抗体提示酵母およびその作製方法
【課題】
抗Ｅ２抗体遺伝子に人為的に変異導入したライブラリーからの高親和性抗体の効率的なスクリーニング方法の開発のための抗Ｅ２抗体提示酵母の開発
【解決の手段】
抗Ｅ２抗体遺伝子の一部をコードするＤＮＡを有し、酵母表層に提示するためのアンカータンパク質遺伝子を含んだ酵母用発現ベクターを、酵母に形質転換することにより抗Ｅ２抗体を表層に提示した形質転換酵母の作製。
抗Ｅ２抗体遺伝子に人為的に変異導入したライブラリーからの高親和性抗体の効率的なスクリーニング方法の開発のための抗Ｅ２抗体提示酵母の開発
【解決の手段】
抗Ｅ２抗体遺伝子の一部をコードするＤＮＡを有し、酵母表層に提示するためのアンカータンパク質遺伝子を含んだ酵母用発現ベクターを、酵母に形質転換することにより抗Ｅ２抗体を表層に提示した形質転換酵母の作製。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｅ２抗体を細胞表層に提示する抗体提示酵母およびその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ２（１７β−エストラジオール）は、主として卵巣から産生され、卵胞発育に伴い特徴的な分泌パターンを示し、妊娠中は胎盤性エストロゲンの一部として、思春期、不妊症、更年期、閉経婦人における卵巣機能の診断マーカーとして重要である。そのため、Ｅ２に対するモノクローナル抗体を作成することができれば、血液検査による病気の早期診断、治療のモニタリングが可能となる。
【０００３】
モノクローナル抗体の作製方法には、大きく分けて、ハイブリドーマ法と進化工学的な手法がある。ハイブリドーマ法は、マウス等の動物に目的抗原を注射することで免疫化し、目的抗体を産生するＢ細胞と、不死のガン細胞であるミエローマ細胞とを細胞融合することで抗体を産生し不死であるハイブリドーマを作製し、スクリーニングを行うことで目的抗原に対し高い親和性、特異性の抗体を得る方法である（非特許文献１）。一方、進化工学的手法は、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法（非特許文献２）、相同組換法（非特許文献３）、ＤＮＡシャッフリング法（非特許文献４）などの変異導入法を用いて、抗体遺伝子にランダムな変異を導入しライブラリーを作製する。そして、このライブラリーの中から高機能な抗体を選び出すために、蛋白質と遺伝子情報が対となるファージディスプレイ法（非特許文献５）、リボソームディスプレイ法（非特許文献６）、バクテリアディスプレイ法（非特許文献７）などを用いてスクリーニングを行うことにより、目的抗原に対し親和性、特異性の高い抗体を得る方法である。
【０００４】
進化工学的手法ならば、生体内で起こる変異を生体外で人為的に起こせるため、生体内では起こりくい変異導入も可能であるため、より高機能な抗体を得られる可能性がある。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，”ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ” Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻， ４９５−４９７頁 １９７５年
【非特許文献２】Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．， Ｃｈｅｎ，Ｅ． ａｎｄ Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｗ．，“Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ” Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １巻 １１−１５頁 １９８９年
【非特許文献３】Ｐｅｔｅｒ Ｌ．Ｗａｎｇ， Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ａｎｄ Ｇｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ “Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １８巻 ８号 ３９７−４０４頁 ２００５年
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｅｍ Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ， “Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻 ３８９３９１頁 １９９４年
【非特許文献５】Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｍａｒｋｓ，他４名，“Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ Ｐｈａｇｅ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２２巻 ５８１−５９７頁 １９９１年
【非特許文献６】Ｊｏｚｅｆ Ｈａｎｅｓ， ａｎｄ Ａｎｄｒｅａｓ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， “Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ” Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ ＵＳＡ ，９４巻 ４９３７−４９４２頁 １９９７年
