抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法。
【課題】抗ｐ２００類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗ｐ２００抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供する
【解決手段】ヒトから採取した血液検体を、ラミニンガンマ１又はその断片と反応させた後、検体のラミニンガンマ１に対する自己抗体である抗ラミニンガンマ１抗体がラミニンガンマ１に結合したか否かを測定して検体中の抗ラミニンガンマ１抗体を検出することにより、抗ｐ２００類天疱瘡を診断することが出来る。
【解決手段】ヒトから採取した血液検体を、ラミニンガンマ１又はその断片と反応させた後、検体のラミニンガンマ１に対する自己抗体である抗ラミニンガンマ１抗体がラミニンガンマ１に結合したか否かを測定して検体中の抗ラミニンガンマ１抗体を検出することにより、抗ｐ２００類天疱瘡を診断することが出来る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法。に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は光線や微生物、細菌などの外部からの刺激や、打撲、圧迫、酸・アルカリなどの化学物質による傷害を防ぐ役割（対外保護作用）を担っている。自己免疫性水疱性皮膚疾患は、皮膚を構成する細胞間接着分子に対する自己抗体が産生され、これにより細胞間の接着が失われることによって皮膚の体外保護作用が失われ、時として死に至る重篤な疾患である。
【０００３】
自己免疫性水疱性疾患は、抗表皮細胞膜抗体による天疱瘡群と抗表皮基底膜部抗体による類天疱瘡群に大別され、前者では表皮細胞間接着の障害を、後者では表皮真皮間接着の障害を生じる。
【０００４】
自己免疫疾患は、患者の体液中に自己抗原に対する抗体が見出されることを特徴とするが、自己免疫疾患の中でも、全身性エリテマトーデスやシェーグレン症候群などの膠原病では、自己抗体の産生が疾患の原因であるのか結果であるのかは明らかでない。しかし、天疱瘡や水疱性類天疱瘡など多くの自己免疫性水疱性皮膚疾患では、患者血清中に存在する自己抗体が疾患の原因であることが明らかにされており、従って自己抗体の検出が疾患の診断に必須で有り、その対応抗原の同定が治療法の開発に繋がると考えられている。
【０００５】
現在、いくつかの自己免疫性水疱性疾患において対応抗原が明らかになっている。例えば、落葉上天疱瘡や尋常性天疱瘡では表皮細胞間接着因子であるデスモグレイン１やデスモグレイン３が病因抗体の対応抗原であり、水疱性類天疱瘡では表皮基底膜間接着因子であるＢＰ１８０が対応抗原であることが明らかにされている。また、これらの情報から、リコンビナントタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法がその診断の用に供されている（特許文献１、および非特許文献１、２参照）。
【０００６】
しかし、自己免疫性水疱性皮膚疾患には未だその自己抗原が明らかでない疾患が存在し、抗ｐ２００類天疱瘡もその一つである。抗ｐ２００類天疱瘡は、１９９６年に本願の一部の発明者らによって発見された疾患であり、緊満性水疱が多発し、約半数に乾癬を合併する。免疫ブロット法では、患者血清が皮膚抽出物中の２００ｋＤａの分子と反応するため、抗ｐ２００類天疱瘡と呼ばれる（非特許文献３参照）。
【０００７】
抗ｐ２００類天疱瘡は、その症例の希少さと、タンパク発現量の少なさから、その分子の同定が困難であった。しかし、本願の発明者らは、自己抗原であるｐ２００を同定するため鋭意努力し、ヒト正常皮膚抽出物を用いて二次元電気泳動を行い、免疫ブロット法により、患者血清によって特異的に染色される分画を得た。そこで、質量分析機を用いてこの分画の分析を行い、データベース上に登録された情報からこの分画が細胞外マトリックスの構成成分ラミニン１のサブユニットであるラミニンガンマ１であることを明らかにし、２００９年に発表した（非特許文献４参照）。
【０００８】
さらに本願発明者らは、リコンビナントラミニンガンマ１を抗原とし、患者血清を用いた免疫ブロット法により、抗ｐ２００類天疱瘡の患者の９０％がラミニンガンマ１に反応すること、一方健常者及び他の自己免疫性水疱性疾患の患者血清はラミニンガンマ１に反応しないことから、ラミニンガンマ１に対する免疫学的測定法が抗ｐ２００類天疱瘡の診断に有用であることを証明した（非特許文献４参照）。
【０００９】
ラミニンは、基底膜内に最も豊富に存在する糖タンパク質で、ニドゲン、ＩＶ型コラーゲンなどの基底膜のその他の成分と複合体を形成している。また、ラミニンは、３本のポリペプチドがｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを介して十字架様に会合した構造をとり、多くのアイソフォームの存在が確認されている。即ち、ラミニンは、それを構成する３つのポリペプチドであるα鎖（４００ｋＤａ以下）、β鎖（２００ｋＤａ以下）及びγ鎖（２００ｋＤａ以下）の組み合わせによって様々なアイソフォームを形成することが可能であり、α鎖には５種類、β鎖とγ鎖には３種類ずつの異なるタイプがあることから、現在までに少なくとも１２個のアイソフォームの存在が報告されている（非特許文献５および６参照）。
【００１０】
たとえば、ラミニン−1（α１、β１、γ１）は、腎臓、胎児脳、網膜、血管等に存在し、メロシン（＝ラミニン−２；α２、β１、γ１）は、骨格筋、心臓、胎盤に存在し、ｓ−ラミニン（＝ラミニン−３；α１、β２、γ１）は、神経筋末端プレートの接合部の基底膜、血管内皮及び子宮体基底膜に存在し、ｓ−メロシン（＝ラミニン−４；α２、β２、γ１）は、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、胎盤などに存在し、カリニン／ナイセイン（＝ラミニン−５；α３、β３、γ２）とｋ−ラミニン（＝ラミニン−６；α３、β１、γ１）とｋｓ−ラミニン（＝ラミニン−７；α３、β２、γ１）は、皮膚の基底膜に特有なものであることが明らかとなっている。ラミニンガンマ１はラミニンを構成するγ鎖のひとつである。
【００１１】
（従来の診断方法）
従来、抗ｐ２００類天疱瘡の診断は、蛍光抗体直接法で患者の表皮基底膜部にＩｇＧ、Ｃ３の沈着を認め１Ｍ食塩水で剥離した表皮を用いた間接法により真皮側に反応することの確認、及び、上記のように免疫ブロット法により患者血清が２００ｋＤａの蛋白質との反応を確認することによって行われていた。しかし、１Ｍ食塩水による剥離表皮切片や表皮抽出物の入手が、一般の病院では困難なこと、間接蛍光抗体法は定性的であり判定に熟練を要することなどから、ルーチンの検査として実施することは困難であった。
【００１２】
このような状況からＧｒｏｔｈらは、２０１１年に大腸菌で発現させたラミニンガンマ１を抗原とするＥＬＩＳＡ法を報告した（非特許文献７参照）。しかし、その陽性率は６９％と、診断として用いるには不十分なものであった。また、尿中に存在する２００ｋＤａのラミニン分画に対する抗体の測定が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断に利用できる可能性が報告（特許文献２参照）されているが、抗ｐ２００類天疱瘡については言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平８−１８８５４０号公報
【特許文献２】特開平８−０３６９６６号公報
【非特許文献１】岸本和裕ら、日皮会誌：１１２（６）、７９３−８０１（２００２）
【非特許文献２】岸本和裕ら、日皮会誌：１１３（１１）、１６９５−１７１０（２００３）
【非特許文献３】Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０６：１３３３−１３３８
【非特許文献４】Ｄａｉｎｉｃｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．（２００９） Ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ−１ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：２８００−２８０５
【非特許文献５】Ｍｉｎｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ α Ｃｈａｉｎｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ α１−５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｌａｍｉｎｉｎｓ８−１１， ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ α３ Ｉｓｏｆｏｒｍ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３７：６８５−７０１
【非特許文献６】Ｈｏｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｍｉｎｉｎ γ３Ｃｈａｉｎ：Ａ ｎｏｖｅｌ， Ｎｏｎ−Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ， Ｌａｍｉｎｉｎ Ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４５：６０５−６１７
【非特許文献７】Ｇｒｏｔｈ Ｓ ｅｔ ａｌ（２０１１） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｐ２００ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １６４：７６−８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述の技術では、抗ｐ２００類天疱瘡は、多くの場合水疱性類天疱瘡と区別されていなかったと考えられる。水疱性類天疱瘡の診断には現在、抗ＢＰ１８０抗体測定用ＥＬＩＳＡ及び抗ＢＰ２３０抗体測定用ＥＬＩＳＡが開発され使われているが、抗ｐ２００類天疱瘡はこれらの試薬で診断することはできない。
【００１５】
そこで、本発明の目的は、抗ｐ２００類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗ｐ２００抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法は、次の工程を有する。
（１）検体をラミニンガンマ１又はその断片と接触させる工程、
（２）ラミニンガンマ１又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【００１７】
ここで、ラミニンガンマ１の断片が、ラミニンガンマ１のＣ末の２４６アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するペプチドを含むペプチドであることとすることができる。
【００１８】
また、ラミニンガンマ１またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ１またはその断片であることとすることができる。
【００１９】
また、検体が、血液、血漿又は血清であることとすることができる。
【００２０】
また、上記目的を達成するため、本発明のキット（抗ｐ２００抗体の測定試薬）は、構成試薬がラミニンガンマ１又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の抗体量を測定する方法に用いられる。
【００２１】
ここで、ラミニンガンマ１又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ１又はその断片であることとすることができる。
【００２２】
また、上記目的を達成するため、本発明の皮膚科疾患を検出する方法は、上述のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する。
【００２３】
ここで、皮膚科疾患が、抗ｐ２００類天疱瘡であることとすることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明では、抗ｐ２００類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗ｐ２００抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】真皮抽出物を用いた二次元電気泳動の結果を示す図である。ここで、（Ａ）は、真皮抽出物のプロテオームパターンであり、７．５％ＳＤＳゲル上で、クマーシーブリリアントブルーで染色したものである。また、（Ｂ）は、患者血清を用いた免疫ブロットであり、分子量約２５０ｋＤａ、等電点５．０の特定のバンドが染色されたことを示している。また、（Ｃ）は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を用いた免疫ブロットであり、（Ｂ）におけるバンドと同じバンドが染色されたことを示している。また、（Ｄ）は、ゲル上の特定の蛋白質バンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルである（ｍ／ｚ値は７００から３，０００）。また、（Ｅ）は、ラミニンガンマ１に該当する特定のトリプシン分解ペプチドのピークを標識するｍ／ｚ値であり、太字かつ下線付き文字で示したものは、データベースサーチでラミニンガンマ１と一致したトリプシン分解ペプチドであり、これらの配列は、全体の２８％をカバーしている。
