抗体の糖鎖を調製する方法
【課題】 簡便かつ短時間で抗体の糖鎖を調製する方法を提供すること。
【解決手段】 抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行った後に、切り出した糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体固相担体に捕捉し、次いで、捕捉した糖鎖を再遊離することにより、質量分析、クロマトグラフィー、あるいは電気泳動などに供するための糖鎖試料を、簡便かつ迅速に調製しうることを見出した。
【解決手段】 抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行った後に、切り出した糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体固相担体に捕捉し、次いで、捕捉した糖鎖を再遊離することにより、質量分析、クロマトグラフィー、あるいは電気泳動などに供するための糖鎖試料を、簡便かつ迅速に調製しうることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の糖鎖を調製する方法、並びに該方法に用いられるキットおよびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
【０００３】
糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【０００４】
生体内で免疫機能を担うタンパク質である抗体についても、近年、その機能において、結合する糖鎖の重要性が解明されてきている。例えば、糖鎖の構造が、抗体の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）、抗体依存的細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などの抗体エフェクター活性、血中半減期、あるいは特定の疾患と関連することが判明している。このため、抗体から糖鎖を調製し、その構造を分析するための種々の方法の開発が行われてきた。
【０００５】
抗体からの糖鎖の調製は、一般に、第１段階である抗体の精製、第２段階である抗体からの糖鎖の切り出し、第３段階である切り出した糖鎖の標識、第４段階である標識化糖鎖の精製の４段階に分けられる。この第一段階の抗体の精製においては、プロテインＡやプロテインＧなどを用いたアフィニティークロマトグラフィーが広く用いられているが、この方法では、通常、プロテインＡやプロテインＧなどと抗体との結合をカラム中で行い、夾雑物を洗浄した後、結合を解離させ、精製抗体を回収しているため、操作方法が煩雑であり、精製に時間がかかるという欠点があった。
【０００６】
かかる欠点を解決する方法として、抗体を精製する際に、抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させ、その後、該吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行うことにより、操作を簡略化した方法も開発されている（特許文献１、２）。
【０００７】
しかしながら、これらの方法においては、抗体から切り出された糖鎖の精製とラベル化の操作が、依然として、煩雑であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平８−２２８７９５号公報
【特許文献２】国際公開２００９−０２７０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ短時間で抗体の糖鎖を調製しうる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行った後に、切り出した糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する担体に捕捉し、次いで、捕捉した糖鎖を再遊離することにより、質量分析、クロマトグラフィー、あるいは電気泳動などに供するための糖鎖試料を、簡便かつ迅速に調製することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【００１２】
[１] 抗体の糖鎖を調製する方法であって、
（ａ）糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
（ｃ）遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
、を含む方法。
【００１３】
[２] 抗体を捕捉するための担体が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、イオン交換樹脂、または抗体精製用アプタマーが固定化された担体である、[１]に記載の方法。
【００１４】
[３] [１]に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの標品を含むキット。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬
（ｄ）反応液中に過剰に存在する（ｃ）の試薬を除去するための担体
（ｅ）反応用チューブ
[４] [１]に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｃ）を含むマイクロ流路デバイス。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）（ａ）の担体および（ｂ）の担体に連通している流路
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体試料などに含まれる抗体について、その糖鎖を簡便かつ迅速に調製し、分析することが可能となる。しかも、本発明によれば、分析のための糖鎖試料の調製を、１つのチューブ内あるいはマイクロ流路内で行うこともでき、自動化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例および比較例のそれぞれの方法で精製した抗体の糖鎖について、ＨＰＬＣ分析を行い、ＨＰＬＣチャートから読み取ったピークのうち、面積の上位５ピークについてのデータを比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（抗体を担体に捕捉する工程）
