抗体の軽鎖スクリーニング方法
本発明は、（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたライブラリーを工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、及び（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、多重特異性抗体の異なる特異性を有する重鎖に対応して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＢｓＡｂ）は、二機能性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれることもあり、２つの抗原決定基に特異的な結合部位を有する、２種類の抗原と反応することができる多価抗体である。ＢｓＡｂは、ハイブリッドハイブリドーマ、即ちクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）と呼ばれる２種類の異なるモノクローナル抗体産生細胞の融合体を用いて産生することができる（米国特許第４，４７４，８９３号公報；Ｒ．Ｂｏｓ ａｎｄ Ｗ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｔｚｅｎ（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１（１）：４１−５１）。また、２種類のモノクローナル抗体のＦａｂ（抗原結合性）断片、またはＦａｂ’断片を化学的（Ｍ．Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１７０８）：８１−３）、または遺伝子操作により結合して作製することもできる。さらに、２つの完全なモノクローナル抗体を共有結合することにより作製することもできる（Ｂ．Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０（６）：１６８６−７０１）。
ＢｓＡｂ製造方法における問題点として、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖が無作為に組み合わさるため、１０種類の異なる抗体分子が産生される可能性がある点が挙げられる（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。クアドローマにより産生される１０種類の抗体のうち、所望の二特異性を有する抗体は、正しい軽鎖と重鎖が組合されており、且つ、異なる結合特性を有する２組の軽鎖・重鎖ペアにより構成された１種類の抗体のみである。そこで、クアドローマにより産生される１０種類の抗体から所望の二重特異性を有する抗体を選択的に精製する必要がある。精製は、一般にアフィニティークロマトグラフィーを利用して行われるが、余計な手数を要し、またその収量も少なくなってしまうという問題点がある（Ｙ．Ｓ．Ｍａｓｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：５７−６６）。
このような問題点を解消し、より大きな収量でＢｓＡｂを得る方法として、例えば、Ｆａｂ’−チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体とＦａｂ’−チオール（ＳＨ）等の抗体断片を化学的に連結する方法が知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１）。さらに、化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨ断片をより簡便に得るための方法として、大腸菌等の宿主から遺伝子組換技術により産生する方法が知られている（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２５）。遺伝子組換技術を用いることにより、ヒト化抗体断片より構成されるＢｓＡｂを得ることもできる。また、ダイアボディ（Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）が互いに結合できないくらいに短いリンカーによって結合されている２種類の断片からなるＢｓＡｂである（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号）。このようなＤｂをさらに改良したものとして単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｄｂを挙げることができる（特願２００２−１１２３６９号公報）。しかしながら、抗体断片は、完全長の抗体に比べ血清半減期が短く、完全抗体のようにエフェクター機能も有していない。そのため、完全長の抗体の方が、より診断や治療に適している場合があると考えられている。
産生された抗体重鎖をヘテロダイマーとして効率的に結合するための方法として、抗体重鎖のマルチマー化ドメインのＣＨ３（定常領域の一部）ドメインに立体的に相補的な変異を導入する方法が知られている（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７−２１）。この方法により製造された重鎖も、依然として誤った軽鎖と対形成し得る。そこで、特許文献１には、抗体結合ドメインを有するヘテロマー性ポリペプチドと結合した共通の軽鎖を有する多重特異性抗体を製造する方法が記載されている。
２つの異なる抗原に対する特異的結合能を有するＢｓＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断、治療及び免疫学的検定等の臨床分野において標的化薬剤として有用である。例えば、ＢｓＡｂの一方の腕を酵素免疫分析に使用する酵素上の酵素反応を阻害しない部分のエピトープと結合するように、そして他方の腕を固定化用担体に結合するように設計してやることで、担体上に酵素を結合する媒体として使用することができる（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１−７３）。その他、例えば、抗体ターゲティング化血栓溶解療法を挙げることができる。該療法として、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロウロキナーゼ等の酵素またはその前駆体等の蛋白を、血栓に含まれるフィブリン特異的に運搬する抗体を用いることが検討されている（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１１６３；特開平５−３０４９９２号公報）。さらに、癌ターゲティングに応用可能なマウス・ヒト・キメラ二重特異性抗体（特開平２−１４５１８７号公報）、種々の腫瘍を対象とした癌治療及び診断（例えば、特開平５−２１３７７５号公報；特開平１０−１６５１８４号公報；特開平１１−７１２８８号公報；特表２００２−５１８０４１号公報；特表平１１−５０６３１０号公報；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８１：３３４３；Ｔ．Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３５：３６８−７１；Ｌ．ｄｅＬｅｉｊ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ Ｆｒａｎｃｅ ２４９−５３；Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２−７１；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０−５参照）、真菌治療（特開平５−１９９８９４号公報）、免疫応答誘導（特表平１０−５１１０８５号公報；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９４−１００）、Ｔ細胞殺細胞作用の誘導（Ｋｒｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６５２−６１；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５）、免疫分析（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７９８９−９３；特開平５−１８４３８３号公報）、免疫組織化学（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７）等にＢｓＡｂを使用することが報告されている。
抗体の抗原特異性を決定する重鎖及び軽鎖の可変領域塩基配列を取得することにより、特定の抗原に特異的な抗体を遺伝子工学的に作製することができる（Ｊ．Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：８０９；Ｃ．Ｒ．Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９）。抗原特異的な重鎖及び軽鎖を取得する方法として、大腸菌を宿主とし、ファージまたはファージミドを利用した方法が公知である（Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２；Ａ．Ｓ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３）。これらの方法ではＦａｂを産生させて抗体ライブラリーとするか、または、Ｆａｂ若しくは一本鎖Ｆｖとファージコート蛋白質との融合蛋白質を産生させて抗体ライブラリーとする。最終的に、抗原との結合性を調べることにより、それらの抗体ライブラリーから抗原特異的抗体及びその遺伝子を選択する。
〔特許文献１〕特表２００１−５２３９７１号公報
【発明の開示】
二重特異性ＩｇＧの作製では、異なる抗原に対する２つの抗体を選択し、その２つの重鎖遺伝子、２つの軽鎖遺伝子を細胞に導入することになるが、その組み合わせは上記従来技術においても述べたように１０通りにものぼる。そして特許文献１では、ＩｇＧのＣＨ３部分にアミノ酸置換を導入することで重鎖のヘテロな組合せのものを優先的に発現する方法を開発し、さらに軽鎖を共通のものにすることで効率良く二特異性ＩｇＧの発現を行うことが提案されている。しかし任意の抗体を２つ選んだ場合、同じ軽鎖を含む可能性は低く、上記アイデアを実行することは困難である。本発明は、任意の異なる重鎖に対応し高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法を提供する。
本発明者らは、ＢｓＡｂの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖を、（１）抗原Ａに対する抗体Ａ、及び抗原Ｂに対する抗体Ｂをそれぞれ選択し、（２）該抗体の重鎖（好ましくはＦｄ部分、即ちＶＨ及びＣＨ１を含む領域）をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して各重鎖の分泌株Ｈａ（抗体Ａの重鎖を分泌）及びＨｂ（抗体Ｂの重鎖を分泌））を用意し、（３）別に、軽鎖がファージの表面蛋白との融合蛋白質として発現されるライブラリーを構築し、（４）該軽鎖ライブラリーを前記大腸菌Ｈａに導入して抗体Ａの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄ部分の場合はＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーを分泌させ（図１）、（５）該ライブラリーから、抗原Ａによるパニングにてクローンを濃縮し、（６）得られたクローンをさらに大腸菌Ｈｂに感染させ、抗体Ｂの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄ部分の場合はＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーを得、（７）該ライブラリーを抗原Ｂによるパニングによってクローンを濃縮するという工程を繰り返すことによって（図２）得ることができることに想到し、本発明を完成した。
