抗体および高親和性を有する遺伝的に改変された抗体の生成法
ヒトミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、高頻度変異性細胞および生物を作出するために使用することができる。これらの遺伝子を細胞およびトランスジェニック動物に導入することにより、新規かつ有用な特性を持つ新規細胞株および動物変種を、突然変異の自然な発生率に頼るよりも効率的に調製することができる。これらの方法は、強化された生化学的活性を持つ改変された抗体を生産するために、目的の抗原に対する免疫グロブリン遺伝子内に遺伝的多様性を作成するために有用である。さらにこれらの方法は上昇したレベルの抗体生産を有する抗体生産細胞を生成するためにも有用である。また本発明は、モノクローナル抗体の親和性を上げる方法および上昇した親和性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２０００年１１月７日に出願された特許文献１の一部継続出願である２００２年９月１３日に出願された特許文献２の優先権を主張し、それらの内容は全部、引用により本明細書に編入する。
発明の技術分野
本発明は抗体の成熟および細胞生産の分野に関する。特に本発明は突然変異誘発法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
外来および／または内因性ポリペプチドの活性を遮断するために抗体を使用することは、疾患の基にある原因を処置するために効果的かつ選択的な方法を提供する。特にＦＤＡが認めたＲｅｏＰｒｏ（非特許文献１、ＲｅｏＰｒｏは質が低下したモノクローナル治療薬を再生できるか（Ｃａｎ ＲｅｏＰｒｏ ｒｅｐｏｌｉｓｈ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？））、セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）からの抗−血小板ＭＡｂ；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（非特許文献２、ガンのモノクローナル抗体治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ）、ジェネンテェック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））からの抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ ＭＡｂ；およびＳｙｎａｇｉｓ（非特許文献３、未成熟幼児および気管支肺形成異常の幼児におけるＲＳウイルスに対する筋肉内ヒト化モノクローナル抗体の安全性および薬物動態学（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、メディミューン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）により生産された抗ＲＳウイルスＭＡｂ）のような効果的な治療薬としてモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用がある。
【０００３】
候補タンパク質標的に対するＭＡｂを生成するための標準的方法は、当業者には知られている。簡単に説明すると、マウスまたはラットのような齧歯類に、アジュバントの存在下で精製した抗原を注射して免疫応答を生じる（非特許文献４、死体の腎臓移植におけるＯＫＴ３誘導治療の経済的分析（Ａ ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯＫＴ３ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｄａｖｅｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））。陽性の免疫血清を有する齧歯類を屠殺し、そして脾細胞を単離する。単離した脾細胞をメラノーマと融合して不死化細胞株を生産させ、次いで抗体生産についてスクリーニングする。陽性の株を単離し、そして抗体生産について特性を決定する。ヒトの治療薬として齧歯類のＭＡｂを直接使用することは、齧歯類に由来する抗体で処置した有意な数の患者で、ヒト抗−齧歯類抗体（ＨＡＲＡ）応答が生じるという事実から失敗した（非特許文献５、モノクローナル抗体に対するヒトの免疫応答（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））。ＨＡＲＡの問題を回避するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）（これは抗原結合ドメインを作成する免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットの重および軽鎖可変領域内に見いだされる重要なモチーフである）の、ヒト抗体骨格への移植により、これらのキメラ分子はＨＡＲＡ応答を欠くが抗原に対するそれらの結合活性を保持することができることが分かった（非特許文献６、「抗体をヒト化する方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」）。齧歯類に由来するＭＡｂの「ヒト化」（本明細書ではＨＡｂと呼ぶ）中に存在する共通の問題は、ヒト化Ｉｇ骨格への移植でＣＤＲドメインの３次元的構造における立体配座的変化による結合親和性の損失である（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌへの特許文献１）。この問題を克服するために、さらなるＨＡｂベクターは高親和性ＨＡｂを再生するために、骨格領域および／またはＣＤＲコード領域自体の骨格内にさらなるアミノ酸残基を工学的に挿入または削除することが通常、必要となる（特許文献１）。この工程は、高親和性ＨＡｂを導くことができる変化を予測するためのプログラムの高額なコンピューターモデリングが関与する大変時間がかかる手順である。場合によってはＨＡｂの親和性はそのＭＡｂの親和性までに回復されず、それらの治療的用途を無くする。
【０００４】
抗体操作に存在する別の問題は、臨床用材料として分子を製造するために必要な安定で高収量の生産細胞株の生成である。この問題を回避するために、当業者により幾つかの方法が標準的な実践に適合させられた。１つの方法は、移植したヒト軽および重鎖を含む外因性のＩｇ融合遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して全抗体または単鎖抗体を生産することであり、これらは抗原結合ポリペプチドを形成する軽および重鎖の両方を含有するキメラ分子である（非特許文献７、哺乳動物細胞での組換え免疫グロブリンの高レベル生産（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ））。別の方法は、ヒトの移植した免疫系を含むトランスジェニックマウスまたはヒトＩｇ遺伝子のレパートリーを含有するトランスジェニックマウスに由来するヒトのリンパ球の使用を採用する。さらに別の方法は、ヒト抗−サルの応答を欠くと報告された霊長類のＭＡｂを生産するサルの使用を採用する（非特許文献８、モノクローナル抗体。マウスはヒトのレパートリーを生じる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｉｃｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ））。すべての場合で、十分な量の高親和性抗体を生成することができる細胞株の生成は、臨床試験用に十分な量の生産するには大きな限界を生じる。これらの限界により、植物のような他の組換え系の使用が、ヒト化抗体の安全で高レベルの生産を導く系として現在、調査されている（非特許文献９、トランスジェニックタバコ種子中で操作した抗体の高レベル生産および長期保存（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｓ）。）
抗原に対して高い結合親和性を持つＨＡｂおよびＭＡｂを生じる多様な抗体配列を可変ドメイン内に生成するための方法は、それぞれより有力な治療および診断試薬を作成するために有用となるだろう。さらに全抗体分子にわたり無作為に改変されたヌクレオチドおよびポリペプチド残基の生成は、抗原性がより低く、かつ／または有益な薬理学的特性の新規試薬を生じるだろう。本明細書に記載する発明は、生化学的に活性な抗体をコードする免疫グロブリンを生産する宿主細胞の内因性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性を遮断することにより、インビボで抗体構造全体の無作為な遺伝的突然変異を使用することを対象とする。また本発明は強化された結合および薬理学的プロフィールを持つ抗体に関する反復されたインビボ遺伝的改変および選択法に関する。
【０００５】
加えて、増加した量の抗体を分泌することができる遺伝的に改変された宿主細胞を開発する能力は、製品開発のための細胞宿主を作成する価値ある方法も提供するだろう。本明細書に記載する方法は、ＭＭＲの封鎖を介して増加した抗体生産を生じる遺伝的に改変された細胞宿主の作成を対象とする。
【０００６】
本発明は高親和性抗体の生成および増加したレベルの抗体生産を持つ細胞株の生産を促進する。本発明の他の利点は、本明細書に記載する実施例および図面に説明する。
【参考文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，３３０，１０１号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第１０／２４３，１３０号明細書
【非特許文献１】Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６−１２１７，１９９６
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３−５１，１９９９
【非特許文献３】Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．，，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７−７９１，１９９８
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｌｄ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２７：８５５−８６４，１９９６
【非特許文献５】Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２，１９９４
【非特許文献６】Ｅｍｅｒｙ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編集）、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、第１５９−１８３頁、１９９５
【非特許文献７】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３−５７６，１９９３
【非特許文献８】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８６：２５−２６，１９９７
【非特許文献９】Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１０９０−１０９３，１９９５
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、遺伝的に改変された抗体（単鎖分子を含む）を生成する方法およびインビトロおよびインビボで抗体を生産する細胞宿主を提供し、これにより宿主細胞により限定するわけではないが上昇した抗原結合、細胞宿主による上昇した遺伝子発現および／または強化された細胞外分泌のような所望する生化学的特性（１つまたは複数）を有する抗体を提供する。上昇した結合活性を持つ抗体または上昇した抗体生産を生じる細胞の同定法は、強化された結合特性を持つ分子を生産するＭＭＲ欠損抗体生産細胞クローン、または遺伝的に改変されて強化された量の抗体産物を生産するクローンのスクリーニングを介する。
【０００９】
本発明の使用に適する抗体生産細胞には、限定するわけではないが齧歯類、霊長類、またはヒトハイブリドーマまたはリンパ芽球；トランスフェクトされ、そして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する哺乳動物細胞；トランスフェクトされ、そして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する植物細胞、酵母または細菌を含む。
【００１０】
すなわち本発明は、抗体を生産できる細胞にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを導入することにより、高頻度変異可能（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）な抗体生産細胞を作成する方法を提供する。抗体を生産できる細胞には、自然に抗体を生産する細胞、および免疫グロブリンをコードする配列の導入を介して抗体を生産するように工作された細胞を含む。細胞へのポリヌクレオチド配列の導入は、トランスフェクションにより都合よく行われる。
【００１１】
また本発明は、抗体を生産できる細胞にＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２のようなドミナントネガティブミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を導入することにより、高頻度変異可能な抗体生産細胞を作成する方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮突然変異であることができる（好ましくはコドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。本発明はミスマッチ修復遺伝子活性が抑制される方法も提供する。これは例えば、ミスマッチ修復遺伝子または転写産物に対するアンチセンス分子を使用して達成される。
【００１２】
本発明の他の態様は、動物の受精卵にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを導入することにより、高頻度変異可能な抗体生産細胞の作成法を提供する。これらの方法には、引き続き卵を偽妊娠のメスに移植し、これにより受精卵が成熟したトランスジェニック動物に発生することを含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子は例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２を含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮化突然変異であることができる（好ましくは、コドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。
【００１３】
さらに本発明は、抗体を製造することができ、そしてミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む培養した高頻度変異可能な哺乳動物細胞の均一組成物を提供する。ミスマッチ修復遺伝子は例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２を含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮化突然変異であることができる（好ましくは、コドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。カルチャー中の細胞はＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１を含むことができ；あるいはヒトｍｕｔＬ相同体、またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現することができる。
【００１４】
さらに本発明は、目的の免疫グロブリンについて選択した免疫グロブリン生産細胞を培養することによる、目的の免疫グロブリン遺伝子に突然変異を生成する方法を提供し、ここで細胞はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。細胞から生産された免疫グロブリンの特性は、免疫グロブリン遺伝子が突然変異を有するかどうか確認するためにアッセイすることができる。アッセイは免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを分析することを対象とすることができ、あるいは免疫グロブリンのポリペプチド自体を対象とすることができる。
【００１５】
また本発明は、新規な生化学的特性（例えば免疫グロブリン産物の過剰発現および／または分泌）の生成するために、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する細胞を培養し、そして細胞が目的の遺伝子内に突然変異を有するかどうかを決定するために細胞を試験することにより、抗体生産細胞における抗体生産に影響を及ぼす遺伝子中に突然変異を生成する方法を提供する。この試験には目的の免疫グロブリン遺伝子の定常発現の分析、および／または目的の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分泌されたタンパク質の量の分析を含む。また本発明は、齧歯類、非ヒト霊長類およびヒトに由来する細胞を含め、この方法により作成された原核および真核トランスジェニック細胞も包含する。
【００１６】
本発明の他の観点には、抗体生産細胞の高頻度変異性を可逆的に改変する方法を包含し、ここで誘導性プロモーターに操作可能に連結された、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含有するベクターが抗体生産細胞に導入される。細胞は誘導剤で処理されて、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子（これはＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であることができる）を含むことができる。あるいは細胞は、ヒトｍｕｔＬ相同体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現するように誘導することができる。別の態様では、細胞は目的の予め選択した免疫グロブリン遺伝子をコトランスフェクションすることにより抗体を生産できるようにすることができる。高頻度変異性細胞の免疫グロブリン遺伝子、またはこれらの方法により生産されたタンパク質は所望の特性について分析することができ、そして誘導は宿主細胞の遺伝的安定性が回復されるように止めることができる。
【００１７】
また本発明は遺伝的に改変された抗体を生産する方法を包含し、この方法は変異体抗体がさらなる遺伝的改変無しで一定に生産されるように、免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子（天然であるか、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子が細胞に導入されたいずれか）を含む細胞にトランスフェクトし、細胞を培養して免疫グロブリン遺伝子が突然変異となり、そして変異体免疫グロブリンを生産できるようにし、該変異体免疫グロブリンタンパク質の所望の特性についてスクリーニングし、所望の特性を有する選択した変異体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド分子を単離し、そして該変異体ポリヌクレオチドを遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトすることによる。ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であることができる。あるいは細胞はヒトｍｕｔＬ相同体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現することができる。
【００１８】
さらに本発明は、強化された量の抗原結合ポリペプチドを発現する遺伝的に改変された細胞株の生成法を提供する。これらの抗原に結合するポリペプチドは、例えば免疫グロブリンである。また本発明の方法は、強化された量の抗原結合ポリペプチドを分泌する遺伝的に改変された細胞株の生成法も含む。細胞株は、抗体のような抗原結合ポリペプチドを生産する細胞に強化された割合の遺伝子の高頻度変異性を提供するドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子により高頻度変異性とされる。そのような細胞は限定するわけではないがハイブリドーマを含む。強化された量の抗原結合ポリペプチドの発現は、例えば抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの強化された転写または翻訳を介して、あるいは抗原結合ポリペプチドの強化された分泌を介することができる。
【００１９】
また方法は、細胞宿主のＭＭＲ活性を遮断することにより、または免疫グロブリンをコードする遺伝子をＭＭＲ欠損細胞宿主にトランスフェクトすることにより、インビボで遺伝的に改変された抗体を作成することも提供する。
【００２０】
可変ドメイン内の遺伝的変化により抗原に対して上昇した結合特性を持つ抗体は、細胞宿主の内因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法により提供される。軽および／または重鎖内のＣＤＲ領域中の遺伝的変化により抗原に対して上昇した結合特異性を持つ抗体も、細胞宿主の内因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法により提供される。
【００２１】
本発明は、限定するわけではないが齧歯類、霊長類およびヒトを含む宿主生物中で強化された薬物動態学的特性を有する、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞株中で遺伝的に改変された抗体の作成法を提供する。
【００２２】
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下に記載する１以上の態様により提供される。本発明の１つの態様では、抗体生産細胞株を高頻度変異性にする方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、抗体生産細胞に導入される。細胞は遺伝子導入の結果として高頻度変異性となる。
【００２３】
本発明の別の態様では、免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする内因性遺伝子に突然変異を導入するための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。細胞はＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の導入および発現の結果として高頻度変異性となる。細胞はさらに目的の免疫グロブリン遺伝子を含んでなる。細胞を成長させ、そして目的の免疫グロブリンまたは単鎖抗体をコードする遺伝子が突然変異を有するかどうかを決定するために試験される。本発明の別の観点では、突然変異した免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする遺伝子を単離し、そして遺伝的に安定な細胞中で発現させることができる。好適な態様では、突然変異した抗体は限定するわけではないが強化された結合特性のような少なくとも１つの所望する特性についてスクリーニングされる。
【００２４】
本発明の別の態様では、Ｉｇ軽および重鎖をコードする遺伝子または遺伝子組またはその中の組み合わせが、ＭＭＲ欠損の哺乳動物の細胞宿主に導入される。細胞を成長させ、そしてクローンを強化された結合特性を持つ抗体について分析する。
【００２５】
本発明の別の態様では、細胞の新規表現型を生成するための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。細胞は遺伝子の導入の結果として高頻度変異性となる。細胞を成長させる。細胞は、新規表現型の発現に関して試験され、この場合、表現型はポリペプチドの強化された分泌である。
【００２６】