本発明において使用する糖鎖が結合した抗体を含む試料としては、例えば、血清（血液）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液などの体液、またはＢ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞などの抗体産生細胞の培養上清などが挙げられるが、これらに制限されない。これら試料から、抗体を捕捉するための担体としては、抗体に親和性のある分子やイオン交換樹脂が固定化された担体が挙げられる。抗体に親和性のある分子としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗体精製用アプタマーなどを利用することができる。
【００１８】
上記の担体は、カラム、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブなどの容器内に封入し、抗体を含む試料溶液と接触させることで抗体を捕捉することができる。
【００１９】
（担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程）
本発明においては、上記の担体に抗体を捕捉した状態で、当該抗体から糖鎖を遊離する。この工程によれば、担体に捕捉した抗体を、一旦、溶出して回収し、脱塩、濃縮した上で、糖鎖を遊離させる常法（後述の比較例を参照のこと）に比して、操作が簡便である。糖鎖を遊離させる手段としては、Ｎ−グリコシダーゼあるいはＯ−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどによるプロテアーゼ処理、および／または、ＳＤＳなどの界面活性剤による変性処理を行ってもよい。
【００２０】
（遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程）
糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて捕捉担体上に糖鎖を捕捉する。
【００２１】
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、例えば、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、セミチオカルバジド基ならびにそれらの誘導体が好ましく、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基がより好ましい。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。一般的に、生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤などを用いた二次処理が必要であることから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。
【００２２】
糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Millipore社製のMultiScreen Solvinert Filter Plate）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。
【００２３】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「BlotGlyco(Ｒ)」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）を好適に用いることができる。
【００２４】
糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００２５】
ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【００２６】
担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用して、キャッピングすることができる。
【００２７】
（捕捉した糖鎖を再遊離する工程）
次いで、捕捉担体であるポリマー粒子に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る。
【００２８】
ポリマー粒子に結合した糖鎖を別の化合物（以下、「化合物Ａ」と称す）に置換する工程に関して説明する。化合物Ａはラベル化試薬であることが好ましい。糖鎖が結合しているポリマー粒子に対して化合物Ａを過剰量加えることで置換が成される。すなわち、糖鎖はポリマー粒子から切り離され、それと同時に糖鎖に化合物Ａが付加する（糖鎖はＡで「ラベル化」される）。過剰に加える化合物Ａの量は、好ましくはポリマー粒子が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量の１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上である。反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は、好ましくは４０〜９０℃、より好ましくは４０〜８０℃である。本工程後、溶媒は蒸発していることが好ましい。
【００２９】
化合物Ａとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物が好ましく、最も好ましい化合物は、Ｎ-アミノオキシアセチル−トリプトファニル(アルギニン メチル エステル)である。この化合物は、上記の「BlotGlyco(Ｒ) for MALDI」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）に付属の再遊離試薬として、市販されている。
【００３０】
ここでは、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖を遊離して標識化サンプルを得る方法を説明したが、下記の方法によれば、非標識サンプルを得ることができ、本発明はこのような試料調製方法をも提供する。この試料調製方法は、糖鎖が結合しているポリマー粒子を酸性条件で処理することにより、ヒドラゾン結合を解離させ、糖鎖を遊離させることを特徴としている。このときの酸性条件での処理は、０．０１〜２０体積パーセントの酢酸溶液、好ましくは０．１〜５体積パーセントの酢酸溶液にて、４０〜８０℃で５〜６０分間行われる。本工程後、溶媒が蒸発していることが好ましい。
【００３１】
上記非標識サンプルをアミノ化合物で標識化する場合、下記の方法を利用することができる。標識化の方法は、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識化する反応であることが好ましい。アミノ化合物としては、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、８−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄなどを用いることができるが、これらに限定されない。反応系においてｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましく、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