より詳細には、本発明は、下記発明に関するものである。
（１）以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（２）以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（３）抗体重鎖がＦｄであり、重鎖及び軽鎖により構成される抗体がＦａｂである、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）宿主が大腸菌である、上記（１）または（２）記載の方法。
（５）工程（ｂ）から（ｅ）を２回以上繰り返す、上記（１）または（２）記載の方法。
（６）以下の工程をさらに含む、上記（１）記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（７）以下の工程をさらに含む、上記（２）記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（８）上記（１）〜（７）のいずれかの方法により得られた軽鎖。
（９）上記（８）記載の軽鎖を含む抗体。
（１０）以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
（ａ）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖を選択する工程
（ｂ）選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、該軽鎖を発現可能なベクターを作製する工程
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
（１１）軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する宿主。
（１２）軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する大腸菌。
本発明は、（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたライブラリーを工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、及び（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、特にＢｓＡｂの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖を選択するために利用することができる。しかしながら、上記本発明の方法において、工程（ｂ）及び（ｃ）、または工程（ｂ）から（ｅ）をさらに異なる種類の重鎖を分泌する宿主及びそれに対応した抗原を用いて繰り返すことにより、ＢｓＡｂのみならず、３種類以上の抗原に対して特異性を示す多重特異性抗体の作成に利用できる、より多くの重鎖に対応し、抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングしてくることができる。本明細書中に記載される多重特異性抗体とは、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。好ましい多重特異性抗体として２つの抗原に対して特異的に結合することができるＢｓＡｂを挙げることができる。
本発明において、「異なる抗原」とは必ずしも抗原自体が異なる必要はなく、抗原決定基が異なる場合等も本発明の「異なる抗原」に含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なる抗原に含まれ、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する２つの抗体は、本発明において異なる抗原を認識する抗体として扱われる。また、本発明において「共通軽鎖」とは、異なる２種以上の重鎖と会合し、それぞれの抗原に対して結合能を示し得る軽鎖である。ここで、「異なる重鎖」とは、好ましくは異なる抗原に対する抗体の重鎖を指すが、それに限定されず、アミノ酸配列が互いに異なっている重鎖を意味する。従って、本発明は、（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたライブラリーを工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程、並びに（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程、を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法にも関する。
本発明は、２種類以上の異なる抗体の重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関するものである。本発明のスクリーニング方法では、まず、所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を得る必要がある。該宿主は、例えば、ＢｓＡｂを作成する場合には、所望の２種類の抗原の各々に対応する重鎖を分泌する２種類の宿主が必要であり、３特異性抗体であれば３種類、４特異性抗体であれば４種類必要となる。以下、例示的にＢｓＡｂにおける共通重鎖をスクリーニングするための方法を中心として説明する。
本発明のスクリーニングに必要な抗体重鎖を分泌する宿主を得るため、まず、２種類の抗原（便宜的に、抗原Ａ及び抗原Ｂとする）に対する抗体を選択し、それらを産生する細胞を取得する。以後の説明において抗原Ａに対する抗体を抗体Ａ、抗原Ｂに対する抗体を抗体Ｂと呼ぶ。これらの抗体産生細胞は、適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる（ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６参照）。
動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
動物を免疫化する抗原としては、免疫原性を有する完全抗体と、免疫原性を有さない不完全抗原（ハプテンを含む）のどちらかを利用することができる。例えば、蛋白質、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質等からなる物質を抗原として使用することができる。動物を免疫するのに用いる免疫原としては、必要に応じ、抗原となる分子を他の分子（例えば、キーホルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイクログロブリン、ダイズトリプシン阻害剤等）に結合させて可溶性抗原とすることもできる。さらに、場合により、該可溶性抗原の断片を免疫原として利用してもよい。受容体等の膜貫通分子を抗原として用いる場合には、好ましくは、これらの断片（例えば、受容体の細胞外領域）を使用する。また、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原としてもよい。このような細胞としては、天然（腫瘍セルライン等）由来の細胞も存在するが、遺伝子組換技術により膜貫通分子を発現する細胞を調製してもよい。
本発明の共通軽鎖を選択する方法は、多様な抗原に対するＢｓＡｂを製造するのに適用できるものである。例えば、ＢｓＡｂを癌治療において使用することを目的とする場合には、例えば、抗体の一方の腕は腫瘍細胞抗原を認識するように調製し、他方の腕は細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計することができる。腫瘍細胞抗原としては、例えば、１Ｄ１０（悪性Ｂ細胞）、ＡＭＯＣ−１（ｐａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡＭＡ１、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦ受容体、Ｉｄ−１、Ｌ−Ｄ１（大腸癌）、ＭｏＶ１８、ｐ９７、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＯＶＣＡＲ−３、神経細胞接着分子（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＮＣＡＭ）、腎細胞癌、メラノサイト刺激ホルモンアナログ、葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）等が挙げられる。また、細胞傷害性を誘起する分子としては、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＦｃγＲＩが例示される。その他、ＩＦＮ−α、サポニン、ピンカアルカロイド、リシンのＡ鎖等の毒素と結合できるようＢｓＡｂを設計することもできる。
また、ヘテロ二量体を形成し、リガンドとの結合によりその鎖間の距離または角度等が変化することにより細胞内にシグナルを伝達する受容体（例えば、多くのサイトカイン受容体）に対して結合するようにＢｓＡｂを構築することにより、該ＢｓＡｂはリガンドによる受容体の二量体化を模倣できるアゴニスト抗体として利用することができる。
その他にも、（１）ＣＤ３０及びアルカリホスファターゼに結合し、リン酸マイトマイシンをマイトマイシンアルコールに変換する等の、化学物質の変換を助ける酵素と相互作用するＢｓＡｂ、（２）繊維素溶解剤として使用できる、フィブリン、ｔＰＡ、ｕＰＡ等に結合するＢｓＡｂ、（３）ＬＤＬ及びＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導するＢｓＡｂ、（４）ＣＤ３等のＴ細胞上の抗原と、ＨＣＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ等の病原菌の抗原を認識する感染性の疾患に使用できるＢｓＡｂ、（５）腫瘍の検出に使用し得る腫瘍抗原と、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ハプテン等の検出可能な物質に結合性を有するＢｓＡｂ、（６）ワクチンアジュバントとして使用し得るＢｓＡｂ（Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１−２４参照）、並びに（７）診断において使用し得るウサギＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ等の検出可能な物質と、ホルモン、フェリチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ＣＥＡ等を抗原とするＢｓＡｂ等が知られている。本発明の共通軽鎖を選択する方法は、これらの公知のＢｓＡｂを含む多様な多重特異性抗体の製造（ＷＯ８９／０２９２２号パンフレット、ＥＰ３１４、３１７号公報、ＵＳ５１１６９６４号公報参照）において利用することができる。
