抗体の製造方法
【課題】魚類を生かしたままの状態で、魚類に産生させた抗体を繰り返し得ることができる、抗体の製造方法の提供。
【解決手段】水泡を有する魚類を抗原投与の対象とすることにより、魚類を生かしたままの状態で、魚類に産生させた抗体を繰り返し得ることができる、抗体の製造方法。前記方法によって得られる抗体。
【解決手段】水泡を有する魚類を抗原投与の対象とすることにより、魚類を生かしたままの状態で、魚類に産生させた抗体を繰り返し得ることができる、抗体の製造方法。前記方法によって得られる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の製造方法に関する。さらに詳しくは、水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子組み換え技術により大腸菌、酵母等に有用なタンパク質を産生させ、また、これを抗原としてマウス等に投与することにより、抗体を産生させる技術が幅広く利用されている。
しかし、大腸菌などの原核生物に産生させたタンパク質は、多量体形成、糖鎖付加等の翻訳後修飾が正確に行われていない。また、酵母に産生させたタンパク質も完全な翻訳後修飾が行われていないため、本来の機能を有しない場合があるという問題があった。
【０００３】
これらの問題を解決すべく、昆虫細胞や、マウス、ブタ、ヒト等の哺乳動物の細胞において有用なタンパク質を産生させる技術が利用されているが、細胞を培養するためのコストが高く、有用なタンパク質が得られるまでに時間がかかるという問題があった。
そこで、近年、バイオリアクターとして魚類を活用することに注目が集まっている。魚類由来のタンパク質は、哺乳動物と同様に多量体形成、糖鎖付加等の翻訳後修飾が行われるという利点がある。そこで特許文献１ではこの利点を生かし、トランスジェニック魚類に多量体糖タンパク質を産生させ、胚、仔魚、稚魚等の組織、血液中から回収する技術が開示されている。
【０００４】
魚類は飼育が比較的容易であり、飼育コストも安価である。また、水温や給餌、日照時間、水質等によって産卵および採卵を制御できるなど、非常に扱いやすいという利点もある。
本発明者らは、抗原提示酵母を作成し、これをゼブラフィッシュ等の魚類に飼料として付与することで、魚類由来の特異的抗体を産生させる方法や、従来、困難とされてきたＧＰＣＲ（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）等の膜タンパク質に対する抗体を魚類に産生させる（特願２００９−８３９００）等、魚類による様々な技術を開発している（例えば、特許文献２、３、参照）。
しかし、これらの技術では、魚類全身から抗体を回収等するため、魚類を生かしたままの状態で、産生させた抗体を繰り返し得ることができなかった。
【０００５】
本発明者らは、この問題を解決するため、本発明の開発において、水泡眼等の水泡を有する魚類に着目した。この種の金魚は観賞用として、国内外で幅広く飼育されている。
特許文献４において、水泡眼の水疱（水泡）内液が、魚類細胞の細胞保護的又は細胞増殖促進的に作用すること、魚類細胞の処理操作等において、未受精卵の卵質を維持した状態で効率的な操作を可能とすることが開示されている。
しかし、この特許文献では、水疱（水泡）内液に抗体等の有用なタンパク質を産生させること等については示唆すらされておらず、従来の技術においても、水泡を有する魚類を抗体の産生に利用することは試みられていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−８６９９２号公報
【特許文献２】特開２００７−２５５８９２号公報
【特許文献３】特開２００９−７３７８３号公報
【特許文献４】特開２００９−１８３１５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、魚類を生かしたままの状態で、産生させた抗体を繰り返し得ることができる、抗体の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、水泡眼等の水泡を有する魚類を抗原投与の対象とすることにより、魚類を生かしたままの状態で、これらの魚類に産生させた抗体を繰り返し得ることができる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（８）の抗体の製造方法、該製造方法によって製造される抗体等に関する。
（１）水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法。（２）抗原を投与する部位が水泡である上記（１）に記載の製造方法。
（３）抗原をオイルベースとともに、またはオイルベースと不活化大腸菌とともに投与する上記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）魚類に産生させた抗体を、魚類の水泡から採取する工程を含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）水泡を有する魚類が水泡眼またはらんちゅうである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）抗原がタンパク質または糖タンパク質である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）抗原がＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＥＧＦＰと示す場合がある）、グルコアミラーゼまたはＬＧＲ３（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３；以下、ＬＧＲ３と示す場合がある）である上記（６）に記載の製造方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法によって製造される抗体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法により、魚類に抗体を産生させることにより、魚類を生かしたままの状態で大量の抗体を繰り返し製造することが可能となった。本発明の製造方法では、糖タンパク質等を抗原とする場合でも、有用な抗体を製造することができる、有用な抗体の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ウェスタンブロット法の結果を示した図である（実施例１）。
【図２】ドットブロット法の結果を示した図である（実施例１）。
【図３】水泡眼（一例）の写真を示した図である（実施例１）。
【図４】タグの写真を示した図である（実施例１）。
【図５】抗原抗体反応の結果（ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質）を示した図である（実施例１）。
【図６】抗原抗体反応の結果（精製ＧＡ−Ｈｉｓ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓ）を示した図である（実施例１）。
【図７】ｐＣｏｌｄ ＴＦ−ｈＬＧＲ３の配列を示した図である（実施例２）。
【図８】抗原抗体反応の結果を示した図である（実施例２）。
【図９】抗原抗体反応の結果を示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「抗体の製造方法」とは、抗体を産生する生物を魚類とし、これに抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む方法のことをいう。
本発明の「抗体の製造方法」は、魚類が水泡を有する魚類であって、この水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む製造方法であればよく、抗体を製造するせるために、従来知られている他の工程や方法を含むものであってもよい。
【００１３】
この方法において、「抗原を投与」は、魚類に抗体を産生させることが可能な投与方法であればどのような方法であってもよい。例えば、抗原となるタンパク質や抗原酵母等を飼料として経口的に投与したり、腹腔や水泡を投与部位として、抗原を直接、注射等によって投与したりすることが挙げられる。本発明においては特に、抗原の投与部位を水泡として、ここに直接抗原を投与することが好ましい。
【００１４】
抗原は、そのまま投与してもよく、アジュバントと組み合わせて投与しても良い。アジュバントとしては、魚類の抗体産生を助けるものであれば、どのようなものであってもよいが、特にオイルベースをアジュバントとすることや、オイルベースと不活化大腸菌とを組み合わせたものをアジュバントとすることが好ましい。
【００１５】
本発明の「抗体の製造方法」には、魚類に産生させた抗体を回収する工程も含むことができる。この抗体の回収は、魚類を生かしたまま回収できる方法で行うことが好ましく、特に、魚類の水泡から、抗体を含む水泡内液を回収する等の方法であることが好ましい。この場合、魚類の水泡に直接注射針等をさして、水泡内液を回収することにより、魚類を生かしたままで、魚類に産生させた抗体を回収することが可能となる。
【００１６】
本発明における「水泡を有する魚類」としては、魚類の表皮に水泡を有する魚類であれば、いずれの魚種も含まれる。この「水泡を有する魚類」の水泡には、産生された抗体を含むリンパ液が含まれており、水泡内に貯留したこの液を注射器等で採取した場合、再貯留するという性質がある。このような「水泡を有する魚類」として、例えば、水泡眼、らんちゅうなどの金魚を挙げることができる。
【００１７】
本発明の「抗原」とは、抗体を産生させるためのものであればどのようなものであってもよく、ＧＰＣＲ、ＬＧＲ３などの膜貫通型タンパク質、ＥＧＦＰなどの可溶性タンパク質や、α−ジストログリカン、グルコアミラーゼなどの糖タンパク質であってもよい。
魚類に投与する抗原の量は、魚類が抗体を産生できる量であれば特に問わないが、抗原となるこれらのタンパク質が１００μｇ以上となるように、投与されることが特に好ましい。
【００１８】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
Ｉ．抗原の調製
＜抗原＞ 麹菌グルコアミラーゼ
１−１．プラスミドの構築
１）麹菌アスペルギルスオリザ由来の硝酸還元酵素遺伝子（以下、ｎｉａＤ遺伝子と示す場合がある）の大腸菌ベクターへの組み込み
目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ（配列表配列番号１）、プライマーＢ（配列表配列番号２）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｎｉａＤ遺伝子（配列表配列番号３）を増幅した。
目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡは参考文献１に記載の定法に従い、調製した。
参考文献１：Ｒ．Ｃ．Ｇａｒｂｅｒ ａｎｄ Ｏ．Ｃ．Ｙｏｄｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３５，４１６−４２２（１９８３）
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２０】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｎｉａＤ遺伝子のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｎｉａＤ遺伝子のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を大腸菌プラスミドｐＵＣ１１９（宝ホールディングス）のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｎｉａＤマーカー遺伝子がサブクローニングされた大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２を得た。
大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２は、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ部位の両方にｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２１】
２）麹菌アスペルギルスオリザ由来のグルコアミラーゼＢターミネーター遺伝子（以下、ｇｌａＢターミネーター遺伝子と示す）の大腸菌ベクターへの組み込み
麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＣ（配列表配列番号４）とプライマーＤ（配列番号５）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｇｌａＢターミネーター遺伝子（配列表配列番号６）を増幅した。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２２】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ−ＸｈｏＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｇｌａＢターミネーター遺伝子のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｇｌａＢターミネーター遺伝子のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を、上記１）で得た大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２のＳａｌＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｇｌａＢターミネーター遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＩＡＴを得た。
大腸菌プラスミドｐＮＩＡＴは、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ部位の両方に遺伝子をｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２３】
３）麹菌アスペルギルスオリザ由来のｓｏｄＭプロモーター遺伝子（以下、ｓｏｄＭプロモーター遺伝子と示す）の組み込み
麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＥ（配列表配列番号７）、プライマーＦ（配列表配列番号８）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、麹菌由来ｓｏｄＭプロモーター遺伝子（配列表配列番号９）を増幅した。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２４】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ−ＰｓｔＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｓｏｄＭプロモーター遺伝子のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｓｏｄＭプロモーター遺伝子のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片を、上記２）で得た大腸菌プラスミドｐＮＩＡＴのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｓｏｄＭプロモーター遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＭＢを得た。
大腸菌プラスミドｐＮＭＢは、ＳａｌＩ部位に麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子をｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２５】
１−２．目的遺伝子の組み込み
１）ベクターの調製
上記１−１．で構築した大腸菌プラスミドｐＮＭＢを制限酵素ＳａｌＩで処理（３７℃）した後、ｄＮＴＰを最終１０ｍＭとなるように添加してＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝ホールディングス）で１時間処理（３７℃）した。さらに、バクテリア由来アルカリホスファターゼ（宝ホールディングス）で３０分処理（５０℃）した。処理後得られた物をＰＣＲクリーンアップカラム（プロメガ社製）で溶出させ、ベクターとした。
【００２６】
２）インサートの調製
麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を目的遺伝子として、上記ベクターにサブクローニングするインサートとして調製した。
目的遺伝子は、ａ）麹菌由来グルコアミラーゼＢ（ｇｌａＢ）遺伝子（配列表配列番号１０（アミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した））、またはｂ）Ｈｉｓタグ遺伝子をつなげた麹菌由来グルコアミラーゼＢ（ｇｌａＢ）遺伝子（配列表配列番号１２（アミノ酸配列を配列表配列番号１３に示した））であった。
上記１−１．１）で調製した目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、目的遺伝子の開始コドンから下流３０ｂｐのセンス鎖のプライマー（５’末端をリン酸化）（配列表配列番号１４）と、目的遺伝子の終止コドンから上流４９ｂｐのアンチセンス鎖のプライマー（５’末端をリン酸化）（配列表配列番号１５）と、ｐｆｕ Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物をＰＣＲクリーンアップカラム（プロメガ社製）で処理溶出させ、インサートとした。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２７】
３）ベクターとインサートのライゲーション
上記１）で得たベクターおよび上記２）で得た各目的遺伝子のインサートを１：２０（モル比）となるように添加して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションを行い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換した。
形質転換体から、各目的遺伝子の読み枠がｓｏｄＭプロモーターと正方向にサブクローニングされているものを目的遺伝子発現プラスミドとした。
【００２８】
１−３．目的遺伝子発現株の取得