【００３２】
本発明においては、抗体から切り出された糖鎖の精製とラベル化を、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基を含有する担体を利用して簡便に行うことができる。
【００３３】
こうして得られた糖鎖は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ）、クロマトグラフィ（例えば、高速液体クロマトグラフィやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィ）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）などの公知の方法により、糖鎖の構造や量などを分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、GlycoMod、Glycosuite、SimGlycan(Ｒ)など）を利用することができる。
【００３４】
（キット）
本発明は、上記本発明の方法を実施するための、キットを提供する。本発明のキットには、例えば、（１）抗体を捕捉するための担体（ビーズなど）、（２）糖鎖を捕捉（精製）するための担体（ビーズなど）、（３）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬、（４）反応液中に過剰に存在する（３）の試薬を除去するための担体（カラムなど）、（５）反応用チューブ、（６）使用説明書、を含むことができる。
【００３５】
（マイクロ流路デバイス）
上記本発明の方法は、マイクロ流路デバイスを利用して行うことも可能である。従って、本発明は、上記本発明の方法を実施するための、マイクロ流路デバイスを提供する。本発明のマイクロ流路デバイスは、（１）抗体を捕捉するための担体、（２）糖鎖を捕捉するための担体、（３）（１）の担体および（２）の担体に連通している流路を含むものである。
【００３６】
本発明におけるマイクロ流路とは、幅１ｍｍ以下、深さ１ｍｍ以下の溝を指す。溝（流路）の断面形状は特に制限されず、矩形、台形、三角形、半円形、さらにそれらの複合形でもよい。矩形や台形のような、底面がデバイスの基材表面に対して平行な面を有する形状が好ましい。また、マイクロ流路の全体的な形状（例えば、直線状、Ｙ字状、屈曲している形状）や流路全体の長さなどについても特に制限はなく、目的に応じた自由な形態をとることができる。デバイスの基材全体の形状としては、板状、キューブ状、直方体状、球状、その他のいかなる形状でもよいが、板状が好ましい。デバイスの基材としては不透過性および耐水性を有するものであれば基本的には制限はない。このような材質としては、ガラスおよびプラスチック、金属類が挙げられる。
【００３７】
本発明のマイクロ流路デバイスにおいては、上記マイクロ流路内に、抗体を捕捉するための担体、および、糖鎖を捕捉するための担体、が配置されている。これら担体は、流路を形成する基材の表面の別個の領域に固定化されていてもよく、また、流路内の別個の領域で、それぞれの担体が堰止られるように、基材において、堰止ダムが設置されていてもよい。抗体を捕捉するための分子と糖鎖を捕捉するための分子が、流路を形成する基材の表面の別個の領域に直接、固定化されていてもよい（この場合は、「担体」とは、デバイスの基材そのものを意味する）。
【００３８】
マイクロ流路における、上流側から、糖鎖が結合した抗体を含む試料を流すことにより、当該試料が、抗体を捕捉するための担体が配置された領域に到達する。ここで担体上に、抗体が捕捉される。次いで、流路内に、上記の担体に抗体を捕捉した状態で、当該抗体から糖鎖を遊離するための試薬を流す。この試薬の作用により遊離した糖鎖は、その下流に存在する、糖鎖を捕捉するための担体が配置された領域に到達し、当該担体に捕捉される。次いで、流路内に、担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬を流す。これにより、担体に捕捉された糖鎖が再遊離し、精製された糖鎖試料が得られる。得られた糖鎖試料は、上記の糖鎖分析に供することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例]
（抗体捕捉）
糖鎖精製キットBlotGlyco(Ｒ)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)に付属の反応用チューブ(スピンカラム)に、プロテインＡビーズ分散液(MabSelect Xtra, GEヘルスケア・ジャパン株式会社製、17-5269-07)１００μＬを分注し、遠心して溶媒を除去した後、純水２００μＬで3回洗浄した。抗体を含む培養上清１．６ｍＬを加え、スピンカラムを通過させた後、純水２００μＬで3回洗浄した。
【００４０】
（ビーズ共存下での糖鎖遊離）
スピンカラム内のプロテインＡビーズに純水(５０μＬ)、1M重炭酸アンモニウム水溶液(５μＬ)、１２０ｍＭジチオスレイトール水溶液(５μＬ)を加え、６０℃で３０分間反応させた。室温に戻した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液(１０μＬ)を加え、室温で遮光して１時間静置した。トリプシン４０ユニットを加え、３７℃で１時間静置した後、９０℃で５分間加熱してトリプシンを失活させた。室温に戻した後、Ｎ−グリコシダーゼＦ(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)１０ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。９０℃で５分間加熱してＮ−グリコシダーゼFを失活させた後、純水５０μＬを加え、スピンカラムを遠心して溶液を回収した。
【００４１】
（糖鎖精製、２ＡＢラベル化）