【図２】真皮抽出物の免疫沈降物を免疫ブロット分析した図である。ここで、（Ａ）は、真皮抽出物を、健常者血清無し（レーン１）、健常者血清有り(レーン２)、抗ｐ２００類天疱瘡患者血清(１：２０希釈、レーン３)、で免疫沈降したもの、各上清を、コントロール血清（レーン４）、あるいは患者血清（レーン５）で同様に実施したものを示している。また、マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を用いた免疫ブロットでは、レーン３及びレーン４において未処理の真皮抽出物から得たラミニンガンマ１(レーン６)と同じバンドを検出した。また、（Ｂ）は、真皮抽出物は２０μｇ／ｍｌのマウスコントロールＩｇＧ(レーン１)、モノクローナル抗体Ｂ−４（５μｇ／ｍｌ、レーン２及び２０μｇ／ｍｌ、レーン３）及び患者血清(１：２０希釈、レーン４)と免疫沈降し、患者血清で免疫ブロットを行った図である。各上清も同様に検討した（レーン５−８）。患者血清は抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体による免疫沈降物と投与量依存的に反応した（レーン２，３及びレーン６，７）。
【図３】２０人の抗ｐ２００類天疱瘡患者（二重線）抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４(矢印)及び健常者９名の血清（単線）を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。（Ａ）は、すべての患者血清は真皮抽出物中の２００ｋＤａの蛋白質と反応したのに対し、健常者コントロール血清はいずれも反応しなかった事を示しており、それぞれのバンドは抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体のバンドと一致した。（Ｂ）は、ほとんどの患者血清が、ＪＡＲヒト絨毛癌細胞株から精製したラミニン１１１と反応したことを示し、（Ｃ）は、ほとんどの患者血清が、ヒト胎盤から精製したラミニン２１１／２２１と反応したことを示し、（Ｄ）は、ほとんどの患者血清が、ラミニン１１１のリコンビナント産物のラミニンガンマ１と反応したことを示している。なお、健常者コントロール血清は、ラミニンガンマ１と反応しなかった。短い矢印は、ｐ２００のバンドを示し、矢頭はラミニンガンマ１を示す（６％ＳＤＳ）。
【図４】抗ｐ２００類天疱瘡患者血清のラミニンガンマ１Ｃ末部分に対する反応性を示す図である。（Ａ）は、真皮抽出物を用いた免疫ブロット法（７．５％ＳＤＳ）において、患者血清のｐ２００（黒矢印）に対する反応性は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を加えたときに（Ｂ−４、２及び１０μｇ／ｍｌ）、この蛋白質のＣ末を認識して投与量依存的に減少したことを示している。また、（Ａ）は、正常ヒトＩｇＧ、抗ラミニンガンマ１Ｎ末モノクローナル抗体（Ｃ１３Ｓ）あるいは抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体（３Ｃ４、腹水）は、真皮抽出物から得たｐ２００と患者血清の結合を阻害しなかったことを示している。なお、各示された量のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）、腹水、血清（μｌ）の有り、無しを、反応中セルロース膜に添加した。（Ｂ）は、抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た血清又は精製ＩｇＧは抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４の真皮から抽出したラミニンガンマ１抽出物への結合を減少させた（白矢印）が、健常者からの血清又はＩｇＧは減少させなかったことを示している。
【図５】ラミニン１１１のＥ８分画を用いた免疫ブロットである（１２％ＳＤＳ）。（Ａ）は、ラミニン１１１のリコンビナントＣ末Ｅ８分画の構造計画を示している。（Ｂ）の上段は、図２の患者１８（左の１８番目のレーン）を除くすべてのラミニンガンマ１陽性血清は、還元状態において、免疫ブロットでＥ８分画に陽性の反応を示したことを示している。（Ｂ）の下段は、図２の患者１６と１８（左の１６番目及び１８番目のレーン）を除くすべてのラミニンガンマ１陽性血清は、非還元状態で、ラミニンガンマ１のＥ８分画に陽性反応を示したことを示している。二重線は、抗ｐ２００類天疱瘡の２０名の患者の血清を示している。矢印は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を示す。１本線は、９人の健常人コントロール血清を示す。矢頭は、Ｅ８のバンドを示す。ＮＳは、非特異バンドを示す。
【図６】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、１Ｍ食塩水剥離皮膚を用いた間接蛍光抗体法の結果を示す図である。（Ａ）は、抗ｐ２００類天疱瘡の患者から得た精製ＩｇＧは、剥離皮膚の真皮側に反応したことを示しており、症例＃２００の患者から得たＩｇＧは真皮上層で血管に反応しなかった。一方（Ｂ）は、症例＃１２から得たＩｇＧは反応したことを示している。（Ｃ）は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３Ｓは、基底膜領域の真皮側及び真皮の血管壁の両方に反応したことを示している。（Ｄ）は、真皮及び血管壁の抽出物を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。なお、添加した抽出物の量は抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（一番下）との反応性で調節した。還元状態では＃２０の症例の患者の精製ＩｇＧ（図６Ａでも使用）の上皮ラミニンガンマ1に対する反応性は、血管のラミニンガンマ1に対する反応性よりもずっと高かった（上段）。＃１２の患者の精製ＩｇＧ（図６Ｂでも使用）は、真皮抽出物のラミニンガンマ１と血管抽出物のラミニンガンマ１に同じような反応性を示した（中段）レーン1；ＪＡＲ細胞株から得た精製ラミニン１１１レーン２；真皮抽出物レーン３；血管抽出物（７．５％ＳＤＳ、還元状態）
【図７】患者２０名の血清を用いた免疫ブロットの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者らの研究により、抗ｐ２００類天疱瘡の患者血清中に見出される自己抗体が認識するｐ２００タンパク質は、ラミニンの構成成分であるラミニンガンマ１であり、そのエピトープのラミニンガンマ１のＣ末にあることを明らかにした。さらに、本発明者らは、患者血清中の抗ラミニンガンマ１抗体の反応性を検討したところ、皮膚のラミニンガンマ１に対して強く反応し、血管のラミニンガンマ１に対しては一部の患者血清しか反応しないことを見出した。
【００２７】
本発明は、上記のような知見に基づいてなされたものであり、従来の抗ラミニンガンマ１抗体の測定法に比べてより高い臨床的感度と特異性を持った、自動機にも対応可能な抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法である。以下、本発明の実施の形態にについて、図面を参照しながら説明する。
【００２８】
本発明の実施の形態はラミニンガンマ１に対する抗体を検出する方法及び試薬に関する。抗ラミニンガンマ１抗体は抗ｐ２００類天疱瘡患者の血清中に見出され、抗ラミニンガンマ１抗体の検出は抗ｐ２００類天疱瘡の診断に有用である。本発明の実施の形態の抗ラミニンガンマ１抗体の検出に用いられる抗原は、ヒトのラミニンガンマ１のＣ末部分、２４６アミノ酸以外の分画を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明の実施の形態に係る抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法は以下の測定方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
（１）検体をラミニンガンマ１のＣ末以外のペプチドを含む断片を固相化した不溶性担体に接触させる工程
（２）ラミニンガンマ１のＣ末以外の断片を含むペプチド断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【００３０】
本発明の実施の形態には上記ラミニンガンマ１のＣ末以外のペプチド断片のアミノ酸配列を含むペプチド又は、そのアミノ酸に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加されたラミニンガンマ１Ｃ末以外の断片を用いる測定方法が含まれる。
【００３１】
ラミニンガンマ１は、正常皮膚組織から抽出して用いることもできるが、リコンビナントタンパク質として作製することが出来る。特に、特定の分画を抗原として使用する場合、リコンビナントタンパク質として作製することが好ましい。
【００３２】
一般的に、蛋白質の機能発現には特異的な修飾が必要とされることが多いことから、目的蛋白質を発現させるための宿主細胞は、導入される蛋白質遺伝子に応じて適宜選択できることが好ましい。
【００３３】
使用できる宿主細胞としては、大腸菌のほか、真核細胞としてはバキュロウイルス感染細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞である。
【００３４】
抗ラミニンガンマ１抗体の量を測定するには、不溶性担体である固相にラミニンガンマ１又はその断片を結合させ、これに検体中の抗ラミニンガンマ１抗体を接触させて、ラミニンガンマ１若しくはその断片と抗ラミニンガンマ１抗体の複合体を形成し、洗浄によって検体中の他の成分を除いた後、標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させて、ラミニンガンマ１（又はその断片）−抗ラミニンガンマ１抗体−標識化抗ヒト免疫グロブリンの複合体を形成させ、その標識物の反応量を測定することによる。
【００３５】
ラミニンガンマ１又はその断片を結合させる不溶性担体としては、アガロース系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系等の有機高分子、コラーゲン、キトサン等の生体由来の天然有機高分子あるいは活性炭素、セラミック等の無機物が挙げられる。その形態としては、平板状、粒子状等様々な形態が使用しうるが、表面積を大きくとれるものが好ましい。ラミニンガンマ１分子の固相への結合は、物理吸着によっても可能であるが、共有結合によって結合することもできる。例えば、担体がその表面に有するエポキシ基やアルデヒド基等の反応性官能基に水性溶液中で直接結合することによって実施される。また、アミノ基等の官能基を表面に有する担体を用いる場合は、ラミニンガンマ１蛋白質と担体との混合水性溶液にジアルデヒドやジエポキシ化合物等の反応性多官能基を有する化合物を添加し、反応させることによっても実施することができる。
【００３６】
検出方法としては、ＥＬＩＳＡ法が好適に用いられるが、抗原としてラミニンガンマ１またはその一部を使用するものであれば、他の方法も同様に使用することができる。他の方法としては蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラテックス比濁法等が挙げられる。
【００３７】
標識化した抗ヒト免疫グロブリンとしては、ウサギ、ヤギその他の動物にヒトの免疫グロブリン（ＩｇＧ，好ましくはＩｇＧ４）を免疫して得た抗ヒトＩｇＧあるいはその断片を用いることができる。標識物としては、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン等の各種酵素やアイソトープを標識して使用することができる。酵素を標識した場合には、適宜適切な基質を選択することにより、その発色、発光、蛍光を測定することによって、検体中の目的物を定量することができる。
【００３８】
検体としては、ヒトの血液、血漿、血清が使用でき、日常検査としては血清が最も好適に使用できるが、尿その他の体液の使用を制限するものではない。
【００３９】
本発明の実施の形態に係る測定方法によれば、患者血清中の抗ラミニンガンマ１抗体を高い感度で測定でき、自動化機器によって測定することも可能なため、日常検査として実施が可能となる他、標準血清を用いて定量的に測定することにより、結果が客観的な数値として捉えることができるため、測定者による判定の差をなくすことができる。また、患者血清中の抗体量の変化を捉えることができるため、治療効果の判定や疾患の憎悪期において治療のタイミングをより早く知ることができる。
