抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途
【課題】薬効の優れたモノクローナル抗体または代替的なモノクローナル抗体を提供すること。
【解決手段】本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体、より具体的には、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体；上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；上記モノクローナル抗体の製造方法；上記ハイブリドーマ細胞の製造方法；上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤；上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤；ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。
【解決手段】本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体、より具体的には、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体；上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；上記モノクローナル抗体の製造方法；上記ハイブリドーマ細胞の製造方法；上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤；上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤；ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途に関する。より具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、上記モノクローナル抗体の製造方法、上記ハイブリドーマ細胞の製造方法、上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤、上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞と細胞外マトリックスとの接着は、インテグリンに代表される膜貫通細胞接着タンパク質を介して行われる。インテグリンはα鎖とβ鎖の１：１のヘテロ二量体で構成され、現在までにα鎖１８種類、β鎖８種類が発見され、それらの組合せで、少なくとも２４種類が同定確認されている。各インテグリンはそれぞれが特異的な細胞外マトリックス（リガンド）を認識することが知られている。また、インテグリンを含む膜貫通細胞接着タンパク質の役割は、細胞と細胞外マトリックスの接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。
【０００３】
インテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブファミリーに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、ファイブロネクチン、ビトロネクチンなどに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される。α４インテグリンおよびα９インテグリンは、これらのどれにも属さないサブファミリーでありα４インテグリンサブファミリーと呼ばれている。
【０００４】
α４およびα９インテグリンに結合するリガンドとして、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ；以下、ＯＰＮと略称する）、ファイブロネクチンのＥＤＡ部位、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸIII血液凝固因子そしてVascular Ce11 Adhesion Molecule-1（ＶＣＡ
Ｍ−１）などが知られている。また、α４インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクチンのＣＳ−１ドメイン、ＭａｄＣＡＭ−１（α４β７）などが知られている。一方、α９インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。
【０００５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるＯＰＮは分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、尿、腎尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、腫瘍組織などに広く発現が認められている分子である。分子中央部に細胞接着配列ＧＲＧＤＳとヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ配列、その直後にはトロンビン切断部位を有しており、ＧＲＧＤＳ配列を介してＲＧＤ受容体のインテグリンと、ＳＶＶＹＧＬＲ配列あるいはＳＬＡＹＧＬＲ配列を介してα４（α４β１）とα９（α９β１）インテグリンと接着する。
【０００６】
α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１は切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている。
【０００７】
α４とα９インテグリンおよびβ１のインテグリン・サブユニットのアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらのインテグリンは種間でアミノ酸配列の類似性が高いことが知られている。
【０００８】
ＷＯ０２／０８１５２２には、ＯＰＮ欠損マウスやＯＰＮに対する中和抗体を用いたＯＰＮ機能抑制による、リウマチ様関節炎や肝炎の治療効果について開示されている。また、この公報には、炎症性疾患発症にはα４インテグリン、α９インテグリンの認識配列であるＳＶＶＹＧＬＲ配列が重要であること、ＯＰＮに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、炎症性疾患に開連していることが開示されている。
【特許文献１】ＷＯ０２／０８１５２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された治療効果を有する癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の予防薬および／または治療薬等を開発することが望まれている。
【００１０】
現在までに、本発明者らは、インテグリン、特にα９インテグリンに着目し、種々の研究を行った結果、α９インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果および抗炎症効果を有することを見出し、５種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、および２８Ｓ１）を作製した（それぞれ、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１３、およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３２として、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに（最初の４つは２００６年２月１５日付で、最後の１つは２００７年５月２９日付で）寄託されている）。
【００１１】
このような状況下、さらに薬効の優れたモノクローナル抗体または代替的なモノクローナル抗体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前述の５種類のモノクローナル抗体より薬効的に優れた、または代替的なモノクローナル抗体を開発するため、鋭意研究し、新規なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製に成功して、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体、そのモノクローナル抗体、その産生細胞、上記抗体を含有する治療剤、α９インテグリン活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等を提供する。
（１）配列番号１〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
（２）配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）モノクローナル抗体である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（９）キメラ抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１０）ヒト化抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１１）ヒト抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１２）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１４）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１５）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
（１６）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
（１７）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
（１８）α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、新規な抗αインテグリン抗体が提供される。本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された、癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［発明の経緯］
α４インテグリンに対する抗体であるTysabri（登録商標）（natalizumab）は２００４年１１月にバイオジェン・アイデック（Biogen Idec Inc.、米マサチューセッツ州）とエラン（Elan Corporation、アイルランド）が多発性硬化症治療薬として米食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受けている。また、Tysabri（登録商標）はクローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されている。なお、Ｐ４Ｃ２という抗ヒトα４β１インテグリン・モノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
【００１６】
しかし、α９インテグリンに対する抗体はヒトおよびモルモットのα９インテグリンに特異性を示すＹ９Ａ２と呼ばれるモノクローナル抗体（A.Wang et al、，（1996）Am. J. Respir.，Ce11 Mol. Biol. 15、664-672）が実験用として供されているが、臨床的に用いられていない。