ＰＥＧ−カルシウム法により、上記１−２．で調製した目的遺伝子発現プラスミドにより、麹菌アスペルギルスオリザのｎｉａＤ変異株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７として寄託済み）を形質転換した。
【００２９】
１）ＰＥＧ−カルシウム法は、参考文献２に従い、以下の手順により行った。
即ち、麹菌胞子約１０8個を１００ｍｌ ＤＰＹ液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養を行った。こうして発芽させた後、ガラスビーズ（直径０．６ｃｍ）を培養フラスコに加え、３０℃，１３０ｒｐｍの震とう培養でさらに２４時間培養した。
菌糸を採集し、０．８Ｍ ＮａＣｌ水溶液で菌糸を２〜３回洗い、洗った菌糸に１０ｍｌの新しく作ったプロトプラスト化溶液（１５ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ），１０ｍｇ／ｍｌ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０（Ｙａｋｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ），０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＤＴＴ）を加え、３０℃で３〜４時間ゆっくりと震とうし、細胞壁を消化してプロトプラストを調製した。
得られたプロトプラスト溶液をミラクロス（カルビオケム社）でろ過し、ろ液を更に４℃，２５００ｇ、５分間、遠心分離して回収した。
【００３０】
プロトプラストを氷冷した溶液１（０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で洗浄した後、２×１０8／ｍｌになるように溶液１に懸濁して、その量に対して０．２容量になるように溶液２（４０％ ＰＥＧ４０００，５０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加え、静かに混合した。
形質転換は、０．１ｍｌのプロトプラスト溶液を新しい１５ｍｌチューブに移し、１５μｌ以下（３〜７μｇ）の目的ＤＮＡを加え、氷上で３０分間放置した後、０．５ｍｌ溶液２を加えゆっくりと攪拌し、室温で２０分間放置した。５ｍｌ溶液１を加えて、混合した後、４℃で２５００ｇの速度で５分間遠心を行った。
プロトプラストを含んだ沈殿物を０．１ｍｌの溶液１に懸濁し、０．８Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤ再生培地に広げ、さらに、その上に、３０℃まで冷却したＣＤ軟寒天培地を添加した後、固化させ、２８℃で４〜７日培養した。
参考文献２：Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ， ２１８，９９−１０４，（１９８９）
【００３１】
２）形質転換体のうち硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（２％ グルコース、０．１％ リン酸１水素２カリウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、０．００１％ 硫酸鉄、０．３％ 硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、目的遺伝子発現プラスミドを保持する形質転換体を複数得た。
【００３２】
１−４．目的遺伝子産物の調製
上記１−３．により得られた形質転換体をポテトデキストロース培地で培養することで胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。
回収した胞子を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った１００ｍｌ ＧＰＹ液体培地（２％ グルコース、１％ ポリペプトン、０．５％ イーストエキストラクト、０．１％ リン酸１水素２カリウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、０．００１％ 硫酸鉄、０．３％ 硝酸ナトリウム）に最終胞子濃度１Ｘ１０6／ｍｌとなるように植菌した。
これを３０℃で３日間液体培養し、目的遺伝子産物が分泌発現した培養上清を回収した。
【００３３】
１−５．培養上清の濃縮
上記１−４．で回収した培養上清の一部を、分画分子量１０，０００ＮＭＷＬのセントリプレップ１０（ミリポア社製）により遠心分離（３，０００×ｇ）し、濃縮した。
【００３４】
１−６．培養上清に含まれるＧＡ濃度の定量
上記１−４．で回収した培養上清に含まれるＧＡ濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって培養上清からタンパク質を分離し、ＣＢＢ染色像を画像解析ソフトのＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０（ＡＴＴＯ）により定量化することで推定した。
すなわち、次の１）〜５）の工程を行った。
１）下記１−７．で得た精製ＧＡを３μｇから１１μｇとなるようにＰＢＳに溶解した（スタンダード）。
これと、１〜３μＬの１ｘ培養上清とにそれぞれ５ｘサンプルバッファー（２．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ、１０％ ＳＤＳ）を添加（終濃度１ｘ）し、１００℃で５分間煮沸することによってサンプルとした。
２）これらのサンプルから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ ポリアクリルアミドゲル、２００Ｖ、２０ｍＡ）によってタンパク質を分離した。
３）泳動後のゲルをＣＢＢ染色液（０．２５％ ＣＢＢ−Ｒ２５０、５０％ メタノール、５％ 酢酸）に浸漬し、室温で３０分間振盪しながらタンパク質を染色した。
４）染色後のゲルを脱色液（２５％ メタノール、１０％ 酢酸）に浸漬し、室温で振盪しながらタンパク質に結合しなかったＣＢＢを洗浄した。
５）脱色後のゲルをＣＣＤカメラ（Ｌｉｇｈｔ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ、ＡＴＴＯ）により撮影し、検出されたＧＡのバンドをＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０のゾーンデンシトメトリー解析によって定量化し、精製ＧＡの積算値から検量線を作成した。
作成した検量線から推定された培養上清（濃縮なし）に含まれるＧＡ濃度は約３．０μｇ／μＬであった。
この結果より、上記１−５．にて５倍濃縮した培養上清を金魚用リンガー液｛１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ ｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）｝によってＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを培養上清ＧＡまたは培養上清ＧＡ−Ｈｉｓと示す場合がある）。
【００３５】
１−７．目的遺伝子産物の精製
１）目的遺伝子産物
上記１−４．で回収した培養上清の一部を飽和濃度７０％の硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩撹拌しタンパク質を沈殿させた後、遠心分離により沈殿を取り除いた。
この培養上清をブチルトヨパール−６５０Ｍ（東ソー社製）樹脂を添加し、低温で一晩撹拌した後、樹脂を回収した。
回収した樹脂を１．５Ｍ 硫酸アンモニウム溶液で２回洗浄し、１０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で目的のＧＡタンパク質を溶出し、凍結乾燥したものを、精製ＧＡタンパク質とした。
精製ＧＡタンパク質は、金魚用リンガー液によりＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを精製ＧＡと示す場合がある）。
【００３６】
２）Ｈｉｓタグをもつ目的遺伝子産物
上記１−４．の目的遺伝子産物を含む培養上清をニッケルカラム（Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に添加した後、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび４００ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を添加してカラムに結合した組換えグルコアミラーゼを溶出した。
この溶出液を透析膜に移し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を含む１Ｌのバッファーに対し、４℃、３時間で透析を２回行い、Ｈｉｓタグをもつ目的遺伝子産物を精製した。
精製したＨｉｓタグをもつ目的遺伝子産物は、金魚用リンガー液によりＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを精製ＧＡ−Ｈｉｓと示す場合がある）。
【００３７】
＜抗原＞ ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質
２−１．ベクターの作製（プラスミドの構築〜目的遺伝子の組み込み）
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）を次のように改変することにより、ｃｓｐ Ａプロモーターの下流に５’非翻訳領域、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＥＥ）、ＥＧＦＰ、および３’末端に精製用のタグであるＨｉｓタグのＤＮＡ配列が連結したコンストラクトである、ｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓベクターを作製した。
１）本発明者らがｐＸＩ（配列表配列番号１６）の下流にＥＧＦＰ（配列表配列番号１７）を組み込んで作製したｐＸＩ−ＥＧＦＰベクター（特願２００９−１０７３４４号、参考文献３）を鋳型として、プライマーＧ（配列表配列番号１８）、プライマーＨ（配列表配列番号１９）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｅｇｆｐ遺伝子の開始コドンが制限酵素ＳｍａＩの認識配列に変換され、３’末端がＨｉｓタグのＤＮＡ配列に変換された断片を増幅した。
参考文献３：Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＤ，Ｋｒｉｅｇ ＰＡ．ｐＸｅＸ，ａ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｇｅｎｅ． １９９４ Ｓｅｐ．
＜ＰＣＲ条件＞
９５℃（１分間）を１サイクル
９５℃（１０秒間）、５５℃（３０秒間）、７２℃ （２分間）を３０サイクル
７２℃（５分間）を１サイクル
【００３８】
２）上記１）の増幅産物（ｅｇｆｐ遺伝子の開始コドンが制限酵素ＳｍａＩの認識配列に変換され、３’末端がＨｉｓタグのＤＮＡ配列に変換された断片）を鋳型として、プライマーＧ（配列表配列番号１８）、プライマーＩ（配列表配列番号２０）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、上記１）と同様の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｈｉｓタグの下流に制限酵素ＳｆｉＩの認識配列が連結したｅｇｆｐ−ｈｉｓ６遺伝子断片を増幅した。
【００３９】
３）ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＤＮＡ（タカラバイオ）を鋳型として、プライマーＪ（配列表配列番号２１）、プライマーＫ（配列表配列番号２２）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ＴＥＥにＳｍａＩの認識配列が連結し、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＤＮＡのｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列の上流にＳｆｉＩの認識配列が連結するＤＮＡ断片を増幅した。
【００４０】
上記３）で増幅したＤＮＡ断片と、ＳｍａＩおよびＳｆｉＩによって消化した上記２）のｅｇｆｐ−ｈｉｓ６遺伝子断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ）によりライゲーションすることによってｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓを作製した。
【００４１】
２−２．目的遺伝子産物の調製
上記２−１．で作製したｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓベクターにより大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ平板培地に塗抹して、３７℃で一晩保温しながら培養した。なお、特に記載のない場合、試薬は全て和光純薬工業株式会社の製品を使用した。
【００４２】
１）生成したコロニーをＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地に植菌し、３７℃で１２時間振盪しながら培養した。この培養上清を、あらかじめ作製した２ｘＹＴ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地｛５０μｇ／ｍＬ アンピシリンナトリウム、１．６％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ（ＢＤ）、１％ 乾燥酵母エキス（ナカライテスク）、０．５％ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０）｝に植菌し、波長６００ｎｍの吸光度が０．４〜０．５の範囲となるまで３７℃で振盪しながら培養した。
その後、１５℃で３０分間静置し、０．１ｍＭ Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培養上清の１／１０００量を添加して、１５℃で２４時間振盪しながらＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質の発現を誘導した。
目視にてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質の発現を確認した後、４℃で３０００ｘｇ １５分間遠心分離して菌体を回収し、予冷した１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4）により２回洗浄することで残留した培地成分を除去した。
【００４３】
２）上記１）に続いて、４０ｍＬのＮｉカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝を添加し、微量超音波細胞破砕機（ＭＩＣＲＯＳＯＮ ＸＬ ２０００、ＭＩＳＯＮＩＸ）により菌体を破砕した。
次に、４℃で１２０００ｘｇ ３０分間遠心分離して上清を回収し、０．２０μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）によって夾雑物を除去して大腸菌発現タンパク質抽出液とした。
調製した大腸菌発現タンパク質抽出液をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＧＥヘルスケア）を充填したＮｉ カラム（ＧＥヘルスケア）にペリスタポンプ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）によって添加することで、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を担体に結合させた。
【００４４】
３）上記２）に続いて、Ｎｉカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝およびＮｉカラム溶出緩衝液Ｂ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝による２０ｍＭ〜５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌの連続濃度勾配によってカラムからＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を溶出した。
【００４５】
４）次に、限外濾過膜（ミリポア）を用いて、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質が溶出した画分のＮｉ カラム溶出緩衝液をＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）｝にバッファー置換したものをサンプルとし、あらかじめＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体（ＧＥヘルスケア）を充填した陰イオン交換カラムに低圧クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ：ＧＥヘルスケア）によって添加することで、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を担体に結合させ、ＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）｝およびＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ｂ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）｝により、０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの連続濃度勾配による溶出を行った。
【００４６】
５）上記４）のカラムより溶出したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を含む画分の溶液を、２価イオンを含まない金魚用リンガー液｛１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）｝に置換し、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質濃度が４μｇ／μＬになるように調製した。
【００４７】
ＩＩ．抗原抗体反応の確認
上記Ｉ．にて調製した抗原（精製ＧＡ、精製ＧＡ−ＨｉｓおよびＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質）を抗体と作用させ、ウェスタンブロット法またはドットブロット法により、抗原抗体反応を確認した。