【実施例】
【００４０】
（１）患者検体の入手；本検討は、久留米大学医学部の倫理委員会のガイドラインに従って実施され、臨床試験への参加者はインフォームドコンセントを提出し、ヘルシンキ宣言に沿って行われた。３２人の患者（男性１０人、女性６名、１６名は性別不明、１７歳〜８７歳）は、その臨床経過と水疱形成の兆候、１Ｍ食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた間接蛍光抗体法は基底膜領域の真皮側にＩｇＧの反応性を示し、真皮抽出物を用いたウエスターンブロットは２００ｋＤａのバンドを示したことから、抗ｐ２００類天疱瘡と診断された。９名の健常ボランティア及び水疱性類天疱瘡、抗ラミニン３３２粘膜類天疱瘡及び後天性表皮水疱症の血清は、コントロールとして用いた。
【００４１】
（２）抗体の調製
マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４は、サンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３５は、研究室において作製した（（Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１，ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１８９−１９７、Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｍｉｎｉｎ−８． Ｌａｍｉｎｉｎ−８ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１ ａｎｄ ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７５５０−１７５５８）。マウス抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体３Ｃ４及びマウスのコントロールＩｇＧは、それぞれケミコン、ミリポア及びサンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。第二抗体であるＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ(ウサギ)及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ(ウサギ)は、ダコから購入した。患者及び健常者コントロールからのＩｇＧは、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（アマシャム）を用いて精製した。
【００４２】
（３）真皮及び血管抽出物の調製
免疫ブロット分析に用いる真皮抽出物は、既報の方法に従って調製した（Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｒｍａｌ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：９３−１０２）。血管抽出物は、同様の方法に若干の変更を加えて調製した。外膜を除いた腸間膜動脈は、２ｍＭ ＥＤＴＡと２ｍＭ ＰＭＳＦを加えたＰＢＳ中で４℃２時間インキュベートした。血管の蛋白質は、８Ｍ Ｕｒｅａ、０．３Ｍ β−メルカプトエタノール１ｍＭ ＰＭＳＦを加えた２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）で室温2時間抽出した。血管抽出物は、４℃で２時間精製水に透析し、等量のアセトンで沈殿させた。
【００４３】
（４）ラミニンの調製
ヒトのラミニン１１１は、ＪＡＲ絨毛癌細胞株から、ラミニン２１１／２２１は、ヒト胎盤から精製した（Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１，ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１８９−１９７）。リコンビナントラミニン１１１は、ヒトα１／β１／γ１チェーンをコードする発現ベクターで形質転換したヒト２９３Ｆ細胞（インビトロジェン）で産生した。α１、β１、γ１のＣ末部分を切断したヘテロトリマーであるラミニン１１１のリコンビナントＥ８分画は、以下のように調製した。
【００４４】
ヒトラミニンβ１及びγ１のリコンビナントＥ８分画の発現ベクター（それぞれＬｅｕ１５６１−Ｌｅｕ１７８６及びＡｓｎ１３６４−Ｐｒｏ１６０９をコードする）は、既報の通り調製した（ＩＤＯ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｈｔｅ ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１１１４４−１１１５４）。ラミニンα１チェーンの切断されたＣ末部分（Ｐｈｅ１８７８−Ｇｌｎ２７００）をコードするｃＤＮＡは、全長ヒトラミニンα１発現ベクターをテンプレートとして用いてＰＣＲで増幅し（Ｉｄｏ Ｈ， Ｈａｒａｄａ Ｋ， Ｙａｇｉ Ｙ， Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ（２００６） Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍｅｉｎ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−５１１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ４Ｃ７． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１１２−１１７）、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン）に挿入した。ラミニン１１１のリコンビナントＥ８分画は、Ｆｒｅｅ−ＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システム（インビトロジェン）を用いて産生し、既報の通り（ＩＤＯ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｈｔｅ ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１１１４４−１１１５４）調製培地から精製した。即ち、調製培地は、ニッケルニトリロ三酢酸アフィニティーカラム（キアゲン）に添加し、結合した蛋白質は、２００ｍＭのイミダゾールで溶出した。溶出した蛋白質は、更に抗ＦＬＡＧカラム（シグマ・アルドリッチ）で精製した。精製した蛋白質は、ＴＢＳに透析した。蛋白濃度は、ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ピアースバイオテクノロジー）で定量した。
【００４５】
（５）免疫ブロット法による分析
ＳＤＳ／ＰＡＧＥは、既報の通り実施した（Ｓｕｇｉ Ｔ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ， Ｈｉｂｉ Ｔ， Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ（１９８９） Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ（ＢＭＺ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ（ＢＰ） ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｕｏｎ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ＢＭＺ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＢＰ ｓｅｒａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｍ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１０５０−１０５５）。真皮及び血管の抽出物、ヒトラミニン、及びヒトラミニンＥ８分画は、Ｌａｅｍｍｌｉ‘ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５％βメルカプトエタノール有り／無し）で煮沸し、６％、７．５％、又は１２％のＳＤＳゲルで分画した。次いで蛋白質は、ニトロセルロースに電気化学的に転写した。３％スキムミルクでブロックした後、ブロットは、１：５〜１：８００に希釈した患者血清、１０μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍｌ、若しくは１：２００に希釈した抗ヒトラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（マウス）でインキュベートした。二次抗体としては、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ又は抗マウスＩｇ抗血清を用いた。発色は、４−クロロ−１−ナフトールを用いた。
【００４６】
真皮抽出物の免疫沈降は、以下のように行った。凍結乾燥した真皮抽出物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉａｔｕｒｅ（シグマ・アルドリッチ）を含む免疫沈降用バッファーに溶解した。この溶液をＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）と正常コントロールあるいは患者血清（１：２０）の有り、無しでインキュベートし、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（５又は２０μｇ／ｍｌ）あるいはマウスコントロールＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）で４℃一晩インキュベートした。十分洗浄した後、集められた沈降物は、５％βメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ‘ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒで煮沸した。上清は、既報の通り免疫ブロット分析で評価した。
【００４７】
阻害アッセイでは、患者＃１２の血清（１：８００）を競合物、即ち正常ヒトＩｇＧ、Ｂ−４、Ｃ１３Ｓ（２又は１０μｇ／ｍｌ）若しくは３Ｃ４（１：１００又は１：２０希釈）と、転写した真皮抽出物の載ったニトロセルロースストリップ上でインキュベートし、上述の通り抗ヒトＩｇＧ抗血清で発色した。他のストリップ上では、Ｂ−４（１μｇ／ｍｌ）を競合物、即ち血清（１：１００又は１：２０希釈）若しくはＩｇＧ（０．２又は１ｍｇ／ｍｌ）４℃一晩インキュベートし、抗マウスＩｇ抗血清で発色した。
【００４８】
（６）二次元電気泳動による分析
凍結乾燥した真皮抽出物を７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４０ｍＭトリス、１％Ｃ７デタージェント及び適量のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＥ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｔａｂｌｅｔｓ（ロッシュ アプライド サイセンス）を含む溶解バッファーに溶かした。還元及びアルカリ化のため最終濃度５ｍＭトリブチルフォスファイン及び最終濃度１０ｍＭのアクリルアミドを添加した。室温で９０分インキュベートした後、１０ｍＭ（最終濃度）のＤＴＴを添加し、反応を停止するため室温で１０分間インキュベートした。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １００Ｋ（アミコン）で遠心ろ過した後、濃縮液は、７Ｍ Ｕｒｅａ、２Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ、１％Ｃ７からなる等電点用バッファーと混合した。等電点電気泳動のためにＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＴＭ ＩＰＴＧ Ｓｔｒｉｐ
（ｐＨ４−７、１１ｃｍ ｌｏｎｇ、３．３ｍｍ ｗｉｄｅ厚さ０．５ｍｍ バイオラッドラボラトリーズ)を適当量のＢｉｏ−Ｌｙｔｅ３−８バッファー（バイオラッドラボラトリーズ）及びＯｒａｎｇｅ Ｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むサンプル溶液で一晩水に戻した。
【００４９】
