗ＨＩＶの結果を図１Ｅに示す。該図は、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の為の最大希釈の棒グラフである。選択したＨＰＬＣ画分の２０％アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。非還元のＨＰＬＣ画分での結果を図１Ｃに、還元したＨＰＬＣ画分での結果を図１Ｆに示す。
【００７７】
３０−５０％ＣＨ3ＣＮからの直線勾配を用いた最初のＨＰＬＣ分離においては、抗ＨＩＶ活性は、およそ３３％ＣＨ3ＣＮで、主要なＵＶ吸収ピークと一緒に溶出した。該活性ピークに対応する画分をプールし、２つのアリコートにわけた。２８−３８％ＣＨ3ＣＮからの直線勾配を用いる以外は、同様のＨＰＬＣ条件下で最初のアリコート再注入することにより、該活性物質を３３．４および３４．０％ＣＨ3ＣＮでの、２つの近接した溶出ピークに分けた。このＨＰＬＣ試行の間に回収された画分の抗ＨＩＶ活性のプロフィール（図１Ｂに示すように）は２つのＵＶピークに対応していた（図１Ａに示すように）。個々のピークのもとに回収した画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥは単一の蛋白質のバンドを示した（図１Ｃに示すように）。もとのＨＰＬＣ分離由来の２つめのアリコートを、ＨＰＬＣに再注入する前にβ−メルカプトエタノールで還元した。同じ２８−３８％勾配を用いると、還元した物質は、３６．８％ＣＨ3ＣＮでの試行において後で溶出される１つの主要なピーク（図１Ｄに示されるように）を与えた。還元した物質からのＨＰＬＣ画分においては、ただ一つわずかな抗ＨＩＶ活性が検出された（図１Ｅに示されるように）。非還元の物質の２つの近接して溶出するＨＰＬＣピーク（図１Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元状態下での試行）においては単一の同じバンドを与え（図１Ｃ）、β−メルカプトエタノールでの還元は結果として非還元のピークのどちらよりもより長い保持時間を有するＨＰＬＣピークを生じた（図１Ｆ）。これは、ネイティブな蛋白質にはジスルフィドが存在していることを示した。２つの活性ピークのアミノ酸解析は、それらが実質的に同じ組成を有していることを示した。該２つのＨＰＬＣピークはプロリン残基の周囲でのシス／トランス異性から生じたものか、あるいはアミノ酸解析又はシークエンシングの間のどちらにおいても検出されなかった蛋白質試料中の微細異種状態性(microheterogeneity)から生じたものである可能性がある。さらなる解析の為に２つのＨＩＶ阻害性ピークとして回収された物質を併せ、シアノビリン−Ｎと命名した。
【００７８】
実施例２
この実施例において、シアノビリン遺伝子の合成について述べる。
シアノビリン−Ｎの化学的に類推されるアミノ酸配列をバックトランスレートし、ＤＮＡコード配列を得た。組換えシアノビリン−Ｎの最初の生産および精製を容易にするために、アフィニティー精製や検出のための試薬が入手可能な市販の発現ベクター（ｐＦＬＡＧ−１、International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT より）を選択した。ｐＦＬＡＧ−１に連結するための好適な制限サイト、および停止コドンをＤＮＡ配列に含めた。図２は合成シアノビリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列の一例である。このＤＮＡ配列設計は、シアノビリンのＮ−末端でシアノビリン−Ｎをコードする領域を“ＦＬＡＧ”オクタペプチドのコドンに連結し、ＦＬＡＧ−シアノビリン融合蛋白質を与える。このＤＮＡ配列の合成の為のフローチャートを以下に示す。
【００７９】
【化１】
【００８０】
１３のオーバーラップしている、相補的なオリゴヌクレオチドとしてＤＮＡ配列を合成し、２本鎖のコード配列を形成するように組み立てた。合成ＤＮＡコード配列のオリゴヌクレオチド要素は二元カラム(dual-colum)核酸合成機（モデル３９２、Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA）を用いて合成した。完成したオリゴヌクレオチドはカラムから切り出して濃アンモニウムヒドロキシド中、５６℃で一晩インキュベートすることによって脱保護した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理する前に、３３−６６ｍｅｒｓを蒸留水に対してドロップ透析した。１３のオリゴヌクレオチド調製品は各々ＨＰＬＣによって精製し、各１０ｎｍｏｌ量をＴ４リガーゼを用いて３２７ｂｐの２本鎖ＤＮＡ配列へと連結した。フェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈澱、およびさらにエタノールで洗浄することによって、反応バッファーからＤＮＡを回収し精製した。個々のオリゴヌクレオチド調製品はプールし、変性を確実にするために１０分間煮沸した。ついで、相補鎖のアニーリングの為に、該混合物の温度を７０℃にまで下げた。２０分後、該チューブを氷上で冷却し、２，０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを追加のリガーゼバッファーとともに添加した。ライゲーションを１６℃で一晩行った。フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈澱および洗浄によって該ライゲーション反応混合物から、ＤＮＡを回収し、精製した。
【００８１】
次いで、精製した２本鎖合成ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において鋳型として用いた。ライゲーション反応混合物を精製して得られたＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として用いた。熱サイクリングはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ装置を用いて行った。“Ｖｅｎｔ”熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびポリヌクレオチドキナーゼはNew England Biolabs，Beverly,MAより入手した。通常のＴａｑ酵素に比較して正確さにおいて優れているということなので、Ｖｅｎｔポリメラーゼがこの適用のために選択された。ＰＣＲ反応産物をＴＢＥバッファー中、２％アガロースゲルにかけた。ついで３２７ｂｐ構築物をゲルから切り出し、電気的溶出によって精製した。該構築物はHind IIIおよびXho I 制限酵素による消化に比較的耐性が認められたので、はじめにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ｓｙｓｔｅｍ(Stratagene)を用いて該構築物をクローニングした。これらのクローンのうちのひとつからのプラスミド調製品を消化してコード配列を得、該配列をｐＦＬＡＧ−１ベクターのマルチクローニングサイトに連結した。
【００８２】
ｐＦＬＡＧ−１構築物で大腸菌を形質転換し、組み換えクローンをプラスミドＤＮＡの制限消化の解析によって同定した。これらの選択されたクローンのうちの一つの配列解析は、意図していたコード配列からは４塩基はずれていることを示した。これは該蛋白質に含まれている４つのシステイン残基のうちの一つをコードしている３塩基の欠失、およびその前のコドンにおける３番目の変更を含んでいた（図２のボックスによって示されている）。恐らく合成鋳型のＰＣＲ増幅の間に起こったであろうこれらの“変異”を修正するために、該変異の隣の制限サイト（これらのBst XIおよびEsp1サイトもまた図２に示される。）に連結されうる２本鎖の“パッチ”を合成した。該パッチを適用し、該修復をＤＮＡ配列解析によって確認した。