【非特許文献７】Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ， Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ， 他５名 “Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ： ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ｌｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５巻 ２９−３４頁 １９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特定の抗原と高い親和性・特異性を有する抗Ｅ２抗体を取得するためには、進化工学的手法で作製したライブラリーからのスクリーニングが必要である。このスクリーニングには、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、バクテリアディスプレイ法、などのディスプレイ法が用いられるが、これらのディスプレイ法では発現できる蛋白質のサイズに制限があり、大きな蛋白質を発現及び提示させることは困難である。また、これらのディスプレイ法では用いられている宿主が原核細胞であるため、生産されるタンパク質にアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾が起こらないため、提示されるタンパク質が本来の活性を示していない可能性がある。そのため、比較的大きな蛋白質でも発現することが可能で、翻訳後修飾が起こる真核生物でのディスプレイ法が望まれている。
【０００７】
本発明の目的は、抗Ｅ２抗体等の抗体遺伝子に人為的に変異導入したライブラリーからの高親和性抗体の効率的なスクリーニング方法の開発のための抗Ｅ２抗体等の抗体を提示する酵母の提供およびその作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
タンパク質生産の宿主として主に使われている大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の中で、酵母は大量培養方法が確立しており、生産されてくるタンパク質のアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾も動物細胞の場合と類似していると考えられている。また、酵母はファージなどに比べ細胞のサイズが大きいため、表層に提示できる蛋白質も多く、比較的大きな蛋白質も提示することができる。このため、酵母を宿主とした蛋白質のディスプレイ法を用いて酵母表層へ抗体を提示できれば、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、バクテリアディスプレイ法を用いるよりも、親和性、特異性の高い抗体のスクリーニングなどにおいて有用であると考えられる。そこで、抗Ｅ２抗体提示酵母の作製が必要である。
【０００９】
酵母のベクターとしては、酵母専用のベクターだけではなく、酵母と大腸菌の両方で使えるシャトルベクターもある。また、ベクターのタイプとしてはマルチコピー型、ゲノム組込型がある。本発明においては、スクリーニングを目的とした抗Ｅ２抗体提示酵母の作製なので、酵母に比べると扱いやすい大腸菌でも使用できるシャトルベクターで、スクリーニング後に酵母からプラスミド抽出ができるようマルチコピー型のプラスミドを使用することが望ましい。
【００１０】
細胞からｍＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジンチオシアネートでＲＮａｓｅを失活させた細胞抽出液を高密度の塩化セシウム溶液で密度勾配遠心を行いｍＲＮＡを回収するグアニジンー塩化セシウム超遠心法や、 ＲＮＡはＤＮＡに比べて２位の炭素に水酸基が一つ多くあるため、酸性下でフェノール処理するとＤＮＡは疎水性にまさるフェノール層に分配されるが、ＲＮＡ水相に分配性質を利用してＲＮＡを抽出するＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）などがあり、どれを用いてもよい。また、各メーカーからＲＮＡ抽出用のｋｉｔが販売されているのでそれらを用いても構わない。
【００１１】
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成には逆転写酵素を用いて行う。ｃＤＮＡからの遺伝子増幅にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）等の増幅法があるが、どれを用いてもかまわない。また、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅法には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ）を用いると効率がよいが、どの方法を用いても問題はない。
【００１２】
インサートである抗体遺伝子を増幅し、インサートとベクターを制限酵素で処理した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌に形質転換するが、形質転換法には化学的なヒートショック法と、物理的なエレクトロポレーション法がある。この２つの方法では、一般に形質転換効率はヒートショック法よりもエレクトロポレーション法の方が高いためエレクトロポレーション法で行うことが望ましい。
【００１３】
大腸菌からのプラスミド抽出法には、大腸菌を溶液に懸濁し煮沸することで溶菌し、フェノール／クロロホルムで蛋白質を変性させ、除去しプラスミドを取出すボイル法や、アルカリ溶液で大腸菌を溶菌するアルカリ溶解法などがある。現在は、各メーカーからアルカリ溶解法での大腸菌からのプラスイミド抽出ｋｉｔが販売されており簡便な方法で精製度の高いプラスミド抽出が行えるためそれらを用いれば問題はない。
【００１４】
大腸菌から抽出したプラスミドを酵母へ形質転換するが、その酵母には代表的なものに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどが挙げられ、どれを用いてもかまわない。また、酵母の形質転換の方法には、酵母の細胞壁を適当な細胞壁溶解酵素で除去して生成するプロトプラストに、ポリエチレングリコールとカルシウム存在下で遺伝子を導入するプロトプラスト法や、パルスで物理的な穴を細胞に開けるエレクトロポレーション法や、リチウム、セシウム、ルビジウムなどのアルカリ一価カチオンで処理することによって、酵母細胞にコンピテント能（遺伝子取り込み能力）を賦与し、ポリエチレングリコール存在下で酵母細胞に遺伝子を取り込ませる金属処理法などがある。この中で最も形質転換効率の高い方法は、プロトプラスト法であるが、操作が煩雑な上に細胞壁を溶解した後のポリエチレングリコール処理によって細胞融合が起こってしまう問題があるため、簡便な金属処理法を用いる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、抗Ｅ２抗体を細胞表層に提示する形質転換酵母を提供でき、これにより、真核微生物である酵母で変異を入れた抗体ライブラリーからスクリーニングを行えば、他のディスプレイ法を用いるより高い親和性、特異性の抗体の取得に非常に有用となる。本発明により、抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を細胞表層に提示する形質転換酵母を作製できた。
