抗原−ノロウイルスＰドメインモノマーおよびダイマー、抗原−ノロウイルスＰ粒子分子、ならびにそれらの製造および使用法
Ｐドメインのみを有し、抗原−ノロウイルスＰドメインモノマーと称される置換ノロウイルスカプシドタンパク質モノマーは、分子クローニングによって各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入された外来抗原を含む。抗原−Ｐドメインモノマーは、集合して、２４個の抗原−Ｐドメインモノマーのコピーからなる、抗原−ノロウイルスＰ粒子と称される八面体形態を自然発生的に構築できる。各置換Ｐドメインモノマーは、各抗原−Ｐ粒子上の合計２４〜７２個の抗原コピーにつき、１〜３個の外来抗原のコピーを含む。抗原−Ｐ粒子は、外来ウイルス、例えばロタウイルスに感染した個体の診断、免疫および処置のための方法において有用であり、多くの感染症および非感染症に対する新規なワクチンの開発のための外来抗原提示用担体として利用できる。置換ノロウイルスＰ粒子は大腸菌および酵母において容易に製造でき、高度に安定であり、広範な物理化学的状態を許容する。修飾ノロウイルスＰドメインモノマーは、表面ループに候補外来抗原を簡便に挿入するためのユーザーフレンドリーなクローニングカセットを提供するために、Ｐドメインモノマーの３個のループの１個以上に挿入された１個以上の制限認識部位を含む。Ｐ粒子−ＶＰ８キメラはまた、ロタウイルスおよびノロウイルス両方に対するデュアルワクチンとしても利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
利害関係
本発明は、合衆国政府の支援の下になされ、National Institute of Health（NIH）、National Institute of Allergy and Infectious（認可番号R01 AI37093およびR01 AI055649）およびDepartment of Defense（認可番号PR033018）によってXi Jiangへと表彰された。この研究はUniversity of CincinnatiおよびCincinnati Children's Hospital Medical Center（Center for Clinical and Translational Science and TrainingからのＴ１助成金）によってMing Tanへも支援された。さらに、Ming TanへのNipert Foundationが出資する感染症助成金がこの研究に寄与した。合衆国政府は本発明についての一定の権利を保有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ノロウイルス（ＮＯＲ）カプシドタンパク質のＰドメインおよびＮＯＲ Ｐ粒子、抗原−ノロウイルスＰドメインモノマー、抗原−ノロウイルスＰドメインダイマーおよび抗原−ノロウイルスＰ粒子分子の製造、ならびに抗ウイルス剤、薬物送達系およびワクチン開発のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生体材料および生物工学は、現代医学の重要な部分となりつつある急速に成長している分野である。ウイルス性タンパク質ケージは、その万能性およびアレイを形成する傾向のため、提示系を構築するための理想的な基板である。遺伝子操作を通じて、自己集合性ウイルス構造タンパク質は、生体材料合成のための傑出したプラットフォームであり、そして設計されたパターンで外来分子を統合するためのスキャフォールドであり、これはワクチンまたは薬物として使用できる。
【０００４】
抗原提示のためにウイルス粒子を用いる最近の例は、Manayani et alに記載の、炭疽菌（Bacillus anthracis）の１８０アミノ酸抗原挿入を有するフロックハウスウイルス（ＦＨＶ）ＶＬＰのキメラである。組換えウイルス様粒子は、炭疽抗毒素として、かつ、炭疽菌ワクチンのための分子スキャフォールドとして機能し、炭疽抗毒素およびワクチンの機能を１個の化合物に組み合わせる。別の例は、Chatterji et al.に記載のCowpeaモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり、これは、エピトープ提示ならびにペプチドおよびタンパク質の付着のためのマトリックスとしての両方のための、Cowpeaモザイクウイルスの使用を含む。全タンパク質は、正二十面体のＣＰＭＶ粒子のコートタンパク質において遺伝的に操作されたリシンおよびシステイン残基と、化学的に架橋結合されている。また、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）の表面抗原（ＯｓｐＡ）を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）カプシド様粒子（ＣＬＰ）が記載されている。
【０００５】
ノロウイルス（ＮＯＲ）は、以前は「ノーウォーク様ウイルス」（ＮＬＶ）または小型球形ウイルスとして知られており、先進国および発展途上国の両方で生じる、伝染性急性胃腸炎の最も重要なウイルス性病原体である。これらの遺伝的に多様なウイルスは、２個の主要な遺伝子グループ（ＧＩおよびＧＩＩ）ならびに約３０個の遺伝子型を含む。ＮＯＲはカリシウイルス科（Caliciviridae）に属し、正二十面体の一本鎖のポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、そのカプシドは１個の主要構造タンパク質の１８０個のコピーからなる。
【０００６】
過去、ヒトＮＯＲの生物学的特徴付けは、該ウイルスが細胞培養では効率的に増殖せず、ウイルス複製のための好適な動物モデルが構築されなかったために、妨害されていた。発生およびヒトボランティア試験から得られたヒト糞便サンプルが唯一のウイルス源であったが、糞便中のウイルス濃度は、通常の電子顕微鏡によるウイルス検出が不可能であったほど低い。しかし、近年の昆虫細胞中のバキュロウイルス（主として昆虫に感染する二本鎖ＤＮＡウイルス）によるＮＯＲカプシドタンパク質発現の成功が、ＮＯＲの免疫学、疫学および発症機序の研究のための有用な別法を提供している。ウイルスカプシドタンパク質モノマーは、自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作り出す。これらのＶＬＰは形態学的および抗原的にヒト糞便において見られる真菌とは区別不可能であり、免疫学的アッセイの開発およびレセプター−ウイルス相互作用の研究に有用なツールを提供する。
【０００７】
組換えＮＯＲカプシドタンパク質の原子構造は、それがＴ＝３正二十面体を形成する９０個のダイマーカプソメアに組織された１８０個のカプシドタンパク質モノマーを含むことを示している。低温電子顕微鏡およびＸ線結晶学からのデータは、該ウイルスカプシドタンパク質が２個の主要なドメイン、Ｎ末端シェル（Ｓ）ドメインおよびＣ末端突起（Ｐ）ドメインに折り畳まれることを示した。Ｓドメインは内部のシェルを形成し、一方でＰドメインは、シェルから伸長もしくは突出するアーチ様構造を構築する。形態形成の研究により、Ｓドメインがカプシドの内部シェルの構築に必要な要素を含むが、Ｐドメインのダイマーサブユニット間の分子間接触がカプシドの安定性を増加することが示された。これら２個のドメインは、８〜１０残基（アミノ酸）のヒンジを介して結合している。ＰドメインはさらにＰ１およびＰ２ドメインに分けられ、後者はカプシドの最も外側表面に位置する。ＳおよびＰ１ドメインとは異なって、Ｐ２ドメインは高い配列バリエーションを有する。Ｐドメインはウイルス粒子の最も外側表面に位置し、最も変化しうる配列を有するため、Ｐドメインが宿主相互作用、免疫認識、レセプター結合および免疫応答に関与すると考えられている。ヒンジを有する（しかしＳドメインを欠く）単離されたＰドメインが、ヒト組織−血液グループ抗原（ＨＢＧＡ）レセプターの構築を維持するダイマーをインビトロで形成することが示されている。
【０００８】
ＨＢＧＡは、複合グリカンと関連糖の異種グループである。ＮＯＲは多様な、株特異的な手法で、ヒトＨＢＧＡをレセプターとして認識する。ＨＢＧＡの中で、最も一般に遭遇する血液グループはＡＢＯ（ＡＢＨ）およびLewisである。ＡＢＨおよびLewis血液グループ系において抗原の形成に使用される生合成経路は、相互に関連している。
【０００９】
ヒトＨＢＧＡは赤血球および血管内皮細胞を含む多くの細胞タイプ、ならびに消化器、尿生殖器および呼吸管の粘膜上皮に存在する。それらはまた、血液、唾液、消化器内容物および乳のような生物学的液体中で可溶形態でも存在しうる。ＨＢＧＡは遺伝子的に制御され、ＡＢＯ、Lewisおよび分泌遺伝子ファミリーとして知られる一組のグリコシルトランスフェラーゼを介して、単糖ユニットの段階的添加によって、一連の前駆体構造から合成される。
【００１０】