上記で得られた糖鎖含有溶液にうち２０μＬを使用し、糖鎖精製キットBlotGlyco(Ｒ)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)により糖鎖の精製および蛍光標識(2-aminobenzamide:2AB)化を行った。まず、糖鎖捕捉ビーズ５ｍｇを反応用チューブに取り、これに糖鎖含有溶液２０μＬを添加し、さらに２％酢酸／アセトニトリル溶液(１８０μＬ)を加え、８０℃で１時間反応させることにより糖鎖をビーズに捕捉させた。反応後、ビーズを２Ｍグアニジン塩酸塩水溶液、純水、１％トリエチルアミン／メタノール溶液、メタノール(各２００μＬ)で３回ずつ洗浄した。１０％無水酢酸／メタノール溶液(１００μＬ)を添加し、室温で３０分間反応させることでビーズ上の余剰のヒドラジド基をキャッピングした。ビーズをメタノール、１０ｍＭ塩酸、純水(各２００μＬ)で順次洗浄したのち、純水（２０μＬ）および２％酢酸／アセトニトリル溶液(１８０μＬ)を加え、７０℃で９０分間反応させることでビーズから糖鎖を再遊離させた。次に、３０％酢酸／ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに２ＡＢ(３５０ｍＭ)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(１Ｍ)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液５０μＬを上記ビーズに添加し、６０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル９５０μＬを加えて希釈した。この溶液をBlotGlyco(Ｒ)に付属のクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル４００μＬで３回、アセトニトリル／純水(９５：５，ｖ/ｖ)で３回洗浄した後、純水５０μＬを加えて２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
【００４２】
（ＨＰＬＣ測定）
上記で得られたラベル化糖鎖溶液のうち１０μＬをＨＰＬＣ測定に供した。ＨＰＬＣ装置は、Waters Corporation製‘Alliance’(Separation module 2695, Multi λ Fluorescent detector 2475)を使用し、蛍光励起波長330nm、検出波長420nmで測定した。カラムは、Shodex Asahipak NH2P-50 4Eを使用し、カラム温度は４０℃とした。溶離液は２％酢酸／アセトニトリル(Ａ液)と５％酢酸、３％トリエチルアミン／水(Ｂ液)を使用し、Ｂ液３０％(０分)→Ｂ液３０％(２分)→Ｂ液９５％(８０分)→Ｂ液９５％(１１０分)のグラジエント、流速１ｍＬ/分の条件で測定した。
【００４３】
[比較例]
（抗体精製）
プロテインＡビーズ分散液を容量１ｍＬのディスポーザブルカラム(Varian社製)に充填した。抗体を含む培養上清１．６ｍＬを加え、カラムを通過させた後、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸バッファー１０００μＬで洗浄した。その後、ｐＨ２．７の１００ｍＭグリシンバッファー１０００μＬで抗体を溶出させた。回収した抗体溶液を透析により脱塩し、凍結乾燥することで精製抗体を得た。
【００４４】
（糖鎖遊離）
上記精製抗体を５０μＬの純水に溶解し、これに１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液(５μＬ)、１２０ｍＭジチオスレイトール水溶液(５μＬ)を加え、６０℃で３０分間反応させた。室温に戻した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液(１０μＬ)を加え、室温で遮光して１時間静置した。Ｎ−グリコシダーゼＦ(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)１０ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。９０℃で５分間加熱してＮ−グリコシダーゼＦを失活させた後、エタノール８０μＬを添加してタンパク質を沈殿させた。遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥することで糖鎖を得た。
【００４５】
（糖鎖の２ＡＢラベル化）
３０％酢酸／ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに２ＡＢ(３５０ｍＭ)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(１Ｍ)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液５０μＬを上記糖鎖に添加し、６０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル９５０μＬを加えて希釈した。この溶液をクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル４００μＬで３回、アセトニトリル／純水(９５：５，ｖ／ｖ)で３回洗浄した後、純水５０μＬを加えて、２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
【００４６】
（ＨＰＬＣ測定）
実施例と同様の方法でＨＰＬＣ測定を行った。図１に、ＨＰＬＣチャートから読み取ったピークのうち、面積の上位５ピークについて実施例と比較例のデータを比較したものを示した。実施例と比較例で糖鎖解析のパターンに大差がないことが確認され、本発明の方法により、簡便な方法で従来法と同等の糖鎖分析が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の抗体の糖鎖を調製する方法を用いると、生体試料に含まれる抗体から糖鎖試料を簡便かつ迅速に調製することが可能となる。本発明は、抗体の糖鎖の研究、抗体の糖鎖構造と関連する疾患の診断、あるいは抗体医薬の研究開発・製造・品質保証に、大きく貢献しうるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の糖鎖を調製する方法、並びに該方法に用いられるキットおよびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。
【０００３】
糖鎖は非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【０００４】
生体内で免疫機能を担うタンパク質である抗体についても、近年、その機能において、結合する糖鎖の重要性が解明されてきている。例えば、糖鎖の構造が、抗体の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）、抗体依存的細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などの抗体エフェクター活性、血中半減期、あるいは特定の疾患と関連することが判明している。このため、抗体から糖鎖を調製し、その構造を分析するための種々の方法の開発が行われてきた。
