抗体グリコシル化変異型
Ｆｃ領域内にグリコシル化変異を有する抗体及び他のＦｃ含有分子は、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼ等のプロテアーゼに対して増大した耐性を示す。本Ｆｃ含有分子は、様々な疾患及び障害の治療において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体及び他のＦｃ含有分子のＦｃ配列を評価することに関し、より具体的には、プロテアーゼに対する感受性を変更するように、抗体調製物及び他のＦｃ含有分子を調整、変更、及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃドメイン内のアミノ酸修飾は、アロステリック効果と考えられるものを有し、つまり、遠くからＦｃ高次構造に影響を及ぼし得る。特に、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインでもある重鎖（下部ヒンジ領域）間の鎖間ジスルフィド結合よりも下で抗体を結合する、Ｆｃ−γ受容体への結合に影響することが示されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：８８８２）。
【０００３】
成熟した抗体においては、Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成する。それらの存在は、抗体がＡＤＣＣ等のエフェクター機能を仲介するために必須であることが分かった（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３〜８２２（１９９５）、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９〜７６（１９９８）、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｓｕｐｒａ）。他者及び本出願人（国際特許公開第ＷＯ２００７００５７８６号）による研究は、Ｆｃ領域におけるこれらの自然に付着したグリカンのオリゴ糖組成物が、ポリペプチド鎖の様々な非隣接部位におけるＦｃ受容体結合親和性及びプロテアーゼ感受性も変更することを更に示した（Ｒａｊｕ，Ｓ．Ｔ．２００８ Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：４７１〜４７８、国際特許公開第ＷＯ２００７０２４７４３号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、抗体分子の様々な高次構造の態様に関する理解が進み、モデリング及びタンパク質工学技術がより洗練されるにつれて、治療的抗体候補内の領域を修飾のための標的として、特定用途又は適応について所望のスペクトルのインビボ相互作用と合致させることが今や可能である。そのような修飾は、維持された安全性を有する改善された抗体治療薬を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、抗体又は抗体様治療薬の設計に有用な修飾されたグリコシル化免疫グロブリン定常ドメインの組成物、例えば、１つ以上の操作されたＡｓｎ結合グリコシル化部位（「Ｎ−グリコシル化」）を有するＦｃ領域を含むものを提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、３６１位の突然変異から生じる３５９位のＮ−グリコシル化部位、及び／又は４２１位の突然変異から生じる４１９位のＮ−グリコシル化部位がある。更に、天然Ｆｃグリコシル化がＡｓｎ２９７位に存在し、別の実施形態では、天然Ｆｃグリコシル化が存在しなくてもよい。抗体由来の構造物は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列から派生する、又はそれらを含む二量体タンパク質構造である。一態様において、構造物は、ヒンジ領域内の２２８、２３４、又は２３５位（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含有する。
【０００７】
本発明の別の目的は、類似の非修飾免疫グロブリン定常領域を有する化合物と比較して、プロテアーゼ感受性、血清半減期、及びＦｃ受容体結合を含むが、これらに限定されない改善された特性を有する修飾グリコシル化免疫グロブリン定常領域に基づく化合物を含む。
【０００８】
本発明の更なる目的は、グリコシル化抗体調製物がプロテアーゼによる開裂に抵抗する能力を強化するための組成物及び方法を提供することであり、したがって、癌等のプロテアーゼの上昇レベルの存在に随伴する病的状態を治療するための抗体調製物を提供することである。方法の更に別の実施形態において、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質は、抗体であり、好ましくは治療的モノクローナル抗体である。その開裂活性が抵抗の対象となるプロテアーゼは、宿主又は寄生生物、バクテリア、又はウイルスであり得る病原体から生じる、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態において、プロテアーゼは、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである。これらの修飾は、抗体配列に導入され得る。開示される修飾構造物は、生理学的に関連するプロテアーゼに対して優れた耐性を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】番号がＫａｂａｔのＥＵ抗体番号に基づくＩｇＧ４系変異型のヒンジ及びＦｃドメインのアミノ酸配列の整列。図示される配列は、コアヒンジ（残基２２７）で始まり、ＦｃドメインのＣ末端（残基４４７）で終了して、Ｔｈｒの代わりに３５９位にＡｓｎ（Ｎ）を有し、Ａｓｎの代わりに３６１位にＴｈｒ（Ｔ）を有することによって、ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３が、それぞれＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６とは異なり、結果としてグリコシル化モチーフの形成をもたらし、Ａｓｎ３５９位においてグリコシル化されるタンパク質を生じることを示す。変異型ＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４は、Ａｓｎで置換された２９９位にＴｈｒを有し、それによってＡｓｎ２９７位におけるモチーフ及びグリコシル化を除去することによって、ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３とは異なる。ＮＥＭ ３０５２配列は、４１９位及び４２１位のアミノ酸を変更することによって、４１９位においてグリコシル化モチーフ及びグリコシル化をもたらす。グリコシル化モチーフ位置の形成について図示される別の部位は、図面において（「可能な変異型）として示される３８２と３８４との間である。点は、アミノ酸が野生型配列において見られるものと同一であることを示す。
【図２】両方の重鎖上で強調される新しいグリコシル化部位のＦｃ断片残基３５９の構造。
【図３】ＣＮＴＯ ５３０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（非還元）を通して分割されるその変異型。
【図４】２つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異型が、ヒトＦｃＲｎに結合するために、いかに良好にビオチニル化ｍＡｂと競合するかについてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ系分析。
【図５Ａ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｂ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｃ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｄ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｅ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｆ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図６】図１において見られるようなＩｇＧ１系変異型のヒンジ及びＦｃドメインのアミノ酸配列。
【図７】両方の分子を注入されたマウスの血液中のＣＮＴＯ ５３０とＣＮＴＯ ５３０３の血清持続性を表すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
略語
ＡＡ＝アントラニル酸、α１，３ＧＴ＝α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＡＲＤ＝急性呼吸困難、β１，４ＧＴ＝β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α２，３ＳＴ＝α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞毒性、ＣＤＣ＝補体依存性細胞毒性、ＣＭＰ−Ｓｉａ＝シチジンリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＦＢＳ＝ウシ胎児血清、ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ＝マトリックス支援レーザー／脱着イオン化時間のフライト質量分析、ＮＡＮＡ＝シアル酸のＮ−アセチルノイラミン酸異性体、ＮＧＮＡ＝シアル酸のＮ−グリコノイラミン酸異性体、ＯＡ＝変形性関節症、ＰＮＧａｓｅ Ｆ＝ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ、ＨＰＬＣ＝逆相高性能液体クロマトグラフィー、ＲＡ＝関節リウマチ、ＳＡ＝シナピン酸、Ｓｉａ＝シアル酸、ＳＤＨＢ＝塩化ナトリウムを含有するジヒドロキシ安息香酸、ＵＤＰ−Ｇａｌ＝ウリジン二リン酸ガラクトース、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ＝ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００１１】
定義＆用語の説明
本明細書で使用するとき、「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」又は「Ｆｃ含有分子」という用語は、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する単量体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タンパク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。
【００１２】
用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異型を含むことを意図し、これには抗体模倣薬が非限定的に挙げられ、又は抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小体、及びその断片が非限定的に挙げられる。機能的断片は、関心対象の標的抗原に結合する、抗原結合断片を含む。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、及びＦ（ａｂ’）2（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げられるが、これらに限定されない、標的抗原又はその一部に結合できる抗体断片が、用語「抗体」に含まれる（例えば、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと）。
【００１３】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、動物抗体の少なくとも１つの種の重鎖又は軽鎖抗体可変ドメインのうちの少なくとも１つに対して実質的に相同性を保持する少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含む、Ｆｃ含有融合タンパク質の特定の形態である。
【００１４】
概論
本発明は、ＰＥＧ化のためのＦｃドメイン上の新しい部位を識別することにおける関心により促進された。修飾のための特定標的部位を提供する、ＰＥＧ部分のタンパク質のグリカンへの接合のための技術が知られていることから、Ａｓｎ２９７位での天然グリカンの使用が試みられたが、Ｆｃ二量体構造の三級及び四級構造に起因して、天然Ｆｃグリカンは、大きいＰＥＧ構造の接合を可能にするために十分にはアクセス可能でないことが示された。
【００１５】
したがって、Ｆｃドメイン上の位置は、代替的又付加的なＮ−結合グリコシル化部位が、真核細胞の小胞体におけるグリコシルトランスフェラーゼの認識部位として知られる、モチーフ配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにおける工学によって導入されることができると考えられた。２つの異なるＦｃ含有構造物、ＣＮＴＯ ５３０（ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物）及びＣＮＴＯ ７３６（ＧＬＰ−１ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物）のそのようなグリカン変異型を作製する際に、非ＰＥＧ化グリカン変異型が、タンパク質分解酵素に対して著しく高い耐性を予想外に示したことが観察された。
【００１６】
体は、タンパク質の消化及びリモデリングのためのプロテアーゼを自然に生成し、治療的タンパク質もこの影響を受ける。ＲＡ及び他の炎症性疾患等の非病原体駆動疾患状態、並びに癌におけるある範囲のタンパク質分解酵素が上昇することがよく知られている。また、ヒトプロテアーゼは、炎症性、増殖性、転位性、及び感染性疾患に関連することもよく知られている。循環する免疫グロブリン、及び特にＩｇＧクラスのそれらの抗体は、主要な血清タンパク質である。ヒトプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、及び好中球エラスターゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）又は連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素等の細菌プロテアーゼに類似する、各プロテアーゼに固有の残基におけるＩｇＧ重鎖ポリペプチドを開裂することが知られている。重鎖における開裂部位は、２つの重鎖の鎖間ジスルフィド結合が起こる、ヒンジドメインと呼ばれる領域の周りに集約される。ヒンジの下の領域は、Ｆｃ領域を構成し、ＩｇＧのエフェクター機能に関与する結合部位を含む。微生物の場合、プロテアーゼ発現は潜在的な補助毒性経路であり、ヒンジの下の開裂によるＦｃドメインのタンパク質分解放出が、そうでなければその病的細胞の標的及び致死に至らしめる作用を効果的に中和する限りにおいて、有機体がオプソニン化を回避するのを可能にする（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７：４７６〜４８４，２００５）。したがって、特定プロテアーゼの綿密さは、癌、炎症、及び感染性疾患を含む、無数の疾患状態の代表であり得る。ＩｇＧ分解が病理学的インビボ環境において強化されることは、開裂したヒンジドメインに結合する、天然ＩｇＧ自己抗体の存在によって更に明らかにされる（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９５，Ｎａｓｕら、１９８０，Ｐｅｒｓｓｅｌｉｎ及びＳｔｅｖｅｎｓ、１９８５，Ｔｅｒｎｅｓｓら、１９９５ Ｊ Ｉｍｕｎｏｌ．１５４：６４４６〜６４５２）。したがって、生理学的に関連するプロテアーゼに対する高い耐性は、特にプロテアーゼに富む環境における治療的Ｆｃ含有分子の長期のインビボ半減期をもたらすことができ、有効性を強化し、及び／又は投与回数の減少を可能にすることができる。
【００１７】
同一出願人が所有する特許出願第ＷＯ２００９／０２３４５７号は、癌、炎症、及び感染等の疾患又は病的状態に関連する、ＩｇＧを分解することができるプロテアーゼを開示する。情報は、表１（以下に再現される）に要約され、「凝固プロテイナーゼ」は、Ｆ．ＸＩＩａ、ＦＩＸａ、Ｆ．Ｘａ、トロンビン、及び活性タンパク質Ｃを含み、プラスミンは、プラスミノゲン活性剤であるｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、及びスタフィロキナーゼと共インキュベートされたプラスミノゲンであり、「プラスミノゲン活性剤単独」とは、プラスミノゲンを含まず、ＭＭＰは、活性形態又はプロ酵素のいずれかとして得られる組み換えプロテイナーゼであり、「無し」は、２４時間以内に検出可能な開裂がないことを示す。指示される場合を除き、すべての酵素はヒトであった。残基の指定は、完全な成熟ＩｇＧ１抗体重鎖のＥＵ番号付けシステム用である。
【００１８】
【表１−１】
【００１９】
【表１−２】
（１）Ｂａｒｒｅｔｔ Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．及びＷｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（２）Ｂａｒｒｅｔｔ Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．及びＷｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（３）Ｐｏｗｅｒｓ，ＪＣ．、「Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」１９８２．Ｉｎ：Ｆｅｅｎｅｙ及びＷｈｉｔａｋｅｒ（編）、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ １９８．ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８２ ｐｐ ３４７〜３６７。
（４）Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖｌ．、Ｒｏｎｄａｙ Ｈ．Ｋ．、ｖａｎ ＥｌＢ．、Ｋｉｅｒｓ Ｇ．Ｈ．、Ｖｅｒｚｉｊｌ Ｎ．、ＴｅＫｏｐｐｅｌｅ Ｊ．Ｍ．、Ｈｕｉｚｉｎｇａ Ｔ．Ｗ．Ｊ．、ＤｅＧｒｏｏｔ Ｊ．及びＨａｎｎｅｒｍａａｉｊｅｒ Ｒ．、２００４．ＭＭＰ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｉｒｅｄ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ：Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３，８８１〜８８３。
（５）Ｖｉｎｃｅｎｔｓ Ｂ．、ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ Ｕ．、Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ．及びＡｂｒａｈａｍｓｏｎ Ｍ．、２００４．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＩｄｅＳ，ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｓｔｒｉｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＩｇＧ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｅｘｏｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１５５４０〜１５５４９。
（６）Ｓｕｎ Ｈ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｕ．、Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ Ｊ．Ｗ．、Ｆａｙ Ｗ．Ｐ．、Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ Ｎ．Ｃ．、Ｙａｎｇ Ａ．Ｙ．、Ｒｏｚｅｋ Ｌ．Ｓ．、Ｗａｎｇ Ｘ．、Ｓｊｏｂｒｉｎｇ Ｕ．、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ Ｄ．、２００４．Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｈｏｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０５，１２８３〜１２８６。
【００２０】
オリゴ糖機能
細胞からの輸送のための信号配列によって指定されたタンパク質の通常処理として、真核細胞の小胞体内で起こるグリコシル化の結果として、分泌されたタンパク質上に特定のオリゴ糖が存在する。タンパク質に付着したオリゴ糖組成物は、タンパク質の性質、細胞の起源の種、培養状態、及び細胞外環境等の因子によって影響を受ける。種による、又は更には個人による「グライコーム」の性質は、抗原エピトープ、例えば、ヒト血液基の源として長く認識されている。したがって、タンパク質表面グリコシル化は、特定のグリカン構造又は末端サッカリドの特異的又は非特異的受容体を標的することによって、タンパク質の認識を変更する方法を表す。哺乳類受容体のオリゴ糖又はリガンドは、セレクチン等のレクチン、例えば、マンノース結合タンパク質、Ｌ−セレクチン、及びＰ−セレクチンに類似する。
【００２１】
哺乳類ＩｇＧ分子内のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に正常に付着したグリカンは、ＣＨ２ドメインの周囲のヒンジ領域における２つのＣＨ３ドメインの非共有結合性会合によって共有結合されたＦｃ、２つのポリペプチド鎖の三級構造を提供するように作用する。グリコシル化ＩｇＧは、Ｆｃ受容体を結合しないか、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣのエフェクター機能を呈しないか、又は補体Ｃ１ｑを結合しない。最近の研究（Ｋａｎｅｋｏ、２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０〜６７３、Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３０ ２６７３３〜２６７４０）は、Ａｓｎ２９７連結グリカン含有物もまた、ＩｇＧ分子のＦｃ（γ）受容体への結合の親和性にも影響を及ぼし得ることを示している。
【００２２】
ＩＶＩＧとして知られるヒトγグロブリンの調製は、一般的な抗炎症治療として長く使用されてきた。高投与量のヒトＩＶＩＧを用いる治療が関節炎を抑制する、マウス血清誘導性関節炎モデルにおける最近の研究は、先のＩＶＩＧの酵素脱シアリル化が、その治療効果を無効にするが、ＩＶＩＧのシアリル化分留は、その抗炎症効果を強化することを示した（Ｋａｎｅｋｏ、２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０〜６７３）。