【実施例】
【００１６】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） 提示用ベクターの調整と形質転換
抗Ｅ２抗体産生ハイブリドーマ（Ｂ０２９）よりｔｏｔａｌＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ２ＲＮａｓｅＨ− ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｇｉｂｃｏ社製）、配列表の配列番号１、２を用いて４２℃で２時間処理した後、７０℃で１５分処理しＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２．５μｌ加えてＲＮＡを分解した後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製しｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡから、配列表の配列番号３〜２０を用いて抗体遺伝子のＨ鎖（ＶＨ、ＣＨ１）、配列表の配列番号２１〜４２を用いてＬ鎖（Ｖκ、Ｃκ）をＰＣＲ（９８℃／１分、９８℃／３０秒、５５℃／１５秒、７２℃／３０秒、２５サイクル、７２℃／２分）により増幅した。また、このときＰＣＲによりＬ鎖とアンカー蛋白であるα−アグルチニンとの間にはＦＬＡＧ Ｔａｇを入れ、Ｈ鎖の方にはＨｉｓ Ｔａｇを入れた。ＰＣＲによる増幅後、Ｈ鎖を制限酵素（Ｓａｃ２、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で処理し、ゲルの切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）後、表層提示用シャトルベクターｐＣＡＳ１（非特許文献１１）へＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイ社製））した。また、Ｌ鎖を（ＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ：タカラバイオ社製）で処理し、ゲルの切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）後、表層提示用シャトルベクターｐＥＲＳへＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ：タカラバイ社製）した。その後、二つのＬｉｇａｔｉｏｎ産物をそれぞれ大腸菌 （ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行った。形質転換後の大腸菌からプラスミド抽出（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行い、抗体遺伝子をクローニングした表層提示用プラスミド（ｐＣＡＳ１−Ｈ，ｐＥＲＳ−Ｌ）を作製した。
【００１７】
作製したプラスミド（ｐＣＡＳ１−Ｈ，ｐＥＲＳ−Ｌ）を、ＳＤＣ＋ＷＵ培地（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製） ２０ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ（和光純薬工業社製）２０ｍｇ／Ｌ）で培養した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へそれぞれ形質転換（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ：ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）することにより、アンカータンパクであるα−アグルチニンを介して抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）（Ｆａｂ）を表層に提示した酵母を作製した（図１参照）。
【００１８】
（非特許文献１１） Ｓ．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ， Ｍ． Ｕｅｄａ 他６名 ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ” Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ５５巻 ４７１−４７５頁 ２００１年
（実施例２） １ベクターでの抗体提示
実施例１で作製したベクター（ｐＣＡＳ−Ｈ、ｐＥＲＳ−Ｌ）を用いて、ｐＥＲＳ−ＬベクターにｐＣＡＳ−ＨのＨ鎖を導入することにより、１ベクターに抗体遺伝子のＨ鎖、Ｌ鎖を入れて酵母表層に抗Ｅ２抗体を提示させることを行った。まず、ｐＣＡＳ−Ｈ をテンプレートとして配列表の配列番号４３，４４を用いてＰＣＲ（９６℃／２分、９６℃／１分、６０℃／１５秒、７２℃／４分、２７サイクル、７２℃／４分）を行いＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーターからＨ鎖を含む形で増幅し、ゲルの切出し精製 （ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行った。その後、ＰＣＲ産物、ｐＥＲＳ−Ｌプラスミドをそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で処理し、ｐＥＲＳ−Ｌプラスミド をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製））で３７℃、１時間、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。こうして調整した、ＰＣＲ産物とｐＥＲＳ−ＬプラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ：タカラバイ社製）し、その後大腸菌 （ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へ形質転換を行い、抗体遺伝子を二つ含んだｐＥＲＳ−ＨＬプラスミドベクターを作製した。大腸菌からプラスミド抽出（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行い、得られたプラスミドを、ＳＤＣ＋ＷＵ（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製） ２０ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ（和光純薬工業社製）２０ｍｇ／Ｌ）培地で培養した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へ形質転換（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）し１つのベクターで、アンカータンパクであるα−アグルチニンを介して抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）（Ｆａｂ）を表層に提示した酵母を作製した（図２参照）。