【０００５】
抗体からの糖鎖の調製は、一般に、第１段階である抗体の精製、第２段階である抗体からの糖鎖の切り出し、第３段階である切り出した糖鎖の標識、第４段階である標識化糖鎖の精製の４段階に分けられる。この第一段階の抗体の精製においては、プロテインＡやプロテインＧなどを用いたアフィニティークロマトグラフィーが広く用いられているが、この方法では、通常、プロテインＡやプロテインＧなどと抗体との結合をカラム中で行い、夾雑物を洗浄した後、結合を解離させ、精製抗体を回収しているため、操作方法が煩雑であり、精製に時間がかかるという欠点があった。
【０００６】
かかる欠点を解決する方法として、抗体を精製する際に、抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させ、その後、該吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行うことにより、操作を簡略化した方法も開発されている（特許文献１、２）。
【０００７】
しかしながら、これらの方法においては、抗体から切り出された糖鎖の精製とラベル化の操作が、依然として、煩雑であるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平８−２２８７９５号公報
【特許文献２】国際公開２００９−０２７０４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ短時間で抗体の糖鎖を調製しうる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、抗体をプロテインＡやプロテインＧなどの吸着材に結合させたまま抗体から糖鎖の切り出しを行った後に、切り出した糖鎖を、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する担体に捕捉し、次いで、捕捉した糖鎖を再遊離することにより、質量分析、クロマトグラフィー、あるいは電気泳動などに供するための糖鎖試料を、簡便かつ迅速に調製することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【００１２】
[１] 抗体の糖鎖を調製する方法であって、
（ａ）糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
（ｃ）遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
、を含む方法。
【００１３】
[２] 抗体を捕捉するための担体が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、イオン交換樹脂、または抗体精製用アプタマーが固定化された担体である、[１]に記載の方法。
【００１４】
[３] [１]に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの標品を含むキット。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬
（ｄ）反応液中に過剰に存在する（ｃ）の試薬を除去するための担体
（ｅ）反応用チューブ
[４] [１]に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｃ）を含むマイクロ流路デバイス。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）（ａ）の担体および（ｂ）の担体に連通している流路
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体試料などに含まれる抗体について、その糖鎖を簡便かつ迅速に調製し、分析することが可能となる。しかも、本発明によれば、分析のための糖鎖試料の調製を、１つのチューブ内あるいはマイクロ流路内で行うこともでき、自動化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例および比較例のそれぞれの方法で精製した抗体の糖鎖について、ＨＰＬＣ分析を行い、ＨＰＬＣチャートから読み取ったピークのうち、面積の上位５ピークについてのデータを比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（抗体を担体に捕捉する工程）
本発明において使用する糖鎖が結合した抗体を含む試料としては、例えば、血清（血液）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液などの体液、またはＢ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞などの抗体産生細胞の培養上清などが挙げられるが、これらに制限されない。これら試料から、抗体を捕捉するための担体としては、抗体に親和性のある分子やイオン交換樹脂が固定化された担体が挙げられる。抗体に親和性のある分子としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗体精製用アプタマーなどを利用することができる。
【００１８】
上記の担体は、カラム、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブなどの容器内に封入し、抗体を含む試料溶液と接触させることで抗体を捕捉することができる。
【００１９】
（担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程）
本発明においては、上記の担体に抗体を捕捉した状態で、当該抗体から糖鎖を遊離する。この工程によれば、担体に捕捉した抗体を、一旦、溶出して回収し、脱塩、濃縮した上で、糖鎖を遊離させる常法（後述の比較例を参照のこと）に比して、操作が簡便である。糖鎖を遊離させる手段としては、Ｎ−グリコシダーゼあるいはＯ−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどによるプロテアーゼ処理、および／または、ＳＤＳなどの界面活性剤による変性処理を行ってもよい。
【００２０】
（遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程）
糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて捕捉担体上に糖鎖を捕捉する。
【００２１】