【００１７】
本発明では、以下の点を注意深く進めることにより、より優れた薬効が期待できるヒトα９インテグリンに対する新たな抗体を得ることができた。
【００１８】
（１）ヒトα９インテグリン過剰発現株の作製
α９インテグリンに対する抗体を作製するために、マウス線維芽細胞であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞へ遺伝子導入を行い、ヒトα９インテグリンを過剰発現する細胞株を樹立し、この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
【００１９】
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合で得られた種々のハイブリドーマからヒトα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、同じインテグリンファミリーであるヒトα４インテグリンをＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリンとは交差反応性を示さず、親細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）の細胞表面抗原とは反応しないクローンを選抜することにより、効率的にヒトα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
【００２０】
［本発明の抗α９インテグリン抗体］
本発明は、ヒトα９インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、「抗体」とは、抗原であるα９インテグリンまたはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、などの断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を包含する。
【００２１】
本発明において、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋa）が少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、１０9Ｍ-1、さらにより好ましくは、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1、１０12Ｍ-1またはそれより高い、例えば、最高で１０13Ｍ-1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００２２】
本発明における「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものをいう。
【００２３】
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、およびＦｖ断片が含まれる。これらの抗体断片は抗体のパパイン消化、ペプシン消化など一般的に知られている方法で作製することができる。
【００２４】
上記「キメラ抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変したヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）を指す。「ヒト化抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）を意味する。
【００２５】
より具体的には、本発明は、まず、これまで作製された抗ヒトα９インテグリン抗体と異なる抗ヒトα９インテグリン抗体を提供する。本発明の好ましい態様による抗体は、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２６】
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２７】
本発明において特に好ましい抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２８】
以下、抗α９インテグリン・モノクローナル抗体の作製について詳述するが、該抗体の作製はこれに限定されることはない。
［α９インテグリン（抗原）］
【００２９】
本発明において抗原として使用するα９インテグリンは、（１）ヒトやその他の哺乳動物のα９インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また（３）合成タンパク質であってもよい。
【００３０】
また、本発明のα９インテグリンには、各種哺乳動物のα９インテグリンのアミノ酸配列、特に好ましくはヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００３１】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個））のアミノ酸が置換、欠失および／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、ならびに該天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個））のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
【００３２】
本発明のα９インテグリン、特にはヒト由来のα９インテグリンは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００３３】
また、変異ポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（gapped duplex法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明のα９インテグリンには、該α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、ＯＰＮ、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１等のα９インテグリンリガンドと結合するために必要な領域を含む部分をいう。該α９インテグリンの「一部」は、後述する当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンをタンパク分解酵素等により適切に切断することで製造することができる。
【００３５】
抗原としてはまた、α９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体、あるいはその膜画分等を用いることができる。
【００３６】
本発明のα９インテグリンには、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。また、特に本発明ではヒトα９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。したがって、後述するような、ヒトα９インテグリンをコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、ヒトα９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、またはその細胞膜画分を抗原として調製する場合もある。
【００３７】
［抗体産生細胞の調製］
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではマウスが好適に用いられる。
【００３８】
治療の対象がヒトであり、α９インテグリン阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒト・マウスのキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
［抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合］
【００３９】
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３が好適に用いられる。
【００４０】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
【００４１】
［ハイブリドーマ細胞の選別］
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体の産生は、新臨床免疫実験操作法（part 3）、科学評論社、1997に記載される細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認およびスクリーニングできる。免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、免疫に用いた細胞とは別の細胞で過剰発現するヒトα９インテグリンに反応し、かつ、ヒトα４インテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗ヒトα９インテグリン抗体とすることができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
【００４３】
［抗体の分離精製］
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
【００４４】
［抗体の標識化］
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）できる。本発明では、Biotin Labeling Kit（同仁化学）を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
【００４５】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。これらの予防および／または治療剤としての剤形は注射剤、点滴用剤などの非経口製剤とすることができ、創意工夫により経口製剤として使用することができる。また、製剤化に当たっては、薬事上および薬学的に許容される範囲内で、剤形に適した担体、希釈剤もしくは添加剤などを使用することができる。
【００４６】
［抗体の薬理学的効果］
インテグリンの役割は、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。従って、得られたモノクローナル抗体は、ＥＣＭとα９インテグリンとの結合を阻害することにより、ＥＣＭからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、ＥＣＭが関与する疾患の治療が可能である。α９インテグリンに結合するＥＣＭ、およびα９リガンドとしてＯＰＮ、ファイブロネクチン、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸIII血液凝固因子、Vascular Ce11 Adhesion Molecul
e-1（ＶＣＡＭ−１）、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。これらのＥＣＭとα９インテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られたモノクローナル抗体の存在下での結合阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察することにより、本発明のモノクローナル抗体の対象疾患を見出すことができる。