【００１９】
（実施例３） 表層提示抗体のＥＬＩＳＡによる確認
実施例１、２で作成した形質転換酵母はα−アグルチニンを介してＦＬＡＧ Ｔａｇ（アミノ酸配列５’−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−３’）をはさみ抗体（Ｂ０２９）を提示している。そこで、ＦＬＡＧ Ｔａｇ中の Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓに特異的な酵素ｒＥＫ（リコンビナントエンテロキナーゼ：タカラバイオ社製）を用いて選択培地（２ベクターの場合ＳＤＣ培地（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製）６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ）、１ベクターの場合ＳＤＣ＋Ｗ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ／Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製）２０ｍｇ／Ｌ）５ｍｌで１〜２日培養した形質転換酵母を３，０００ｒｐｍ ５ｍｉｎで遠心し、上清を捨て１ｍｌの滅菌水に懸濁する洗浄を３回行い、３００μｌの系で室温、１６時間処理することで、酵母表層から抗体分子を切り出した。この切り出した抗体が抗原に反応するかを調べるため、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、蛍光用９８穴プレート（ＮＵＮＣ社製）にａｎｔｉ−ＩｇＧ−（Ｆａｂ）２抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）１μｇ／ｍｌを１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、４℃で一晩置いた後、ＴＢＳで３回洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を３００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、３７℃で１ｈｏｕｒ置いた。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、ｒＥＫ処理をした溶液を３，０００ｒｐｍ ５ｍｉｎで遠心し上清を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、３７℃で１ｈｏｕｒ置いた後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、Ｅ２−ＡＬＰ （Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ） （０．０８１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き３７℃で１ｈｏｕｒ置いた後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、蛍光基質４ＭＵＰ（東ソー社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き３７℃で１ｈｏｕｒ置き、蛍光を測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）。その結果、２つのベクターで形質転換した酵母、１ベクターで形質転換した酵母それぞれで、酵素処理をして切り出した抗体が抗原であるＥ２に反応することが確認できた（図３参照）。これにより抗Ｅ２抗体がＦＬＡＧ Ｔａｇをはさみ酵母表層に提示されていることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で示した、抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を表層提示用ベクター（ｐＣＡＳ１、ｐＥＲＳ）にクローニングし、酵母へ形質転換するまでの概略図である。
【図２】実施例２で示した、ｐＥＲＳベクター１つで抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を酵母表層へ提示するまでの概略図である。
【図３】実施例３で示した、形質転換した酵母をｒＥＫ（リコンビナントエンテロキナーゼ）で処理し酵母表層に抗体が提示されているかを調べるために行ったＥＬＩＳＡの結果であり、Ａは２ベクター系、Ｂは１ベクター系の結果であり、図中、Ｘ軸（横軸）はサンプルの希釈倍率を、Ｙ軸（縦軸）は４４７ｎｍにおける蛍光強度（任意の単位）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｅ２抗体を細胞表層に提示する抗体提示酵母およびその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ２（１７β−エストラジオール）は、主として卵巣から産生され、卵胞発育に伴い特徴的な分泌パターンを示し、妊娠中は胎盤性エストロゲンの一部として、思春期、不妊症、更年期、閉経婦人における卵巣機能の診断マーカーとして重要である。そのため、Ｅ２に対するモノクローナル抗体を作成することができれば、血液検査による病気の早期診断、治療のモニタリングが可能となる。
【０００３】