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、例えば、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、セミチオカルバジド基ならびにそれらの誘導体が好ましく、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基がより好ましい。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理などによって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。一般的に、生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤などを用いた二次処理が必要であることから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。
【００２２】
糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Millipore社製のMultiScreen Solvinert Filter Plate）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。
【００２３】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「BlotGlyco(Ｒ)」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）を好適に用いることができる。
【００２４】
糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００２５】
ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【００２６】
担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用して、キャッピングすることができる。
【００２７】
（捕捉した糖鎖を再遊離する工程）
次いで、捕捉担体であるポリマー粒子に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る。
【００２８】
ポリマー粒子に結合した糖鎖を別の化合物（以下、「化合物Ａ」と称す）に置換する工程に関して説明する。化合物Ａはラベル化試薬であることが好ましい。糖鎖が結合しているポリマー粒子に対して化合物Ａを過剰量加えることで置換が成される。すなわち、糖鎖はポリマー粒子から切り離され、それと同時に糖鎖に化合物Ａが付加する（糖鎖はＡで「ラベル化」される）。過剰に加える化合物Ａの量は、好ましくはポリマー粒子が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量の１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上である。反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。反応系の温度は、好ましくは４０〜９０℃、より好ましくは４０〜８０℃である。本工程後、溶媒は蒸発していることが好ましい。
【００２９】
化合物Ａとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物が好ましく、最も好ましい化合物は、Ｎ-アミノオキシアセチル−トリプトファニル(アルギニン メチル エステル)である。この化合物は、上記の「BlotGlyco(Ｒ) for MALDI」（住友ベークライト株式会社製、#BS-45603）に付属の再遊離試薬として、市販されている。
【００３０】
ここでは、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖を遊離して標識化サンプルを得る方法を説明したが、下記の方法によれば、非標識サンプルを得ることができ、本発明はこのような試料調製方法をも提供する。この試料調製方法は、糖鎖が結合しているポリマー粒子を酸性条件で処理することにより、ヒドラゾン結合を解離させ、糖鎖を遊離させることを特徴としている。このときの酸性条件での処理は、０．０１〜２０体積パーセントの酢酸溶液、好ましくは０．１〜５体積パーセントの酢酸溶液にて、４０〜８０℃で５〜６０分間行われる。本工程後、溶媒が蒸発していることが好ましい。
【００３１】
上記非標識サンプルをアミノ化合物で標識化する場合、下記の方法を利用することができる。標識化の方法は、還元的アミノ化反応を用いて任意のアミノ化合物で標識化する反応であることが好ましい。アミノ化合物としては、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、８−ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄなどを用いることができるが、これらに限定されない。反応系においてｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましく、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
【００３２】
本発明においては、抗体から切り出された糖鎖の精製とラベル化を、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基を含有する担体を利用して簡便に行うことができる。
【００３３】
こうして得られた糖鎖は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ）、クロマトグラフィ（例えば、高速液体クロマトグラフィやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィ）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）などの公知の方法により、糖鎖の構造や量などを分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、GlycoMod、Glycosuite、SimGlycan(Ｒ)など）を利用することができる。
【００３４】
（キット）
本発明は、上記本発明の方法を実施するための、キットを提供する。本発明のキットには、例えば、（１）抗体を捕捉するための担体（ビーズなど）、（２）糖鎖を捕捉（精製）するための担体（ビーズなど）、（３）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬、（４）反応液中に過剰に存在する（３）の試薬を除去するための担体（カラムなど）、（５）反応用チューブ、（６）使用説明書、を含むことができる。