次に、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作成する（Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，５９−１０３）。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体Ａ及び抗体Ｂの重鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）から、重鎖に特異的に結合し得るプローブ（例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を用いてクローニングする。また、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２等）に分けられる。本発明において使用する抗体重鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属するものであってもよく、特に限定されないが、ＩｇＧは特に好ましいものである。
上述のハイブリドーマに代えて抗体ライブラリーから所望の抗原との結合性を利用して、目的とする抗体または抗体断片をコードする遺伝子を取得することもできる。抗体ライブラリーの構築は周知であり、様々な方法により作成し、利用することができる。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５−６０、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−１４、及び特表平１０−５０４９７０号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法（ＷＯ９５／１５３９３号パンフレット）やリボソーム提示法などの公知の方法を用いることが可能である。
ここで、重鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。遺伝子工学的に非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）由来のモノクローナル抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）以外の部分をヒト免疫グロブリン由来の可変領域の枠組構造配列に置換し、「ヒト化抗体」とする技術が公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−９；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６参照）。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入されたＣＤＲまたは枠組構造配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなアミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識及び／または結合能力をより正確に至適化するために行われる。本発明の方法のスクリーニングに使用する重鎖は、このようなヒト化等の改変されたものであってもよい。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９７％、９８％、９９％等）のアミノ酸配列相同性及び／または類似性を元となった抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び／または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同（同じ残基）または類似（一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基いて（１）疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；（２）中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；（３）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；（５）鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに（６）芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
本発明の方法において用いる抗体重鎖を分泌する宿主細胞は、抗体の重鎖の全長を分泌するものでも、重鎖の一部の断片を分泌するものであってもよい。従って、本発明の重鎖とは、抗体重鎖の全長、及び重鎖の断片が含まれる。重鎖の断片は、特に限定されないが、重鎖可変領域を含む断片であることが好ましく、特に好ましくはＦｄ部分（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ１））を含む断片である。しかしながら、特にこれに限定されるものではなく、重鎖の可変領域のみ、可変領域の一部、または定常領域のその他の領域（ＣＨ２及び３）を含む部分を分泌する構成としてもよい。
所望の抗体重鎖をコードする遺伝子部分を、適当な宿主細胞における発現に適した発現ベクターに導入する。本発明の方法では、重鎖を分泌する宿主細胞は特に限定されるものではないが、ファージを感染させることができる細菌、特にグラム陰性細菌が好ましく、中でも、Ｆ因子を発現する大腸菌が好ましい。Ｆ因子を発現する大腸菌としては、例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅを挙げることができる。
本発明の方法において特に好ましい、重鎖を大腸菌で発現させるためのベクターは、遺伝子情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、ターミネーター等のユニットを含む必要がある。例えば、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用することができる。プロモーターとしは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λファージＰＬ、ＰＲ等に由来するプロモーターが利用可能である。ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ、ファージ、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のものを使用することができる。
構築した発現ベクターは宿主細胞へ導入し、各抗体の重鎖を分泌する株を取得する。発現ベクターは、カルシウムイオンを用いた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８２９号公報）、エレクトポーレション法（Ｇｅｎｅ １７：１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８：１１１（１９７９））等の方法により宿主細胞へ導入され得る。
本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングの対象となる抗体軽鎖のプールは、重鎖を分泌する宿主として細菌を選択した場合には、ファージライブラリーの形態とするのが好ましい。軽鎖をコードする遺伝子としては、ヒトまたはその他の動物の末梢血単核球、骨髄、または脾臓調製物由来のＲＮＡを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等により増幅して得られた遺伝子群、合成ＤＮＡ等を利用することができる。その他、抗体のＣＤＲ領域内に変異を誘発して抗体ライブラリーの多様性を高める方法も知られている（特表平１０−５０４９７０号公報）。このような方法により多様性を高められた抗体軽鎖遺伝子ライブラリーを本発明のスクリーニング方法における軽鎖をコードする遺伝子のプールとして使用することもできる。本発明の軽鎖には、軽鎖の全長、及び軽鎖の一部の断片が含まれる。軽鎖の断片とは、特に限定されないが、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む断片であることが好ましい。
ファージライブラリーを作製するため、通常、軽鎖をコードするＤＮＡを、該軽鎖が外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質との融合蛋白質としてファージ外表面へ提示されるように適当なファージベクターに組込む。ここで、ファージベクターは特に限定されないが、通常、バクテリオファージ用の複製開始点（ｏｒｉ）を含む、ファージゲノムの修飾により誘導されるベクターである。ファージベクターは、好ましくは、Ｎ末からＣ未の方向で（１）軽鎖、及び（２）ファージ膜アンカードメイン（外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部若しくは一部）をコードしている。また、必要に応じ、上記（１）及び（２）によりコードされる蛋白質が、宿主細菌の細胞外へ分泌されバクテリオファージに取込まれることを可能とする原核細胞分泌シグナルドメインをコードする配列を（１）の軽鎖をコードする配列の前に有している。
軽鎖をファージ粒子表面上に提示させるためのファージ膜アンカードメインは、糸状ファージ粒子の外膜と結合することができ、それにより融合蛋白質を取り込ませることができる外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部または一部である。外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質とは、成熟ファージ粒子をコートする蛋白質であり、例えば、ファージ粒子のメジャーコート蛋白質であるｃｐＶＩＩＩや、それ以外のマイナーなコート蛋白質であるｃｐＶＩ、ｃｐＶＩＩ、ｃｐＩＸ、あるいは感染吸着蛋白質であるｃｐＩＩＩ蛋白質を挙げることができる。特に、ｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ蛋白質との融合蛋白質として発現させるのが好ましく、中でもｃｐＩＩＩ蛋白質との融合蛋白質の発現はよく研究されている（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−７；ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：４３１８−２２参照）。膜アンカードメインは、これらの成熟ファージ粒子をコートする蛋白質のＣ末領域の一部を含むものであり、脂質二重層膜を貫通するための疎水性アミノ酸残基の領域、及び、細胞質領域の荷電したアミノ酸残基の領域である。
分泌シグナルは、宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を可能にするリーダーペプチド配列であればよく、ｐｅｌ１Ｂ分泌シグナルを例示することができる（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−３；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８参照）。
上述のようなファージベクターでは、通常、ファージ粒子の産生に必要なファージゲノム配列が除去または不活性化されている。そこで、該ファージベクターを宿主細菌に感染させてファージ粒子を産生させるために、一般的には、ヘルパーファージが必要とされる。ヘルパーファージは、欠損ファージまたはファージベクターを含む細胞に対して感染され、該欠損ファージまたはファージベクターを補足する機能を有する。