モノクローナル抗体の作製方法には、大きく分けて、ハイブリドーマ法と進化工学的な手法がある。ハイブリドーマ法は、マウス等の動物に目的抗原を注射することで免疫化し、目的抗体を産生するＢ細胞と、不死のガン細胞であるミエローマ細胞とを細胞融合することで抗体を産生し不死であるハイブリドーマを作製し、スクリーニングを行うことで目的抗原に対し高い親和性、特異性の抗体を得る方法である（非特許文献１）。一方、進化工学的手法は、ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法（非特許文献２）、相同組換法（非特許文献３）、ＤＮＡシャッフリング法（非特許文献４）などの変異導入法を用いて、抗体遺伝子にランダムな変異を導入しライブラリーを作製する。そして、このライブラリーの中から高機能な抗体を選び出すために、蛋白質と遺伝子情報が対となるファージディスプレイ法（非特許文献５）、リボソームディスプレイ法（非特許文献６）、バクテリアディスプレイ法（非特許文献７）などを用いてスクリーニングを行うことにより、目的抗原に対し親和性、特異性の高い抗体を得る方法である。
【０００４】
進化工学的手法ならば、生体内で起こる変異を生体外で人為的に起こせるため、生体内では起こりくい変異導入も可能であるため、より高機能な抗体を得られる可能性がある。
【０００５】
【非特許文献１】Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，”ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ” Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻， ４９５−４９７頁 １９７５年
【非特許文献２】Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．， Ｃｈｅｎ，Ｅ． ａｎｄ Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｗ．，“Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ” Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １巻 １１−１５頁 １９８９年
【非特許文献３】Ｐｅｔｅｒ Ｌ．Ｗａｎｇ， Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ａｎｄ Ｇｒｅｇ Ｗｉｎｔｅｒ “Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １８巻 ８号 ３９７−４０４頁 ２００５年
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｅｍ Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ， “Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｎａｔｕｒｅ ３７０巻 ３８９３９１頁 １９９４年
【非特許文献５】Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｍａｒｋｓ，他４名，“Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｎ Ｐｈａｇｅ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２２巻 ５８１−５９７頁 １９９１年
【非特許文献６】Ｊｏｚｅｆ Ｈａｎｅｓ， ａｎｄ Ａｎｄｒｅａｓ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， “Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ” Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ ＵＳＡ ，９４巻 ４９３７−４９４２頁 １９９７年
【非特許文献７】Ｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ， Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ Ｃ， 他５名 “Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ： ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｔｏ ｌｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５巻 ２９−３４頁 １９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特定の抗原と高い親和性・特異性を有する抗Ｅ２抗体を取得するためには、進化工学的手法で作製したライブラリーからのスクリーニングが必要である。このスクリーニングには、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、バクテリアディスプレイ法、などのディスプレイ法が用いられるが、これらのディスプレイ法では発現できる蛋白質のサイズに制限があり、大きな蛋白質を発現及び提示させることは困難である。また、これらのディスプレイ法では用いられている宿主が原核細胞であるため、生産されるタンパク質にアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾が起こらないため、提示されるタンパク質が本来の活性を示していない可能性がある。そのため、比較的大きな蛋白質でも発現することが可能で、翻訳後修飾が起こる真核生物でのディスプレイ法が望まれている。
【０００７】
本発明の目的は、抗Ｅ２抗体等の抗体遺伝子に人為的に変異導入したライブラリーからの高親和性抗体の効率的なスクリーニング方法の開発のための抗Ｅ２抗体等の抗体を提示する酵母の提供およびその作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
タンパク質生産の宿主として主に使われている大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の中で、酵母は大量培養方法が確立しており、生産されてくるタンパク質のアセチル化、リン酸化および糖鎖の付加などの翻訳後修飾も動物細胞の場合と類似していると考えられている。また、酵母はファージなどに比べ細胞のサイズが大きいため、表層に提示できる蛋白質も多く、比較的大きな蛋白質も提示することができる。このため、酵母を宿主とした蛋白質のディスプレイ法を用いて酵母表層へ抗体を提示できれば、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、バクテリアディスプレイ法を用いるよりも、親和性、特異性の高い抗体のスクリーニングなどにおいて有用であると考えられる。そこで、抗Ｅ２抗体提示酵母の作製が必要である。