また本発明は、置換が重および／または軽鎖の可変ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸について作成された免疫グロブリン分子を含んでなる、抗原に対して上昇した親和性を有する抗体を提供する。幾つかの態様では、置換はその位置の親のアミノ酸が非極性側鎖である位置での置換である。幾つかの態様では、親のアミノ酸が非極性側鎖を有する異なるアミノ酸に置換されている。別の態様では、親のアミノ酸はプロリンまたはヒドロキシプロリンに置き換えられる。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が重および／または軽鎖可変ドメインの骨格領域に作成される。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が重鎖の第１骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が軽鎖の第２骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換は重鎖の第１骨格領域および軽鎖の第２骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換は配列番号１８に示す重鎖の第１骨格領域の６位に作成される。幾つかの態様では、置換は配列番号２１に示す軽鎖の第２骨格領域の２２位に作成される。幾つかの態様における特異的位置の突然変異に関して、アミノ酸の置換はプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
【００２７】
また本発明は、主題の抗体の重または軽鎖の可変ドメイン内のアミノ酸を、非極性側鎖を有する別のアミノ酸に置換することを含んでなる、抗原に対する抗体の親和性を上げる方法も提供する。幾つかの態様では、その位置で元のアミノ酸の代わりにプロリンが使用される。幾つかの態様では、プロリンが非極性側鎖を有する別のアミノ酸の代わりに使用される。幾つかの態様ではアラニンおよび／またはロイシンがプロリンに置き換えられる。特定の態様では、配列番号１８に示す抗体の重鎖の第１骨格領域の６位のアミノ酸がプロリンに置き換えられる。別の態様では、配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位のアミノ酸がプロリンに置き換えられる。また本発明はこれらの方法により生産される抗体も提供する。
【００２８】
本発明で生産される抗体は、本発明の方法を使用して作成することができ、この方法はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が抗体生産細胞に導入され、そして細胞は本明細書でさらに完全に記載されるように高頻度変異性となる。あるいは２００２年７月１８日に公開された国際公開第０２／０５４８５６号パンフレット（これは引用により本明細書に編入する）に記載されているアントラセンおよび／またはその誘導体を使用するような、ミスマッチ修復の化学的インヒビターを使用してミスマッチ修復を破壊することができる。ミスマッチ修復を破壊する化学物質で処理されたか、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現する細胞は高頻度変異性となる。高頻度変異性細胞により生産された抗体は上昇した親和性についてスクリーニングされ、そして上記のアミノ酸置換を含んでなる抗体は、抗原に対して上昇した親和性を表す。上昇した親和性および本明細書に記載する分子特性を有する抗体を生産する細胞は、化学的インヒビターを離脱することにより、またはドミナントネガティブ対立遺伝子の発現の不活性化を介して細胞を遺伝的に安定とすることにより、再び遺伝的に安定とすることができる。例えば誘導性プロモーターの制御下にあるドミナントネガティブ対立遺伝子は、誘導物質を離脱することにより不活性化することができる。あるいはドミナントネガティブ対立遺伝子はノックアウトすることができ、またはＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を使用し、これによりいったん遺伝的に多様な免疫グロブリンを含む細胞が樹立されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子をゲノムからスプライスすることができる。
【００２９】
別の態様では、当業者は突然変異をタンパク質に導入し、そして上記のアミノ酸置換を持つ、より高い親和性を有する抗体について選択する既知の方法を使用することができる。突然変異を導入する方法は、化学的突然変異誘発法のような無作為なものでよく、あるいは位置指定突然変異誘発法のような特異的なものでよい。無作為および特異的な突然変異誘発法は当該技術分野では周知であり、そして限定するわけではないが例えば、化学的突然変異誘発法（例えばメタンスルホネート、ジメチルスルホネート、Ｏ６−メチルベンザジン、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、およびエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）のような化学物質を使用する）；オリゴヌクレオチドが媒介する位置指定突然変異誘発法；アラニンスキャンニング；およびＰＣＲ突然変異誘発法（例えばＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５−１３９、位置指定突然変異誘発法；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（２）：１９４−１９６、カセット突然変異誘発法；およびＨａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（１）：４７−４８、制限選択突然変異誘発法を参照にされたい）を含む。
【００３０】
本発明のこれらのおよび他の態様は当該技術分野に、細胞および動物に強化された変異性を生成し得る方法を提供し、ならびに有利な薬物動態学的プロフィールを持つ高親和性抗体の大規模生産に潜在的に有用な突然変異を持つ細胞および動物を提供する。
【００３１】
宿主細胞の保存されたミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスを利用することにより、高頻度変異性抗体生産細胞を開発する方法を開発した。そのような遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は細胞またはトランスジェニック動物に導入された時、ＤＮＡ修復の効率を下げ、そしてこれにより細胞または動物を高頻度変異性にすることにより、自然な突然変異の割合を上げる。次いで高頻度変異性細胞または動物は、目的の遺伝子中に新規突然変異を発生させるために利用することができる。限定するわけではないがハイブリドーマ；Ｉｇ軽および重鎖をコードする遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞；単鎖抗体をコードする遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞；Ｉｇ遺伝子でトランスフェクトされた真核細胞のような抗体生産細胞でのＭＭＲの遮断は、これらの細胞中で突然変異の割合を強化し、強化された抗体生産を有するクローンおよび／または上昇した抗原結合のような強化された生化学的特性を持つ遺伝的に改変された抗体を含む細胞を導くことができる。ミスマッチプルーフリーディングとも呼ばれるＭＭＲのプロセスは、細菌から哺乳動物細胞にわたる細胞でタンパク質複合体により行われる。ＭＭＲ遺伝子はそのようなミスマッチ修復複合体のタンパク質の１つをコードする遺伝子である。作用メカニズムの特定の理論に拘束されることは望まないが、ＭＭＲ複合体はヌクレオチド塩基の非相補的対合から生じるＤＮＡヘリックスのゆがみを検出すると考えられている。より新しいＤＮＡ鎖上の非相補的塩基が切り出され、そして切り出された塩基は古いＤＮＡ鎖に相補的な適切な塩基に置き換えられる。このように細胞はＤＮＡ修復における誤りの結果として起こる多くの突然変異を排除する。
【００３２】
ドミナントネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞に野生型の対立遺伝子が存在してもＭＭＲ欠損の表現型を引き起こす。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の例は、ヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４であり、これはコドン１３４に短縮化された突然変異を持つ（配列番号１５）。突然変異は、この遺伝子産物が１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終結することを引き起こし、Ｎ−末端１３３アミノ酸を含む短縮化されたポリペプチドを生じる。そのような突然変異は突然変異の割合に上昇を引き起こし、これはＤＮＡ複製後の細胞に蓄積する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型の対立遺伝子が存在してもミスマッチ修復活性の減損をもたらす。そのような効果を生成する任意の対立遺伝子を本発明に使用することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌または他の生物の細胞から得ることができる。そのような対立遺伝子は、細胞を欠損ＭＭＲ活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。ガンを有する動物またはヒトに由来する細胞は、欠損ミスマッチ修復についてスクリーニングすることができる。結腸ガン患者に由来する細胞は特に有用である。任意の細胞に由来するＭＭＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを、野生型配列からの変異について分析することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、例えばｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子または他のＭＭＲ遺伝子のバリアントを生成することにより人工的に作成することもできる。位置指定突然変異誘発法の種々の技術を使用することができる。天然または人工であっても、そのような対立遺伝子の高頻度変異性細胞または動物を作出するために使用する適性は、１以上の野生型対立遺伝子の存在下で対立遺伝子により引き起こされるミスマッチ修復活性を試験し、それがドミナントネガティブ対立遺伝子であるかどうかを決定することにより評価できる。
【００３３】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が導入された細胞または動物は高頻度変異性となる。これはそのような細胞または動物の自然発生的な突然変異率が、そのような対立遺伝子が無い細胞または動物に比べて上昇することを意味する。自然発生的な突然変異率の上昇の程度は、正常な細胞または動物の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１００倍であることができる。限定するわけではないがメタンスルホネート、ジメチルスルホネート、Ｏ６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵ等のような化学的な突然変異原の使用は、ＭＭＲ欠損細胞で使用されて、ＭＭＲ欠損自体のさらに１０〜１００倍に率を上げることができる。
【００３４】
本発明の１つの観点では、ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ形をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。遺伝子はＭＭＲ複合体の一部であるタンパク質をコードするドミナントネガティブ対立遺伝子、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１またはＭＳＨ２であることができる。ドミナントネガティブ対立遺伝子は自然に生じるか、または研究室で作成することができる。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的に合成されたポリヌクレオチドの状態であることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチドは、構成的に活性なプロモーターセグメント（限定するわけではないがＣＭＶ、ＳＶ４０、延長因子またはＬＴＲ配列のような）を含む発現ベクターに、またはドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現を調節することができるステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような誘導性プロモーター配列にクローン化することができる。ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞に導入することができる。
【００３６】
本発明の別の観点に従い、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、Ｉｇ遺伝子の組またはＩｇ遺伝子の全部または一部を含有するキメラ遺伝子を、ＭＭＲ欠損細胞宿主にトランスフェクトし、細胞を成長させ、そして新規な生化学的特性を持つ遺伝的に改変されたＩｇ遺伝子を含有するクローンについてスクリーニングすることができる。ＭＭＲ欠損細胞はヒト、霊長類、哺乳動物、齧歯類、植物、酵母または原核生物界の細胞であることができる。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードする突然変異した遺伝子を個々のクローンから単離し、そして遺伝的に安定な細胞（すなわち正常ＭＭＲを持つ細胞）に導入して、新規な生化学的特性を持つＩｇを一定して生産するクローンを提供することができる。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードするＩｇ遺伝子の単離法は、当該技術分野で知られている任意の方法でよい。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードする単離されたポリヌクレオチドの導入も、限定するわけではないが新規な生化学的特性を持つＩｇをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターのトランスフェクションを含め、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して行うことができる。Ｉｇ遺伝子、１組のＩｇ遺伝子またはＩｇ遺伝子の全部または一部を含有するキメラ遺伝子のＭＭＲ欠損宿主細胞へのトランスフェクションに代えて、そのようなＩｇ遺伝子はドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子と同時に遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトして、細胞を高頻度変異性にすることができる。
【００３７】
トランスフェクションはポリヌクレオチドが細胞に導入される任意のプロセスである。トランスフェクションのプロセスは生きている動物で、例えば遺伝子治療用のベクターの使用して行うことができ、あるいはインビトロで例えばカルチャー中の１以上の単離された細胞の懸濁液を使用して行うことができる。細胞は、例えばヒトまたは他の霊長類、哺乳動物または他の脊椎動物、無脊椎動物から単離された細胞を含め任意の種類の真核細胞、および原生生物、酵母または細菌のような単細胞生物であることができる。
【００３８】
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液または１つの細胞を使用して行われるが、他の方法もトランスフェクトされた細胞を成長させ、そして利用できるように、処理された細胞または組織の十分な画分がポリヌクレオチドを包含する限り適用することができる。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、細胞中で一時的に、または安定に発現され得る。トランスフェクションの技術は周知である。ポリヌクレオチドを導入するために利用可能な技術には、限定するわけではないが電気穿孔、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用および目的の細胞との融合にポリヌクレオチドと一緒に脂質のパッケージングを含む。いったん細胞がＭＭＲ遺伝子でトランスフェクトされれば、細胞を培養で成長させ、そして再生させることができる。トランスフェクションが安定である場合、遺伝子が多くの細胞世代で一定レベルで発現されるので、細胞株を生じる。
【００３９】
単離された細胞は、個々の細胞に機械的に分離し、そしてそれらを適当な細胞培養基（酵素、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンでの組織の前処理を含むか、または含まない）に移すことにより、ヒトまたは動物の組織から得られる細胞である。そのような単離された細胞は典型的には他の種類の細胞の不存在下で培養される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の導入について選択された細胞は、初代細胞培養または不死化細胞株の状態で真核生物に由来することができ、あるいは単細胞生物の懸濁液に由来することができる。
【００４０】
ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ形をコードするポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を作出することにより動物のゲノムに導入することができる。トランスジェニック動物を作出するために、適切な技術を利用できる動物は任意の種でよい。例えばトランスジェニック動物は家畜、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等から；組換えタンパク質の生産に使用される動物、例えば乳に組換えポリペプチドを発現するウシ、ブタまたはヤギから；あるいは調査または製品試験用の実験動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等から調製することができる。ＭＭＲ欠損であると決定された細胞株は、次いで単鎖抗体をコードする全体の、完全な免疫グロブリン遺伝子および／またはキメラ遺伝子を、ＭＭＲ欠損動物の任意の組織に由来するＭＭＲ欠損細胞に導入することにより、遺伝的に改変された免疫グロブリン遺伝子をインビトロで生産するための供給源として使用される。
【００４１】
いったんトランスフェクトされた細胞株またはトランスジェニック動物のコロニーが生産されれば、これは１以上の目的遺伝子に新規な突然変異を作成するために使用することができる。目的の遺伝子は、細胞株またはトランスジェニック動物により自然に保有される任意の遺伝子であるか、あるいは細胞株またはトランスジェニック動物に導入することができる。突然変異を誘導するためにそのような細胞または動物を使用する利点は、暴露した物体および作業者の両方に２次的な有害効果を有し得る突然変異原性の化学物質または照射に細胞または動物を暴露する必要が無い点である。しかし化学的突然変異原はＭＭＲ欠損と組み合わせて使用することができ、これはそのような突然変異原の不明瞭なメカニズムによる毒性を低くする。次いで高頻度変異性動物を育種し、そして遺伝的に変異性（ｖａｒｉａｂｌｅ）の細胞を生産するために有用な新規細胞株を同定するために、単離し、そしてクローン化され得る遺伝的に変異性のＢ細胞を生産する細胞について選択することができる。いったん新たな形質が同定されれば、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、当業者により使用されている技術により対立遺伝子を直接ノックアウトすることにより、または所望の形質および安定なゲノムを持つ子孫を選択するためにドミナントネガティブ対立遺伝子を欠く仲間（ｍａｔｅ）に育種することにより除去することができる。別の選択は、ＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を使用することであり、これによりいったん遺伝的に多様な免疫グロブリンのプロフィールが含まれる動物が樹立されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子は動物のゲノムからスプライスされる。さらに別の選択は、コルチコステロイドの存在下で外因性遺伝子を発現するステロイドで誘導するｐＩＮＤ（インビトロジェン）またはｐＭＡＭ（クロンテック：Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）ベクターのような誘導性ベクターの使用である。
【００４２】
突然変異は細胞または動物の遺伝子型の改変を分析することにより、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは目的の遺伝子に関連するアミノ酸の配列を調査することにより検出することができる。突然変異は抗体力価の生成をスクリーニングすることにより検出することができる。変異体ポリペプチドは、変異体遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動的移動度、分光光学的特性または他の物理的もしくは構造的特性の変化を同定することにより検出することができる。またタンパク質の改変された機能をｉｎ ｓｉｔｕで、単離された状態で、またはモデル系でスクリーニングすることもできる。目的遺伝子の機能に関連する細胞または動物の任意の特性、限定するわけではないがＩｇ分泌の変化についてスクリーニングすることができる。
【００４３】
ミスマッチ修復タンパク質をコードする核酸配列の例には、限定するわけではないが以下を含む：マウスＰＭＳ２（配列番号６）；ヒトＰＭＳ２（配列番号８）；ヒトＰＭＳ１（配列番号１０）ヒトＭＳＨ２（配列番号１２）；ヒトＭＬＨ１（配列番号１４）；およびヒトＰＭＳ２−１３４（配列番号１６）。対応するアミノ酸配列は：マウスＰＭＳ２（配列番号５）；ヒトＰＭＳ２（配列番号７）；ヒトＰＭＳ１（配列番号９）ヒトＭＳＨ２（配列番号１１）；ヒトＭＬＨ１（配列番号１３）；およびヒトＰＭＳ２−１３４（配列番号１５）。
【００４４】
抗原に対して上昇した親和性を示す変異体抗体を配列決定し、そして野生型（ＷＴ）Ｈ３６の親の抗体の配列と比較する。プロリンへのアミノ酸の改変は、免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖のいずれかの可変領域に導入された時、抗原に対する親和性を上げる効果を有することが見い出された。操作の特定の理論に拘束されることは望まないが、プロリンは局所化された剛性の領域を導入し、そして免疫グロブリン分子、特に抗原結合部位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の回りの領域に安定性を与えると考えられている。
【００４５】
このように本発明は、可変ドメイン重および／または軽鎖のアミノ酸をプロリンまたはヒドロキシプロリン（集合的に「プロリン」と呼ぶ）に置き換えることを含んでなる、抗体の親和性を上げる方法を提供する。幾つかの態様では、プロリンの置換は重鎖可変ドメイン内にある。幾つかの態様では、プロリンの置換は軽鎖可変ドメイン内にある。他の態様では、プロリンの置換は免疫グロブリン分子の可変ドメインの重鎖および軽鎖の両方にある。幾つかの態様では、非極性側鎖を有する他のアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン）に代えてプロリンを使用する。幾つかの態様では、非極性側鎖を有するアミノ酸と非極性側鎖を有する別のアミノ酸とのさらなる交換も、抗原に対する抗体の上昇した親和性を付与することができる。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は重鎖の骨格領域内にある。他の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の骨格領域内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重および軽鎖の両方の骨格領域内にある。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第１骨格領域（ＦＲ１）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第３骨格領域（ＦＲ３）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第４骨格領域（ＦＲ４）内にある。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第１骨格領域（ＦＲ１）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第３骨格領域（ＦＲ３）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第４骨格領域（ＦＲ４）内にある。