【００４７】
［抗体を含有する医薬］
本発明の抗体（特に、モノクローナル抗体）を有効成分とする製剤は、癌（例えば癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等の治療剤（therapeutic agent）または予防剤（prophylactic agent）として用いることができる。
【００４８】
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
【００４９】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供される。
【００５０】
すなわち、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。また、上記抗体を適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。
【００５１】
上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
【００５２】
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、本発明の医薬製剤は、上記抗体に加えて、抗ヒトα４インテグリン抗体を含有させることができる。この場合の混合比は特に限定されないが、例えば、抗ヒトα９インテグリン抗体：抗ヒトα４インテグリン抗体の比率を１〜９９：９９〜１の比率の範囲内で調整することができる。
【００５３】
［本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤］
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、あるいはイムノメトリック法などによる定量などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【００５４】
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、α９インテグリンを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのα９インテグリンの定量法を利用することにより、α９インテグリンが関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、α９インテグリンの濃度の増減が検出された場合は、α９インテグリンが関連する疾患、例えば炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。また、α９インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれるα９インテグリンの検出、被検細胞内におけるα９インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
【００５５】
［ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法］
本発明の抗体が認識するヒトα９インテグリン上のエピトープを利用して、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、「ペプチドＡ」という）を用いることを特徴とする、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）ペプチドＡと、ヒトα９インテグリンのリガンド（例えば、テネイシンＣ、プラスミンなど）とを接触させた場合と（ii）ペプチドＡと、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう。工程（ｉ）と（ii）の比較は、例えば、ペプチドＡに対するリガンドの結合量を測定することにより行う。そのような結合量の比較を容易にするために、公知の手法によって標識したリガンドを用いることが好ましい。このような方法によって得られた候補化合物について、ヒトα９インテグリンの活性を阻害するか否かの確認実験を行って、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物を得る。
【００５７】
ここで被験物質としては、ポリペプチド、タンパク質、生体由来の非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等を用いることができ、新規化合物であっても、公知の化合物であっても良い。
【００５８】
選択される化合物は、本発明の抗体同様、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。
【００５９】
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
［ヒトα９インテグリンに対する抗体の作製］
ヒトα９インテグリンに対する抗体作製は、以下のようにしてBALB/cマウス３匹に対して免疫を行った。まず、ヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を３×１０6細胞／匹を腹腔内投与し、さらにその１週間後と２週間後に、ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を３×１０6細胞／匹を腹腔内投与した。さらに一週間後、ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０6細胞／匹を静脈内投与した。ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びヒトα９インテグリンを内在的に発現するヒトメラノーマ細胞株（Ｇ３６１細胞）に反応し、且つ、ヒトα４インテグリン発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を樹立した。
【００６１】
ここで得られたハイブリドーマ細胞Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａは、２００７年５月２９日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１として寄託されている。
【００６２】
（実施例２）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の相補認識領域（ＣＤＲ）の解析］
ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出して、逆転写によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳｃＦｖクローニング用プライマー（Light Primer Mix、Heavy Primer Mix；アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行い、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長・増幅した。次に、ＰＣＲ産物を常法に基づいてpCRII TOPO vectorに組み込んだ。これをシ
ークエンスしてアミノ酸配列を決定した。各抗体について３回ずつ上記の操作を行った。
【００６３】
その結果、Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａの重鎖および軽鎖の可変領域とＣＤＲ領域のアミノ酸配列は図１Ａおよび図１Ｂに示す通りとなった。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、具体的には、以下の通りである。
【００６４】
（重鎖）
［ＣＤＲＨ１］
Ｋ３３Ｎ： ＳＹＹＭＮ（配列番号１）
Ｍ３５Ａ： ＳＹＷＩＨ（配列番号２）
［ＣＤＲＨ２］
Ｋ３３Ｎ： ＷＩＦＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫ（配列番号３）
Ｍ３５Ａ： ＥＩＮＰＳＳＧＲＴＮＦＩＥＮＦＥＴＫ（配列番号４）
［ＣＤＲＨ３］
Ｋ３３Ｎ： ＳＷＶＳＹＥＲＧＹＹＦＤＹ（配列番号５）
Ｍ３５Ａ： ＬＡＹＧＮＹＳＷＦＡＹ（配列番号６）
【００６５】
（軽鎖）
［ＣＤＲＬ１］
Ｋ３３Ｎ： ＲＡＳＥＮＩＹＹＳＬＡ（配列番号７）
Ｍ３５Ａ： ＲＡＳＥＴＶＤＳＹＧＮＴＦＭＨ（配列番号８）
［ＣＤＲＬ２］
Ｋ３３Ｎ： ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号９）
Ｍ３５Ａ： ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１０）
［ＣＤＲＬ３］
Ｋ３３Ｎ： ＫＱＡＹＤＶＰＹＴ（配列番号１１）
Ｍ３５Ａ： ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２）
【００６６】
なお、図１Ａおよび図１Ｂには、上記の配列解析方法（ＧＴＳ）とは異なる解析方法（異なる配列解析ソフトウェア）を使用して得た配列（ＪＮ ＢｉｏおよびＴａｋａｒａ）も示している。それぞれの方法の詳細は以下の通りである。
【００６７】
［JN Biosciencesの配列解析法（Ｋ３３Ｎ）］
ハイブリドーマ細胞（Ｋ３３Ｎ）を10%牛胎児血清（FBS；HyClone）含有TIL Media I培地（免疫生物研究所）で７．５％ＣＯ2、３７℃で培養し、増殖させた。 全RNAは、Invitrogenのプロトコールに従い、TRIzol試薬（Invitrogen）を用い、約３×１０6個のハイブリドーマ細胞から抽出した。 オリゴdT-プライマーを使用した逆転写反応でのcDNAの作製は、GeneRacer Kit（Invitrogen）を用い、Invitrogenのプロトコールに従った。H鎖とL鎖の可変領域cDNAは、マウス定常領域γ1とκにそれぞれ相当する3' primerおよびGeneRacer Kit 添付のGeneRacer 5' primer（5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'（配列番号１４））を用い、Phusion DNA polymerase（New England Biolabs）を使用し、PCRで増幅した。 H鎖可変領域（VH）のPCR増幅のための3' primaerは 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'（配列番号１５）である。L鎖可変領域（VL）のPCR増幅のための3' primerは、5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'（配列番号１６）である。増幅したVHとVLの cDNAは配列決定のためにpCR4Blunt-TOPO vector（Invitrogen）中でサブクローニングした。可変領域のDNA配列解析はTocore（Menlo Park）で行った。
【００６８】
［Takaraの配列解析法（Ｍ３５Ａ）］