【００８３】
ネイティブシアノビリンをコードしているＤＮＡ配列の調製には、ＦＬＡＧオクタペプチドのコドンを排除し、同時にユニークなHind III制限サイトを排除する為に、上述のＦＬＡＧ−シアノビリン構築物を部位特異的突然変異誘発に付した。この手法を図３に説明する。該図は、ＦＬＡＧオクタペプチドのコドンおよびHind III制限サイトを図２の配列から排除するため用いられる部位特異的突然変異誘発工作を説明するものである。Ｏｍｐ分泌ペプチドおよびシアノビリンのコドンの部分を含有し、ＦＬＡＧペプチドのコドンを欠いた、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。鋳型鎖におけるＤＮＡヘアピンの発生を伴った、この変異原性のプライマーのアニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長は、結果としてＦＬＡＧコドン配列およびHind IIIサイト（詳細は図２を参照）の両方を欠いている新しいプラスミドＤＮＡを生成した。該プラスミドＤＮＡのHind IIIでの消化は、“変異型”鎖ではなく“野性型”鎖の鎖状化を生じた。大腸菌の形質転換は環状ＤＮＡでより効率よく起こるので、Ｏｍｐ分泌ペプチドのすぐ後にネイティブシアノビリン−Ｎの産生が指定されている変更されたコード配列を有するクローンは容易に選択することができた。ＤＮＡ配列決定(sequencing)により意図する配列の存在が立証された。部位特異的突然変異誘発反応はPharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ から入手した材料（ポリメラーゼ、バッファー等）を用いて行った。
【００８４】
実施例３
この実施例において、合成シアノビリン遺伝子の発現について述べる。
以下のフローチャートに示すようにして行った。
【００８５】
【化２】
【００８６】
大腸菌（ＤＨ５α株）を、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質のコード配列を含有するｐＦＬＡＧ−１ベクターで形質転換（エレクトロポレーションによる）した（ＤＮＡ配列の詳細は図２参照）。選択したクローンを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む（ＬＢ）増殖培地の入った小スケールの振とうフラスコに接種し、３７℃でインキュベートすることにより拡大した。次いで、大スケールのエルレンマイヤーフラスコ（０．５−３．０リッター）に接種し、０．５−０．７ＯＤ600単位の密度になるまで増殖させた。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質の発現はＩＰＴＧを最終濃度が１．７ｍＭになるように添加し、３０℃で３−６時間インキュベーションを続けることにより誘導した。ペリプラズムの蛋白質を採取するためには、細菌をペレット化し、洗浄し、そしてシュクロースによる処理、それに続く蒸留水中での再懸濁によって浸透圧的にショックを与えた。ペリプラズムの蛋白質は、細菌を沈澱させ、ついで水性の上清をWhatman 紙で濾過することにより得た。粗ペリプラズム抽出物は抗ＨＩＶ活性およびウエスタンあるいはスポット−ブロッティングによるＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質の存在の両方を示した。
実施例２に記載されたネイティブシアノビリン−Ｎの構築物を用いて、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質について記載した方法と同様の方法で細菌を形質転換した。クローニング、拡大、ＩＰＴＧでの誘導、および採取は同様にして行った。粗ペリプラズム抽出物はバイオアッセイにおいて強い抗ＨＩＶ活性を示した。
【００８７】
実施例４
この実施例において、組換えシアノビリン蛋白質の精製について述べる。
抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体(International Biotechnologies，Inc.，New Haven，CT)に基づいたアフィニティーカラムを用いて、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ融合蛋白質を以下のようにして精製することができた。
【００８８】
【化３】
【００８９】
実施例３に記載されるようにして調製した、個々のペリプラズム抽出物を、アフィニティーマトリックスを含有する２−２０ｍｌの重力カラム(gravity column)にロードし、混入している蛋白質を除去するために、ＣＡ++を含有するＰＢＳで徹底的に洗浄した。ＦＬＡＧペプチドの該抗体への結合はＣa++依存性であるので、カラムにＥＤＴＡを通すことにより融合蛋白質を溶出することができた。カラム分画および洗浄容量は同じ抗ＦＬＡＧ抗体を用いたスポット−ブロット解析によって監視制御した。融合蛋白質を含有する画分をプールし、蒸留水に対して徹底的に透析し、凍結乾燥した。
【００９０】
該組換えネイティブシアノビリン−Ｎの精製については、実施例３の対応するペリプラズム抽出物をステップ勾配Ｃ4逆相真空液体クロマトグラフィーに付して次の３つの画分を得た：（１）１００％Ｈ2Ｏで溶出される、（２）ＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ（２：１）で溶出される、および（３）１００％ＭｅＯＨで溶出される。抗ＨＩＶ活性は画分（２）で濃縮された。組換えシアノビリン−Ｎの精製は１．９×１５ｃｍ μＢｏｎｄａｐａｋ（Waters Associates）Ｃ18カラムを用いた、Ｈ2Ｏ（移動相中で０．０５％ＴＦＡ、Ｖ／Ｖ）中で徐々に高くなるＣＨ3ＣＮ濃度の勾配で溶出されるＨＰＬＣによって行った。１×１０ｃｍ（Cohensive Thchnologies，Inc.）Ｃ4カラムを用いた最終的なＨＰＬＣ精製の、２８０ｎｍで測定したクロマトグラムを図４に示した。該図は、組換えネイティブシアノビリンの精製の間の典型的なＨＰＬＣクロマトグラムである。１００％Ｈ2ＯからＨ2Ｏ−ＣＨ3ＣＮ（７：３）のグラジエント溶離（５ｍｌ／分）は０．０５％ＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）の移動相で２３分にわたって行った。
【００９１】
実施例５
この実施例において、天然、および組換えシアノビリン−ＮおよびＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの抗ＨＩＶ活性について述べる。はじめに純粋な蛋白質の抗ウイルス活性を、以前に述べられたＸＴＴ−テトラゾリウム 抗ＨＩＶアッセイ（Boyd，in AIDS，Etiology，Diagnosis，Treatment and Prevention，1988，上述；Gustafson ら，J．Med．Chem．35，1978-1986,1992；Weislow，1989,上述；Gulakowski，1991，上述）を用いて評価した。全てのアッセイで使用されるＣＥＭ−ＳＳヒトリンパ球性標的細胞株は、フェノールレッドを含有せず、５％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったＲＰＭＩ１６５０培地（Gibco，Grand Island,NY）（完全培地）中で維持した。指数的に増殖している細胞を沈澱とし、完全培地で２．０×１０5細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。ＨＩＶのＨａｉｔｉａｎ変異株であるＨＴＬＶ−ＩＩＩRF（３．５４×１０6ＳＦＵ／ｍｌ）を一貫して使用した。凍結したウイルスのストック溶液を使用直前に解凍し、１．２×１２5ＳＦＵ／ｍｌとなるように完全培地で再懸濁した。抗ＨＩＶ評価の為に、適当な量の純粋な蛋白質をＨ2Ｏ−ＤＭＳＯ（３：１）に溶解し、ついで完全培地で所望の初期濃度に希釈した。全ての薬剤の逐次的な希釈、試薬の添加、およびプレートからプレートへの移動はオートメーション化されたＢｉｏｍｅｋ１０００ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Beckman Instruments，Palo Alto，CA）を用いて行った。