【０００９】
酵母のベクターとしては、酵母専用のベクターだけではなく、酵母と大腸菌の両方で使えるシャトルベクターもある。また、ベクターのタイプとしてはマルチコピー型、ゲノム組込型がある。本発明においては、スクリーニングを目的とした抗Ｅ２抗体提示酵母の作製なので、酵母に比べると扱いやすい大腸菌でも使用できるシャトルベクターで、スクリーニング後に酵母からプラスミド抽出ができるようマルチコピー型のプラスミドを使用することが望ましい。
【００１０】
細胞からｍＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジンチオシアネートでＲＮａｓｅを失活させた細胞抽出液を高密度の塩化セシウム溶液で密度勾配遠心を行いｍＲＮＡを回収するグアニジンー塩化セシウム超遠心法や、 ＲＮＡはＤＮＡに比べて２位の炭素に水酸基が一つ多くあるため、酸性下でフェノール処理するとＤＮＡは疎水性にまさるフェノール層に分配されるが、ＲＮＡ水相に分配性質を利用してＲＮＡを抽出するＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）などがあり、どれを用いてもよい。また、各メーカーからＲＮＡ抽出用のｋｉｔが販売されているのでそれらを用いても構わない。
【００１１】
ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成には逆転写酵素を用いて行う。ｃＤＮＡからの遺伝子増幅にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）等の増幅法があるが、どれを用いてもかまわない。また、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ増幅法には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ）を用いると効率がよいが、どの方法を用いても問題はない。
【００１２】
インサートである抗体遺伝子を増幅し、インサートとベクターを制限酵素で処理した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌に形質転換するが、形質転換法には化学的なヒートショック法と、物理的なエレクトロポレーション法がある。この２つの方法では、一般に形質転換効率はヒートショック法よりもエレクトロポレーション法の方が高いためエレクトロポレーション法で行うことが望ましい。
【００１３】
大腸菌からのプラスミド抽出法には、大腸菌を溶液に懸濁し煮沸することで溶菌し、フェノール／クロロホルムで蛋白質を変性させ、除去しプラスミドを取出すボイル法や、アルカリ溶液で大腸菌を溶菌するアルカリ溶解法などがある。現在は、各メーカーからアルカリ溶解法での大腸菌からのプラスイミド抽出ｋｉｔが販売されており簡便な方法で精製度の高いプラスミド抽出が行えるためそれらを用いれば問題はない。
【００１４】
大腸菌から抽出したプラスミドを酵母へ形質転換するが、その酵母には代表的なものに、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどが挙げられ、どれを用いてもかまわない。また、酵母の形質転換の方法には、酵母の細胞壁を適当な細胞壁溶解酵素で除去して生成するプロトプラストに、ポリエチレングリコールとカルシウム存在下で遺伝子を導入するプロトプラスト法や、パルスで物理的な穴を細胞に開けるエレクトロポレーション法や、リチウム、セシウム、ルビジウムなどのアルカリ一価カチオンで処理することによって、酵母細胞にコンピテント能（遺伝子取り込み能力）を賦与し、ポリエチレングリコール存在下で酵母細胞に遺伝子を取り込ませる金属処理法などがある。この中で最も形質転換効率の高い方法は、プロトプラスト法であるが、操作が煩雑な上に細胞壁を溶解した後のポリエチレングリコール処理によって細胞融合が起こってしまう問題があるため、簡便な金属処理法を用いる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、抗Ｅ２抗体を細胞表層に提示する形質転換酵母を提供でき、これにより、真核微生物である酵母で変異を入れた抗体ライブラリーからスクリーニングを行えば、他のディスプレイ法を用いるより高い親和性、特異性の抗体の取得に非常に有用となる。本発明により、抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を細胞表層に提示する形質転換酵母を作製できた。
【実施例】
【００１６】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１） 提示用ベクターの調整と形質転換
抗Ｅ２抗体産生ハイブリドーマ（Ｂ０２９）よりｔｏｔａｌＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ２ＲＮａｓｅＨ− ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｇｉｂｃｏ社製）、配列表の配列番号１、２を用いて４２℃で２時間処理した後、７０℃で１５分処理しＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２．５μｌ加えてＲＮＡを分解した後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で精製しｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡから、配列表の配列番号３〜２０を用いて抗体遺伝子のＨ鎖（ＶＨ、ＣＨ１）、配列表の配列番号２１〜４２を用いてＬ鎖（Ｖκ、Ｃκ）をＰＣＲ（９８℃／１分、９８℃／３０秒、５５℃／１５秒、７２℃／３０秒、２５サイクル、７２℃／２分）により増幅した。また、このときＰＣＲによりＬ鎖とアンカー蛋白であるα−アグルチニンとの間にはＦＬＡＧ Ｔａｇを入れ、Ｈ鎖の方にはＨｉｓ Ｔａｇを入れた。