ハイブリドーマ細胞（Ｍ３５Ａ）を培養、増殖させた後、細胞の全RNAはRNAiso（タカラバイオ社）を用いて、Acid Guanidine-Phenol-Chloroform法（AGPC法）で抽出した。抽出したRNAは常法によりDNase I 処理を行った後、フェノールクロロホルム処理を行い、DNase I を除き、エタノール沈殿で精製した。得られたRNA は再度蒸留水に懸濁して解析に用いた。DNase I 処理後の RNA 約1μg を鋳型に、Random Primer(9mer)を用いて逆転写酵素Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H free）で逆転写反応を行った。可変領域のPCR 増幅には、各逆転写反応液の一部を鋳型とし、H 鎖はプライマーHeavy Primer 1 とHeavy Primer 2（アマシャムバイオサイエンス社）を、L 鎖にプライマーLight Primer Mix（アマシャムバイオサイエンス社）をそれぞれ用い、PCR 酵素にはタカラTaKaRa LA Taq を使用した。
【００６９】
PCRによって得たDNA断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってDNAの精製を行った。精製したDNAをpMD20-T vectorにTAクローニングした。可変領域のDNA配列解析はpMD20-T vectorに含まれるM13-47 primer配列を用いて遺伝子配列を決定した。シーケンス反応にはBigDye Terminators v3.1 cycle sequencing kit （アプライドバイオシステムズ社）を使用し、同社のプロトコールに従ってABI3730シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社）により行った。
【００７０】
図１Ａおよび図１Ｂから明らかなように、用いる解析方法（または解析ソフトウェア）により、得られる配列に多少の違いがみられるが、ＣＤＲのアミノ酸配列に関しては、解析方法の違いによる差異は見られなかった。
【００７１】
（実施例３）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害効果］
細胞接着する際にはα９インテグリンがＯＰＮ、ファイブロネクチン、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むリガンドと結合することから、得られた新規な抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害をα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とリガンドの結合阻害で検討した。
【００７２】
ＯＰＮペプチドはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を結合したＳＶＶＹＧＬＲペプチド、ＴＮ-Ｃ ｆｎ３ (ＲＡＡ)はヒトテネイシン―ＣのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＴｙｐｅIII ｒｅｐｅａｔの三番目の領域を大腸菌にて発現させたタンパク（この領域内のＲＧＤ配列をＲＡＡ配列に変換した。）を用いた。
【００７３】
ＯＰＮ ペプチドまたはテネイシンＣフラグメント(ＴＮ−Ｃ ｆｎ３(ＲＡＡ)) （５μｇ/ｍＬ）を９６穴プレートに３７℃一時間放置後、０．５％ＢＳＡ/ＰＢＳでブロッキングした。ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１は、１×１０5個／ｍＬになるように０．２５％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培地で調整し、各濃度の抗ヒトα９インテグリン抗体を添加した。抗体を添加したＧ３６１細胞を２００μＬずつ固相した９６穴プレートに入れ、３７℃１時間反応させた。二回ＰＢＳにて洗浄後、接着細胞を０．５％ クリスタルバイオレッド/２０％メタノールで固定、染色した。３回、蒸留水で洗浄後、２０％酢酸で溶解し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）、陽性対照として先に調製した抗ヒトα９インテグリン抗体５種類（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）を用いた。
【００７４】
ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着に及ぼす抗ヒトα９インテグリン抗体の影響を図２に、テネイシンＣフラグメントでの結果を図３に示す。
【００７５】
ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着において、Ｍ３５Ａは陰性対象５Ａ１と陽性対象１Ｋ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１と同様に細胞接着阻害の効果が小さかった。一方、Ｋ３３Ｎは陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同等の細胞接着阻害効果を示した。テネイシンＣフラグメントへのＧ３６１細胞の接着では、Ｍ３５Ａは細胞接着阻害の効果が小さかったが、Ｋ３３Ｎは少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同じ程度にその細胞接着阻害効果が陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて明らかに強かった。このように、特にＫ３３Ｎは他の抗体と比較しても格別顕著な細胞接着阻害効果を示した。
【００７６】
（実施例４）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の認識部位の差異］
新規に作製した抗ヒトα９インテグリン抗体Ｋ３３Ｎの細胞接着阻害効果がＹ９Ａ２と同様な挙動を示したので、ヒトα９インテグリン発現細胞（ｈα９／ＣＨＯ）に対する両抗体の競合反応をＦＡＣＳで検出することにより、認識部位の差異を調べた。
【００７７】
ビオチン標識したＫ３３ＮまたはＹ９Ａ２（５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）にその１００倍量のＫ３３Ｎ、Ｙ９Ａ２、陰性対象ＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加えた後、ヒトα９インテグリン細胞（ｈα９／ＣＨＯ、１×１０7／ｍＬ、１００μＬ）と反応（４℃、３０分）させ、ＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。ストレプトアビジン標識ＡＰＣ（０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を細胞溶液に加え、（４℃、２０分）で反応させ、再度ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した後、７−ＡＡＤ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）を用いて死細胞の染色を行った。その後、再度ＦＡＣＳバッファーで洗浄して、細胞をＦＡＣＳで測定した。
【００７８】
図４に示すように、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｙ９Ａ２を競合反応させると蛍光物質が結合した細胞が明らかにバックグランド近辺まで減少しているが、ビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｋ３３Ｎの共存下では蛍光物質が結合した細胞の減少はみられるものの、バックグランド近辺まで減少しなかった。一方、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｋ３３Ｎに無標識Ｋ３３Ｎを添加すると競合し、蛍光物質が結合した細胞が明らかに減少したが、無標識Ｙ９Ａ２を添加しても蛍光物質が結合した細胞が無標識Ｋ３３Ｎ添加までは減少しなかった。したがって、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎが同じエピトープを認識する場合には競合を示すが、完全な競合を呈しなかったことから、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎは異なるエピトープを認識しており、同一の抗体でないと示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の重鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。
【図１Ｂ】抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の軽鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。
【図２】抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とＯＰＮのα９インテグリン結合部位ペプチド（ＳＶＶＹＧＬＲ）で調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。
【図３】抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とテナイシンＣフラグメントのα９インテグリン結合部位ペプチドで調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。
【図４】ヒトα９インテグリン発現細胞に対する新規な抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ）とＹ９Ａ２との競合反応を調べた結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途に関する。より具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、上記モノクローナル抗体の製造方法、上記ハイブリドーマ細胞の製造方法、上記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤、上記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞と細胞外マトリックスとの接着は、インテグリンに代表される膜貫通細胞接着タンパク質を介して行われる。インテグリンはα鎖とβ鎖の１：１のヘテロ二量体で構成され、現在までにα鎖１８種類、β鎖８種類が発見され、それらの組合せで、少なくとも２４種類が同定確認されている。各インテグリンはそれぞれが特異的な細胞外マトリックス（リガンド）を認識することが知られている。また、インテグリンを含む膜貫通細胞接着タンパク質の役割は、細胞と細胞外マトリックスの接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。
【０００３】
インテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブファミリーに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、ファイブロネクチン、ビトロネクチンなどに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される。α４インテグリンおよびα９インテグリンは、これらのどれにも属さないサブファミリーでありα４インテグリンサブファミリーと呼ばれている。