ファージライブラリーを構成するファージ粒子は特に限定されず、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ３０、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、Ｇ４、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐｆ１、Ｐｆ３、Ｔ４、Ｔ７、Ｘｆ、λ、λＢ、λｇＷＥＳ、ΦＫ、ΦＸ１７４等の公知のファージを利用することができるが、好ましくはｆｄ、ｆ１、Ｍ１３などの糸状ファージである。このようにして作製されたライブラリーの個々のファージ粒子は、粒子表面上に提示される軽鎖融合蛋白質をコードする対応ファージミドのコピーを含む。従って、軽鎖提示ファージライブラリーに対して抗体Ａの重鎖を接触させ、ファージ粒子上に提示される軽鎖融合蛋白質に該重鎖が会合したものを抗原Ａに対する結合能によりファージ粒子を分離してくることにより抗体Ａの重鎖と会合し、抗原Ａに対する結合能を有する軽鎖をコードする遺伝子を得ることができる。
例えば、ｆ１ファージのｏｒｉを含んだベクターを用いて、軽鎖（例えば、ＶＬ及びＣＬを含むもの）がｆ１ファージのｇｅｎｅ３蛋白（マイナーコート蛋白質）と融合蛋白として発現するライブラリーを構築する。この軽鎖ライブラリーを先に述べた抗体Ａの重鎖（例えば、Ｆｄ）を発現する大腸菌宿主に導入し、ヘルパーファージを感染させることにより、ｇｅｎｅ３蛋白との融合蛋白として抗体Ａの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄであり、軽鎖がＶＬ及びＣＬを含む場合にはＦａｂ）を表面に提示するファージライブラリーを大腸菌から分泌させることができる（図１）。
ＷＯ９５／１５３９３号パンフレットには、抗体本来の抗原結合能をスクリーニング段階からより正確に調べることを可能にする抗体真核細胞ライブラリーの構築も提案されている。そこで、本発明の方法において、大腸菌等の細菌宿主に代えて、抗体を細胞表面上に提示する抗体真核細胞ライブラリーを採用することもできる。即ち、所望の重鎖（例えば、Ｆｄ）をコードする遺伝子を、該遺伝子の発現に適したプロモーター及び該重鎖を分泌可能なシグナル配列の下流に連結した発現ベクターを真核細胞宿主に導入する。そして、軽鎖をコードする遺伝子は、該軽鎖が発現された場合に細胞表面上に提示されるように細胞膜貫通領域をコードする配列と連結して、適当なプロモーターの下流へ挿入し、発現ベクターを構築する。好ましくは、該細胞膜貫通領域は、発現された軽鎖のＣ末端に付加される。該軽鎖発現ベクターを前記重鎖分泌宿主細胞へ導入することにより、所望の抗原に対して結合する抗体（重鎖としてＦｄを、そして軽鎖としてＶＬ及びＣＬを含むものを使用した場合には、提示される抗体はＦａｂ断片となる）を細胞表面上に発現している宿主細胞を選択することもできる。
使用する宿主細胞の種類は特に限定されないが、抗体の正しい抗原特異性に基いたスクリーニングを目的とする場合には、真核生物細胞、特に動物細胞が好ましく、さらに哺乳動物細胞が好ましい。例えば、３Ｔ３、ＢＨＫ、Ｂｏｗｅｓメラノーマ、Ｃ１２７、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０８：９４５（１９９５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８））、ＣＯＳ、ＨＥＫ、Ｈｅｌａ、ＫＪＭ、Ｎａｍａｌｗａ、ミエローマ細胞等を例示することができる。重鎖及び軽鎖を発現させるベクターは、選択した宿主における発現に適したものであればよく、ｐＵＣ１８等を利用して構築することができる。重鎖をコードする遺伝子は、周知の技術によりゲノム上に組込むことも可能である。発現ベクターは、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６）、カチオニックリポソーム法、直接注入法（マイクロインジェクション法）、電気穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．１−９．９）、リポフェクション法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ（１９９４）Ｃｅｌｌ ７：１１０２５−３７）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：５７０７−１７；Ｓｕｓｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１６４２−３）等の慣用の方法により宿主細胞へ導入する。
次に、本発明のスクリーニング法では、上述のようにして作製された抗体を提示する宿主細胞を抗原Ａに対する結合性により選択する。宿主として細菌細胞を選択し、軽鎖をコードする遺伝子をファージライブラリーとした場合には、抗体はファージライブラリーとして宿主細胞より分泌される。従って、抗体Ａに対する抗原Ａによるパニングにて抗原Ａに結合するクローンを宿主細胞より分泌されたファージライブラリーから濃縮することができる。この場合、濃縮された所望のファージライブラリーをそのまま次の工程における宿主細胞の感染に使用することができ、特に都合がよい。ファージライブラリーの分泌ではなく、宿主細胞表面に抗体が提示される形態とした場合には、所望の抗体を提示する細胞から該抗体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、必要に応じ公知の手段により精製して次の工程に用いる。
続いて、本発明のスクリーニング法では、上述のようにして濃縮されたクローン、または回収された軽鎖発現ベクターを、抗体Ｂの抗体（例えば、Ｆｄ）を分泌する宿主細胞に感染または導入する。ファージライブラリーを用いる場合には、該宿主細胞に対してヘルパーファージを再び重感染させることにより、抗体Ｂの重鎖（例えば、Ｆｄ）と様々な軽鎖から成る抗体（Ｆｄ並びにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖を使用した場合にはＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーが分泌される。ファージベクター以外の発現ベクターを用いた場合には、細胞表面上に抗体Ｂの重鎖（例えばＦｄ）と軽鎖から成る抗体（Ｆｄ並びにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖を使用した場合にはＦａｂ）を表面に提示した様々な細胞が得られる。
次に、抗原Ａに対する選択と同様に、ファージライブラリーを用いた場合には、該ライブラリーに対する抗原Ｂによるパニングによって、宿主細胞より分泌されたファージライブラリーから抗原Ｂに結合するクローンを濃縮する。また、宿主細胞表面に抗体が提示される形態とした場合には、所望の抗体を提示する細胞から該抗体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、必要に応じ公知の手段により精製する。以上のようにして、抗原Ａ及び抗原Ｂに対する軽鎖のスクリーニングを行うことによって、異なる重鎖に対応し、種々の抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることができる（図２）。
さらに、必要に応じ、抗原Ａ及び抗原Ｂに対する抗体（例えばＦｄ）を分泌する宿主への感染・導入、抗体（またはＦａｂ等の使用した軽鎖及び重鎖に応じた抗体断片）の分泌・提示、並びにパニング・選択を繰り返すことによってより選択性の高い共通軽鎖をスクリーニングすることができる。また、スクリーニングする抗原の種類を増やすことによって、より多くの重鎖に対応し、種々の抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることも可能である。このようにして選択された軽鎖、及び軽鎖をコードする遺伝子は、様々な診断及び治療方法において有用なＢｓＡｂを含む多重特異性抗体の製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆａｂ Ｌｃｈライブラリーの模式図である。
図２は、本発明の異なる重鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通軽鎖のスクリーニング方法の流れを示す模式図である。
【産業上の利用の可能性】
本発明の方法により、異なる重鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることが可能となった。本発明の方法を利用することにより、効率の良く多重特異性抗体の発現を行うことができる。
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は、多重特異性抗体の異なる特異性を有する重鎖に対応して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＢｓＡｂ）は、二機能性抗体（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれることもあり、２つの抗原決定基に特異的な結合部位を有する、２種類の抗原と反応することができる多価抗体である。ＢｓＡｂは、ハイブリッドハイブリドーマ、即ちクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）と呼ばれる２種類の異なるモノクローナル抗体産生細胞の融合体を用いて産生することができる（米国特許第４，４７４，８９３号公報；Ｒ．Ｂｏｓ ａｎｄ Ｗ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｔｚｅｎ（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１（１）：４１−５１）。また、２種類のモノクローナル抗体のＦａｂ（抗原結合性）断片、またはＦａｂ’断片を化学的（Ｍ．Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（１７０８）：８１−３）、または遺伝子操作により結合して作製することもできる。さらに、２つの完全なモノクローナル抗体を共有結合することにより作製することもできる（Ｂ．Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０（６）：１６８６−７０１）。
ＢｓＡｂ製造方法における問題点として、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖が無作為に組み合わさるため、１０種類の異なる抗体分子が産生される可能性がある点が挙げられる（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。クアドローマにより産生される１０種類の抗体のうち、所望の二特異性を有する抗体は、正しい軽鎖と重鎖が組合されており、且つ、異なる結合特性を有する２組の軽鎖・重鎖ペアにより構成された１種類の抗体のみである。そこで、クアドローマにより産生される１０種類の抗体から所望の二重特異性を有する抗体を選択的に精製する必要がある。精製は、一般にアフィニティークロマトグラフィーを利用して行われるが、余計な手数を要し、またその収量も少なくなってしまうという問題点がある（Ｙ．Ｓ．Ｍａｓｓｉｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１：５７−６６）。