１．抗体
１）抗Ｈｉｓ抗体
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２）抗ＧｌａＢ抗体
グルコアミラーゼタンパク質全長のペプチド（配列表配列番号１１）をデザインし、化学合成によりペプチド合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）をキャリアタンパク質としてコンジュゲーションしたペプチドを抗原としてウサギに免疫することにより抗体を得た（カスタム抗体作製；インビトロジェン社製）。
【００４８】
２．ウェスタンブロット法
１）上記Ｉ．にて調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓに５ｘサンプルバッファー（２．５Ｍ Ｔｒｉｓ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ，１０％ ＳＤＳ）をそれぞれ添加し（終濃度１ｘ）、１００℃で５分間煮沸してサンプルとした。
これらのサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルにより２００Ｖ ２０ｍＡの設定で電気泳動し、タンパク質を分離した。
【００４９】
２）次にセミドライブロッターによってタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）に転写し、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（０．５％ ＰＢＳＴ）で２回リンスして、５％ スキムミルク／０．５％ＰＢＳＴに浸漬して振盪しながら１時間ブロッキングした。
ブロッキング後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで２回リンスし、０．５％ＰＢＳＴで１５分間ｘ１回、５分間ｘ２回洗浄して、余分なブロッキング液を除去した。
【００５０】
３）続いて上記１．の抗Ｈｉｓ抗体および抗ＧｌａＢ抗体をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ（ＴＯＹＯＢＯ） Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １により、それぞれ１／３０００および１／１０００に希釈し、これにＰＶＤＦ膜を浸漬して室温にて１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜を０．５％ ＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
４）次に、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体および抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって、それぞれ１／２５０００および１／１０００００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。
【００５１】
５）反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、発光基質液｛Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ ヘルスケア）｝に浸漬して室温で５分間反応させたのち、ＣＣＤカメラ［Ｌｉｇｈｔ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）］によって撮影し、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０（ＡＴＴＯ）により発光を検出した。
【００５２】
その結果、図１、Ａ（抗Ｈｉｓ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体によって、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ検出したところ、抗Ｈｉｓ抗体を反応させたＰＶＤＦ膜ではＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図１、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図１、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）がそれぞれ検出された。
また、図１、Ｂ（抗ＧｌａＢ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体を反応させたＰＶＤＦ膜では精製ＧＡ（図１、ｇｌａＢ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図１、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）がそれぞれ検出された。
従って、これらの結果から、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗ＧｌａＢ抗体および抗Ｈｉｓ抗体で検出できることが確認できた。
なお、図１では、各写真の上部に、各レーンに泳動したサンプル量および使用した一次抗体、二次抗体とその希釈倍率を示している（Ｍ：プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ）（Ｂｉｏ Ｒａｄ））。
【００５３】
２．ドットブロット法
１）上記Ｉ．にて調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓを、ＰＢＳにより、それぞれ２５０ｐｇ／μＬから２５０ｎｇ／μＬの範囲に希釈してサンプルとした。
２）ＰＶＤＦ膜をメタノールに浸漬して５分間振盪しながら置換し、その後超純水に浸漬して１０分間ｘ２回振盪しながら置換し、最後にＰＢＳに浸漬して１０分間以上振盪しながら置換することによって平衡化した。
３）上記１）のサンプル滴下直前にＰＶＤＦ膜をプロワイプ（エリエール）に挟み込むことによって余分なＰＢＳを除去し、パラフィルム上のＰＶＤＦ膜へサンプルを２μＬずつ滴下して風乾した。
【００５４】
４）乾燥させたＰＶＤＦ膜を｛５％ スキムミルク／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）（０．０５％ ＴＢＳＴ）｝によって平衡化およびブロッキングした。
５）続いて、ＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより２回リンスし、１０分間振盪しながら洗浄して５分間ｘ２回振盪しながら洗浄し、余分なスキムミルク溶液を除去した。
６）続いて、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １により、上記１．の抗Ｈｉｓ抗体、抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）および抗ＧｌａＢ抗体をそれぞれ１／３０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で２時間振盪しながら反応させた。
反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
【００５５】
７）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体および抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体をそれぞれ１／２５０００および１／１０００００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。
８）反応後のＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、ウェスタンブロット法と同様に発光基質液と反応させて発光を検出した。
【００５６】
その結果、図２（左側）に示されるように、抗ＧＦＰ抗体により、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓの検出をそれぞれ行ったところ、１０ｎｇから５００ｎｇまでのＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図２、ＧＦＰ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
また、図２（中央）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体により検出を行ったものは、１０ｎｇから５００ｎｇまでの精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図２、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）のスポットおよび５０ｎｇから５００ｎｇまでのＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図２、ＧＦＰ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
さらに、図２（右側）に示されるように、抗ＧｌａＢ抗体により反応させたＰＶＤＦ膜では５００ｐｇから５００ｎｇの精製ＧＡ（図２、ｇｌａＢ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図２、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
以上の結果から、抗ＧｌａＢ抗体および抗Ｈｉｓ抗体によって精製ＧＡ−Ｈｉｓを検出できることが確認された。
【００５７】
またこの条件では、１／１０００に希釈した抗ＧｌａＢ抗体は５００ｐｇ以上の精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓを、１／３０００に希釈した抗Ｈｉｓ抗体は１０ｎｇ以上の精製ＧＡ−Ｈｉｓおよび５０ｎｇ以上のＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を、１／３０００に希釈した抗ＧＦＰ抗体では１０ｎｇ以上のＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質がそれぞれ検出できることも示された。
なお、図２でも、写真の上部に、各行に滴下したタンパク質の種類と、検出に使用した一次抗体および二次抗体とその希釈倍率をそれぞれ示した。写真の左側には、各列に滴下した各タンパク質量を示した。
【００５８】
ＩＩＩ．水泡を有する魚類による抗体産生
１．試料
１）水泡を有する魚類
愛知県弥富市の丸照養魚場より入手した水泡眼を使用した。これらは、中和剤（金魚・メダカの中和剤、株式会社ニチドウ）を加えて残留塩素を中和した水道水により、水温２０〜２５℃で飼育した。本発明で使用した水泡眼（一例）を図３に写真で示した。
２）試薬
特に記載のない場合、試薬は全て和光純薬工業株式会社の製品を使用した。
３）抗原
上記Ｉ．で調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡ−Ｈｉｓまたは培養上清ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ抗原とした。
【００５９】
４）アジュバント
次の（Ａ）〜（Ｄ）を調製し、アジュバントとした。
（Ａ）レシチンを含むオイルベース
（Ｂ）不活化結核菌を混合したオイルベース
（Ｃ）不活化麹菌を混合したオイルベース
（Ｄ）不活化大腸菌を混合したオイルベース
【００６０】
（１）オイルベースの調製
オイルベースは、参考文献４を改変して、以下のように作製した。
すなわち、１０ｇのグリセロールに０．１ｇの卵黄レシチンを添加し、６０℃で保温しながらスターラーによって撹拌した。次に、１０ｇの落花生油（ナカライテスク）を徐々に添加し、均一になるまで同様に撹拌してオイルベースとした。
参考文献４：Ｊ．Ａ．ＲＥＹＮＯＬＤＳ ｅｔ ａｌ．１９８０（Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＪＡ， Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＤＧ， Ｃｒａｂｂｓ ＣＬ， Ｐｅｔｅｒｓ ＣＪ， Ｄｉ Ｌｕｚｉｏ ＮＲ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９８０ Ｊｕｎ；２８（３）：９３７−９４３．
【００６１】
（２）不活化大腸菌、不活化麹菌の調製
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間振盪培養した。
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＯＳＩ−１０１３株をＤＰＹ液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養した。
これらの菌をソニケーターで破砕し、不活化大腸菌および不活化麹菌を得た。
（３）不活化結核菌
結核菌Ｈ３７ Ｒａ， 乾燥（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を不活化結核菌として使用した。
（４）オイルベースと不活化大腸菌、不活化結核菌、不活化麹菌の混合
不活化大腸菌、不活化結核菌、不活化麹菌を、それぞれオイルベースに０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加した。
【００６２】
（５）抗原とアジュバントの混合
（Ａ）〜（Ｄ）のそれぞれのアジュバントと抗原溶液を１ｍＬ容シリンジ（テルモ）および１８Ｇの試薬混合針（三商）により体積比１：１で混合し、油中水型エマルジョンを作製して免疫に使用した。菌体を混合したアジュバントは初回免疫時のみ使用し、２回目以降はオイルベースのみのアジュバントを使用した。
【００６３】
２．抗体の産生
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を抗原とする試験区Ａ〜Ｅ、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｆ〜Ｊ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｋ，Ｌおよびコントロールとして試験区Ｍを作成し、各試験区における水泡眼は６匹とした。各試験区の抗原、アジュバントの組合せを表１に示した。
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を抗原とする試験区Ａ〜Ｅ、およびコントロールの試験区Ｍの合計３６匹は、６Ｌ水槽に一匹ずつ、同水系において飼育した。また、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｆ〜Ｊ、および培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｋ，Ｌの合計３６匹は個体識別のためのタグ（図４（Ａ））を水泡眼の尾柄部分に装着し（図４（Ｂ））、６０Ｌ水槽に１試験区（６匹）ごと飼育した。
【００６４】
水泡眼への免疫は、試験区ごとに抗原のみ、またはアジュバントと混合してエマルジョン化した抗原を水泡眼の右側水泡に１匹当たり１００μｇ注射することによって行った。免疫は１４日に１回行い、７０日間継続した。
免疫前および免疫と同日に水泡眼の左側水泡から１匹当たり５０〜１００μＬの水泡液を採取した。免疫と同日に水泡液を採取する場合は、先に免疫した後、水泡液を採取した。
採取した水泡液は、４℃で１５００ｘｇ １０分間遠心分離して上清を回収し、抗体価測定のためのサンプルとした。なお、調製したサンプルは抗原特異的な抗体の検出に使用するまで、−２０℃で保管した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
３．ドットブロット法による抗体検出
１）サンプル
上記２．において採取した水泡液を解凍した後、４℃で１００００ｘｇ １０分間遠心分離して沈殿を除去してサンプルとした。
また、抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）をネガティブコントロールとし、抗Ｈｉｓ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳで１／１００〜１／５０００の範囲に希釈したものをポジティブコントロールとした。
２）抗原
上記Ｉ．で調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質および精製ＧＡ−ＨｉｓをそれぞれＰＢＳに置換したものを抗原とした。
【００６７】
３）ドットブロット
抗原抗体反応の検出は、次の（１）〜（６）の手順により、サンドイッチ法によるドットブロット法によって行った。
（１）ＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）をメタノールに浸漬して５分間振盪しながら置換し、その後超純水に浸漬して１０分間ｘ２回振盪しながら置換した。最後に、ＰＢＳに浸漬して１０分間以上振盪しながら置換することによって平衡化した。サンプル滴下直前にＰＶＤＦ膜をプロワイプ（エリエール）に挟み込むことによって余分なＰＢＳを除去し、パラフィルム上のＰＶＤＦ膜へサンプルを２μＬずつ滴下して風乾した。
（２）乾燥させたＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルク／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＴＢＳ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（０．０５％ ＴＢＳＴ）｝で平衡化およびブロッキングした。
続いて、ＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより２回リンスし、１０分間振盪しながら洗浄した。さらに、５分間ｘ２回振盪しながら洗浄することによって、余分なスキムミルク溶液を除去した。
【００６８】
（３）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ）によって抗原となるＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質あるいは精製ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ５ｎｇ／μＬあるいは１０ｎｇ／μＬに希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で２時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗原溶液を除去した。