【００３５】
（マイクロ流路デバイス）
上記本発明の方法は、マイクロ流路デバイスを利用して行うことも可能である。従って、本発明は、上記本発明の方法を実施するための、マイクロ流路デバイスを提供する。本発明のマイクロ流路デバイスは、（１）抗体を捕捉するための担体、（２）糖鎖を捕捉するための担体、（３）（１）の担体および（２）の担体に連通している流路を含むものである。
【００３６】
本発明におけるマイクロ流路とは、幅１ｍｍ以下、深さ１ｍｍ以下の溝を指す。溝（流路）の断面形状は特に制限されず、矩形、台形、三角形、半円形、さらにそれらの複合形でもよい。矩形や台形のような、底面がデバイスの基材表面に対して平行な面を有する形状が好ましい。また、マイクロ流路の全体的な形状（例えば、直線状、Ｙ字状、屈曲している形状）や流路全体の長さなどについても特に制限はなく、目的に応じた自由な形態をとることができる。デバイスの基材全体の形状としては、板状、キューブ状、直方体状、球状、その他のいかなる形状でもよいが、板状が好ましい。デバイスの基材としては不透過性および耐水性を有するものであれば基本的には制限はない。このような材質としては、ガラスおよびプラスチック、金属類が挙げられる。
【００３７】
本発明のマイクロ流路デバイスにおいては、上記マイクロ流路内に、抗体を捕捉するための担体、および、糖鎖を捕捉するための担体、が配置されている。これら担体は、流路を形成する基材の表面の別個の領域に固定化されていてもよく、また、流路内の別個の領域で、それぞれの担体が堰止られるように、基材において、堰止ダムが設置されていてもよい。抗体を捕捉するための分子と糖鎖を捕捉するための分子が、流路を形成する基材の表面の別個の領域に直接、固定化されていてもよい（この場合は、「担体」とは、デバイスの基材そのものを意味する）。
【００３８】
マイクロ流路における、上流側から、糖鎖が結合した抗体を含む試料を流すことにより、当該試料が、抗体を捕捉するための担体が配置された領域に到達する。ここで担体上に、抗体が捕捉される。次いで、流路内に、上記の担体に抗体を捕捉した状態で、当該抗体から糖鎖を遊離するための試薬を流す。この試薬の作用により遊離した糖鎖は、その下流に存在する、糖鎖を捕捉するための担体が配置された領域に到達し、当該担体に捕捉される。次いで、流路内に、担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬を流す。これにより、担体に捕捉された糖鎖が再遊離し、精製された糖鎖試料が得られる。得られた糖鎖試料は、上記の糖鎖分析に供することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例]
（抗体捕捉）
糖鎖精製キットBlotGlyco(Ｒ)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)に付属の反応用チューブ(スピンカラム)に、プロテインＡビーズ分散液(MabSelect Xtra, GEヘルスケア・ジャパン株式会社製、17-5269-07)１００μＬを分注し、遠心して溶媒を除去した後、純水２００μＬで3回洗浄した。抗体を含む培養上清１．６ｍＬを加え、スピンカラムを通過させた後、純水２００μＬで3回洗浄した。
【００４０】
（ビーズ共存下での糖鎖遊離）
スピンカラム内のプロテインＡビーズに純水(５０μＬ)、1M重炭酸アンモニウム水溶液(５μＬ)、１２０ｍＭジチオスレイトール水溶液(５μＬ)を加え、６０℃で３０分間反応させた。室温に戻した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液(１０μＬ)を加え、室温で遮光して１時間静置した。トリプシン４０ユニットを加え、３７℃で１時間静置した後、９０℃で５分間加熱してトリプシンを失活させた。室温に戻した後、Ｎ−グリコシダーゼＦ(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)１０ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。９０℃で５分間加熱してＮ−グリコシダーゼFを失活させた後、純水５０μＬを加え、スピンカラムを遠心して溶液を回収した。
【００４１】
（糖鎖精製、２ＡＢラベル化）
上記で得られた糖鎖含有溶液にうち２０μＬを使用し、糖鎖精製キットBlotGlyco(Ｒ)(住友ベークライト株式会社製、BS-45603)により糖鎖の精製および蛍光標識(2-aminobenzamide:2AB)化を行った。まず、糖鎖捕捉ビーズ５ｍｇを反応用チューブに取り、これに糖鎖含有溶液２０μＬを添加し、さらに２％酢酸／アセトニトリル溶液(１８０μＬ)を加え、８０℃で１時間反応させることにより糖鎖をビーズに捕捉させた。反応後、ビーズを２Ｍグアニジン塩酸塩水溶液、純水、１％トリエチルアミン／メタノール溶液、メタノール(各２００μＬ)で３回ずつ洗浄した。１０％無水酢酸／メタノール溶液(１００μＬ)を添加し、室温で３０分間反応させることでビーズ上の余剰のヒドラジド基をキャッピングした。ビーズをメタノール、１０ｍＭ塩酸、純水(各２００μＬ)で順次洗浄したのち、純水（２０μＬ）および２％酢酸／アセトニトリル溶液(１８０μＬ)を加え、７０℃で９０分間反応させることでビーズから糖鎖を再遊離させた。次に、３０％酢酸／ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに２ＡＢ(３５０ｍＭ)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(１Ｍ)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液５０μＬを上記ビーズに添加し、６０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル９５０μＬを加えて希釈した。この溶液をBlotGlyco(Ｒ)に付属のクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル４００μＬで３回、アセトニトリル／純水(９５：５，ｖ/ｖ)で３回洗浄した後、純水５０μＬを加えて２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
【００４２】
（ＨＰＬＣ測定）