ＰＣＲによる増幅後、Ｈ鎖を制限酵素（Ｓａｃ２、ＫｐｎＩ：タカラバイオ社製）で処理し、ゲルの切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）後、表層提示用シャトルベクターｐＣＡＳ１（非特許文献１１）へＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（タカラバイ社製））した。また、Ｌ鎖を（ＳａｃＩＩ、ＸｈｏＩ：タカラバイオ社製）で処理し、ゲルの切出し精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）後、表層提示用シャトルベクターｐＥＲＳへＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ：タカラバイ社製）した。その後、二つのＬｉｇａｔｉｏｎ産物をそれぞれ大腸菌 （ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へヒートショックにて形質転換を行った。形質転換後の大腸菌からプラスミド抽出（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行い、抗体遺伝子をクローニングした表層提示用プラスミド（ｐＣＡＳ１−Ｈ，ｐＥＲＳ−Ｌ）を作製した。
【００１７】
作製したプラスミド（ｐＣＡＳ１−Ｈ，ｐＥＲＳ−Ｌ）を、ＳＤＣ＋ＷＵ培地（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製） ２０ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ（和光純薬工業社製）２０ｍｇ／Ｌ）で培養した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へそれぞれ形質転換（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ：ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）することにより、アンカータンパクであるα−アグルチニンを介して抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）（Ｆａｂ）を表層に提示した酵母を作製した（図１参照）。
【００１８】
（非特許文献１１） Ｓ．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ， Ｍ． Ｕｅｄａ 他６名 ”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ” Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ５５巻 ４７１−４７５頁 ２００１年
（実施例２） １ベクターでの抗体提示
実施例１で作製したベクター（ｐＣＡＳ−Ｈ、ｐＥＲＳ−Ｌ）を用いて、ｐＥＲＳ−ＬベクターにｐＣＡＳ−ＨのＨ鎖を導入することにより、１ベクターに抗体遺伝子のＨ鎖、Ｌ鎖を入れて酵母表層に抗Ｅ２抗体を提示させることを行った。まず、ｐＣＡＳ−Ｈ をテンプレートとして配列表の配列番号４３，４４を用いてＰＣＲ（９６℃／２分、９６℃／１分、６０℃／１５秒、７２℃／４分、２７サイクル、７２℃／４分）を行いＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）プロモーターからＨ鎖を含む形で増幅し、ゲルの切出し精製 （ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行った。その後、ＰＣＲ産物、ｐＥＲＳ−Ｌプラスミドをそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で処理し、ｐＥＲＳ−Ｌプラスミド をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｃ７５（タカラバイオ社製））で３７℃、１時間、脱リン酸化処理をした後、フェノール、クロロホルムで２回洗浄し、エタノール沈殿した。こうして調整した、ＰＣＲ産物とｐＥＲＳ−ＬプラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ（Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ：タカラバイ社製）し、その後大腸菌 （ＪＭ１０９：タカラバイオ社製）へ形質転換を行い、抗体遺伝子を二つ含んだｐＥＲＳ−ＨＬプラスミドベクターを作製した。大腸菌からプラスミド抽出（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＵＩＡＧＥＮ社製）を行い、得られたプラスミドを、ＳＤＣ＋ＷＵ（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製） ２０ｍｇ／Ｌ、Ｕｒａｃｉｌ（和光純薬工業社製）２０ｍｇ／Ｌ）培地で培養した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へ形質転換（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ ＹｅａｓｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩ ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）し１つのベクターで、アンカータンパクであるα−アグルチニンを介して抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）（Ｆａｂ）を表層に提示した酵母を作製した（図２参照）。
【００１９】
（実施例３） 表層提示抗体のＥＬＩＳＡによる確認