【００４６】
本発明の特定の態様では、プロリンが配列番号１８の６位でアラニンに換えて使用される。別の態様では、プロリンは配列番号１８の６位でアラニンに換えて、および配列番号１８の９位でグリシンに換えて使用され、かつ／または配列番号１８の１０位のリシンは非極性側鎖を有するアミノ酸（好ましくはそれぞれバリンおよびアルギニン）に置換される。別の態様では、プロリンが配列番号２１の２２位でロイシンに換えて使用される。本発明の背景に関するさらなる情報について、以下の参考文献を調べることができ、これらの各々は全部、引用により本明細書に編入する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
上記開示は本発明を全般的に説明する。より完全な理解は、具体的説明のためにのみ提供され、そして本発明の範囲を限定するものではない以下の具体的実施例を参考にすることにより得ることができる。
【実施例１】
【００５１】
ハイブリドーマ細胞中でのドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の安定な発現
Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異はドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）により、以前に別のＭＭＲプロフィシェント細胞でのドミナントネガティブ対立遺伝子の発現がこれらの宿主細胞をＭＭＲ欠損にできることが示された。ＭＭＲ欠損細胞の作成は、宿主生物の子孫の全ゲノムを通して遺伝的な改変の生成を導くことができ、改変された特性の生物化学物質を生産することができる遺伝的に改変された子孫または姉妹群を生じる。本出願は抗体生産細胞でのドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の使用を教示し、そのような細胞には限定するわけではないがヒトの免疫グロブリン遺伝子産物を生産する齧歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、キメラ齧歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト細胞、単鎖抗体を生産する哺乳動物細胞、および哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子または単鎖抗体内に含まれるようなキメラ免疫グロブリン分子を生産する原核細胞を含む。抗体を生産するために使用される上記の細胞発現系は、抗体治療薬の分野の当業者には周知である。
【００５２】
ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を使用してＭＭＲ欠損ハイブリドーマを作成する能力を示すために、我々は最初にヒトＩｇＥタンパク質に対する抗体を生産することが知られているマウスのハイブリドーマ細胞株を、ヒトＰＭＳ２（ＨＢＰＭＳ２と呼ぶ細胞株）、本明細書でＰＭＳ１３４と呼ぶ以前に公開されたドミナントネガティブＰＭＳ２変異体（ＨＢ１３４と呼ぶ細胞株）を含むか、または挿入物が無い（ＨＢｖｅｃと呼ぶ細胞株）発現ベクターでトランスフェクトした。結果はＰＭＳ１３４変異体が正に強固なドミナントネガティブ効果を発揮することができ、ＭＭＲ欠損の生化学的および遺伝的発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）をもたらすことを示した。予期しなかったことは、完全長のＰＭＳ２もより低いＭＭＲ活性を生じたが、空ベクターを含有する細胞には効果は無かったという知見であった。方法の簡単な説明を以下に提供する。
【００５３】
ＭＭＲ能力を有する（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）マウスＨ３６ハイブリドーマ細胞株を、種々のｈＰＭＳ２発現プラスミドに加えてＭＭＲ活性を評価するためのレポーター構築物でトランスフェクトした。ＭＭＲ遺伝子をｐＥＦ発現ベクターにクローン化し、またこのベクターはクローニング部位の上流に延長因子プロモーターを、次いで哺乳動物のポリアデニル化シグナルを含む。このベクターは、このプラスミドを保持している細胞の選択を可能にするＮＥＯｒ遺伝子も含む。簡単に説明すると、細胞は製造元のプロトコール（ライフテクノロジーズ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ポリリポソームを使用して１μｇの各ベクターでトランスフェクトした。次いで細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で１０日間選択し、そしてＧ４１８耐性細胞を一緒にプールして遺伝子発現に関して分析した。ｐＥＦ構築物はＥＦ遺伝子のエキソン１をエキソン２から分けるイントロンを含み、これはポリリンカークローニング部位の５’末端に並置されている。これにより迅速な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で、スプライス生成物を発現している細胞のスクリーニングができるようになる。１７日で１００，０００個の細胞が単離され、そしてそれらのＲＮＡはすでに記載されたトリゾール法を使用して抽出された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９５）ＰＭＳ２の５’領域の分析により、異種性の転写産物および新規な重複遺伝子が明らかとなる（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：３２９−３３４）。ＲＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジーズ）を使用して逆転写され、そしてＥＦ遺伝子（５’−ｔｔｔ ｃｇｃ ａａｃ ｇｇｇ ｔｔｔ ｇｃｃ ｇ−３’）（配列番号２３）のエキソン１に位置するセンスプライマー、および公開されたヒトＰＭＳ２のｃＤＮＡのｎｔ２８３で中央に位置するアンチセンスプライマー（５’−ｇｔｔ ｔｃａ ｇａｇ ｔｔａ ａｇｃ ｃｔｔ ｃｇ−３’）（配列番号２４）を使用してＰＣＲ増幅され、これは完全長ならびにＰＭＳ１３４遺伝子発現の両方を検出するだろう。反応は以前に記載されたバッファーおよび条件を使用して（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ヒトＰＭＳ２遺伝子ファミリーのゲノム組織化（Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＰＭＳ２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６）、以下の増幅パラメーターを使用して行った：９４℃で３０秒間、５２℃で２分、７２℃で２分間を３０サイクル。反応はアガロースゲルで分析した。図１は安定に形質導入されたＨ３６細胞におけるＰＭＳ発現の代表例を示す。
【００５４】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、タンパク質のＮ−末端に位置する最初の２０個のアミノ酸に対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットを介して、以前に記載された手順（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブ変異体の表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）（データは示さず）に従い確認された。
【実施例２】
【００５５】
ｈＰＭＳ１３４はハイブリドーマ細胞にＭＭＲ活性の欠損および高頻度変異性を引き起こす
ＭＭＲ欠損の証明は、宿主細胞のゲノム中の不安定なマイクロサテライト反復の生成である。この表現型はマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＭＩ）と呼ばれる（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）ミスマッチ修復、遺伝的安定性およびガン（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５９−１９６０）；Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ミスマッチ修復およびガン（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）Ｎａｔｕｒｅ ３６：４１７）。ＭＩは、宿主細胞の全ゲノムを通した反復的なモノ−、ジ−および／またはトリ−ヌクレオチド反復配列内の欠失および／または挿入からなる。真核細胞の徹底的な遺伝子の分析により、ＭＩを生じることができる生化学的欠損は欠損ＭＭＲだけであることが見いだされた（Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）ＤＮＡミスマッチ修復に影響を及ぼす突然変異による酵母の単純な反復的ＤＮＡ域の脱安定化（Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：２７４−２７６；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）マイクロサテライトミューテーター表現型のガン（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）ヒトの発癌現象におけるミスマッチ修復欠損（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９−４９４）。欠損ＭＭＲがＭＩを促進させるという独自の観点から、これを宿主細胞中のＭＭＲ活性の損失を監視するための生化学マーカーとして使用する（Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）マイクロサテライトミューテーター表現型のガン（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）ヒトの発癌現象におけるミスマッチ修復欠損（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９−４９４；Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）家族性結腸直腸ガンにおけるＤＮＡミスマッチ修復遺伝子中の突然変異の予測因子としてのマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：１７−２５）。
【００５６】
真核細胞でＭＭＲ欠損を検出するために使用する方法は、フレームシフトによりそのリーディングフレームを破壊するコード領域中に挿入されたポリヌクレオチド反復を有するレポーター遺伝子を採用することである。ＭＭＲが欠損している場合、レポーター遺伝子はポリヌクレオチド反復内に無作為の突然変異（すなわち挿入および／または欠失）を獲得し、オープンリーディングフレームを持つレポーターを含むクローンを生じる。我々はＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢＰＭＳ１３４細胞でＭＭＲ活性について測定するために、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子の使用を採用した。レポーター構築物はｐＣＡＲ−ＯＦを使用し、これはハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子に、そのコード領域の５’末端に２９ｂｐのフレーム外ポリ−ＣＡ域を含むβガラクトシダーゼ遺伝子を加えて含む。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターはフレーム回復突然変異（すなわち挿入または欠失）がトランスフェクション後に生じなければ、β−ガラクトシダーゼ活性を生じないだろう。ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢ１３４細胞はそれぞれ、実施例１に記載されたプロトコールに従いｐＣＡＲ−ＯＦベクターを用いて二連反応でトランスフェクトされた。細胞は０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．５ｍｇ／ｍｌのＨＹＧ中で選択され、ＭＭＲエフェクターおよびｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの両方を保持している細胞について選択された。ｐＣＡＲベクターでトランスフェクトされたすべてのカルチャーは、類似した数のＨＹＧ／Ｇ４１８耐性細胞を生じた。次いでカルチャーを拡大し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について、ｉｎ ｓｉｔｕならびに細胞抽出物の生化学的分析により試験した。ｉｎ ｓｉｔｕ分析について、１００，０００個の細胞を回収し、そして１％グルタルアルデヒドで固定化し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして２４ウェルプレート中の１ｍｌのＸ−ｇａｌ基質溶液［０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％Ｘ−Ｇａｌ］中で３７℃にて２時間インキュベーションした。反応は５００ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液で止め、そして分析のために顕微鏡スライドに移した。ＭＭＲ不活性化を評価するために、青（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）または白（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）について、各２００細胞の３つの視野をカウントした。表１はこれらの実験結果を示す。ＨＢｖｅｃ細胞にはβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞は観察されなかったが、ＨＢ１３４カルチャーでは視野あたり１０％の細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であり、そしてＨＢＰＭＳ２カルチャーでは視野あたり２％の細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
【００５７】
細胞抽出物は上記のカルチャーから調製して、以前に記載されたような生化学アッセイ（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｕｎファミリーの員、ｃ−ＪｕｎおよびＪＵＮＤはＡｐ１様要素を介してヒトｃ−ｍｙｂプロモーターをトランス活性化する（Ｔｈｅ Ｊｕｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ，ｃ−ＪＵＮ ａｎｄ ＪＵＮＤ，ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ−ｍｙｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ａｎ Ａｐ１ ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９６６５−１９６７２）を使用してβ−ガラクトシダーゼを測定した。簡単に説明すると、１００，０００個の細胞を集め、遠心し、そして２００μｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁した。細胞は３回の凍結／解凍により溶解し、そして細胞屑を除くために１４，０００ｒｐｍでのミクロ遠心後に上清を集めた。タンパク質含量はＯＤ２８０での分光光度的分析により測定した。生化学的アッセイについては、２０μｇのタンパク質を４５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＰＯ４および０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するバッファーに加えた。反応は１時間インキュベーションし、０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加えることにより終了し、そして５７６ｎｍで分光法により分析した。Ｈ３６細胞溶解物はバックグラウンドを引くために使用した。図２は種々の細胞株に由来する抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。示したように、ＨＢ１３４細胞が最高量のβ−ガラクトシダーゼを生産し、一方、ｐＣＡＲ−ＯＦを含有するＨＢｖｅｃ細胞には活性が見いだされなかった。これらのデータは、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を使用したＭＭＲ欠損ハイブリドーマ細胞を作成する能力を示す。
【００５８】
表１。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターでトランスフェクトしたＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢ１３４細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現。細胞はｐＣＡＲ−ＯＦβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞はハイグロマイシンおよびＧ４１８で選択し、拡大し、そしてＸ−ｇａｌ溶液で染色してβ−ガラクトシダーゼ活性について測定した（青色に着色された細胞）。各２００細胞の３視野を顕微鏡で分析した。以下の結果はこれらの実験の平均＋／−標準偏差を表す。
【００５９】
【表４】
【実施例３】
【００６０】
より高い結合親和性を有する抗体を生産するハイブリドーマクローンおよび／または上昇した免疫グロブリン生産を同定するスクリーニング法
本明細書に提示する方法の応用は、改変された生化学的特性を持つ抗体を生じる免疫グロブリン遺伝子内の遺伝的改変を作成するために、ＭＭＲ欠損ハイブリドーマまたは他の免疫グロブリン生産細胞の使用である。この応用の具体的説明はこの実施例内に示され、これにより抗−ヒト免疫グロブリン型Ｅ（ｈＩｇＥ）ＭＡｂを生産するＭＭＲ欠損細胞株であるＨＢ１３４ハイブリドーマ（実施例１を参照にされたい）を２０世代成長させ、そしてクローンを９６ウェルプレートで単離し、そしてｈＩｇＥ結合についてスクリーニングした。図３は、タンパク質の軽または重鎖可変領域内の改変によると予想される高親和性ＭＡｂを生産するクローンを同定するためのスクリーニング手順を概説する。アッセイにはプレート酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用を採用して、高親和性ＭＡｂを生産するクローンをスクリーニングする。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４プールに由来する単一細胞を含有する９６ウェルプレートを、成長培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％のウシ胎児血清を加えた）に０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を加えて９日間成長させ、クローンが発現ベクターを保持することを確実とする。９日後、プレートはｈＩｇＥプレートＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングし、これにより９６ウェルプレートが５０μｌの１μｇ／ｍｌ ｈＩｇＥ溶液で４℃にて４時間コートされる。プレートはカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄し、そして５％の乾燥ミルクを含む１００μｌのＰＢＳ−／−で室温にて１時間ブロックした。ウェルをすすぎ、そして各細胞クローンに由来するコンディショニングした培地の１：５希釈を含有する１００μｌのＰＢＳ溶液と２時間インキュベーションする。次いでプレートはＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そしてヒツジ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した２次抗体の１：３０００希釈物を含有する５０μｌのＰＢＳ溶液と室温で１時間インキュベーションする。次いでプレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そして５０μｌのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（バイオラッド：ＢｉｏＲａｄ）と室温で１５分間インキュベーションして、各クローンにより生産された抗体の量を検出する。反応は５０μｌの５００ｍＭ 重炭酸ナトリウムを加えることにより止め、そしてバイオラッドのプレートリーダーを使用して４１５ｎｍでのＯＤにより分析する。次いでバッグラウンドの細胞（Ｈ３６対照細胞）よりも強いシグナルを現すクローンを単離し、そしてさらに特性決定し、そしてＥＬＩＳＡのデータを３連で確認するために１０ｍｌのカルチャーに拡大する。ＥＬＩＳＡも同じクローンのコンディショニングした培地（ＣＭ）で行い、各ウェル中のコンディショニングした培地内の総Ｉｇ生産を測定する。次いで上昇したＥＬＩＳＡシグナルを生成し、そして上昇した抗体レべルを有するクローンを、さらに実施例４に記載するように抗体を過剰発現し、かつ／または過剰分泌するバリアントについて分析する。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４細胞から５枚の各９６ウェルプレートの分析で、ＨＢｖｅｃ対照と比べてより高い光学密度（ＯＤ）値を有する有意な数のクローンがＭＭＲ欠損ＨＢ１３４細胞で観察されることが分かった。図４は、より高い親和性で特異的抗原（この場合ＩｇＥ）に結合する抗体を生産するＨＢ１３４クローンの代表例を示す。図４はＨＢｖｅｃ（左のグラフ）またはＨＢ１３４（右のグラフ）の９６ウェルの分析からの生データを提供し、これはＨＢ１３４プレートからの２つのクローンが、１）ＩｇＥ抗原に対する上昇した結合を導く抗体可変ドメインの遺伝的改変、または２）抗体分子の過剰生産／分泌を導く細胞宿主の遺伝的改変により、より高いＯＤの読みを有することを示す。抗−ＩｇＥＬＩＳＡでは、２つのクローン（図４に示す）がそれらのＣＭ中に、低いＯＤ値を現す周辺ウェルに類似するＩｇレベルを有することが見いだされた。これらのデータは抗体の抗原結合ドメイン内で起こった遺伝的改変が、次いで抗原に対するより高い結合を可能とすることを示唆している。
【００６１】
ＥＬＩＳＡにより測定された、より高いＯＤ値を生成するクローンをさらに遺伝子レベルで分析して、より高い結合親和性を導き、故により強いＥＬＩＳＡシグナルを生じる軽または重鎖可変領域内の突然変異を確認した。簡単に説明すると１００，０００個の細胞を回収し、そしてトリアゾール法を使用して上記のようにＲＮＡを抽出する。ＲＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを使用して製造元（ライフテクノロジーズ）により指示されるように逆転写し、そして可変軽および重鎖内に含まれる抗原結合部位についてＰＣＲで増幅する。これらの遺伝子の不均一性から以下の縮重プライマーを使用して、親のＨ３６株に由来する軽および重鎖対立遺伝子を増幅する。
【００６２】
【表５】
【００６３】
縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、そして７２℃で１分間を３５サイクル行う。生成物をアガロースゲルで分析する。予想される分子量の生成物をゲルからＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）により精製し、Ｔ−テイル化ベクターにクローン化し、そして配列決定して可変軽鎖および重鎖の野生型配列を同定する。いったん野生型配列が決定されれば、非縮重プライマーを陽性ＨＢ１３４クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅用に作成した。軽および重鎖の両方を増幅し、ゲル精製し、そして対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを使用して配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のシークエンシングにより、内因性の免疫グロブリン遺伝子であり、ＰＣＲが誘導した突然変異ではない代表的な配列データを与える。次いで配列比較のためにクローンに由来する配列を野生型の配列と比較した。免疫グロブリンの軽または重鎖内のインビボ突然変異を作成する能力の例は図５に示し、ここでＨＢ１３４クローン９２はＥＬＩＳＡによりｈＩｇＥに対して上昇したシグナルを有することが同定された。軽鎖を特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを使用して増幅した。軽鎖はＲＴ−ＰＣＲ増幅し、そして生成した産物を精製し、そして自動化ＡＢＩ３７７シークエンサーで分析した。クローンＡで示されるように、１つの残基（ＣＤＲ領域３から４上流）がＡＣＴからＴＣＴへの遺伝的変化を有し、これはちょうどＣＲＤ＃３に先行する骨格領域内のＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたした。クローンＢでは、１つの残基（ＣＤＲ領域の６上流）にＣＣＣからＣＴＣへの遺伝的変化を有し、これはＣＤＲ＃２に先行する骨格領域内にＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらした。
【００６４】
免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン遺伝子中に無作為な突然変異を作成する能力は、ハイブリドーマに限らない。Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ａ Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）は、以前に高頻度変異性ハムスター細胞を作成し、そして内因性遺伝子内に突然変異を生じる能力を示した。ヒト化抗体を生産する一般的方法は、ＭＡｂ（齧歯類宿主の免疫感作により生成された）に由来するＣＤＲ配列をヒトのＩｇ骨格に移植し、そしてキメラ遺伝子のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのトランスフェクションであり、これは次いでＣＨＯ細胞により分泌される機能的Ａｂを生産する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）アレルゲンに特異的なヒスタミン放出を抑制する抗−ＩｇＥモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２−４１３）。また本出願に記載する方法は、齧歯類細胞株、植物、酵母および原核細胞のような宿主細胞内でトランスフェクトされたＩｇ遺伝子またはキメラＩｇ内に遺伝的改変を生成するために有用でもある（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０００）植物におけるハイブリッド免疫グロブリンの集成、分泌および液胞送達（Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：１４８３−１４９４）。
【００６５】
これらのデータは、限定するわけではないが上昇した抗原結合親和性を含む強化された生化学的特性をもつ抗体を生じる構造的に改変された免疫グロブリンを同定するために成長させ、そして選択することができる高頻度変異性ハイブリドーマ、または他のＩｇ生産宿主細胞を生成する能力を証明する。さらにアミノ酸の変化（１つまたは複数）をもたらす免疫グロブリン遺伝子内のミスセンス突然変異を含む高頻度変異性クローンは、次いでインビボの安定性、抗原の排除、抗原に対するオン−オフ結合等についてさらに特性設定することができる。またクローンは後のインビボ突然変異のためにさらに拡大することができ、そして上に列挙した方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００６６】
細胞または生物全体に遺伝的突然変異を生じる化学的突然変異原の使用は、これらの作用物質が「正常」な細胞に対して毒性効果を有するので制限されている。ＭＭＲ欠損生物におけるＭＮＵのような化学的突然変異原の使用はさらに一層耐溶性であり、ＭＭＲ欠損単独よりも遺伝的突然変異に１０〜１００倍の上昇を生じる（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）キラーの正体を暴く：ＤＮＡ Ｏ（６）−メチルグアニンおよびメチル化剤の細胞傷害性（Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この方法は抗原に対する強化された結合親和性等のような改変された生化学的特性を持つ機能的Ａｂを生じることができる免疫グロブリン遺伝子またはキメラ内にさらなる突然変異を増すための方法として、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞で使用すべき化学的な突然変異原としての使用を可能とする。
【実施例４】
【００６７】
強化された抗体生産を有する抗体生産細胞の作成
上に列挙したスクリーニング法後のＨ３６およびＨＢ１３４に由来するクローンの分析により、強化された量の抗体を培地に生産する有意な数のクローンが同定された。これらクローンのサブセットは、可変領域中に含まれる抗原結合ドメイン内の突然変異の結果として、ＥＬＩＳＡにより測定されるような、より高いＩｇ結合データを与えたが、その他は「強化された」抗体生産を含むことが分かった。強化された量の分泌ＭＡｂを生産するクローンのまとめを表２に示し、ここでＨ１３４細胞に由来する有意な数のクローンがＨ３６対照細胞と比べた時に、コンディショニングした培地内に強化されたＡｂ生産を生じることが分かった。
表２．高レベルの抗体を生産するハイブリドーマの生成。ＨＢ１３４クローンは上昇したＩｇレベルについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。４８０個のクローンの分析により、有意な数のクローンがそれらのＣＭ中に上昇したＭＡｂ生産レベルを有したことが示された。定量により、これらのクローンの幾つかは、Ｈ３６細胞株に由来するクローンと比べて、強化された発現および／または分泌のいずれかにより５００ｎｇ／ｍｌより多いＭＡｂを生産した。
【００６８】
【表６】
【００６９】
コンディショニングした培地（ＣＭ）内で、より高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローンの細胞分析は、生産の増加が単に抗体を形成するポリペプチドの過剰発現を導くことができるＩｇ座での遺伝的改変によるものか、または分泌経路のメカニズムに影響を及ぼす遺伝的改変による強化された分泌であるのかを決定するために分析した。この問題に取り組むために、我々はそれらのＣＭ中に上昇したレベルの抗体を有する３個のＨＢ１３４クローンを拡大した。１０，０００個の細胞をウエスタンブロット分析用に調製し、それらの細胞内の定常状態のＩｇタンパク質レベルをアッセイした（図６）。加えてＨ３６細胞を標準参照として使用し（レーン２）、そして齧歯類繊維芽細胞（レーン１）をＩｇ陰性対照として使用した。簡単に説明すると、細胞を遠心によりペレット化し、そして３００μｌのＳＤＳ溶解バッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）中で直接溶解し、そして５分間煮沸した。ライセートのタンパク質は、Ｉｇ重鎖を分析するために４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルでの電気泳動により分離した。ゲルは、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、４０ｍＭ グリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール中でＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ミリポア：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロブロットし、そして室温で１時間、Ｔｒｉｓ緩衝化塩溶液（ＴＢＳ）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％コンデンスミルクを加えた中でブロッキングした。フィルターは１：１０，０００倍に希釈したヒツジ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体でＴＢＳバッファー中にて釣り上げ、そしてＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（ピアス：Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して化学発光により検出した。実験は２連で繰り返して再現性を確保した。図６は、クローンのサブセットが増加したＡｂ生産の原因である強化されたＩｇ生産を有する一方（レーン５）、他は対照サンプルに類似する定常状態のレベルを有したが、それでもＣＭ中のＡｂレベルは高かったことを示す代表的分析を表す。これらのデータは、ＨＢ１３４クローンのサブセットが遺伝的改変を含み、これが次いで上昇したレベルの抗体分泌を生じるメカニズムを示唆する。
【００７０】
細胞または生物全体に遺伝的突然変異を生じるための化学的突然変異原の使用は、これらの作用物質が「正常」細胞に及ぼす毒性効果により制限されている。ＭＭＲ欠損生物でのＭＮＵのような化学的突然変異原の使用はさらに一層耐溶性であり、ＭＭＲ欠損単独よりも遺伝的突然変異に１０〜１００倍の上昇を生じる（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）キラーの正体を暴く：ＤＮＡ Ｏ（６）−メチルグアニンおよびメチル化試薬の細胞傷害性（Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この方法は抗原に対する強化された結合親和性等のような改変された生化学的特性を持つ機能的Ａｂを生じることができる免疫グロブリン遺伝子またはキメラ内にさらなる突然変異を増すための方法として、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞で使用すべき化学的な突然変異原としての使用を可能とする。
【実施例５】
【００７１】
新規生産量の形質を持つハイブリドーマ細胞における遺伝的安定性の樹立
ＭＭＲの最初の段階はＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２つのタンパク質複合体に依存する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。ドミナントネガティブＭＭＲ対立遺伝子は、ヌクレオチドの切り出しおよび「正しい」ヌクレオチドを含んでなる重合に関与する下流の生化学物質による、これら複合体の形成を乱すことができる。本出願からの実施例では、ハイブリドーマ細胞株で発現した時に、短縮化ＭＭＲ対立遺伝子（ＰＭＳ１３４）ならびに完全長のヒトＰＭＳ２がＭＭＲを遮断することができ、細胞分裂毎にそのゲノム全体を通して遺伝的改変を獲得する高頻度変異性細胞株を生じる能力を示す。いったん抗体、単鎖抗体、免疫グロブリン遺伝子の過剰発現および／または抗体の強化された分泌をコードする遺伝子内に遺伝的改変を含む細胞株が生産されれば、細胞宿主のゲノムの完全性を保存することが望ましい。これは誘導性ベクターの使用により達成することができ、これによりドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子がそのようなベクターにクローン化され、Ａｂ生産細胞に導入され、そして細胞がインデューサー分子および／または条件の存在下で培養される。誘導性ベクターには限定するわけではないが、ステロイド誘導性ＭＭＴＶのような化学物質で調節されるプロモーター、テトラサイクリンで調節されるプロモーター、温度感受性ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子および温度感受性プロモーターを含む。
【００７２】
上記の結果は幾つかの結論を導く。第１にｈＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４の発現は、ハイブリドーマ細胞のマイクロサテライト不安定性の上昇をもたらす。すなわちＭＭＲ欠損性によるこの上昇したマイクロサテライト不安定性は、安定に形質導入された細胞に由来する抽出物の評価により示された。ＰＭＳ１３４の発現はＭＭＲに極性の欠損（ｐｏｌａｒ ｄｅｆｅｃｔ）をもたらし、これは５’方向からの修復を試験するために設計したヘテロ二重鎖を使用して観察されてだけであった（同じ抽出物中で３’方向からの修復に有意な欠損は観察されなかった）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。興味深いことには、ｈＭＬＨ１が欠損している細胞もＭＭＲに極性の欠損を有するが、しかしこの場合、３’方向からの修復に優先的に影響を及ぼす（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）シスプラチンおよびアドリアマイシン耐性は、卵巣腫瘍細胞株でのＭｕｔＬａおよびミスマッチ修復欠損に関連する（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｕｔＬａ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９６４５−１９６４８）。以前の実験から原核および真核細胞の両方で、別個の酵素的成分が２つの異なる方向からの修復を媒介することが知られている。Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，ｅｔ ａｌ．の結果（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）アレルゲンに特異的なヒスタミン放出を抑制する抗−ＩｇＥモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２−４１３）と組み合わせた我々の結果は、５’修復は主にｈＰＭＳ２に依存しているのに対し、３’修復は主にｈＭＬＨ１に依存していることを強く示唆する。ＰＭＳ２とＭＬＨ１との間の二量体複合体がこの方向性をどのように設定するのかは容易に構想される。また合わせた結果は、ＭＭＲにおける方向性の欠損がＭＭＲ欠損表現型を生成するに十分であることも示し、そして任意のＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子が遺伝的に改変されたハイブリドーマ細胞、またはＩｇ遺伝子産物を生産する細胞株を生成するために有用であることを示唆する。さらにそのようなＭＭＲ対立遺伝子の使用は、改変された生化学的特性を持つ遺伝的に改変されたＩｇポリペプチド、ならびに抗体分子の強化された量を生産する宿主細胞を作成するために有用となる。
【００７３】
本出願で教示する別の方法は、ＭＭＲを遮断するために使用される任意の方法を、限定するわけではないが上昇した抗原結合、強化された薬物動態学的プロフィール等のような強化された生化学的特徴を持つ遺伝的に改変された抗体を導くことができる抗体生産細胞に、高頻度変異性を作成するために行うことができる。これらの方法はまた、図４、図６に示すような上昇したＩｇ発現、かつ／または表２に示すような上昇した抗体分泌を有する抗体生産細胞を作成するためにも使用することができる。
【００７４】
加えて、我々は限定するわけではないが上昇した抗原結合親和性のような改変された生化学的特徴を導くことができるＩｇ遺伝子内の遺伝的改変を増すために、抗体生産細胞中のＭＭＲを遮断する用途を証明する（図５Ａおよび５Ｂ）。そのような細胞におけるＭＭＲの遮断は、細菌、酵母、原生生物、昆虫、齧歯類、霊長類、哺乳動物細胞およびヒトを含む任意の種に由来するドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の使用を介することができる。またＭＭＲの遮断は、ＭＭＲの生化学的経路に関与する任意の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡまたはデオキシヌクレオチドの使用を介して生成することができる。またＭＭＲの遮断は、限定するわけではないが抗体を含むＭＭＲ複合体のサブユニットを妨害するポリペプチドの使用を介することができる。最後に、ＭＭＲの遮断は限定するわけではないがＭＭＲを遮断することが示された非加水分解性ＡＴＰ類似体のような化学物質の使用を介してもよい（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬを用いた力学的な３個からなる核タンパク質複合体のＡＴＰ加水分解依存的形成（ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｅｒｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＭｕｔＳ ａｎｄ ＭｕｔＬ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３２３１）。
【実施例６】
【００７５】
高親和性抗体を生産する変異体Ｈ３６細胞株の遺伝子配列の分析
Ｈ３６変異体細胞株により生産される抗体の軽および重鎖の核酸配列を、親のクローンと比べて抗体の上昇した親和性に貢献する免疫グロブリンコード配列内の突然変異について調査した。結果を表３に示す。このデータは重および軽鎖可変ドメインの両方で、プロリン置換が抗原に対する抗体の親和性を上げる一因であることを示す。特定のホットスポットは、ＨＢ９１−４７、ＨＢ１３４ＤＲＭＡ１３およびＨＢＤＲＭＡ５５について、元のアラニンをプロリンへ変えるアミノ酸置換が起こった配列番号６のアミノ酸６位で現れる。これらの３つのクローンは９および１０位にも突然変異を有した。９位では、親のバリンがグリシンまたはアルギニンに変わり、一方、配列番号６の１０位では、親のアルギニンがリシンに両方の場合で変わった。
【００７６】
【表７】
【００７７】
遺伝的に改変された抗体は、以下の配列の差異およびコンセンサス配列を示す：
形態形成ＨＢ９１−４７重鎖（配列番号１７）、親のＨ３６重鎖（配列番号１８）およびコンセンサス重鎖配列（配列番号１９）のアミノ酸の整列
【００７８】
【表８】
【００７９】
形態形成ＨＢ９１−３７軽鎖（配列番号２０）、親のＨ３６軽鎖（配列番号２１）およびコンセンサス軽鎖配列（配列番号２２）のアミノ酸の整列
【００８０】
【表９】
【００８１】
軽鎖についてデータは、配列番号２１の２２位での軽鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）中のプロリンへの置換が、抗体の結合親和性を上昇させたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４ＭＭＲ遺伝子を安定して発現するハイブリドーマ細胞。示すのは、マウスのハイブリドーマ細胞にトランスフェクトされたＭＭＲ遺伝子の定常状態のｍＲＮＡ発現である。安定な発現は連続成長の３カ月後に見いだされた。（−）レーンは逆転写酵素が加えられなかった陰性対照を表し、そして（＋）レーンは逆転写され、そしてＭＭＲ遺伝子についてＰＣＲ増幅されたサンプル、および対照として内部ハウスキーピング遺伝子を表す。
【図２】遺伝的に高頻度変異性のハイブリドーマ細胞の作成。ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を発現する細胞中に発現された。ＰＭＳ１３４のようなドミナントネガティブ対立遺伝子および他の種に由来するＭＭＲ遺伝子の発現は、強化された生化学的特徴を持つ遺伝的に改変された免疫グロブリン遺伝子、ならびに上昇したＩｇ発現および／または分泌を持つ株を生産するために使用することができる高頻度変異性の表現型をもつ抗体生産細胞をもたらす。示した値は、ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター遺伝子内の遺伝的改変から、細胞内に含まれる機能的なβ−ガラクトシダーゼの量を反映する転換されたＣＰＲＧ基質の量を表す。より高量のβ−ガラクトシダーゼ活性は、欠損ＭＭＲによる、より高い突然変異の率を反映している。
【図３】上昇した結合活性および／または上昇した発現／分泌を有する抗体を含有する抗体生産細胞を同定するためのスクリーニング法。
【図４】上昇した結合活性を持つ遺伝的に改変された抗体の作成。示すのは、ｈＩｇＥに特異的な抗体についてスクリーニングした９６ウェルプレートからのＥＬＩＳＡの値である。高い結合値を有する２つのクローンがＨＢ１３４カルチャーで見いだされた。
【図５】抗体の可変鎖内の配列改変（ＭＭＲ欠損ＨＢ１３４抗体生産細胞における軽鎖可変領域中の突然変異）。矢印は、突然変異がＨＢ１３４細胞に由来するクローンからの細胞サブセットで発生したヌクレオチドを指す。図５Ａでは、変化は軽鎖可変領域内のＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたらす。コード配列はアンチセンス方向である。図５Ｂでは、変化は軽鎖可変領域内のＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらす。
【図６】強化された定常状態のＩｇタンパク質レベルを持つＭＭＲ欠損クローンの生成。コンディシニングした培地中に高レベルのＭＡｂ（＞５００ｎｇ／ｍｌ）を含むＨＢ１３４クローンからの重鎖免疫グロブリンのウエスタンブロットは、クローンのサブセットがより高い定常状態レベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現することを示す。Ｈ３６細胞株は、親株における定常状態レベルを測定するために対照として使用した。レーン１：繊維芽細胞（陰性対照）；レーン２：Ｈ３６細胞；レーン３：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン；レーン４：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン；レーン５：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２０００年１１月７日に出願された特許文献１の一部継続出願である２００２年９月１３日に出願された特許文献２の優先権を主張し、それらの内容は全部、引用により本明細書に編入する。
発明の技術分野
本発明は抗体の成熟および細胞生産の分野に関する。特に本発明は突然変異誘発法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
外来および／または内因性ポリペプチドの活性を遮断するために抗体を使用することは、疾患の基にある原因を処置するために効果的かつ選択的な方法を提供する。特にＦＤＡが認めたＲｅｏＰｒｏ（非特許文献１、ＲｅｏＰｒｏは質が低下したモノクローナル治療薬を再生できるか（Ｃａｎ ＲｅｏＰｒｏ ｒｅｐｏｌｉｓｈ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ？））、セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）からの抗−血小板ＭＡｂ；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（非特許文献２、ガンのモノクローナル抗体治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ）、ジェネンテェック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））からの抗−Ｈｅｒ２／ｎｅｕ ＭＡｂ；およびＳｙｎａｇｉｓ（非特許文献３、未成熟幼児および気管支肺形成異常の幼児におけるＲＳウイルスに対する筋肉内ヒト化モノクローナル抗体の安全性および薬物動態学（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、メディミューン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）により生産された抗ＲＳウイルスＭＡｂ）のような効果的な治療薬としてモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の使用がある。
【０００３】