【０００４】
α４およびα９インテグリンに結合するリガンドとして、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ；以下、ＯＰＮと略称する）、ファイブロネクチンのＥＤＡ部位、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸIII血液凝固因子そしてVascular Ce11 Adhesion Molecule-1（ＶＣＡ
Ｍ−１）などが知られている。また、α４インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクチンのＣＳ−１ドメイン、ＭａｄＣＡＭ−１（α４β７）などが知られている。一方、α９インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。
【０００５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるＯＰＮは分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、尿、腎尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、腫瘍組織などに広く発現が認められている分子である。分子中央部に細胞接着配列ＧＲＧＤＳとヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ配列、その直後にはトロンビン切断部位を有しており、ＧＲＧＤＳ配列を介してＲＧＤ受容体のインテグリンと、ＳＶＶＹＧＬＲ配列あるいはＳＬＡＹＧＬＲ配列を介してα４（α４β１）とα９（α９β１）インテグリンと接着する。
【０００６】
α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１は切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている。
【０００７】
α４とα９インテグリンおよびβ１のインテグリン・サブユニットのアミノ酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらのインテグリンは種間でアミノ酸配列の類似性が高いことが知られている。
【０００８】
ＷＯ０２／０８１５２２には、ＯＰＮ欠損マウスやＯＰＮに対する中和抗体を用いたＯＰＮ機能抑制による、リウマチ様関節炎や肝炎の治療効果について開示されている。また、この公報には、炎症性疾患発症にはα４インテグリン、α９インテグリンの認識配列であるＳＶＶＹＧＬＲ配列が重要であること、ＯＰＮに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、炎症性疾患に開連していることが開示されている。
【特許文献１】ＷＯ０２／０８１５２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された治療効果を有する癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の予防薬および／または治療薬等を開発することが望まれている。
【００１０】
現在までに、本発明者らは、インテグリン、特にα９インテグリンに着目し、種々の研究を行った結果、α９インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果および抗炎症効果を有することを見出し、５種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、および２８Ｓ１）を作製した（それぞれ、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１３、およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３２として、茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに（最初の４つは２００６年２月１５日付で、最後の１つは２００７年５月２９日付で）寄託されている）。
【００１１】
このような状況下、さらに薬効の優れたモノクローナル抗体または代替的なモノクローナル抗体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前述の５種類のモノクローナル抗体より薬効的に優れた、または代替的なモノクローナル抗体を開発するため、鋭意研究し、新規なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製に成功して、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体、そのモノクローナル抗体、その産生細胞、上記抗体を含有する治療剤、α９インテグリン活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等を提供する。
（１）配列番号１〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
（２）配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）モノクローナル抗体である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（９）キメラ抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１０）ヒト化抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１１）ヒト抗体である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１２）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１４）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（１５）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
（１６）上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
（１７）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
（１８）α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、新規な抗αインテグリン抗体が提供される。本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された、癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
［発明の経緯］
α４インテグリンに対する抗体であるTysabri（登録商標）（natalizumab）は２００４年１１月にバイオジェン・アイデック（Biogen Idec Inc.、米マサチューセッツ州）とエラン（Elan Corporation、アイルランド）が多発性硬化症治療薬として米食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受けている。また、Tysabri（登録商標）はクローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されている。なお、Ｐ４Ｃ２という抗ヒトα４β１インテグリン・モノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
【００１６】
しかし、α９インテグリンに対する抗体はヒトおよびモルモットのα９インテグリンに特異性を示すＹ９Ａ２と呼ばれるモノクローナル抗体（A.Wang et al、，（1996）Am. J. Respir.，Ce11 Mol. Biol. 15、664-672）が実験用として供されているが、臨床的に用いられていない。
【００１７】
本発明では、以下の点を注意深く進めることにより、より優れた薬効が期待できるヒトα９インテグリンに対する新たな抗体を得ることができた。
【００１８】
（１）ヒトα９インテグリン過剰発現株の作製
α９インテグリンに対する抗体を作製するために、マウス線維芽細胞であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞へ遺伝子導入を行い、ヒトα９インテグリンを過剰発現する細胞株を樹立し、この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
【００１９】
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合で得られた種々のハイブリドーマからヒトα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、同じインテグリンファミリーであるヒトα４インテグリンをＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリンとは交差反応性を示さず、親細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）の細胞表面抗原とは反応しないクローンを選抜することにより、効率的にヒトα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
【００２０】
［本発明の抗α９インテグリン抗体］
本発明は、ヒトα９インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、「抗体」とは、抗原であるα９インテグリンまたはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、などの断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を包含する。
【００２１】
本発明において、抗体が、あるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋa）が少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、１０9Ｍ-1、さらにより好ましくは、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1、１０12Ｍ-1またはそれより高い、例えば、最高で１０13Ｍ-1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００２２】
本発明における「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものをいう。
【００２３】
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）2、およびＦｖ断片が含まれる。これらの抗体断片は抗体のパパイン消化、ペプシン消化など一般的に知られている方法で作製することができる。
【００２４】
上記「キメラ抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変したヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）を指す。「ヒト化抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）を意味する。