【００２３】
抗炎症特性は、ＩＶＩＧのＦｃ部分によって決定されることは長く知られていた。後次の研究は、マウス関節炎モデルにおける関節炎症を抑制することに主に関与するＩＶＩＧ分子の断片が、α２，３連結においてシアル酸を有するものに対向して、ガラクトースを有するα２，６連結においてＦｃシアル酸を有するものである（Ａｎｔｈｏｎｙら、（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７３）ことを示した。脾臓マクロファージの表面上に発現するマウスレクチンＳＩＧＮ−Ｒ１は、ヒトレクチンと同様に、α２，５シアリル化Ｆｃ断片の受容体であり、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ヒト樹状細胞上で発現する（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｄｅｃ １６；１０５（５０）：１９５７１〜８）。
【００２４】
したがって、本発明のタンパク質組成物を使用して、特定のオリゴ糖構造、末端、又は含有物を有するタンパク質組成物は、宿主細胞の操作及び糖工学を介して合成することができるか、又はプレ若しくはポストタンパク質精製処理、例えば、レクチン親和性クロマトグラフィー若しくは酵素処理又は幾つかの方法の組み合わせを使用する断片によって調製することができる。そのような方法は、本明細書に教示されるように、当業者に周知であるか、又は遺伝子工学、酵素学、タンパク質断片等において周知の方法を使用して開発されているか、若しくは開発することができる。これらの調製を使用して、それらが選択した細胞型、組織、又は器官上で起こる時に、特定の受容体を標的とすることができる。
【００２５】
タンパク質のグリコシル化又はハイパーグリコシル化は、タンパク質の水和量を増加させ、シアル酸残基の存在に起因して、負電荷を付加することができる。これらの変更によって、タンパク質が受ける腎臓濾過によるクリアランスの影響が減少する。したがって、Ｆｃ断片が循環血液中のタンパク質半減期を強化する手段としてのＦｃＲｎ結合に加えて、タンパク質の周辺の増加は、付加されたグリコシル化がＦｃＲｎ結合を減少させないことを前提として、付加的効果をもたらす。
【００２６】
変更Ｆｃ含有分子を作製する方法
付加的なグリコシル化の部位は、Ｆｃ構造又は機能に影響することなく、Ａｓｎ連結グリカンを付加するという要望に基づいて選択された。ＩｇＧ４ Ｆｃ構造（１ａｄｑ）（Ｃｏｒｐｅｒら（１９９７）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．４：３７４）を分析して、修飾の潜在的部位を分析した。下部ヒンジにおいてＦｃ（γ）Ｒ結合部位から遠位にあり、及びＣＨ２−ＣＨ３接合領域においてＦｃＲｎ結合部位から遠位にある、ＣＨ３ドメインのループ領域が標的とされた。３５９−ＴＫＮＱＶＳ−３６４、３８２−ＥＳＮＧＱＰ−３８７、及び４１９−ＥＧＮＶＦＳ−４２４ループは、修飾の影響を受けやすいと思われる残基を含有する。これらのループ内で、残基３５９、３８２、及び４１９は、曝露される表面に基づいて、及び得られるグリコシル化によるＡｓｎ置換は、構造的に適合性があるという予測に基づいて、グリコシル化を導入するために魅力的な部位として同定された。次に、多数のＮ−グリコシル化配列モチーフ（ＮＸＳ／Ｔ）が、これらの位置にコンピュータ的に作られ、及び配列をＮｅｔＮＧｌｙｃサーバ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ）に提出することによってグリコシル化に対するそれらの可能性を推定した。スコアが０．５以下のモチーフは末梢された。試験分子への導入のために選択されたモチーフは、３５９ＮＫＴ及び４１９ＮＧＴであった（図１）。３８２部位は、新しいグリカンがＦｃＲｎ結合を干渉する方向を指し得ることを考慮して、遂行されなかった。しかしながら、残基３８２におけるグリコシル化部位の導入は、完全に機能的なＦｃドメインを産出することが可能である。
【００２７】
Ｆｃ含有タンパク質の酵素修飾
特定のグリカン構造又は特定のオリゴ糖含有量を有するＦｃ含有タンパク質を調製するための一方法は、Ｆｃ含有タンパク質調製物をサッカラーゼ、例えば、フコシダーゼ又はシアリダーゼ酵素で処理することにより、それによって、特定の糖残基、例えば、フコース又はシアル酸を除去する。糖をＦｃ領域に付加することは、インビトログリコシル化方法を使用して達成することもできる。
【００２８】
グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を合成するように自然に機能する。それらは、優れた立体化学及び位置化学形状を有する特定の生成物を生成する。グリコシル残基の移動は、オリゴ糖又は多糖類の伸長又は合成をもたらす。シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ等を含む、多数のグリコシルトランスフェラーゼ型が説明されている。
【００２９】
本発明において有用なグリコシルトランスフェラーゼには、例えば、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−フコシル−トランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、α−キシロシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼ、β−シアリルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−フコシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ナイセリア髄膜炎菌又は他の細菌源に由来するもの、及びラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒト、ならびに昆虫及びウイルス源に由来するものが挙げられる。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインが削除されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の切断変異型である。
【００３０】
典型的なガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）及びＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：２２９〜２３３（１９９０））及びα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．３８）を含む。他のグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、シアリルトランスフェラーゼを使用することができる。
【００３１】
シアリルトランスフェラーゼと呼ばれる場合が多い、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアリルラクトース又は高次構造の生成において使用することができる。この酵素は、シアル酸（ＮｅｕＡｃ）をＣＭＰ−シアル酸からＧａｌ残基に移動させ、２つの糖の間にα連結の形成を伴う。糖の間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌから３Ｇｌｃ二糖又はグリコシドに移動させる。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５（１９８２）、及びＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。別の例示的なα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖又はグリコシドの非還元末端Ｇａｌに移動させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４（１９７４）及びＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。更に例示的な酵素は、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１（１９９４）を参照）を含む。
【００３２】
本発明のオリゴ糖を調製する時に特に有用な他のグリコシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、及びＰｍｔ１を含むマンノシルトランスフェラーゼである。
【００３３】
更に他のグルコシルトランスフェラーゼには、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが挙げられ、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２）及びＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））、及びポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））が挙げられる。好適なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼには、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、及びＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））が挙げられる。
【００３４】
この方法が商業規模で実践されるそれらの実施形態の場合、グリコシルトランスフェラーゼを支持体上に不動化することが有利であり得る。この不動化は、生成物のバッチからの酵素の除去を促進し、後次の酵素の再利用を促進する。グリコシルトランスフェラーゼの不動化は、例えば、トランスフェラーゼからその膜結合ドメインを除去し、その場所にセルロース結合ドメインを付着させることによって達成することができる。当業者は、不動化の他の方法を使用することもでき、それらの方法は、入手可能な文献に記載されていることを理解するであろう。
【００３５】
受容体基質は、本質的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼが特異性を呈する末端糖残基を有するあらゆる単糖類又はオリゴ糖であり得ることから、基質は、その非還元末端の位置で置換されてもよい。したがって、グリコシド受容体は、単糖類、オリゴ糖、蛍光標識糖、又は糖誘導体、例えば、アミノグリコシド抗生物質、ガングリオシド、又は抗体及び他のＦｃ含有タンパク質を含む糖タンパク質であってもよい。好ましい実施形態の一群において、グリコシド受容体は、オリゴ糖であり、好ましくは、Ｇａｌβ（１〜３）ＧｌｃＮａｃ、Ｇａｌβ（１〜４）ＧｌｃＮａｃ、Ｇａｌβ（１〜３）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ（１〜４）ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ α（１，３）Ｍａｎ、Ｍａｎ α（１，６）Ｍａｎ、又はＧａｌＮＡｃβ（１〜４）マンノースである。特定の好ましい実施形態において、オリゴ糖受容体は、Ｆｃ含有タンパク質のＣＨ２ドメインに付着される。
【００３６】
活性化糖基質、すなわち、糖−ヌクレオシドリン酸塩の使用は、グリコトランスフェラーゼ反応（再利用システムとしても知られる）と同時に、再生反応を使用することによって回避することができる。例えば、米国特許第６，０３０，８１５号において教示されるように、ＣＭＰ−シアル酸再利用システムは、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在下で、シアリルトランスフェラーゼ受容体と反応して、シアリル糖を形成すると、ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを利用して、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を補充する。本発明に有用なＣＭＰ−シアル酸再生システムは、シチジン一リン酸塩（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸塩（例えば、アデノシン三リン酸塩（ＡＴＰ））、リン酸塩ドナー（例えば、ホスホエノールピルビン酸塩又はアセチルリン酸塩）、リン酸塩ドナーからリン酸塩をヌクレオシド二リン酸塩に移行することができるキナーゼ（例えば、ピルビン酸キナーゼ又は酢酸キナーゼ）、及びヌクレオシド三リン酸塩からＣＭＰに末端リン酸塩を移行させることができるヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えば、ミオキナーゼ）を含む。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−シアリル酸シンセターゼは、活性化シアリル酸の除去が順速度の合成を維持するように機能するため、ＣＭＰ−シアル酸再生システムの一部として見ることもできる。修飾されたＣＭＰ−シアリル酸シンセターゼ酵素の遺伝子を含むファージミドを使用する、シアリル化手順におけるシアリル酸化合物の合成及び使用は、１９９２年１０月１日に発行された国際出願第ＷＯ ９２／１６６４０号に開示される。
【００３７】
オリゴ糖を調整する代替方法は、グリコシルトランスフェラーゼ及び活性化グリコシル誘導体をドナー糖として使用することにより、米国特許第５，９５２，２０３号において教示されるように、ドナー糖としての糖ヌクレオチドの必要性を回避する。活性化グリコシル誘導体は、高価な糖ヌクレオチド、通常、ヌクレオチド二リン酸糖又はヌクレオチド一リン酸糖である、自然発生する基質に対する代替として作用し、ヌクレオチドリン酸塩は、糖の１位にα結合する。
【００３８】
有用な活性化グリコシド誘導体には、活性化脱離基、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステル等が挙げられる。活性化グリコシド誘導体の好ましい実施形態には、グリコシルフッ化物及びグリコシルメシル酸塩が挙げられ、及びグリコシルフッ化物が特に好ましい。グリコシルフッ化物の中で、α−ガラクトシルフッ化物、α−マンノシルフッ化物、α−グルコシルフッ化物、α−フコシルフッ化物、α−キシロシルフッ化物、α−シアリルフッ化物、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物、β−ガラクトシルフッ化物、β−マンノシルフッ化物、β−グルコシルフッ化物、β−フコシルフッ化物、β−キシロシルフッ化物、β−シアリルフッ化物、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物が最も好ましい。
【００３９】
グリコシルフッ化物は、最初に糖をアセチル化した後、それをＨＦ−ピリジンで処理することによって、遊離糖から調製することができる。アセチル化グリコシルフッ化物は、メタノール（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）中の軽度の（触媒）塩基との反応によって脱保護されてもよい。更に、多くのグリコシルフッ化物は、商業的に入手可能である。他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に知られている従来の方法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシレートは、糖の完全にベンジル化したヘミアセタール形態を塩化メシルで処理した後、触媒水素化によってベンジル基を除去して調製することができる。
【００４０】
反応の更なる構成成分は、触媒量のヌクレオシドリン酸塩又はその類似体である。本発明において使用するために適したヌクレオシド一リン酸塩には、例えば、アデノシン一リン酸塩（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸塩（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸塩（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸塩（ＧＭＰ）、イノシン一リン酸塩（ＩＭＰ）、及びチミジン一リン酸塩（ＴＭＰ）が挙げられる。本発明に従って使用するために適したヌクレオシド三リン酸塩には、アデノシン三リン酸塩（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸塩（ＣＴＰ）、ウルジン三リン酸塩（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸塩（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸塩（ＩＴＰ）、及びチミジン三リン酸塩（ＴＴＰ）が挙げられる。好適なヌクレオシド三リン酸塩は、ＵＴＰである。好ましくは、ヌクレオシドリン酸塩は、ヌクレオシド二リン酸塩、例えば、アデノシン二リン酸塩（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸塩（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸塩（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸塩（ＧＤＰ）、イノシン二リン酸塩（ＩＤＰ）、及びチミジン二リン酸塩（ＴＤＰ）である。好適なヌクレオシド二リン酸塩は、ＵＤＰである。上記のとおり、本発明はまた、ヌクレオシドリン酸塩の類似体を用いて実践することもできる。適した類似体は、例えば、ヌクレオシド硫酸塩及びスルホン酸塩を含む。更に他の類似体は、単純リン酸塩、例えば、ピロリン酸塩を含む。
【００４１】
例えば、シアル酸のヒドロキシル化形態が優位である（ＮＧＮＡ）マウス細胞において生成された組み換えタンパク質を修飾するための一手順は、タンパク質をシアリダーゼで処理すること、ＮＧＮＡ型シアル酸を除去することに続いて、試薬ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ１，４ガルトランスフェラーゼを使用する酵素ガラクトシル化により高均質Ｇ２糖型を生成することである。次に、調整は、所望により試薬ＣＭＰ−ＮＡＮＡ及びα−２，３シアリルトランスフェラーゼで処理して、高均質Ｇ２Ｓ２糖型を得ることができる。
【００４２】
本発明の目的で、糖型の実質的に均質とは、その糖型の約８５％以上、好ましくは約９５％以上を意味する。
【００４３】
抗体のプロテアーゼ及びプロテアーゼ感受性
ペプシンは、食後に胃の内腔に分泌される胃液の通常構成成分であるため、自己活性化され、及び低ｐＨで活性である。低レベルの前駆体酵素ペプシノゲンは、血清中で認めることができるが、活性化及び活性は酸依存であるため、循環する抗体に生理学的に関連しない。ペプシンは、下部ヒンジにおいてロイシン234とロイシン235の間のヒトＩｇＧ１を開裂する。この開裂部位は、抗原結合に対して二価である、Ｆ（ａｂ’）2分子を形成するジスルフィド結合を介して、２つの重鎖を連結する、２つのシステイン残基を含有するヒンジコア（−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−）から下流にある。
【００４４】
ＣＨ２領域の下部ヒンジ及び開始部、Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｆ／Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ（配列番号１及び２の残基５〜１６）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２の開裂部位を含む。ペプシン及びＭＭＰ−７はまた、この領域（Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ*Ｌ−Ｇ）においても開裂する。更に、生理学的に関連する酵素群、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）は、幾つかの位置でＩｇＧを開裂し、わずかに異なるＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、及びＦｃ断片を生成する（表１を参照）。
【００４５】
糖型変異型の生物学的特性化
Ｆｃ含有タンパク質は、幾つかのよく知られているインビトロアッセイによって、機能性について比較することができる。特に、Ｆｃｖ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩ群のメンバーに対する親和性が関心対象である。これらの測定値は、受容体の組み換え可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して形成することができる。更に、ＦｃＲｎに対する親和性、ＩｇＧの延長された循環半減期に応答可能な受容体は、組み換え可溶型ＦｃＲｎを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定することができる。ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ等の細胞ベースの機能性アッセイは、特定の変異型構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。一実施形態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要なエフェクター細胞であるＮＫ細胞を有するように構成され、それによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体上で機能的効果を反映させる。過酸化又は炎症媒介放出等の細胞応答を測定できるように、食作用アッセイを使用して、異なる変異型の免疫エフェクター機能を比較することもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ３抗体の変異型を使用して、マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することができ、活性は、Ｆｃγ受容体等の特定リガンドを係合するＦｃドメインに依存する。
【００４６】
タンパク質生成プロセス
Ｆｃ含有タンパク質の生成に関与する異なるプロセスは、Ｆｃオリゴ糖構造に影響を及ぼし得る。一例では、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する宿主細胞は、以前には、高い熱処理（例えば、５６℃で３０分間）に供されていなかった血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養される。これは、それらの細胞から分泌されたＦｃ含有タンパク質からシアル酸を除去することができる、活性シアリダーゼ酵素の血清中に自然に存在することに起因して、シアル酸を含有しないか、又は極めて少量を含有するＦｃ含有タンパク質をもたらし得る。別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する細胞は、上昇した熱処理に供され、それによってシアリダーゼ酵素を不活性化する血清の存在下、又はシアリダーゼ酵素を含有し得る血清若しくは他の媒質構成成分の非存在下のいずれかで培養され、Ｆｃ含有タンパク質が、より高いか又は低いレベルのグリコシル化若しくはグリコシル化変異型を有するようにする。
