抗体のフレームワーク・シャッフル
本発明は、抗体を再設計または再構成して、抗原に対する抗体の免疫特異性を維持する一方、抗体の免疫原性を低下させる方法に関する。特に、本発明は、フレームワーク領域のサブバンク由来のフレームワーク領域とインフレームで融合されたドナー抗体由来の相補性決定領域（CDR）を含んでなるコンビナトリアルライブラリーを合成することにより、抗原に免疫特異的な抗体を作製する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入し、かつドナー軽鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入し、かつドナー重鎖可変領域、ヒト化重鎖可変領域および改変された重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項４】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来でありかつその改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
改善された特性がTmであり、改善がドナー抗体と比較してTmの約5℃〜20℃の増加である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
改善された特性がpIであり、改善がドナー抗体と比較してpIの約0.5〜2.0の増加または約0.5〜2.0の減少である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
改善された特性が改善された産生レベルであり、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により作製されたヒト化抗体。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１３】
請求項７に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１５】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域、改変された軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１６】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー重鎖可変領域；改変された重鎖可変領域；およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１７】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１８】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来でありかつその改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
改善された特性がTmであり、改善がドナー抗体と比較してTmの5℃〜20℃の増加である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
改善された特性がpIであり、改善がドナー抗体と比較してpIの約0.5〜2.0の増加または約0.5〜2.0の減少である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
改善された特性が改善された産生レベルであり、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２９】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域、改変された軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３０】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつ前記ドナー重鎖可変領域、改変された重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３１】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３２】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法により作製された抗体。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入し、かつドナー軽鎖可変領域、ヒト化軽鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項２】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入し、かつドナー重鎖可変領域、ヒト化重鎖可変領域および改変された重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３】
抗原と免疫特異的に結合するヒト化抗体を作製する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項４】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来でありかつその改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
改善された特性がTmであり、改善がドナー抗体と比較してTmの約5℃〜20℃の増加である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
改善された特性がpIであり、改善がドナー抗体と比較してpIの約0.5〜2.0の増加または約0.5〜2.0の減少である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
改善された特性が改善された産生レベルであり、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により作製されたヒト化抗体。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１２】
請求項６に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１３】
請求項７に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法により作製された抗体。
【請求項１５】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域、改変された軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１６】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー重鎖可変領域；改変された重鎖可変領域；およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、前記改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１７】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の１以上の特性を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 平衡解離定数（KD）、安定性、融点（Tm）、pI、溶解度、産生レベルおよびエフェクター機能からなる群より選択される１以上の改善された特性を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約1％〜500％であるかまたはドナー抗体と比較して2倍〜1000倍であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項１８】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来でありかつその改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
改善された特性が抗原に対する抗体の平衡解離定数（KD）であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
改善された特性がTmであり、改善がドナー抗体と比較してTmの5℃〜20℃の増加である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
改善された特性がpIであり、改善がドナー抗体と比較してpIの約0.5〜2.0の増加または約0.5〜2.0の減少である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
改善された特性が改善された産生レベルであり、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法により作製された抗体。
【請求項２９】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつドナー軽鎖可変領域、改変された軽鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域からなる群より選択される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３０】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を合成するステップであって、前記第１のヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、および軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 前記第１の核酸配列を細胞中に導入しかつ前記ドナー重鎖可変領域、改変された重鎖可変領域およびヒト化重鎖可変領域からなる群より選択される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を該細胞中に導入するステップ；
(c) 改変された軽鎖可変領域および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(d) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(e) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３１】
抗原と免疫特異的に結合するドナー抗体の平衡解離定数（KD）を改善する方法であって、
(a) 改変された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は重鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、重鎖CDR1をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、重鎖CDR2をコードする核酸配列、重鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、重鎖CDR3をコードする核酸配列、および重鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体重鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの重鎖フレームワーク領域はヒト重鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ；
(b) 改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を合成するステップであって、前記ヌクレオチド配列は軽鎖フレームワーク領域1をコードする核酸配列、軽鎖CDR1をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域2をコードする核酸配列、軽鎖CDR2をコードする核酸配列、軽鎖フレームワーク領域3をコードする核酸配列、軽鎖CDR3をコードする核酸配列、およびa軽鎖フレームワーク領域4をコードする核酸配列を同時に融合することにより作製され、少なくとも1つのCDRは前記抗原と免疫特異的に結合する前記ドナー抗体軽鎖可変領域由来でありかつ少なくとも1つの軽鎖フレームワーク領域はヒト軽鎖フレームワーク領域のサブバンク由来である前記ステップ
(c) ステップ(a)および(b)で作製した核酸配列を細胞中に導入するステップ；
(d) 改変された重鎖可変領域および改変された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を発現させるステップ；
(e) 抗原と免疫特異的に結合する改変された抗体をスクリーニングするステップ；ならびに
(f) 改善された平衡解離定数（KD）を有する改変された抗体をスクリーニングするステップであって、改善がドナー抗体と比較して約25％〜500％であるステップ
を含んでなる前記方法。
【請求項３２】
全ての6個のCDRがドナー抗体由来であり、改善がドナー抗体と比較して約50％〜500％である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法により作製された抗体。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法により作製された抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【公表番号】特表２００８−５３７８７６（Ｐ２００８−５３７８７６Ａ）
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２１０１（Ｐ２００８−５０２１０１）
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２０９５
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１７日（２００６．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０２０９５
【国際公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０４３３３９７２）メディミューン，エルエルシー (108)
【Ｆターム（参考）】
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