ヒトＨＢＧＡ系は高度に多形性であり、サイレントアレルを含む複数の遺伝子ファミリーによって制御される。細胞表面上でのＨＢＧＡのような多様化した分子の存在は、外部環境変化に対する宿主防御メカニズムの可能性を示す。それにもかかわらず、ＨＢＧＡは多様な細菌性およびウイルス性病原体による感染と関連しており、ノロウイルスの「ドッキングステーション」を提供しうる。すなわち、ＨＢＧＡは病原体にとっての認識標的であり、抗原とのレセプターリガンド結合を発現または形成する細胞への侵入を促進しうる。かかる相互作用の正確な性質は未だ知られていないが、生じる病原体と抗原構築との密接な関連は、感染プロセスにおける最初のステップとして、細胞への病原体の係留に重要な役割を果たしうる。
【００１１】
ＮＯＲによるヒトＨＢＧＡの認識は典型的なタンパク質−糖相互作用であり、ここで、ウイルスカプシドタンパク質の突起ドメインは、様々な株において広い多様性を有するＨＢＧＡ抗原のオリゴ糖側鎖による界面を形成する。腸管内でのみ複製可能な病原体として、ＮＯＲは、宿主防御系を克服するユニークな戦略を開発している。これは、なぜＮＯＲ関連疾患が世界中のあらゆる集団で一般的であり拡がっているかを説明する、それらの遺伝的および構造的バリエーションによって示されている。
【００１２】
２００３年１２月２日に公開されたＰＣＴ公開公報US2003/101176（その全体について参照により本明細書に組み込む）は、複数の異なる組織−血液グループパターンの一つにおけるＮＯＲ株とＡＢＯおよびLewisＨＢＧＡの結合に関する。ＮＯＲによるＨＢＧＡの認識は株特異的であり、多数の異なるＨＢＧＡ結合パターンが同定されている。ＮＯＲの多様性および宿主細胞表面における糖の多形性に基づいて、より多くの結合パターンが発見されうる。
【００１３】
２００６年１２月２８日に公開されたＰＣＴ公開公報US2006/138,514（その全体について参照により本明細書に組み込む）は、ＨＢＧＡとの向上した結合親和性を示す、Ｐ粒子として知られる小さな粒子に関する。Ｐ粒子は、１２個の同一のＰドメインダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーによって構築されるＴ＝１正二十面体である。１２個（Ｐドメインダイマー）および２４個（Ｐドメインモノマー）は、植物および動物ウイルスについて頻繁に生じる正二十面体シンメトリーについての完全単位数である。単離された、モノマーカプシドタンパク質のＳドメインまたはヒンジを含まないＰドメインは、１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーからなる複合体である、Ｔ＝１正二十面体Ｐ粒子を自然発生的に形成できる。Ｐ粒子は対応するＨＢＧＡと結合でき、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡとの結合の強い遮断を示す。Ｐ粒子の自然発生的形成は、ＶＡ３８７、ＭＯＨおよびノーウォークウイルス（ＮＶ）を含む多様なＮＯＲ株で観察されている。ＮＯＲ Ｐ粒子は、ＮＯＲ感染の治療処置およびＮＯＲ感染に対するワクチンの作製において有用である。
【００１４】
ロタウイルス（ＲＶ）およびＮＯＲはいずれも、疾患の大きな負担を招く世界中で一般的な病原体である。世界基準で、５歳未満の小児において毎年、全原因の胃腸炎が最大10億事象生じており、その１３〜２５％（〜1億3000万事象）がＲＶによって引き起こされる。ＲＶは、小児の様々な下痢および脱水の主たる原因であり、毎年重度のＲＶ胃腸炎によって35万〜60万人の５歳未満の小児が死亡している。それはまた、年間200万人の小児の入院に寄与しており、その費用は10億ドルを超えると予測される。他方、ＮＯＲはあらゆる年齢の個体が罹患する急性胃腸炎の非細菌性流行の最も重要な原因である。ＮＯＲは極めて接触感染性であり、急速に拡大して多様な状況で大流行を導く。近年の報告では、発展途上国においてＮＯＲは、毎年５歳未満の小児における1,091,000件の入院および218,000人の死亡を引き起こしていると予測された。米国において、食品媒介性病原体は、毎年推定7600万人に感染しており、325,000件の入院の原因である。ＮＯＲは単独で、臨床治療およびリコールされた食品による損失のために、毎年3億5000万〜7億5000万ドルの損害を引き起こしている。
【００１５】
２種の新たなＲＶワクチン（Rotarix(商標), GlaxoSmithKline および RotaTeq(登録商標), Merck）が近年導入されているが、これらのワクチンに関する十分に解決されていない次のような様々な問題が存在する：ａ）ワクチンにおいて見られるものよりも広い範囲のＲＶ血清型にワクチン接種およびワクチン非接種小児が曝露された際の有効性；ｂ）ワクチンが最も必要とされる貧困国にこれらのワクチンをどのように分配するかという問題を導く、ワクチンのコストおよび分配コスト；ならびにｃ）死亡率が最も高い発展途上国における保護のレベル。これらの弱毒化生ワクチンは、復帰し、最集合して、毒性株を生じる可能性がある。したがって、極めて有効なＲＶ中和エピトープを含む、新世代のサブユニットワクチンが必要とされている。現在、ＮＯＲ関連疾患に対する処置は存在しない。したがって、ＮＯＲおよびＲＶに対して有効なワクチン、特に両方に対して保護ができる単一のワクチンの開発は、主要な臨床的必要を充足し、さらに本明細書に記載のＰ粒子ワクチンプラットフォームの顕著な販売潜在力を強調する。
【００１６】
ＮＯＲ感染の治療処置およびそれに対するワクチン開発における進歩にもかかわらず、他のウイルスタイプによって引き起こされる感染の同定の改善、他のウイルスタイプの治療処置、他のウイルスタイプに対するワクチン開発、ならびに特定の組織または臓器を標的とする改善された薬物送達系を開発する必要がなおも存在する。
【発明の概要】
【００１７】
発明の概要
本発明は、ＮＯＲ Ｐドメインモノマーの遠位部分が外来抗原、特に外来ウイルス性抗原を挿入できるペプチド鎖を含むという発見に関する。得られる抗原−Ｐドメインモノマーは、１２個のダイマーに組織される２４個の抗原−Ｐドメインモノマーからなる、典型的には八面体形態の、抗原−Ｐ粒子と称される、ナノ粒子に自然発生的に集合しうる。このＰ粒子は大腸菌において容易に製造され、極めて安定であり、免疫原性が高い。Ｐドメインモノマーあたり３個の表面ループが存在し、これは粒子あたり合計７２個のループとなり、免疫増進のための外来抗原提示の潜在的部位である。抗原−Ｐ粒子は自然発生的に形成され、そしてＰドメインモノマーの遠位部分で提示される外来抗原を有する。この抗原−Ｐ粒子形成プロセスは、抗原−Ｐダイマーの濃度に基づいて交換し、または動的に平衡化しうる。抗原−Ｐ粒子は、外来ウイルス性抗原に対する抗体を産生し、またかかる外来ウイルス感染のためのワクチンを作製するために有用である。
【００１８】
本発明の第一の局面は、多様な感染性病原体の抗原を提示するためのプラットフォームとして使用するための修飾ＮＯＲ Ｐ粒子に関し、したがってこれらの疾患に対する新たなワクチン戦略を提供する。このプラットフォームはまた、ワクチンの開発のため、あるいはがん、アレルギーおよび自己免疫疾患を含む非感染性疾患の処置のための、薬物の担体または薬物送達ビークルとしても有用である。多数の他のワクチンプラットフォームと比較して、本抗原−Ｐ粒子系は、単純な精製手法に伴う高収率および低製造コスト、ならびに高い抗原提示効率を含む多くの利点を有する。
【００１９】
本発明の抗原−Ｐ粒子は、ＮＯＲカプシドの突起（Ｐ）ドメインによって形成され、ダイマーに組織されるＰドメインモノマーの２４個のコピーを含む。抗原−Ｐ粒子の分子量およびサイズ（ＭＷ＝約８３０ｋＤａおよびΦ＝２０ｎｍ）は、サブユニットワクチンとして有効なサイズである。外来抗原は各Ｐドメインモノマーに存在する３個の表面ループの１個以上に挿入され、それによって各抗原−Ｐ粒子の表面で、外来抗原の７２個までのコピーを提示する。１個の抗原−Ｐ粒子上の外来抗原の多重性は、外来抗原の抗原性および免疫原性を大きく向上させる。小さなポリペプチドから大きなタンパク質まで多様なタイプおよびサイズの外来抗原が３個の表面ループのいずれか１個以上に挿入されてよく、外来抗原の代表例としては次のものを含む：Ｈｉｓタグ（７個のヒスチジン）、マウスサイトメガロウイルスのＴ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属のＥｐｉ８抗原（１０アミノ酸）、ロタウイルス（ＲＶ）のＶＰ８（１５９アミノ酸）および緑色蛍光タンパク質（２３８アミノ酸）。
【００２０】
ＮＯＲ Ｐ粒子は、極めて安定であり、広範な物理化学的条件に耐性である。最も重要なことに、製造のために真核細胞系を必要とする多くの他の組換えサブユニットワクチンとは異なって、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子同様、抗原−Ｐ粒子は、大腸菌および酵母または他の細菌源において、極めて高い収率および単純な精製手段で容易に製造できる。
【００２１】