【００４７】
別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質を精製し、更に処理するために使用される状態が確立され、最適なグリカン含有物を優先する。一実施形態において、状態は最大又は最小オリゴ糖含有物を生成するか、又は優勢な糖型において発現したＦｃ含有ポリペプチドの形質転換を引き起こす。例えば、シアル酸は酸に不安定な、低ｐＨ環境に長期間曝露されることから、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムからの溶出又はウイルス不活性化努力に続いて、シアル酸含有物の還元につながり得る。別の実施形態において、グリコシル化材料は、特定の糖又はオリゴ糖複合体を表示するタンパク質の経路を選択的に結合又は遅延させる、レクチン固定された支持体材料を使用するクロマトグラフィーに供される。不動化レクチンカラムの場合、非結合フロースルー（Ｔ、スルー）又はカラム非結合断片は、結合断片（Ｂ、結合）から分離することができ、後者は、溶出緩衝液をカラムに通しながら収集される。例えば、カラムをオリジナル試料緩衝液で連続洗浄する間に溶出するＦｃ含有タンパク質を収集することによって、結合の弱い断片又はカラム遅延断片（Ｒ、遅延）を個別に収集することも可能であり得る。シアリル化又はアシアリル化Ｆｃ含有タンパク質に対して強化し得るレクチンの例は、オリゴ糖を末端シアル酸と特異的に結合する、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）からのレクチン、及びオリゴ糖を末端シアル酸又は末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のいずれかと特異的に結合する、レクチン小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ）である。別の実施例は、オリゴ糖を末端ガラクトースと結合する、レクチンリシンＩ（ＲＣＡ）である。後者の実施例において、非結合フロースルー断片は、シアリル化Ｆｃ含有分子に対して強化されてもよい。当該技術分野において既知の他のレクチンは、Ｖｅｃｔｏｒラボ及びＥＹラボによって提供されるものを含む。
【００４８】
宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書に記載されるように、組み換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発現に対して選択される宿主細胞は、最終組成物に対する重要な寄与因子であり、免疫グロブリンＣＨ２ドメインにおいてタンパク質を修飾するオリゴ糖部分の組成物における変異を含むが、これに限定されない。したがって、本発明の一態様は、所望の治療的タンパク質を発現する生成細胞の使用及び／開発に適切な宿主細胞の選択を伴う。
【００４９】
抗体又はＦｃ融合のシアル酸含有物が消滅する一実施形態において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼが自然に不足しているか、又は欠いている細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼを欠くように遺伝子的に修飾される。更なる実施形態において、宿主細胞は、減少レベル又は検出不可能なレベルのシアリルトランスフェラーゼを発現するように選択される誘導体宿主細胞株である。更に別の実施形態において、宿主細胞は、シアル酸を抗体に移動させるように、シアリルトランスフェラーゼによって使用されるシアル酸の源である、ＣＭＰ−シアル酸の形成を触媒する酵素である、ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを自然に欠いているか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。関連実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸からシアル酸を形成する酵素である、ピルビン酸シンセターゼを自然に欠き得るか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。
【００５０】
付加的な実施形態において、宿主細胞は、当該細胞において発現した抗体がガラクトースを欠くように、ガラクトシルトランスフェラーゼを自然に欠き得るか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。ガラクトース無しに、シアル酸は付着されない。個別の実施形態において、宿主細胞は、生成中にシアル酸を抗体から除去するシアリダーゼ酵素を自然に過剰発現し得るか、又は過剰発現するように遺伝子的に修飾されてもよい。そのようなシアリダーゼ酵素は、抗体が培養媒質中に分泌されるか、又は分泌されることになる前に細胞内で抗体に作用し、また媒質中に既に分泌された抗体に作用し得、ガラクターゼを更に含有し得る。変更されたグリコシラーゼを有し、変更した炭水化物組成物を有する糖タンパク質を発現する細胞株を選択する方法は、説明されている（Ｒｉｐｋａ及びＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ １２：５１〜６２、米国特許出願第ＵＳ２００４／０１３２１４０号）。変更されたグリコシル化パターンを有する抗体を生成し、ＡＤＣＣの強化をもたらすように宿主細胞を設計する方法は、例えば、米国特許第６，６０２，８６４号において教示されており、宿主細胞は、少なくとも１つの糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ、特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を含む。
【００５１】
宿主細胞グリコシルトランスフェラーゼの操作を通して宿主細胞のグリコシル化特性を遺伝子的に設計する他のアプローチは、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号に教示されるように、特にα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８遺伝子生成物）の活性を排除又は抑制することを伴う。上記の特定の実施例以外で宿主細胞を設計する方法を実践することは、当業者に既知であろう。更に、設計された宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそのあらゆる誘導体不動化若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。
【００５２】
別の実施形態において、オリゴ糖付着に必要な酵素の活性を抑制又は排除する方法は、ｓｉＲＮＡの使用等による遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックアウト、又はその酵素活性を結合及び遮断する酵素に特異的な細胞内抗体若しくはペプチドの共発現等による酵素阻害剤の添加、及び他の既知の遺伝子工学技術からなる群から選択されてもよい。別の実施形態において、糖付着を遮断する酵素、又は既に付着している糖を除去する糖酵素の発現若しくは活性を強化する方法は、組み換え酵素遺伝子による形質転換、酵素ＲＮＡ合成を強化する転写因子の形質転換、及び酵素ＲＮＡの安定性を強化する遺伝子修飾からなる群から選択されてもよく、すべてがシアリダーゼ等の酵素活性の強化につながり、結果として精製された生成物中のシアル酸のレベルが低下する。別の実施形態において、特定の酵素阻害剤が、細胞培養媒質に添加されてもよい。あるいは、別の方法としては、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能である種又は有機体、例えば、原核細胞又は有機体、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐから選択されてもよい。
【００５３】
抗体
本出願に記載される抗体は、あらゆる哺乳類、例えば、非限定的にヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、ヤギ、若しくはそれらの組み合わせを含むか、又はそれらに由来することができ、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化及び／又はＣＤＲ移植された抗体、免疫グロブリン、開裂生成物、及び他の特定部分、ならびにそれらの変異型を含む。
【００５４】
本明細書に記載される抗体、Ｆｃ含有タンパク質、又はＦｃ断片は、当該技術分野において周知の幾つかの方法で派生し得る。一態様において、抗体は、マウス又は他の動物を標的ペプチド、細胞、又は組織抽出物で免疫付与することによって調製されたハイブリドーマから便宜的に得られる。したがって、抗体は、当該技術分野において周知であるハイブリドーマ技術のうちのいずれかを使用して得ることができ、例えば、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７〜２００１）を参照する。
【００５５】
抗体若しくはＦｃ融合タンパク質又はその成分及びドメインは、そのようなドメイン又は成分のライブラリ、例えば、ファージライブラリから選択することにより得られてもよい。ファージライブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ又は関心の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって、例えば、免疫付与した動物又はヒトのＢ細胞から形成することができる。（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブラリは、１つのファージに重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）可変領域対を含有し、単鎖Ｆｖ断片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリの多様性を操作して、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を増加及び／又は変更し、付加的な望ましいヒトモノクローナル抗体を生成した後、同定することができる。例えば、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン分子コード遺伝子をランダムに混合して（シャッフルして）、組み立てられた免疫グロブリン分子において、新しいＨＬ対を形成することができる。付加として、Ｈ及びＬ鎖コード遺伝子のいずれか、又は両方は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補的決定領域（ＣＤＲ）において突然変異を起こさせることができ、後次に望ましい親和性及び中和能力についてスクリーニングすることができる。抗体ライブラリは、１つ以上のヒトフレームワーク配列を選択し、ヒト抗体レパートリーに由来するＣＤＲカセットの集合を導入するか、又は設計された変異によって合成的に形成することもできる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置は、ＣＤＲに限定されないが、可変領域のフレームワークセグメントも含むことができるか、又はペプチド等の抗体変数領域以外を含んでもよい。
【００５６】
抗体変数領域以外を含み得る標的結合成分の他のライブラリは、リボソーム表示、酵母表示、及び細菌表示である。リボソーム表示は、タンパク質のＲＮＡへの付着を保持しながら、ｍＲＮＡをそれらの同種タンパク質に転換する方法である。核酸コード配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回復される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母表示は、膜関連αアグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１及びａｇａ２、噛合型システムの一部の、融合タンパク質の構成に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌表示は、細胞膜又は細胞壁に関連する排出された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。
【００５７】
ハイブリドーマ技術と比較して、ファージ及び他の抗体表示は、抗原に対する宿主作用又はその逆の可能性を制限することなく、抗原標的に対する選択をインビトロで操作する機会を付与する。
【００５８】
本発明は、組成物又はその定方向突然変異の真核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌、及び／又は表示と適合性のあるベクターを含む、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、本発明の組成物をコードする核酸も提供する。
【００５９】
Ｆｃ含有分子の使用
上述される方法のいずれかによって生成される組成物（抗体、Ｆｃ融合、Ｆｃ断片）を使用して、細胞、組織、器官、流体、又は一般的に宿主において、ヒト疾患又は特定病理を診断、治療、検出、又は調節してもよい。本明細書で教示されるように、抗体のＦｃ部分、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃ断片のグリコシル化を修飾して、治療の標的である流体、区画、組織、又は器官中に存在することが知られているプロテアーゼによるタンパク質分解消化に対する耐性を使用して、治療的分子を生成することができ、これらの分子は、それらの元の標的特性を維持してもよく、これらのプロテアーゼによる分解を起こす傾向が低下する。
【００６０】
その開裂活性が抵抗の対象となるプロテアーゼは、宿主、又は寄生生物、バクテリア、若しくはウイルスであり得る病原体から生じる、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態において、プロテアーゼは、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである。分子又はＦｃ分子のＦｃ部分のグリコシル化の変更に対する修飾（ＥＵ番号付けを使用する）は、ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化部位の除去（Ａｓｎ２９７の置換）、ＣＨ３ドメインにおいて３５９位のＡｓｎ及び３６１位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加、ＣＨ３ドメインにおいて３８２位のＡｓｎ及び３８４位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加、ならびにＣＨ３ドメインにおいて４１９位のＡｓｎ及び４２１位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加から選択することができる。グリコシル化部位をＣＨ３ドメインに付加することは、得られる分子の水和量を増加し、体内の持続性を高めると予想される。
【００６１】
本発明によって提供される組成物を使用する治療の影響を受けやすい疾患又は病理には、これらに限定されないが、癌又は増殖性疾患、炎症性又はリウマチ疾患、自己免疫疾患、神経障害、線維症、心臓血管疾患、皮膚病及び感染症、及び火傷又は傷害に起因する状態が挙げられる。
【００６２】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい癌又は増殖性疾患は、固体腫瘍、転移性腫瘍、液体腫瘍、及び両性腫瘍、例えば、リンパ腫、リンパ芽球性又は骨髄性白血病、（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ増殖性疾患、ホジキンス病、キャッスルマン病、悪性リンパ種、非ホジキンスリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腺癌、扁平上皮癌、肉腫、悪性黒色腫、特定の転移性黒色腫、及び血管腫から選択される。
【００６３】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい炎症又は免疫系媒介疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊柱炎、胃潰瘍、関節症及び関節鏡プラーク、変形性関節症、炎症性腸疾患、海洋性大腸炎、全身ループスエリテマトーシス、抗リン脂質症候群、ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎、ウェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎、アレルギー及びアトピー性疾患、ぜんそく及びアトピー性ぜんそく、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏症肺炎、臓器移植の拒絶反応、移植片対宿主疾患、及び全身性炎症反応症候群から選択される。
【００６４】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい他の疾患又は状態は、天疱瘡、強皮症、慢性閉塞性肺疾患、グラム陰性又はグラム陽性細菌の感染、インフルエンザ及びＨＩＶ等のウイルス感染、マラリア又はリーシュマニア症等の寄生虫による感染、ハンセン病、脳炎、カンジダ症、アミロイド症、アルツハイマー病、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、及び出血である。
【００６５】
本明細書において特異的に例示されるように、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおいてＮ−結合グリカンを付加することによって（３５９位のＡｓｎ残基及び３６１位のＴｈｒ残基を置換することによって（ＥＵ番号付け））、ペプチドＦｃ融合タンパク質である化合物が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−３）及びセリンエンドペプチダーゼ（ＮＥ）に対して感受性が低くなる一方、分子のＦｃＲｎ結合親和性及びＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を維持する。
【００６６】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、「特許請求の範囲」を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００６７】
実施例１．Ｆｃグリコシル化変異型の構成
米国特許第７，３９３，６６２号において、ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物（Ｆｃ融合）として記載されるＥＭＰ−１Ｆｃ融合（ＣＮＴＯ５３０）、及び国際特許第ＷＯ／０５０９７１７５号に記載されるＧＬＰ−１ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物（Ｆｃ融合）（ＣＮＴＯ７３６）に関して実験を行った。両方の構造物は、図１に示されるように、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含有する。
【００６８】
ＣＮＴＯ ５３０変異体
プラスミドコード化ＣＮＴＯ５３０、ｐ２６３０を出発物質として使用し、標準組み換えＰＣＲ及びクローニング方法を使用して、ＮＥＭ２６３１を調製した。Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換をＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物ＣＮＴＯ ５３０に導入するために、ＣＨ３コード化制限断片を、ＮＥＭ ２６３１ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔプラスミドｐ３０５１から単離し、プラスミドｐ２６３０コード化ＣＮＴＯ ５３０において対応する断片の代わりにクローン化した。得られるプラスミド、ｐ３２０１は、タンパク質ＣＮＴＯ ５３０ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔをコード化し、本明細書において、ＣＮＴＯ ５３０３と称される（図２及び表１を参照）。
【００６９】
同一のＴ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換を有するが、２９７位の天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ５３０変異型を調製するために、プラスミドｐ３２０１の適切な部分を、突然変異誘発オリゴヌクレオチドでＰＣＲ増幅させ、クローン化して、Ｔ２９９Ｎコドン置換を得た（すなわち、297ＮＳＴ299〜297ＮＳＮ299に変更）。得られるプラスミドは、タンパク質ＣＮＴＯ ５３０ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ／Ｔ２９９Ｎをコード化するｐ３５６５であり、本明細書においてＣＮＴＯ ５３０４と称される。
【００７０】
ＣＮＴＯ ７３６変異体
Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換をＣＮＴＯ ７３６に導入するために、ＣＨ３コード化制限断片を、ＮＥＭ ２６３１ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔプラスミドｐ３０５１から単離し、プラスミドｐ２５３８コード化ＣＮＴＯ ７３６において対応する断片の代わりにクローン化した。得られるプラスミドは、ＣＮＴＯ ７３６ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔをコード化するｐ３３４９であり、本明細書においてＣＮＴＯ ７３６３と称される（表１）。
【００７１】
同一のＴ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換を有するが、２９７位の天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ７３６変異型を調製するために、プラスミドｐ３３４９の適切な部分をＰＣＲ増幅させ、クローン化して、Ｔ２９９Ｎコドン置換を得た。得られるプラスミドは、タンパク質ＣＮＴＯ ７３６ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ／Ｔ２９９Ｎをコード化するｐ３５７７であり、本明細書においてＣＮＴＯ ７３６４と称される。
【００７２】
【表２】
* 形質転換した細胞から観察された生成レベル
【００７３】