【００９２】
図５Ａ−５Ｃは濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフであり、該図はノストック・エリプソスポラム由来のネイティブシアノビリン（Ａ）、組換えネイティブな（Ｂ）、および組換えＦＬＡＧ−融合シアノビリンの抗ウイルス活性を説明している。該グラフは、培養６日後に測定した、ＨＩＶ−１（●）で感染されたＣＥＭ−ＳＳ細胞における各シアノビリンの濃度範囲の影響を示している。データポイントは、個々の非感染の、薬剤未処理のコントロール値のパーセントを表している。３種のシアノビリン全てが、低ナノモル領域でＥＣ50を有し、最も高い被検濃度（１．２μＭまで）において宿主細胞に直接的な細胞毒性の顕著な形跡を示さない、強力な抗ＨＩＶ活性を示した。
【００９３】
純粋なシアノビリン−Ｎの抗ＨＩＶ活性のさらなる証明の一例として、詳細は他で記載されている方法（Gulakowski，1991，上述）を用いて９６ウエルマイクロタイタープレートの個々のウエル中で、相互に関係のある一連の抗ＨＩＶアッセイを行った。簡単に説明すると、該方法は以下のとおりである。シアノビリン溶液を完全培地で逐次的に希釈し、９６ウエルテストプレートに添加した。非感染ＣＥＭ−ＳＳ細胞を５０μｌ完全培地中１×１０4細胞の密度で撒きこんだ。ついで希釈したＨＩＶ−１を、感染多重度０．６となるように適当なウエルに容量５０μｌで添加した。適当な細胞、ウイルス、および薬剤コントロールを各実験に取り入れた。各マイクロタイターウエル中の最終容量は２００μｌであった。ウイルス感染細胞については４つ組のウエルを用いた。プレートを５％ＣＯ2を含有する雰囲気下、３７℃で４、５、あるいは６日間インキュベートした。
【００９４】
続いて、無細胞の上清のアリコートをＢｉｏｍｅｋを用いて各ウエルから移し、逆転写酵素活性、ｐ２４抗原産生、および感染性のウイルス粒子の合成について、記載された（Gulakowski，1991，上述）ようにして解析した。ついで、細胞の増殖あるいは生存度を記載された（Gulakowskiら，1991，上述）ＸＴＴ（Weislow ら，1989，上述）、ＢＣＥＣＦ（Rinkら，J．Cell Biol. 95，189-196，1982）およびＤＡＰＩ（McCaffrey ら，In Vitro Cell Develop．Biol. 24，247-252，1988）アッセイを用いて、各ウエルに残存している内容物で評価した。データのグラフ表示や比較を容易にする為に、個々の実験のアッセイ結果（少なくとも各々について４つ組の測定の結果）は平均をとり、そして適当なコントロールに関して割合を算出するためにその平均値を用いた。これらの計算において用いた平均値の標準誤差は、通常平均して個々の平均値の１０％以下であった。
【００９５】
図６Ａ−６Ｄは濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフであり、該図はマルチパラメーターアッセイフォーマット（multiparameter assay format）におけるシアノビリンの抗ＨＩＶ活性を説明している。グラフ６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、培養６日後に測定した非感染のＣＥＭ−ＳＳ細胞（○）、ＨＩＶ−１で感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞（●）におけるシアノビリンの濃度範囲の影響を示している。グラフ６Ａは、ＢＣＥＣＦアッセイによって測定された、生きているＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示している。グラフ６Ｂは、各培養物の相対ＤＮＡ量を示している。グラフ６Ｃは、ＸＴＴアッセイによって測定された、生きているＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示している。グラフ６Ｄは、培養４日後に測定した、感染性ウイルスあるいはウイルス複製の指数におけるシアノビリンの濃度範囲の影響を示している。これらの指数はウイルスの逆転写酵素（▲）、ウイルスのコア蛋白質ｐ２４（◆）、およびシンシチウム形成単位（■）を含む。グラフ６Ａ、６Ｂおよび６Ｃでは、該データを、非感染、薬剤未処理のコントロール値のパーセントとして表している。グラフ６Ｄでは、該データを、感染、薬剤未処理のコントロール値のパーセントとして表している。
【００９６】
図６に示されるように、シアノビリン−Ｎは、in vitroで、ＣＥＭ−ＳＳヒトリンパ芽球様標的細胞に対してＨＩＶ−１の細胞変性効果の完全阻害が可能であった；該蛋白質の、標的細胞に対する直接的な細胞毒性は最も高い被検濃度でも認められなかった。シアノビリン−Ｎは又ＨＩＶ−１で感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞内でのＲＴ、ｐ２４、およびＳＦＵの生産を、これらの同じ阻害効果濃度内で著しく阻害し、該蛋白質がウイルスの複製を停止させたことを示した。
【００９７】
シアノビリンの抗ＨＩＶ活性は、過酷な環境の挑戦に対して極めて弾力性がある。例えば、緩衝化していないシアノビリン−Ｎ溶液は、繰り返される凍結融解サイクルあるいは有機溶媒（１００％ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ、あるいはＣＨ3ＣＮに及ぶ）での溶解に活性の損失なしによく耐えた。シアノビリン−Ｎは、ＨＩＶ阻害活性の顕著な損失なしに、界面活性剤（０．１％ＳＤＳ）、高塩（６Ｍ塩酸グアニジン）、および熱処理（Ｈ2Ｏ中で１０分、煮沸）に抵抗性であった。β−メルカプトエタノールでのジスルフィドの還元、その直後のＣ18ＨＰＬＣ精製はシアノビリン−Ｎの細胞保護作用を急激に低下させた。しかしながら、還元したシアノビリン−Ｎの溶液は長期保存している間に抗ＨＩＶ阻害活性を回復した。シアノビリン−Ｎを還元する（β−メルカプトエタノール、６Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ８．０）が、Ｃ18ＨＰＬＣを通さず、そのかわりに単に脱塩、再構成して測定した時は、実質的に完全な活性を維持していた。
【００９８】
実施例６
この実施例において、ＨＩＶウイルスのエンベロープｇｐ１２０がシアノビリン−Ｎの主要な分子標的であることを述べる。ＸＴＴ−テトラゾリウムアッセイ（Weislow ら，1989，上述）を用いた最初の実験では、シアノビリンでプレインキュベート（１０ｎＭ、１時間）し次いでシアノビリン−Ｎのない状態に遠心分離した宿主細胞は、ＨＩＶ感染に対する通常の感受性を維持したが、対照的に、濃縮ウイルスを同様に前処理し次いで阻害性のない濃度にまでシアノビリン−Ｎを希釈すると、感染性が本質的になくなった。このことはシアノビリン−Ｎが直接ウイルスそのものに作用している、すなわちウイルスが宿主細胞に侵入しうる前でもウイルス感染を防ぐために直接的な“殺ウイルス剤”として働いていることを示した。このことはＸＴＴ−テトラゾリウムアッセイ（Weislow ら，1989，上述）の試行と同様、添加時期実験においても確認された。該実験は、最大の抗ウイルス活性を得るためには、図７〔添加の時期（時間）に対する％非感染コントロールのグラフであり、該図は、ＨＩＶ−１RFで感染されているＣＥＭ−ＳＳ細胞において抗ＨＩＶ活性を示すシアノビリンの、添加時期実験の結果を示している〕に示されるようにシアノビリン−Ｎをウイルスの添加前、あるいは添加後可能な限り速やかに添加しなくてはならないことを示した。はじめのインキュベーションのあと、種々の時期で遅れてシアノビリン（●）あるいはｄｄｃ（■）（各々１０ｎＭおよび５μＭ濃度）を導入し、ついで６日間インキュベートし、細胞の生存度（線グラフ）およびＲＴ（棒グラフ（オープンバー）、挿入図）のアッセイを行った。ポイントは少なくとも３つの測定の平均（±Ｓ．Ｄ）を表している。逆転写酵素阻害剤であるｄｄｃとは極めて対照的に、たった３時間のシアノビリン−Ｎの添加の遅れは、結果として抗ウイルス活性を無くすかほとんど無くすかした（図７）。前述の結果は、シアノビリン−Ｎがウイルスの細胞との最初の相互作用の妨害によってＨＩＶ感染性を阻害したことを示唆した；したがって、これはおそらくシアノビリン−Ｎのウイルスｇｐ１２０との直接的な相互作用を意味している。このことは限外濾過の実験やドット−ブロットアッセイによって確認された。