候補タンパク質標的に対するＭＡｂを生成するための標準的方法は、当業者には知られている。簡単に説明すると、マウスまたはラットのような齧歯類に、アジュバントの存在下で精製した抗原を注射して免疫応答を生じる（非特許文献４、死体の腎臓移植におけるＯＫＴ３誘導治療の経済的分析（Ａ ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＯＫＴ３ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｄａｖｅｒｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））。陽性の免疫血清を有する齧歯類を屠殺し、そして脾細胞を単離する。単離した脾細胞をメラノーマと融合して不死化細胞株を生産させ、次いで抗体生産についてスクリーニングする。陽性の株を単離し、そして抗体生産について特性を決定する。ヒトの治療薬として齧歯類のＭＡｂを直接使用することは、齧歯類に由来する抗体で処置した有意な数の患者で、ヒト抗−齧歯類抗体（ＨＡＲＡ）応答が生じるという事実から失敗した（非特許文献５、モノクローナル抗体に対するヒトの免疫応答（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））。ＨＡＲＡの問題を回避するために、相補性決定領域（ＣＤＲ）（これは抗原結合ドメインを作成する免疫グロブリン（Ｉｇ）サブユニットの重および軽鎖可変領域内に見いだされる重要なモチーフである）の、ヒト抗体骨格への移植により、これらのキメラ分子はＨＡＲＡ応答を欠くが抗原に対するそれらの結合活性を保持することができることが分かった（非特許文献６、「抗体をヒト化する方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」）。齧歯類に由来するＭＡｂの「ヒト化」（本明細書ではＨＡｂと呼ぶ）中に存在する共通の問題は、ヒト化Ｉｇ骨格への移植でＣＤＲドメインの３次元的構造における立体配座的変化による結合親和性の損失である（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌへの特許文献１）。この問題を克服するために、さらなるＨＡｂベクターは高親和性ＨＡｂを再生するために、骨格領域および／またはＣＤＲコード領域自体の骨格内にさらなるアミノ酸残基を工学的に挿入または削除することが通常、必要となる（特許文献１）。この工程は、高親和性ＨＡｂを導くことができる変化を予測するためのプログラムの高額なコンピューターモデリングが関与する大変時間がかかる手順である。場合によってはＨＡｂの親和性はそのＭＡｂの親和性までに回復されず、それらの治療的用途を無くする。
【０００４】
抗体操作に存在する別の問題は、臨床用材料として分子を製造するために必要な安定で高収量の生産細胞株の生成である。この問題を回避するために、当業者により幾つかの方法が標準的な実践に適合させられた。１つの方法は、移植したヒト軽および重鎖を含む外因性のＩｇ融合遺伝子でトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して全抗体または単鎖抗体を生産することであり、これらは抗原結合ポリペプチドを形成する軽および重鎖の両方を含有するキメラ分子である（非特許文献７、哺乳動物細胞での組換え免疫グロブリンの高レベル生産（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ））。別の方法は、ヒトの移植した免疫系を含むトランスジェニックマウスまたはヒトＩｇ遺伝子のレパートリーを含有するトランスジェニックマウスに由来するヒトのリンパ球の使用を採用する。さらに別の方法は、ヒト抗−サルの応答を欠くと報告された霊長類のＭＡｂを生産するサルの使用を採用する（非特許文献８、モノクローナル抗体。マウスはヒトのレパートリーを生じる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｉｃｅ ｐｅｒｆｏｒｍ ａ ｈｕｍａｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ））。すべての場合で、十分な量の高親和性抗体を生成することができる細胞株の生成は、臨床試験用に十分な量の生産するには大きな限界を生じる。これらの限界により、植物のような他の組換え系の使用が、ヒト化抗体の安全で高レベルの生産を導く系として現在、調査されている（非特許文献９、トランスジェニックタバコ種子中で操作した抗体の高レベル生産および長期保存（Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｓｅｅｄｓ）。）
抗原に対して高い結合親和性を持つＨＡｂおよびＭＡｂを生じる多様な抗体配列を可変ドメイン内に生成するための方法は、それぞれより有力な治療および診断試薬を作成するために有用となるだろう。さらに全抗体分子にわたり無作為に改変されたヌクレオチドおよびポリペプチド残基の生成は、抗原性がより低く、かつ／または有益な薬理学的特性の新規試薬を生じるだろう。本明細書に記載する発明は、生化学的に活性な抗体をコードする免疫グロブリンを生産する宿主細胞の内因性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）活性を遮断することにより、インビボで抗体構造全体の無作為な遺伝的突然変異を使用することを対象とする。また本発明は強化された結合および薬理学的プロフィールを持つ抗体に関する反復されたインビボ遺伝的改変および選択法に関する。
【０００５】
加えて、増加した量の抗体を分泌することができる遺伝的に改変された宿主細胞を開発する能力は、製品開発のための細胞宿主を作成する価値ある方法も提供するだろう。本明細書に記載する方法は、ＭＭＲの封鎖を介して増加した抗体生産を生じる遺伝的に改変された細胞宿主の作成を対象とする。
【０００６】
本発明は高親和性抗体の生成および増加したレベルの抗体生産を持つ細胞株の生産を促進する。本発明の他の利点は、本明細書に記載する実施例および図面に説明する。
【参考文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，３３０，１０１号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第１０／２４３，１３０号明細書
【非特許文献１】Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２１６−１２１７，１９９６
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：４３−５１，１９９９
【非特許文献３】Ｓａｅｚ−Ｌｌｏｒｅｎｓ，Ｘ．Ｅ．，，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１７：７８７−７９１，１９９８
【非特許文献４】Ｓｈｉｅｌｄ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２７：８５５−８６４，１９９６
【非特許文献５】Ｋｈａｚａｅｌｉ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５：４２−５２，１９９４
【非特許文献６】Ｅｍｅｒｙ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｗ．Ｊ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編集）、オックスフォード大学出版、ニューヨーク、第１５９−１８３頁、１９９５
【非特許文献７】Ｒｅｆｆ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５７３−５７６，１９９３
【非特許文献８】Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８６：２５−２６，１９９７
【非特許文献９】Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｕ．，ａｎｄ Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１０９０−１０９３，１９９５
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、遺伝的に改変された抗体（単鎖分子を含む）を生成する方法およびインビトロおよびインビボで抗体を生産する細胞宿主を提供し、これにより宿主細胞により限定するわけではないが上昇した抗原結合、細胞宿主による上昇した遺伝子発現および／または強化された細胞外分泌のような所望する生化学的特性（１つまたは複数）を有する抗体を提供する。上昇した結合活性を持つ抗体または上昇した抗体生産を生じる細胞の同定法は、強化された結合特性を持つ分子を生産するＭＭＲ欠損抗体生産細胞クローン、または遺伝的に改変されて強化された量の抗体産物を生産するクローンのスクリーニングを介する。
【０００９】
本発明の使用に適する抗体生産細胞には、限定するわけではないが齧歯類、霊長類、またはヒトハイブリドーマまたはリンパ芽球；トランスフェクトされ、そして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する哺乳動物細胞；トランスフェクトされ、そして外因性Ｉｇサブユニットまたはキメラ単鎖分子を発現する植物細胞、酵母または細菌を含む。
【００１０】
すなわち本発明は、抗体を生産できる細胞にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを導入することにより、高頻度変異可能（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｌｅ）な抗体生産細胞を作成する方法を提供する。抗体を生産できる細胞には、自然に抗体を生産する細胞、および免疫グロブリンをコードする配列の導入を介して抗体を生産するように工作された細胞を含む。細胞へのポリヌクレオチド配列の導入は、トランスフェクションにより都合よく行われる。
【００１１】
また本発明は、抗体を生産できる細胞にＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２のようなドミナントネガティブミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を導入することにより、高頻度変異可能な抗体生産細胞を作成する方法も提供する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮突然変異であることができる（好ましくはコドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。本発明はミスマッチ修復遺伝子活性が抑制される方法も提供する。これは例えば、ミスマッチ修復遺伝子または転写産物に対するアンチセンス分子を使用して達成される。
【００１２】
本発明の他の態様は、動物の受精卵にミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドを導入することにより、高頻度変異可能な抗体生産細胞の作成法を提供する。これらの方法には、引き続き卵を偽妊娠のメスに移植し、これにより受精卵が成熟したトランスジェニック動物に発生することを含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子は例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２を含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮化突然変異であることができる（好ましくは、コドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。
【００１３】
さらに本発明は、抗体を製造することができ、そしてミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む培養した高頻度変異可能な哺乳動物細胞の均一組成物を提供する。ミスマッチ修復遺伝子は例えばＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ２を含むことができる。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ミスマッチ修復遺伝子の短縮化突然変異であることができる（好ましくは、コドン１３４、または野生型ＰＭＳ２のヌクレオチド４２４のチミジンでの短縮突然変異）。カルチャー中の細胞はＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１を含むことができ；あるいはヒトｍｕｔＬ相同体、またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現することができる。
【００１４】
さらに本発明は、目的の免疫グロブリンについて選択した免疫グロブリン生産細胞を培養することによる、目的の免疫グロブリン遺伝子に突然変異を生成する方法を提供し、ここで細胞はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含む。細胞から生産された免疫グロブリンの特性は、免疫グロブリン遺伝子が突然変異を有するかどうか確認するためにアッセイすることができる。アッセイは免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを分析することを対象とすることができ、あるいは免疫グロブリンのポリペプチド自体を対象とすることができる。
【００１５】
また本発明は、新規な生化学的特性（例えば免疫グロブリン産物の過剰発現および／または分泌）の生成するために、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を発現する細胞を培養し、そして細胞が目的の遺伝子内に突然変異を有するかどうかを決定するために細胞を試験することにより、抗体生産細胞における抗体生産に影響を及ぼす遺伝子中に突然変異を生成する方法を提供する。この試験には目的の免疫グロブリン遺伝子の定常発現の分析、および／または目的の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分泌されたタンパク質の量の分析を含む。また本発明は、齧歯類、非ヒト霊長類およびヒトに由来する細胞を含め、この方法により作成された原核および真核トランスジェニック細胞も包含する。
【００１６】
本発明の他の観点には、抗体生産細胞の高頻度変異性を可逆的に改変する方法を包含し、ここで誘導性プロモーターに操作可能に連結された、ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を含有するベクターが抗体生産細胞に導入される。細胞は誘導剤で処理されて、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子（これはＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であることができる）を含むことができる。あるいは細胞は、ヒトｍｕｔＬ相同体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現するように誘導することができる。別の態様では、細胞は目的の予め選択した免疫グロブリン遺伝子をコトランスフェクションすることにより抗体を生産できるようにすることができる。高頻度変異性細胞の免疫グロブリン遺伝子、またはこれらの方法により生産されたタンパク質は所望の特性について分析することができ、そして誘導は宿主細胞の遺伝的安定性が回復されるように止めることができる。
【００１７】
また本発明は遺伝的に改変された抗体を生産する方法を包含し、この方法は変異体抗体がさらなる遺伝的改変無しで一定に生産されるように、免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子（天然であるか、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子が細胞に導入されたいずれか）を含む細胞にトランスフェクトし、細胞を培養して免疫グロブリン遺伝子が突然変異となり、そして変異体免疫グロブリンを生産できるようにし、該変異体免疫グロブリンタンパク質の所望の特性についてスクリーニングし、所望の特性を有する選択した変異体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド分子を単離し、そして該変異体ポリヌクレオチドを遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトすることによる。ドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子は、ＰＭＳ２（好ましくはヒトＰＭＳ２）、ＭＬＨ１、またはＰＭＳ１であることができる。あるいは細胞はヒトｍｕｔＬ相同体またはｈＰＭＳ２の最初の１３３アミノ酸を発現することができる。
【００１８】
さらに本発明は、強化された量の抗原結合ポリペプチドを発現する遺伝的に改変された細胞株の生成法を提供する。これらの抗原に結合するポリペプチドは、例えば免疫グロブリンである。また本発明の方法は、強化された量の抗原結合ポリペプチドを分泌する遺伝的に改変された細胞株の生成法も含む。細胞株は、抗体のような抗原結合ポリペプチドを生産する細胞に強化された割合の遺伝子の高頻度変異性を提供するドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子により高頻度変異性とされる。そのような細胞は限定するわけではないがハイブリドーマを含む。強化された量の抗原結合ポリペプチドの発現は、例えば抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの強化された転写または翻訳を介して、あるいは抗原結合ポリペプチドの強化された分泌を介することができる。
【００１９】
また方法は、細胞宿主のＭＭＲ活性を遮断することにより、または免疫グロブリンをコードする遺伝子をＭＭＲ欠損細胞宿主にトランスフェクトすることにより、インビボで遺伝的に改変された抗体を作成することも提供する。
【００２０】
可変ドメイン内の遺伝的変化により抗原に対して上昇した結合特性を持つ抗体は、細胞宿主の内因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法により提供される。軽および／または重鎖内のＣＤＲ領域中の遺伝的変化により抗原に対して上昇した結合特異性を持つ抗体も、細胞宿主の内因性ＭＭＲを遮断する本発明の方法により提供される。
【００２１】
本発明は、限定するわけではないが齧歯類、霊長類およびヒトを含む宿主生物中で強化された薬物動態学的特性を有する、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞株中で遺伝的に改変された抗体の作成法を提供する。
【００２２】
本発明のこれらのおよび他の観点は、以下に記載する１以上の態様により提供される。本発明の１つの態様では、抗体生産細胞株を高頻度変異性にする方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、抗体生産細胞に導入される。細胞は遺伝子導入の結果として高頻度変異性となる。
【００２３】
本発明の別の態様では、免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする内因性遺伝子に突然変異を導入するための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。細胞はＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の導入および発現の結果として高頻度変異性となる。細胞はさらに目的の免疫グロブリン遺伝子を含んでなる。細胞を成長させ、そして目的の免疫グロブリンまたは単鎖抗体をコードする遺伝子が突然変異を有するかどうかを決定するために試験される。本発明の別の観点では、突然変異した免疫グロブリンポリペプチドまたは単鎖抗体をコードする遺伝子を単離し、そして遺伝的に安定な細胞中で発現させることができる。好適な態様では、突然変異した抗体は限定するわけではないが強化された結合特性のような少なくとも１つの所望する特性についてスクリーニングされる。
【００２４】
本発明の別の態様では、Ｉｇ軽および重鎖をコードする遺伝子または遺伝子組またはその中の組み合わせが、ＭＭＲ欠損の哺乳動物の細胞宿主に導入される。細胞を成長させ、そしてクローンを強化された結合特性を持つ抗体について分析する。
【００２５】
本発明の別の態様では、細胞の新規表現型を生成するための方法が提供される。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。細胞は遺伝子の導入の結果として高頻度変異性となる。細胞を成長させる。細胞は、新規表現型の発現に関して試験され、この場合、表現型はポリペプチドの強化された分泌である。
【００２６】
また本発明は、置換が重および／または軽鎖の可変ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸について作成された免疫グロブリン分子を含んでなる、抗原に対して上昇した親和性を有する抗体を提供する。幾つかの態様では、置換はその位置の親のアミノ酸が非極性側鎖である位置での置換である。幾つかの態様では、親のアミノ酸が非極性側鎖を有する異なるアミノ酸に置換されている。別の態様では、親のアミノ酸はプロリンまたはヒドロキシプロリンに置き換えられる。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が重および／または軽鎖可変ドメインの骨格領域に作成される。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が重鎖の第１骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換（１つまたは複数）が軽鎖の第２骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換は重鎖の第１骨格領域および軽鎖の第２骨格領域内に作成される。幾つかの態様では、置換は配列番号１８に示す重鎖の第１骨格領域の６位に作成される。幾つかの態様では、置換は配列番号２１に示す軽鎖の第２骨格領域の２２位に作成される。幾つかの態様における特異的位置の突然変異に関して、アミノ酸の置換はプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
【００２７】
また本発明は、主題の抗体の重または軽鎖の可変ドメイン内のアミノ酸を、非極性側鎖を有する別のアミノ酸に置換することを含んでなる、抗原に対する抗体の親和性を上げる方法も提供する。幾つかの態様では、その位置で元のアミノ酸の代わりにプロリンが使用される。幾つかの態様では、プロリンが非極性側鎖を有する別のアミノ酸の代わりに使用される。幾つかの態様ではアラニンおよび／またはロイシンがプロリンに置き換えられる。特定の態様では、配列番号１８に示す抗体の重鎖の第１骨格領域の６位のアミノ酸がプロリンに置き換えられる。別の態様では、配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位のアミノ酸がプロリンに置き換えられる。また本発明はこれらの方法により生産される抗体も提供する。
【００２８】
本発明で生産される抗体は、本発明の方法を使用して作成することができ、この方法はミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が抗体生産細胞に導入され、そして細胞は本明細書でさらに完全に記載されるように高頻度変異性となる。あるいは２００２年７月１８日に公開された国際公開第０２／０５４８５６号パンフレット（これは引用により本明細書に編入する）に記載されているアントラセンおよび／またはその誘導体を使用するような、ミスマッチ修復の化学的インヒビターを使用してミスマッチ修復を破壊することができる。ミスマッチ修復を破壊する化学物質で処理されたか、またはドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子を発現する細胞は高頻度変異性となる。高頻度変異性細胞により生産された抗体は上昇した親和性についてスクリーニングされ、そして上記のアミノ酸置換を含んでなる抗体は、抗原に対して上昇した親和性を表す。上昇した親和性および本明細書に記載する分子特性を有する抗体を生産する細胞は、化学的インヒビターを離脱することにより、またはドミナントネガティブ対立遺伝子の発現の不活性化を介して細胞を遺伝的に安定とすることにより、再び遺伝的に安定とすることができる。例えば誘導性プロモーターの制御下にあるドミナントネガティブ対立遺伝子は、誘導物質を離脱することにより不活性化することができる。あるいはドミナントネガティブ対立遺伝子はノックアウトすることができ、またはＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を使用し、これによりいったん遺伝的に多様な免疫グロブリンを含む細胞が樹立されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子をゲノムからスプライスすることができる。