発現及び精製ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｃ１０１３Ａ）は、ＣＮＴＯ ５３０３をコードするｐ３２０１プラスミドで安定して形質転換され、結果として、ＣＮＴＯ ５３０３生成細胞株Ｃ１５１４Ａの単離をもたらす。マウスＮＳ０細胞は、ＣＮＴＯ ５３０４、ＣＮＴＯ ７３６３、及びＣＮＴＯ ７３６４をコードする上記プラスミドで安定して形質転換され、結果として、それぞれ形質転換された細胞株Ｃ１６７０Ａ、Ｃ１５２８Ａ、及びＣ１６７１Ａの単離をもたらす（表１）。４つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異型のすべては、標準タンパク質Ａクロマトグラフィーによって形質転換された細胞上清から精製された。タンパク質Ａ及びＦｃＲｎは、いずれもＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３接合において結合するため、タンパク質Ａカラムを使用する良好な精製は、新しいグリコシル化部位がＦｃＲｎへの結合に影響を及ぼし得ないことを示唆した（以下を参照）。
【００７４】
実施例２．Ｆｃグリコシル化変異体の特性化
一連の分析的な生物物理学的な生物活性試験は、実施例１の発現構造物に関して行った。
【００７５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行って、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異体のグリカン構造を特性化し、新しい部位において重鎖がグリコシル化した割合を確立した。
【００７６】
正常なＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、ＣＮＴＯ ５３０３、ＣＮＴＯ ５３０４、ＣＮＴＯ ７３６３、及びＣＮＴＯ ７３６４試料が、新しい部位において７５〜９５％がグリカンで占められることを示した。これらの試料のグリカン分析は、それらがＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物グリカンよりも不均質であり、バイ、トリ、及びテトラ触覚構造を含有する３５９位にグリカンを伴うことを示した。ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３における２９７位の天然Ｆｃグリカンは、それぞれＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６における天然Ｆｃグリカンと同一の構造であり、オリジナルのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物においてガラクトシル化がいくらか優れているという差異が観察されたに過ぎない（例えば、ＣＮＴＯ ５３０の場合約５０％、ＣＮＴＯ ５３０３の場合約７０％）。
【００７７】
寸法及び移動度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。
精製したＣＮＴＯ ５３０、ＣＮＴＯ ５３０３、及びＣＮＴＯ ５３０４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、非還元条件下、１．０ｍｍ厚のＢｉｓＴｒｉｓ ４〜１２％勾配ゲルに１μｇ／レーンを負荷し、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液中の分留を２００Ｖで５０分間実行することによって分析された。ゲルは、クマシーＧ２５０（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、得られた画像は、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ ２２００撮像システム（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して捕捉した（図４）。
【００７８】
ＳＤＳゲル中で観察された移行は予想と一致し、すなわち、合計４つのＮ−グリコシル化部位を有するＣＮＴＯ ５３０３は、更にゆっくり移行し、明らかな分子量は、２つのＮ−グリコシル化部位を有するＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ５３０４よりも３〜４ｋＤａだけ増加した。同一数のグリコシル化部位を有するにもかかわらず、ＣＮＴＯ ５３０４は、ＣＮＴＯ ５３０よりもゆっくり移行するように見える。これは、ＣＮＴＯ ５３０上の自然なグリコシル化に対して、優れたレベルのガラクトシル化及びシアリル化を有するＣＮＴＯ ５３０４上の新しいグリコシル化部位、ならびにより多くのトリ触覚及びテトラ触覚構造に起因する。分子量の推定値は、ＣＮＴＯ ５３０、ＣＮＴＯ ５３０３、及びＣＮＴＯ ５３０４について、それぞれ５７．５、６１．５、及び５９．５ｋＤａである。
【００７９】
ＦｃＲｎ結合分析によって評価された生物活性
新しいグリコシル化を導入する場所の選択における１つの要因は、ＦｃＲｎ結合領域を回避するという要請であり、ＣＮＴＯ ５３０３によるＦｃＲｎへの結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを使用してＣＮＴＯ ５３０と比較した。２つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料は、パッケージの指示書のとおり、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析ユニット（１０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して、ｐＨ ６．０アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．０２５％ ＢＳＡ、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ６．０）中、４℃で一晩透析した。抗体濃度は、ＯＤ280によって決定した。次に、９６ウェル、半領域、平底、非結合、白色ポリスチレンアッセイプレートにおいて室温で１時間混合しながら以下の成分を共インキュベートした：ビオチニル化ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ（ＣＮＴＯ ６２３４、最終濃度４μｇ／ｍＬ）、連続希釈した試験試料、ポリヒスチジンタグ付けされたヒトＦｃＲｎ（最終濃度８μｇ／ｍＬ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎニッケルキレート受容体ビーズ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）、及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ（最終希釈１：２５０）。すべての材料は、上述されるように、アッセイ緩衝液を使用して希釈した。インキュベーション後、プレートは、ＡｌｐｈａＡｃｒｅｅｎプロトコルを使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ器具上で読み取った。結果（図５）は、ＣＮＴＯ ５３０３が、類似する親和性（ＫD ＣＮＴＯ ５３０よりもわずか２倍弱い）を有するＦｃＲｎと結合したことを示し、ＦｃＲｎ結合がＣＮＴＯ ５３０３において保存されたことを示す。
【００８０】
プロテアーゼ感受性評価
次に、精製したＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）分子は、２つのヒトプロテアーゼ、組み換えマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）及び好中球エラスターゼ（ＮＥ）に対するそれらの相対感受性について評価した。下部ヒンジにおける228ＳＣＰＡＰ配列後に開裂すると考えられるＭＭＰ−３は、ポリＨｉｓタグ付プロＭＭＰ−３としてＨＥＫ細胞内の一時発現、Ｔａｌｏｎ親和性カラムによる精製、及びアリコート中の凍結によって、Ｃｅｎｔｏｃｏｒにおいて調製された。通常、220ＣＤＫＴ上部ヒンジ配列後に主に開裂するが、下部ヒンジにおける二次部位で開裂することもできる（以下参照）ヒトＮＥは、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）から得られた。
【００８１】
プロテアーゼ感受性
ＭＭＰ−３．凍結ＭＭＰ−３を融解した後、ＭＭＰ−３消化を行う前に、５５℃で２５分間インキュベートすることによって活性化した。最大１ｍｇ／ｍＬの精製ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料は、２ｍＭ塩化カルシウムを含有するｐＨ ７．０の２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液中の活性化ＭＭＰ３（１：５０、ｗ／ｗ）を用いて３７℃で処理した。アリコート（最大２μｌ）を固定した時間間隔（０、０．５、１、２、４、６、８、及び２４時間）で採取し、２μｌのマトリックス溶液で即時に混合した（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の１．０ｍＬ ５０％アセトニトリルに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することによって調製した）。２μｌのこの溶液をＭＡＬＤＩ標的プレート上に装填し、以下に記述される質量スペクトル解析の前に空気乾燥させた。
【００８２】
好中性エラスターゼＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物のＮ末端ペプチド部分は、ＮＥ消化に対して極めて敏感であり（それによって、正常な分子の定量を複雑化し、ヒンジＦｃ耐性に対する焦点を干渉する）、二次ＮＥ開裂部位が下部ヒンジ領域内のどこかに存在することが観察されたため、特に非グリコシル化ＩｇＧにおいてパパイン生成Ｆｃ断片を、各ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料から最初に調製した。各ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物からのそれらのＦｃ断片は、最大１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ ７．０の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中、ＮＥ（１：５０、ｗ／ｗ）を用いて、３７℃で処理した。アリコート（最大２μｌ）を固定した時間間隔（０、０．５、１、２、４、６、８、及び２４時間）で採取し、２μｌのマトリックス溶液で即時に混合した（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の１．０ｍＬ ５０％アセトニトリルに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することによって調製した）。２μｌのこの溶液をＭＡＬＤＩ標的プレート上に装填し、質量スペクトル解析の前に空気乾燥させた。
【００８３】
タンパク質分解消化におけるＩｇＧ及びＩｇＧ断片は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を使用して分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、遅延抽出を伴う線状又はリフレクトロン陽イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）モードで行った。器具は、タンパク質較正キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、外的に較正された。結果は、Ａｓｎ３５９位のＮ−結合グリコシル化の存在が、ＭＭＰ−３（図５Ａ、５Ｃ、５Ｅ）及びＮＥ（図５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ）の両方に対して優れた耐性を明らかに付与したことを示し、２つのプロテアーゼは、下部ヒンジ領域においてこれらの基質を開裂する。ＭＭＰ−３による８時間のインキュベーション後、オリジナルＣＮＴＯ ５３０の２０％未満が正常なままであったが、ＣＮＴＯ ５３０３の６０％超が正常なままであった。ＣＮＴＯ ７３６３及びＣＮＴＯ ７３６について、類似の結果が認められた。ＮＥによる８時間のインキュベーション後、ＣＮＴＯ ５３０ Ｆｃの１０％未満が正常であったが、ＣＮＴＯ ５３０３ Ｆｃの５０％が正常であり、ＣＮＴＯ ７３６３及びＣＮＴＯ ７３６からのＦｃ断片について、再び類似の結果が認められた。３５９位に新しいグリコシル化を有するが、２９７位において天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４変異体は、ＭＭＰ−３に対して中度の感受性を示したが（図５Ｅ）、ＮＥに対して著しく優れた感受性を示した（図５Ｆ）。ＮＥ感受性が、天然Ｆｃグリコシル化の欠失によって直接影響される程度、又は天然グリコシル化の非存在下で得られる上部Ｆｃドメインの誤折り畳みによって間接的に影響される程度は、これから決定されるべきことである。ＭＭＰ−３及びＮＥは双方とも、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物ヒンジ領域の付近で開裂することから、開裂部位から離れて導入された新しいグリコシル化部位は（図２を参照）、幾つかのアミノ酸置換とともに認められるように、タンパク質高次構造に対して明らかにアロステリック効果を有する。しかしながら、Ｔ３５９Ｎ又はＮ３６１Ｔ置換は、それ自体がそのようなアロステリック効果をもたらし得ることを無視することはできない。
【００８４】
実施例３．Ｆｃグリコシル化変異体のインビボ挙動
この研究において、ＣＮＴＯ ５３０のグリコシル化変異体の薬物動態を、マウスにおいて比較した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）からの通常の健康な雌Ｂａｌｂ／ｃマウス、８〜１２週齢（約１８〜２２ｇ）を、体重別にランダム化し、プラスチックフィルターで蓋をしたケージに群で収容し（４匹／ケージ）、市販のげっ歯類食餌及び酸性化水を不断供給した。マウス（４匹／試験物品）に、１ｍｇ／ｋｇの投与量を達成するために、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬで製剤された１０ｍＬ／ｋｇ投与量のＣＮＴＯ ５３０又はＣＮＴＯ ５３０３のいずれかを腹腔内注入した。
【００８５】
２、７、１６、２６、及び３５日目に、連続逆行軌道出血によって、最初の２６日間、各ＣＯ2麻酔下マウスから血液試料を採取した。末端血液試料は、３５日目に心臓穿孔によってＣＯ2麻酔下マウスから採取した。すべての試料は、経時分析が各個別の動物に関して行われ得るように、それが由来する動物に関してマークされた。
【００８６】
すべての血液試料は、室温で少なくとも３０分間〜１時間未満の間放置し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を分離した。血清試料は、研究が終了するまで、すべての試料が一緒に分析される時まで−２０℃で保管した。
【００８７】
すべてのマウスから採取した血清試料は、９６ウェルＥＩＡプレートをポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片でコーティングすることと、血清試料の可変希釈をインキュベートすることと、ＨＲＰ複合ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧと結合されたヒトＩｇＧを検出した後、適切な着色基質を添加することを伴う、標準ＥＬＩＳＡによってヒトＦｃについて分析した。通常血清にスパイクされた滴定量の試験物品を使用して、定量目的の標準曲線を確立した。
【００８８】
各血清試料について決定されたヒトＦｃの濃度は、２日目の血清レベルに標準化し、グラフ化した。結果は、ＣＮＴＯ ５３０３グリコシル化変異型の薬物動態プロファイルは、本質的に、ＣＮＴＯ ５３０のそれと区別できないことを明らかにし、新規のグリカンが、通常の健康なマウスにおける半減期に対して有害な作用を有しないことを示した（図７）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体及び他のＦｃ含有分子のＦｃ配列を評価することに関し、より具体的には、プロテアーゼに対する感受性を変更するように、抗体調製物及び他のＦｃ含有分子を調整、変更、及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃドメイン内のアミノ酸修飾は、アロステリック効果と考えられるものを有し、つまり、遠くからＦｃ高次構造に影響を及ぼし得る。特に、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメインでもある重鎖（下部ヒンジ領域）間の鎖間ジスルフィド結合よりも下で抗体を結合する、Ｆｃ−γ受容体への結合に影響することが示されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：８８８２）。
【０００３】
成熟した抗体においては、Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋め込まれ、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成する。それらの存在は、抗体がＡＤＣＣ等のエフェクター機能を仲介するために必須であることが分かった（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３〜８２２（１９９５）、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９〜７６（１９９８）、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｓｕｐｒａ）。他者及び本出願人（国際特許公開第ＷＯ２００７００５７８６号）による研究は、Ｆｃ領域におけるこれらの自然に付着したグリカンのオリゴ糖組成物が、ポリペプチド鎖の様々な非隣接部位におけるＦｃ受容体結合親和性及びプロテアーゼ感受性も変更することを更に示した（Ｒａｊｕ，Ｓ．Ｔ．２００８ Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：４７１〜４７８、国際特許公開第ＷＯ２００７０２４７４３号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、抗体分子の様々な高次構造の態様に関する理解が進み、モデリング及びタンパク質工学技術がより洗練されるにつれて、治療的抗体候補内の領域を修飾のための標的として、特定用途又は適応について所望のスペクトルのインビボ相互作用と合致させることが今や可能である。そのような修飾は、維持された安全性を有する改善された抗体治療薬を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、抗体又は抗体様治療薬の設計に有用な修飾されたグリコシル化免疫グロブリン定常ドメインの組成物、例えば、１つ以上の操作されたＡｓｎ結合グリコシル化部位（「Ｎ−グリコシル化」）を有するＦｃ領域を含むものを提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、３６１位の突然変異から生じる３５９位のＮ−グリコシル化部位、及び／又は４２１位の突然変異から生じる４１９位のＮ−グリコシル化部位がある。更に、天然Ｆｃグリコシル化がＡｓｎ２９７位に存在し、別の実施形態では、天然Ｆｃグリコシル化が存在しなくてもよい。抗体由来の構造物は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４配列から派生する、又はそれらを含む二量体タンパク質構造である。一態様において、構造物は、ヒンジ領域内の２２８、２３４、又は２３５位（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含有する。
【０００７】
本発明の別の目的は、類似の非修飾免疫グロブリン定常領域を有する化合物と比較して、プロテアーゼ感受性、血清半減期、及びＦｃ受容体結合を含むが、これらに限定されない改善された特性を有する修飾グリコシル化免疫グロブリン定常領域に基づく化合物を含む。
【０００８】
本発明の更なる目的は、グリコシル化抗体調製物がプロテアーゼによる開裂に抵抗する能力を強化するための組成物及び方法を提供することであり、したがって、癌等のプロテアーゼの上昇レベルの存在に随伴する病的状態を治療するための抗体調製物を提供することである。方法の更に別の実施形態において、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質は、抗体であり、好ましくは治療的モノクローナル抗体である。その開裂活性が抵抗の対象となるプロテアーゼは、宿主又は寄生生物、バクテリア、又はウイルスであり得る病原体から生じる、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態において、プロテアーゼは、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである。これらの修飾は、抗体配列に導入され得る。開示される修飾構造物は、生理学的に関連するプロテアーゼに対して優れた耐性を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】番号がＫａｂａｔのＥＵ抗体番号に基づくＩｇＧ４系変異型のヒンジ及びＦｃドメインのアミノ酸配列の整列。図示される配列は、コアヒンジ（残基２２７）で始まり、ＦｃドメインのＣ末端（残基４４７）で終了して、Ｔｈｒの代わりに３５９位にＡｓｎ（Ｎ）を有し、Ａｓｎの代わりに３６１位にＴｈｒ（Ｔ）を有することによって、ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３が、それぞれＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６とは異なり、結果としてグリコシル化モチーフの形成をもたらし、Ａｓｎ３５９位においてグリコシル化されるタンパク質を生じることを示す。変異型ＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４は、Ａｓｎで置換された２９９位にＴｈｒを有し、それによってＡｓｎ２９７位におけるモチーフ及びグリコシル化を除去することによって、ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３とは異なる。ＮＥＭ ３０５２配列は、４１９位及び４２１位のアミノ酸を変更することによって、４１９位においてグリコシル化モチーフ及びグリコシル化をもたらす。グリコシル化モチーフ位置の形成について図示される別の部位は、図面において（「可能な変異型）として示される３８２と３８４との間である。点は、アミノ酸が野生型配列において見られるものと同一であることを示す。
【図２】両方の重鎖上で強調される新しいグリコシル化部位のＦｃ断片残基３５９の構造。
【図３】ＣＮＴＯ ５３０及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（非還元）を通して分割されるその変異型。
【図４】２つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異型が、ヒトＦｃＲｎに結合するために、いかに良好にビオチニル化ｍＡｂと競合するかについてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ系分析。