実施例１、２で作成した形質転換酵母はα−アグルチニンを介してＦＬＡＧ Ｔａｇ（アミノ酸配列５’−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−３’）をはさみ抗体（Ｂ０２９）を提示している。そこで、ＦＬＡＧ Ｔａｇ中の Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓに特異的な酵素ｒＥＫ（リコンビナントエンテロキナーゼ：タカラバイオ社製）を用いて選択培地（２ベクターの場合ＳＤＣ培地（ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ・Ｄ社製）６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ）、１ベクターの場合ＳＤＣ＋Ｗ（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （Ｂ／Ｄ社製） ６．７ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ（和光純薬工業社製）２０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｂ・Ｄ社製）２０ｇ／Ｌ、Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｎｕｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社製）２０ｍｇ／Ｌ）５ｍｌで１〜２日培養した形質転換酵母を３，０００ｒｐｍ ５ｍｉｎで遠心し、上清を捨て１ｍｌの滅菌水に懸濁する洗浄を３回行い、３００μｌの系で室温、１６時間処理することで、酵母表層から抗体分子を切り出した。この切り出した抗体が抗原に反応するかを調べるため、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡは、蛍光用９８穴プレート（ＮＵＮＣ社製）にａｎｔｉ−ＩｇＧ−（Ｆａｂ）２抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）１μｇ／ｍｌを１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、４℃で一晩置いた後、ＴＢＳで３回洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を３００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、３７℃で１ｈｏｕｒ置いた。その後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、ｒＥＫ処理をした溶液を３，０００ｒｐｍ ５ｍｉｎで遠心し上清を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き、３７℃で１ｈｏｕｒ置いた後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、Ｅ２−ＡＬＰ （Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ） （０．０８１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き３７℃で１ｈｏｕｒ置いた後、ＴＢＳＴで３回洗浄後、蛍光基質４ＭＵＰ（東ソー社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌで撒き３７℃で１ｈｏｕｒ置き、蛍光を測定した（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００：ＴＥＣＡＮ社製）。その結果、２つのベクターで形質転換した酵母、１ベクターで形質転換した酵母それぞれで、酵素処理をして切り出した抗体が抗原であるＥ２に反応することが確認できた（図３参照）。これにより抗Ｅ２抗体がＦＬＡＧ Ｔａｇをはさみ酵母表層に提示されていることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１で示した、抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を表層提示用ベクター（ｐＣＡＳ１、ｐＥＲＳ）にクローニングし、酵母へ形質転換するまでの概略図である。
【図２】実施例２で示した、ｐＥＲＳベクター１つで抗Ｅ２抗体（Ｂ０２９）を酵母表層へ提示するまでの概略図である。
【図３】実施例３で示した、形質転換した酵母をｒＥＫ（リコンビナントエンテロキナーゼ）で処理し酵母表層に抗体が提示されているかを調べるために行ったＥＬＩＳＡの結果であり、Ａは２ベクター系、Ｂは１ベクター系の結果であり、図中、Ｘ軸（横軸）はサンプルの希釈倍率を、Ｙ軸（縦軸）は４４７ｎｍにおける蛍光強度（任意の単位）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体を酵母の細胞壁に提示した形質転換酵母であって、前記抗体のＣ末端が酵母の細胞壁に結合可能なアンカー蛋白質のＮ末端に結合した融合蛋白質として発現され、前記形質転換酵母が前記融合蛋白質を発現し当該融合蛋白質のアンカードメインが細胞壁に結合され、前記抗体が前記形質転換酵母の細胞壁の外側に存在している、抗体提示酵母。
【請求項２】
１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体の遺伝子の一部をコードするＤＮＡを有し、酵母表層に提示するためのアンカータンパク質遺伝子を含んだ酵母用発現ベクターを、酵母に形質転換することにより、１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体を酵母細胞壁表層に提示させる、抗体提示酵母の作製方法。
【請求項１】
１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体を酵母の細胞壁に提示した形質転換酵母であって、前記抗体のＣ末端が酵母の細胞壁に結合可能なアンカー蛋白質のＮ末端に結合した融合蛋白質として発現され、前記形質転換酵母が前記融合蛋白質を発現し当該融合蛋白質のアンカードメインが細胞壁に結合され、前記抗体が前記形質転換酵母の細胞壁の外側に存在している、抗体提示酵母。
【請求項２】
１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体の遺伝子の一部をコードするＤＮＡを有し、酵母表層に提示するためのアンカータンパク質遺伝子を含んだ酵母用発現ベクターを、酵母に形質転換することにより、１７β−エストラジオールに特異的に結合する抗体を酵母細胞壁表層に提示させる、抗体提示酵母の作製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−３５５０８（Ｐ２０１０−３５５０８Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０３８５４（Ｐ２００８−２０３８５４）
【出願日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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