（４）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １によって抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）あるいは抗ＧＡ抗体（月桂冠より供与）をともに１／３，０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
【００６９】
（５）続いて、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体を１／１００，０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
（６）反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、発光基質液（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥ ヘルスケア）に浸漬して室温で５分間反応させた後、ＣＣＤカメラによって発光を検出した。
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を投与した試験区の結果を図５および表２に示し、精製ＧＡ−Ｈｉｓ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを投与した試験区の結果を図６および表３に示した。
【００７０】
【表２】
【００７１】
その結果、図５および表２に示されるように、抗原とともにアジュバントとしてオイルベースを投与した試験区Ｂの２匹と、オイルベースに不活化大腸菌を加えて免疫した試験区Ｃの２匹において、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図５、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ、以下同様である）に対する抗体が検出され、さらに抗体価の増加が見られた。
しかしながら、抗原とともにオイルベースと結核菌を加えて免疫した試験区Ｄ、麹菌を加えて免疫した試験区ＥではＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加が認められなかった。また同様に、抗原のみを投与した試験区Ａにおいても抗体価の増加は見られなかった。
【００７２】
試験区ＢにおいてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加が認められた２匹のうち、識別個体３では初回免疫から４２日以降の水泡液において抗体価が増加し、特に５６日後から７０日後にかけて抗体価が徐々に増加していた。また、識別個体６では４２日後に抗体価がわずかに増加し、５６日後にさらに増加していた。
一方、試験区ＣにおいてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加がみられた２匹のうち、識別個体３では４２日後から抗体価が大きく増加し、７０日後まで継続しており、また識別個体６でも４２日後から抗体価が増加し、７０日後まで継続していた。
【００７３】
なお、図５では、左上に抗Ｈｉｓ抗体を反応させたポジティブコントロール（＋）および抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体を反応させたネガティブコントロール（−）の結果を示している（希釈倍率：１／１００〜１／１８００）。
図５、各ＰＶＤＦ膜上部のアルファベットは各試験区、１〜６までの数字は水泡眼の個体識別番号を示し、アルファベットの右に各試験群の免疫条件（ＯＢ：オイルベース）を示している。また、右側には各列にはサンプル（水泡液）の採取日（ｐｒｅ：免疫前、その他は初回免疫から採取日までの日数）を示している。
【００７４】
【表３】
【００７５】
また、図６および表３に示されるように抗原とともにアジュバントとしてオイルベースを免疫した試験区Ｇの３匹において精製ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体が検出され、抗体価も増加していた。
しかしながら、オイルベースに大腸菌を加えて免疫した試験区Ｈ、結核菌を加えて免疫した試験区Ｉ、麹菌を加えて免疫した試験区Ｊでは、精製ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加は見られなかった。また同様に、抗原のみを投与した試験区Ｆにおいても抗体価の増加は検出されなかった。
【００７６】
培養上清ＧＡ−Ｈｉｓ（図６、ＧＡ麹菌培養上清、以下同様である）を免疫した試験区ＫおよびＬでは、抗原のみを免疫した試験区Ｋの３匹、抗原とともにオイルベースを免疫した試験区Ｌの１匹において培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が見られた。
試験区Ｋにおいて培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が検出された３匹のうち、識別個体１では初回免疫から４２日後の水泡液から抗体価が増加し、７０日後まで継続した。また、識別個体４では７０日後の抗体価がわずかに増加し、識別個体６では２８日後の抗体価が増加した。試験区Ｌについては、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が検出された識別個体６では、初回免疫から４２日後の水泡液における抗体価がわずかに増加し、５６日後にさらに増加して７０日後まで継続した。
コントロールとして金魚用リンガー液とともにオイルベースを免疫した試験区Ｍでは、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡ−Ｈｉｓおよび培養上清ＧＡ−Ｈｉｓのいずれの抗原に対しても抗体価の増加は認められなかった。
【００７７】
なお、図６では、左上に抗Ｈｉｓ抗体を反応させたポジティブコントロール（＋）および抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体を反応させたネガティブコントロール（−）の結果を示している（希釈倍率：１／１００〜１／５０００）。
図６、各ＰＶＤＦ膜上部のアルファベットは各試験区、１〜６までの数字は水泡眼の個体識別番号を示し、アルファベットの右に各試験群の免疫条件（ＯＢ：オイルベース）を示している。また、右側には各列にはサンプル（水泡液）の採取日（ｐｒｅ：免疫前、その他は初回免疫から採取日までの日数）を示している。
【実施例２】
【００７８】
Ｉ．抗原の調製
＜抗原＞ ＬＧＲ３
１−１．ベクターの作製（プラスミドの構築〜目的遺伝子の組み込み）
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）を次のように改変することにより、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲを作製した。
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）上のトリガーファクター（ＴＦ）配列を除去するために、ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＳｍａＩおよびＳｆｉＩ認識配列を持つプライマーによるＰＣＲを行い、ベクターを増幅した。
同様に、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ｈＬＧＲ３（インビトロジェン）を鋳型とし、制限酵素ＳｍａＩおよびＳｆｉＩ認識配列を持つプライマーによるＰＣＲを行い、ｈＬＧＲ３（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３；ｈＬＧＲ３）遺伝子のｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ（ＬＲＲ）部分（配列表配列番２３）（図７、ｈＬＧＲマーカー部分（塩基：１６９５〜２１７３））を増幅した。
増幅産物を精製後、制限酵素処理に供し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲを構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８株によりコンストラクトを作製し、上記にて構築したｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲの塩基配列を確認したところ、構築前に予想した塩基配列と完全に一致した。従って、この結果より、コンストラクトが正しく構築されていることが確認できた。
【００７９】
ＩＩ．抗原抗体反応の確認
上記Ｉ．で作製したコンストラクト（発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲ）を大腸菌ｏｒｉｇａｍｉ株に形質転換した。
ダイレクトＰＣＲ法によって形質転換が確認された株を、５ｍｌ ＬＢ培地（アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加）に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで６時間前培養した。
前培養液１ｍｌを２５０ｍｌ ２×ＹＴ培地に接種し、ＯＤ600＝０．４５−０．５になるまで３７℃、１３０ｒｐｍで培養した後、速やかに１５℃に急冷し３０分間保冷した。３０分後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、１５℃、１３０ｒｐｍ、２４時間培養した。
菌体を集菌後、２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４、２０ｍＭ イミダゾール、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁し、ソニケーション後、４℃、２０，０００×ｇ、３０分間遠心分離した。
上清を可溶性画分とし、また沈殿を６Ｍ 尿素を用いて可溶化不溶性画分とした。それぞれの画分をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ミリポア）によって濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製度を確認した。
【００８０】
精製・濃縮した可溶性画分および可溶化不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて検出した結果を図８に示した。
その結果、可溶性画分および可溶化不溶性画分のいずれにおいても、目的分子量の位置にバンドが検出されたことから（図８、矢印部分）、目的タンパク質であるｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分が発現していることが確認できた。なお、図８において、Ｍはマーカー、Ｓは可溶性画分、Ｐか可溶化不溶性画分のことを示している。
【００８１】
ＩＩＩ．水泡を有する魚類による抗体産生
１．試料
実施例１と同様の方法によって入手し２か月以上飼育した水泡眼（体長約８ｃｍから１０ｃｍの健康な個体５匹）、実施例１と同様の試薬を試料とした。
また、上記ＩＩ．で調製した可溶性画分（ｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分）を０．６μｇ／μｌに調製したもの、または可溶化不溶性画分（ｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分）を０．１μｇ／μｌに調製したものをそれぞれ抗原とし、表４の成分が均一になるまで混合したオイルベースをアジュバントとした。
【００８２】
【表４】
【００８３】
２．抗体の産生
次の（１）〜（５）の手順により、抗体の産生を行った。
（１）比較として免疫前の水泡眼の水泡液を１００μｌ 注射器によりサンプリングした。
（２）上記（１）の後、免疫１回目として、上記ＩＩ．で調製した抗原（０．６μｇ／μｌの可溶性画分）９０μｌを等量のオイルベースと混合してエマルジョンとしたもの（合計１８０μｌ）を水泡眼の各個体の水泡内に注射した。
（３）上記（２）の免疫１回目から１週間後に、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング １回目）した直後、免疫２回目として、上記ＩＩ．で調製した抗原（０．１μｇ／μｌの可溶化不溶性画分）を１００μｌを等量のオイルベースと混合してエマルジョンとしたもの（合計２００μｌ）を水泡眼の各個体の水泡内に注射した。
（４）上記（３）の免疫２回目から１週間後に、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング ２回目）した。
（５）上記（４）のサンプリング ２回目から１週間後に、さらに、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング ３回目）した。
採取した水泡液はいずれも４℃で１，５００×ｇ １０分間遠心分離して上清を回収し、抗体価測定のためのサンプルとした。調製したサンプルは抗原特異的な抗体の検出に使用するまで、４℃で保存した。なお、この免疫期間中、死亡した個体はいなかった。
【００８４】
３．ドットブロット法による抗体検出
１）サンプル
各個体において、上記１．において採取した水泡液を、１／２、１／１０、１／２０、１／１００、１／２００、１／１０００、または１／２０００にそれぞれ希釈したものをサンプルとした。
また、抗Ｈｉｓ抗体を検出用一次抗体とし、抗ＴＦ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をポジティブコントロールとし、抗ＡＩＦ抗体（ラビット−ポリクローナル抗体）（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ）をネガティブコントロールとした。
【００８５】
２）抗原
上記Ｉ．ＩＩ．と同様の手法によって、調製したＨｉｓ−ＴＦ−ｈＬＧＲ３（図７、Ｈｉｓ部分（塩基：２７８〜２９５、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｆａｃｔｏｒ部分（塩基：２９６〜１６５７）、およびｈＬＧＲマーカー部分（塩基：１６９５〜２１７３）を含む）を終濃度５ｎｇ／μｌとなるようにＰＢＳに置換したものを抗原とした。
【００８６】
３）ドットブロット
抗原抗体反応の検出は、実施例１と同様の手順により、サンドイッチ法によるドットブロット法によって行った。
サンプルは、上記１）において調製したものを各２μｌ、図９に示したようにＰＶＤＦ膜に滴下した。これに上記２）の抗原を反応させた後、上記１）の検出用一次抗体、ネガティブコントロール、もしくはポジティブコントロールを反応させた。その後、続いて、ＰＢＳによって抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１／２５，０００に希釈して反応させた。
反応後、洗浄等したＰＶＤＦ膜を発光基質液（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥ ヘルスケア）に浸漬して室温で５分間反応させた後、ＣＣＤカメラによって発光を検出した。
【００８７】
その結果、図９に示したように、抗Ｈｉｓ抗体を検出用一次抗体とした場合、水泡液を１／２希釈したサンプルにおいて、免疫前よりもサンプリング ２回目、さらにサンプリング ３回目のサンプルのシグナルが強くなったことが確認できた。従って、この結果より、水泡眼に抗原を投与したことにより、水泡液中に抗原に対する抗体が産生されていることが示唆された。
なお、図９において、下のＢ１〜Ｂ５は各サンプルの由来となる水泡眼の個体を示している。上の０は免疫前の水泡液、２はサンプリング ２回目の水泡液、３はサンプリング ３回目の水泡液を示しており、これらの水泡液の希釈倍率（１／２〜１／２０００）を縦に示している。さらに、上のＰはポジティブコントロール、Ｎはネガティブコントロールを示しており、これらのコントロールについては、上から１／１００、１／２００、１／５００、１／１０００、１／２０００、１／５０００に希釈したものを固相化している。
【００８８】
以上の結果より、水泡を有する魚類によって抗体を製造することが可能であることが示された。水泡を有する魚類における抗体の製造では、水泡を有する魚類に対し、抗原を水泡内へ直接投与することができ、また、産生された抗体を水泡から直接回収できることも確認できた。
水泡から１回で直接回収できるリンパ液は１〜５ｍｌであるため、１度の抗原の投与で産生された抗体を大量に回収することができる。また、抗体を含むリンパ液を採取後も、水泡眼が生きたままの状態であり、繰り返し水泡眼から抗体を含むリンパ液を継続的に採取することも可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、大量かつ、魚類を生かしたままの状態で繰り返し、魚類に産生させた抗体を得ることが可能となった。本発明によって得られる抗体は、糖タンパク質等を抗原とするものも含まれ、哺乳動物等を対象とする抗体と同様に幅広く活用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の製造方法に関する。さらに詳しくは、水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子組み換え技術により大腸菌、酵母等に有用なタンパク質を産生させ、また、これを抗原としてマウス等に投与することにより、抗体を産生させる技術が幅広く利用されている。
しかし、大腸菌などの原核生物に産生させたタンパク質は、多量体形成、糖鎖付加等の翻訳後修飾が正確に行われていない。また、酵母に産生させたタンパク質も完全な翻訳後修飾が行われていないため、本来の機能を有しない場合があるという問題があった。
【０００３】
これらの問題を解決すべく、昆虫細胞や、マウス、ブタ、ヒト等の哺乳動物の細胞において有用なタンパク質を産生させる技術が利用されているが、細胞を培養するためのコストが高く、有用なタンパク質が得られるまでに時間がかかるという問題があった。
そこで、近年、バイオリアクターとして魚類を活用することに注目が集まっている。魚類由来のタンパク質は、哺乳動物と同様に多量体形成、糖鎖付加等の翻訳後修飾が行われるという利点がある。そこで特許文献１ではこの利点を生かし、トランスジェニック魚類に多量体糖タンパク質を産生させ、胚、仔魚、稚魚等の組織、血液中から回収する技術が開示されている。