【００２５】
より具体的には、本発明は、まず、これまで作製された抗ヒトα９インテグリン抗体と異なる抗ヒトα９インテグリン抗体を提供する。本発明の好ましい態様による抗体は、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２６】
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する。さらに好ましい抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のうち、２以上、３以上、４以上、５以上、または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２７】
本発明において特に好ましい抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体である。
【００２８】
以下、抗α９インテグリン・モノクローナル抗体の作製について詳述するが、該抗体の作製はこれに限定されることはない。
［α９インテグリン（抗原）］
【００２９】
本発明において抗原として使用するα９インテグリンは、（１）ヒトやその他の哺乳動物のα９インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また（３）合成タンパク質であってもよい。
【００３０】
また、本発明のα９インテグリンには、各種哺乳動物のα９インテグリンのアミノ酸配列、特に好ましくはヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００３１】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個））のアミノ酸が置換、欠失および／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、ならびに該天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、特に好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個））のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
【００３２】
本発明のα９インテグリン、特にはヒト由来のα９インテグリンは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００３３】
また、変異ポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（gapped duplex法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明のα９インテグリンには、該α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、ＯＰＮ、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１等のα９インテグリンリガンドと結合するために必要な領域を含む部分をいう。該α９インテグリンの「一部」は、後述する当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンをタンパク分解酵素等により適切に切断することで製造することができる。
【００３５】
抗原としてはまた、α９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体、あるいはその膜画分等を用いることができる。
【００３６】
本発明のα９インテグリンには、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号１３）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。また、特に本発明ではヒトα９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。したがって、後述するような、ヒトα９インテグリンをコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、ヒトα９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、またはその細胞膜画分を抗原として調製する場合もある。
【００３７】
［抗体産生細胞の調製］
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではマウスが好適に用いられる。
【００３８】
治療の対象がヒトであり、α９インテグリン阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒト・マウスのキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
［抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合］
【００３９】
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３が好適に用いられる。
【００４０】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
【００４１】
［ハイブリドーマ細胞の選別］
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体の産生は、新臨床免疫実験操作法（part 3）、科学評論社、1997に記載される細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認およびスクリーニングできる。免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、免疫に用いた細胞とは別の細胞で過剰発現するヒトα９インテグリンに反応し、かつ、ヒトα４インテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗ヒトα９インテグリン抗体とすることができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
【００４３】
［抗体の分離精製］
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.（Amersham Biosciences）等が挙げられる。
【００４４】
［抗体の標識化］
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）できる。本発明では、Biotin Labeling Kit（同仁化学）を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
【００４５】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。これらの予防および／または治療剤としての剤形は注射剤、点滴用剤などの非経口製剤とすることができ、創意工夫により経口製剤として使用することができる。また、製剤化に当たっては、薬事上および薬学的に許容される範囲内で、剤形に適した担体、希釈剤もしくは添加剤などを使用することができる。
【００４６】
［抗体の薬理学的効果］
インテグリンの役割は、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。従って、得られたモノクローナル抗体は、ＥＣＭとα９インテグリンとの結合を阻害することにより、ＥＣＭからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、ＥＣＭが関与する疾患の治療が可能である。α９インテグリンに結合するＥＣＭ、およびα９リガンドとしてＯＰＮ、ファイブロネクチン、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸIII血液凝固因子、Vascular Ce11 Adhesion Molecul
e-1（ＶＣＡＭ−１）、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。これらのＥＣＭとα９インテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られたモノクローナル抗体の存在下での結合阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察することにより、本発明のモノクローナル抗体の対象疾患を見出すことができる。
【００４７】
［抗体を含有する医薬］
本発明の抗体（特に、モノクローナル抗体）を有効成分とする製剤は、癌（例えば癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等の治療剤（therapeutic agent）または予防剤（prophylactic agent）として用いることができる。
【００４８】
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
【００４９】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供される。
【００５０】
すなわち、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。また、上記抗体を適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。
【００５１】
上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
【００５２】
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、本発明の医薬製剤は、上記抗体に加えて、抗ヒトα４インテグリン抗体を含有させることができる。この場合の混合比は特に限定されないが、例えば、抗ヒトα９インテグリン抗体：抗ヒトα４インテグリン抗体の比率を１〜９９：９９〜１の比率の範囲内で調整することができる。
【００５３】
［本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤］
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、あるいはイムノメトリック法などによる定量などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
【００５４】
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、α９インテグリンを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのα９インテグリンの定量法を利用することにより、α９インテグリンが関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、α９インテグリンの濃度の増減が検出された場合は、α９インテグリンが関連する疾患、例えば炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。また、α９インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれるα９インテグリンの検出、被検細胞内におけるα９インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