等電点電気泳動終了の後、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ(バイオラッドラボラトリーズ)を含むＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＭ Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌｓ Ｊ（４％ Ｔ ｓｔｒａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ、７．５％ Ｔ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｊｅｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｔｙｐｅ、１３．３ｃｍ ｗｉｄｅ、８．７ｃｍ ｈｉｇｈ、 ａｎｄ １．０ｍｍ ｔｈｉｃｋバイオラッドラボラトリーズ)を用いてＳＤＳ／ＰＡＧＥを実施した。得られた二次元ゲルは、クマーシー・ブリリアントブルーで染色するか又は免疫ブロットに用いられた。
【００５０】
（７）ゲル内消化
蛋白質のスポットは、切り取って５０％セトニトリル／１００ｍＭ炭酸アンモニウムｐＨ８．０で脱色した。切り出したゲルをドライヤーで１５分間乾燥した後、トリプシンプロテオミクスグレードソリューション（９％アセトリトリル中、０．１ｍＭ ＨＣｌ／３６ｍＭ炭酸アンモニウム０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、２．５ｍＭ炭酸アンモニウムを含む９％アセトニトリルで３７℃、一晩インキュベートした。インキュベートした液は、集めて乾燥した。
【００５１】
（８）質量分析
乾燥させたトリプシン分解ペプチドは、２−５μｌの０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリルに溶解し、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）溶液と混合し、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ（島津製作所）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。トリプシン分解ペプチドのモノアイソトピックｍ／Ｚ値のピークは、蛋白質データベースサーチと蛋白質の同定のためにＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ（マトリックスサイエンス）のＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔで分析した。
【００５２】
（９）１Ｍ食塩水剥離皮膚の免疫蛍光法
正常ヒト皮膚を４８時間４℃で１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１Ｍ食塩水に浸した。皮膚サンプルは、液体窒素ですばやく凍結し、クリオスタットで薄切して患者血清（１：１０希釈）、精製した患者ＩｇＧ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）及びマウス抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体を一次抗体として反応させ、次いでＦＩＴＣ標識したウサギ抗ヒトＩｇＧ又は、抗マウスＩｇポリクローナル抗体を二次抗体として染色した。
【００５３】
（１０）二次元電気泳動の分析結果
真皮抽出物は、ｐＩ７と４の間の等電点電気泳動と、７．５％ＳＤＳゲル電気泳動の二次元電気泳動で分離した。抽出物は、２枚のゲルで実施し、１枚はクマーシーブルーで染め（図１Ａ）、もう1枚はニトロセルロース膜に転写して抗ｐ２００天疱瘡患者の血清で免疫ブロットを行った（図１Ｂ）。血清は、ｐＩ５．０付近、１２０−１２５ｋＤａの範囲で複数のバンドを検出し、最も反応性の強かったバンドは、２５０ｋＤａに存在した。クマーシーで染色したゲルの同じバンドが、質量分析器で分析された（図１Ｄ）。データベースの検索の結果、このバンドは名目上の分子量１８４，５９５、計算上の等電点５．０１、配列の２８％をカバーするラミニンガンマ１であることが分かった（図１Ｅ）。
【００５４】
特定のバンドとの同一性を確認するため、二次元電気泳動で分離した真皮抽出物を転写した膜上で抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを実施した。患者血清とモノクローナル抗体は、同じバンドに反応した（図１Ｃ）。更に3人の患者の血清も同じバンドを染色した。
【００５５】
抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体は、免疫沈降法で抗ｐ２００類天疱瘡患者血清と真皮抽出物の形成した沈降物に反応したが、健常者血清の沈降物とは反応しなかった（図２Ａ）。真皮抽出物と患者血清の免疫沈降上清は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを行い、如何なるバンドも検出できなかった。このことは、すべてのラミニンガンマ１は、患者血清によって吸収されたことを示唆している。逆に、免疫ブロットにおいて、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体との免疫沈降物は、投与量依存的に患者血清と反応した（図２Ｂ）。抗ラミニンガンマ１免疫沈降の上清は、沈降に用いられた抗ラミニンガンマ１抗体の量に反比例して抗ｐ２００類天疱瘡血清と反応性を示した。抗ｐ２００類天疱瘡血清を用いた免疫ブロットの結果は、ラミニンのガンマ１チェーンがｐ２００のバンドの真皮構成物であることを示唆している。
【００５６】
（１１）ラミニンガンマ１と患者血清の反応性
患者血清とラミニンガンマ１の反応性が、抗ｐ２００類天疱瘡の患者に共通するかどうかを調べるため、２０人の患者の血清について、精製したラミニン１１１及びラミニン２１１／２２１（どちらもラミニンガンマ1チェーンを含む）に対する反応性を調査した。２０の血清すべてが、真皮抽出物を用いた免疫ブロットで２００ｋＤａの蛋白質に反応し、バンドの位置は抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体の位置と一致した（図３Ａ）。このことから、抗ｐ２００類天疱瘡の自己抗原がラミニンガンマ1であることを支持している。この可能性と一致するように、８０％及び８５％の患者血清が、それぞれ精製したラミニン１１１及びラミニン２１１／２２１のガンマ１チェーンと反応した（図３Ｂ，Ｃ及び表１）。合計３２の患者の血清が同程度の反応性を示した。これらの結果は、更にリコンビナントラミニン１１１を用いた免疫ブロットによって確認された。そこでは、９０％の患者血清がリコンビナントラミニンガンマ１に明確な反応性を示した（図３Ｄ及び表１）。重要なことは、健常者９名の血清は精製した／またはリコンビナントのラミニンガンマ1に対してまったく反応しなかったことである。他の水疱性疾患（例えば水疱性類天疱瘡、抗ラミニン３３２粘膜天疱瘡及び表皮水疱症のような）の患者血清はラミニンガンマ１に対する反応性を示さなかった。これらの結果は、若干の陰性例があるにもかかわらず、ラミニンガンマ１が抗ｐ２００類天疱瘡の唯一の自己抗原であることを示唆している。
【００５７】
（１２）ラミニンガンマ１上の原因エピトープ
免疫ブロットによって、患者血清の、上皮抽出物から得たｐ２００への反応性は、抗ラミニンガンマ１Ｃ末モノクローナル抗体の添加によって競合的に阻害された（レーンＢ−４）が、抗ラミニンガンマ１Ｎ末モノクローナル抗体（レーンＣ−１３Ｓ）あるいは抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体（レーン３Ｃ４）の添加によっては阻害されなかった（図４Ａ）。抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た血清と精製ＩｇＧは、上皮ラミニンガンマ１に対するモノクローナル抗体Ｂ−４の反応性を投与量依存的に阻害した。しかし、健常者血清又はＩｇＧは阻害しなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、間接的に上皮ｐ２００蛋白質上の患者血清に対する反応部位が、ラミニンガンマ１のＣ末にあることを示している。ラミニンガンマ１上の原因エピトープの位置をさらに限定するため、二重コイルドメインのＣ末の２５％を占め、３つのラミニンＧ様モジュールからなるラミニン１１１の切断部分であるヒトラミニン１１１のＥ８分画（即ちＬＧ１−３）をリコンビナントで作製した（図５Ａ）。このリコンビナント蛋白を用いた免疫ブロット分析により、ほとんどのラミニンガンマ１陽性血清は、還元／非還元状態においてラミニンガンマ１Ｅ８分画に反応することが分かった（図５Ｂ）。患者２０名の血清を用いた免疫ブロットの分析結果を図７に示す。これらの結果は、患者の自己抗体の標的である想定されるエピトープはラミニンガンマ１のＣ末２４６アミノ酸の中に存在することを示唆している。
【００５８】
（１３）自己抗体の臓器特異性
１Ｍ食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた蛍光抗体間接法により、抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た精製ＩｇＧは、剥離片の真皮側に反応した（図６Ａ、Ｂ）。特定の症例から得たＩｇＧも、真皮乳頭層毛細血管の血管壁と反応した（図６Ｂ）。しかし、他の患者のＩｇＧは、目に見えるほどの血管壁との反応性は示さなかった（図６Ａ）。このことは、以前に報告された結果と一致している（Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ．
Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ
１０６：１３３３−１３３８、Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｒｍａｌ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：９３−１０２）。対照的に、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３Ｓは、剥離皮膚の真皮側と血管壁の両方に反応した（図６Ｃ）。
【００５９】
還元状態及び非還元状態での免疫ブロット法での検討により、真皮及び血管の抽出物の添加量は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４の反応性により調節された（図６Ｄ下）。同じ免疫ブロットにより真皮ラミニンガンマ１に対する患者＃２０からの精製ＩｇＧの反応性は、血管ラミニンガンマ1に対する反応性よりはるかに高かった（図６Ｄ上）。この結果は、幾人かの患者の血清を用いて再現されている。しかし、患者＃１２から得た精製ＩｇＧ（間接蛍光抗体法により真皮及び血管の両方の基底膜領域に反応した）は、真皮及び血管から抽出したラミニンガンマ１に同等の反応性を示した（図６Ｄ中）。この症例を除き、これらの結果は、抗ｐ２００類天疱瘡患者の循環血ＩｇＧ抗体は真皮基底膜領域中のラミニンガンマ１に反応し、血管壁ラミニンに対してはずっと弱い反応性を示すことを示唆した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法。に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は光線や微生物、細菌などの外部からの刺激や、打撲、圧迫、酸・アルカリなどの化学物質による傷害を防ぐ役割（対外保護作用）を担っている。自己免疫性水疱性皮膚疾患は、皮膚を構成する細胞間接着分子に対する自己抗体が産生され、これにより細胞間の接着が失われることによって皮膚の体外保護作用が失われ、時として死に至る重篤な疾患である。
【０００３】
自己免疫性水疱性疾患は、抗表皮細胞膜抗体による天疱瘡群と抗表皮基底膜部抗体による類天疱瘡群に大別され、前者では表皮細胞間接着の障害を、後者では表皮真皮間接着の障害を生じる。
【０００４】
自己免疫疾患は、患者の体液中に自己抗原に対する抗体が見出されることを特徴とするが、自己免疫疾患の中でも、全身性エリテマトーデスやシェーグレン症候群などの膠原病では、自己抗体の産生が疾患の原因であるのか結果であるのかは明らかでない。しかし、天疱瘡や水疱性類天疱瘡など多くの自己免疫性水疱性皮膚疾患では、患者血清中に存在する自己抗体が疾患の原因であることが明らかにされており、従って自己抗体の検出が疾患の診断に必須で有り、その対応抗原の同定が治療法の開発に繋がると考えられている。
【０００５】
現在、いくつかの自己免疫性水疱性疾患において対応抗原が明らかになっている。例えば、落葉上天疱瘡や尋常性天疱瘡では表皮細胞間接着因子であるデスモグレイン１やデスモグレイン３が病因抗体の対応抗原であり、水疱性類天疱瘡では表皮基底膜間接着因子であるＢＰ１８０が対応抗原であることが明らかにされている。また、これらの情報から、リコンビナントタンパク質を用いたＥＬＩＳＡ法がその診断の用に供されている（特許文献１、および非特許文献１、２参照）。