【０００４】
魚類は飼育が比較的容易であり、飼育コストも安価である。また、水温や給餌、日照時間、水質等によって産卵および採卵を制御できるなど、非常に扱いやすいという利点もある。
本発明者らは、抗原提示酵母を作成し、これをゼブラフィッシュ等の魚類に飼料として付与することで、魚類由来の特異的抗体を産生させる方法や、従来、困難とされてきたＧＰＣＲ（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）等の膜タンパク質に対する抗体を魚類に産生させる（特願２００９−８３９００）等、魚類による様々な技術を開発している（例えば、特許文献２、３、参照）。
しかし、これらの技術では、魚類全身から抗体を回収等するため、魚類を生かしたままの状態で、産生させた抗体を繰り返し得ることができなかった。
【０００５】
本発明者らは、この問題を解決するため、本発明の開発において、水泡眼等の水泡を有する魚類に着目した。この種の金魚は観賞用として、国内外で幅広く飼育されている。
特許文献４において、水泡眼の水疱（水泡）内液が、魚類細胞の細胞保護的又は細胞増殖促進的に作用すること、魚類細胞の処理操作等において、未受精卵の卵質を維持した状態で効率的な操作を可能とすることが開示されている。
しかし、この特許文献では、水疱（水泡）内液に抗体等の有用なタンパク質を産生させること等については示唆すらされておらず、従来の技術においても、水泡を有する魚類を抗体の産生に利用することは試みられていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−８６９９２号公報
【特許文献２】特開２００７−２５５８９２号公報
【特許文献３】特開２００９−７３７８３号公報
【特許文献４】特開２００９−１８３１５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、魚類を生かしたままの状態で、産生させた抗体を繰り返し得ることができる、抗体の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、水泡眼等の水泡を有する魚類を抗原投与の対象とすることにより、魚類を生かしたままの状態で、これらの魚類に産生させた抗体を繰り返し得ることができる方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（８）の抗体の製造方法、該製造方法によって製造される抗体等に関する。
（１）水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法。（２）抗原を投与する部位が水泡である上記（１）に記載の製造方法。
（３）抗原をオイルベースとともに、またはオイルベースと不活化大腸菌とともに投与する上記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）魚類に産生させた抗体を、魚類の水泡から採取する工程を含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）水泡を有する魚類が水泡眼またはらんちゅうである上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）抗原がタンパク質または糖タンパク質である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）抗原がＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＥＧＦＰと示す場合がある）、グルコアミラーゼまたはＬＧＲ３（ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３；以下、ＬＧＲ３と示す場合がある）である上記（６）に記載の製造方法。
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法によって製造される抗体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法により、魚類に抗体を産生させることにより、魚類を生かしたままの状態で大量の抗体を繰り返し製造することが可能となった。本発明の製造方法では、糖タンパク質等を抗原とする場合でも、有用な抗体を製造することができる、有用な抗体の製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ウェスタンブロット法の結果を示した図である（実施例１）。
【図２】ドットブロット法の結果を示した図である（実施例１）。
【図３】水泡眼（一例）の写真を示した図である（実施例１）。
【図４】タグの写真を示した図である（実施例１）。
【図５】抗原抗体反応の結果（ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質）を示した図である（実施例１）。
【図６】抗原抗体反応の結果（精製ＧＡ−Ｈｉｓ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓ）を示した図である（実施例１）。
【図７】ｐＣｏｌｄ ＴＦ−ｈＬＧＲ３の配列を示した図である（実施例２）。
【図８】抗原抗体反応の結果を示した図である（実施例２）。
【図９】抗原抗体反応の結果を示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「抗体の製造方法」とは、抗体を産生する生物を魚類とし、これに抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む方法のことをいう。
本発明の「抗体の製造方法」は、魚類が水泡を有する魚類であって、この水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む製造方法であればよく、抗体を製造するせるために、従来知られている他の工程や方法を含むものであってもよい。
【００１３】
この方法において、「抗原を投与」は、魚類に抗体を産生させることが可能な投与方法であればどのような方法であってもよい。例えば、抗原となるタンパク質や抗原酵母等を飼料として経口的に投与したり、腹腔や水泡を投与部位として、抗原を直接、注射等によって投与したりすることが挙げられる。本発明においては特に、抗原の投与部位を水泡として、ここに直接抗原を投与することが好ましい。
【００１４】
抗原は、そのまま投与してもよく、アジュバントと組み合わせて投与しても良い。アジュバントとしては、魚類の抗体産生を助けるものであれば、どのようなものであってもよいが、特にオイルベースをアジュバントとすることや、オイルベースと不活化大腸菌とを組み合わせたものをアジュバントとすることが好ましい。
【００１５】
本発明の「抗体の製造方法」には、魚類に産生させた抗体を回収する工程も含むことができる。この抗体の回収は、魚類を生かしたまま回収できる方法で行うことが好ましく、特に、魚類の水泡から、抗体を含む水泡内液を回収する等の方法であることが好ましい。この場合、魚類の水泡に直接注射針等をさして、水泡内液を回収することにより、魚類を生かしたままで、魚類に産生させた抗体を回収することが可能となる。
【００１６】
本発明における「水泡を有する魚類」としては、魚類の表皮に水泡を有する魚類であれば、いずれの魚種も含まれる。この「水泡を有する魚類」の水泡には、産生された抗体を含むリンパ液が含まれており、水泡内に貯留したこの液を注射器等で採取した場合、再貯留するという性質がある。このような「水泡を有する魚類」として、例えば、水泡眼、らんちゅうなどの金魚を挙げることができる。
【００１７】
本発明の「抗原」とは、抗体を産生させるためのものであればどのようなものであってもよく、ＧＰＣＲ、ＬＧＲ３などの膜貫通型タンパク質、ＥＧＦＰなどの可溶性タンパク質や、α−ジストログリカン、グルコアミラーゼなどの糖タンパク質であってもよい。
魚類に投与する抗原の量は、魚類が抗体を産生できる量であれば特に問わないが、抗原となるこれらのタンパク質が１００μｇ以上となるように、投与されることが特に好ましい。
【００１８】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
Ｉ．抗原の調製
＜抗原＞ 麹菌グルコアミラーゼ
１−１．プラスミドの構築
１）麹菌アスペルギルスオリザ由来の硝酸還元酵素遺伝子（以下、ｎｉａＤ遺伝子と示す場合がある）の大腸菌ベクターへの組み込み
目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＡ（配列表配列番号１）、プライマーＢ（配列表配列番号２）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｎｉａＤ遺伝子（配列表配列番号３）を増幅した。
目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡは参考文献１に記載の定法に従い、調製した。
参考文献１：Ｒ．Ｃ．Ｇａｒｂｅｒ ａｎｄ Ｏ．Ｃ．Ｙｏｄｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３５，４１６−４２２（１９８３）
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２０】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｎｉａＤ遺伝子のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｎｉａＤ遺伝子のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を大腸菌プラスミドｐＵＣ１１９（宝ホールディングス）のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｎｉａＤマーカー遺伝子がサブクローニングされた大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２を得た。
大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２は、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ部位の両方にｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２１】
２）麹菌アスペルギルスオリザ由来のグルコアミラーゼＢターミネーター遺伝子（以下、ｇｌａＢターミネーター遺伝子と示す）の大腸菌ベクターへの組み込み
麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＣ（配列表配列番号４）とプライマーＤ（配列番号５）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｇｌａＢターミネーター遺伝子（配列表配列番号６）を増幅した。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２２】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ−ＸｈｏＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｇｌａＢターミネーター遺伝子のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｇｌａＢターミネーター遺伝子のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を、上記１）で得た大腸菌プラスミドｐＮＩＡ２のＳａｌＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｇｌａＢターミネーター遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＩＡＴを得た。
大腸菌プラスミドｐＮＩＡＴは、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ部位の両方に遺伝子をｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２３】
３）麹菌アスペルギルスオリザ由来のｓｏｄＭプロモーター遺伝子（以下、ｓｏｄＭプロモーター遺伝子と示す）の組み込み
麹菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーＥ（配列表配列番号７）、プライマーＦ（配列表配列番号８）およびＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（宝ホールディングス）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、麹菌由来ｓｏｄＭプロモーター遺伝子（配列表配列番号９）を増幅した。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２４】
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩ−ＰｓｔＩで処理（３７℃）した後、アガロースゲル電気泳動でｓｏｄＭプロモーター遺伝子のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片として切り出した。切り出しは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により行った。
切り出したｓｏｄＭプロモーター遺伝子のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片を、上記２）で得た大腸菌プラスミドｐＮＩＡＴのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ部位にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換することで、ｓｏｄＭプロモーター遺伝子がサブクローニングされたプラスミドｐＮＭＢを得た。
大腸菌プラスミドｐＮＭＢは、ＳａｌＩ部位に麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子をｕｎｉｑｕｅ ｓｉｔｅとして遺伝子を導入することができる。
【００２５】
１−２．目的遺伝子の組み込み
１）ベクターの調製
上記１−１．で構築した大腸菌プラスミドｐＮＭＢを制限酵素ＳａｌＩで処理（３７℃）した後、ｄＮＴＰを最終１０ｍＭとなるように添加してＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝ホールディングス）で１時間処理（３７℃）した。さらに、バクテリア由来アルカリホスファターゼ（宝ホールディングス）で３０分処理（５０℃）した。処理後得られた物をＰＣＲクリーンアップカラム（プロメガ社製）で溶出させ、ベクターとした。
【００２６】
２）インサートの調製
麹菌で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を目的遺伝子として、上記ベクターにサブクローニングするインサートとして調製した。
目的遺伝子は、ａ）麹菌由来グルコアミラーゼＢ（ｇｌａＢ）遺伝子（配列表配列番号１０（アミノ酸配列を配列表配列番号１１に示した））、またはｂ）Ｈｉｓタグ遺伝子をつなげた麹菌由来グルコアミラーゼＢ（ｇｌａＢ）遺伝子（配列表配列番号１２（アミノ酸配列を配列表配列番号１３に示した））であった。
上記１−１．１）で調製した目的遺伝子の起源生物（麹菌アスペルギルスオリザ）由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、目的遺伝子の開始コドンから下流３０ｂｐのセンス鎖のプライマー（５’末端をリン酸化）（配列表配列番号１４）と、目的遺伝子の終止コドンから上流４９ｂｐのアンチセンス鎖のプライマー（５’末端をリン酸化）（配列表配列番号１５）と、ｐｆｕ Ｔａｑポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、目的遺伝子を増幅した。
得られたＰＣＲ増幅産物をＰＣＲクリーンアップカラム（プロメガ社製）で処理溶出させ、インサートとした。
＜ＰＣＲ条件＞
９６℃（５分間）を１サイクル
９６℃（２０秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（５分間）を３０サイクル
７２℃（７分間）を１サイクル
【００２７】
３）ベクターとインサートのライゲーション
上記１）で得たベクターおよび上記２）で得た各目的遺伝子のインサートを１：２０（モル比）となるように添加して、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．１（宝ホールディングス）によりライゲーションを行い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に形質転換した。
形質転換体から、各目的遺伝子の読み枠がｓｏｄＭプロモーターと正方向にサブクローニングされているものを目的遺伝子発現プラスミドとした。
【００２８】
１−３．目的遺伝子発現株の取得
ＰＥＧ−カルシウム法により、上記１−２．で調製した目的遺伝子発現プラスミドにより、麹菌アスペルギルスオリザのｎｉａＤ変異株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１７７０７として寄託済み）を形質転換した。
【００２９】
１）ＰＥＧ−カルシウム法は、参考文献２に従い、以下の手順により行った。
即ち、麹菌胞子約１０8個を１００ｍｌ ＤＰＹ液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養を行った。こうして発芽させた後、ガラスビーズ（直径０．６ｃｍ）を培養フラスコに加え、３０℃，１３０ｒｐｍの震とう培養でさらに２４時間培養した。
菌糸を採集し、０．８Ｍ ＮａＣｌ水溶液で菌糸を２〜３回洗い、洗った菌糸に１０ｍｌの新しく作ったプロトプラスト化溶液（１５ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ），１０ｍｇ／ｍｌ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ−１０（Ｙａｋｕｌｔ Ｈｏｎｓｈａ），０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＤＴＴ）を加え、３０℃で３〜４時間ゆっくりと震とうし、細胞壁を消化してプロトプラストを調製した。
得られたプロトプラスト溶液をミラクロス（カルビオケム社）でろ過し、ろ液を更に４℃，２５００ｇ、５分間、遠心分離して回収した。
【００３０】