このような問題点を解消し、より大きな収量でＢｓＡｂを得る方法として、例えば、Ｆａｂ’−チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体とＦａｂ’−チオール（ＳＨ）等の抗体断片を化学的に連結する方法が知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１）。さらに、化学的に連結させることができるＦａｂ’−ＳＨ断片をより簡便に得るための方法として、大腸菌等の宿主から遺伝子組換技術により産生する方法が知られている（Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２５）。遺伝子組換技術を用いることにより、ヒト化抗体断片より構成されるＢｓＡｂを得ることもできる。また、ダイアボディ（Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築された軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）が互いに結合できないくらいに短いリンカーによって結合されている２種類の断片からなるＢｓＡｂである（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−８；ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号）。このようなＤｂをさらに改良したものとして単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｄｂを挙げることができる（特願２００２−１１２３６９号公報）。しかしながら、抗体断片は、完全長の抗体に比べ血清半減期が短く、完全抗体のようにエフェクター機能も有していない。そのため、完全長の抗体の方が、より診断や治療に適している場合があると考えられている。
産生された抗体重鎖をヘテロダイマーとして効率的に結合するための方法として、抗体重鎖のマルチマー化ドメインのＣＨ３（定常領域の一部）ドメインに立体的に相補的な変異を導入する方法が知られている（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７−２１）。この方法により製造された重鎖も、依然として誤った軽鎖と対形成し得る。そこで、特許文献１には、抗体結合ドメインを有するヘテロマー性ポリペプチドと結合した共通の軽鎖を有する多重特異性抗体を製造する方法が記載されている。
２つの異なる抗原に対する特異的結合能を有するＢｓＡｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫診断、治療及び免疫学的検定等の臨床分野において標的化薬剤として有用である。例えば、ＢｓＡｂの一方の腕を酵素免疫分析に使用する酵素上の酵素反応を阻害しない部分のエピトープと結合するように、そして他方の腕を固定化用担体に結合するように設計してやることで、担体上に酵素を結合する媒体として使用することができる（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：１４６１−７３）。その他、例えば、抗体ターゲティング化血栓溶解療法を挙げることができる。該療法として、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロウロキナーゼ等の酵素またはその前駆体等の蛋白を、血栓に含まれるフィブリン特異的に運搬する抗体を用いることが検討されている（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１１６３；特開平５−３０４９９２号公報）。さらに、癌ターゲティングに応用可能なマウス・ヒト・キメラ二重特異性抗体（特開平２−１４５１８７号公報）、種々の腫瘍を対象とした癌治療及び診断（例えば、特開平５−２１３７７５号公報；特開平１０−１６５１８４号公報；特開平１１−７１２８８号公報；特表２００２−５１８０４１号公報；特表平１１−５０６３１０号公報；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８１：３３４３；Ｔ．Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３３５：３６８−７１；Ｌ．ｄｅＬｅｉｊ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ Ｆｒａｎｃｅ ２４９−５３；Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：１６６２−７１；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０−５参照）、真菌治療（特開平５−１９９８９４号公報）、免疫応答誘導（特表平１０−５１１０８５号公報；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：９４−１００）、Ｔ細胞殺細胞作用の誘導（Ｋｒｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７０：６５２−６１；Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２３８５）、免疫分析（Ｍ．Ｒ．Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７９８９−９３；特開平５−１８４３８３号公報）、免疫組織化学（Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７）等にＢｓＡｂを使用することが報告されている。
抗体の抗原特異性を決定する重鎖及び軽鎖の可変領域塩基配列を取得することにより、特定の抗原に特異的な抗体を遺伝子工学的に作製することができる（Ｊ．Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：８０９；Ｃ．Ｒ．Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９）。抗原特異的な重鎖及び軽鎖を取得する方法として、大腸菌を宿主とし、ファージまたはファージミドを利用した方法が公知である（Ｗ．Ｄ．Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２；Ａ．Ｓ．Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６３）。これらの方法ではＦａｂを産生させて抗体ライブラリーとするか、または、Ｆａｂ若しくは一本鎖Ｆｖとファージコート蛋白質との融合蛋白質を産生させて抗体ライブラリーとする。最終的に、抗原との結合性を調べることにより、それらの抗体ライブラリーから抗原特異的抗体及びその遺伝子を選択する。
〔特許文献１〕特表２００１−５２３９７１号公報
【発明の開示】
二重特異性ＩｇＧの作製では、異なる抗原に対する２つの抗体を選択し、その２つの重鎖遺伝子、２つの軽鎖遺伝子を細胞に導入することになるが、その組み合わせは上記従来技術においても述べたように１０通りにものぼる。そして特許文献１では、ＩｇＧのＣＨ３部分にアミノ酸置換を導入することで重鎖のヘテロな組合せのものを優先的に発現する方法を開発し、さらに軽鎖を共通のものにすることで効率良く二特異性ＩｇＧの発現を行うことが提案されている。しかし任意の抗体を２つ選んだ場合、同じ軽鎖を含む可能性は低く、上記アイデアを実行することは困難である。本発明は、任意の異なる重鎖に対応し高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法を提供する。
本発明者らは、ＢｓＡｂの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖を、（１）抗原Ａに対する抗体Ａ、及び抗原Ｂに対する抗体Ｂをそれぞれ選択し、（２）該抗体の重鎖（好ましくはＦｄ部分、即ちＶＨ及びＣＨ１を含む領域）をコードする遺伝子の発現ベクターを導入して各重鎖の分泌株Ｈａ（抗体Ａの重鎖を分泌）及びＨｂ（抗体Ｂの重鎖を分泌））を用意し、（３）別に、軽鎖がファージの表面蛋白との融合蛋白質として発現されるライブラリーを構築し、（４）該軽鎖ライブラリーを前記大腸菌Ｈａに導入して抗体Ａの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄ部分の場合はＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーを分泌させ（図１）、（５）該ライブラリーから、抗原Ａによるパニングにてクローンを濃縮し、（６）得られたクローンをさらに大腸菌Ｈｂに感染させ、抗体Ｂの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄ部分の場合はＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーを得、（７）該ライブラリーを抗原Ｂによるパニングによってクローンを濃縮するという工程を繰り返すことによって（図２）得ることができることに想到し、本発明を完成した。
より詳細には、本発明は、下記発明に関するものである。
（１）以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（２）以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（３）抗体重鎖がＦｄであり、重鎖及び軽鎖により構成される抗体がＦａｂである、上記（１）または（２）記載の方法。
（４）宿主が大腸菌である、上記（１）または（２）記載の方法。
（５）工程（ｂ）から（ｅ）を２回以上繰り返す、上記（１）または（２）記載の方法。
（６）以下の工程をさらに含む、上記（１）記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（７）以下の工程をさらに含む、上記（２）記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（８）上記（１）〜（７）のいずれかの方法により得られた軽鎖。
（９）上記（８）記載の軽鎖を含む抗体。
（１０）以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
（ａ）上記（１）〜（７）のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖を選択する工程
（ｂ）選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、該軽鎖を発現可能なベクターを作製する工程
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
（１１）軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する宿主。
（１２）軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する大腸菌。
本発明は、（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたライブラリーを工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、及び（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法に関する。本発明の方法は、特にＢｓＡｂの作成に利用可能な異なる重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖を選択するために利用することができる。しかしながら、上記本発明の方法において、工程（ｂ）及び（ｃ）、または工程（ｂ）から（ｅ）をさらに異なる種類の重鎖を分泌する宿主及びそれに対応した抗原を用いて繰り返すことにより、ＢｓＡｂのみならず、３種類以上の抗原に対して特異性を示す多重特異性抗体の作成に利用できる、より多くの重鎖に対応し、抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングしてくることができる。本明細書中に記載される多重特異性抗体とは、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異的に結合することができる抗体である。好ましい多重特異性抗体として２つの抗原に対して特異的に結合することができるＢｓＡｂを挙げることができる。