【００２９】
別の態様では、当業者は突然変異をタンパク質に導入し、そして上記のアミノ酸置換を持つ、より高い親和性を有する抗体について選択する既知の方法を使用することができる。突然変異を導入する方法は、化学的突然変異誘発法のような無作為なものでよく、あるいは位置指定突然変異誘発法のような特異的なものでよい。無作為および特異的な突然変異誘発法は当該技術分野では周知であり、そして限定するわけではないが例えば、化学的突然変異誘発法（例えばメタンスルホネート、ジメチルスルホネート、Ｏ６−メチルベンザジン、メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）、およびエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）のような化学物質を使用する）；オリゴヌクレオチドが媒介する位置指定突然変異誘発法；アラニンスキャンニング；およびＰＣＲ突然変異誘発法（例えばＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５−１３９、位置指定突然変異誘発法；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（２）：１９４−１９６、カセット突然変異誘発法；およびＨａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（１）：４７−４８、制限選択突然変異誘発法を参照にされたい）を含む。
【００３０】
本発明のこれらのおよび他の態様は当該技術分野に、細胞および動物に強化された変異性を生成し得る方法を提供し、ならびに有利な薬物動態学的プロフィールを持つ高親和性抗体の大規模生産に潜在的に有用な突然変異を持つ細胞および動物を提供する。
【００３１】
宿主細胞の保存されたミスマッチ修復（ＭＭＲ）プロセスを利用することにより、高頻度変異性抗体生産細胞を開発する方法を開発した。そのような遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は細胞またはトランスジェニック動物に導入された時、ＤＮＡ修復の効率を下げ、そしてこれにより細胞または動物を高頻度変異性にすることにより、自然な突然変異の割合を上げる。次いで高頻度変異性細胞または動物は、目的の遺伝子中に新規突然変異を発生させるために利用することができる。限定するわけではないがハイブリドーマ；Ｉｇ軽および重鎖をコードする遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞；単鎖抗体をコードする遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞；Ｉｇ遺伝子でトランスフェクトされた真核細胞のような抗体生産細胞でのＭＭＲの遮断は、これらの細胞中で突然変異の割合を強化し、強化された抗体生産を有するクローンおよび／または上昇した抗原結合のような強化された生化学的特性を持つ遺伝的に改変された抗体を含む細胞を導くことができる。ミスマッチプルーフリーディングとも呼ばれるＭＭＲのプロセスは、細菌から哺乳動物細胞にわたる細胞でタンパク質複合体により行われる。ＭＭＲ遺伝子はそのようなミスマッチ修復複合体のタンパク質の１つをコードする遺伝子である。作用メカニズムの特定の理論に拘束されることは望まないが、ＭＭＲ複合体はヌクレオチド塩基の非相補的対合から生じるＤＮＡヘリックスのゆがみを検出すると考えられている。より新しいＤＮＡ鎖上の非相補的塩基が切り出され、そして切り出された塩基は古いＤＮＡ鎖に相補的な適切な塩基に置き換えられる。このように細胞はＤＮＡ修復における誤りの結果として起こる多くの突然変異を排除する。
【００３２】
ドミナントネガティブ対立遺伝子は、同じ細胞に野生型の対立遺伝子が存在してもＭＭＲ欠損の表現型を引き起こす。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の例は、ヒト遺伝子ｈＰＭＳ２−１３４であり、これはコドン１３４に短縮化された突然変異を持つ（配列番号１５）。突然変異は、この遺伝子産物が１３４番目のアミノ酸の位置で異常に終結することを引き起こし、Ｎ−末端１３３アミノ酸を含む短縮化されたポリペプチドを生じる。そのような突然変異は突然変異の割合に上昇を引き起こし、これはＤＮＡ複製後の細胞に蓄積する。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の発現は、野生型の対立遺伝子が存在してもミスマッチ修復活性の減損をもたらす。そのような効果を生成する任意の対立遺伝子を本発明に使用することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、ヒト、動物、酵母、細菌または他の生物の細胞から得ることができる。そのような対立遺伝子は、細胞を欠損ＭＭＲ活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。ガンを有する動物またはヒトに由来する細胞は、欠損ミスマッチ修復についてスクリーニングすることができる。結腸ガン患者に由来する細胞は特に有用である。任意の細胞に由来するＭＭＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを、野生型配列からの変異について分析することができる。ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子は、例えばｈＰＭＳ２−１３４対立遺伝子または他のＭＭＲ遺伝子のバリアントを生成することにより人工的に作成することもできる。位置指定突然変異誘発法の種々の技術を使用することができる。天然または人工であっても、そのような対立遺伝子の高頻度変異性細胞または動物を作出するために使用する適性は、１以上の野生型対立遺伝子の存在下で対立遺伝子により引き起こされるミスマッチ修復活性を試験し、それがドミナントネガティブ対立遺伝子であるかどうかを決定することにより評価できる。
【００３３】
ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子が導入された細胞または動物は高頻度変異性となる。これはそのような細胞または動物の自然発生的な突然変異率が、そのような対立遺伝子が無い細胞または動物に比べて上昇することを意味する。自然発生的な突然変異率の上昇の程度は、正常な細胞または動物の少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍または１００倍であることができる。限定するわけではないがメタンスルホネート、ジメチルスルホネート、Ｏ６−メチルベンザジン、ＭＮＵ、ＥＮＵ等のような化学的な突然変異原の使用は、ＭＭＲ欠損細胞で使用されて、ＭＭＲ欠損自体のさらに１０〜１００倍に率を上げることができる。
【００３４】
本発明の１つの観点では、ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ形をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する。遺伝子はＭＭＲ複合体の一部であるタンパク質をコードするドミナントネガティブ対立遺伝子、例えばＰＭＳ２、ＰＭＳ１、ＭＬＨ１またはＭＳＨ２であることができる。ドミナントネガティブ対立遺伝子は自然に生じるか、または研究室で作成することができる。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的に合成されたポリヌクレオチドの状態であることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチドは、構成的に活性なプロモーターセグメント（限定するわけではないがＣＭＶ、ＳＶ４０、延長因子またはＬＴＲ配列のような）を含む発現ベクターに、またはドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の発現を調節することができるステロイド誘導性ｐＩＮＤベクター（インビトロジェン：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような誘導性プロモーター配列にクローン化することができる。ポリヌクレオチドはトランスフェクションにより細胞に導入することができる。
【００３６】
本発明の別の観点に従い、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子、Ｉｇ遺伝子の組またはＩｇ遺伝子の全部または一部を含有するキメラ遺伝子を、ＭＭＲ欠損細胞宿主にトランスフェクトし、細胞を成長させ、そして新規な生化学的特性を持つ遺伝的に改変されたＩｇ遺伝子を含有するクローンについてスクリーニングすることができる。ＭＭＲ欠損細胞はヒト、霊長類、哺乳動物、齧歯類、植物、酵母または原核生物界の細胞であることができる。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードする突然変異した遺伝子を個々のクローンから単離し、そして遺伝的に安定な細胞（すなわち正常ＭＭＲを持つ細胞）に導入して、新規な生化学的特性を持つＩｇを一定して生産するクローンを提供することができる。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードするＩｇ遺伝子の単離法は、当該技術分野で知られている任意の方法でよい。新規な生化学的特性を持つＩｇをコードする単離されたポリヌクレオチドの導入も、限定するわけではないが新規な生化学的特性を持つＩｇをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターのトランスフェクションを含め、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して行うことができる。Ｉｇ遺伝子、１組のＩｇ遺伝子またはＩｇ遺伝子の全部または一部を含有するキメラ遺伝子のＭＭＲ欠損宿主細胞へのトランスフェクションに代えて、そのようなＩｇ遺伝子はドミナントネガティブミスマッチ修復遺伝子をコードする遺伝子と同時に遺伝的に安定な細胞にトランスフェクトして、細胞を高頻度変異性にすることができる。
【００３７】
トランスフェクションはポリヌクレオチドが細胞に導入される任意のプロセスである。トランスフェクションのプロセスは生きている動物で、例えば遺伝子治療用のベクターの使用して行うことができ、あるいはインビトロで例えばカルチャー中の１以上の単離された細胞の懸濁液を使用して行うことができる。細胞は、例えばヒトまたは他の霊長類、哺乳動物または他の脊椎動物、無脊椎動物から単離された細胞を含め任意の種類の真核細胞、および原生生物、酵母または細菌のような単細胞生物であることができる。
【００３８】
一般に、トランスフェクションは細胞の懸濁液または１つの細胞を使用して行われるが、他の方法もトランスフェクトされた細胞を成長させ、そして利用できるように、処理された細胞または組織の十分な画分がポリヌクレオチドを包含する限り適用することができる。ポリヌクレオチドのタンパク質産物は、細胞中で一時的に、または安定に発現され得る。トランスフェクションの技術は周知である。ポリヌクレオチドを導入するために利用可能な技術には、限定するわけではないが電気穿孔、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用および目的の細胞との融合にポリヌクレオチドと一緒に脂質のパッケージングを含む。いったん細胞がＭＭＲ遺伝子でトランスフェクトされれば、細胞を培養で成長させ、そして再生させることができる。トランスフェクションが安定である場合、遺伝子が多くの細胞世代で一定レベルで発現されるので、細胞株を生じる。
【００３９】
単離された細胞は、個々の細胞に機械的に分離し、そしてそれらを適当な細胞培養基（酵素、例えばコラゲナーゼまたはトリプシンでの組織の前処理を含むか、または含まない）に移すことにより、ヒトまたは動物の組織から得られる細胞である。そのような単離された細胞は典型的には他の種類の細胞の不存在下で培養される。ミスマッチ修復遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子の導入について選択された細胞は、初代細胞培養または不死化細胞株の状態で真核生物に由来することができ、あるいは単細胞生物の懸濁液に由来することができる。
【００４０】
ＭＭＲタンパク質のドミナントネガティブ形をコードするポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を作出することにより動物のゲノムに導入することができる。トランスジェニック動物を作出するために、適切な技術を利用できる動物は任意の種でよい。例えばトランスジェニック動物は家畜、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等から；組換えタンパク質の生産に使用される動物、例えば乳に組換えポリペプチドを発現するウシ、ブタまたはヤギから；あるいは調査または製品試験用の実験動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等から調製することができる。ＭＭＲ欠損であると決定された細胞株は、次いで単鎖抗体をコードする全体の、完全な免疫グロブリン遺伝子および／またはキメラ遺伝子を、ＭＭＲ欠損動物の任意の組織に由来するＭＭＲ欠損細胞に導入することにより、遺伝的に改変された免疫グロブリン遺伝子をインビトロで生産するための供給源として使用される。
【００４１】
いったんトランスフェクトされた細胞株またはトランスジェニック動物のコロニーが生産されれば、これは１以上の目的遺伝子に新規な突然変異を作成するために使用することができる。目的の遺伝子は、細胞株またはトランスジェニック動物により自然に保有される任意の遺伝子であるか、あるいは細胞株またはトランスジェニック動物に導入することができる。突然変異を誘導するためにそのような細胞または動物を使用する利点は、暴露した物体および作業者の両方に２次的な有害効果を有し得る突然変異原性の化学物質または照射に細胞または動物を暴露する必要が無い点である。しかし化学的突然変異原はＭＭＲ欠損と組み合わせて使用することができ、これはそのような突然変異原の不明瞭なメカニズムによる毒性を低くする。次いで高頻度変異性動物を育種し、そして遺伝的に変異性（ｖａｒｉａｂｌｅ）の細胞を生産するために有用な新規細胞株を同定するために、単離し、そしてクローン化され得る遺伝的に変異性のＢ細胞を生産する細胞について選択することができる。いったん新たな形質が同定されれば、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、当業者により使用されている技術により対立遺伝子を直接ノックアウトすることにより、または所望の形質および安定なゲノムを持つ子孫を選択するためにドミナントネガティブ対立遺伝子を欠く仲間（ｍａｔｅ）に育種することにより除去することができる。別の選択は、ＣＲＥ−ＬＯＸ発現系を使用することであり、これによりいったん遺伝的に多様な免疫グロブリンのプロフィールが含まれる動物が樹立されれば、ドミナントネガティブ対立遺伝子は動物のゲノムからスプライスされる。さらに別の選択は、コルチコステロイドの存在下で外因性遺伝子を発現するステロイドで誘導するｐＩＮＤ（インビトロジェン）またはｐＭＡＭ（クロンテック：Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）ベクターのような誘導性ベクターの使用である。
【００４２】
突然変異は細胞または動物の遺伝子型の改変を分析することにより、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは目的の遺伝子に関連するアミノ酸の配列を調査することにより検出することができる。突然変異は抗体力価の生成をスクリーニングすることにより検出することができる。変異体ポリペプチドは、変異体遺伝子によりコードされるタンパク質の電気泳動的移動度、分光光学的特性または他の物理的もしくは構造的特性の変化を同定することにより検出することができる。またタンパク質の改変された機能をｉｎ ｓｉｔｕで、単離された状態で、またはモデル系でスクリーニングすることもできる。目的遺伝子の機能に関連する細胞または動物の任意の特性、限定するわけではないがＩｇ分泌の変化についてスクリーニングすることができる。
【００４３】
ミスマッチ修復タンパク質をコードする核酸配列の例には、限定するわけではないが以下を含む：マウスＰＭＳ２（配列番号６）；ヒトＰＭＳ２（配列番号８）；ヒトＰＭＳ１（配列番号１０）ヒトＭＳＨ２（配列番号１２）；ヒトＭＬＨ１（配列番号１４）；およびヒトＰＭＳ２−１３４（配列番号１６）。対応するアミノ酸配列は：マウスＰＭＳ２（配列番号５）；ヒトＰＭＳ２（配列番号７）；ヒトＰＭＳ１（配列番号９）ヒトＭＳＨ２（配列番号１１）；ヒトＭＬＨ１（配列番号１３）；およびヒトＰＭＳ２−１３４（配列番号１５）。
【００４４】
抗原に対して上昇した親和性を示す変異体抗体を配列決定し、そして野生型（ＷＴ）Ｈ３６の親の抗体の配列と比較する。プロリンへのアミノ酸の改変は、免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖のいずれかの可変領域に導入された時、抗原に対する親和性を上げる効果を有することが見い出された。操作の特定の理論に拘束されることは望まないが、プロリンは局所化された剛性の領域を導入し、そして免疫グロブリン分子、特に抗原結合部位（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）の回りの領域に安定性を与えると考えられている。
【００４５】
このように本発明は、可変ドメイン重および／または軽鎖のアミノ酸をプロリンまたはヒドロキシプロリン（集合的に「プロリン」と呼ぶ）に置き換えることを含んでなる、抗体の親和性を上げる方法を提供する。幾つかの態様では、プロリンの置換は重鎖可変ドメイン内にある。幾つかの態様では、プロリンの置換は軽鎖可変ドメイン内にある。他の態様では、プロリンの置換は免疫グロブリン分子の可変ドメインの重鎖および軽鎖の両方にある。幾つかの態様では、非極性側鎖を有する他のアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン）に代えてプロリンを使用する。幾つかの態様では、非極性側鎖を有するアミノ酸と非極性側鎖を有する別のアミノ酸とのさらなる交換も、抗原に対する抗体の上昇した親和性を付与することができる。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は重鎖の骨格領域内にある。他の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の骨格領域内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重および軽鎖の両方の骨格領域内にある。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第１骨格領域（ＦＲ１）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第３骨格領域（ＦＲ３）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は重鎖の第４骨格領域（ＦＲ４）内にある。幾つかの態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第１骨格領域（ＦＲ１）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第３骨格領域（ＦＲ３）内にある。別の態様では、アミノ酸の置換は軽鎖の第４骨格領域（ＦＲ４）内にある。
【００４６】
本発明の特定の態様では、プロリンが配列番号１８の６位でアラニンに換えて使用される。別の態様では、プロリンは配列番号１８の６位でアラニンに換えて、および配列番号１８の９位でグリシンに換えて使用され、かつ／または配列番号１８の１０位のリシンは非極性側鎖を有するアミノ酸（好ましくはそれぞれバリンおよびアルギニン）に置換される。別の態様では、プロリンが配列番号２１の２２位でロイシンに換えて使用される。本発明の背景に関するさらなる情報について、以下の参考文献を調べることができ、これらの各々は全部、引用により本明細書に編入する。
【００４７】
【表１】
【００４８】
【表２】
【００４９】
【表３】
【００５０】
上記開示は本発明を全般的に説明する。より完全な理解は、具体的説明のためにのみ提供され、そして本発明の範囲を限定するものではない以下の具体的実施例を参考にすることにより得ることができる。
【実施例１】
【００５１】
ハイブリドーマ細胞中でのドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の安定な発現
Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異はドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）により、以前に別のＭＭＲプロフィシェント細胞でのドミナントネガティブ対立遺伝子の発現がこれらの宿主細胞をＭＭＲ欠損にできることが示された。ＭＭＲ欠損細胞の作成は、宿主生物の子孫の全ゲノムを通して遺伝的な改変の生成を導くことができ、改変された特性の生物化学物質を生産することができる遺伝的に改変された子孫または姉妹群を生じる。本出願は抗体生産細胞でのドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の使用を教示し、そのような細胞には限定するわけではないがヒトの免疫グロブリン遺伝子産物を生産する齧歯類ハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマ、キメラ齧歯類細胞、免疫グロブリン遺伝子を発現するヒト細胞、単鎖抗体を生産する哺乳動物細胞、および哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子または単鎖抗体内に含まれるようなキメラ免疫グロブリン分子を生産する原核細胞を含む。抗体を生産するために使用される上記の細胞発現系は、抗体治療薬の分野の当業者には周知である。
【００５２】
ＭＭＲ遺伝子のドミナントネガティブ対立遺伝子を使用してＭＭＲ欠損ハイブリドーマを作成する能力を示すために、我々は最初にヒトＩｇＥタンパク質に対する抗体を生産することが知られているマウスのハイブリドーマ細胞株を、ヒトＰＭＳ２（ＨＢＰＭＳ２と呼ぶ細胞株）、本明細書でＰＭＳ１３４と呼ぶ以前に公開されたドミナントネガティブＰＭＳ２変異体（ＨＢ１３４と呼ぶ細胞株）を含むか、または挿入物が無い（ＨＢｖｅｃと呼ぶ細胞株）発現ベクターでトランスフェクトした。結果はＰＭＳ１３４変異体が正に強固なドミナントネガティブ効果を発揮することができ、ＭＭＲ欠損の生化学的および遺伝的発現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）をもたらすことを示した。予期しなかったことは、完全長のＰＭＳ２もより低いＭＭＲ活性を生じたが、空ベクターを含有する細胞には効果は無かったという知見であった。方法の簡単な説明を以下に提供する。
【００５３】