【図５Ａ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｂ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｃ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｄ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｅ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図５Ｆ】ヒトＭＭＰ−３又はヒト好中球エラスターゼ（ＮＥ）とのインキュベート時の正常なＦｃ構造物の消失率の長期間にわたるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ追跡のために得られたデータを示し、Ａ〜Ｄ）ＭＭＰ−３又はＮＥとのインキュベーション時のＣＮＴＯ ５３０３〜ＣＮＴＯ ５３０、及びＣＮＴＯ ７３６３とＣＮＴＯ ７３６との比較、Ｅ、Ｆ）２つのプロテアーゼとインキュベートした場合のＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４を含む、すべての試料。
【図６】図１において見られるようなＩｇＧ１系変異型のヒンジ及びＦｃドメインのアミノ酸配列。
【図７】両方の分子を注入されたマウスの血液中のＣＮＴＯ ５３０とＣＮＴＯ ５３０３の血清持続性を表すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
略語
ＡＡ＝アントラニル酸、α１，３ＧＴ＝α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＡＲＤ＝急性呼吸困難、β１，４ＧＴ＝β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α２，３ＳＴ＝α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞毒性、ＣＤＣ＝補体依存性細胞毒性、ＣＭＰ−Ｓｉａ＝シチジンリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＦＢＳ＝ウシ胎児血清、ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ＝マトリックス支援レーザー／脱着イオン化時間のフライト質量分析、ＮＡＮＡ＝シアル酸のＮ−アセチルノイラミン酸異性体、ＮＧＮＡ＝シアル酸のＮ−グリコノイラミン酸異性体、ＯＡ＝変形性関節症、ＰＮＧａｓｅ Ｆ＝ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ、ＨＰＬＣ＝逆相高性能液体クロマトグラフィー、ＲＡ＝関節リウマチ、ＳＡ＝シナピン酸、Ｓｉａ＝シアル酸、ＳＤＨＢ＝塩化ナトリウムを含有するジヒドロキシ安息香酸、ＵＤＰ−Ｇａｌ＝ウリジン二リン酸ガラクトース、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ＝ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン。
【００１１】
定義＆用語の説明
本明細書で使用するとき、「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」又は「Ｆｃ含有分子」という用語は、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する単量体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タンパク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる。
【００１２】
用語「抗体」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異型を含むことを意図し、これには抗体模倣薬が非限定的に挙げられ、又は抗体の構造及び／若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、小体、及びその断片が非限定的に挙げられる。機能的断片は、関心対象の標的抗原に結合する、抗原結合断片を含む。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、及びＦ（ａｂ’）2（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元、及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げられるが、これらに限定されない、標的抗原又はその一部に結合できる抗体断片が、用語「抗体」に含まれる（例えば、上記のＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと）。
【００１３】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、動物抗体の少なくとも１つの種の重鎖又は軽鎖抗体可変ドメインのうちの少なくとも１つに対して実質的に相同性を保持する少なくとも１つのリガンド結合ドメインを含む、Ｆｃ含有融合タンパク質の特定の形態である。
【００１４】
概論
本発明は、ＰＥＧ化のためのＦｃドメイン上の新しい部位を識別することにおける関心により促進された。修飾のための特定標的部位を提供する、ＰＥＧ部分のタンパク質のグリカンへの接合のための技術が知られていることから、Ａｓｎ２９７位での天然グリカンの使用が試みられたが、Ｆｃ二量体構造の三級及び四級構造に起因して、天然Ｆｃグリカンは、大きいＰＥＧ構造の接合を可能にするために十分にはアクセス可能でないことが示された。
【００１５】
したがって、Ｆｃドメイン上の位置は、代替的又付加的なＮ−結合グリコシル化部位が、真核細胞の小胞体におけるグリコシルトランスフェラーゼの認識部位として知られる、モチーフ配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにおける工学によって導入されることができると考えられた。２つの異なるＦｃ含有構造物、ＣＮＴＯ ５３０（ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物）及びＣＮＴＯ ７３６（ＧＬＰ−１ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物）のそのようなグリカン変異型を作製する際に、非ＰＥＧ化グリカン変異型が、タンパク質分解酵素に対して著しく高い耐性を予想外に示したことが観察された。
【００１６】
体は、タンパク質の消化及びリモデリングのためのプロテアーゼを自然に生成し、治療的タンパク質もこの影響を受ける。ＲＡ及び他の炎症性疾患等の非病原体駆動疾患状態、並びに癌におけるある範囲のタンパク質分解酵素が上昇することがよく知られている。また、ヒトプロテアーゼは、炎症性、増殖性、転位性、及び感染性疾患に関連することもよく知られている。循環する免疫グロブリン、及び特にＩｇＧクラスのそれらの抗体は、主要な血清タンパク質である。ヒトプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）、及び好中球エラスターゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）又は連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素等の細菌プロテアーゼに類似する、各プロテアーゼに固有の残基におけるＩｇＧ重鎖ポリペプチドを開裂することが知られている。重鎖における開裂部位は、２つの重鎖の鎖間ジスルフィド結合が起こる、ヒンジドメインと呼ばれる領域の周りに集約される。ヒンジの下の領域は、Ｆｃ領域を構成し、ＩｇＧのエフェクター機能に関与する結合部位を含む。微生物の場合、プロテアーゼ発現は潜在的な補助毒性経路であり、ヒンジの下の開裂によるＦｃドメインのタンパク質分解放出が、そうでなければその病的細胞の標的及び致死に至らしめる作用を効果的に中和する限りにおいて、有機体がオプソニン化を回避するのを可能にする（Ｒｏｏｉｊａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ７：４７６〜４８４，２００５）。したがって、特定プロテアーゼの綿密さは、癌、炎症、及び感染性疾患を含む、無数の疾患状態の代表であり得る。ＩｇＧ分解が病理学的インビボ環境において強化されることは、開裂したヒンジドメインに結合する、天然ＩｇＧ自己抗体の存在によって更に明らかにされる（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９５，Ｎａｓｕら、１９８０，Ｐｅｒｓｓｅｌｉｎ及びＳｔｅｖｅｎｓ、１９８５，Ｔｅｒｎｅｓｓら、１９９５ Ｊ Ｉｍｕｎｏｌ．１５４：６４４６〜６４５２）。したがって、生理学的に関連するプロテアーゼに対する高い耐性は、特にプロテアーゼに富む環境における治療的Ｆｃ含有分子の長期のインビボ半減期をもたらすことができ、有効性を強化し、及び／又は投与回数の減少を可能にすることができる。
【００１７】
同一出願人が所有する特許出願第ＷＯ２００９／０２３４５７号は、癌、炎症、及び感染等の疾患又は病的状態に関連する、ＩｇＧを分解することができるプロテアーゼを開示する。情報は、表１（以下に再現される）に要約され、「凝固プロテイナーゼ」は、Ｆ．ＸＩＩａ、ＦＩＸａ、Ｆ．Ｘａ、トロンビン、及び活性タンパク質Ｃを含み、プラスミンは、プラスミノゲン活性剤であるｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、及びスタフィロキナーゼと共インキュベートされたプラスミノゲンであり、「プラスミノゲン活性剤単独」とは、プラスミノゲンを含まず、ＭＭＰは、活性形態又はプロ酵素のいずれかとして得られる組み換えプロテイナーゼであり、「無し」は、２４時間以内に検出可能な開裂がないことを示す。指示される場合を除き、すべての酵素はヒトであった。残基の指定は、完全な成熟ＩｇＧ１抗体重鎖のＥＵ番号付けシステム用である。
【００１８】
【表１−１】
【００１９】
【表１−２】
（１）Ｂａｒｒｅｔｔ Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．及びＷｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（２）Ｂａｒｒｅｔｔ Ａ．Ｊ．、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ．Ｄ．及びＷｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ．Ｆ．（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｖｏｌ．２，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，２００４。
（３）Ｐｏｗｅｒｓ，ＪＣ．、「Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」１９８２．Ｉｎ：Ｆｅｅｎｅｙ及びＷｈｉｔａｋｅｒ（編）、Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｏｄ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ １９８．ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８２ ｐｐ ３４７〜３６７。
（４）Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖｌ．、Ｒｏｎｄａｙ Ｈ．Ｋ．、ｖａｎ ＥｌＢ．、Ｋｉｅｒｓ Ｇ．Ｈ．、Ｖｅｒｚｉｊｌ Ｎ．、ＴｅＫｏｐｐｅｌｅ Ｊ．Ｍ．、Ｈｕｉｚｉｎｇａ Ｔ．Ｗ．Ｊ．、ＤｅＧｒｏｏｔ Ｊ．及びＨａｎｎｅｒｍａａｉｊｅｒ Ｒ．、２００４．ＭＭＰ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｐａｉｒｅｄ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ：Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６３，８８１〜８８３。
（５）Ｖｉｎｃｅｎｔｓ Ｂ．、ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ Ｕ．、Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ．及びＡｂｒａｈａｍｓｏｎ Ｍ．、２００４．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＩｄｅＳ，ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｓｔｒｉｃｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＩｇＧ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｅｘｏｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１５５４０〜１５５４９。
（６）Ｓｕｎ Ｈ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｕ．、Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ Ｊ．Ｗ．、Ｆａｙ Ｗ．Ｐ．、Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ Ｎ．Ｃ．、Ｙａｎｇ Ａ．Ｙ．、Ｒｏｚｅｋ Ｌ．Ｓ．、Ｗａｎｇ Ｘ．、Ｓｊｏｂｒｉｎｇ Ｕ．、Ｇｉｎｓｂｕｒｇ Ｄ．、２００４．Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｈｏｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０５，１２８３〜１２８６。
【００２０】
オリゴ糖機能
細胞からの輸送のための信号配列によって指定されたタンパク質の通常処理として、真核細胞の小胞体内で起こるグリコシル化の結果として、分泌されたタンパク質上に特定のオリゴ糖が存在する。タンパク質に付着したオリゴ糖組成物は、タンパク質の性質、細胞の起源の種、培養状態、及び細胞外環境等の因子によって影響を受ける。種による、又は更には個人による「グライコーム」の性質は、抗原エピトープ、例えば、ヒト血液基の源として長く認識されている。したがって、タンパク質表面グリコシル化は、特定のグリカン構造又は末端サッカリドの特異的又は非特異的受容体を標的することによって、タンパク質の認識を変更する方法を表す。哺乳類受容体のオリゴ糖又はリガンドは、セレクチン等のレクチン、例えば、マンノース結合タンパク質、Ｌ−セレクチン、及びＰ−セレクチンに類似する。
【００２１】
哺乳類ＩｇＧ分子内のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に正常に付着したグリカンは、ＣＨ２ドメインの周囲のヒンジ領域における２つのＣＨ３ドメインの非共有結合性会合によって共有結合されたＦｃ、２つのポリペプチド鎖の三級構造を提供するように作用する。グリコシル化ＩｇＧは、Ｆｃ受容体を結合しないか、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣのエフェクター機能を呈しないか、又は補体Ｃ１ｑを結合しない。最近の研究（Ｋａｎｅｋｏ、２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０〜６７３、Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３０ ２６７３３〜２６７４０）は、Ａｓｎ２９７連結グリカン含有物もまた、ＩｇＧ分子のＦｃ（γ）受容体への結合の親和性にも影響を及ぼし得ることを示している。
【００２２】
ＩＶＩＧとして知られるヒトγグロブリンの調製は、一般的な抗炎症治療として長く使用されてきた。高投与量のヒトＩＶＩＧを用いる治療が関節炎を抑制する、マウス血清誘導性関節炎モデルにおける最近の研究は、先のＩＶＩＧの酵素脱シアリル化が、その治療効果を無効にするが、ＩＶＩＧのシアリル化分留は、その抗炎症効果を強化することを示した（Ｋａｎｅｋｏ、２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：６７０〜６７３）。
【００２３】
抗炎症特性は、ＩＶＩＧのＦｃ部分によって決定されることは長く知られていた。後次の研究は、マウス関節炎モデルにおける関節炎症を抑制することに主に関与するＩＶＩＧ分子の断片が、α２，３連結においてシアル酸を有するものに対向して、ガラクトースを有するα２，６連結においてＦｃシアル酸を有するものである（Ａｎｔｈｏｎｙら、（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７３）ことを示した。脾臓マクロファージの表面上に発現するマウスレクチンＳＩＧＮ−Ｒ１は、ヒトレクチンと同様に、α２，５シアリル化Ｆｃ断片の受容体であり、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ヒト樹状細胞上で発現する（Ａｎｔｈｏｎｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００８ Ｄｅｃ １６；１０５（５０）：１９５７１〜８）。
【００２４】
したがって、本発明のタンパク質組成物を使用して、特定のオリゴ糖構造、末端、又は含有物を有するタンパク質組成物は、宿主細胞の操作及び糖工学を介して合成することができるか、又はプレ若しくはポストタンパク質精製処理、例えば、レクチン親和性クロマトグラフィー若しくは酵素処理又は幾つかの方法の組み合わせを使用する断片によって調製することができる。そのような方法は、本明細書に教示されるように、当業者に周知であるか、又は遺伝子工学、酵素学、タンパク質断片等において周知の方法を使用して開発されているか、若しくは開発することができる。これらの調製を使用して、それらが選択した細胞型、組織、又は器官上で起こる時に、特定の受容体を標的とすることができる。
【００２５】
タンパク質のグリコシル化又はハイパーグリコシル化は、タンパク質の水和量を増加させ、シアル酸残基の存在に起因して、負電荷を付加することができる。これらの変更によって、タンパク質が受ける腎臓濾過によるクリアランスの影響が減少する。したがって、Ｆｃ断片が循環血液中のタンパク質半減期を強化する手段としてのＦｃＲｎ結合に加えて、タンパク質の周辺の増加は、付加されたグリコシル化がＦｃＲｎ結合を減少させないことを前提として、付加的効果をもたらす。
【００２６】
変更Ｆｃ含有分子を作製する方法
付加的なグリコシル化の部位は、Ｆｃ構造又は機能に影響することなく、Ａｓｎ連結グリカンを付加するという要望に基づいて選択された。ＩｇＧ４ Ｆｃ構造（１ａｄｑ）（Ｃｏｒｐｅｒら（１９９７）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．４：３７４）を分析して、修飾の潜在的部位を分析した。下部ヒンジにおいてＦｃ（γ）Ｒ結合部位から遠位にあり、及びＣＨ２−ＣＨ３接合領域においてＦｃＲｎ結合部位から遠位にある、ＣＨ３ドメインのループ領域が標的とされた。３５９−ＴＫＮＱＶＳ−３６４、３８２−ＥＳＮＧＱＰ−３８７、及び４１９−ＥＧＮＶＦＳ−４２４ループは、修飾の影響を受けやすいと思われる残基を含有する。これらのループ内で、残基３５９、３８２、及び４１９は、曝露される表面に基づいて、及び得られるグリコシル化によるＡｓｎ置換は、構造的に適合性があるという予測に基づいて、グリコシル化を導入するために魅力的な部位として同定された。次に、多数のＮ−グリコシル化配列モチーフ（ＮＸＳ／Ｔ）が、これらの位置にコンピュータ的に作られ、及び配列をＮｅｔＮＧｌｙｃサーバ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ）に提出することによってグリコシル化に対するそれらの可能性を推定した。スコアが０．５以下のモチーフは末梢された。試験分子への導入のために選択されたモチーフは、３５９ＮＫＴ及び４１９ＮＧＴであった（図１）。３８２部位は、新しいグリカンがＦｃＲｎ結合を干渉する方向を指し得ることを考慮して、遂行されなかった。しかしながら、残基３８２におけるグリコシル化部位の導入は、完全に機能的なＦｃドメインを産出することが可能である。
【００２７】
Ｆｃ含有タンパク質の酵素修飾
特定のグリカン構造又は特定のオリゴ糖含有量を有するＦｃ含有タンパク質を調製するための一方法は、Ｆｃ含有タンパク質調製物をサッカラーゼ、例えば、フコシダーゼ又はシアリダーゼ酵素で処理することにより、それによって、特定の糖残基、例えば、フコース又はシアル酸を除去する。糖をＦｃ領域に付加することは、インビトログリコシル化方法を使用して達成することもできる。
【００２８】
グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を合成するように自然に機能する。それらは、優れた立体化学及び位置化学形状を有する特定の生成物を生成する。グリコシル残基の移動は、オリゴ糖又は多糖類の伸長又は合成をもたらす。シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ等を含む、多数のグリコシルトランスフェラーゼ型が説明されている。
【００２９】
本発明において有用なグリコシルトランスフェラーゼには、例えば、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−フコシル−トランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、α−キシロシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼ、β−シアリルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−フコシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼ、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼ、例えば、ナイセリア髄膜炎菌又は他の細菌源に由来するもの、及びラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒト、ならびに昆虫及びウイルス源に由来するものが挙げられる。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインが削除されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の切断変異型である。
【００３０】