【００９９】
可溶性のｇｐ１２０およびシアノビリン−Ｎが直接的に結合できるかどうかを決定するために、５０ｋＤａカットオフの限外濾過機によるシアノビリンの通過の阻害によって測定する、限外濾過の実験を行った。シアノビリン（３０μｇ）のＰＢＳ溶液を種々の濃度のｇｐ１２０で１時間３７℃で処理し、ついで５０ｋＤａカットオフの遠心分離限外濾過機（Amicon）によって濾過した。ＰＢＳで３回洗浄後、濾液を３ｋＤａの限外濾過機で脱塩し；保留分を凍結乾燥し、１００μｌＨ2Ｏに再構成し、抗ＨＩＶ活性を測定した。
【０１００】
図８Ａはシアノビリン濃度（μｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフであり、該図はｇｐ１２０をシアノビリンの主要分子標的として定義づけする、シアノビリン／ｇｐ１２０相互作用を示している。濾液中のシアノビリン−Ｎの生物活性の完全な回収によって証明されるように、遊離のシアノビリン−Ｎは容易に溶離された。対照的に、ｇｐ１２０で処理したシアノビリン−Ｎ溶液からの濾液は、濾液の生物活性の濃度依存的な損失を示し；さらに該５０ｋＤａ濾過機の保留分は全て不活性であり、シアノビリン−Ｎと可溶性のｇｐ１２０とが直接相互作用し、完全なウイルスのｇｐ１２０との結合が不可能な複合体を形成することを示した。
【０１０１】
ＰＶＤＦ膜ドット−ブロットアッセイにおけるシアノビリン−Ｎとｇｐ１２０との直接的な相互作用のさらなる証拠があった。ＰＶＤＦ膜に５μｇのＣＤ４（ＣＤ）、１０μｇのアプロチニン（ＡＰ）、１０μｇのウシグロブリン（ＢＧ）、および次第に量を減少させたシアノビリン：６μｇ〔１〕、３μｇ〔２〕、１．５μｇ〔３〕、０．７５μｇ〔４〕、０．３８μｇ〔５〕、０．１９μｇ〔６〕、０．０９μｇ〔７〕、および０．０５μｇ〔８〕をスポットし、ついでＰＢＳＴで洗浄し、製造者の推奨に従って可視化した。図８はシアノビリンとｇｐ１２０−ＨＲＰ結合体（Invitrogen）との結合のドットブロットであり、該図はシアノビリン−Ｎが、濃度依存的な挙動で特異的にｇｐ１２０のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（ｇｐ１２０−ＨＲＰ）に結合したことを示している。
【０１０２】
実施例７
この実施例において、ヒトのあるいはヒト以外の霊長類の免疫不全性レトロウイルスの、研究室向けの、および臨床上の様々な株に対する極めて広範囲にわたる抗レトロウイルス活性について述べる。下の表１は種々の宿主細胞において広範囲のウイルス株に対して調べた、シアノビリン−Ｎ及びｓＣＤ４の抗免疫不全性ウイルス活性の比較範囲を示している。特に注目すべきことは、シアノビリン−Ｎがラボ向けのＨＩＶ株およびＨＩＶの臨床分離株の両方に対して同等の能力を有することである。このことはｓＣＤ４が臨床的分離株に対してその活性を欠いていることとは明らかに対照的であった。
【０１０３】
ＥＣ50値（表１）は８とおりに希釈した被検薬剤の濃度応答曲線から決定した（１種の濃度あたり３つのウエルからの平均）；Ｇ９１０−６はＡＺＴ−耐性株であり；Ａ１７はピリジノン耐性株であり；ＨＩＶ−１Ｂａ−Ｌは、ヒトの末梢血マクロファージ（ＰＢＭ）培養中で、上清の逆転写酵素の活性によって調べ；すべての他のアッセイはＸＴＴ−テトラゾリウム（Gulakowskiら，1991，上述）を使用した。ウイルス株、細胞系統、臨床分離株、およびアッセイ方法の詳細は発表されている（Buckheitら，AIDS Res．Hum．Retrovir. 10，1497-1506，1994; Buckheitら，Antiviral Res. 25，43-56，1994; およびそれらに含まれる引例）。表１において、Ｎ．Ｄ．は測定していないことである。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
実施例８
この実施例において、選択的にＨＩＶ−感染細胞を標的とし、死滅させるシアノビリン−毒素蛋白質コンジュゲートを得るための、コンジュゲートＤＮＡコード配列の構築およびその発現についてさらに述べる。より具体的には、この実施例に、ウイルスのｇｐ−１２０を発現している宿主細胞を選択的に殺すシアノビリン／シュードモナス−外毒素のコンジュゲートＤＮＡコード配列の構築および発現について述べる。
ＦＬＡＧ−シアノビリン−ＮをコードしているＤＮＡ配列（配列表配列番号３）およびシュードモナスの外毒素のＰＥ３８断片をコードするＤＮＡ配列（Kreitmanら，Blood 83，426-434，1994）をｐＦＬＡＧ−１発現ベクター内で結合させた。ＰＥ３８コード配列をプラスミドから切り出し、適合させ、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列のＣ末端の位置に、標準的な組換えＤＮＡの手法を用いて連結した。この構築物を図９に模式的に示した。この構築物での大腸菌の形質転換、クローンの選択、およびＩＰＴＧでの遺伝子発現の誘導により、予測される分子量ならびに抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタンブロット解析における免疫反応性を有するコンジュケート蛋白質を産生した。キメラ分子をＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製し（例えば実施例４のように）、ＨＩＶで感染されたヒトリンパ芽球様細胞（Ｈ９／ＩＩＩＢ細胞）およびそれらの非感染の対照物（Ｈ９およびＣＥＭ−ＳＳ細胞）に対する毒性で評価した。細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートに撒きこみ、種々の濃度のコンジュゲート蛋白質（ＰＰＥと名付けた）に暴露した。３日後、ＸＴＴアッセイ（Gulakowskiら.，1991,上述）を用いて生存度を測定した。図１０はこの実験の結果を示している。予期したように、細胞表面ｇｐ１２０を発現している、感染されているＨ９／ＩＩＩＢ細胞は、非感染のＨ９あるいはＣＥＭ−ＳＳ細胞よりも劇的にＰＰＥの該毒性効果により感受性であった。濃度−効果曲線から決定されたＩＣ50は、Ｈ９およびＣＥＭ−ＳＳに対してそれぞれ０．４８および０．４２ｎＭであったのに対して、Ｈ９／ＩＩＩＢに対しては０．０１４ｎＭであった。
【０１０６】
実施例９