本発明において、「異なる抗原」とは必ずしも抗原自体が異なる必要はなく、抗原決定基が異なる場合等も本発明の「異なる抗原」に含まれる。従って、例えば、単一分子内の異なる抗原決定基も本発明の異なる抗原に含まれ、このような単一分子内の異なる抗原決定基を各々認識する２つの抗体は、本発明において異なる抗原を認識する抗体として扱われる。また、本発明において「共通軽鎖」とは、異なる２種以上の重鎖と会合し、それぞれの抗原に対して結合能を示し得る軽鎖である。ここで、「異なる重鎖」とは、好ましくは異なる抗原に対する抗体の重鎖を指すが、それに限定されず、アミノ酸配列が互いに異なっている重鎖を意味する。従って、本発明は、（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程、（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するライブラリーを製造する工程、（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するライブラリーを選択する工程、（ｄ）工程（ｃ）において選択されたライブラリーを工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程、並びに（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程、を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法にも関する。
本発明は、２種類以上の異なる抗体の重鎖に対応し、抗原に対し高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングする方法に関するものである。本発明のスクリーニング方法では、まず、所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を得る必要がある。該宿主は、例えば、ＢｓＡｂを作成する場合には、所望の２種類の抗原の各々に対応する重鎖を分泌する２種類の宿主が必要であり、３特異性抗体であれば３種類、４特異性抗体であれば４種類必要となる。以下、例示的にＢｓＡｂにおける共通重鎖をスクリーニングするための方法を中心として説明する。
本発明のスクリーニングに必要な抗体重鎖を分泌する宿主を得るため、まず、２種類の抗原（便宜的に、抗原Ａ及び抗原Ｂとする）に対する抗体を選択し、それらを産生する細胞を取得する。以後の説明において抗原Ａに対する抗体を抗体Ａ、抗原Ｂに対する抗体を抗体Ｂと呼ぶ。これらの抗体産生細胞は、適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる（ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６参照）。
動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
動物を免疫化する抗原としては、免疫原性を有する完全抗体と、免疫原性を有さない不完全抗原（ハプテンを含む）のどちらかを利用することができる。例えば、蛋白質、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質等からなる物質を抗原として使用することができる。動物を免疫するのに用いる免疫原としては、必要に応じ、抗原となる分子を他の分子（例えば、キーホルリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイクログロブリン、ダイズトリプシン阻害剤等）に結合させて可溶性抗原とすることもできる。さらに、場合により、該可溶性抗原の断片を免疫原として利用してもよい。受容体等の膜貫通分子を抗原として用いる場合には、好ましくは、これらの断片（例えば、受容体の細胞外領域）を使用する。また、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原としてもよい。このような細胞としては、天然（腫瘍セルライン等）由来の細胞も存在するが、遺伝子組換技術により膜貫通分子を発現する細胞を調製してもよい。
本発明の共通軽鎖を選択する方法は、多様な抗原に対するＢｓＡｂを製造するのに適用できるものである。例えば、ＢｓＡｂを癌治療において使用することを目的とする場合には、例えば、抗体の一方の腕は腫瘍細胞抗原を認識するように調製し、他方の腕は細胞傷害性を誘起する分子を認識するように設計することができる。腫瘍細胞抗原としては、例えば、１Ｄ１０（悪性Ｂ細胞）、ＡＭＯＣ−１（ｐａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡＭＡ１、ＣＤ７、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＥＡ、ＥＧＦ受容体、Ｉｄ−１、Ｌ−Ｄ１（大腸癌）、ＭｏＶ１８、ｐ９７、ｐ１８５ＨＥＲ２、ＯＶＣＡＲ−３、神経細胞接着分子（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＮＣＡＭ）、腎細胞癌、メラノサイト刺激ホルモンアナログ、葉酸結合蛋白質（ＦＢＰ）等が挙げられる。また、細胞傷害性を誘起する分子としては、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＦｃγＲＩが例示される。その他、ＩＦＮ−α、サポニン、ピンカアルカロイド、リシンのＡ鎖等の毒素と結合できるようＢｓＡｂを設計することもできる。
また、ヘテロ二量体を形成し、リガンドとの結合によりその鎖間の距離または角度等が変化することにより細胞内にシグナルを伝達する受容体（例えば、多くのサイトカイン受容体）に対して結合するようにＢｓＡｂを構築することにより、該ＢｓＡｂはリガンドによる受容体の二量体化を模倣できるアゴニスト抗体として利用することができる。
その他にも、（１）ＣＤ３０及びアルカリホスファターゼに結合し、リン酸マイトマイシンをマイトマイシンアルコールに変換する等の、化学物質の変換を助ける酵素と相互作用するＢｓＡｂ、（２）繊維素溶解剤として使用できる、フィブリン、ｔＰＡ、ｕＰＡ等に結合するＢｓＡｂ、（３）ＬＤＬ及びＦｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、またはＦｃγＲＩＩＩ）等に結合し免疫複合体を細胞表面受容体へ誘導するＢｓＡｂ、（４）ＣＤ３等のＴ細胞上の抗原と、ＨＣＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ等の病原菌の抗原を認識する感染性の疾患に使用できるＢｓＡｂ、（５）腫瘍の検出に使用し得る腫瘍抗原と、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ハプテン等の検出可能な物質に結合性を有するＢｓＡｂ、（６）ワクチンアジュバントとして使用し得るＢｓＡｂ（Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１０１−２４参照）、並びに（７）診断において使用し得るウサギＩｇＧ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ＦＩＴＣ、β−ガラクトシダーゼ等の検出可能な物質と、ホルモン、フェリチン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、ＣＥＡ等を抗原とするＢｓＡｂ等が知られている。本発明の共通軽鎖を選択する方法は、これらの公知のＢｓＡｂを含む多様な多重特異性抗体の製造（ＷＯ８９／０２９２２号パンフレット、ＥＰ３１４、３１７号公報、ＵＳ５１１６９６４号公報参照）において利用することができる。
次に、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用してミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作成する（Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，５９−１０３）。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体Ａ及び抗体Ｂの重鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）から、重鎖に特異的に結合し得るプローブ（例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等）を用いてクローニングする。また、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２等）に分けられる。本発明において使用する抗体重鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属するものであってもよく、特に限定されないが、ＩｇＧは特に好ましいものである。
上述のハイブリドーマに代えて抗体ライブラリーから所望の抗原との結合性を利用して、目的とする抗体または抗体断片をコードする遺伝子を取得することもできる。抗体ライブラリーの構築は周知であり、様々な方法により作成し、利用することができる。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−８、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−６、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５−６０、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−１４、及び特表平１０−５０４９７０号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法（ＷＯ９５／１５３９３号パンフレット）やリボソーム提示法などの公知の方法を用いることが可能である。