プロトプラストを氷冷した溶液１（０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））で洗浄した後、２×１０8／ｍｌになるように溶液１に懸濁して、その量に対して０．２容量になるように溶液２（４０％ ＰＥＧ４０００，５０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加え、静かに混合した。
形質転換は、０．１ｍｌのプロトプラスト溶液を新しい１５ｍｌチューブに移し、１５μｌ以下（３〜７μｇ）の目的ＤＮＡを加え、氷上で３０分間放置した後、０．５ｍｌ溶液２を加えゆっくりと攪拌し、室温で２０分間放置した。５ｍｌ溶液１を加えて、混合した後、４℃で２５００ｇの速度で５分間遠心を行った。
プロトプラストを含んだ沈殿物を０．１ｍｌの溶液１に懸濁し、０．８Ｍ ＮａＣｌを含むＣＤ再生培地に広げ、さらに、その上に、３０℃まで冷却したＣＤ軟寒天培地を添加した後、固化させ、２８℃で４〜７日培養した。
参考文献２：Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ， ２１８，９９−１０４，（１９８９）
【００３１】
２）形質転換体のうち硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（２％ グルコース、０．１％ リン酸１水素２カリウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、０．００１％ 硫酸鉄、０．３％ 硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、目的遺伝子発現プラスミドを保持する形質転換体を複数得た。
【００３２】
１−４．目的遺伝子産物の調製
上記１−３．により得られた形質転換体をポテトデキストロース培地で培養することで胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。
回収した胞子を、５００ｍｌ容三角フラスコに入った１００ｍｌ ＧＰＹ液体培地（２％ グルコース、１％ ポリペプトン、０．５％ イーストエキストラクト、０．１％ リン酸１水素２カリウム、０．０５％ 塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、０．００１％ 硫酸鉄、０．３％ 硝酸ナトリウム）に最終胞子濃度１Ｘ１０6／ｍｌとなるように植菌した。
これを３０℃で３日間液体培養し、目的遺伝子産物が分泌発現した培養上清を回収した。
【００３３】
１−５．培養上清の濃縮
上記１−４．で回収した培養上清の一部を、分画分子量１０，０００ＮＭＷＬのセントリプレップ１０（ミリポア社製）により遠心分離（３，０００×ｇ）し、濃縮した。
【００３４】
１−６．培養上清に含まれるＧＡ濃度の定量
上記１−４．で回収した培養上清に含まれるＧＡ濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって培養上清からタンパク質を分離し、ＣＢＢ染色像を画像解析ソフトのＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０（ＡＴＴＯ）により定量化することで推定した。
すなわち、次の１）〜５）の工程を行った。
１）下記１−７．で得た精製ＧＡを３μｇから１１μｇとなるようにＰＢＳに溶解した（スタンダード）。
これと、１〜３μＬの１ｘ培養上清とにそれぞれ５ｘサンプルバッファー（２．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ、１０％ ＳＤＳ）を添加（終濃度１ｘ）し、１００℃で５分間煮沸することによってサンプルとした。
２）これらのサンプルから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ ポリアクリルアミドゲル、２００Ｖ、２０ｍＡ）によってタンパク質を分離した。
３）泳動後のゲルをＣＢＢ染色液（０．２５％ ＣＢＢ−Ｒ２５０、５０％ メタノール、５％ 酢酸）に浸漬し、室温で３０分間振盪しながらタンパク質を染色した。
４）染色後のゲルを脱色液（２５％ メタノール、１０％ 酢酸）に浸漬し、室温で振盪しながらタンパク質に結合しなかったＣＢＢを洗浄した。
５）脱色後のゲルをＣＣＤカメラ（Ｌｉｇｈｔ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ、ＡＴＴＯ）により撮影し、検出されたＧＡのバンドをＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０のゾーンデンシトメトリー解析によって定量化し、精製ＧＡの積算値から検量線を作成した。
作成した検量線から推定された培養上清（濃縮なし）に含まれるＧＡ濃度は約３．０μｇ／μＬであった。
この結果より、上記１−５．にて５倍濃縮した培養上清を金魚用リンガー液｛１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙ ｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）｝によってＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを培養上清ＧＡまたは培養上清ＧＡ−Ｈｉｓと示す場合がある）。
【００３５】
１−７．目的遺伝子産物の精製
１）目的遺伝子産物
上記１−４．で回収した培養上清の一部を飽和濃度７０％の硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩撹拌しタンパク質を沈殿させた後、遠心分離により沈殿を取り除いた。
この培養上清をブチルトヨパール−６５０Ｍ（東ソー社製）樹脂を添加し、低温で一晩撹拌した後、樹脂を回収した。
回収した樹脂を１．５Ｍ 硫酸アンモニウム溶液で２回洗浄し、１０ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で目的のＧＡタンパク質を溶出し、凍結乾燥したものを、精製ＧＡタンパク質とした。
精製ＧＡタンパク質は、金魚用リンガー液によりＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを精製ＧＡと示す場合がある）。
【００３６】
２）Ｈｉｓタグをもつ目的遺伝子産物
上記１−４．の目的遺伝子産物を含む培養上清をニッケルカラム（Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に添加した後、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび４００ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を添加してカラムに結合した組換えグルコアミラーゼを溶出した。
この溶出液を透析膜に移し、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を含む１Ｌのバッファーに対し、４℃、３時間で透析を２回行い、Ｈｉｓタグをもつ目的遺伝子産物を精製した。
精製したＨｉｓタグをもつ目的遺伝子産物は、金魚用リンガー液によりＧＡ濃度が４μｇ／μＬとなるよう調製した（以下、これを精製ＧＡ−Ｈｉｓと示す場合がある）。
【００３７】
＜抗原＞ ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質
２−１．ベクターの作製（プラスミドの構築〜目的遺伝子の組み込み）
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）を次のように改変することにより、ｃｓｐ Ａプロモーターの下流に５’非翻訳領域、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＥＥ）、ＥＧＦＰ、および３’末端に精製用のタグであるＨｉｓタグのＤＮＡ配列が連結したコンストラクトである、ｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓベクターを作製した。
１）本発明者らがｐＸＩ（配列表配列番号１６）の下流にＥＧＦＰ（配列表配列番号１７）を組み込んで作製したｐＸＩ−ＥＧＦＰベクター（特願２００９−１０７３４４号、参考文献３）を鋳型として、プライマーＧ（配列表配列番号１８）、プライマーＨ（配列表配列番号１９）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ｅｇｆｐ遺伝子の開始コドンが制限酵素ＳｍａＩの認識配列に変換され、３’末端がＨｉｓタグのＤＮＡ配列に変換された断片を増幅した。
参考文献３：Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＤ，Ｋｒｉｅｇ ＰＡ．ｐＸｅＸ，ａ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｇｅｎｅ． １９９４ Ｓｅｐ．
＜ＰＣＲ条件＞
９５℃（１分間）を１サイクル
９５℃（１０秒間）、５５℃（３０秒間）、７２℃ （２分間）を３０サイクル
７２℃（５分間）を１サイクル
【００３８】
２）上記１）の増幅産物（ｅｇｆｐ遺伝子の開始コドンが制限酵素ＳｍａＩの認識配列に変換され、３’末端がＨｉｓタグのＤＮＡ配列に変換された断片）を鋳型として、プライマーＧ（配列表配列番号１８）、プライマーＩ（配列表配列番号２０）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、上記１）と同様の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｈｉｓタグの下流に制限酵素ＳｆｉＩの認識配列が連結したｅｇｆｐ−ｈｉｓ６遺伝子断片を増幅した。
【００３９】
３）ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＤＮＡ（タカラバイオ）を鋳型として、プライマーＪ（配列表配列番号２１）、プライマーＫ（配列表配列番号２２）およびＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）を混合し、以下の条件でＰＣＲを行うことにより、ＴＥＥにＳｍａＩの認識配列が連結し、ｐＣｏｌｄ−ＴＦ−ＤＮＡのｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列の上流にＳｆｉＩの認識配列が連結するＤＮＡ断片を増幅した。
【００４０】
上記３）で増幅したＤＮＡ断片と、ＳｍａＩおよびＳｆｉＩによって消化した上記２）のｅｇｆｐ−ｈｉｓ６遺伝子断片を、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（タカラバイオ）によりライゲーションすることによってｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓを作製した。
【００４１】
２−２．目的遺伝子産物の調製
上記２−１．で作製したｐＣｏｌｄＴＥＥ−ＥＧＦＰ−Ｈｉｓベクターにより大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ平板培地に塗抹して、３７℃で一晩保温しながら培養した。なお、特に記載のない場合、試薬は全て和光純薬工業株式会社の製品を使用した。
【００４２】
１）生成したコロニーをＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地に植菌し、３７℃で１２時間振盪しながら培養した。この培養上清を、あらかじめ作製した２ｘＹＴ−Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ液体培地｛５０μｇ／ｍＬ アンピシリンナトリウム、１．６％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ（ＢＤ）、１％ 乾燥酵母エキス（ナカライテスク）、０．５％ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．０）｝に植菌し、波長６００ｎｍの吸光度が０．４〜０．５の範囲となるまで３７℃で振盪しながら培養した。
その後、１５℃で３０分間静置し、０．１ｍＭ Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培養上清の１／１０００量を添加して、１５℃で２４時間振盪しながらＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質の発現を誘導した。
目視にてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質の発現を確認した後、４℃で３０００ｘｇ １５分間遠心分離して菌体を回収し、予冷した１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4）により２回洗浄することで残留した培地成分を除去した。
【００４３】
２）上記１）に続いて、４０ｍＬのＮｉカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝を添加し、微量超音波細胞破砕機（ＭＩＣＲＯＳＯＮ ＸＬ ２０００、ＭＩＳＯＮＩＸ）により菌体を破砕した。
次に、４℃で１２０００ｘｇ ３０分間遠心分離して上清を回収し、０．２０μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）によって夾雑物を除去して大腸菌発現タンパク質抽出液とした。
調製した大腸菌発現タンパク質抽出液をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ担体（ＧＥヘルスケア）を充填したＮｉ カラム（ＧＥヘルスケア）にペリスタポンプ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）によって添加することで、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を担体に結合させた。
【００４４】
３）上記２）に続いて、Ｎｉカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝およびＮｉカラム溶出緩衝液Ｂ｛２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４）｝による２０ｍＭ〜５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌの連続濃度勾配によってカラムからＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を溶出した。
【００４５】
４）次に、限外濾過膜（ミリポア）を用いて、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質が溶出した画分のＮｉ カラム溶出緩衝液をＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ ２−ａｍｉｎｏ−２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉｏｌ（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）｝にバッファー置換したものをサンプルとし、あらかじめＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ担体（ＧＥヘルスケア）を充填した陰イオン交換カラムに低圧クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ：ＧＥヘルスケア）によって添加することで、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を担体に結合させ、ＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ａ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）｝およびＤＥＡＥカラム溶出緩衝液Ｂ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）｝により、０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの連続濃度勾配による溶出を行った。
【００４６】
５）上記４）のカラムより溶出したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を含む画分の溶液を、２価イオンを含まない金魚用リンガー液｛１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）｝に置換し、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質濃度が４μｇ／μＬになるように調製した。
【００４７】
ＩＩ．抗原抗体反応の確認
上記Ｉ．にて調製した抗原（精製ＧＡ、精製ＧＡ−ＨｉｓおよびＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質）を抗体と作用させ、ウェスタンブロット法またはドットブロット法により、抗原抗体反応を確認した。
１．抗体
１）抗Ｈｉｓ抗体
Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２）抗ＧｌａＢ抗体
グルコアミラーゼタンパク質全長のペプチド（配列表配列番号１１）をデザインし、化学合成によりペプチド合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）をキャリアタンパク質としてコンジュゲーションしたペプチドを抗原としてウサギに免疫することにより抗体を得た（カスタム抗体作製；インビトロジェン社製）。
【００４８】
２．ウェスタンブロット法
１）上記Ｉ．にて調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓに５ｘサンプルバッファー（２．５Ｍ Ｔｒｉｓ，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０５％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ，１０％ ＳＤＳ）をそれぞれ添加し（終濃度１ｘ）、１００℃で５分間煮沸してサンプルとした。
これらのサンプルを、１０％ポリアクリルアミドゲルにより２００Ｖ ２０ｍＡの設定で電気泳動し、タンパク質を分離した。
【００４９】