典型的なガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）及びＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：２２９〜２３３（１９９０））及びα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．３８）を含む。他のグリコシルトランスフェラーゼ、例えば、シアリルトランスフェラーゼを使用することができる。
【００３１】
シアリルトランスフェラーゼと呼ばれる場合が多い、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアリルラクトース又は高次構造の生成において使用することができる。この酵素は、シアル酸（ＮｅｕＡｃ）をＣＭＰ−シアル酸からＧａｌ残基に移動させ、２つの糖の間にα連結の形成を伴う。糖の間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１の非還元末端Ｇａｌから３Ｇｌｃ二糖又はグリコシドに移動させる。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５（１９８２）、及びＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。別の例示的なα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖又はグリコシドの非還元末端Ｇａｌに移動させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４（１９７４）及びＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。更に例示的な酵素は、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１（１９９４）を参照）を含む。
【００３２】
本発明のオリゴ糖を調製する時に特に有用な他のグリコシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、及びＰｍｔ１を含むマンノシルトランスフェラーゼである。
【００３３】
更に他のグルコシルトランスフェラーゼには、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが挙げられ、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９（１９９２）及びＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））、及びポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））が挙げられる。好適なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼには、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、及びＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））が挙げられる。
【００３４】
この方法が商業規模で実践されるそれらの実施形態の場合、グリコシルトランスフェラーゼを支持体上に不動化することが有利であり得る。この不動化は、生成物のバッチからの酵素の除去を促進し、後次の酵素の再利用を促進する。グリコシルトランスフェラーゼの不動化は、例えば、トランスフェラーゼからその膜結合ドメインを除去し、その場所にセルロース結合ドメインを付着させることによって達成することができる。当業者は、不動化の他の方法を使用することもでき、それらの方法は、入手可能な文献に記載されていることを理解するであろう。
【００３５】
受容体基質は、本質的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼが特異性を呈する末端糖残基を有するあらゆる単糖類又はオリゴ糖であり得ることから、基質は、その非還元末端の位置で置換されてもよい。したがって、グリコシド受容体は、単糖類、オリゴ糖、蛍光標識糖、又は糖誘導体、例えば、アミノグリコシド抗生物質、ガングリオシド、又は抗体及び他のＦｃ含有タンパク質を含む糖タンパク質であってもよい。好ましい実施形態の一群において、グリコシド受容体は、オリゴ糖であり、好ましくは、Ｇａｌβ（１〜３）ＧｌｃＮａｃ、Ｇａｌβ（１〜４）ＧｌｃＮａｃ、Ｇａｌβ（１〜３）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ（１〜４）ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ α（１，３）Ｍａｎ、Ｍａｎ α（１，６）Ｍａｎ、又はＧａｌＮＡｃβ（１〜４）マンノースである。特定の好ましい実施形態において、オリゴ糖受容体は、Ｆｃ含有タンパク質のＣＨ２ドメインに付着される。
【００３６】
活性化糖基質、すなわち、糖−ヌクレオシドリン酸塩の使用は、グリコトランスフェラーゼ反応（再利用システムとしても知られる）と同時に、再生反応を使用することによって回避することができる。例えば、米国特許第６，０３０，８１５号において教示されるように、ＣＭＰ−シアル酸再利用システムは、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在下で、シアリルトランスフェラーゼ受容体と反応して、シアリル糖を形成すると、ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを利用して、ＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を補充する。本発明に有用なＣＭＰ−シアル酸再生システムは、シチジン一リン酸塩（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸塩（例えば、アデノシン三リン酸塩（ＡＴＰ））、リン酸塩ドナー（例えば、ホスホエノールピルビン酸塩又はアセチルリン酸塩）、リン酸塩ドナーからリン酸塩をヌクレオシド二リン酸塩に移行することができるキナーゼ（例えば、ピルビン酸キナーゼ又は酢酸キナーゼ）、及びヌクレオシド三リン酸塩からＣＭＰに末端リン酸塩を移行させることができるヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えば、ミオキナーゼ）を含む。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ及びＣＭＰ−シアリル酸シンセターゼは、活性化シアリル酸の除去が順速度の合成を維持するように機能するため、ＣＭＰ−シアル酸再生システムの一部として見ることもできる。修飾されたＣＭＰ−シアリル酸シンセターゼ酵素の遺伝子を含むファージミドを使用する、シアリル化手順におけるシアリル酸化合物の合成及び使用は、１９９２年１０月１日に発行された国際出願第ＷＯ ９２／１６６４０号に開示される。
【００３７】
オリゴ糖を調整する代替方法は、グリコシルトランスフェラーゼ及び活性化グリコシル誘導体をドナー糖として使用することにより、米国特許第５，９５２，２０３号において教示されるように、ドナー糖としての糖ヌクレオチドの必要性を回避する。活性化グリコシル誘導体は、高価な糖ヌクレオチド、通常、ヌクレオチド二リン酸糖又はヌクレオチド一リン酸糖である、自然発生する基質に対する代替として作用し、ヌクレオチドリン酸塩は、糖の１位にα結合する。
【００３８】
有用な活性化グリコシド誘導体には、活性化脱離基、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステル等が挙げられる。活性化グリコシド誘導体の好ましい実施形態には、グリコシルフッ化物及びグリコシルメシル酸塩が挙げられ、及びグリコシルフッ化物が特に好ましい。グリコシルフッ化物の中で、α−ガラクトシルフッ化物、α−マンノシルフッ化物、α−グルコシルフッ化物、α−フコシルフッ化物、α−キシロシルフッ化物、α−シアリルフッ化物、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物、β−ガラクトシルフッ化物、β−マンノシルフッ化物、β−グルコシルフッ化物、β−フコシルフッ化物、β−キシロシルフッ化物、β−シアリルフッ化物、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフッ化物、及びβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフッ化物が最も好ましい。
【００３９】
グリコシルフッ化物は、最初に糖をアセチル化した後、それをＨＦ−ピリジンで処理することによって、遊離糖から調製することができる。アセチル化グリコシルフッ化物は、メタノール（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）中の軽度の（触媒）塩基との反応によって脱保護されてもよい。更に、多くのグリコシルフッ化物は、商業的に入手可能である。他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に知られている従来の方法を使用して調製することができる。例えば、グリコシルメシレートは、糖の完全にベンジル化したヘミアセタール形態を塩化メシルで処理した後、触媒水素化によってベンジル基を除去して調製することができる。
【００４０】
反応の更なる構成成分は、触媒量のヌクレオシドリン酸塩又はその類似体である。本発明において使用するために適したヌクレオシド一リン酸塩には、例えば、アデノシン一リン酸塩（ＡＭＰ）、シチジン一リン酸塩（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸塩（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸塩（ＧＭＰ）、イノシン一リン酸塩（ＩＭＰ）、及びチミジン一リン酸塩（ＴＭＰ）が挙げられる。本発明に従って使用するために適したヌクレオシド三リン酸塩には、アデノシン三リン酸塩（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸塩（ＣＴＰ）、ウルジン三リン酸塩（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸塩（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸塩（ＩＴＰ）、及びチミジン三リン酸塩（ＴＴＰ）が挙げられる。好適なヌクレオシド三リン酸塩は、ＵＴＰである。好ましくは、ヌクレオシドリン酸塩は、ヌクレオシド二リン酸塩、例えば、アデノシン二リン酸塩（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸塩（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸塩（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸塩（ＧＤＰ）、イノシン二リン酸塩（ＩＤＰ）、及びチミジン二リン酸塩（ＴＤＰ）である。好適なヌクレオシド二リン酸塩は、ＵＤＰである。上記のとおり、本発明はまた、ヌクレオシドリン酸塩の類似体を用いて実践することもできる。適した類似体は、例えば、ヌクレオシド硫酸塩及びスルホン酸塩を含む。更に他の類似体は、単純リン酸塩、例えば、ピロリン酸塩を含む。
【００４１】
例えば、シアル酸のヒドロキシル化形態が優位である（ＮＧＮＡ）マウス細胞において生成された組み換えタンパク質を修飾するための一手順は、タンパク質をシアリダーゼで処理すること、ＮＧＮＡ型シアル酸を除去することに続いて、試薬ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ１，４ガルトランスフェラーゼを使用する酵素ガラクトシル化により高均質Ｇ２糖型を生成することである。次に、調整は、所望により試薬ＣＭＰ−ＮＡＮＡ及びα−２，３シアリルトランスフェラーゼで処理して、高均質Ｇ２Ｓ２糖型を得ることができる。
【００４２】
本発明の目的で、糖型の実質的に均質とは、その糖型の約８５％以上、好ましくは約９５％以上を意味する。
【００４３】
抗体のプロテアーゼ及びプロテアーゼ感受性
ペプシンは、食後に胃の内腔に分泌される胃液の通常構成成分であるため、自己活性化され、及び低ｐＨで活性である。低レベルの前駆体酵素ペプシノゲンは、血清中で認めることができるが、活性化及び活性は酸依存であるため、循環する抗体に生理学的に関連しない。ペプシンは、下部ヒンジにおいてロイシン234とロイシン235の間のヒトＩｇＧ１を開裂する。この開裂部位は、抗原結合に対して二価である、Ｆ（ａｂ’）2分子を形成するジスルフィド結合を介して、２つの重鎖を連結する、２つのシステイン残基を含有するヒンジコア（−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−）から下流にある。
【００４４】
ＣＨ２領域の下部ヒンジ及び開始部、Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｆ／Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ（配列番号１及び２の残基５〜１６）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１２の開裂部位を含む。ペプシン及びＭＭＰ−７はまた、この領域（Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ*Ｌ−Ｇ）においても開裂する。更に、生理学的に関連する酵素群、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）は、幾つかの位置でＩｇＧを開裂し、わずかに異なるＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、及びＦｃ断片を生成する（表１を参照）。
【００４５】
糖型変異型の生物学的特性化
Ｆｃ含有タンパク質は、幾つかのよく知られているインビトロアッセイによって、機能性について比較することができる。特に、Ｆｃｖ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩ群のメンバーに対する親和性が関心対象である。これらの測定値は、受容体の組み換え可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して形成することができる。更に、ＦｃＲｎに対する親和性、ＩｇＧの延長された循環半減期に応答可能な受容体は、組み換え可溶型ＦｃＲｎを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定することができる。ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイ等の細胞ベースの機能性アッセイは、特定の変異型構造の可能な機能性の結果に関する見識を提供する。一実施形態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要なエフェクター細胞であるＮＫ細胞を有するように構成され、それによって、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体上で機能的効果を反映させる。過酸化又は炎症媒介放出等の細胞応答を測定できるように、食作用アッセイを使用して、異なる変異型の免疫エフェクター機能を比較することもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ３抗体の変異型を使用して、マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することができ、活性は、Ｆｃγ受容体等の特定リガンドを係合するＦｃドメインに依存する。
【００４６】
タンパク質生成プロセス
Ｆｃ含有タンパク質の生成に関与する異なるプロセスは、Ｆｃオリゴ糖構造に影響を及ぼし得る。一例では、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する宿主細胞は、以前には、高い熱処理（例えば、５６℃で３０分間）に供されていなかった血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で培養される。これは、それらの細胞から分泌されたＦｃ含有タンパク質からシアル酸を除去することができる、活性シアリダーゼ酵素の血清中に自然に存在することに起因して、シアル酸を含有しないか、又は極めて少量を含有するＦｃ含有タンパク質をもたらし得る。別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する細胞は、上昇した熱処理に供され、それによってシアリダーゼ酵素を不活性化する血清の存在下、又はシアリダーゼ酵素を含有し得る血清若しくは他の媒質構成成分の非存在下のいずれかで培養され、Ｆｃ含有タンパク質が、より高いか又は低いレベルのグリコシル化若しくはグリコシル化変異型を有するようにする。
【００４７】
別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質を精製し、更に処理するために使用される状態が確立され、最適なグリカン含有物を優先する。一実施形態において、状態は最大又は最小オリゴ糖含有物を生成するか、又は優勢な糖型において発現したＦｃ含有ポリペプチドの形質転換を引き起こす。例えば、シアル酸は酸に不安定な、低ｐＨ環境に長期間曝露されることから、例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィーカラムからの溶出又はウイルス不活性化努力に続いて、シアル酸含有物の還元につながり得る。別の実施形態において、グリコシル化材料は、特定の糖又はオリゴ糖複合体を表示するタンパク質の経路を選択的に結合又は遅延させる、レクチン固定された支持体材料を使用するクロマトグラフィーに供される。不動化レクチンカラムの場合、非結合フロースルー（Ｔ、スルー）又はカラム非結合断片は、結合断片（Ｂ、結合）から分離することができ、後者は、溶出緩衝液をカラムに通しながら収集される。例えば、カラムをオリジナル試料緩衝液で連続洗浄する間に溶出するＦｃ含有タンパク質を収集することによって、結合の弱い断片又はカラム遅延断片（Ｒ、遅延）を個別に収集することも可能であり得る。シアリル化又はアシアリル化Ｆｃ含有タンパク質に対して強化し得るレクチンの例は、オリゴ糖を末端シアル酸と特異的に結合する、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ（ＭＡＡ）からのレクチン、及びオリゴ糖を末端シアル酸又は末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のいずれかと特異的に結合する、レクチン小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ）である。別の実施例は、オリゴ糖を末端ガラクトースと結合する、レクチンリシンＩ（ＲＣＡ）である。後者の実施例において、非結合フロースルー断片は、シアリル化Ｆｃ含有分子に対して強化されてもよい。当該技術分野において既知の他のレクチンは、Ｖｅｃｔｏｒラボ及びＥＹラボによって提供されるものを含む。
【００４８】
宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書に記載されるように、組み換えＦｃ含有タンパク質又はモノクローナル抗体の発現に対して選択される宿主細胞は、最終組成物に対する重要な寄与因子であり、免疫グロブリンＣＨ２ドメインにおいてタンパク質を修飾するオリゴ糖部分の組成物における変異を含むが、これに限定されない。したがって、本発明の一態様は、所望の治療的タンパク質を発現する生成細胞の使用及び／開発に適切な宿主細胞の選択を伴う。
【００４９】
抗体又はＦｃ融合のシアル酸含有物が消滅する一実施形態において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼが自然に不足しているか、又は欠いている細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼを欠くように遺伝子的に修飾される。更なる実施形態において、宿主細胞は、減少レベル又は検出不可能なレベルのシアリルトランスフェラーゼを発現するように選択される誘導体宿主細胞株である。更に別の実施形態において、宿主細胞は、シアル酸を抗体に移動させるように、シアリルトランスフェラーゼによって使用されるシアル酸の源である、ＣＭＰ−シアル酸の形成を触媒する酵素である、ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを自然に欠いているか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。関連実施形態において、宿主細胞は、ピルビン酸からシアル酸を形成する酵素である、ピルビン酸シンセターゼを自然に欠き得るか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。
【００５０】
付加的な実施形態において、宿主細胞は、当該細胞において発現した抗体がガラクトースを欠くように、ガラクトシルトランスフェラーゼを自然に欠き得るか、又は欠くように遺伝子的に修飾される。ガラクトース無しに、シアル酸は付着されない。個別の実施形態において、宿主細胞は、生成中にシアル酸を抗体から除去するシアリダーゼ酵素を自然に過剰発現し得るか、又は過剰発現するように遺伝子的に修飾されてもよい。そのようなシアリダーゼ酵素は、抗体が培養媒質中に分泌されるか、又は分泌されることになる前に細胞内で抗体に作用し、また媒質中に既に分泌された抗体に作用し得、ガラクターゼを更に含有し得る。変更されたグリコシラーゼを有し、変更した炭水化物組成物を有する糖タンパク質を発現する細胞株を選択する方法は、説明されている（Ｒｉｐｋａ及びＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ １２：５１〜６２、米国特許出願第ＵＳ２００４／０１３２１４０号）。変更されたグリコシル化パターンを有する抗体を生成し、ＡＤＣＣの強化をもたらすように宿主細胞を設計する方法は、例えば、米国特許第６，６０２，８６４号において教示されており、宿主細胞は、少なくとも１つの糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ、特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を含む。
【００５１】
宿主細胞グリコシルトランスフェラーゼの操作を通して宿主細胞のグリコシル化特性を遺伝子的に設計する他のアプローチは、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号に教示されるように、特にα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８遺伝子生成物）の活性を排除又は抑制することを伴う。上記の特定の実施例以外で宿主細胞を設計する方法を実践することは、当業者に既知であろう。更に、設計された宿主細胞は、哺乳類起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそのあらゆる誘導体不動化若しくは形質転換細胞から選択されてもよい。