【０００６】
しかし、自己免疫性水疱性皮膚疾患には未だその自己抗原が明らかでない疾患が存在し、抗ｐ２００類天疱瘡もその一つである。抗ｐ２００類天疱瘡は、１９９６年に本願の一部の発明者らによって発見された疾患であり、緊満性水疱が多発し、約半数に乾癬を合併する。免疫ブロット法では、患者血清が皮膚抽出物中の２００ｋＤａの分子と反応するため、抗ｐ２００類天疱瘡と呼ばれる（非特許文献３参照）。
【０００７】
抗ｐ２００類天疱瘡は、その症例の希少さと、タンパク発現量の少なさから、その分子の同定が困難であった。しかし、本願の発明者らは、自己抗原であるｐ２００を同定するため鋭意努力し、ヒト正常皮膚抽出物を用いて二次元電気泳動を行い、免疫ブロット法により、患者血清によって特異的に染色される分画を得た。そこで、質量分析機を用いてこの分画の分析を行い、データベース上に登録された情報からこの分画が細胞外マトリックスの構成成分ラミニン１のサブユニットであるラミニンガンマ１であることを明らかにし、２００９年に発表した（非特許文献４参照）。
【０００８】
さらに本願発明者らは、リコンビナントラミニンガンマ１を抗原とし、患者血清を用いた免疫ブロット法により、抗ｐ２００類天疱瘡の患者の９０％がラミニンガンマ１に反応すること、一方健常者及び他の自己免疫性水疱性疾患の患者血清はラミニンガンマ１に反応しないことから、ラミニンガンマ１に対する免疫学的測定法が抗ｐ２００類天疱瘡の診断に有用であることを証明した（非特許文献４参照）。
【０００９】
ラミニンは、基底膜内に最も豊富に存在する糖タンパク質で、ニドゲン、ＩＶ型コラーゲンなどの基底膜のその他の成分と複合体を形成している。また、ラミニンは、３本のポリペプチドがｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを介して十字架様に会合した構造をとり、多くのアイソフォームの存在が確認されている。即ち、ラミニンは、それを構成する３つのポリペプチドであるα鎖（４００ｋＤａ以下）、β鎖（２００ｋＤａ以下）及びγ鎖（２００ｋＤａ以下）の組み合わせによって様々なアイソフォームを形成することが可能であり、α鎖には５種類、β鎖とγ鎖には３種類ずつの異なるタイプがあることから、現在までに少なくとも１２個のアイソフォームの存在が報告されている（非特許文献５および６参照）。
【００１０】
たとえば、ラミニン−1（α１、β１、γ１）は、腎臓、胎児脳、網膜、血管等に存在し、メロシン（＝ラミニン−２；α２、β１、γ１）は、骨格筋、心臓、胎盤に存在し、ｓ−ラミニン（＝ラミニン−３；α１、β２、γ１）は、神経筋末端プレートの接合部の基底膜、血管内皮及び子宮体基底膜に存在し、ｓ−メロシン（＝ラミニン−４；α２、β２、γ１）は、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、胎盤などに存在し、カリニン／ナイセイン（＝ラミニン−５；α３、β３、γ２）とｋ−ラミニン（＝ラミニン−６；α３、β１、γ１）とｋｓ−ラミニン（＝ラミニン−７；α３、β２、γ１）は、皮膚の基底膜に特有なものであることが明らかとなっている。ラミニンガンマ１はラミニンを構成するγ鎖のひとつである。
【００１１】
（従来の診断方法）
従来、抗ｐ２００類天疱瘡の診断は、蛍光抗体直接法で患者の表皮基底膜部にＩｇＧ、Ｃ３の沈着を認め１Ｍ食塩水で剥離した表皮を用いた間接法により真皮側に反応することの確認、及び、上記のように免疫ブロット法により患者血清が２００ｋＤａの蛋白質との反応を確認することによって行われていた。しかし、１Ｍ食塩水による剥離表皮切片や表皮抽出物の入手が、一般の病院では困難なこと、間接蛍光抗体法は定性的であり判定に熟練を要することなどから、ルーチンの検査として実施することは困難であった。
【００１２】
このような状況からＧｒｏｔｈらは、２０１１年に大腸菌で発現させたラミニンガンマ１を抗原とするＥＬＩＳＡ法を報告した（非特許文献７参照）。しかし、その陽性率は６９％と、診断として用いるには不十分なものであった。また、尿中に存在する２００ｋＤａのラミニン分画に対する抗体の測定が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断に利用できる可能性が報告（特許文献２参照）されているが、抗ｐ２００類天疱瘡については言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平８−１８８５４０号公報
【特許文献２】特開平８−０３６９６６号公報
【非特許文献１】岸本和裕ら、日皮会誌：１１２（６）、７９３−８０１（２００２）
【非特許文献２】岸本和裕ら、日皮会誌：１１３（１１）、１６９５−１７１０（２００３）
【非特許文献３】Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０６：１３３３−１３３８
【非特許文献４】Ｄａｉｎｉｃｈｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．（２００９） Ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ−１ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：２８００−２８０５
【非特許文献５】Ｍｉｎｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｔｈｅ ｌａｍｉｎｉｎ α Ｃｈａｉｎｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ α１−５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ Ｌａｍｉｎｉｎｓ８−１１， ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ α３ Ｉｓｏｆｏｒｍ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３７：６８５−７０１
【非特許文献６】Ｈｏｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ（１９９９） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｍｉｎｉｎ γ３Ｃｈａｉｎ：Ａ ｎｏｖｅｌ， Ｎｏｎ−Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ， Ｌａｍｉｎｉｎ Ｃｈａｉｎ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４５：６０５−６１７
【非特許文献７】Ｇｒｏｔｈ Ｓ ｅｔ ａｌ（２０１１） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｐ２００ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ．Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １６４：７６−８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述の技術では、抗ｐ２００類天疱瘡は、多くの場合水疱性類天疱瘡と区別されていなかったと考えられる。水疱性類天疱瘡の診断には現在、抗ＢＰ１８０抗体測定用ＥＬＩＳＡ及び抗ＢＰ２３０抗体測定用ＥＬＩＳＡが開発され使われているが、抗ｐ２００類天疱瘡はこれらの試薬で診断することはできない。
【００１５】
そこで、本発明の目的は、抗ｐ２００類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗ｐ２００抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明の抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法は、次の工程を有する。
（１）検体をラミニンガンマ１又はその断片と接触させる工程、
（２）ラミニンガンマ１又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【００１７】
ここで、ラミニンガンマ１の断片が、ラミニンガンマ１のＣ末の２４６アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するペプチドを含むペプチドであることとすることができる。
【００１８】
また、ラミニンガンマ１またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ１またはその断片であることとすることができる。
【００１９】
また、検体が、血液、血漿又は血清であることとすることができる。
【００２０】
また、上記目的を達成するため、本発明のキット（抗ｐ２００抗体の測定試薬）は、構成試薬がラミニンガンマ１又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の抗体量を測定する方法に用いられる。
【００２１】
ここで、ラミニンガンマ１又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ１又はその断片であることとすることができる。
【００２２】
また、上記目的を達成するため、本発明の皮膚科疾患を検出する方法は、上述のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する。
【００２３】
ここで、皮膚科疾患が、抗ｐ２００類天疱瘡であることとすることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明では、抗ｐ２００類天疱瘡に特異的で高い臨床的感度を有する抗ｐ２００抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】真皮抽出物を用いた二次元電気泳動の結果を示す図である。ここで、（Ａ）は、真皮抽出物のプロテオームパターンであり、７．５％ＳＤＳゲル上で、クマーシーブリリアントブルーで染色したものである。また、（Ｂ）は、患者血清を用いた免疫ブロットであり、分子量約２５０ｋＤａ、等電点５．０の特定のバンドが染色されたことを示している。また、（Ｃ）は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を用いた免疫ブロットであり、（Ｂ）におけるバンドと同じバンドが染色されたことを示している。また、（Ｄ）は、ゲル上の特定の蛋白質バンドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのスペクトルである（ｍ／ｚ値は７００から３，０００）。また、（Ｅ）は、ラミニンガンマ１に該当する特定のトリプシン分解ペプチドのピークを標識するｍ／ｚ値であり、太字かつ下線付き文字で示したものは、データベースサーチでラミニンガンマ１と一致したトリプシン分解ペプチドであり、これらの配列は、全体の２８％をカバーしている。
【図２】真皮抽出物の免疫沈降物を免疫ブロット分析した図である。ここで、（Ａ）は、真皮抽出物を、健常者血清無し（レーン１）、健常者血清有り(レーン２)、抗ｐ２００類天疱瘡患者血清(１：２０希釈、レーン３)、で免疫沈降したもの、各上清を、コントロール血清（レーン４）、あるいは患者血清（レーン５）で同様に実施したものを示している。また、マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を用いた免疫ブロットでは、レーン３及びレーン４において未処理の真皮抽出物から得たラミニンガンマ１(レーン６)と同じバンドを検出した。また、（Ｂ）は、真皮抽出物は２０μｇ／ｍｌのマウスコントロールＩｇＧ(レーン１)、モノクローナル抗体Ｂ−４（５μｇ／ｍｌ、レーン２及び２０μｇ／ｍｌ、レーン３）及び患者血清(１：２０希釈、レーン４)と免疫沈降し、患者血清で免疫ブロットを行った図である。各上清も同様に検討した（レーン５−８）。患者血清は抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体による免疫沈降物と投与量依存的に反応した（レーン２，３及びレーン６，７）。
【図３】２０人の抗ｐ２００類天疱瘡患者（二重線）抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４(矢印)及び健常者９名の血清（単線）を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。（Ａ）は、すべての患者血清は真皮抽出物中の２００ｋＤａの蛋白質と反応したのに対し、健常者コントロール血清はいずれも反応しなかった事を示しており、それぞれのバンドは抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体のバンドと一致した。（Ｂ）は、ほとんどの患者血清が、ＪＡＲヒト絨毛癌細胞株から精製したラミニン１１１と反応したことを示し、（Ｃ）は、ほとんどの患者血清が、ヒト胎盤から精製したラミニン２１１／２２１と反応したことを示し、（Ｄ）は、ほとんどの患者血清が、ラミニン１１１のリコンビナント産物のラミニンガンマ１と反応したことを示している。なお、健常者コントロール血清は、ラミニンガンマ１と反応しなかった。短い矢印は、ｐ２００のバンドを示し、矢頭はラミニンガンマ１を示す（６％ＳＤＳ）。