２）次にセミドライブロッターによってタンパク質をＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）に転写し、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（０．５％ ＰＢＳＴ）で２回リンスして、５％ スキムミルク／０．５％ＰＢＳＴに浸漬して振盪しながら１時間ブロッキングした。
ブロッキング後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで２回リンスし、０．５％ＰＢＳＴで１５分間ｘ１回、５分間ｘ２回洗浄して、余分なブロッキング液を除去した。
【００５０】
３）続いて上記１．の抗Ｈｉｓ抗体および抗ＧｌａＢ抗体をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ（ＴＯＹＯＢＯ） Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １により、それぞれ１／３０００および１／１０００に希釈し、これにＰＶＤＦ膜を浸漬して室温にて１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜を０．５％ ＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
４）次に、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体および抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって、それぞれ１／２５０００および１／１０００００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。
【００５１】
５）反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、発光基質液｛Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ ヘルスケア）｝に浸漬して室温で５分間反応させたのち、ＣＣＤカメラ［Ｌｉｇｈｔ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）］によって撮影し、ＣＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ３．０（ＡＴＴＯ）により発光を検出した。
【００５２】
その結果、図１、Ａ（抗Ｈｉｓ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体によって、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ検出したところ、抗Ｈｉｓ抗体を反応させたＰＶＤＦ膜ではＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図１、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図１、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）がそれぞれ検出された。
また、図１、Ｂ（抗ＧｌａＢ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体を反応させたＰＶＤＦ膜では精製ＧＡ（図１、ｇｌａＢ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図１、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）がそれぞれ検出された。
従って、これらの結果から、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗ＧｌａＢ抗体および抗Ｈｉｓ抗体で検出できることが確認できた。
なお、図１では、各写真の上部に、各レーンに泳動したサンプル量および使用した一次抗体、二次抗体とその希釈倍率を示している（Ｍ：プレステインドＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ）（Ｂｉｏ Ｒａｄ））。
【００５３】
２．ドットブロット法
１）上記Ｉ．にて調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓを、ＰＢＳにより、それぞれ２５０ｐｇ／μＬから２５０ｎｇ／μＬの範囲に希釈してサンプルとした。
２）ＰＶＤＦ膜をメタノールに浸漬して５分間振盪しながら置換し、その後超純水に浸漬して１０分間ｘ２回振盪しながら置換し、最後にＰＢＳに浸漬して１０分間以上振盪しながら置換することによって平衡化した。
３）上記１）のサンプル滴下直前にＰＶＤＦ膜をプロワイプ（エリエール）に挟み込むことによって余分なＰＢＳを除去し、パラフィルム上のＰＶＤＦ膜へサンプルを２μＬずつ滴下して風乾した。
【００５４】
４）乾燥させたＰＶＤＦ膜を｛５％ スキムミルク／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）（０．０５％ ＴＢＳＴ）｝によって平衡化およびブロッキングした。
５）続いて、ＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより２回リンスし、１０分間振盪しながら洗浄して５分間ｘ２回振盪しながら洗浄し、余分なスキムミルク溶液を除去した。
６）続いて、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １により、上記１．の抗Ｈｉｓ抗体、抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）および抗ＧｌａＢ抗体をそれぞれ１／３０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で２時間振盪しながら反応させた。
反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
【００５５】
７）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体および抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体をそれぞれ１／２５０００および１／１０００００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。
８）反応後のＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、ウェスタンブロット法と同様に発光基質液と反応させて発光を検出した。
【００５６】
その結果、図２（左側）に示されるように、抗ＧＦＰ抗体により、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓの検出をそれぞれ行ったところ、１０ｎｇから５００ｎｇまでのＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図２、ＧＦＰ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
また、図２（中央）に示されるように、抗Ｈｉｓ抗体により検出を行ったものは、１０ｎｇから５００ｎｇまでの精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図２、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）のスポットおよび５０ｎｇから５００ｎｇまでのＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図２、ＧＦＰ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
さらに、図２（右側）に示されるように、抗ＧｌａＢ抗体により反応させたＰＶＤＦ膜では５００ｐｇから５００ｎｇの精製ＧＡ（図２、ｇｌａＢ）および精製ＧＡ−Ｈｉｓ（図２、ｇｌａＢ−Ｈｉｓ）のスポットに反応が見られた。
以上の結果から、抗ＧｌａＢ抗体および抗Ｈｉｓ抗体によって精製ＧＡ−Ｈｉｓを検出できることが確認された。
【００５７】
またこの条件では、１／１０００に希釈した抗ＧｌａＢ抗体は５００ｐｇ以上の精製ＧＡおよび精製ＧＡ−Ｈｉｓを、１／３０００に希釈した抗Ｈｉｓ抗体は１０ｎｇ以上の精製ＧＡ−Ｈｉｓおよび５０ｎｇ以上のＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を、１／３０００に希釈した抗ＧＦＰ抗体では１０ｎｇ以上のＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質がそれぞれ検出できることも示された。
なお、図２でも、写真の上部に、各行に滴下したタンパク質の種類と、検出に使用した一次抗体および二次抗体とその希釈倍率をそれぞれ示した。写真の左側には、各列に滴下した各タンパク質量を示した。
【００５８】
ＩＩＩ．水泡を有する魚類による抗体産生
１．試料
１）水泡を有する魚類
愛知県弥富市の丸照養魚場より入手した水泡眼を使用した。これらは、中和剤（金魚・メダカの中和剤、株式会社ニチドウ）を加えて残留塩素を中和した水道水により、水温２０〜２５℃で飼育した。本発明で使用した水泡眼（一例）を図３に写真で示した。
２）試薬
特に記載のない場合、試薬は全て和光純薬工業株式会社の製品を使用した。
３）抗原
上記Ｉ．で調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡ−Ｈｉｓまたは培養上清ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ抗原とした。
【００５９】
４）アジュバント
次の（Ａ）〜（Ｄ）を調製し、アジュバントとした。
（Ａ）レシチンを含むオイルベース
（Ｂ）不活化結核菌を混合したオイルベース
（Ｃ）不活化麹菌を混合したオイルベース
（Ｄ）不活化大腸菌を混合したオイルベース
【００６０】
（１）オイルベースの調製
オイルベースは、参考文献４を改変して、以下のように作製した。
すなわち、１０ｇのグリセロールに０．１ｇの卵黄レシチンを添加し、６０℃で保温しながらスターラーによって撹拌した。次に、１０ｇの落花生油（ナカライテスク）を徐々に添加し、均一になるまで同様に撹拌してオイルベースとした。
参考文献４：Ｊ．Ａ．ＲＥＹＮＯＬＤＳ ｅｔ ａｌ．１９８０（Ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＪＡ， Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＤＧ， Ｃｒａｂｂｓ ＣＬ， Ｐｅｔｅｒｓ ＣＪ， Ｄｉ Ｌｕｚｉｏ ＮＲ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９８０ Ｊｕｎ；２８（３）：９３７−９４３．
【００６１】
（２）不活化大腸菌、不活化麹菌の調製
大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株をＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間振盪培養した。
麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＯＳＩ−１０１３株をＤＰＹ液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養した。
これらの菌をソニケーターで破砕し、不活化大腸菌および不活化麹菌を得た。
（３）不活化結核菌
結核菌Ｈ３７ Ｒａ， 乾燥（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を不活化結核菌として使用した。
（４）オイルベースと不活化大腸菌、不活化結核菌、不活化麹菌の混合
不活化大腸菌、不活化結核菌、不活化麹菌を、それぞれオイルベースに０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加した。
【００６２】
（５）抗原とアジュバントの混合
（Ａ）〜（Ｄ）のそれぞれのアジュバントと抗原溶液を１ｍＬ容シリンジ（テルモ）および１８Ｇの試薬混合針（三商）により体積比１：１で混合し、油中水型エマルジョンを作製して免疫に使用した。菌体を混合したアジュバントは初回免疫時のみ使用し、２回目以降はオイルベースのみのアジュバントを使用した。
【００６３】
２．抗体の産生
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を抗原とする試験区Ａ〜Ｅ、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｆ〜Ｊ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｋ，Ｌおよびコントロールとして試験区Ｍを作成し、各試験区における水泡眼は６匹とした。各試験区の抗原、アジュバントの組合せを表１に示した。
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を抗原とする試験区Ａ〜Ｅ、およびコントロールの試験区Ｍの合計３６匹は、６Ｌ水槽に一匹ずつ、同水系において飼育した。また、精製ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｆ〜Ｊ、および培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを抗原とする試験区Ｋ，Ｌの合計３６匹は個体識別のためのタグ（図４（Ａ））を水泡眼の尾柄部分に装着し（図４（Ｂ））、６０Ｌ水槽に１試験区（６匹）ごと飼育した。
【００６４】
水泡眼への免疫は、試験区ごとに抗原のみ、またはアジュバントと混合してエマルジョン化した抗原を水泡眼の右側水泡に１匹当たり１００μｇ注射することによって行った。免疫は１４日に１回行い、７０日間継続した。
免疫前および免疫と同日に水泡眼の左側水泡から１匹当たり５０〜１００μＬの水泡液を採取した。免疫と同日に水泡液を採取する場合は、先に免疫した後、水泡液を採取した。
採取した水泡液は、４℃で１５００ｘｇ １０分間遠心分離して上清を回収し、抗体価測定のためのサンプルとした。なお、調製したサンプルは抗原特異的な抗体の検出に使用するまで、−２０℃で保管した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
３．ドットブロット法による抗体検出
１）サンプル
上記２．において採取した水泡液を解凍した後、４℃で１００００ｘｇ １０分間遠心分離して沈殿を除去してサンプルとした。
また、抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）をネガティブコントロールとし、抗Ｈｉｓ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＢＳで１／１００〜１／５０００の範囲に希釈したものをポジティブコントロールとした。
２）抗原
上記Ｉ．で調製したＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質および精製ＧＡ−ＨｉｓをそれぞれＰＢＳに置換したものを抗原とした。
【００６７】
３）ドットブロット
抗原抗体反応の検出は、次の（１）〜（６）の手順により、サンドイッチ法によるドットブロット法によって行った。
（１）ＰＶＤＦ膜（ＡＴＴＯ）をメタノールに浸漬して５分間振盪しながら置換し、その後超純水に浸漬して１０分間ｘ２回振盪しながら置換した。最後に、ＰＢＳに浸漬して１０分間以上振盪しながら置換することによって平衡化した。サンプル滴下直前にＰＶＤＦ膜をプロワイプ（エリエール）に挟み込むことによって余分なＰＢＳを除去し、パラフィルム上のＰＶＤＦ膜へサンプルを２μＬずつ滴下して風乾した。
（２）乾燥させたＰＶＤＦ膜を５％ スキムミルク／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＴＢＳ｛２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（０．０５％ ＴＢＳＴ）｝で平衡化およびブロッキングした。
続いて、ＰＶＤＦ膜を０．０５％ ＴＢＳＴにより２回リンスし、１０分間振盪しながら洗浄した。さらに、５分間ｘ２回振盪しながら洗浄することによって、余分なスキムミルク溶液を除去した。
【００６８】
（３）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（ＴＯＹＯＢＯ）によって抗原となるＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質あるいは精製ＧＡ−Ｈｉｓをそれぞれ５ｎｇ／μＬあるいは１０ｎｇ／μＬに希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で２時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗原溶液を除去した。
（４）次に、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １によって抗ＧＦＰ抗体（ＭＢＬ）あるいは抗ＧＡ抗体（月桂冠より供与）をともに１／３，０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
【００６９】
（５）続いて、Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２によって抗ラビットＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体を１／１００，０００に希釈し、ＰＶＤＦ膜を浸漬して室温で１時間振盪しながら反応させた。反応後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ ＴＢＳＴにより１０分間ｘ３回洗浄し、余分な抗体溶液を除去した。
（６）反応後のＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで１０分間ｘ３回洗浄し、発光基質液（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥ ヘルスケア）に浸漬して室温で５分間反応させた後、ＣＣＤカメラによって発光を検出した。
ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質を投与した試験区の結果を図５および表２に示し、精製ＧＡ−Ｈｉｓ、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓを投与した試験区の結果を図６および表３に示した。