本発明の第二の局面は、簡便なクローニングカセットの挿入によって、各Ｐドメインモノマー上に存在する表面ループの１個以上に候補外来抗原を挿入するためのユーザーフレンドリーな方法である。クローニングカセットは、典型的には、Ｐドメインベクターの１個以上のループに、制限部位または制限認識部位としても知られる特異的認識ヌクレオチド配列の１個以上、典型的には少なくとも１個の対を含む。制限部位は制限酵素によって認識される特異的なヌクレオチド配列である。該部位は一般にパリンドロームであり（制限酵素は通常ホモダイマーとして結合するため）、特定の制限酵素は典型的には、その認識部位内またはその近くのどこかの２個のヌクレオチド間の特定のＤＮＡ配列を切断する。例えば、一般的な制限酵素ＥｃｏＲＩは、パリンドローム配列ＧＡＡＴＴＣを認識し、ＤＮＡ鎖の上下両方のＧとＡの間を切断し、各末端にオーバーハング（結合した相補鎖のないＤＮＡ鎖の末端部分）を残す。次いでこのオーバーハングまたは「付着末端」は、相補的オーバーハングを有するＤＮＡ片（例えばＤＮＡの他のＥｃｏＲＩ切断断片）を加えまたはライゲート（ＤＮＡリガーゼを介して）するために使用できる。各Ｐドメインモノマー上に存在する表面ループの１個以上における制限部位を使用することで、表面ループのいずれか１個以上にクローニングカセットに含まれる外来遺伝子を置換でき、またＰドメインモノマーの３個のループの異なる一つに、２個以上の異なる外来抗原または他のクローニングカセットを置換できる。
【００２２】
本発明の別の局面は、１２個のダイマーの対として、２４個のＰドメインモノマーの自然発生的集合による、抗原−Ｐ粒子の形成である。全てのＰドメインモノマーが同一である場合、抗原−Ｐ粒子は同種Ｐ粒子と呼ばれる。
【００２３】
本発明の別の局面は、２個以上の異なって修飾された抗原−Ｐドメインモノマー、または少なくとも１個の種々に修飾された抗原−Ｐドメインモノマーおよび野生型Ｐドメインモノマーを含む、異種抗原−Ｐ粒子の形成である。種々に修飾された抗原−Ｐドメインモノマーまたは野生型Ｐドメインモノマーは、広範な抗原−Ｐ粒子を得るために、任意の比（分子量または重量比）で使用できる。
【００２４】
本発明の別の局面は、ウイルスに対する免疫保護を与えるための候補ワクチンとしての、Ｐ粒子内の各Ｐドメインモノマーの表面ループの少なくとも１個に挿入された特異的ウイルス性抗原、例えばロタウイルス（ＲＶ）抗原を有する、抗原−Ｐ粒子の使用である。
【００２５】
本発明の別の局面は、ウイルス性疾患からヒトを保護する方法であって、滅菌、非毒性の薬学的に許容される担体中の、本明細書に記載のＰ粒子内のＰドメインモノマーの表面ループの少なくとも１個に挿入された特異的ウイルス性抗原を有する抗原−Ｐ粒子の免疫量をヒトに投与することを含み、ここで前記抗原がウイルス性抗原である、方法に関する。
【００２６】
本発明の別の局面は、ウイルス性疾患に対する個体の免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載の抗原−Ｐ粒子および医薬担体を含む組成物の少なくとも１個の免疫学的有効量を個体に経口または非経口投与する工程を含み、ここで前記抗原がウイルス性抗原であり、量が個体の免疫応答を誘導するのに有効である、方法に関する。
【００２７】
本発明の別の局面は、抗原−Ｐ粒子ベクター／ワクチンプラットフォームキットである。
【００２８】
本発明の別の局面は、Ｐドメインモノマーの１個以上の完全に露出したループのクローニングカセットへの、固有または稀少な制限部位を含む制限部位の導入に関する。制限部位を含むクローニングカセットの挿入に関して、ループのクローニングカセットへのプロテアーゼ認識配列の挿入を避けることが推奨される。例えば、ＢｇＩＩＩ部位（ＡＧＡＴＣＴ）は、典型的なトリプシン切断部位であるジアミノ酸制限部位をコードし、避けられるべきである。
【００２９】
本発明の別の局面は、最適にある外来抗原を適合させるために、ループの露出を伸長するスペーサーまたはアームを加えることを含む、ループの１個以上の修飾に関する。
【００３０】
本発明の別の局面は、ＲＶ ＶＰ８のような大きな抗原がより小さな外来抗原を有する隣のループを、このループにおける小さなエピトープの提示が困難となるように覆わないように、異なる抗原が複数挿入されている設計に関する。
【００３１】
本発明の別の局面は、遠位表面の１個以上に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有する置換Ｐ粒子がもたらされる、Ｐドメインモノマーの表面ループの１個以上へのリガンドまたはシグナルペプチドの挿入に関する。このリガンドまたはシグナルペプチドは、次いで、特定の臓器または組織の対応するレセプターに置換Ｐ粒子を標的化し、それらの位置に移動させられる。例えば、ペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸）を有する置換Ｐ粒子は、ＣＮＧＲＣのレセプター（ＣＤ１３）が高度に発現している腫瘍組織（すなわち癌）に移動できる。
【００３２】
本発明の別の局面は、化学反応によって表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されている薬物のコンジュゲートを有する、置換Ｐ粒子モノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子に関する。この場合、置換Ｐ粒子は薬物の担体として使用される。
【００３３】
本発明の別の局面は、表面ループの少なくとも１個に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有し、そして表面ループの少なくとも１個に挿入された薬物のコンジュゲートを有する、置換Ｐモノマーならびにそれから形成されたダイマーおよびＰ粒子に関する。
【００３４】
本発明の別の局面は、修飾または抗原−Ｐドメインモノマーの修飾された遺伝子コードの遺伝子配列である。
【００３５】
本発明の別の局面は、修飾または抗原−Ｐドメインモノマーの修飾された遺伝子コードを有する複製生物学的物体（例えば大腸菌）である。
【００３６】
本発明の性質および利点は、本明細書に記載の、そして添付の特許請求の範囲によってより具体的に定義されている意図する新規構成、組合せおよび要素を示す下記図面および詳細な説明からより十分に理解されるが、先行技術によって除外されない限り、本発明の正確な態様における変化が特許請求の範囲に含まれることを意味すると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのＣｒｙｏ−ＥＭ構造を示す。（Ａ）野生型Ｐ粒子。（Ｂ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラ。野生型Ｐ粒子と比較して、キメラは、中央にニックを伴う伸長された突起を示し、これはＰ２サブドメインと挿入されたＶＰ８抗原との間の境界を示唆する。（Ａ）および（Ｂ）における粒子の半径は、示したとおり異なるカラースキームによって示される。（Ｃ）ロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原の２つのコピーの結晶構造（模式図、緑および青）の、キメラの伸長された突起の密度マップ（透明なグレー）への重ね合わせであり、キメラＰ粒子上でのＶＰ８抗原の露出が確認される。（Ｄ〜Ｅ）Ｐ粒子−ＶＰ８の突起を拡大した側面図（Ｄ）および上面図（Ｅ）。
【図２】ＮＯＲカプシドおよびカプシドタンパク質（ＶＰ１）を示す。ＡおよびＢは、ノーウォークウイルス様粒子（ＮＯＲ ＶＬＰ）の表面構造（Ａ）および断面（Ｂ）を示す。ＣはＶＬＰの基本単位であるＶＰ１のダイマー（リボンモデル）を示す。各ＶＰ１は、Ｎ末端アーム（緑）、シェル（Ｓ）ドメイン（黄色）および突起（Ｐ）ドメインに分けられる。Ｐドメインはさらに、Ｐ１およびＰ２サブドメイン（それぞれ赤および青）に分けられ、Ｐ２はＶＬＰの最も外側の表面に存在する。ＶＰ１の直線構造を同じカラーテーマでＤに示す。
【００３８】
【図３】ＮＯＲ Ｐ粒子およびその表面ループの構造を示す。（Ａ）はｃｒｙｏ−ＥＭによって再構成されたノロウイルスＰ粒子の構造を示し、（Ｂ）は結晶構造（リボンモデル）において解明された、Ｐダイマーの最も外側の領域であるその突起の一つを示し、ダイマーの６個の表面ループを示している。赤−緑および青−黄色は、それぞれ２個のＰドメインを示す。抗原挿入に好適な部位である各モノマーの３個の表面ループが示されている。２個のＰドメインモノマーは安定なグローバルＰダイマーを形成する。次いで、１２個の同一のＰダイマーが集合して、Ｐダイマーの濃度に依存して動力学的に交換および／または平衡するＴ＝１正二十面体Ｐ粒子となる。Ｐドメイン間の分子内相互作用がＰ粒子形成の原動力である。末端結合システインは、分子内ジスルフィド結合を形成してＰ粒子を安定化できる。
【００３９】
【図４】ＮＯＲ Ｐダイマー−Ｂ−トリサッカライド複合体の結晶構造を示す。トリサッカライド（ウイルス性レセプター）は、リボンモデル中に存在するアーチ様Ｐダイマーの上部に、球で存在する。
【００４０】
【図５】ＮＯＲ Ｐ粒子が野生型ＮＯＲ ＶＬＰと同様の免疫原性および免疫反応性を有することを示す。Ａにおいて、ＮＯＲ株ＶＡ３８７のＰ粒子によって誘導される過免疫抗体が、ＶＬＰ誘導性抗体と同様の力価でＶＬＰと反応した。ＶＬＰ−（Ｂ）およびＰ粒子−（Ｃ）誘導性抗体は、ＮＯＲ ＶＬＰとタイプＡ ＨＢＧＡレセプターとの結合に対して同様の遮断効果を示した。
【００４１】