この実施例において、その中でシアノビリンを発現するための、哺乳動物細胞の形質転換について述べる。哺乳動物細胞中でのシアノビリンの発現の証明に適した遺伝子構築物をＦＬＡＧ−シアノビリン−ＮをコードするＤＮＡ配列をｐＦＬＡＧＣＭＶ−１発現ベクター（IBI-Kodak，Rochester，NY）に連結させることによって調製した。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列（配列表配列番号３）をあらかじめ構築したプラスミドから切り出し、ｐＦＬＡＧ ＣＭＶ−１ベクターに標準的な組換えＤＮＡの手法を用いて連結した。アフリカミドリザル細胞（ＣＯＳ−７細胞、American Type Culture Collection，Rockville，MD から入手）をＤＥＡＥデキストラン溶液中で該構築物に暴露することによって形質転換した。ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの発現を測定するために、細胞を７２時間後に溶解し、ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析に付した。図１１に示されるように、大腸菌中で産生されるネイティブ組換え ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎに比べて実質的により大きなみかけ分子量ではあるが、形質転換されたＣＯＳ−７細胞において抗ＦＬＡＧ免疫反応性の物質が容易に検出された。以下の実施例１０と同じ方法で行った消化産物の診断的解析は、この分子量の増加がＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの翻訳後の修飾（Ｎ結合型オリゴサッカライド）によるものであることを示した。
【０１０７】
実施例１０
この実施例において、哺乳動物のものではない細胞、より具体的には酵母細胞内での形質転換およびシアノビリン発現について述べる。ピキア・パストリス中でのシアノビリンの発現を証明するために適した遺伝子の構築物を、シアノビリン−ＮをコードするＤＮＡ配列をｐＰＩＣ９発現ベクター（Invitrogen Corporation，San Diego，CA）に連結することによって調製した。シアノビリン−Ｎコード配列（配列表配列番号１）をあらかじめ構築したプラスミドから切り出し、標準的な組換えＤＮＡの手法を用いてベクターに連結した。酵母細胞をエレクトロポレーションによって形質転換し、特徴づけのためにクローンを選択した。いくつかのクローンが、抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体（例えば実施例１１参照）に反応する物質を発現し、培養培地中に分泌していることがわかった。実施例９に記載されている哺乳動物フォームでの観察と同様に、酵母由来の産物のＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析におけるみかけ分子量の上昇はこの発現システムにおいて、シアノビリン−Ｎの翻訳後の修飾が起こっていることを示唆した。
【０１０８】
この修飾をさらに明確にするために、２つのクローン由来の分泌産物をペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼで消化した。この酵素は、New England Biolabs（Beverly，MA）から入手され、アスパラギン残基に結合したオリゴサッカライド部分を特異的に開裂する。図１２に示されるように、この処理は該産物のみかけ分子量を、大腸菌中で発現されるネイティブ組換えシアノビリン−Ｎと同じにまで減少させた。シアノビリンのアミノ酸配列の精査は唯１つのＮ−結合型修飾の認識部位（ポジション３０に位置するアスパラギンに結合する）を明らかにした。これをグリコシル化の部位としてさらに立証するために、この位置で変異を導入し、アスパラギン残基をグルタミンに変えた（Ｎ３０Ｑ）。この変異型の発現は、結果的にネイティブ組換えＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎのそれに一致する分子量を有する免疫反応性の物質を産生した。
【０１０９】
実施例１１
この実施例において、シアノビリンに特異的に結合する抗体についてさらに述べる。３羽の２月齢のニュージーランド白ウサギ（１．８−２．２ｋｇ）を以下の免疫手順に付した：全量１００μｇのシアノビリン−Ｎをリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）とフロインドの不完全アジュバントとの１：１の懸濁液１００μｌに溶解し、各々の後肢の２か所で筋肉内注射によって投与し；最初の注射から８−１６カ月で、ウサギ１羽あたり最終ブースト５０μｇのシアノビリン−ＮをＰＢＳとフロインドの不完全アジュバントとの１：１の懸濁液１０００μｌに溶解し、腹腔内注射によって投与し；４２、７０、９８および１２２日目に、１０ｍｌの血液を各ウサギの耳静脈から取り；最後の腹腔内ブーストの１４日後に該ウサギを屠殺して放血させた。上述のウサギから得られた免疫血清のＩｇＧ画分を、Goudswaardら（Scand．J．Immunol. 8，21-28，1978）の方法によってプロテイン−Ａセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。このポリクローナル抗体調製品のシアノビリン−Ｎに対する反応性を、ウサギＩｇＧ画分の１：１０００から１：５０００希釈物を用いてウエスタンブロット解析によって証明した。
【０１１０】
図１３は、上述の方法によって調製された該抗体が本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体であることをさらに示している。シアノビリン−Ｎを産生するように設計した大腸菌株ＤＨ５αからの全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Laemmeli（Nature 227，680-685，1970）に従って、１８％のポリアクリルアミドが溶解しているゲルおよび通常の不連続な緩衝液系を用いて行った。蛋白質はクマシーブリリアントブルーで染色することによって可視化した（図１３）。ウエスタンブロット解析については、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロース膜上に電気的に溶出した。膜上の非特異的な結合部位を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液で洗浄することによってブロックした。ついで、該膜をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で１：３０００に希釈した上述のウサギ抗シアノビリン−Ｎ免疫血清由来のＩｇＧ画分の溶液中でインキュベートした。続いて、該膜を１：１００００に希釈されたヤギ−抗ウサギ−ペルオキシダーゼ結合体（Sigma）を含有する２次抗体溶液中でインキュベートした。結合した２次抗体複合体を、該膜をケミルミネッセンス基質中でインキュベートし、Ｘ線フィルムに露出することによって可視化した（図１３Ｂ）。
【０１１１】
さらに当業者は、十分に立証された、ルーティンの手法（例えばHarlowとLane，1988，上述，参照）によっても同様に、本発明の蛋白質を抗原として用いてモノクローナル抗体を作製しうること、そしてそのようにして得られたモノクローナル抗体が同様に本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体であることを示すことができるということがわかるだろう。ここに挙げた全ての引例は、言及することによってそっくりそのままそれにより組み入れられるものである。本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきたが、当業者には好ましい蛋白質、コンジュゲート、宿主細胞、組成物、方法などのバリエーションが使用され得ること、本発明がここで具体的に記載された以外によっても実施されてもよいことが意図されるものであることが自明であろう。従って、本発明は添付の請求の範囲によって定義される該発明の精神と範囲に包含されるすべての変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１Ａ】図１Ａは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣクロマトグラムを表す、時間（分）に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果を５０％防御した各ＨＰＬＣ画分の最大希釈を示す、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の最大希釈の棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、非還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣクロマトグラムを表す、時間(分)に対するＯＤ（２０６ｎｍ）のグラフである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分について、ＨＩＶ感染の細胞変性効果を５０％防御した各画分の最大希釈を示す、ＨＰＬＣ画分に対する５０％防御の最大希釈の棒グラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、還元シアノビリン−ＮのＨＰＬＣ画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。