【図４】抗ｐ２００類天疱瘡患者血清のラミニンガンマ１Ｃ末部分に対する反応性を示す図である。（Ａ）は、真皮抽出物を用いた免疫ブロット法（７．５％ＳＤＳ）において、患者血清のｐ２００（黒矢印）に対する反応性は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を加えたときに（Ｂ−４、２及び１０μｇ／ｍｌ）、この蛋白質のＣ末を認識して投与量依存的に減少したことを示している。また、（Ａ）は、正常ヒトＩｇＧ、抗ラミニンガンマ１Ｎ末モノクローナル抗体（Ｃ１３Ｓ）あるいは抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体（３Ｃ４、腹水）は、真皮抽出物から得たｐ２００と患者血清の結合を阻害しなかったことを示している。なお、各示された量のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）、腹水、血清（μｌ）の有り、無しを、反応中セルロース膜に添加した。（Ｂ）は、抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た血清又は精製ＩｇＧは抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４の真皮から抽出したラミニンガンマ１抽出物への結合を減少させた（白矢印）が、健常者からの血清又はＩｇＧは減少させなかったことを示している。
【図５】ラミニン１１１のＥ８分画を用いた免疫ブロットである（１２％ＳＤＳ）。（Ａ）は、ラミニン１１１のリコンビナントＣ末Ｅ８分画の構造計画を示している。（Ｂ）の上段は、図２の患者１８（左の１８番目のレーン）を除くすべてのラミニンガンマ１陽性血清は、還元状態において、免疫ブロットでＥ８分画に陽性の反応を示したことを示している。（Ｂ）の下段は、図２の患者１６と１８（左の１６番目及び１８番目のレーン）を除くすべてのラミニンガンマ１陽性血清は、非還元状態で、ラミニンガンマ１のＥ８分画に陽性反応を示したことを示している。二重線は、抗ｐ２００類天疱瘡の２０名の患者の血清を示している。矢印は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４を示す。１本線は、９人の健常人コントロール血清を示す。矢頭は、Ｅ８のバンドを示す。ＮＳは、非特異バンドを示す。
【図６】（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）は、１Ｍ食塩水剥離皮膚を用いた間接蛍光抗体法の結果を示す図である。（Ａ）は、抗ｐ２００類天疱瘡の患者から得た精製ＩｇＧは、剥離皮膚の真皮側に反応したことを示しており、症例＃２００の患者から得たＩｇＧは真皮上層で血管に反応しなかった。一方（Ｂ）は、症例＃１２から得たＩｇＧは反応したことを示している。（Ｃ）は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３Ｓは、基底膜領域の真皮側及び真皮の血管壁の両方に反応したことを示している。（Ｄ）は、真皮及び血管壁の抽出物を用いた免疫ブロットの結果を示す図である。なお、添加した抽出物の量は抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（一番下）との反応性で調節した。還元状態では＃２０の症例の患者の精製ＩｇＧ（図６Ａでも使用）の上皮ラミニンガンマ1に対する反応性は、血管のラミニンガンマ1に対する反応性よりもずっと高かった（上段）。＃１２の患者の精製ＩｇＧ（図６Ｂでも使用）は、真皮抽出物のラミニンガンマ１と血管抽出物のラミニンガンマ１に同じような反応性を示した（中段）レーン1；ＪＡＲ細胞株から得た精製ラミニン１１１レーン２；真皮抽出物レーン３；血管抽出物（７．５％ＳＤＳ、還元状態）
【図７】患者２０名の血清を用いた免疫ブロットの分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明者らの研究により、抗ｐ２００類天疱瘡の患者血清中に見出される自己抗体が認識するｐ２００タンパク質は、ラミニンの構成成分であるラミニンガンマ１であり、そのエピトープのラミニンガンマ１のＣ末にあることを明らかにした。さらに、本発明者らは、患者血清中の抗ラミニンガンマ１抗体の反応性を検討したところ、皮膚のラミニンガンマ１に対して強く反応し、血管のラミニンガンマ１に対しては一部の患者血清しか反応しないことを見出した。
【００２７】
本発明は、上記のような知見に基づいてなされたものであり、従来の抗ラミニンガンマ１抗体の測定法に比べてより高い臨床的感度と特異性を持った、自動機にも対応可能な抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法、測定試薬およびその試薬を用いた皮膚科疾患検出方法である。以下、本発明の実施の形態にについて、図面を参照しながら説明する。
【００２８】
本発明の実施の形態はラミニンガンマ１に対する抗体を検出する方法及び試薬に関する。抗ラミニンガンマ１抗体は抗ｐ２００類天疱瘡患者の血清中に見出され、抗ラミニンガンマ１抗体の検出は抗ｐ２００類天疱瘡の診断に有用である。本発明の実施の形態の抗ラミニンガンマ１抗体の検出に用いられる抗原は、ヒトのラミニンガンマ１のＣ末部分、２４６アミノ酸以外の分画を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明の実施の形態に係る抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法は以下の測定方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
（１）検体をラミニンガンマ１のＣ末以外のペプチドを含む断片を固相化した不溶性担体に接触させる工程
（２）ラミニンガンマ１のＣ末以外の断片を含むペプチド断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【００３０】
本発明の実施の形態には上記ラミニンガンマ１のＣ末以外のペプチド断片のアミノ酸配列を含むペプチド又は、そのアミノ酸に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加されたラミニンガンマ１Ｃ末以外の断片を用いる測定方法が含まれる。
【００３１】
ラミニンガンマ１は、正常皮膚組織から抽出して用いることもできるが、リコンビナントタンパク質として作製することが出来る。特に、特定の分画を抗原として使用する場合、リコンビナントタンパク質として作製することが好ましい。
【００３２】
一般的に、蛋白質の機能発現には特異的な修飾が必要とされることが多いことから、目的蛋白質を発現させるための宿主細胞は、導入される蛋白質遺伝子に応じて適宜選択できることが好ましい。
【００３３】
使用できる宿主細胞としては、大腸菌のほか、真核細胞としてはバキュロウイルス感染細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞である。
【００３４】
抗ラミニンガンマ１抗体の量を測定するには、不溶性担体である固相にラミニンガンマ１又はその断片を結合させ、これに検体中の抗ラミニンガンマ１抗体を接触させて、ラミニンガンマ１若しくはその断片と抗ラミニンガンマ１抗体の複合体を形成し、洗浄によって検体中の他の成分を除いた後、標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させて、ラミニンガンマ１（又はその断片）−抗ラミニンガンマ１抗体−標識化抗ヒト免疫グロブリンの複合体を形成させ、その標識物の反応量を測定することによる。
【００３５】
ラミニンガンマ１又はその断片を結合させる不溶性担体としては、アガロース系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリスチレン系、アクリル酸エステル系等の有機高分子、コラーゲン、キトサン等の生体由来の天然有機高分子あるいは活性炭素、セラミック等の無機物が挙げられる。その形態としては、平板状、粒子状等様々な形態が使用しうるが、表面積を大きくとれるものが好ましい。ラミニンガンマ１分子の固相への結合は、物理吸着によっても可能であるが、共有結合によって結合することもできる。例えば、担体がその表面に有するエポキシ基やアルデヒド基等の反応性官能基に水性溶液中で直接結合することによって実施される。また、アミノ基等の官能基を表面に有する担体を用いる場合は、ラミニンガンマ１蛋白質と担体との混合水性溶液にジアルデヒドやジエポキシ化合物等の反応性多官能基を有する化合物を添加し、反応させることによっても実施することができる。
【００３６】
検出方法としては、ＥＬＩＳＡ法が好適に用いられるが、抗原としてラミニンガンマ１またはその一部を使用するものであれば、他の方法も同様に使用することができる。他の方法としては蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラテックス比濁法等が挙げられる。
【００３７】
標識化した抗ヒト免疫グロブリンとしては、ウサギ、ヤギその他の動物にヒトの免疫グロブリン（ＩｇＧ，好ましくはＩｇＧ４）を免疫して得た抗ヒトＩｇＧあるいはその断片を用いることができる。標識物としては、例えばペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン等の各種酵素やアイソトープを標識して使用することができる。酵素を標識した場合には、適宜適切な基質を選択することにより、その発色、発光、蛍光を測定することによって、検体中の目的物を定量することができる。
【００３８】
検体としては、ヒトの血液、血漿、血清が使用でき、日常検査としては血清が最も好適に使用できるが、尿その他の体液の使用を制限するものではない。
【００３９】
本発明の実施の形態に係る測定方法によれば、患者血清中の抗ラミニンガンマ１抗体を高い感度で測定でき、自動化機器によって測定することも可能なため、日常検査として実施が可能となる他、標準血清を用いて定量的に測定することにより、結果が客観的な数値として捉えることができるため、測定者による判定の差をなくすことができる。また、患者血清中の抗体量の変化を捉えることができるため、治療効果の判定や疾患の憎悪期において治療のタイミングをより早く知ることができる。
【実施例】
【００４０】
（１）患者検体の入手；本検討は、久留米大学医学部の倫理委員会のガイドラインに従って実施され、臨床試験への参加者はインフォームドコンセントを提出し、ヘルシンキ宣言に沿って行われた。３２人の患者（男性１０人、女性６名、１６名は性別不明、１７歳〜８７歳）は、その臨床経過と水疱形成の兆候、１Ｍ食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた間接蛍光抗体法は基底膜領域の真皮側にＩｇＧの反応性を示し、真皮抽出物を用いたウエスターンブロットは２００ｋＤａのバンドを示したことから、抗ｐ２００類天疱瘡と診断された。９名の健常ボランティア及び水疱性類天疱瘡、抗ラミニン３３２粘膜類天疱瘡及び後天性表皮水疱症の血清は、コントロールとして用いた。
【００４１】
（２）抗体の調製
マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４は、サンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。マウス抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３５は、研究室において作製した（（Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１，ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１８９−１９７、Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌａｍｉｎｉｎ−８． Ｌａｍｉｎｉｎ−８ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１ ａｎｄ ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７５５０−１７５５８）。マウス抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体３Ｃ４及びマウスのコントロールＩｇＧは、それぞれケミコン、ミリポア及びサンタクルーズバイオテクノロジーから購入した。第二抗体であるＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ(ウサギ)及びＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ(ウサギ)は、ダコから購入した。患者及び健常者コントロールからのＩｇＧは、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム（アマシャム）を用いて精製した。