ＭＭＲ能力を有する（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）マウスＨ３６ハイブリドーマ細胞株を、種々のｈＰＭＳ２発現プラスミドに加えてＭＭＲ活性を評価するためのレポーター構築物でトランスフェクトした。ＭＭＲ遺伝子をｐＥＦ発現ベクターにクローン化し、またこのベクターはクローニング部位の上流に延長因子プロモーターを、次いで哺乳動物のポリアデニル化シグナルを含む。このベクターは、このプラスミドを保持している細胞の選択を可能にするＮＥＯｒ遺伝子も含む。簡単に説明すると、細胞は製造元のプロトコール（ライフテクノロジーズ：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、ポリリポソームを使用して１μｇの各ベクターでトランスフェクトした。次いで細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中で１０日間選択し、そしてＧ４１８耐性細胞を一緒にプールして遺伝子発現に関して分析した。ｐＥＦ構築物はＥＦ遺伝子のエキソン１をエキソン２から分けるイントロンを含み、これはポリリンカークローニング部位の５’末端に並置されている。これにより迅速な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で、スプライス生成物を発現している細胞のスクリーニングができるようになる。１７日で１００，０００個の細胞が単離され、そしてそれらのＲＮＡはすでに記載されたトリゾール法を使用して抽出された（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９５）ＰＭＳ２の５’領域の分析により、異種性の転写産物および新規な重複遺伝子が明らかとなる（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ５’ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳ２ ｒｅｖｅａｌｓ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ａｎｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９：３２９−３３４）。ＲＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジーズ）を使用して逆転写され、そしてＥＦ遺伝子（５’−ｔｔｔ ｃｇｃ ａａｃ ｇｇｇ ｔｔｔ ｇｃｃ ｇ−３’）（配列番号２３）のエキソン１に位置するセンスプライマー、および公開されたヒトＰＭＳ２のｃＤＮＡのｎｔ２８３で中央に位置するアンチセンスプライマー（５’−ｇｔｔ ｔｃａ ｇａｇ ｔｔａ ａｇｃ ｃｔｔ ｃｇ−３’）（配列番号２４）を使用してＰＣＲ増幅され、これは完全長ならびにＰＭＳ１３４遺伝子発現の両方を検出するだろう。反応は以前に記載されたバッファーおよび条件を使用して（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ Ｎ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ヒトＰＭＳ２遺伝子ファミリーのゲノム組織化（Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＰＭＳ２ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１９５−２０６）、以下の増幅パラメーターを使用して行った：９４℃で３０秒間、５２℃で２分、７２℃で２分間を３０サイクル。反応はアガロースゲルで分析した。図１は安定に形質導入されたＨ３６細胞におけるＰＭＳ発現の代表例を示す。
【００５４】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の発現は、タンパク質のＮ−末端に位置する最初の２０個のアミノ酸に対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットを介して、以前に記載された手順（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブ変異体の表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）（データは示さず）に従い確認された。
【実施例２】
【００５５】
ｈＰＭＳ１３４はハイブリドーマ細胞にＭＭＲ活性の欠損および高頻度変異性を引き起こす
ＭＭＲ欠損の証明は、宿主細胞のゲノム中の不安定なマイクロサテライト反復の生成である。この表現型はマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＭＩ）と呼ばれる（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．（１９９４）ミスマッチ修復、遺伝的安定性およびガン（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１９５９−１９６０）；Ｐａｌｏｍｂｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ミスマッチ修復およびガン（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ）Ｎａｔｕｒｅ ３６：４１７）。ＭＩは、宿主細胞の全ゲノムを通した反復的なモノ−、ジ−および／またはトリ−ヌクレオチド反復配列内の欠失および／または挿入からなる。真核細胞の徹底的な遺伝子の分析により、ＭＩを生じることができる生化学的欠損は欠損ＭＭＲだけであることが見いだされた（Ｓｔｒａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）ＤＮＡミスマッチ修復に影響を及ぼす突然変異による酵母の単純な反復的ＤＮＡ域の脱安定化（Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：２７４−２７６；Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）マイクロサテライトミューテーター表現型のガン（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）ヒトの発癌現象におけるミスマッチ修復欠損（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９−４９４）。欠損ＭＭＲがＭＩを促進させるという独自の観点から、これを宿主細胞中のＭＭＲ活性の損失を監視するための生化学マーカーとして使用する（Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｍ．（１９９６）マイクロサテライトミューテーター表現型のガン（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｕｔａｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７５−６８４；Ｅｓｈｌｅｍａｎ Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）ヒトの発癌現象におけるミスマッチ修復欠損（Ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：１４８９−４９４；Ｌｉｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）家族性結腸直腸ガンにおけるＤＮＡミスマッチ修復遺伝子中の突然変異の予測因子としてのマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２７：１７−２５）。
【００５６】
真核細胞でＭＭＲ欠損を検出するために使用する方法は、フレームシフトによりそのリーディングフレームを破壊するコード領域中に挿入されたポリヌクレオチド反復を有するレポーター遺伝子を採用することである。ＭＭＲが欠損している場合、レポーター遺伝子はポリヌクレオチド反復内に無作為の突然変異（すなわち挿入および／または欠失）を獲得し、オープンリーディングフレームを持つレポーターを含むクローンを生じる。我々はＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢＰＭＳ１３４細胞でＭＭＲ活性について測定するために、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子の使用を採用した。レポーター構築物はｐＣＡＲ−ＯＦを使用し、これはハイグロマイシン耐性（ＨＹＧ）遺伝子に、そのコード領域の５’末端に２９ｂｐのフレーム外ポリ−ＣＡ域を含むβガラクトシダーゼ遺伝子を加えて含む。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターはフレーム回復突然変異（すなわち挿入または欠失）がトランスフェクション後に生じなければ、β−ガラクトシダーゼ活性を生じないだろう。ＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢ１３４細胞はそれぞれ、実施例１に記載されたプロトコールに従いｐＣＡＲ−ＯＦベクターを用いて二連反応でトランスフェクトされた。細胞は０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．５ｍｇ／ｍｌのＨＹＧ中で選択され、ＭＭＲエフェクターおよびｐＣＡＲ−ＯＦレポータープラスミドの両方を保持している細胞について選択された。ｐＣＡＲベクターでトランスフェクトされたすべてのカルチャーは、類似した数のＨＹＧ／Ｇ４１８耐性細胞を生じた。次いでカルチャーを拡大し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について、ｉｎ ｓｉｔｕならびに細胞抽出物の生化学的分析により試験した。ｉｎ ｓｉｔｕ分析について、１００，０００個の細胞を回収し、そして１％グルタルアルデヒドで固定化し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして２４ウェルプレート中の１ｍｌのＸ−ｇａｌ基質溶液［０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．３ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、３．３ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．２％Ｘ−Ｇａｌ］中で３７℃にて２時間インキュベーションした。反応は５００ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液で止め、そして分析のために顕微鏡スライドに移した。ＭＭＲ不活性化を評価するために、青（β−ガラクトシダーゼ陽性細胞）または白（β−ガラクトシダーゼ陰性細胞）について、各２００細胞の３つの視野をカウントした。表１はこれらの実験結果を示す。ＨＢｖｅｃ細胞にはβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞は観察されなかったが、ＨＢ１３４カルチャーでは視野あたり１０％の細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であり、そしてＨＢＰＭＳ２カルチャーでは視野あたり２％の細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。
【００５７】
細胞抽出物は上記のカルチャーから調製して、以前に記載されたような生化学アッセイ（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｕｎファミリーの員、ｃ−ＪｕｎおよびＪＵＮＤはＡｐ１様要素を介してヒトｃ−ｍｙｂプロモーターをトランス活性化する（Ｔｈｅ Ｊｕｎ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒｓ，ｃ−ＪＵＮ ａｎｄ ＪＵＮＤ，ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃ−ｍｙｂ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ａｎ Ａｐ１ ｌｉｋｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１９６６５−１９６７２）を使用してβ−ガラクトシダーゼを測定した。簡単に説明すると、１００，０００個の細胞を集め、遠心し、そして２００μｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁した。細胞は３回の凍結／解凍により溶解し、そして細胞屑を除くために１４，０００ｒｐｍでのミクロ遠心後に上清を集めた。タンパク質含量はＯＤ２８０での分光光度的分析により測定した。生化学的アッセイについては、２０μｇのタンパク質を４５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ ＮａＰＯ４および０．６ｍｇ／ｍｌクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するバッファーに加えた。反応は１時間インキュベーションし、０．５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３を加えることにより終了し、そして５７６ｎｍで分光法により分析した。Ｈ３６細胞溶解物はバックグラウンドを引くために使用した。図２は種々の細胞株に由来する抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。示したように、ＨＢ１３４細胞が最高量のβ−ガラクトシダーゼを生産し、一方、ｐＣＡＲ−ＯＦを含有するＨＢｖｅｃ細胞には活性が見いだされなかった。これらのデータは、ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子を使用したＭＭＲ欠損ハイブリドーマ細胞を作成する能力を示す。
【００５８】
表１。ｐＣＡＲ−ＯＦレポーターベクターでトランスフェクトしたＨＢｖｅｃ、ＨＢＰＭＳ２およびＨＢ１３４細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現。細胞はｐＣＡＲ−ＯＦβ−ガラクトシダーゼレポータープラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞はハイグロマイシンおよびＧ４１８で選択し、拡大し、そしてＸ−ｇａｌ溶液で染色してβ−ガラクトシダーゼ活性について測定した（青色に着色された細胞）。各２００細胞の３視野を顕微鏡で分析した。以下の結果はこれらの実験の平均＋／−標準偏差を表す。
【００５９】
【表４】
【実施例３】
【００６０】
より高い結合親和性を有する抗体を生産するハイブリドーマクローンおよび／または上昇した免疫グロブリン生産を同定するスクリーニング法
本明細書に提示する方法の応用は、改変された生化学的特性を持つ抗体を生じる免疫グロブリン遺伝子内の遺伝的改変を作成するために、ＭＭＲ欠損ハイブリドーマまたは他の免疫グロブリン生産細胞の使用である。この応用の具体的説明はこの実施例内に示され、これにより抗−ヒト免疫グロブリン型Ｅ（ｈＩｇＥ）ＭＡｂを生産するＭＭＲ欠損細胞株であるＨＢ１３４ハイブリドーマ（実施例１を参照にされたい）を２０世代成長させ、そしてクローンを９６ウェルプレートで単離し、そしてｈＩｇＥ結合についてスクリーニングした。図３は、タンパク質の軽または重鎖可変領域内の改変によると予想される高親和性ＭＡｂを生産するクローンを同定するためのスクリーニング手順を概説する。アッセイにはプレート酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の使用を採用して、高親和性ＭＡｂを生産するクローンをスクリーニングする。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４プールに由来する単一細胞を含有する９６ウェルプレートを、成長培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％のウシ胎児血清を加えた）に０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を加えて９日間成長させ、クローンが発現ベクターを保持することを確実とする。９日後、プレートはｈＩｇＥプレートＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングし、これにより９６ウェルプレートが５０μｌの１μｇ／ｍｌ ｈＩｇＥ溶液で４℃にて４時間コートされる。プレートはカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ−／−）で３回洗浄し、そして５％の乾燥ミルクを含む１００μｌのＰＢＳ−／−で室温にて１時間ブロックした。ウェルをすすぎ、そして各細胞クローンに由来するコンディショニングした培地の１：５希釈を含有する１００μｌのＰＢＳ溶液と２時間インキュベーションする。次いでプレートはＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そしてヒツジ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した２次抗体の１：３０００希釈物を含有する５０μｌのＰＢＳ溶液と室温で１時間インキュベーションする。次いでプレートをＰＢＳ−／−で３回洗浄し、そして５０μｌのＴＭＢ−ＨＲＰ基質（バイオラッド：ＢｉｏＲａｄ）と室温で１５分間インキュベーションして、各クローンにより生産された抗体の量を検出する。反応は５０μｌの５００ｍＭ 重炭酸ナトリウムを加えることにより止め、そしてバイオラッドのプレートリーダーを使用して４１５ｎｍでのＯＤにより分析する。次いでバッグラウンドの細胞（Ｈ３６対照細胞）よりも強いシグナルを現すクローンを単離し、そしてさらに特性決定し、そしてＥＬＩＳＡのデータを３連で確認するために１０ｍｌのカルチャーに拡大する。ＥＬＩＳＡも同じクローンのコンディショニングした培地（ＣＭ）で行い、各ウェル中のコンディショニングした培地内の総Ｉｇ生産を測定する。次いで上昇したＥＬＩＳＡシグナルを生成し、そして上昇した抗体レべルを有するクローンを、さらに実施例４に記載するように抗体を過剰発現し、かつ／または過剰分泌するバリアントについて分析する。ＨＢｖｅｃまたはＨＢ１３４細胞から５枚の各９６ウェルプレートの分析で、ＨＢｖｅｃ対照と比べてより高い光学密度（ＯＤ）値を有する有意な数のクローンがＭＭＲ欠損ＨＢ１３４細胞で観察されることが分かった。図４は、より高い親和性で特異的抗原（この場合ＩｇＥ）に結合する抗体を生産するＨＢ１３４クローンの代表例を示す。図４はＨＢｖｅｃ（左のグラフ）またはＨＢ１３４（右のグラフ）の９６ウェルの分析からの生データを提供し、これはＨＢ１３４プレートからの２つのクローンが、１）ＩｇＥ抗原に対する上昇した結合を導く抗体可変ドメインの遺伝的改変、または２）抗体分子の過剰生産／分泌を導く細胞宿主の遺伝的改変により、より高いＯＤの読みを有することを示す。抗−ＩｇＥＬＩＳＡでは、２つのクローン（図４に示す）がそれらのＣＭ中に、低いＯＤ値を現す周辺ウェルに類似するＩｇレベルを有することが見いだされた。これらのデータは抗体の抗原結合ドメイン内で起こった遺伝的改変が、次いで抗原に対するより高い結合を可能とすることを示唆している。
【００６１】
ＥＬＩＳＡにより測定された、より高いＯＤ値を生成するクローンをさらに遺伝子レベルで分析して、より高い結合親和性を導き、故により強いＥＬＩＳＡシグナルを生じる軽または重鎖可変領域内の突然変異を確認した。簡単に説明すると１００，０００個の細胞を回収し、そしてトリアゾール法を使用して上記のようにＲＮＡを抽出する。ＲＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを使用して製造元（ライフテクノロジーズ）により指示されるように逆転写し、そして可変軽および重鎖内に含まれる抗原結合部位についてＰＣＲで増幅する。これらの遺伝子の不均一性から以下の縮重プライマーを使用して、親のＨ３６株に由来する軽および重鎖対立遺伝子を増幅する。
【００６２】
【表５】
【００６３】
縮重オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、そして７２℃で１分間を３５サイクル行う。生成物をアガロースゲルで分析する。予想される分子量の生成物をゲルからＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）により精製し、Ｔ−テイル化ベクターにクローン化し、そして配列決定して可変軽鎖および重鎖の野生型配列を同定する。いったん野生型配列が決定されれば、非縮重プライマーを陽性ＨＢ１３４クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅用に作成した。軽および重鎖の両方を増幅し、ゲル精製し、そして対応するセンスおよびアンチセンスプライマーを使用して配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のシークエンシングにより、内因性の免疫グロブリン遺伝子であり、ＰＣＲが誘導した突然変異ではない代表的な配列データを与える。次いで配列比較のためにクローンに由来する配列を野生型の配列と比較した。免疫グロブリンの軽または重鎖内のインビボ突然変異を作成する能力の例は図５に示し、ここでＨＢ１３４クローン９２はＥＬＩＳＡによりｈＩｇＥに対して上昇したシグナルを有することが同定された。軽鎖を特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを使用して増幅した。軽鎖はＲＴ−ＰＣＲ増幅し、そして生成した産物を精製し、そして自動化ＡＢＩ３７７シークエンサーで分析した。クローンＡで示されるように、１つの残基（ＣＤＲ領域３から４上流）がＡＣＴからＴＣＴへの遺伝的変化を有し、これはちょうどＣＲＤ＃３に先行する骨格領域内のＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたした。クローンＢでは、１つの残基（ＣＤＲ領域の６上流）にＣＣＣからＣＴＣへの遺伝的変化を有し、これはＣＤＲ＃２に先行する骨格領域内にＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらした。
【００６４】
免疫グロブリン遺伝子またはキメラ免疫グロブリン遺伝子中に無作為な突然変異を作成する能力は、ハイブリドーマに限らない。Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ａ Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）は、以前に高頻度変異性ハムスター細胞を作成し、そして内因性遺伝子内に突然変異を生じる能力を示した。ヒト化抗体を生産する一般的方法は、ＭＡｂ（齧歯類宿主の免疫感作により生成された）に由来するＣＤＲ配列をヒトのＩｇ骨格に移植し、そしてキメラ遺伝子のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのトランスフェクションであり、これは次いでＣＨＯ細胞により分泌される機能的Ａｂを生産する（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）アレルゲンに特異的なヒスタミン放出を抑制する抗−ＩｇＥモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２−４１３）。また本出願に記載する方法は、齧歯類細胞株、植物、酵母および原核細胞のような宿主細胞内でトランスフェクトされたＩｇ遺伝子またはキメラＩｇ内に遺伝的改変を生成するために有用でもある（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２０００）植物におけるハイブリッド免疫グロブリンの集成、分泌および液胞送達（Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｖａｃｕｏｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３：１４８３−１４９４）。
【００６５】
これらのデータは、限定するわけではないが上昇した抗原結合親和性を含む強化された生化学的特性をもつ抗体を生じる構造的に改変された免疫グロブリンを同定するために成長させ、そして選択することができる高頻度変異性ハイブリドーマ、または他のＩｇ生産宿主細胞を生成する能力を証明する。さらにアミノ酸の変化（１つまたは複数）をもたらす免疫グロブリン遺伝子内のミスセンス突然変異を含む高頻度変異性クローンは、次いでインビボの安定性、抗原の排除、抗原に対するオン−オフ結合等についてさらに特性設定することができる。またクローンは後のインビボ突然変異のためにさらに拡大することができ、そして上に列挙した方法を使用してスクリーニングすることができる。
【００６６】
細胞または生物全体に遺伝的突然変異を生じる化学的突然変異原の使用は、これらの作用物質が「正常」な細胞に対して毒性効果を有するので制限されている。ＭＭＲ欠損生物におけるＭＮＵのような化学的突然変異原の使用はさらに一層耐溶性であり、ＭＭＲ欠損単独よりも遺伝的突然変異に１０〜１００倍の上昇を生じる（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）キラーの正体を暴く：ＤＮＡ Ｏ（６）−メチルグアニンおよびメチル化剤の細胞傷害性（Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この方法は抗原に対する強化された結合親和性等のような改変された生化学的特性を持つ機能的Ａｂを生じることができる免疫グロブリン遺伝子またはキメラ内にさらなる突然変異を増すための方法として、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞で使用すべき化学的な突然変異原としての使用を可能とする。