【図６】ｃｒｙｏ−ＥＭによる小Ｐ粒子の３Ｄ構造再構成を示す。ＡおよびＢは小Ｐ粒子の側面図および上面図を示し、Ｃは小Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせを示す。
【００４２】
【図７】Ｐ粒子形成および安定性の妥協なしに完全に露出される、Ｐ粒子のループ２での７ｘＨｉｓタグの露出を示す。（Ａ）は７ｘＨｉｓタグを有するＰ粒子がＴａｌｏｎ樹脂に良好に結合することを示す。ＧＳＴ−Ｐドメイン−Ｈｉｓタグ融合タンパク質はトロンビンによって消化されて、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＰ−Ｈｉｓタグ）、ＧＳＴおよび他の共に精製されたタンパク質の混合物をもたらした。共に精製されたタンパク質と７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子（ロード前）をＴａｌｏｎ樹脂と共にインキュベートした。７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子全ておよびわずかな共に精製されたタンパク質は、樹脂に結合した（フロースルー）。洗浄した後、結合した７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子をイミダゾールで樹脂から溶出した（溶出１および２）。マーカーは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドを有する予め染色したタンパク質標準であった。（Ｂ）において、（Ａ）の溶出のゲルろ過分析は、溶出した７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子の＞９８％がＰ粒子を形成したことを示した。
【００４３】
【図８】露出したＲＶ ＶＰ８を有するＮＯＲ Ｐ粒子を示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥのパネルＡは、アフィニティーカラム（レーン１）およびさらにＰ粒子（レーン２）およびＰドメインダイマー（レーン３）フラクションでのゲルろ過によって精製された、組換えＲＶ ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（５３．５ｋＤａ）を示す。パネルＢおよびＣは、ＶＰ８（パネルＢ、レーン４および５）またはＮＯＲ ＶＬＰ（パネルＣ、レーン６および７）に対する抗体を用いた、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのウェスタン分析を示す。パネルＤにおいて、アフィニティー精製ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（レーン１）のゲルろ過は、該タンパク質の大部分がＰ粒子（〜１３００ｋＤａ）を形成することを示す。パネルＥは、被覆ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（赤、ＰＰ−ｈＶＰ８Ｃ）、組換えＶＰ８（青、ｈＶＰ８Ｃ）およびＰ粒子のみ（緑、ＰＰ、コントロール）を検出するためにＶＰ８に対する抗体を用いた、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の結果を示す。レーンＭは、上から１１３、９２、５２、３５、２９ｋＤａのバンドで、予め染色したタンパク質マーカーを示す。
【００４４】
【図９】ループ２上にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクターを示す。Ｐ粒子の最も外側の結晶構造（リボンモデル）は、３個の表面ループの表示を有する図の下半分に示し、Ｐ粒子ベクターのクローニングカセットの詳細は、図の上半分に示す。
【００４５】
【図１０】ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラの製造を示す。ループ２にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクター（Ａ）は野生型ＮＯＲ Ｐ粒子（Ｂ）を製造する。ＲＶ ＶＰ８コード配列（Ｃ）がＰ粒子ベクター（Ｄ）にクローン化されると、それはキメラの最も外側表面でのＲＶ ＶＰ８の指標と共に、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（Ｅ）を製造する。
【００４６】
【図１１】ＶＰ８−Ｐ粒子キメラによって誘導された抗体が、ＮＯＲおよびＲＶの両方に反応性であり、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合の遮断を示した。グラフＡは、それぞれＰ粒子およびＲＶ ＶＰ８に対する抗体の反応性を示す。グラフＢは、該抗体がＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断することを示す。Ｘ軸は抗血清の希釈（倍率）を示す。
【００４７】
【図１２】Ｐ粒子ベクター、Ｐ粒子プラットフォームおよびキメラＰ粒子ワクチンの構築のフローチャートを示す。ＧＳＴ、ＰドメインおよびＣは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子、ＮＯＲ Ｐドメインおよびシステイン含有短ペプチドをそれぞれコードする配列を示す。両末端の太線は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のプラスミドを示す。
【００４８】
【図１３】Ｐ粒子ベクターのデザインを示す。３個の表面ループの指標と共にＰ粒子の最も外側部分の結晶構造を、図の下側に示す。各表面ループで異なる制限酵素認識部位を含むクローニングカセットを有するＰ粒子ベクターの一つの代表的なデザイン選択肢を、図の上側部分に示す。
【図１４】Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの製造および分析を示す。（Ａ）Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの発現構築物。ＨｉｓタグはＮ３７２とＤ３７４の間のループ２に挿入した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１は、ＧＳＴ遺伝子融合システムの発現ベクターである。丸で囲んだＣは、システイン含有ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を示す。（Ｂ）結晶構造（模式図）においてＰ粒子の突起の遠位末端は、挿入されたＨｉｓタグが位置すると予測される、２個のＮ３７３の位置を示す（グレーおよびシアンのドットモデル）。（Ｃ）Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの発現および精製。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、ＧＳＴ−Ｐドメイン−Ｈｉｓタグ融合タンパク質（ＧＳＴ融合体）が〜５２ｋＤａであることを示した。トロンビンによる溶液中での融合タンパク質の消化は、ＧＳＴ（〜２７ｋＤａ）およびＰドメイン−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＤ−Ｈｉｓタグ）（〜３５ｋＤａ、左パネル）をもたらした。ＰドメインＨｉｓタグキメラは、トロンビン消化によって精製樹脂からも放出されうる（右パネル）。Ｍは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドで、予め染色したタンパク質マーカーである。（Ｄ）サイズ排除カラムＳｐｅｒｄｅｘ ２００を用いたトロンビン放出Ｐドメイン−Ｈｉｓタグタンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出曲線。３つの主要ピークはそれぞれ、空、Ｐ粒子−ＨｉｓタグおよびＰダイマー−Ｈｉｓタグを示した。これらの３つのピークのサイズは、それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、空）、野生型Ｐ粒子（〜８３０ｋＤａ）および野生型Ｐダイマー（〜７０ｋＤａ）でキャリブレートした。（Ｅ）ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｄ）のフラクションをＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。
【００４９】