【００５２】
別の実施形態において、オリゴ糖付着に必要な酵素の活性を抑制又は排除する方法は、ｓｉＲＮＡの使用等による遺伝子サイレンシング、遺伝子ノックアウト、又はその酵素活性を結合及び遮断する酵素に特異的な細胞内抗体若しくはペプチドの共発現等による酵素阻害剤の添加、及び他の既知の遺伝子工学技術からなる群から選択されてもよい。別の実施形態において、糖付着を遮断する酵素、又は既に付着している糖を除去する糖酵素の発現若しくは活性を強化する方法は、組み換え酵素遺伝子による形質転換、酵素ＲＮＡ合成を強化する転写因子の形質転換、及び酵素ＲＮＡの安定性を強化する遺伝子修飾からなる群から選択されてもよく、すべてがシアリダーゼ等の酵素活性の強化につながり、結果として精製された生成物中のシアル酸のレベルが低下する。別の実施形態において、特定の酵素阻害剤が、細胞培養媒質に添加されてもよい。あるいは、別の方法としては、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能である種又は有機体、例えば、原核細胞又は有機体、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐから選択されてもよい。
【００５３】
抗体
本出願に記載される抗体は、あらゆる哺乳類、例えば、非限定的にヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類、ヤギ、若しくはそれらの組み合わせを含むか、又はそれらに由来することができ、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化及び／又はＣＤＲ移植された抗体、免疫グロブリン、開裂生成物、及び他の特定部分、ならびにそれらの変異型を含む。
【００５４】
本明細書に記載される抗体、Ｆｃ含有タンパク質、又はＦｃ断片は、当該技術分野において周知の幾つかの方法で派生し得る。一態様において、抗体は、マウス又は他の動物を標的ペプチド、細胞、又は組織抽出物で免疫付与することによって調製されたハイブリドーマから便宜的に得られる。したがって、抗体は、当該技術分野において周知であるハイブリドーマ技術のうちのいずれかを使用して得ることができ、例えば、それぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９７〜２００１）を参照する。
【００５５】
抗体若しくはＦｃ融合タンパク質又はその成分及びドメインは、そのようなドメイン又は成分のライブラリ、例えば、ファージライブラリから選択することにより得られてもよい。ファージライブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリ又は関心の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリを挿入することによって、例えば、免疫付与した動物又はヒトのＢ細胞から形成することができる。（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブラリは、１つのファージに重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）可変領域対を含有し、単鎖Ｆｖ断片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリの多様性を操作して、ライブラリのモノクローナル抗体の免疫特異性を増加及び／又は変更し、付加的な望ましいヒトモノクローナル抗体を生成した後、同定することができる。例えば、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン分子コード遺伝子をランダムに混合して（シャッフルして）、組み立てられた免疫グロブリン分子において、新しいＨＬ対を形成することができる。付加として、Ｈ及びＬ鎖コード遺伝子のいずれか、又は両方は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補的決定領域（ＣＤＲ）において突然変異を起こさせることができ、後次に望ましい親和性及び中和能力についてスクリーニングすることができる。抗体ライブラリは、１つ以上のヒトフレームワーク配列を選択し、ヒト抗体レパートリーに由来するＣＤＲカセットの集合を導入するか、又は設計された変異によって合成的に形成することもできる（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５９８〜６０２）。多様性の位置は、ＣＤＲに限定されないが、可変領域のフレームワークセグメントも含むことができるか、又はペプチド等の抗体変数領域以外を含んでもよい。
【００５６】
抗体変数領域以外を含み得る標的結合成分の他のライブラリは、リボソーム表示、酵母表示、及び細菌表示である。リボソーム表示は、タンパク質のＲＮＡへの付着を保持しながら、ｍＲＮＡをそれらの同種タンパク質に転換する方法である。核酸コード配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって回復される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，９０２２）。酵母表示は、膜関連αアグルチニン酵母接着受容体、ａｇａ１及びａｇａ２、噛合型システムの一部の、融合タンパク質の構成に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌表示は、細胞膜又は細胞壁に関連する排出された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（Ｃｈｅｎ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３）。
【００５７】
ハイブリドーマ技術と比較して、ファージ及び他の抗体表示は、抗原に対する宿主作用又はその逆の可能性を制限することなく、抗原標的に対する選択をインビトロで操作する機会を付与する。
【００５８】
本発明は、組成物又はその定方向突然変異の真核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌、及び／又は表示と適合性のあるベクターを含む、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、本発明の組成物をコードする核酸も提供する。
【００５９】
Ｆｃ含有分子の使用
上述される方法のいずれかによって生成される組成物（抗体、Ｆｃ融合、Ｆｃ断片）を使用して、細胞、組織、器官、流体、又は一般的に宿主において、ヒト疾患又は特定病理を診断、治療、検出、又は調節してもよい。本明細書で教示されるように、抗体のＦｃ部分、Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃ断片のグリコシル化を修飾して、治療の標的である流体、区画、組織、又は器官中に存在することが知られているプロテアーゼによるタンパク質分解消化に対する耐性を使用して、治療的分子を生成することができ、これらの分子は、それらの元の標的特性を維持してもよく、これらのプロテアーゼによる分解を起こす傾向が低下する。
【００６０】
その開裂活性が抵抗の対象となるプロテアーゼは、宿主、又は寄生生物、バクテリア、若しくはウイルスであり得る病原体から生じる、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態において、プロテアーゼは、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである。分子又はＦｃ分子のＦｃ部分のグリコシル化の変更に対する修飾（ＥＵ番号付けを使用する）は、ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化部位の除去（Ａｓｎ２９７の置換）、ＣＨ３ドメインにおいて３５９位のＡｓｎ及び３６１位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加、ＣＨ３ドメインにおいて３８２位のＡｓｎ及び３８４位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加、ならびにＣＨ３ドメインにおいて４１９位のＡｓｎ及び４２１位のＴｈｒを置換することによるＮ−結合グリコシル化部位の付加から選択することができる。グリコシル化部位をＣＨ３ドメインに付加することは、得られる分子の水和量を増加し、体内の持続性を高めると予想される。
【００６１】
本発明によって提供される組成物を使用する治療の影響を受けやすい疾患又は病理には、これらに限定されないが、癌又は増殖性疾患、炎症性又はリウマチ疾患、自己免疫疾患、神経障害、線維症、心臓血管疾患、皮膚病及び感染症、及び火傷又は傷害に起因する状態が挙げられる。
【００６２】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい癌又は増殖性疾患は、固体腫瘍、転移性腫瘍、液体腫瘍、及び両性腫瘍、例えば、リンパ腫、リンパ芽球性又は骨髄性白血病、（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ増殖性疾患、ホジキンス病、キャッスルマン病、悪性リンパ種、非ホジキンスリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腺癌、扁平上皮癌、肉腫、悪性黒色腫、特定の転移性黒色腫、及び血管腫から選択される。
【００６３】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい炎症又は免疫系媒介疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊柱炎、胃潰瘍、関節症及び関節鏡プラーク、変形性関節症、炎症性腸疾患、海洋性大腸炎、全身ループスエリテマトーシス、抗リン脂質症候群、ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎、ウェグナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎、アレルギー及びアトピー性疾患、ぜんそく及びアトピー性ぜんそく、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏症肺炎、臓器移植の拒絶反応、移植片対宿主疾患、及び全身性炎症反応症候群から選択される。
【００６４】
本発明の組成物による治療の影響を受けやすい他の疾患又は状態は、天疱瘡、強皮症、慢性閉塞性肺疾患、グラム陰性又はグラム陽性細菌の感染、インフルエンザ及びＨＩＶ等のウイルス感染、マラリア又はリーシュマニア症等の寄生虫による感染、ハンセン病、脳炎、カンジダ症、アミロイド症、アルツハイマー病、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、及び出血である。
【００６５】
本明細書において特異的に例示されるように、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインにおいてＮ−結合グリカンを付加することによって（３５９位のＡｓｎ残基及び３６１位のＴｈｒ残基を置換することによって（ＥＵ番号付け））、ペプチドＦｃ融合タンパク質である化合物が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−３）及びセリンエンドペプチダーゼ（ＮＥ）に対して感受性が低くなる一方、分子のＦｃＲｎ結合親和性及びＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を維持する。
【００６６】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、「特許請求の範囲」を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【００６７】
実施例１．Ｆｃグリコシル化変異型の構成
米国特許第７，３９３，６６２号において、ＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物（Ｆｃ融合）として記載されるＥＭＰ−１Ｆｃ融合（ＣＮＴＯ５３０）、及び国際特許第ＷＯ／０５０９７１７５号に記載されるＧＬＰ−１ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物（Ｆｃ融合）（ＣＮＴＯ７３６）に関して実験を行った。両方の構造物は、図１に示されるように、ヒトＩｇＧ４抗体に由来するＦｃ領域を含有する。
【００６８】
ＣＮＴＯ ５３０変異体
プラスミドコード化ＣＮＴＯ５３０、ｐ２６３０を出発物質として使用し、標準組み換えＰＣＲ及びクローニング方法を使用して、ＮＥＭ２６３１を調製した。Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換をＥＰＯ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物ＣＮＴＯ ５３０に導入するために、ＣＨ３コード化制限断片を、ＮＥＭ ２６３１ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔプラスミドｐ３０５１から単離し、プラスミドｐ２６３０コード化ＣＮＴＯ ５３０において対応する断片の代わりにクローン化した。得られるプラスミド、ｐ３２０１は、タンパク質ＣＮＴＯ ５３０ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔをコード化し、本明細書において、ＣＮＴＯ ５３０３と称される（図２及び表１を参照）。
【００６９】
同一のＴ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換を有するが、２９７位の天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ５３０変異型を調製するために、プラスミドｐ３２０１の適切な部分を、突然変異誘発オリゴヌクレオチドでＰＣＲ増幅させ、クローン化して、Ｔ２９９Ｎコドン置換を得た（すなわち、297ＮＳＴ299〜297ＮＳＮ299に変更）。得られるプラスミドは、タンパク質ＣＮＴＯ ５３０ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ／Ｔ２９９Ｎをコード化するｐ３５６５であり、本明細書においてＣＮＴＯ ５３０４と称される。
【００７０】
ＣＮＴＯ ７３６変異体
Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換をＣＮＴＯ ７３６に導入するために、ＣＨ３コード化制限断片を、ＮＥＭ ２６３１ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔプラスミドｐ３０５１から単離し、プラスミドｐ２５３８コード化ＣＮＴＯ ７３６において対応する断片の代わりにクローン化した。得られるプラスミドは、ＣＮＴＯ ７３６ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔをコード化するｐ３３４９であり、本明細書においてＣＮＴＯ ７３６３と称される（表１）。
【００７１】
同一のＴ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ置換を有するが、２９７位の天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ７３６変異型を調製するために、プラスミドｐ３３４９の適切な部分をＰＣＲ増幅させ、クローン化して、Ｔ２９９Ｎコドン置換を得た。得られるプラスミドは、タンパク質ＣＮＴＯ ７３６ Ｔ３５９Ｎ／Ｎ３６１Ｔ／Ｔ２９９Ｎをコード化するｐ３５７７であり、本明細書においてＣＮＴＯ ７３６４と称される。
【００７２】
【表２】
* 形質転換した細胞から観察された生成レベル
【００７３】
発現及び精製ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｃ１０１３Ａ）は、ＣＮＴＯ ５３０３をコードするｐ３２０１プラスミドで安定して形質転換され、結果として、ＣＮＴＯ ５３０３生成細胞株Ｃ１５１４Ａの単離をもたらす。マウスＮＳ０細胞は、ＣＮＴＯ ５３０４、ＣＮＴＯ ７３６３、及びＣＮＴＯ ７３６４をコードする上記プラスミドで安定して形質転換され、結果として、それぞれ形質転換された細胞株Ｃ１６７０Ａ、Ｃ１５２８Ａ、及びＣ１６７１Ａの単離をもたらす（表１）。４つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異型のすべては、標準タンパク質Ａクロマトグラフィーによって形質転換された細胞上清から精製された。タンパク質Ａ及びＦｃＲｎは、いずれもＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３接合において結合するため、タンパク質Ａカラムを使用する良好な精製は、新しいグリコシル化部位がＦｃＲｎへの結合に影響を及ぼし得ないことを示唆した（以下を参照）。
【００７４】
実施例２．Ｆｃグリコシル化変異体の特性化
一連の分析的な生物物理学的な生物活性試験は、実施例１の発現構造物に関して行った。
【００７５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行って、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物変異体のグリカン構造を特性化し、新しい部位において重鎖がグリコシル化した割合を確立した。
【００７６】
正常なＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、ＣＮＴＯ ５３０３、ＣＮＴＯ ５３０４、ＣＮＴＯ ７３６３、及びＣＮＴＯ ７３６４試料が、新しい部位において７５〜９５％がグリカンで占められることを示した。これらの試料のグリカン分析は、それらがＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物グリカンよりも不均質であり、バイ、トリ、及びテトラ触覚構造を含有する３５９位にグリカンを伴うことを示した。ＣＮＴＯ ５３０３及びＣＮＴＯ ７３６３における２９７位の天然Ｆｃグリカンは、それぞれＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ７３６における天然Ｆｃグリカンと同一の構造であり、オリジナルのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物においてガラクトシル化がいくらか優れているという差異が観察されたに過ぎない（例えば、ＣＮＴＯ ５３０の場合約５０％、ＣＮＴＯ ５３０３の場合約７０％）。
【００７７】
寸法及び移動度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。
精製したＣＮＴＯ ５３０、ＣＮＴＯ ５３０３、及びＣＮＴＯ ５３０４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、非還元条件下、１．０ｍｍ厚のＢｉｓＴｒｉｓ ４〜１２％勾配ゲルに１μｇ／レーンを負荷し、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液中の分留を２００Ｖで５０分間実行することによって分析された。ゲルは、クマシーＧ２５０（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、得られた画像は、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ ２２００撮像システム（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して捕捉した（図４）。
【００７８】
ＳＤＳゲル中で観察された移行は予想と一致し、すなわち、合計４つのＮ−グリコシル化部位を有するＣＮＴＯ ５３０３は、更にゆっくり移行し、明らかな分子量は、２つのＮ−グリコシル化部位を有するＣＮＴＯ ５３０及びＣＮＴＯ ５３０４よりも３〜４ｋＤａだけ増加した。同一数のグリコシル化部位を有するにもかかわらず、ＣＮＴＯ ５３０４は、ＣＮＴＯ ５３０よりもゆっくり移行するように見える。これは、ＣＮＴＯ ５３０上の自然なグリコシル化に対して、優れたレベルのガラクトシル化及びシアリル化を有するＣＮＴＯ ５３０４上の新しいグリコシル化部位、ならびにより多くのトリ触覚及びテトラ触覚構造に起因する。分子量の推定値は、ＣＮＴＯ ５３０、ＣＮＴＯ ５３０３、及びＣＮＴＯ ５３０４について、それぞれ５７．５、６１．５、及び５９．５ｋＤａである。
【００７９】
ＦｃＲｎ結合分析によって評価された生物活性
新しいグリコシル化を導入する場所の選択における１つの要因は、ＦｃＲｎ結合領域を回避するという要請であり、ＣＮＴＯ ５３０３によるＦｃＲｎへの結合は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを使用してＣＮＴＯ ５３０と比較した。２つのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料は、パッケージの指示書のとおり、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析ユニット（１０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して、ｐＨ ６．０アッセイ緩衝液（０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．０２５％ ＢＳＡ、０．００１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ６．０）中、４℃で一晩透析した。抗体濃度は、ＯＤ280によって決定した。次に、９６ウェル、半領域、平底、非結合、白色ポリスチレンアッセイプレートにおいて室温で１時間混合しながら以下の成分を共インキュベートした：ビオチニル化ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂ（ＣＮＴＯ ６２３４、最終濃度４μｇ／ｍＬ）、連続希釈した試験試料、ポリヒスチジンタグ付けされたヒトＦｃＲｎ（最終濃度８μｇ／ｍＬ）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎニッケルキレート受容体ビーズ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）、及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンコーティングされたドナービーズ（最終希釈１：２５０）。すべての材料は、上述されるように、アッセイ緩衝液を使用して希釈した。インキュベーション後、プレートは、ＡｌｐｈａＡｃｒｅｅｎプロトコルを使用して、ＥｎＶｉｓｉｏｎ器具上で読み取った。結果（図５）は、ＣＮＴＯ ５３０３が、類似する親和性（ＫD ＣＮＴＯ ５３０よりもわずか２倍弱い）を有するＦｃＲｎと結合したことを示し、ＦｃＲｎ結合がＣＮＴＯ ５３０３において保存されたことを示す。
【００８０】
プロテアーゼ感受性評価