【００７０】
【表２】
【００７１】
その結果、図５および表２に示されるように、抗原とともにアジュバントとしてオイルベースを投与した試験区Ｂの２匹と、オイルベースに不活化大腸菌を加えて免疫した試験区Ｃの２匹において、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質（図５、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓ、以下同様である）に対する抗体が検出され、さらに抗体価の増加が見られた。
しかしながら、抗原とともにオイルベースと結核菌を加えて免疫した試験区Ｄ、麹菌を加えて免疫した試験区ＥではＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加が認められなかった。また同様に、抗原のみを投与した試験区Ａにおいても抗体価の増加は見られなかった。
【００７２】
試験区ＢにおいてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加が認められた２匹のうち、識別個体３では初回免疫から４２日以降の水泡液において抗体価が増加し、特に５６日後から７０日後にかけて抗体価が徐々に増加していた。また、識別個体６では４２日後に抗体価がわずかに増加し、５６日後にさらに増加していた。
一方、試験区ＣにおいてＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質に対する抗体価の増加がみられた２匹のうち、識別個体３では４２日後から抗体価が大きく増加し、７０日後まで継続しており、また識別個体６でも４２日後から抗体価が増加し、７０日後まで継続していた。
【００７３】
なお、図５では、左上に抗Ｈｉｓ抗体を反応させたポジティブコントロール（＋）および抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体を反応させたネガティブコントロール（−）の結果を示している（希釈倍率：１／１００〜１／１８００）。
図５、各ＰＶＤＦ膜上部のアルファベットは各試験区、１〜６までの数字は水泡眼の個体識別番号を示し、アルファベットの右に各試験群の免疫条件（ＯＢ：オイルベース）を示している。また、右側には各列にはサンプル（水泡液）の採取日（ｐｒｅ：免疫前、その他は初回免疫から採取日までの日数）を示している。
【００７４】
【表３】
【００７５】
また、図６および表３に示されるように抗原とともにアジュバントとしてオイルベースを免疫した試験区Ｇの３匹において精製ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体が検出され、抗体価も増加していた。
しかしながら、オイルベースに大腸菌を加えて免疫した試験区Ｈ、結核菌を加えて免疫した試験区Ｉ、麹菌を加えて免疫した試験区Ｊでは、精製ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加は見られなかった。また同様に、抗原のみを投与した試験区Ｆにおいても抗体価の増加は検出されなかった。
【００７６】
培養上清ＧＡ−Ｈｉｓ（図６、ＧＡ麹菌培養上清、以下同様である）を免疫した試験区ＫおよびＬでは、抗原のみを免疫した試験区Ｋの３匹、抗原とともにオイルベースを免疫した試験区Ｌの１匹において培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が見られた。
試験区Ｋにおいて培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が検出された３匹のうち、識別個体１では初回免疫から４２日後の水泡液から抗体価が増加し、７０日後まで継続した。また、識別個体４では７０日後の抗体価がわずかに増加し、識別個体６では２８日後の抗体価が増加した。試験区Ｌについては、培養上清ＧＡ−Ｈｉｓに対する抗体価の増加が検出された識別個体６では、初回免疫から４２日後の水泡液における抗体価がわずかに増加し、５６日後にさらに増加して７０日後まで継続した。
コントロールとして金魚用リンガー液とともにオイルベースを免疫した試験区Ｍでは、ＥＧＦＰ−Ｈｉｓタンパク質、精製ＧＡ−Ｈｉｓおよび培養上清ＧＡ−Ｈｉｓのいずれの抗原に対しても抗体価の増加は認められなかった。
【００７７】
なお、図６では、左上に抗Ｈｉｓ抗体を反応させたポジティブコントロール（＋）および抗ｍｙｃ ｔａｇ抗体を反応させたネガティブコントロール（−）の結果を示している（希釈倍率：１／１００〜１／５０００）。
図６、各ＰＶＤＦ膜上部のアルファベットは各試験区、１〜６までの数字は水泡眼の個体識別番号を示し、アルファベットの右に各試験群の免疫条件（ＯＢ：オイルベース）を示している。また、右側には各列にはサンプル（水泡液）の採取日（ｐｒｅ：免疫前、その他は初回免疫から採取日までの日数）を示している。
【実施例２】
【００７８】
Ｉ．抗原の調製
＜抗原＞ ＬＧＲ３
１−１．ベクターの作製（プラスミドの構築〜目的遺伝子の組み込み）
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）を次のように改変することにより、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲを作製した。
ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡ（タカラバイオ）上のトリガーファクター（ＴＦ）配列を除去するために、ｐＣｏｌｄ ＴＦ ＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＳｍａＩおよびＳｆｉＩ認識配列を持つプライマーによるＰＣＲを行い、ベクターを増幅した。
同様に、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ｈＬＧＲ３（インビトロジェン）を鋳型とし、制限酵素ＳｍａＩおよびＳｆｉＩ認識配列を持つプライマーによるＰＣＲを行い、ｈＬＧＲ３（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３；ｈＬＧＲ３）遺伝子のｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ（ＬＲＲ）部分（配列表配列番２３）（図７、ｈＬＧＲマーカー部分（塩基：１６９５〜２１７３））を増幅した。
増幅産物を精製後、制限酵素処理に供し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲを構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８株によりコンストラクトを作製し、上記にて構築したｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲの塩基配列を確認したところ、構築前に予想した塩基配列と完全に一致した。従って、この結果より、コンストラクトが正しく構築されていることが確認できた。
【００７９】
ＩＩ．抗原抗体反応の確認
上記Ｉ．で作製したコンストラクト（発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＴＥＥ−Ｈｉｓ−ｈＬＧＲ３−ＬＲＲ）を大腸菌ｏｒｉｇａｍｉ株に形質転換した。
ダイレクトＰＣＲ法によって形質転換が確認された株を、５ｍｌ ＬＢ培地（アンピシリンを終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加）に植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで６時間前培養した。
前培養液１ｍｌを２５０ｍｌ ２×ＹＴ培地に接種し、ＯＤ600＝０．４５−０．５になるまで３７℃、１３０ｒｐｍで培養した後、速やかに１５℃に急冷し３０分間保冷した。３０分後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、１５℃、１３０ｒｐｍ、２４時間培養した。
菌体を集菌後、２０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４、２０ｍＭ イミダゾール、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁し、ソニケーション後、４℃、２０，０００×ｇ、３０分間遠心分離した。
上清を可溶性画分とし、また沈殿を６Ｍ 尿素を用いて可溶化不溶性画分とした。それぞれの画分をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて精製し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（ミリポア）によって濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製度を確認した。
【００８０】
精製・濃縮した可溶性画分および可溶化不溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて検出した結果を図８に示した。
その結果、可溶性画分および可溶化不溶性画分のいずれにおいても、目的分子量の位置にバンドが検出されたことから（図８、矢印部分）、目的タンパク質であるｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分が発現していることが確認できた。なお、図８において、Ｍはマーカー、Ｓは可溶性画分、Ｐか可溶化不溶性画分のことを示している。
【００８１】
ＩＩＩ．水泡を有する魚類による抗体産生
１．試料
実施例１と同様の方法によって入手し２か月以上飼育した水泡眼（体長約８ｃｍから１０ｃｍの健康な個体５匹）、実施例１と同様の試薬を試料とした。
また、上記ＩＩ．で調製した可溶性画分（ｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分）を０．６μｇ／μｌに調製したもの、または可溶化不溶性画分（ｈＬＧＲ３タンパク質のＬＲＲ部分）を０．１μｇ／μｌに調製したものをそれぞれ抗原とし、表４の成分が均一になるまで混合したオイルベースをアジュバントとした。
【００８２】
【表４】
【００８３】
２．抗体の産生
次の（１）〜（５）の手順により、抗体の産生を行った。
（１）比較として免疫前の水泡眼の水泡液を１００μｌ 注射器によりサンプリングした。
（２）上記（１）の後、免疫１回目として、上記ＩＩ．で調製した抗原（０．６μｇ／μｌの可溶性画分）９０μｌを等量のオイルベースと混合してエマルジョンとしたもの（合計１８０μｌ）を水泡眼の各個体の水泡内に注射した。
（３）上記（２）の免疫１回目から１週間後に、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング １回目）した直後、免疫２回目として、上記ＩＩ．で調製した抗原（０．１μｇ／μｌの可溶化不溶性画分）を１００μｌを等量のオイルベースと混合してエマルジョンとしたもの（合計２００μｌ）を水泡眼の各個体の水泡内に注射した。
（４）上記（３）の免疫２回目から１週間後に、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング ２回目）した。
（５）上記（４）のサンプリング ２回目から１週間後に、さらに、各個体から水泡液を１００μｌ採取（サンプリング ３回目）した。
採取した水泡液はいずれも４℃で１，５００×ｇ １０分間遠心分離して上清を回収し、抗体価測定のためのサンプルとした。調製したサンプルは抗原特異的な抗体の検出に使用するまで、４℃で保存した。なお、この免疫期間中、死亡した個体はいなかった。
【００８４】
３．ドットブロット法による抗体検出
１）サンプル
各個体において、上記１．において採取した水泡液を、１／２、１／１０、１／２０、１／１００、１／２００、１／１０００、または１／２０００にそれぞれ希釈したものをサンプルとした。
また、抗Ｈｉｓ抗体を検出用一次抗体とし、抗ＴＦ抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をポジティブコントロールとし、抗ＡＩＦ抗体（ラビット−ポリクローナル抗体）（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ）をネガティブコントロールとした。
【００８５】
２）抗原
上記Ｉ．ＩＩ．と同様の手法によって、調製したＨｉｓ−ＴＦ−ｈＬＧＲ３（図７、Ｈｉｓ部分（塩基：２７８〜２９５、Ｔｒｉｇｇｅｒ Ｆａｃｔｏｒ部分（塩基：２９６〜１６５７）、およびｈＬＧＲマーカー部分（塩基：１６９５〜２１７３）を含む）を終濃度５ｎｇ／μｌとなるようにＰＢＳに置換したものを抗原とした。
【００８６】
３）ドットブロット
抗原抗体反応の検出は、実施例１と同様の手順により、サンドイッチ法によるドットブロット法によって行った。
サンプルは、上記１）において調製したものを各２μｌ、図９に示したようにＰＶＤＦ膜に滴下した。これに上記２）の抗原を反応させた後、上記１）の検出用一次抗体、ネガティブコントロール、もしくはポジティブコントロールを反応させた。その後、続いて、ＰＢＳによって抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ標識二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１／２５，０００に希釈して反応させた。
反応後、洗浄等したＰＶＤＦ膜を発光基質液（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ＧＥ ヘルスケア）に浸漬して室温で５分間反応させた後、ＣＣＤカメラによって発光を検出した。
【００８７】
その結果、図９に示したように、抗Ｈｉｓ抗体を検出用一次抗体とした場合、水泡液を１／２希釈したサンプルにおいて、免疫前よりもサンプリング ２回目、さらにサンプリング ３回目のサンプルのシグナルが強くなったことが確認できた。従って、この結果より、水泡眼に抗原を投与したことにより、水泡液中に抗原に対する抗体が産生されていることが示唆された。
なお、図９において、下のＢ１〜Ｂ５は各サンプルの由来となる水泡眼の個体を示している。上の０は免疫前の水泡液、２はサンプリング ２回目の水泡液、３はサンプリング ３回目の水泡液を示しており、これらの水泡液の希釈倍率（１／２〜１／２０００）を縦に示している。さらに、上のＰはポジティブコントロール、Ｎはネガティブコントロールを示しており、これらのコントロールについては、上から１／１００、１／２００、１／５００、１／１０００、１／２０００、１／５０００に希釈したものを固相化している。
【００８８】
以上の結果より、水泡を有する魚類によって抗体を製造することが可能であることが示された。水泡を有する魚類における抗体の製造では、水泡を有する魚類に対し、抗原を水泡内へ直接投与することができ、また、産生された抗体を水泡から直接回収できることも確認できた。
水泡から１回で直接回収できるリンパ液は１〜５ｍｌであるため、１度の抗原の投与で産生された抗体を大量に回収することができる。また、抗体を含むリンパ液を採取後も、水泡眼が生きたままの状態であり、繰り返し水泡眼から抗体を含むリンパ液を継続的に採取することも可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、大量かつ、魚類を生かしたままの状態で繰り返し、魚類に産生させた抗体を得ることが可能となった。本発明によって得られる抗体は、糖タンパク質等を抗原とするものも含まれ、哺乳動物等を対象とする抗体と同様に幅広く活用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法。
【請求項２】
抗原を投与する部位が水泡である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
抗原をオイルベースとともに、またはオイルベースと不活化大腸菌とともに投与する請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
魚類に産生させた抗体を、魚類の水泡から採取する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
水泡を有する魚類が水泡眼またはらんちゅうである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
抗原がタンパク質または糖タンパク質である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
抗原がＥＧＦＰ、グルコアミラーゼまたはＬＧＲ３である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法によって製造される抗体。
【請求項１】
水泡を有する魚類に抗原を投与し、抗体を産生させる工程を含む、抗体の製造方法。
【請求項２】
抗原を投与する部位が水泡である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
抗原をオイルベースとともに、またはオイルベースと不活化大腸菌とともに投与する請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
魚類に産生させた抗体を、魚類の水泡から採取する工程を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
水泡を有する魚類が水泡眼またはらんちゅうである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
抗原がタンパク質または糖タンパク質である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
抗原がＥＧＦＰ、グルコアミラーゼまたはＬＧＲ３である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法によって製造される抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
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【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１３−８２６６４（Ｐ２０１３−８２６６４Ａ）
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５８５６６（Ｐ２０１２−５８５６６）
【出願日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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