【図１５】Ｐ粒子提示短ペプチドに対するマウスの反応を示す。（Ａ）それぞれ等量のＰ粒子−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＰ−Ｈｉｓ、青）、Ｐダイマー−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＤ−Ｈｉｓ、紫）または野生型Ｐ粒子（ＷＴ ＰＰ、コントロール、黒）で免疫した後、ＥＩＡにおけるT. Maritimaの組換えＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応性（ｎ＝５）。（Ｂ）（Ａ）における血清の抗体力価を終点希釈アプローチによって測定した。（Ｃ）〜（Ｆ）Ｐ粒子の非露出短ペプチドに対するマウスの抗体反応。（Ｃ）埋め込みペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むＰ粒子（ＰＰ−ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）で免疫した後の、ＥＩＡにおける、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣタグ化マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（to CDCRGDCFC、紫）および野生型Ｐ粒子（to WT PP、ポジティブコントロール、緑）に対するマウス血清の免疫反応性（ｎ＝５）。（Ａ）（PP-His to His-tag、青）が比較のために含まれた場合の、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグで免疫した後の、T. MaritimaのＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応。（Ｄ）終点希釈アプローチによって、（Ｃ）における血清の抗体力価を測定した。（Ｅ）埋め込みペプチドＣＮＧＲＣを含むＰ粒子で免疫した後、ＣＮＧＲＣタグ化ＭＢＰ（to CNGRC、紫）および野生型Ｐ粒子（to WT PP、ポジティブコントロール、緑）に対するマウス血清の免疫反応性。Ｐ粒子−Ｈｉｓタグで免疫した後の、（Ａ）（ＰＰ−Ｈｉｓ、青）のT. MaritimaのＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応性を比較のために加えた。（Ｆ）終点希釈アプローチによって、（Ｅ）における血清の抗体力価を測定した。ＥＩＡアッセイのために、５ｎｇ／μｌの異なる抗原［（Ａ）および（Ｂ）についてＨｉｓタグ化αフコシダーゼ、（Ｃ）および（Ｄ）についてＣＤＣＲＧＤＣＦＣタグ化ＭＢＰ、（Ｅ）および（Ｆ）についてＣＮＧＲＣタグ化ＭＢＰ、ならびに（Ｃ）〜（Ｆ）について野生型Ｐ粒子］をマイクロタイタープレートに被覆した。指定の希釈での対応する血清を用いて、免疫反応性を測定した。＊Ｐ＜０．０５。
【００５０】
【図１６】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの製造および分析を示す。（Ａ）Ｐドメインコード化ｃＤＮＡ配列を含むベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１に基づく、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの発現構築物。酵素部位Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩを有するクローニングカセットのＴ３６８とＬ３７５との間のＰドメインのループ２中に、ロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原を挿入した。丸で囲んだＣはシステイン含有ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を示す。（Ｂ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの発現および精製。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、ＧＳＴ−Ｐ−ＶＰ８融合タンパク質（ＧＳＴ融合体）が〜８０ｋＤａであることを示した（左パネル）。トロンビンによる融合タンパク質の消化は、ＧＳＴ（〜２７ｋＤａ）およびＰ−ＶＰ８キメラ（〜５２ｋＤａ、中央パネル）をもたらした。遊離Ｐ−ＶＰ８キメラは、トロンビン消化によって精製ビーズからも放出されうる（右パネル）。レーンＭは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドで、予め染色したタンパク質マーカーであった。（Ｃ）サイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００によるトロンビン放出Ｐ−ＶＰ８タンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出曲線。ピークフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を上に示す。それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、空）、野生型Ｐ粒子（〜８３０ｋＤａ）および野生型Ｐダイマー（〜７０ｋＤａ）でカラムをキャリブレートした。空のそばの単一主要ピークは、ほぼ全てのＰ−ＶＰ８タンパク質がキメラＰ粒子を形成したことを示す。（Ｄ）Ｐ−ＶＰ８タンパク質（左パネル）は、ロタウイルスＶＰ８（中央パネル）およびノロウイルスＶＬＰ（右パネル）に対する抗体と反応した。
【００５１】
【図１７】Ｐ粒子提示ＶＰ８に対するマウスの免疫応答を示す。等モル量のＰ粒子−ＶＰ８キメラおよび遊離ＶＰ８を用いて、アジュバントなしで鼻腔内（ＡおよびＢ、ｎ＝５〜７）またはフロイントアジュバントと共に皮下（Ｃ、ｎ＝６〜７）で、マウスを免疫した。遊離ＶＰ８およびＧＳＴをＥＩＡにおける抗体力価測定のための抗原として使用した。（ＡおよびＢ）ＷａのＶＰ８（Ａ）およびＤＳ１（Ｂ）それぞれを含む遊離ＶＰ８抗原（遊離ＶＰ８）およびキメラＰ粒子（ＰＰ−ＶＰ８）で免疫した後の、ＶＰ８／ＧＳＴに対するマウス血清の抗体力価。（Ｃ）遊離ＶＰ８抗原（遊離ＶＰ８）、およびＷａ株のＶＰ８を含むキメラＰ粒子（ＰＰ−ＶＰ８）で免疫した後の、ＶＰ８に対する抗体力価。共精製したＧＳＴは内部コントロールとして利用した。＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５２】
【図１８】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラでの免疫によって誘導されるマウス血清による、ロタウイルスの中和を示す。（Ａ）アジュバントなしでＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ、［Ｐ］８）キメラで鼻腔内免疫したマウス由来のマウス血清は、同じＷａ株（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）の強い中和を示すが、遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清は顕著に低い中和を示す（ＶＰ８血清、黒）。抗原を投与されていないマウス由来の血清をネガティブコントロールとして用いた（コントロール血清、紫）。（Ｂ）Ｐ粒子ＶＰ８（ＤＳ１、［Ｐ］４）キメラで免疫したマウス由来の血清は、Ｗａとの弱い交差中和を示し（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）、一方でＤＳ１の遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清（ＶＰ８血清）およびネガティブコントロール血清は、中和を示さなかった（黒および紫）。（Ｃ）遊離Ｗａ ＶＰ８（ＶＰ８血清、黒）およびＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラ（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）でフロイントアジュバントと共に皮下免疫したマウス由来の血清のＶＰ８に対する免疫反応性。抗原なしでの血清は、ネガティブコントロールとして用いる（コントロール血清、紫）。（Ｄ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラによるマウスの免疫によって誘導される（Ｃ）由来の血清（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）は、遊離ＶＰ８による免疫によって誘導される血清（ＶＰ８血清、黒）のものよりも、顕著に高いロタウイルス（Ｗａ）に対する中和力価を示した。抗原を投与されていないマウス由来のコントロール血清をネガティブコントロールとして用いた（コントロール血清、紫）。星印は２つの形態のＶＰ８によって誘導される血清の中和間のＰ値を示す：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【００５３】