【００５５】
［ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法］
本発明の抗体が認識するヒトα９インテグリン上のエピトープを利用して、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明は、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、「ペプチドＡ」という）を用いることを特徴とする、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）ペプチドＡと、ヒトα９インテグリンのリガンド（例えば、テネイシンＣ、プラスミンなど）とを接触させた場合と（ii）ペプチドＡと、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう。工程（ｉ）と（ii）の比較は、例えば、ペプチドＡに対するリガンドの結合量を測定することにより行う。そのような結合量の比較を容易にするために、公知の手法によって標識したリガンドを用いることが好ましい。このような方法によって得られた候補化合物について、ヒトα９インテグリンの活性を阻害するか否かの確認実験を行って、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物を得る。
【００５７】
ここで被験物質としては、ポリペプチド、タンパク質、生体由来の非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等を用いることができ、新規化合物であっても、公知の化合物であっても良い。
【００５８】
選択される化合物は、本発明の抗体同様、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。
【００５９】
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
［ヒトα９インテグリンに対する抗体の作製］
ヒトα９インテグリンに対する抗体作製は、以下のようにしてBALB/cマウス３匹に対して免疫を行った。まず、ヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）を３×１０6細胞／匹を腹腔内投与し、さらにその１週間後と２週間後に、ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を３×１０6細胞／匹を腹腔内投与した。さらに一週間後、ヒトα９／ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０6細胞／匹を静脈内投与した。ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びヒトα９インテグリンを内在的に発現するヒトメラノーマ細胞株（Ｇ３６１細胞）に反応し、且つ、ヒトα４インテグリン発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を樹立した。
【００６１】
ここで得られたハイブリドーマ細胞Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａは、２００７年５月２９日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１として寄託されている。
【００６２】
（実施例２）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の相補認識領域（ＣＤＲ）の解析］
ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出して、逆転写によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳｃＦｖクローニング用プライマー（Light Primer Mix、Heavy Primer Mix；アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行い、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長・増幅した。次に、ＰＣＲ産物を常法に基づいてpCRII TOPO vectorに組み込んだ。これをシ
ークエンスしてアミノ酸配列を決定した。各抗体について３回ずつ上記の操作を行った。
【００６３】
その結果、Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａの重鎖および軽鎖の可変領域とＣＤＲ領域のアミノ酸配列は図１Ａおよび図１Ｂに示す通りとなった。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、具体的には、以下の通りである。
【００６４】
（重鎖）
［ＣＤＲＨ１］
Ｋ３３Ｎ： ＳＹＹＭＮ（配列番号１）
Ｍ３５Ａ： ＳＹＷＩＨ（配列番号２）
［ＣＤＲＨ２］
Ｋ３３Ｎ： ＷＩＦＰＧＳＧＮＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫ（配列番号３）
Ｍ３５Ａ： ＥＩＮＰＳＳＧＲＴＮＦＩＥＮＦＥＴＫ（配列番号４）
［ＣＤＲＨ３］
Ｋ３３Ｎ： ＳＷＶＳＹＥＲＧＹＹＦＤＹ（配列番号５）
Ｍ３５Ａ： ＬＡＹＧＮＹＳＷＦＡＹ（配列番号６）
【００６５】
（軽鎖）
［ＣＤＲＬ１］
Ｋ３３Ｎ： ＲＡＳＥＮＩＹＹＳＬＡ（配列番号７）
Ｍ３５Ａ： ＲＡＳＥＴＶＤＳＹＧＮＴＦＭＨ（配列番号８）
［ＣＤＲＬ２］
Ｋ３３Ｎ： ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号９）
Ｍ３５Ａ： ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１０）
［ＣＤＲＬ３］
Ｋ３３Ｎ： ＫＱＡＹＤＶＰＹＴ（配列番号１１）
Ｍ３５Ａ： ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２）
【００６６】
なお、図１Ａおよび図１Ｂには、上記の配列解析方法（ＧＴＳ）とは異なる解析方法（異なる配列解析ソフトウェア）を使用して得た配列（ＪＮ ＢｉｏおよびＴａｋａｒａ）も示している。それぞれの方法の詳細は以下の通りである。
【００６７】
［JN Biosciencesの配列解析法（Ｋ３３Ｎ）］
ハイブリドーマ細胞（Ｋ３３Ｎ）を10%牛胎児血清（FBS；HyClone）含有TIL Media I培地（免疫生物研究所）で７．５％ＣＯ2、３７℃で培養し、増殖させた。 全RNAは、Invitrogenのプロトコールに従い、TRIzol試薬（Invitrogen）を用い、約３×１０6個のハイブリドーマ細胞から抽出した。 オリゴdT-プライマーを使用した逆転写反応でのcDNAの作製は、GeneRacer Kit（Invitrogen）を用い、Invitrogenのプロトコールに従った。H鎖とL鎖の可変領域cDNAは、マウス定常領域γ1とκにそれぞれ相当する3' primerおよびGeneRacer Kit 添付のGeneRacer 5' primer（5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'（配列番号１４））を用い、Phusion DNA polymerase（New England Biolabs）を使用し、PCRで増幅した。 H鎖可変領域（VH）のPCR増幅のための3' primaerは 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'（配列番号１５）である。L鎖可変領域（VL）のPCR増幅のための3' primerは、5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'（配列番号１６）である。増幅したVHとVLの cDNAは配列決定のためにpCR4Blunt-TOPO vector（Invitrogen）中でサブクローニングした。可変領域のDNA配列解析はTocore（Menlo Park）で行った。
【００６８】
［Takaraの配列解析法（Ｍ３５Ａ）］
ハイブリドーマ細胞（Ｍ３５Ａ）を培養、増殖させた後、細胞の全RNAはRNAiso（タカラバイオ社）を用いて、Acid Guanidine-Phenol-Chloroform法（AGPC法）で抽出した。抽出したRNAは常法によりDNase I 処理を行った後、フェノールクロロホルム処理を行い、DNase I を除き、エタノール沈殿で精製した。得られたRNA は再度蒸留水に懸濁して解析に用いた。DNase I 処理後の RNA 約1μg を鋳型に、Random Primer(9mer)を用いて逆転写酵素Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H free）で逆転写反応を行った。可変領域のPCR 増幅には、各逆転写反応液の一部を鋳型とし、H 鎖はプライマーHeavy Primer 1 とHeavy Primer 2（アマシャムバイオサイエンス社）を、L 鎖にプライマーLight Primer Mix（アマシャムバイオサイエンス社）をそれぞれ用い、PCR 酵素にはタカラTaKaRa LA Taq を使用した。
【００６９】
PCRによって得たDNA断片をアガロースゲルによって電気泳動し、バンドを切り出し、ゲルを溶かし出すことによってDNAの精製を行った。精製したDNAをpMD20-T vectorにTAクローニングした。可変領域のDNA配列解析はpMD20-T vectorに含まれるM13-47 primer配列を用いて遺伝子配列を決定した。シーケンス反応にはBigDye Terminators v3.1 cycle sequencing kit （アプライドバイオシステムズ社）を使用し、同社のプロトコールに従ってABI3730シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社）により行った。
【００７０】
図１Ａおよび図１Ｂから明らかなように、用いる解析方法（または解析ソフトウェア）により、得られる配列に多少の違いがみられるが、ＣＤＲのアミノ酸配列に関しては、解析方法の違いによる差異は見られなかった。
【００７１】
（実施例３）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害効果］
細胞接着する際にはα９インテグリンがＯＰＮ、ファイブロネクチン、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むリガンドと結合することから、得られた新規な抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害をα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とリガンドの結合阻害で検討した。
【００７２】
ＯＰＮペプチドはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を結合したＳＶＶＹＧＬＲペプチド、ＴＮ-Ｃ ｆｎ３ (ＲＡＡ)はヒトテネイシン―ＣのＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ＴｙｐｅIII ｒｅｐｅａｔの三番目の領域を大腸菌にて発現させたタンパク（この領域内のＲＧＤ配列をＲＡＡ配列に変換した。）を用いた。