【００４２】
（３）真皮及び血管抽出物の調製
免疫ブロット分析に用いる真皮抽出物は、既報の方法に従って調製した（Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｒｍａｌ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：９３−１０２）。血管抽出物は、同様の方法に若干の変更を加えて調製した。外膜を除いた腸間膜動脈は、２ｍＭ ＥＤＴＡと２ｍＭ ＰＭＳＦを加えたＰＢＳ中で４℃２時間インキュベートした。血管の蛋白質は、８Ｍ Ｕｒｅａ、０．３Ｍ β−メルカプトエタノール１ｍＭ ＰＭＳＦを加えた２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）で室温2時間抽出した。血管抽出物は、４℃で２時間精製水に透析し、等量のアセトンで沈殿させた。
【００４３】
（４）ラミニンの調製
ヒトのラミニン１１１は、ＪＡＲ絨毛癌細胞株から、ラミニン２１１／２２１は、ヒト胎盤から精製した（Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ１，ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１８９−１９７）。リコンビナントラミニン１１１は、ヒトα１／β１／γ１チェーンをコードする発現ベクターで形質転換したヒト２９３Ｆ細胞（インビトロジェン）で産生した。α１、β１、γ１のＣ末部分を切断したヘテロトリマーであるラミニン１１１のリコンビナントＥ８分画は、以下のように調製した。
【００４４】
ヒトラミニンβ１及びγ１のリコンビナントＥ８分画の発現ベクター（それぞれＬｅｕ１５６１−Ｌｅｕ１７８６及びＡｓｎ１３６４−Ｐｒｏ１６０９をコードする）は、既報の通り調製した（ＩＤＯ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｈｔｅ ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１１１４４−１１１５４）。ラミニンα１チェーンの切断されたＣ末部分（Ｐｈｅ１８７８−Ｇｌｎ２７００）をコードするｃＤＮＡは、全長ヒトラミニンα１発現ベクターをテンプレートとして用いてＰＣＲで増幅し（Ｉｄｏ Ｈ， Ｈａｒａｄａ Ｋ， Ｙａｇｉ Ｙ， Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ（２００６） Ｐｒｏｂｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｔｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｄｏｍｅｉｎ ｏｆ ｌａｍｉｎｉｎ−５１１ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ４Ｃ７． Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５：１１２−１１７）、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン）に挿入した。ラミニン１１１のリコンビナントＥ８分画は、Ｆｒｅｅ−ＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システム（インビトロジェン）を用いて産生し、既報の通り（ＩＤＯ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｈｔｅ ｌａｍｉｎｉｎ ｇａｍｍａ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｌａｍｉｎｉｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１１１４４−１１１５４）調製培地から精製した。即ち、調製培地は、ニッケルニトリロ三酢酸アフィニティーカラム（キアゲン）に添加し、結合した蛋白質は、２００ｍＭのイミダゾールで溶出した。溶出した蛋白質は、更に抗ＦＬＡＧカラム（シグマ・アルドリッチ）で精製した。精製した蛋白質は、ＴＢＳに透析した。蛋白濃度は、ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ピアースバイオテクノロジー）で定量した。
【００４５】
（５）免疫ブロット法による分析
ＳＤＳ／ＰＡＧＥは、既報の通り実施した（Ｓｕｇｉ Ｔ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ， Ｈｉｂｉ Ｔ， Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ（１９８９） Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ（ＢＭＺ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｂｕｌｌｏｕｓ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ（ＢＰ） ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｕｏｎ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ＢＭＺ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ＢＰ ｓｅｒａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｍ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８４：１０５０−１０５５）。真皮及び血管の抽出物、ヒトラミニン、及びヒトラミニンＥ８分画は、Ｌａｅｍｍｌｉ‘ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５％βメルカプトエタノール有り／無し）で煮沸し、６％、７．５％、又は１２％のＳＤＳゲルで分画した。次いで蛋白質は、ニトロセルロースに電気化学的に転写した。３％スキムミルクでブロックした後、ブロットは、１：５〜１：８００に希釈した患者血清、１０μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍｌ、若しくは１：２００に希釈した抗ヒトラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（マウス）でインキュベートした。二次抗体としては、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ又は抗マウスＩｇ抗血清を用いた。発色は、４−クロロ−１−ナフトールを用いた。
【００４６】
真皮抽出物の免疫沈降は、以下のように行った。凍結乾燥した真皮抽出物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉａｔｕｒｅ（シグマ・アルドリッチ）を含む免疫沈降用バッファーに溶解した。この溶液をＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）と正常コントロールあるいは患者血清（１：２０）の有り、無しでインキュベートし、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４（５又は２０μｇ／ｍｌ）あるいはマウスコントロールＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）で４℃一晩インキュベートした。十分洗浄した後、集められた沈降物は、５％βメルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ‘ｓ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒで煮沸した。上清は、既報の通り免疫ブロット分析で評価した。
【００４７】
阻害アッセイでは、患者＃１２の血清（１：８００）を競合物、即ち正常ヒトＩｇＧ、Ｂ−４、Ｃ１３Ｓ（２又は１０μｇ／ｍｌ）若しくは３Ｃ４（１：１００又は１：２０希釈）と、転写した真皮抽出物の載ったニトロセルロースストリップ上でインキュベートし、上述の通り抗ヒトＩｇＧ抗血清で発色した。他のストリップ上では、Ｂ−４（１μｇ／ｍｌ）を競合物、即ち血清（１：１００又は１：２０希釈）若しくはＩｇＧ（０．２又は１ｍｇ／ｍｌ）４℃一晩インキュベートし、抗マウスＩｇ抗血清で発色した。
【００４８】
（６）二次元電気泳動による分析
凍結乾燥した真皮抽出物を７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４０ｍＭトリス、１％Ｃ７デタージェント及び適量のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＥ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｔａｂｌｅｔｓ（ロッシュ アプライド サイセンス）を含む溶解バッファーに溶かした。還元及びアルカリ化のため最終濃度５ｍＭトリブチルフォスファイン及び最終濃度１０ｍＭのアクリルアミドを添加した。室温で９０分インキュベートした後、１０ｍＭ（最終濃度）のＤＴＴを添加し、反応を停止するため室温で１０分間インキュベートした。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １００Ｋ（アミコン）で遠心ろ過した後、濃縮液は、７Ｍ Ｕｒｅａ、２Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ、１％Ｃ７からなる等電点用バッファーと混合した。等電点電気泳動のためにＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＴＭ ＩＰＴＧ Ｓｔｒｉｐ
（ｐＨ４−７、１１ｃｍ ｌｏｎｇ、３．３ｍｍ ｗｉｄｅ厚さ０．５ｍｍ バイオラッドラボラトリーズ)を適当量のＢｉｏ−Ｌｙｔｅ３−８バッファー（バイオラッドラボラトリーズ）及びＯｒａｎｇｅ Ｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを含むサンプル溶液で一晩水に戻した。
【００４９】
等電点電気泳動終了の後、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ(バイオラッドラボラトリーズ)を含むＣｒｉｔｅｒｉｏｎＴＭ Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌｓ Ｊ（４％ Ｔ ｓｔｒａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ、７．５％ Ｔ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｊｅｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｔｙｐｅ、１３．３ｃｍ ｗｉｄｅ、８．７ｃｍ ｈｉｇｈ、 ａｎｄ １．０ｍｍ ｔｈｉｃｋバイオラッドラボラトリーズ)を用いてＳＤＳ／ＰＡＧＥを実施した。得られた二次元ゲルは、クマーシー・ブリリアントブルーで染色するか又は免疫ブロットに用いられた。
【００５０】
（７）ゲル内消化
蛋白質のスポットは、切り取って５０％セトニトリル／１００ｍＭ炭酸アンモニウムｐＨ８．０で脱色した。切り出したゲルをドライヤーで１５分間乾燥した後、トリプシンプロテオミクスグレードソリューション（９％アセトリトリル中、０．１ｍＭ ＨＣｌ／３６ｍＭ炭酸アンモニウム０．２ｍｇ／ｍｌ）を添加し、２．５ｍＭ炭酸アンモニウムを含む９％アセトニトリルで３７℃、一晩インキュベートした。インキュベートした液は、集めて乾燥した。
【００５１】
（８）質量分析
乾燥させたトリプシン分解ペプチドは、２−５μｌの０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリルに溶解し、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）溶液と混合し、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ（島津製作所）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。トリプシン分解ペプチドのモノアイソトピックｍ／Ｚ値のピークは、蛋白質データベースサーチと蛋白質の同定のためにＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ（マトリックスサイエンス）のＰｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔで分析した。