【図２】図２は、合成シアノビリン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を例示している。
【図３】図３は、図２の配列からＦＬＡＧオクタペプチドのコドンおよびHindIII 制限部位を除くために用いられた部位特異的突然変異誘発作戦を示している。
【図４】図４は、組換えネイティブシアノビリン−Ｎの精製から得られる特有のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。
【図５Ａ】図５Ａは、ノストック・エリプソスポラム（Nostoc ellipsosporum）由来のネイティブシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、組換えシアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、組換えＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎの抗ウイルス活性を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢＣＥＣＦアッセイにおけるＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ培養細胞の相対的ＤＮＡ量を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＸＴＴアッセイにおけるＨＩＶ−１に感染した生存ＣＥＭ−ＳＳ細胞の相対数を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、感染力のあるウイルスまたはウイルス複製の指数に及ぼすシアノビリン−Ｎの濃度範囲の効果を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（ｎＭ）に対する％コントロールのグラフである。
【図７】図７は、シアノビリン−Ｎの遅延添加研究の結果を示す、添加時間（時間）に対する％非感染コントロールのグラフであって、ＨＩＶ−１ＲＦに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞における抗ＨＩＶ活性を示している。
【図８Ａ】図８Ａは、ｇｐ１２０をシアノビリンの主要な分子標的と確定するシアノビリン／ｇｐ１２０相互作用を示す、シアノビリン−Ｎ濃度（μｇ／ｍｌ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｇｐ１２０のシアノビリン−Ｎが西洋ワサビペルオキシダーゼ複合物（ｇｐ１２０−ＨＲＰ）に濃度依存的に特異的に結合したことを示す、シアノビリン−Ｎとｇｐ１２０−ＨＲＰ複合物との結合のドットブロットである。
【図９】図９は、シュードモナス外毒素コード配列に連結されたＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎコード配列を含むＤＮＡコード配列を模式的に示す。
【図１０】図１０は、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎ／シュードモナス外毒素蛋白質複合物（ＰＰＥ）によるウイルスｇｐ１２０発現（Ｈ９／III Ｂ）細胞の選択的殺傷を示す、ＰＰＥ濃度（ｎＭ）に対するＯＤ（４５０ｎｍ）のグラフである。
【図１１】図１１は、ＦＬＡＧ−シアノビリン−Ｎを発現するように操作され、形質転換された溶解ＣＯＳ−７細胞のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像のウェスタンブロットである（検出は抗ＦＬＡＧ抗体による）。
【図１２】図１２は、ペプチド−Ｎ４−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼによって消化された、シアノビリンを産生するように操作され形質転換されたピキア・パストリスからの分泌産物の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像のウェスタンブロットである（検出は抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体による）。
【図１３】図１３は、シアノビリン−Ｎを産生するように操作された大腸菌の全細胞溶解物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）である（検出は抗シアノビリン−Ｎポリクローナル抗体による）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含む、単離および精製された抗ウイルス蛋白質または単離および精製された抗ウイルスペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離および精製された抗ウイルス蛋白質または単離された抗ウイルスペプチド。
【請求項３】
エフェクター分子、ウイルス、ウイルス糖蛋白質、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストランまたは固形支持マトリックスに連結された請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドを含む蛋白質複合物またはペプチド複合物。
【請求項４】
該エフェクター分子が毒素および免疫学的試薬からなる群より選ばれる請求の範囲３の複合物。
【請求項５】
該エフェクター分子がシュードモナス外毒素である請求の範囲４の複合物。
【請求項６】
請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドの取得方法であって、(a) 抗ウイルス活性を含むノストック・エリプソスポラムの抽出物を同定し、(b) 抗ウイルスバイオアッセイをガイドに該抽出物を分画して該蛋白質または該ペプチドの部分精製された抽出物を得、(c) 該部分精製抽出物を逆相ＨＰＬＣによりさらに精製して該蛋白質または該ペプチドを得ることを含む方法。
【請求項７】
ウイルスまたはウイルスエンベロープ糖蛋白質をシアノビリンと複合物形成させる方法であって、単離および精製されたウイルスまたは単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質に請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドを接触させ、該単離および精製されたウイルスまたは該単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質と該蛋白質または該ペプチドとの接触によって、該蛋白質または該ペプチドが該単離および精製されたウイルスまたは該単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質に結合し、それによって複合物を形成することを含む方法。