【実施例４】
【００６７】
強化された抗体生産を有する抗体生産細胞の作成
上に列挙したスクリーニング法後のＨ３６およびＨＢ１３４に由来するクローンの分析により、強化された量の抗体を培地に生産する有意な数のクローンが同定された。これらクローンのサブセットは、可変領域中に含まれる抗原結合ドメイン内の突然変異の結果として、ＥＬＩＳＡにより測定されるような、より高いＩｇ結合データを与えたが、その他は「強化された」抗体生産を含むことが分かった。強化された量の分泌ＭＡｂを生産するクローンのまとめを表２に示し、ここでＨ１３４細胞に由来する有意な数のクローンがＨ３６対照細胞と比べた時に、コンディショニングした培地内に強化されたＡｂ生産を生じることが分かった。
表２．高レベルの抗体を生産するハイブリドーマの生成。ＨＢ１３４クローンは上昇したＩｇレベルについてＥＬＩＳＡによりアッセイした。４８０個のクローンの分析により、有意な数のクローンがそれらのＣＭ中に上昇したＭＡｂ生産レベルを有したことが示された。定量により、これらのクローンの幾つかは、Ｈ３６細胞株に由来するクローンと比べて、強化された発現および／または分泌のいずれかにより５００ｎｇ／ｍｌより多いＭＡｂを生産した。
【００６８】
【表６】
【００６９】
コンディショニングした培地（ＣＭ）内で、より高いＭＡｂレベルを有するＨＢ１３４クローンの細胞分析は、生産の増加が単に抗体を形成するポリペプチドの過剰発現を導くことができるＩｇ座での遺伝的改変によるものか、または分泌経路のメカニズムに影響を及ぼす遺伝的改変による強化された分泌であるのかを決定するために分析した。この問題に取り組むために、我々はそれらのＣＭ中に上昇したレベルの抗体を有する３個のＨＢ１３４クローンを拡大した。１０，０００個の細胞をウエスタンブロット分析用に調製し、それらの細胞内の定常状態のＩｇタンパク質レベルをアッセイした（図６）。加えてＨ３６細胞を標準参照として使用し（レーン２）、そして齧歯類繊維芽細胞（レーン１）をＩｇ陰性対照として使用した。簡単に説明すると、細胞を遠心によりペレット化し、そして３００μｌのＳＤＳ溶解バッファー（６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）中で直接溶解し、そして５分間煮沸した。ライセートのタンパク質は、Ｉｇ重鎖を分析するために４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルでの電気泳動により分離した。ゲルは、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、４０ｍＭ グリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール中でＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ミリポア：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロブロットし、そして室温で１時間、Ｔｒｉｓ緩衝化塩溶液（ＴＢＳ）に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５％コンデンスミルクを加えた中でブロッキングした。フィルターは１：１０，０００倍に希釈したヒツジ抗−マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体でＴＢＳバッファー中にて釣り上げ、そしてＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（ピアス：Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して化学発光により検出した。実験は２連で繰り返して再現性を確保した。図６は、クローンのサブセットが増加したＡｂ生産の原因である強化されたＩｇ生産を有する一方（レーン５）、他は対照サンプルに類似する定常状態のレベルを有したが、それでもＣＭ中のＡｂレベルは高かったことを示す代表的分析を表す。これらのデータは、ＨＢ１３４クローンのサブセットが遺伝的改変を含み、これが次いで上昇したレベルの抗体分泌を生じるメカニズムを示唆する。
【００７０】
細胞または生物全体に遺伝的突然変異を生じるための化学的突然変異原の使用は、これらの作用物質が「正常」細胞に及ぼす毒性効果により制限されている。ＭＭＲ欠損生物でのＭＮＵのような化学的突然変異原の使用はさらに一層耐溶性であり、ＭＭＲ欠損単独よりも遺伝的突然変異に１０〜１００倍の上昇を生じる（Ｂｉｇｎａｍｉ Ｍ，（２０００）キラーの正体を暴く：ＤＮＡ Ｏ（６）−メチルグアニンおよびメチル化試薬の細胞傷害性（Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ ａ ｋｉｌｌｅｒ：ＤＮＡ Ｏ（６）−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４６２：７１−８２）。この方法は抗原に対する強化された結合親和性等のような改変された生化学的特性を持つ機能的Ａｂを生じることができる免疫グロブリン遺伝子またはキメラ内にさらなる突然変異を増すための方法として、ＭＭＲ欠損Ａｂ生産細胞で使用すべき化学的な突然変異原としての使用を可能とする。
【実施例５】
【００７１】
新規生産量の形質を持つハイブリドーマ細胞における遺伝的安定性の樹立
ＭＭＲの最初の段階はＭｕｔＳαおよびＭｕｔＬαと呼ばれる２つのタンパク質複合体に依存する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。ドミナントネガティブＭＭＲ対立遺伝子は、ヌクレオチドの切り出しおよび「正しい」ヌクレオチドを含んでなる重合に関与する下流の生化学物質による、これら複合体の形成を乱すことができる。本出願からの実施例では、ハイブリドーマ細胞株で発現した時に、短縮化ＭＭＲ対立遺伝子（ＰＭＳ１３４）ならびに完全長のヒトＰＭＳ２がＭＭＲを遮断することができ、細胞分裂毎にそのゲノム全体を通して遺伝的改変を獲得する高頻度変異性細胞株を生じる能力を示す。いったん抗体、単鎖抗体、免疫グロブリン遺伝子の過剰発現および／または抗体の強化された分泌をコードする遺伝子内に遺伝的改変を含む細胞株が生産されれば、細胞宿主のゲノムの完全性を保存することが望ましい。これは誘導性ベクターの使用により達成することができ、これによりドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子がそのようなベクターにクローン化され、Ａｂ生産細胞に導入され、そして細胞がインデューサー分子および／または条件の存在下で培養される。誘導性ベクターには限定するわけではないが、ステロイド誘導性ＭＭＴＶのような化学物質で調節されるプロモーター、テトラサイクリンで調節されるプロモーター、温度感受性ＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子および温度感受性プロモーターを含む。
【００７２】
上記の結果は幾つかの結論を導く。第１にｈＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４の発現は、ハイブリドーマ細胞のマイクロサテライト不安定性の上昇をもたらす。すなわちＭＭＲ欠損性によるこの上昇したマイクロサテライト不安定性は、安定に形質導入された細胞に由来する抽出物の評価により示された。ＰＭＳ１３４の発現はＭＭＲに極性の欠損（ｐｏｌａｒ ｄｅｆｅｃｔ）をもたらし、これは５’方向からの修復を試験するために設計したヘテロ二重鎖を使用して観察されてだけであった（同じ抽出物中で３’方向からの修復に有意な欠損は観察されなかった）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）自然に発生するｈＰＭＳ２突然変異は、ドミナントネガティブミューテーターの表現型を与えることができる（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈＰＭＳ２ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｃａｎ Ｃｏｎｆｅｒ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１）。興味深いことには、ｈＭＬＨ１が欠損している細胞もＭＭＲに極性の欠損を有するが、しかしこの場合、３’方向からの修復に優先的に影響を及ぼす（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）シスプラチンおよびアドリアマイシン耐性は、卵巣腫瘍細胞株でのＭｕｔＬａおよびミスマッチ修復欠損に関連する（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＭｕｔＬａ ａｎｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９６４５−１９６４８）。以前の実験から原核および真核細胞の両方で、別個の酵素的成分が２つの異なる方向からの修復を媒介することが知られている。Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，ｅｔ ａｌ．の結果（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）アレルゲンに特異的なヒスタミン放出を抑制する抗−ＩｇＥモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＩｇＥ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｌｌｅｒｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：４１２−４１３）と組み合わせた我々の結果は、５’修復は主にｈＰＭＳ２に依存しているのに対し、３’修復は主にｈＭＬＨ１に依存していることを強く示唆する。ＰＭＳ２とＭＬＨ１との間の二量体複合体がこの方向性をどのように設定するのかは容易に構想される。また合わせた結果は、ＭＭＲにおける方向性の欠損がＭＭＲ欠損表現型を生成するに十分であることも示し、そして任意のＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子が遺伝的に改変されたハイブリドーマ細胞、またはＩｇ遺伝子産物を生産する細胞株を生成するために有用であることを示唆する。さらにそのようなＭＭＲ対立遺伝子の使用は、改変された生化学的特性を持つ遺伝的に改変されたＩｇポリペプチド、ならびに抗体分子の強化された量を生産する宿主細胞を作成するために有用となる。
【００７３】
本出願で教示する別の方法は、ＭＭＲを遮断するために使用される任意の方法を、限定するわけではないが上昇した抗原結合、強化された薬物動態学的プロフィール等のような強化された生化学的特徴を持つ遺伝的に改変された抗体を導くことができる抗体生産細胞に、高頻度変異性を作成するために行うことができる。これらの方法はまた、図４、図６に示すような上昇したＩｇ発現、かつ／または表２に示すような上昇した抗体分泌を有する抗体生産細胞を作成するためにも使用することができる。
【００７４】
加えて、我々は限定するわけではないが上昇した抗原結合親和性のような改変された生化学的特徴を導くことができるＩｇ遺伝子内の遺伝的改変を増すために、抗体生産細胞中のＭＭＲを遮断する用途を証明する（図５Ａおよび５Ｂ）。そのような細胞におけるＭＭＲの遮断は、細菌、酵母、原生生物、昆虫、齧歯類、霊長類、哺乳動物細胞およびヒトを含む任意の種に由来するドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子の使用を介することができる。またＭＭＲの遮断は、ＭＭＲの生化学的経路に関与する任意の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡまたはデオキシヌクレオチドの使用を介して生成することができる。またＭＭＲの遮断は、限定するわけではないが抗体を含むＭＭＲ複合体のサブユニットを妨害するポリペプチドの使用を介することができる。最後に、ＭＭＲの遮断は限定するわけではないがＭＭＲを遮断することが示された非加水分解性ＡＴＰ類似体のような化学物質の使用を介してもよい（Ｇａｌｉｏ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬを用いた力学的な３個からなる核タンパク質複合体のＡＴＰ加水分解依存的形成（ＡＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｙｎａｍｉｃ ｔｅｒｎａｒｙ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＭｕｔＳ ａｎｄ ＭｕｔＬ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２３２５−２３２３１）。
【実施例６】
【００７５】
高親和性抗体を生産する変異体Ｈ３６細胞株の遺伝子配列の分析
Ｈ３６変異体細胞株により生産される抗体の軽および重鎖の核酸配列を、親のクローンと比べて抗体の上昇した親和性に貢献する免疫グロブリンコード配列内の突然変異について調査した。結果を表３に示す。このデータは重および軽鎖可変ドメインの両方で、プロリン置換が抗原に対する抗体の親和性を上げる一因であることを示す。特定のホットスポットは、ＨＢ９１−４７、ＨＢ１３４ＤＲＭＡ１３およびＨＢＤＲＭＡ５５について、元のアラニンをプロリンへ変えるアミノ酸置換が起こった配列番号６のアミノ酸６位で現れる。これらの３つのクローンは９および１０位にも突然変異を有した。９位では、親のバリンがグリシンまたはアルギニンに変わり、一方、配列番号６の１０位では、親のアルギニンがリシンに両方の場合で変わった。
【００７６】
【表７】
【００７７】
遺伝的に改変された抗体は、以下の配列の差異およびコンセンサス配列を示す：
形態形成ＨＢ９１−４７重鎖（配列番号１７）、親のＨ３６重鎖（配列番号１８）およびコンセンサス重鎖配列（配列番号１９）のアミノ酸の整列
【００７８】
【表８】
【００７９】
形態形成ＨＢ９１−３７軽鎖（配列番号２０）、親のＨ３６軽鎖（配列番号２１）およびコンセンサス軽鎖配列（配列番号２２）のアミノ酸の整列
【００８０】
【表９】
【００８１】
軽鎖についてデータは、配列番号２１の２２位での軽鎖の第２骨格領域（ＦＲ２）中のプロリンへの置換が、抗体の結合親和性を上昇させたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＰＭＳ２およびＰＭＳ１３４ＭＭＲ遺伝子を安定して発現するハイブリドーマ細胞。示すのは、マウスのハイブリドーマ細胞にトランスフェクトされたＭＭＲ遺伝子の定常状態のｍＲＮＡ発現である。安定な発現は連続成長の３カ月後に見いだされた。（−）レーンは逆転写酵素が加えられなかった陰性対照を表し、そして（＋）レーンは逆転写され、そしてＭＭＲ遺伝子についてＰＣＲ増幅されたサンプル、および対照として内部ハウスキーピング遺伝子を表す。
【図２】遺伝的に高頻度変異性のハイブリドーマ細胞の作成。ドミナントネガティブＭＭＲ遺伝子の対立遺伝子は、ＭＭＲ感受性レポーター遺伝子を発現する細胞中に発現された。ＰＭＳ１３４のようなドミナントネガティブ対立遺伝子および他の種に由来するＭＭＲ遺伝子の発現は、強化された生化学的特徴を持つ遺伝的に改変された免疫グロブリン遺伝子、ならびに上昇したＩｇ発現および／または分泌を持つ株を生産するために使用することができる高頻度変異性の表現型をもつ抗体生産細胞をもたらす。示した値は、ｐＣＡＲ−ＯＦレポーター遺伝子内の遺伝的改変から、細胞内に含まれる機能的なβ−ガラクトシダーゼの量を反映する転換されたＣＰＲＧ基質の量を表す。より高量のβ−ガラクトシダーゼ活性は、欠損ＭＭＲによる、より高い突然変異の率を反映している。
【図３】上昇した結合活性および／または上昇した発現／分泌を有する抗体を含有する抗体生産細胞を同定するためのスクリーニング法。
【図４】上昇した結合活性を持つ遺伝的に改変された抗体の作成。示すのは、ｈＩｇＥに特異的な抗体についてスクリーニングした９６ウェルプレートからのＥＬＩＳＡの値である。高い結合値を有する２つのクローンがＨＢ１３４カルチャーで見いだされた。
【図５】抗体の可変鎖内の配列改変（ＭＭＲ欠損ＨＢ１３４抗体生産細胞における軽鎖可変領域中の突然変異）。矢印は、突然変異がＨＢ１３４細胞に由来するクローンからの細胞サブセットで発生したヌクレオチドを指す。図５Ａでは、変化は軽鎖可変領域内のＴｈｒからＳｅｒへの変化をもたらす。コード配列はアンチセンス方向である。図５Ｂでは、変化は軽鎖可変領域内のＰｒｏからＨｉｓへの変化をもたらす。
【図６】強化された定常状態のＩｇタンパク質レベルを持つＭＭＲ欠損クローンの生成。コンディシニングした培地中に高レベルのＭＡｂ（＞５００ｎｇ／ｍｌ）を含むＨＢ１３４クローンからの重鎖免疫グロブリンのウエスタンブロットは、クローンのサブセットがより高い定常状態レベルの免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現することを示す。Ｈ３６細胞株は、親株における定常状態レベルを測定するために対照として使用した。レーン１：繊維芽細胞（陰性対照）；レーン２：Ｈ３６細胞；レーン３：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン；レーン４：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン；レーン５：上昇したＭＡｂレベルを持つＨＢ１３４クローン。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内のアミノ酸を、非極性側鎖を有する第２のアミノ酸に置換し、これにより抗原に対する該モノクローナル抗体の親和性を上げることを含んでなる、抗原に対するモノクローナル抗体の親和性を上げる方法。
【請求項２】
上記の第２のアミノ酸がプロリンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内の上記アミノ酸が非極性側鎖を有するアミノ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記アミノ酸がアラニンまたはロイシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の重鎖の第１骨格領域にある、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の軽鎖の第２骨格領域にある、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
上記アミノ酸が配列番号１８に示す第１骨格領域の６位にある、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
上記アミノ酸が配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位にある、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内の非極性側鎖を含んでなるアミノ酸をプロリンに置換し、これにより抗原に対する該モノクローナル抗体の親和性を上げることを含んでなる、抗原に対するモノクローナル抗体の親和性を上げる方法。
【請求項１０】
上記アミノ酸がアラニンまたはロイシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の重鎖の第１骨格領域にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の軽鎖の第２骨格領域にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
上記アミノ酸が配列番号１８に示す第１骨格領域の６位にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
上記アミノ酸が配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位にある、請求項１０に記載の方法。。
【請求項１５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法により生産されるモノクローナル抗体。
【請求項１】
モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内のアミノ酸を、非極性側鎖を有する第２のアミノ酸に置換し、これにより抗原に対する該モノクローナル抗体の親和性を上げることを含んでなる、抗原に対するモノクローナル抗体の親和性を上げる方法。
【請求項２】
上記の第２のアミノ酸がプロリンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内の上記アミノ酸が非極性側鎖を有するアミノ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記アミノ酸がアラニンまたはロイシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の重鎖の第１骨格領域にある、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の軽鎖の第２骨格領域にある、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
上記アミノ酸が配列番号１８に示す第１骨格領域の６位にある、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
上記アミノ酸が配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位にある、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体の重または軽鎖可変ドメイン内の非極性側鎖を含んでなるアミノ酸をプロリンに置換し、これにより抗原に対する該モノクローナル抗体の親和性を上げることを含んでなる、抗原に対するモノクローナル抗体の親和性を上げる方法。
【請求項１０】
上記アミノ酸がアラニンまたはロイシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の重鎖の第１骨格領域にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記アミノ酸が上記モノクローナル抗体の軽鎖の第２骨格領域にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
上記アミノ酸が配列番号１８に示す第１骨格領域の６位にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
上記アミノ酸が配列番号２１に示す軽鎖可変ドメインの第２骨格領域の２２位にある、請求項１０に記載の方法。。
【請求項１５】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４に記載の方法により生産されるモノクローナル抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５０３０３５（Ｐ２００６−５０３０３５Ａ）
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３６２２６（Ｐ２００４−５３６２２６）
【出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８７２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４８７１
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５０３１６６６４３）モーフオテク・インコーポレーテツド (4)
【出願人】（５０５０９４０６５）
【出願人】（５０５０９４０７６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８７２２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４８７１
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５０３１６６６４３）モーフオテク・インコーポレーテツド (4)
【出願人】（５０５０９４０６５）
【出願人】（５０５０９４０７６）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]