ここで、重鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。遺伝子工学的に非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）由来のモノクローナル抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）以外の部分をヒト免疫グロブリン由来の可変領域の枠組構造配列に置換し、「ヒト化抗体」とする技術が公知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−９；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６参照）。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入されたＣＤＲまたは枠組構造配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなアミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識及び／または結合能力をより正確に至適化するために行われる。本発明の方法のスクリーニングに使用する重鎖は、このようなヒト化等の改変されたものであってもよい。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９７％、９８％、９９％等）のアミノ酸配列相同性及び／または類似性を元となった抗体重鎖の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び／または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同（同じ残基）または類似（一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基）するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基いて（１）疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；（２）中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；（３）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（４）塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；（５）鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに（６）芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
本発明の方法において用いる抗体重鎖を分泌する宿主細胞は、抗体の重鎖の全長を分泌するものでも、重鎖の一部の断片を分泌するものであってもよい。従って、本発明の重鎖とは、抗体重鎖の全長、及び重鎖の断片が含まれる。重鎖の断片は、特に限定されないが、重鎖可変領域を含む断片であることが好ましく、特に好ましくはＦｄ部分（重鎖の可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ１））を含む断片である。しかしながら、特にこれに限定されるものではなく、重鎖の可変領域のみ、可変領域の一部、または定常領域のその他の領域（ＣＨ２及び３）を含む部分を分泌する構成としてもよい。
所望の抗体重鎖をコードする遺伝子部分を、適当な宿主細胞における発現に適した発現ベクターに導入する。本発明の方法では、重鎖を分泌する宿主細胞は特に限定されるものではないが、ファージを感染させることができる細菌、特にグラム陰性細菌が好ましく、中でも、Ｆ因子を発現する大腸菌が好ましい。Ｆ因子を発現する大腸菌としては、例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅを挙げることができる。
本発明の方法において特に好ましい、重鎖を大腸菌で発現させるためのベクターは、遺伝子情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、ターミネーター等のユニットを含む必要がある。例えば、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用することができる。プロモーターとしは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、λファージＰＬ、ＰＲ等に由来するプロモーターが利用可能である。ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ、ファージ、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のものを使用することができる。
構築した発現ベクターは宿主細胞へ導入し、各抗体の重鎖を分泌する株を取得する。発現ベクターは、カルシウムイオンを用いた方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８２９号公報）、エレクトポーレション法（Ｇｅｎｅ １７：１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８：１１１（１９７９））等の方法により宿主細胞へ導入され得る。
本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングの対象となる抗体軽鎖のプールは、重鎖を分泌する宿主として細菌を選択した場合には、ファージライブラリーの形態とするのが好ましい。軽鎖をコードする遺伝子としては、ヒトまたはその他の動物の末梢血単核球、骨髄、または脾臓調製物由来のＲＮＡを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等により増幅して得られた遺伝子群、合成ＤＮＡ等を利用することができる。その他、抗体のＣＤＲ領域内に変異を誘発して抗体ライブラリーの多様性を高める方法も知られている（特表平１０−５０４９７０号公報）。このような方法により多様性を高められた抗体軽鎖遺伝子ライブラリーを本発明のスクリーニング方法における軽鎖をコードする遺伝子のプールとして使用することもできる。本発明の軽鎖には、軽鎖の全長、及び軽鎖の一部の断片が含まれる。軽鎖の断片とは、特に限定されないが、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む断片であることが好ましい。
ファージライブラリーを作製するため、通常、軽鎖をコードするＤＮＡを、該軽鎖が外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質との融合蛋白質としてファージ外表面へ提示されるように適当なファージベクターに組込む。ここで、ファージベクターは特に限定されないが、通常、バクテリオファージ用の複製開始点（ｏｒｉ）を含む、ファージゲノムの修飾により誘導されるベクターである。ファージベクターは、好ましくは、Ｎ末からＣ未の方向で（１）軽鎖、及び（２）ファージ膜アンカードメイン（外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部若しくは一部）をコードしている。また、必要に応じ、上記（１）及び（２）によりコードされる蛋白質が、宿主細菌の細胞外へ分泌されバクテリオファージに取込まれることを可能とする原核細胞分泌シグナルドメインをコードする配列を（１）の軽鎖をコードする配列の前に有している。
軽鎖をファージ粒子表面上に提示させるためのファージ膜アンカードメインは、糸状ファージ粒子の外膜と結合することができ、それにより融合蛋白質を取り込ませることができる外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質の全部または一部である。外表面蛋白質またはディスプレイアンカー蛋白質とは、成熟ファージ粒子をコートする蛋白質であり、例えば、ファージ粒子のメジャーコート蛋白質であるｃｐＶＩＩＩや、それ以外のマイナーなコート蛋白質であるｃｐＶＩ、ｃｐＶＩＩ、ｃｐＩＸ、あるいは感染吸着蛋白質であるｃｐＩＩＩ蛋白質を挙げることができる。特に、ｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ蛋白質との融合蛋白質として発現させるのが好ましく、中でもｃｐＩＩＩ蛋白質との融合蛋白質の発現はよく研究されている（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−７；ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：４３１８−２２参照）。膜アンカードメインは、これらの成熟ファージ粒子をコートする蛋白質のＣ末領域の一部を含むものであり、脂質二重層膜を貫通するための疎水性アミノ酸残基の領域、及び、細胞質領域の荷電したアミノ酸残基の領域である。
分泌シグナルは、宿主細胞からの融合蛋白質の分泌を可能にするリーダーペプチド配列であればよく、ｐｅｌ１Ｂ分泌シグナルを例示することができる（Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−３；Ｓａｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５７２８参照）。
上述のようなファージベクターでは、通常、ファージ粒子の産生に必要なファージゲノム配列が除去または不活性化されている。そこで、該ファージベクターを宿主細菌に感染させてファージ粒子を産生させるために、一般的には、ヘルパーファージが必要とされる。ヘルパーファージは、欠損ファージまたはファージベクターを含む細胞に対して感染され、該欠損ファージまたはファージベクターを補足する機能を有する。
ファージライブラリーを構成するファージ粒子は特に限定されず、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ３０、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、Ｇ４、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐｆ１、Ｐｆ３、Ｔ４、Ｔ７、Ｘｆ、λ、λＢ、λｇＷＥＳ、ΦＫ、ΦＸ１７４等の公知のファージを利用することができるが、好ましくはｆｄ、ｆ１、Ｍ１３などの糸状ファージである。このようにして作製されたライブラリーの個々のファージ粒子は、粒子表面上に提示される軽鎖融合蛋白質をコードする対応ファージミドのコピーを含む。従って、軽鎖提示ファージライブラリーに対して抗体Ａの重鎖を接触させ、ファージ粒子上に提示される軽鎖融合蛋白質に該重鎖が会合したものを抗原Ａに対する結合能によりファージ粒子を分離してくることにより抗体Ａの重鎖と会合し、抗原Ａに対する結合能を有する軽鎖をコードする遺伝子を得ることができる。
例えば、ｆ１ファージのｏｒｉを含んだベクターを用いて、軽鎖（例えば、ＶＬ及びＣＬを含むもの）がｆ１ファージのｇｅｎｅ３蛋白（マイナーコート蛋白質）と融合蛋白として発現するライブラリーを構築する。この軽鎖ライブラリーを先に述べた抗体Ａの重鎖（例えば、Ｆｄ）を発現する大腸菌宿主に導入し、ヘルパーファージを感染させることにより、ｇｅｎｅ３蛋白との融合蛋白として抗体Ａの重鎖と様々な軽鎖から成る抗体（重鎖がＦｄであり、軽鎖がＶＬ及びＣＬを含む場合にはＦａｂ）を表面に提示するファージライブラリーを大腸菌から分泌させることができる（図１）。
ＷＯ９５／１５３９３号パンフレットには、抗体本来の抗原結合能をスクリーニング段階からより正確に調べることを可能にする抗体真核細胞ライブラリーの構築も提案されている。そこで、本発明の方法において、大腸菌等の細菌宿主に代えて、抗体を細胞表面上に提示する抗体真核細胞ライブラリーを採用することもできる。即ち、所望の重鎖（例えば、Ｆｄ）をコードする遺伝子を、該遺伝子の発現に適したプロモーター及び該重鎖を分泌可能なシグナル配列の下流に連結した発現ベクターを真核細胞宿主に導入する。そして、軽鎖をコードする遺伝子は、該軽鎖が発現された場合に細胞表面上に提示されるように細胞膜貫通領域をコードする配列と連結して、適当なプロモーターの下流へ挿入し、発現ベクターを構築する。好ましくは、該細胞膜貫通領域は、発現された軽鎖のＣ末端に付加される。該軽鎖発現ベクターを前記重鎖分泌宿主細胞へ導入することにより、所望の抗原に対して結合する抗体（重鎖としてＦｄを、そして軽鎖としてＶＬ及びＣＬを含むものを使用した場合には、提示される抗体はＦａｂ断片となる）を細胞表面上に発現している宿主細胞を選択することもできる。