【００５２】
（９）１Ｍ食塩水剥離皮膚の免疫蛍光法
正常ヒト皮膚を４８時間４℃で１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１Ｍ食塩水に浸した。皮膚サンプルは、液体窒素ですばやく凍結し、クリオスタットで薄切して患者血清（１：１０希釈）、精製した患者ＩｇＧ（０．０８ｍｇ／ｍｌ）及びマウス抗ラミニンガンマ1モノクローナル抗体を一次抗体として反応させ、次いでＦＩＴＣ標識したウサギ抗ヒトＩｇＧ又は、抗マウスＩｇポリクローナル抗体を二次抗体として染色した。
【００５３】
（１０）二次元電気泳動の分析結果
真皮抽出物は、ｐＩ７と４の間の等電点電気泳動と、７．５％ＳＤＳゲル電気泳動の二次元電気泳動で分離した。抽出物は、２枚のゲルで実施し、１枚はクマーシーブルーで染め（図１Ａ）、もう1枚はニトロセルロース膜に転写して抗ｐ２００天疱瘡患者の血清で免疫ブロットを行った（図１Ｂ）。血清は、ｐＩ５．０付近、１２０−１２５ｋＤａの範囲で複数のバンドを検出し、最も反応性の強かったバンドは、２５０ｋＤａに存在した。クマーシーで染色したゲルの同じバンドが、質量分析器で分析された（図１Ｄ）。データベースの検索の結果、このバンドは名目上の分子量１８４，５９５、計算上の等電点５．０１、配列の２８％をカバーするラミニンガンマ１であることが分かった（図１Ｅ）。
【００５４】
特定のバンドとの同一性を確認するため、二次元電気泳動で分離した真皮抽出物を転写した膜上で抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを実施した。患者血清とモノクローナル抗体は、同じバンドに反応した（図１Ｃ）。更に3人の患者の血清も同じバンドを染色した。
【００５５】
抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体は、免疫沈降法で抗ｐ２００類天疱瘡患者血清と真皮抽出物の形成した沈降物に反応したが、健常者血清の沈降物とは反応しなかった（図２Ａ）。真皮抽出物と患者血清の免疫沈降上清は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを行い、如何なるバンドも検出できなかった。このことは、すべてのラミニンガンマ１は、患者血清によって吸収されたことを示唆している。逆に、免疫ブロットにおいて、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体との免疫沈降物は、投与量依存的に患者血清と反応した（図２Ｂ）。抗ラミニンガンマ１免疫沈降の上清は、沈降に用いられた抗ラミニンガンマ１抗体の量に反比例して抗ｐ２００類天疱瘡血清と反応性を示した。抗ｐ２００類天疱瘡血清を用いた免疫ブロットの結果は、ラミニンのガンマ１チェーンがｐ２００のバンドの真皮構成物であることを示唆している。
【００５６】
（１１）ラミニンガンマ１と患者血清の反応性
患者血清とラミニンガンマ１の反応性が、抗ｐ２００類天疱瘡の患者に共通するかどうかを調べるため、２０人の患者の血清について、精製したラミニン１１１及びラミニン２１１／２２１（どちらもラミニンガンマ1チェーンを含む）に対する反応性を調査した。２０の血清すべてが、真皮抽出物を用いた免疫ブロットで２００ｋＤａの蛋白質に反応し、バンドの位置は抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体の位置と一致した（図３Ａ）。このことから、抗ｐ２００類天疱瘡の自己抗原がラミニンガンマ1であることを支持している。この可能性と一致するように、８０％及び８５％の患者血清が、それぞれ精製したラミニン１１１及びラミニン２１１／２２１のガンマ１チェーンと反応した（図３Ｂ，Ｃ及び表１）。合計３２の患者の血清が同程度の反応性を示した。これらの結果は、更にリコンビナントラミニン１１１を用いた免疫ブロットによって確認された。そこでは、９０％の患者血清がリコンビナントラミニンガンマ１に明確な反応性を示した（図３Ｄ及び表１）。重要なことは、健常者９名の血清は精製した／またはリコンビナントのラミニンガンマ1に対してまったく反応しなかったことである。他の水疱性疾患（例えば水疱性類天疱瘡、抗ラミニン３３２粘膜天疱瘡及び表皮水疱症のような）の患者血清はラミニンガンマ１に対する反応性を示さなかった。これらの結果は、若干の陰性例があるにもかかわらず、ラミニンガンマ１が抗ｐ２００類天疱瘡の唯一の自己抗原であることを示唆している。
【００５７】
（１２）ラミニンガンマ１上の原因エピトープ
免疫ブロットによって、患者血清の、上皮抽出物から得たｐ２００への反応性は、抗ラミニンガンマ１Ｃ末モノクローナル抗体の添加によって競合的に阻害された（レーンＢ−４）が、抗ラミニンガンマ１Ｎ末モノクローナル抗体（レーンＣ−１３Ｓ）あるいは抗コラーゲンＶＩモノクローナル抗体（レーン３Ｃ４）の添加によっては阻害されなかった（図４Ａ）。抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た血清と精製ＩｇＧは、上皮ラミニンガンマ１に対するモノクローナル抗体Ｂ−４の反応性を投与量依存的に阻害した。しかし、健常者血清又はＩｇＧは阻害しなかった（図４Ｂ）。これらの結果は、間接的に上皮ｐ２００蛋白質上の患者血清に対する反応部位が、ラミニンガンマ１のＣ末にあることを示している。ラミニンガンマ１上の原因エピトープの位置をさらに限定するため、二重コイルドメインのＣ末の２５％を占め、３つのラミニンＧ様モジュールからなるラミニン１１１の切断部分であるヒトラミニン１１１のＥ８分画（即ちＬＧ１−３）をリコンビナントで作製した（図５Ａ）。このリコンビナント蛋白を用いた免疫ブロット分析により、ほとんどのラミニンガンマ１陽性血清は、還元／非還元状態においてラミニンガンマ１Ｅ８分画に反応することが分かった（図５Ｂ）。患者２０名の血清を用いた免疫ブロットの分析結果を図７に示す。これらの結果は、患者の自己抗体の標的である想定されるエピトープはラミニンガンマ１のＣ末２４６アミノ酸の中に存在することを示唆している。
【００５８】
（１３）自己抗体の臓器特異性
１Ｍ食塩水剥離ヒト皮膚切片を用いた蛍光抗体間接法により、抗ｐ２００類天疱瘡患者から得た精製ＩｇＧは、剥離片の真皮側に反応した（図６Ａ、Ｂ）。特定の症例から得たＩｇＧも、真皮乳頭層毛細血管の血管壁と反応した（図６Ｂ）。しかし、他の患者のＩｇＧは、目に見えるほどの血管壁との反応性は示さなかった（図６Ａ）。このことは、以前に報告された結果と一致している（Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｚｏｎｅ．
Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ
１０６：１３３３−１３３８、Ｋａｗａｈａｒａ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｕｂｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｒｍａｌ ２００−ｋＤａ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：９３−１０２）。対照的に、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｃ１３Ｓは、剥離皮膚の真皮側と血管壁の両方に反応した（図６Ｃ）。
【００５９】
還元状態及び非還元状態での免疫ブロット法での検討により、真皮及び血管の抽出物の添加量は、抗ラミニンガンマ１モノクローナル抗体Ｂ−４の反応性により調節された（図６Ｄ下）。同じ免疫ブロットにより真皮ラミニンガンマ１に対する患者＃２０からの精製ＩｇＧの反応性は、血管ラミニンガンマ1に対する反応性よりはるかに高かった（図６Ｄ上）。この結果は、幾人かの患者の血清を用いて再現されている。しかし、患者＃１２から得た精製ＩｇＧ（間接蛍光抗体法により真皮及び血管の両方の基底膜領域に反応した）は、真皮及び血管から抽出したラミニンガンマ１に同等の反応性を示した（図６Ｄ中）。この症例を除き、これらの結果は、抗ｐ２００類天疱瘡患者の循環血ＩｇＧ抗体は真皮基底膜領域中のラミニンガンマ１に反応し、血管壁ラミニンに対してはずっと弱い反応性を示すことを示唆した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を有する、抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法：
（１）検体をラミニンガンマ１又はその断片と接触させる工程、
（２）ラミニンガンマ１又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【請求項２】
前記ラミニンガンマ１の断片が、前記ラミニンガンマ１のＣ末の２４６アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するペプチドを含む請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記ラミニンガンマ１またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ１またはその断片である請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記検体が、血液、血漿又は血清である、請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
構成試薬がラミニンガンマ１又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキット。
【請求項６】
ラミニンガンマ１又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ１又はその断片である請求項５記載のキット。
【請求項７】
請求項６に記載のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する方法。
【請求項８】
皮膚科疾患が、抗ｐ２００類天疱瘡である請求項７記載の方法。
【請求項１】
次の工程を有する、抗ラミニンガンマ１抗体の測定方法：
（１）検体をラミニンガンマ１又はその断片と接触させる工程、
（２）ラミニンガンマ１又はその断片と検体中に存在するラミニンガンマ１を認識する抗体の結合を検出する工程、および
（３）両者の結合のレベルに基づいて検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の量を決定する工程。
【請求項２】
前記ラミニンガンマ１の断片が、前記ラミニンガンマ１のＣ末の２４６アミノ酸以外のペプチド又はそのアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有するペプチドを含む請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記ラミニンガンマ１またはその断片が、固相に固定化されたラミニンガンマ１またはその断片である請求項１記載の測定方法。
【請求項４】
前記検体が、血液、血漿又は血清である、請求項１から４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
構成試薬がラミニンガンマ１又はその断片を含み、検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の抗体量を測定する方法に用いられるキット。
【請求項６】
ラミニンガンマ１又はその断片が、固相に固定化された固相化ラミニンガンマ１又はその断片である請求項５記載のキット。
【請求項７】
請求項６に記載のキットにより測定した検体中の抗ラミニンガンマ１抗体の測定値から皮膚科疾患を検出する方法。
【請求項８】
皮膚科疾患が、抗ｐ２００類天疱瘡である請求項７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２３３８０４（Ｐ２０１２−２３３８０４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０３０７４（Ｐ２０１１−１０３０７４）
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【出願人】（３９０００４０９７）株式会社医学生物学研究所 (41)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【出願人】（３９０００４０９７）株式会社医学生物学研究所 (41)
【Ｆターム（参考）】
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