次に、精製したＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）分子は、２つのヒトプロテアーゼ、組み換えマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）及び好中球エラスターゼ（ＮＥ）に対するそれらの相対感受性について評価した。下部ヒンジにおける228ＳＣＰＡＰ配列後に開裂すると考えられるＭＭＰ−３は、ポリＨｉｓタグ付プロＭＭＰ−３としてＨＥＫ細胞内の一時発現、Ｔａｌｏｎ親和性カラムによる精製、及びアリコート中の凍結によって、Ｃｅｎｔｏｃｏｒにおいて調製された。通常、220ＣＤＫＴ上部ヒンジ配列後に主に開裂するが、下部ヒンジにおける二次部位で開裂することもできる（以下参照）ヒトＮＥは、Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）から得られた。
【００８１】
プロテアーゼ感受性
ＭＭＰ−３．凍結ＭＭＰ−３を融解した後、ＭＭＰ−３消化を行う前に、５５℃で２５分間インキュベートすることによって活性化した。最大１ｍｇ／ｍＬの精製ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料は、２ｍＭ塩化カルシウムを含有するｐＨ ７．０の２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液中の活性化ＭＭＰ３（１：５０、ｗ／ｗ）を用いて３７℃で処理した。アリコート（最大２μｌ）を固定した時間間隔（０、０．５、１、２、４、６、８、及び２４時間）で採取し、２μｌのマトリックス溶液で即時に混合した（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の１．０ｍＬ ５０％アセトニトリルに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することによって調製した）。２μｌのこの溶液をＭＡＬＤＩ標的プレート上に装填し、以下に記述される質量スペクトル解析の前に空気乾燥させた。
【００８２】
好中性エラスターゼＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物のＮ末端ペプチド部分は、ＮＥ消化に対して極めて敏感であり（それによって、正常な分子の定量を複雑化し、ヒンジＦｃ耐性に対する焦点を干渉する）、二次ＮＥ開裂部位が下部ヒンジ領域内のどこかに存在することが観察されたため、特に非グリコシル化ＩｇＧにおいてパパイン生成Ｆｃ断片を、各ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物試料から最初に調製した。各ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物からのそれらのＦｃ断片は、最大１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ ７．０の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中、ＮＥ（１：５０、ｗ／ｗ）を用いて、３７℃で処理した。アリコート（最大２μｌ）を固定した時間間隔（０、０．５、１、２、４、６、８、及び２４時間）で採取し、２μｌのマトリックス溶液で即時に混合した（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中の１．０ｍＬ ５０％アセトニトリルに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することによって調製した）。２μｌのこの溶液をＭＡＬＤＩ標的プレート上に装填し、質量スペクトル解析の前に空気乾燥させた。
【００８３】
タンパク質分解消化におけるＩｇＧ及びＩｇＧ断片は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析を使用して分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、遅延抽出を伴う線状又はリフレクトロン陽イオン（［Ｍ＋Ｈ］+）モードで行った。器具は、タンパク質較正キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、外的に較正された。結果は、Ａｓｎ３５９位のＮ−結合グリコシル化の存在が、ＭＭＰ−３（図５Ａ、５Ｃ、５Ｅ）及びＮＥ（図５Ｂ、５Ｄ、５Ｆ）の両方に対して優れた耐性を明らかに付与したことを示し、２つのプロテアーゼは、下部ヒンジ領域においてこれらの基質を開裂する。ＭＭＰ−３による８時間のインキュベーション後、オリジナルＣＮＴＯ ５３０の２０％未満が正常なままであったが、ＣＮＴＯ ５３０３の６０％超が正常なままであった。ＣＮＴＯ ７３６３及びＣＮＴＯ ７３６について、類似の結果が認められた。ＮＥによる８時間のインキュベーション後、ＣＮＴＯ ５３０ Ｆｃの１０％未満が正常であったが、ＣＮＴＯ ５３０３ Ｆｃの５０％が正常であり、ＣＮＴＯ ７３６３及びＣＮＴＯ ７３６からのＦｃ断片について、再び類似の結果が認められた。３５９位に新しいグリコシル化を有するが、２９７位において天然Ｆｃグリコシル化を欠失するＣＮＴＯ ５３０４及びＣＮＴＯ ７３６４変異体は、ＭＭＰ−３に対して中度の感受性を示したが（図５Ｅ）、ＮＥに対して著しく優れた感受性を示した（図５Ｆ）。ＮＥ感受性が、天然Ｆｃグリコシル化の欠失によって直接影響される程度、又は天然グリコシル化の非存在下で得られる上部Ｆｃドメインの誤折り畳みによって間接的に影響される程度は、これから決定されるべきことである。ＭＭＰ−３及びＮＥは双方とも、ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）構造物ヒンジ領域の付近で開裂することから、開裂部位から離れて導入された新しいグリコシル化部位は（図２を参照）、幾つかのアミノ酸置換とともに認められるように、タンパク質高次構造に対して明らかにアロステリック効果を有する。しかしながら、Ｔ３５９Ｎ又はＮ３６１Ｔ置換は、それ自体がそのようなアロステリック効果をもたらし得ることを無視することはできない。
【００８４】
実施例３．Ｆｃグリコシル化変異体のインビボ挙動
この研究において、ＣＮＴＯ ５３０のグリコシル化変異体の薬物動態を、マウスにおいて比較した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）からの通常の健康な雌Ｂａｌｂ／ｃマウス、８〜１２週齢（約１８〜２２ｇ）を、体重別にランダム化し、プラスチックフィルターで蓋をしたケージに群で収容し（４匹／ケージ）、市販のげっ歯類食餌及び酸性化水を不断供給した。マウス（４匹／試験物品）に、１ｍｇ／ｋｇの投与量を達成するために、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬで製剤された１０ｍＬ／ｋｇ投与量のＣＮＴＯ ５３０又はＣＮＴＯ ５３０３のいずれかを腹腔内注入した。
【００８５】
２、７、１６、２６、及び３５日目に、連続逆行軌道出血によって、最初の２６日間、各ＣＯ2麻酔下マウスから血液試料を採取した。末端血液試料は、３５日目に心臓穿孔によってＣＯ2麻酔下マウスから採取した。すべての試料は、経時分析が各個別の動物に関して行われ得るように、それが由来する動物に関してマークされた。
【００８６】
すべての血液試料は、室温で少なくとも３０分間〜１時間未満の間放置し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、血清を分離した。血清試料は、研究が終了するまで、すべての試料が一緒に分析される時まで−２０℃で保管した。
【００８７】
すべてのマウスから採取した血清試料は、９６ウェルＥＩＡプレートをポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片でコーティングすることと、血清試料の可変希釈をインキュベートすることと、ＨＲＰ複合ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧと結合されたヒトＩｇＧを検出した後、適切な着色基質を添加することを伴う、標準ＥＬＩＳＡによってヒトＦｃについて分析した。通常血清にスパイクされた滴定量の試験物品を使用して、定量目的の標準曲線を確立した。
【００８８】
各血清試料について決定されたヒトＦｃの濃度は、２日目の血清レベルに標準化し、グラフ化した。結果は、ＣＮＴＯ ５３０３グリコシル化変異型の薬物動態プロファイルは、本質的に、ＣＮＴＯ ５３０のそれと区別できないことを明らかにし、新規のグリカンが、通常の健康なマウスにおける半減期に対して有害な作用を有しないことを示した（図７）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループ構造の末端においてＮ−グリコシル化部位を有する抗体Ｆｃドメインを含むプロテアーゼに対する増大した耐性を有するＦｃ含有分子。
【請求項２】
ＦｃドメインがＩｇＧ４であり、前記Ｎ−グリコシル化部位がＣＨ３ドメイン内にある、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項３】
前記Ｎ−グリコシル化部位が、タンパク質分解開裂部位から遠位にある、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項４】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４分子のうちのいずれかに由来する、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項５】
前記Ｆｃ含有分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである、請求項６に記載のＦｃ含有分子。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３８２、及び４１９のうちの少なくとも１つにおけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈する、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈する、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈し、前記Ｆｃドメインの残基２９７におけるＮ−グリコシル化部位が除去される、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１１】
残基２９９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１０に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３６１、４１９、及び４２１のうちの少なくとも１つにおいて、野生型からの変更を有する、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１３】
残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、及び／又は残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１２に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１４】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３６１、４１９、及び４２１において、野生型からの変更を有する、請求項１２に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１５】
残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１４に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１６】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つが変更される、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１７】
プロテアーゼに対して増大した耐性を有するＦｃ含有分子であって、抗体Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を有する前記Ｆｃドメインを含み、前記Ｆｃドメインの残基２９７におけるＮ−グリコシル化部位が除去され、前記Ｆｃドメインが、残基２９９、３５９、３６１、４１９、及び４２１において、野生型からの変更を有する、Ｆｃ含有分子。
【請求項１８】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つが変更される、請求項１７に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１９】
プロテアーゼの放出を特徴とする疾患を治療するための方法であって、対象又は患者にグリコシル化Ｆｃ含有タンパク質調製物を投与する工程を含み、前記抗体調製物が、野生型から変更された残基を有し、前記残基が、下部ヒンジ内のＦｃγＲ結合部位から遠位にあるか又はＣＨ２〜ＣＨ３接合領域においてＦｃＲｎ結合領域から遠位にある、方法。
【請求項２０】
プロテアーゼによる開裂に対するＦｃ含有タンパク質の耐性を増大させる方法であって、３５９位、３８２位、及び４１９位のうちの少なくとも１つにおけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、方法。
【請求項２１】
３５９位、３８２位、及び４１９位におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２９７位におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｎ−グリコシル化部位を除去する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼによる開裂に対するＦｃ含有タンパク質の感受性を変更する方法であって、残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｆｃ含有タンパク質配列のＮ−グリコシル化部位を変更する工程を含む、方法。
【請求項２４】
３５９位、３８２位、及び４１９位におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
２９７位におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｎ−グリコシル化部位を除去する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つを、野生型から変更する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【請求項１】
ループ構造の末端においてＮ−グリコシル化部位を有する抗体Ｆｃドメインを含むプロテアーゼに対する増大した耐性を有するＦｃ含有分子。
【請求項２】
ＦｃドメインがＩｇＧ４であり、前記Ｎ−グリコシル化部位がＣＨ３ドメイン内にある、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項３】
前記Ｎ−グリコシル化部位が、タンパク質分解開裂部位から遠位にある、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項４】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４分子のうちのいずれかに由来する、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項５】
前記Ｆｃ含有分子が、抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、ペプシン、プラスミン、トリプシン、キモトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、及びシステインプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメライシン（ＭＭＰ−３）、及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼである、請求項６に記載のＦｃ含有分子。
【請求項８】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３８２、及び４１９のうちの少なくとも１つにおけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈する、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈する、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を呈し、前記Ｆｃドメインの残基２９７におけるＮ−グリコシル化部位が除去される、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１１】
残基２９９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１０に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１２】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３６１、４１９、及び４２１のうちの少なくとも１つにおいて、野生型からの変更を有する、請求項８に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１３】
残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、及び／又は残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１２に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１４】
前記Ｆｃドメインが、残基３５９、３６１、４１９、及び４２１において、野生型からの変更を有する、請求項１２に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１５】
残基３５９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、残基３６１がＡｓｎからＴｈｒに変更され、残基４１９がＴｈｒからＡｓｎに変更され、及び残基４２１がＡｓｎからＴｈｒに変更される、請求項１４に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１６】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つが変更される、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１７】
プロテアーゼに対して増大した耐性を有するＦｃ含有分子であって、抗体Ｆｃドメインの残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を有する前記Ｆｃドメインを含み、前記Ｆｃドメインの残基２９７におけるＮ−グリコシル化部位が除去され、前記Ｆｃドメインが、残基２９９、３５９、３６１、４１９、及び４２１において、野生型からの変更を有する、Ｆｃ含有分子。
【請求項１８】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つが変更される、請求項１７に記載のＦｃ含有分子。
【請求項１９】
プロテアーゼの放出を特徴とする疾患を治療するための方法であって、対象又は患者にグリコシル化Ｆｃ含有タンパク質調製物を投与する工程を含み、前記抗体調製物が、野生型から変更された残基を有し、前記残基が、下部ヒンジ内のＦｃγＲ結合部位から遠位にあるか又はＣＨ２〜ＣＨ３接合領域においてＦｃＲｎ結合領域から遠位にある、方法。
【請求項２０】
プロテアーゼによる開裂に対するＦｃ含有タンパク質の耐性を増大させる方法であって、３５９位、３８２位、及び４１９位のうちの少なくとも１つにおけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、方法。
【請求項２１】
３５９位、３８２位、及び４１９位におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２９７位におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｎ−グリコシル化部位を除去する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プロテアーゼによる開裂に対するＦｃ含有タンパク質の感受性を変更する方法であって、残基３５９、３８２、及び４１９におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｆｃ含有タンパク質配列のＮ−グリコシル化部位を変更する工程を含む、方法。
【請求項２４】
３５９位、３８２位、及び４１９位におけるＥＵ番号付けに相関するＮ−グリコシル化部位を前記Ｆｃ含有タンパク質に付加する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
２９７位におけるＥＵ番号付けに相関する前記Ｎ−グリコシル化部位を除去する工程を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＥＵ番号付けに相関して、ヒンジ領域内の残基２２８、２３４、及び２３５のうちの少なくとも１つを、野生型から変更する工程を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
本明細書に記載されたいずれかの発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５０９４１５（Ｐ２０１３−５０９４１５Ａ）
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３６９２３（Ｐ２０１２−５３６９２３）
【出願日】平成２２年１０月２５日（２０１０．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３９４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５９６８４
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２５日（２０１０．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３９４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５９６８４
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５０９０８７７５９）ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド (77)
【Ｆターム（参考）】
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