【請求項８】
請求の範囲１〜５のいずれかの蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物をコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項９】
請求の範囲１〜５のいずれかの蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物、あるいは請求の範囲７の方法により得られる複合物の抗ウイルス有効量およびそれ用の医薬上許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
動物のウイルス感染阻害剤である請求の範囲９の医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲８の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求の範囲８の核酸分子または請求の範囲１１のベクターを有効成分とする動物のウイルス感染阻害剤であって、ウイルス感染を阻害する必要のある動物の細胞をインビボで形質転換して、該核酸分子にコードされる抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチド、抗ウイルス蛋白質複合物または抗ウイルスペプチド複合物をインビボで発現させるべく投与されることを特徴とする該ウイルス感染阻害剤。
【請求項１３】
請求の範囲８の核酸分子または請求の範囲１１のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
該宿主細胞が哺乳動物細胞、細菌または酵母である請求の範囲１３の宿主細胞。
【請求項１５】
該細菌が乳酸菌である請求の範囲１４の宿主細胞。
【請求項１６】
請求の範囲１３〜１５のいずれかの宿主細胞中で蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物を発現させることを含む蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲１３〜１５のいずれかの宿主細胞を有効成分とする動物のウイルス感染阻害剤であって、該核酸分子にコードされる抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチド、抗ウイルス蛋白質複合物または抗ウイルスペプチド複合物を発現するように動物中または動物上に置かれるべく投与されることを特徴とする該ウイルス感染阻害剤。
【請求項１８】
該宿主細胞が自己または同種の哺乳動物細胞である請求の範囲１７のウイルス感染阻害剤。
【請求項１９】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量で無生物の対象物、溶液、懸濁液、乳液または他の材料を処理することを含む、ウイルス感染の拡大を阻害する方法。
【請求項２０】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量で血液、血液製剤、精液、細胞、組織または器官を生体外で処理することを含む、ウイルス感染の拡大を阻害する方法。
【請求項２１】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチドまたは複合物中の蛋白質もしくはペプチドに対する抗体。
【請求項２２】
抗ウイルス剤をウイルスに接触させる方法であって、請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量をウイルスに接触させることを含む方法。
【請求項２３】
試料からのウイルスの除去方法であって、
(a) 請求の範囲１〜５のいずれかの単離および精製された抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチドまたは複合物を含む組成物を該試料に接触させ（但し、(i) 該抗ウイルス蛋白質または抗ウイルスペプチドは配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含み、(ii) 該抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチドまたはその複合物は固形支持マトリックスに接着し、(iii) 該少なくとも９個の隣接するアミノ酸が該ウイルスに結合する）、
(b) 該試料と該組成物とを分離することにより、ウイルスを該試料から除去することを含む方法。
【請求項２４】
該試料が血液、血液成分、精液、細胞、組織または器官である請求の範囲２３の方法。
【請求項２５】
該試料がワクチン製剤であり、除去されるウイルスが感染力のあったものである請求の範囲２３の方法。
【請求項２６】
動物の膣、陰茎、直腸または口に局所投与されることを特徴とする請求の範囲１０の医薬組成物。
【請求項２７】
乳剤、懸濁液剤、液剤、ゲル、クリーム、ペースト、泡、滑剤、スプレー、坐剤、ペッサリーまたはタンポンの剤形である請求の範囲１０または２６の医薬組成物。
【請求項２８】
避妊具中または避妊具上にある請求の範囲１０、２６または２７の医薬組成物。
【請求項２９】
該避妊具がコンドームである請求の範囲２８の医薬組成物。
【請求項３０】
避妊薬をさらに含有する請求の範囲１０および２６〜２９のいずれかの医薬組成物。
【請求項３１】
該避妊薬がノノキシノール−９である請求の範囲３０の医薬組成物。
【請求項３２】
別の抗ウイルス剤および／または抗生剤をさらに含有する請求の範囲１０および２６〜３１のいずれかの医薬組成物。
【請求項３３】
該抗生剤が抗真菌剤または抗細菌剤である請求の範囲３２の医薬組成物。
【請求項３４】
工程(b)の前に、該抽出物中に含まれる、該蛋白質または該ペプチドよりも高分子量の生体高分子を該抽出物から除去することを含む、請求の範囲６の方法。
【請求項３５】
免疫刺激剤をさらに含む請求の範囲９の医薬組成物。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含む、単離および精製された抗ウイルス蛋白質または単離および精製された抗ウイルスペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離および精製された抗ウイルス蛋白質または単離された抗ウイルスペプチド。
【請求項３】
エフェクター分子、ウイルス、ウイルス糖蛋白質、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストランまたは固形支持マトリックスに連結された請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドを含む蛋白質複合物またはペプチド複合物。
【請求項４】
該エフェクター分子が毒素および免疫学的試薬からなる群より選ばれる請求の範囲３の複合物。
【請求項５】
該エフェクター分子がシュードモナス外毒素である請求の範囲４の複合物。
【請求項６】
請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドの取得方法であって、(a) 抗ウイルス活性を含むノストック・エリプソスポラムの抽出物を同定し、(b) 抗ウイルスバイオアッセイをガイドに該抽出物を分画して該蛋白質または該ペプチドの部分精製された抽出物を得、(c) 該部分精製抽出物を逆相ＨＰＬＣによりさらに精製して該蛋白質または該ペプチドを得ることを含む方法。
【請求項７】