【図１９】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラワクチンでマウスを免疫した後の、マウスロタウイルス感染に対する保護を示す。４種の異なるワクチンでワクチン接種後、マウスのロタウイルス排出（μｇ／ｍｌ）を測定し、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）でチャレンジした。ＷＴ ＰＰでは、野生型ノロウイルスＰ粒子（ベクターコントロール）をマウスにワクチン接種した（ｎ＝７）。ＰＰ−ｈＶＰ８では、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラをマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。遊離ｍＶＰ８では、遊離マウスＶＰ８（ＥＤＩＭ）抗原をマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。ＰＰ−ｍＶＰ８では、Ｐ粒子−ＶＰ８（ＥＤＩＭ）キメラをマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。データ計算および統計分析は表１に示す。
【００５４】
【図２０】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラでの免疫によって誘導された抗体が、ノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断することを示す。（Ａ）Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラで免疫した後のマウス血清は、ノロウイルスＰ粒子と強く反応したが（ＰＰ−ＶＰ８）、遊離ＶＰ８誘導血清は、この反応性を示さなかった（遊離ＶＰ８）。（Ｂ）（Ａ）由来のマウス血清はノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断したが（タイプＡ唾液、ＰＰ−ＶＰ８血清、青）、遊離ＶＰ８での免疫後に得られた血清は、この遮断を示さなかった（ＶＰ８血清、黒）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本明細書において使用するとき、用語「ノロウイルス」、「ＮＯＲ」、「ノーウォーク様ウイルス」または「ＮＬＶ」は、ノロウイルスファミリーの任意のウイルスを意味し、限定されないが次のものを含む：ノーウォークウイルス（ＮＶ）、ＭＯＨ、Ｍｅｘｉｃｏ、ＶＡ ２０７、ＶＡ ３８７、０２−１４１９、Ｃ５９、ＶＡ １１５、Ｈａｗａｉｉ、Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｈｉｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｌｅｅｄｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｉｄａｈｏ Ｆａｌｌｓ、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ、Ｇｒｉｍｓｂｙ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄ、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍおよびＷｈｉｔｅ Ｒｉｖｅｒｃａｐ。
【００５６】
本明細書において使用するとき、用語「Ｐドメインモノマー」および「Ｐ粒子」は、それぞれ野生型ノロウイルスＰドメインモノマーおよび野生型ノロウイルスＰ粒子を意味する。
【００５７】
本明細書において使用するとき、用語「修飾されたＰドメインモノマー」および「修飾されたＰ粒子」は、分子クローニングによって各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に、１個以上の制限部位を（典型的には対で）挿入し、それによって後で外来抗原、リガンド、薬物コンジュゲートまたはシグナルペプチドを挿入できるように表面ループにクローニングカセットを作成するように修飾されている、ノロウイルスＰドメインモノマーおよびＰ粒子を（それぞれ）意味する。
【００５８】
本明細書において使用するとき、用語「置換Ｐドメインモノマー」および「置換されたＰ粒子」は、分子クローニングによって各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入された少なくとも１個の外来抗原、リガンド、薬物コンジュゲートまたはシグナルペプチドを含む、ノロウイルスＰドメインモノマーおよびＰ粒子を（それぞれ）意味する。
【００５９】
本明細書において使用するとき、用語「抗原−Ｐドメインモノマー」または「抗原−ノロウイルスＰドメインモノマー」は、外来抗原がＰドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入されている、置換Ｐドメインモノマーを意味する。
【００６０】
本明細書において使用するとき、用語「抗原−Ｐ粒子」または「抗原−ノロウイルスＰ粒子」は、外来抗原が各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入されている、置換されたＰ粒子を意味する。
【００６１】
４種の固有の非感染性ＮＯＲ粒子、すなわちウイルス様粒子（ＶＬＰ）、Ｓ粒子、Ｐ粒子および小Ｐ粒子は、多機能性を設計するための優れた候補を表すウイルス性タンパク質ケージであり、Tan et al., 2004, 「The P-domai of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 78:6233-42およびTan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30に記載されている（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）。これらの粒子は、分子量４２０ｋＤａ（小Ｐ粒子）〜１０．５ｍＤａ（ＶＬＰ）を有し、サイズ１４〜３７ｎｍを有する。ＮＯＲ ＶＬＰは１８０個の完全カプシドタンパク質（ＶＰ１）から成り、３個のサブウイルス性粒子はＶＰ１の一部から成る。シェル（Ｓ）ドメイン由来のＳ粒子、突起（Ｐ）ドメイン由来のＰ粒子および同じＰドメイン由来であるがＮ末端にさらなるフラグタグを有する小Ｐ粒子。これら全ての粒子は、Tan et al., 2004, 上記; Tan et al., 2004, 「E. coli-expressed recombinant norovirus capsid proteins maintain authentic antigenicity and receptor binding capability」, J Med Virol 74:641-9; および Xia et al., 2007, 「Norovirus capsid protein expressed in yeast forms virus-like particles and stimulates systemic and mucosal immunity in mice following an oral administration of raw yeast extracts」, J Med Virol 79:74-83（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、タンパク質がインビトロで発現されたとき自然発生的に集合する。
【００６２】
野生型ＮＯＲカプシドは、昆虫細胞において発現されたときウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合する、５５〜６０ｋＤａの単一の主要構造タンパク質（ＶＰ１）から成る（図２）。ＶＬＰは天然ウイルス粒子と形態学的および抗原的に同一であるが、感染性ではない。ノーウォークウイルスのＸ線結晶学的構造に基づくと、カプシドはＶＰ１の９０個のダイマーから成り、Ｔ＝３正二十面体シンメトリーを示す。各ＶＰ１モノマー（５３０アミノ酸[aa］）は、短いＮ末端領域（１〜４９アミノ酸）、続いてシェル（Ｓ）ドメイン（５０〜２２５アミノ酸）、ならびにＰ１（２２６〜２７８および４０６〜５２０アミノ酸）およびＰ２（２７９〜４０５アミノ酸）に分類できる突起（Ｐ）ドメインを含む。Ｎ末端／シェル（Ｎ／Ｓ）ドメインはカプシドの内部コアを形成し、ＶＰ１の最も保存的な部分であるが、Ｐドメインはカプシドの突出したアーチを形成し、より多様である。カプシドの表面に位置するＰ２サブドメインは、ＮＯＲ株のゲノムにおいて最も高い多様性度を含む。それは株特異性、レセプター結合および潜在的中和抗体認識部位の決定基を含む。
【００６３】
原子構造に従って、ＮＯＲカプシドタンパク質のシェル（Ｓ）および突起（Ｐ１、Ｐ２）ドメイン（図２）は、８〜１０アミノ酸ヒンジによって連結されている。Ｐ粒子のカプシドタンパク質（ＶＰ１）のレセプター結合領域は、Tan et al., 2004, 「The P domain of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 78:6233-42（その全体について、参照によりその開示を本明細書に組み込む）に記載されているとおり、マッピングされている。
【００６４】