使用する宿主細胞の種類は特に限定されないが、抗体の正しい抗原特異性に基いたスクリーニングを目的とする場合には、真核生物細胞、特に動物細胞が好ましく、さらに哺乳動物細胞が好ましい。例えば、３Ｔ３、ＢＨＫ、Ｂｏｗｅｓメラノーマ、Ｃ１２７、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０８：９４５（１９９５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８））、ＣＯＳ、ＨＥＫ、Ｈｅｌａ、ＫＪＭ、Ｎａｍａｌｗａ、ミエローマ細胞等を例示することができる。重鎖及び軽鎖を発現させるベクターは、選択した宿主における発現に適したものであればよく、ｐＵＣ１８等を利用して構築することができる。重鎖をコードする遺伝子は、周知の技術によりゲノム上に組込むことも可能である。発現ベクターは、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６）、カチオニックリポソーム法、直接注入法（マイクロインジェクション法）、電気穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．１−９．９）、リポフェクション法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ（１９９４）Ｃｅｌｌ ７：１１０２５−３７）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：５７０７−１７；Ｓｕｓｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１６４２−３）等の慣用の方法により宿主細胞へ導入する。
次に、本発明のスクリーニング法では、上述のようにして作製された抗体を提示する宿主細胞を抗原Ａに対する結合性により選択する。宿主として細菌細胞を選択し、軽鎖をコードする遺伝子をファージライブラリーとした場合には、抗体はファージライブラリーとして宿主細胞より分泌される。従って、抗体Ａに対する抗原Ａによるパニングにて抗原Ａに結合するクローンを宿主細胞より分泌されたファージライブラリーから濃縮することができる。この場合、濃縮された所望のファージライブラリーをそのまま次の工程における宿主細胞の感染に使用することができ、特に都合がよい。ファージライブラリーの分泌ではなく、宿主細胞表面に抗体が提示される形態とした場合には、所望の抗体を提示する細胞から該抗体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、必要に応じ公知の手段により精製して次の工程に用いる。
続いて、本発明のスクリーニング法では、上述のようにして濃縮されたクローン、または回収された軽鎖発現ベクターを、抗体Ｂの抗体（例えば、Ｆｄ）を分泌する宿主細胞に感染または導入する。ファージライブラリーを用いる場合には、該宿主細胞に対してヘルパーファージを再び重感染させることにより、抗体Ｂの重鎖（例えば、Ｆｄ）と様々な軽鎖から成る抗体（Ｆｄ並びにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖を使用した場合にはＦａｂ）を表面に提示したファージライブラリーが分泌される。ファージベクター以外の発現ベクターを用いた場合には、細胞表面上に抗体Ｂの重鎖（例えばＦｄ）と軽鎖から成る抗体（Ｆｄ並びにＶＬ及びＣＬを含む軽鎖を使用した場合にはＦａｂ）を表面に提示した様々な細胞が得られる。
次に、抗原Ａに対する選択と同様に、ファージライブラリーを用いた場合には、該ライブラリーに対する抗原Ｂによるパニングによって、宿主細胞より分泌されたファージライブラリーから抗原Ｂに結合するクローンを濃縮する。また、宿主細胞表面に抗体が提示される形態とした場合には、所望の抗体を提示する細胞から該抗体を構成する軽鎖をコードする発現ベクターを回収し、必要に応じ公知の手段により精製する。以上のようにして、抗原Ａ及び抗原Ｂに対する軽鎖のスクリーニングを行うことによって、異なる重鎖に対応し、種々の抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることができる（図２）。
さらに、必要に応じ、抗原Ａ及び抗原Ｂに対する抗体（例えばＦｄ）を分泌する宿主への感染・導入、抗体（またはＦａｂ等の使用した軽鎖及び重鎖に応じた抗体断片）の分泌・提示、並びにパニング・選択を繰り返すことによってより選択性の高い共通軽鎖をスクリーニングすることができる。また、スクリーニングする抗原の種類を増やすことによって、より多くの重鎖に対応し、種々の抗原に対して高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることも可能である。このようにして選択された軽鎖、及び軽鎖をコードする遺伝子は、様々な診断及び治療方法において有用なＢｓＡｂを含む多重特異性抗体の製造に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、Ｆａｂ Ｌｃｈライブラリーの模式図である。
図２は、本発明の異なる重鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通軽鎖のスクリーニング方法の流れを示す模式図である。
【産業上の利用の可能性】
本発明の方法により、異なる重鎖に対応し、高いアフィニティーを示す共通軽鎖をスクリーニングすることが可能となった。本発明の方法を利用することにより、効率の良く多重特異性抗体の発現を行うことができる。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項２】
以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項３】
抗体重鎖がＦｄであり、重鎖及び軽鎖により構成される抗体がＦａｂである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
宿主が大腸菌である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）から（ｅ）を２回以上繰り返す、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
以下の工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項７】
以下の工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法により得られた軽鎖。
【請求項９】
請求項８記載の軽鎖を含む抗体。
【請求項１０】
以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖を選択する工程
（ｂ）選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、該軽鎖を発現可能なベクターを作製する工程
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
【請求項１１】
軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する宿主。
【請求項１２】
軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する大腸菌。
【請求項１】
以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項２】
以下の工程を含む共通軽鎖をスクリーニングする方法。
（ａ）所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主を製造する工程
（ｂ）抗体軽鎖ライブラリーを工程（ａ）の宿主に導入し、前記重鎖及び前記軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｃ）工程（ａ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｅ）工程（ｄ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項３】
抗体重鎖がＦｄであり、重鎖及び軽鎖により構成される抗体がＦａｂである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
宿主が大腸菌である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）から（ｅ）を２回以上繰り返す、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
以下の工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の抗原とは異なる所望の抗原に対して結合する抗体の重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の所望の抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項７】
以下の工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
（ｆ）工程（ｅ）において選択されたファージライブラリーを、工程（ａ）及び（ｄ）の重鎖とは異なるアミノ酸配列を有する重鎖を分泌する宿主に対して導入し、該重鎖及び軽鎖により構成される抗体を提示するファージライブラリーを分泌させる工程
（ｇ）工程（ｆ）記載の重鎖が認識する抗原に対して特異的に結合する抗体を提示するファージライブラリーを選択する工程
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法により得られた軽鎖。
【請求項９】
請求項８記載の軽鎖を含む抗体。
【請求項１０】
以下の工程を含む抗体の軽鎖の製造方法。
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のスクリーニング方法により抗体の軽鎖を選択する工程
（ｂ）選択された軽鎖の遺伝子配列を基に、該軽鎖を発現可能なベクターを作製する工程
（ｃ）該ベクターを宿主細胞に導入する工程
（ｄ）該宿主細胞を培養する工程
【請求項１１】
軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する宿主。
【請求項１２】
軽鎖を提示可能なファージが感染し、かつ重鎖を発現可能なベクターを有する大腸菌。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５６１１
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８１０６（Ｐ２００５−５０８１０６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００４９６
【国際出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００４９６
【国際出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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