ウイルスまたはウイルスエンベロープ糖蛋白質をシアノビリンと複合物形成させる方法であって、単離および精製されたウイルスまたは単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質に請求の範囲１または２の蛋白質またはペプチドを接触させ、該単離および精製されたウイルスまたは該単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質と該蛋白質または該ペプチドとの接触によって、該蛋白質または該ペプチドが該単離および精製されたウイルスまたは該単離および精製されたウイルスエンベロープ糖蛋白質に結合し、それによって複合物を形成することを含む方法。
【請求項８】
請求の範囲１〜５のいずれかの蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物をコードする、単離および精製された核酸分子。
【請求項９】
請求の範囲１〜５のいずれかの蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物、あるいは請求の範囲７の方法により得られる複合物の抗ウイルス有効量およびそれ用の医薬上許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
動物のウイルス感染阻害剤である請求の範囲９の医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲８の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求の範囲８の核酸分子または請求の範囲１１のベクターを有効成分とする動物のウイルス感染阻害剤であって、ウイルス感染を阻害する必要のある動物の細胞をインビボで形質転換して、該核酸分子にコードされる抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチド、抗ウイルス蛋白質複合物または抗ウイルスペプチド複合物をインビボで発現させるべく投与されることを特徴とする該ウイルス感染阻害剤。
【請求項１３】
請求の範囲８の核酸分子または請求の範囲１１のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
該宿主細胞が哺乳動物細胞、細菌または酵母である請求の範囲１３の宿主細胞。
【請求項１５】
該細菌が乳酸菌である請求の範囲１４の宿主細胞。
【請求項１６】
請求の範囲１３〜１５のいずれかの宿主細胞中で蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物を発現させることを含む蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の製造方法。
【請求項１７】
請求の範囲１３〜１５のいずれかの宿主細胞を有効成分とする動物のウイルス感染阻害剤であって、該核酸分子にコードされる抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチド、抗ウイルス蛋白質複合物または抗ウイルスペプチド複合物を発現するように動物中または動物上に置かれるべく投与されることを特徴とする該ウイルス感染阻害剤。
【請求項１８】
該宿主細胞が自己または同種の哺乳動物細胞である請求の範囲１７のウイルス感染阻害剤。
【請求項１９】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量で無生物の対象物、溶液、懸濁液、乳液または他の材料を処理することを含む、ウイルス感染の拡大を阻害する方法。
【請求項２０】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量で血液、血液製剤、精液、細胞、組織または器官を生体外で処理することを含む、ウイルス感染の拡大を阻害する方法。
【請求項２１】
請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチドまたは複合物中の蛋白質もしくはペプチドに対する抗体。
【請求項２２】
抗ウイルス剤をウイルスに接触させる方法であって、請求の範囲１〜５の蛋白質、ペプチド、蛋白質複合物またはペプチド複合物の抗ウイルス有効量をウイルスに接触させることを含む方法。
【請求項２３】
試料からのウイルスの除去方法であって、
(a) 請求の範囲１〜５のいずれかの単離および精製された抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチドまたは複合物を含む組成物を該試料に接触させ（但し、(i) 該抗ウイルス蛋白質または抗ウイルスペプチドは配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも９個の隣接するアミノ酸を含み、(ii) 該抗ウイルス蛋白質、抗ウイルスペプチドまたはその複合物は固形支持マトリックスに接着し、(iii) 該少なくとも９個の隣接するアミノ酸が該ウイルスに結合する）、
(b) 該試料と該組成物とを分離することにより、ウイルスを該試料から除去することを含む方法。
【請求項２４】
該試料が血液、血液成分、精液、細胞、組織または器官である請求の範囲２３の方法。
【請求項２５】
該試料がワクチン製剤であり、除去されるウイルスが感染力のあったものである請求の範囲２３の方法。
【請求項２６】
動物の膣、陰茎、直腸または口に局所投与されることを特徴とする請求の範囲１０の医薬組成物。
【請求項２７】
乳剤、懸濁液剤、液剤、ゲル、クリーム、ペースト、泡、滑剤、スプレー、坐剤、ペッサリーまたはタンポンの剤形である請求の範囲１０または２６の医薬組成物。
【請求項２８】
避妊具中または避妊具上にある請求の範囲１０、２６または２７の医薬組成物。
【請求項２９】
該避妊具がコンドームである請求の範囲２８の医薬組成物。
【請求項３０】
避妊薬をさらに含有する請求の範囲１０および２６〜２９のいずれかの医薬組成物。
【請求項３１】
該避妊薬がノノキシノール−９である請求の範囲３０の医薬組成物。
【請求項３２】
別の抗ウイルス剤および／または抗生剤をさらに含有する請求の範囲１０および２６〜３１のいずれかの医薬組成物。
【請求項３３】
該抗生剤が抗真菌剤または抗細菌剤である請求の範囲３２の医薬組成物。
【請求項３４】
工程(b)の前に、該抽出物中に含まれる、該蛋白質または該ペプチドよりも高分子量の生体高分子を該抽出物から除去することを含む、請求の範囲６の方法。
【請求項３５】
免疫刺激剤をさらに含む請求の範囲９の医薬組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８Ａ】
【図９】
【図１０】
【図１Ｃ】
【図１Ｆ】
【図８Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１Ｂ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８Ａ】
【図９】
【図１０】
【図１Ｃ】
【図１Ｆ】
【図８Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−９４８６０（Ｐ２００６−９４８６０Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９３００７（Ｐ２００５−２９３００７）
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【分割の表示】特願平８−５３２７７８の分割
【原出願日】平成８年４月２６日（１９９６．４．２６）
【出願人】（５０２１５１１５２）アメリカ合衆国 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【分割の表示】特願平８−５３２７７８の分割
【原出願日】平成８年４月２６日（１９９６．４．２６）
【出願人】（５０２１５１１５２）アメリカ合衆国 (3)
【Ｆターム（参考）】
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