ＮＯＲは、感染のための宿主レセプターとしてヒト組織−血液グループ抗原（ＨＢＧＡ）を認識することが知られている。Ｓドメインの発現は宿主レセプターに結合する機能を有さない平滑粒子を形成するが、ヒンジを有するＰドメインの発現は、レセプター結合機能を有するダイマーを形成するが、その結合親和性は低い。ヒンジなしのＰドメインが発現されると、それはＶＬＰのものと同様の顕著に高いレセプター結合親和性を有するサブウイルスＰ粒子（図１）を自然発生的に形成する。Ｐ粒子は１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーからなる。Ｐ粒子は、対応するＨＢＧＡに結合でき、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合の強い遮断を示す。Ｐ粒子の自然発生的形成は、株ＶＡ３８７、ＭＯＨおよびノーウォークウイルス（ＮＶ）を含む多様なＮＯＲ株で観察されている。これらのＰ粒子は、電子顕微鏡（ＥＭ）下で中心に空洞を有するリング状のイメージを示し、分子量〜８３０ｋＤａでゲルろ過で単一ピークを形成した。Ｐ粒子は極めて安定であり、Tan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30、およびTan et al., 2006, 「C-terminal arginine cluster is essential for receptor binding of norovirus capsid protein」, J Virol 80:7322-31（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、大腸菌および酵母発現系の両方で、高収率で容易に製造できる。
【００６５】
ＮＯＲ Ｐ粒子は、ヒトＮＯＲの２つの主要な遺伝子群の異なる遺伝子群からのＮＯＲ Ｐ粒子の構築によって示されるように、ＮＯＲに共通の特徴である。ＧＩ−１（ノーウォークウイルス）、ＧＩ−４（Ｋｏｂｌｅｎｚ４３３）、ＧＩ−８（Ｂｏｘｅｒ）、ＧＩＩ−２（Ｍｅｌｋｓｈａｍ）、ＧＩＩ−３（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ３２１）、ＧＩＩ−４、ＧＩＩ−５（ＭＯＨ）、ＧＩＩ−９（ＶＡ２０７）を含む異なるＮＯＲ遺伝子型を示す、４０種類以上のＮＯＲ Ｐ粒子がこれまでに構築されている。世界中のＮＯＲ胃腸炎の６５〜８５％に関与する主たるＮＯＲタイプ（ＧＩＩ−４）について、２５種類のＰ粒子が作成されている。これは、過去２５年間で２５種類の株が広まっていることを示す。
【００６６】
Ｐ粒子の３Ｄ構造は、図１および３に示すとおり、７．６Åの分解能のｃｒｙｏ−ＥＭによって再構成されている。Ｐ粒子は、１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーを含む八面体シンメトリーである。Ｐ粒子の中心に空洞が存在する。Ｐダイマーの方向は、野生型カプシドのものと同様であり、Ｐ１サブドメインが空洞の中心に対して内側にあり、Ｐ２サブドメインがＰ粒子の最も外側の表面に対して外側にある。Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせ（図４）は、ＨＢＧＡレセプター結合界面がＰ粒子の最も外側の表面に位置することを示している。これは、ＨＢＧＡレセプターとの強い結合機能を保持しているＰ粒子の観察と一致している。
【００６７】
Ｐダイマーの原子構造は、プロトタイプノーウォークウイルスおよび主なＧＩＩ−４株（ＶＡ３８７）においてＸ線結晶学によって解明されている（図４）。これらの結晶構造は、Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップに良好にフィットする（図１）。３個の表面ループは、これらはアーチ様Ｐダイマーの上部（６個の表面ループ／Ｐダイマー、図３）またはＮＯＲカプシドおよびＰ粒子の最も外側の表面に対応する各Ｐモノマーの最も遠い末端で同定された。これらの表面ループは外来抗原提示のための優れた部位を提供し、詳細な結晶構造は、本明細書に開示するＰ粒子ワクチンプラットフォームの構造に基づく設計のための確かな基礎を提供する。
【００６８】
ＨＢＧＡレセプターとの結合について、Ｐ粒子はその外側表面に依存する。いずれか１個以上の制限酵素部位、抗原、リガンド、シグナルペプチドまたは薬物コンジュゲートが野生型Ｐドメインモノマーの表面ループに挿入されている場合、制限酵素部位、抗原、リガンド、シグナルペプチドまたは薬物コンジュゲートのサイズに部分的または完全に基づいて、それは形成されたＰ粒子の最も外側の部分を被覆し、１個以上の修飾もしくは置換されたループへのアクセスを隠すことができ、または修飾もしくは置換されたループのタンパク質構造を変化させて、形成されたＰ粒子がＨＢＧＡレセプターと結合するその能力を失わせることができる。我々は未だＰ粒子が最早ＨＢＧＡに結合しないという前にはどの程度のループの変化が必要かということについての系統立てた分析は行っていない。しかし、我々は、制限部位をＰドメインモノマーの中央ループ２に加えた場合に修飾されたＰ粒子がＨＢＧＡと結合しないことを見出している。
【００６９】
ウイルスレセプター結合界面の同定は、図４に示すとおり、ノーウォークウイルスおよびＶＡ３８７におけるＡ−またはＢ−トリサッカライド（ノロウイルスレセプター）との複合体におけるＰダイマーの結晶化によって示されている。図示したとおり、図４は、Ｂ−トリサッカライド複合体（球体モデル）と関連したＮＯＲ Ｐダイマーの結晶構造（リボンモデル）を示す。レセプター結合界面はＮＯＲカプシドおよびＰ粒子の最も外側の表面と等しいアーチ様Ｐダイマーの上部に位置する。トリサッカライドとＰダイマーのアミノ酸との間の大規模な水素結合ネットワークが観察される。ウイルスレセプターと相互作用していると予測されるこれらのアミノ酸の重要性は、Tan et al., 2008, 「Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4 norovirus with HBGA receptors by site-directed mutagenesis study」,Virology 379:324-334（その全体について、参照によりその開示を本明細書に組み込む）に記載されているとおり、部位特異的突然変異誘発によって証明されている。
【００７０】
４個のＮＯＲ粒子（ＶＬＰ、Ｓ粒子、Ｐ粒子および小Ｐ粒子）のうち、Ｐ粒子は最も安定であり容易に製造できる。それは高度に免疫原性であり、広範な温度、ｐＨならびに化学的および物理的条件に耐える。ｃｒｙｏ−ＥＭによるＰ粒子の３Ｄ構造（図１）およびＰダイマーの原子構造（図２）は、Cao et al., 2007, 「Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides by norovirus」, J Virol 81:5949-57、およびTan, 2008, 「Noroviral P-particle: Structure, function and applications in virus-host interaction」, Virology, Vol. 382, Issue 1, 5 December 2008, Pages 115-123（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、Ｐ粒子の２４個のモノマーまたは１２個のＰダイマーの各々の最も外側の表面に高度に露出している（図１、３および４）。構造に基づく配列アラインメントは、これらの露出ループが大きな配列の挿入に耐えることを示唆している。
【００７１】
本発明の一つの局面において、タンパク質またはポリペプチド抗原性エピトープがこれらのループ、すなわちループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）またはループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の一つで、あるいはその中に挿入されている場合、抗原−Ｐドメインモノマーまたはダイマーの自然発生的自己集合は、集合した抗原−Ｐ粒子の表面で２４個の抗原エピトープを提示する。本発明のこの特徴は抗原提示、したがって下記の通りワクチンのための利点を提供する。Ｐダイマーの解明された分子構造は、したがって、かかる抗原挿入のための構造に基づく設計の確かな、詳細な情報を提供する。
【００７２】
野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、抗原−Ｐドメインモノマーがダイマーを、そしてダイマーが抗原−Ｐ粒子を形成するプロセスは、Ｐダイマーの濃度に基づいて動力学的に交換または平衡しうる。また野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、システインが抗原−Ｐドメインモノマーの末端に結合しているとき、得られる抗原−Ｐ粒子は、システイン末端を有さないものよりもより安定となり、抗原−Ｐドメインモノマーの濃度に依存しない。各抗原−Ｐダイマーは、５本の折り畳み軸に沿った五角形を形成する、５個の周囲抗原−Ｐダイマーとの相互作用において同じ方向を有するべきである。結果として、抗原−Ｐ粒子の外側層はノロウイルスカプシドのアーチ構造と類似のＰ２サブドメインによって形成されるが、内側層はＰ２アーチに支えを提供するＰ１サブドメインによって作成される。他の正二十面体ウイルス粒子と同様に、抗原−Ｐ粒子の内側に空洞が存在すべきである。