【００７３】
ＯＰＮ ペプチドまたはテネイシンＣフラグメント(ＴＮ−Ｃ ｆｎ３(ＲＡＡ)) （５μｇ/ｍＬ）を９６穴プレートに３７℃一時間放置後、０．５％ＢＳＡ/ＰＢＳでブロッキングした。ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１は、１×１０5個／ｍＬになるように０．２５％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭ培地で調整し、各濃度の抗ヒトα９インテグリン抗体を添加した。抗体を添加したＧ３６１細胞を２００μＬずつ固相した９６穴プレートに入れ、３７℃１時間反応させた。二回ＰＢＳにて洗浄後、接着細胞を０．５％ クリスタルバイオレッド/２０％メタノールで固定、染色した。３回、蒸留水で洗浄後、２０％酢酸で溶解し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）、陽性対照として先に調製した抗ヒトα９インテグリン抗体５種類（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）を用いた。
【００７４】
ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着に及ぼす抗ヒトα９インテグリン抗体の影響を図２に、テネイシンＣフラグメントでの結果を図３に示す。
【００７５】
ＯＰＮ ペプチドへのＧ３６１細胞の接着において、Ｍ３５Ａは陰性対象５Ａ１と陽性対象１Ｋ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１と同様に細胞接着阻害の効果が小さかった。一方、Ｋ３３Ｎは陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同等の細胞接着阻害効果を示した。テネイシンＣフラグメントへのＧ３６１細胞の接着では、Ｍ３５Ａは細胞接着阻害の効果が小さかったが、Ｋ３３Ｎは少量で細胞接着を阻害し、Ｙ９Ａ２と同じ程度にその細胞接着阻害効果が陽性対象２１Ｃ５、２４Ｉ１１に比べて明らかに強かった。このように、特にＫ３３Ｎは他の抗体と比較しても格別顕著な細胞接着阻害効果を示した。
【００７６】
（実施例４）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の認識部位の差異］
新規に作製した抗ヒトα９インテグリン抗体Ｋ３３Ｎの細胞接着阻害効果がＹ９Ａ２と同様な挙動を示したので、ヒトα９インテグリン発現細胞（ｈα９／ＣＨＯ）に対する両抗体の競合反応をＦＡＣＳで検出することにより、認識部位の差異を調べた。
【００７７】
ビオチン標識したＫ３３ＮまたはＹ９Ａ２（５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）にその１００倍量のＫ３３Ｎ、Ｙ９Ａ２、陰性対象ＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加えた後、ヒトα９インテグリン細胞（ｈα９／ＣＨＯ、１×１０7／ｍＬ、１００μＬ）と反応（４℃、３０分）させ、ＦＡＣＳバッファー（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。ストレプトアビジン標識ＡＰＣ（０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を細胞溶液に加え、（４℃、２０分）で反応させ、再度ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した後、７−ＡＡＤ（０．０５ｍｇ／ｍＬ、２０μＬ）を用いて死細胞の染色を行った。その後、再度ＦＡＣＳバッファーで洗浄して、細胞をＦＡＣＳで測定した。
【００７８】
図４に示すように、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｙ９Ａ２を競合反応させると蛍光物質が結合した細胞が明らかにバックグランド近辺まで減少しているが、ビオチン標識Ｙ９Ａ２と無標識Ｋ３３Ｎの共存下では蛍光物質が結合した細胞の減少はみられるものの、バックグランド近辺まで減少しなかった。一方、ヒトα９インテグリン発現細胞に対してビオチン標識Ｋ３３Ｎに無標識Ｋ３３Ｎを添加すると競合し、蛍光物質が結合した細胞が明らかに減少したが、無標識Ｙ９Ａ２を添加しても蛍光物質が結合した細胞が無標識Ｋ３３Ｎ添加までは減少しなかった。したがって、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎが同じエピトープを認識する場合には競合を示すが、完全な競合を呈しなかったことから、Ｙ９Ａ２とＫ３３Ｎは異なるエピトープを認識しており、同一の抗体でないと示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の抗α９インテグリン抗体は、優れたα９インテグリン機能抑制作用を示し、癌（例えば、癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病等））、感染症（例えば、肝炎）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば、骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体および抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の重鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。
【図１Ｂ】抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａ）の軽鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）を含む可変領域のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。Ｋ３３ＮおよびＭ３５Ａのそれぞれについて、２つの異なる配列解析ソフトウェアを使用した結果を示す。
【図２】抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とＯＰＮのα９インテグリン結合部位ペプチド（ＳＶＶＹＧＬＲ）で調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。
【図３】抗ヒトα９インテグリン抗体（本発明の２クローン（Ｋ３３Ｎ、Ｍ３５Ａ）、その他の５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）、およびＹ９Ａ２）の細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１）とテナイシンＣフラグメントのα９インテグリン結合部位ペプチドで調べた結果を示す図である。陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）を用いた。
【図４】ヒトα９インテグリン発現細胞に対する新規な抗ヒトα９インテグリン抗体（Ｋ３３Ｎ）とＹ９Ａ２との競合反応を調べた結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項６】
重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項７】
ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項９】
キメラ抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１１】
ヒト抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１２】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
【請求項１７】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
【請求項１８】
α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
配列番号１〜１２のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７、９、および１１のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、１０、または１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０、および１２のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項６】
重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるアミノ酸配列として配列番号１〜６のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるアミノ酸配列として配列番号７〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項７】
ヒトα９インテグリンと、α９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項９】
キメラ抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１０】
ヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１１】
ヒト抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１２】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体および抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
【請求項１７】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３０またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３１で標示されるハイブリドーマ細胞。
【請求項１８】
α９インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１６７１１５（Ｐ２００９−１６７１１５Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４２９９（Ｐ２００８−４２９９）
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【出願人】（５０１４１６２４３）株式会社ジーンテクノサイエンス (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１１日（２００８．１．１１）
【出願人】（５０１４１６２４３）株式会社ジーンテクノサイエンス (9)
【Ｆターム（参考）】
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