上記で得られたラベル化糖鎖溶液のうち１０μＬをＨＰＬＣ測定に供した。ＨＰＬＣ装置は、Waters Corporation製‘Alliance’(Separation module 2695, Multi λ Fluorescent detector 2475)を使用し、蛍光励起波長330nm、検出波長420nmで測定した。カラムは、Shodex Asahipak NH2P-50 4Eを使用し、カラム温度は４０℃とした。溶離液は２％酢酸／アセトニトリル(Ａ液)と５％酢酸、３％トリエチルアミン／水(Ｂ液)を使用し、Ｂ液３０％(０分)→Ｂ液３０％(２分)→Ｂ液９５％(８０分)→Ｂ液９５％(１１０分)のグラジエント、流速１ｍＬ/分の条件で測定した。
【００４３】
[比較例]
（抗体精製）
プロテインＡビーズ分散液を容量１ｍＬのディスポーザブルカラム(Varian社製)に充填した。抗体を含む培養上清１．６ｍＬを加え、カラムを通過させた後、ｐＨ７の２０ｍＭリン酸バッファー１０００μＬで洗浄した。その後、ｐＨ２．７の１００ｍＭグリシンバッファー１０００μＬで抗体を溶出させた。回収した抗体溶液を透析により脱塩し、凍結乾燥することで精製抗体を得た。
【００４４】
（糖鎖遊離）
上記精製抗体を５０μＬの純水に溶解し、これに１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液(５μＬ)、１２０ｍＭジチオスレイトール水溶液(５μＬ)を加え、６０℃で３０分間反応させた。室温に戻した後、１２３ｍＭヨードアセトアミド水溶液(１０μＬ)を加え、室温で遮光して１時間静置した。Ｎ−グリコシダーゼＦ(ロシュ・アプライドサイエンス社製、11365193001)１０ユニットを加え、３７℃で２時間反応させた。９０℃で５分間加熱してＮ−グリコシダーゼＦを失活させた後、エタノール８０μＬを添加してタンパク質を沈殿させた。遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥することで糖鎖を得た。
【００４５】
（糖鎖の２ＡＢラベル化）
３０％酢酸／ジメチルスルホキシド溶液を調製し、これに２ＡＢ(３５０ｍＭ)およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム(１Ｍ)をそれぞれ記載の濃度で溶解させた。この溶液５０μＬを上記糖鎖に添加し、６０℃で２時間反応させることにより糖鎖を２ＡＢラベル化した。反応後、溶液をサンプルチューブに回収し、アセトニトリル９５０μＬを加えて希釈した。この溶液をクリーンアップカラム(底部にモノリスシリカフィルターを備えたスピンカラム)に全量加え、カラムを通過させることで２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカに吸着させた。カラムをアセトニトリル４００μＬで３回、アセトニトリル／純水(９５：５，ｖ／ｖ)で３回洗浄した後、純水５０μＬを加えて、２ＡＢラベル化糖鎖をモノリスシリカから溶出させた。
【００４６】
（ＨＰＬＣ測定）
実施例と同様の方法でＨＰＬＣ測定を行った。図１に、ＨＰＬＣチャートから読み取ったピークのうち、面積の上位５ピークについて実施例と比較例のデータを比較したものを示した。実施例と比較例で糖鎖解析のパターンに大差がないことが確認され、本発明の方法により、簡便な方法で従来法と同等の糖鎖分析が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の抗体の糖鎖を調製する方法を用いると、生体試料に含まれる抗体から糖鎖試料を簡便かつ迅速に調製することが可能となる。本発明は、抗体の糖鎖の研究、抗体の糖鎖構造と関連する疾患の診断、あるいは抗体医薬の研究開発・製造・品質保証に、大きく貢献しうるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の糖鎖を調製する方法であって、
（ａ）糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
（ｃ）遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【請求項２】
抗体を捕捉するための担体が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、イオン交換樹脂、または抗体精製用アプタマーが固定化された担体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの標品を含むキット。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬
（ｄ）反応液中に過剰に存在する（ｃ）の試薬を除去するための担体
（ｅ）反応用チューブ
【請求項４】
請求項１に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｃ）を含むマイクロ流路デバイス。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）（ａ）の担体および（ｂ）の担体に連通している流路
【請求項１】
抗体の糖鎖を調製する方法であって、
（ａ）糖鎖が結合した抗体を含む試料を、抗体を捕捉するための担体に接触させ、当該抗体を当該担体に捕捉する工程、
（ｂ）担体に捕捉した状態で抗体から糖鎖を遊離する工程、
（ｃ）遊離した糖鎖を固相担体に捕捉する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【請求項２】
抗体を捕捉するための担体が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、イオン交換樹脂、または抗体精製用アプタマーが固定化された担体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの標品を含むキット。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）担体に捕捉された糖鎖を標識化および／または再遊離するための試薬
（ｄ）反応液中に過剰に存在する（ｃ）の試薬を除去するための担体
（ｅ）反応用チューブ
【請求項４】
請求項１に記載の方法を実施するための、下記（ａ）から（ｃ）を含むマイクロ流路デバイス。
（ａ）抗体を捕捉するための担体
（ｂ）糖鎖を捕捉するための担体
（ｃ）（ａ）の担体および（ｂ）の担体に連通している流路
【図１】
【公開番号】特開２０１２−３２２０３（Ｐ２０１２−３２２０３Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７０１６８（Ｐ２０１０−１７０１６８）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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