【００７３】
また野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、本発明の抗原−Ｐドメインモノマーおよびダイマーは、インビトロで抗原−Ｐ粒子を自然発生的に形成することを防止するために、周知の方法で変性されていてもよい。同様に、本発明の抗原−Ｐ粒子は、それぞれの抗原−Ｐドメインモノマーおよびダイマーに自然発生的に分離しないように、変性されていてもよい。これは、所望により野生型Ｐドメインモノマーと共に、多様な抗原タイプの抗原−Ｐドメインモノマーの形成の、多様な分子割合へのインビトロでの混和または混合を可能として、次いで変性の影響が除かれたときに自然発生的に抗原−Ｐ粒子へと形成されうる。
【００７４】
本発明の置換されたまたは抗原−Ｐ粒子は、安定であり、Tan et al., 2004, J Virol 78:6233-42およびTan et al., 2005, Virol 79:14017-30に記載のもののような周知の方法によって大腸菌および酵母において容易に製造できるため、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子のように、抗原ディスプレイのための魅力的な候補である。先行技術のManayani et al.のキメラＦＨＶ粒子およびChatterji et al.のキメラＣＰＭＶ粒子はそれぞれ、昆虫および植物に感染するが（ヒトに対する影響は知られていない）、非感染性野生型ＮＯＲ Ｐ粒子はヒトウイルスに由来し、候補ヒトワクチンとして同定されている。
【００７５】
多くの固有の特徴のため、本発明の抗原−Ｐ粒子は、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子のように、ワクチンプラットフォームとして有用な商品となる。第一に、ベースのＮＯＲ Ｐ粒子はサブユニットワクチンにほぼ理想的なサイズ（〜８４０ｋＤａ、Φ＝２０ｎｍ）を有し、多価であり、完全サイズのウイルス様粒子（ＶＬＰ）よりも容易に製造でき、単一ポリペプチドまたはタンパク質抗原よりも免疫原性である。第二に、抗原−Ｐ粒子は高収率かつ低コストで大腸菌で容易に製造でき、これは発展途上国にとって特に有用である。第三に、Ｐドメインモノマーの複数の（３個）表面ループおよび外来抗原の挿入のためのそれらの高い能力（少なくとも〜２３８アミノ酸まで）は、異なる複数の抗原の挿入を可能とする。したがって、得られたキメラ置換Ｐ粒子ワクチンは、多くの感染症および非感染症に対してさえも、広い適応を提供できる。第四に、外来抗原が挿入された少なくとも２４個のコピーを含む均一なキメラ置換Ｐ粒子を作成するために、２〜３段階の単純な遺伝子操作のみが必要とされる。したがってこれらのワクチンは速やかに開発でき、インフルエンザウイルスのような急速に変化するウイルスファミリーに特に有用であり得る。第五に、制限部位を含む表面ループにクローニングカセットを有するＰドメインモノマーベクターは、ユーザーフレンドリーなベクターであり、簡便なワクチンプラットフォームである。そして第六に、抗原−Ｐ粒子は、両方のヒトＮＯＲについての下痢および他の感染症に対する優れた候補ワクチンである。
【００７６】
主たる感染症に加えて、本ＰドメインベクターおよびＰ粒子ワクチンプラットフォームは、抗原提示および／または薬物の担体もしくはがん、アレルギー、自己免疫疾患を含む非感染性疾患の処置のための薬物送達ビークルとしても有用であり得る。一つの態様において、薬物は、化学反応によって表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されていてよい。この場合、置換されたＰ粒子は、薬物の担体として用いられる。他の態様において、リガンドまたはシグナルペプチドは、表面ループの少なくとも一つに挿入されてよく、そして薬物のコンジュゲートも、表面ループの少なくとも一つに挿入されていてよい。これらの置換されたＰ粒子は、薬物に特定の組織または臓器を標的とさせる薬物送達系を提供する。
【００７７】
本発明のＰ粒子は、さらに特異性を高め、当該技術分野の有用な進歩を利用するために、他の薬物送達アプローチと組み合わせてもよい。一つの例は、病原体感染または特定の化学的もしくは酵素的切断がないかぎり、そしてそれまで、生物学的に不活性であり、植栽棒哺乳類細胞の内部で活性薬物形態に変換される、プロドラッグを含む。かかる態様は、特定の微生物に感染した細胞または特定の腫瘍に罹患した細胞でのみプロドラッグが活性化される、プロドラッグ−Ｐ粒子の開発を特に含みうる。
【００７８】
Ｐ粒子ベクターの固有の特徴のために、ワクチンプラットフォームは広い適応を有することができる。それは既知の保護エピトープを有する多くのワクチンを製造するために使用できる。したがって、Ｐ粒子ベクターワクチンプラットフォームの適応は、広範な臨床状態に潜在的に有益であり得る。さらに、このナノ粒子プラットフォームの柔軟性は、容易に拡張されうる。例えば、ＰドメインモノマーまたはＰ粒子の１個の表面ループが特定のレセプターを有するある組織または臓器にＰ粒子を誘導するシグナルペプチド（リガンド）を発現するが、ワクチンまたは薬物が効果を奏するように送達される第２の表面ループに結合されるように、粒子を開発できる。例えば、ペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸の鎖）で置換されたＰ粒子は、ＣＮＧＲＣのレセプター（ＣＤ１３）が重度に発現されている腫瘍組織（すなわち癌腫）に移動できる。膜結合メタロプロテアーゼＣＤ１３のリガンドであるペプチド部分ＣＮＧＲＣは、ＣＤ１３を発現する血管形成血管系の内皮細胞に結合でき、ＣＤ１３を発現する内皮細胞におけるアポトーシスを誘導し、それによって腫瘍関連血管新生を阻害できる。
【００７９】
さらに、２個以上のループが同一または異なる病原体由来の異なる抗原を発現するように、多価ワクチンが作製できる。置換されたＰ粒子は、野生型Ｐドメインモノマーおよび抗原−Ｐドメインモノマーを含む、異なる抗原−Ｐドメインモノマーの混合物から集合して、異種抗原−Ｐ粒子を形成できる。多様な外来抗原を同じループまたは３個のループの異なる一つに挿入して、広範な異種抗原−Ｐ粒子を提供できる。したがって、本Ｐ粒子およびＰドメインモノマーベクタープラットフォームの市場価値は極めて高い。
【００８０】
本発明の態様は、ＮＯＲおよびロタウイルス（ＲＶ）に対するワクチンとして使用するための抗原−Ｐ粒子を含んでいてもよい。抗原−Ｐ粒子の一つの例は、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラである。ロタウイルス（ＲＶ）およびＮＯＲは、疾患の大きな負担を生じる世界中で共通の病原体である。この抗原−Ｐ粒子は、毒性株を生じる復帰または再集合の可能性のない、単独ワクチンでＮＯＲおよびＲＶに対して有効なワクチンを提供する。
【００８１】
１個以上のループの修飾の前に、Ｐ粒子形成を促進し安定化するためにＰドメインのいずれかの末端にシステインを加え、そしてＰ粒子を不安定化しうるトリプシン処理に対する耐性を与えるためにＰドメインのＣ末端に短いペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を加えて、野生型Ｐドメインモノマーを製造できる。また、Ｐ粒子形成のために、ＰドメインモノマーのインタクトなＣ末端が必要であり、ワクチンプラットフォームとしてのＰ粒子形成および安定性のために、Ｃ末端でのアルギニンクラスターが重要である。
【００８２】
小ペプチドタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、フラグタグ）がＰドメインのＣ末端に結合したとき、ＮＯＲ Ｐドメインモノマーはまた、小Ｐ粒子と呼ばれる別の複合体を形成した。この小Ｐ粒子は、６個のＰダイマーに組織される１２個のＰモノマーを含む四面体シンメトリーを示す（図６）。小Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせは、Ｐダイマーの方向がＰ粒子のものと同様であることを示した。インビトロでのＨＢＧＡ結合アッセイは、小Ｐ粒子がＮＯＲ ＶＬＰおよびＰ粒子と同様の結合プロファイルを有することを示した。小Ｐ粒子の発見は、より小さなＰ粒子が特定の用途に必要である場合における、我々のＰ粒子系のさらなる候補を提供する。
【００８３】
本発明のＮＯＲベースの抗原−Ｐ粒子は、各Ｐドメインダイマーまたはモノマーサブユニットの提示ループの１個以上において外来抗原を担持するように構築されうる。Ｈｉｓタグ（７ｘヒスチジン）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）Ｔ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属エピトープＥｐｉ８（１４アミノ酸）およびＲＶ表面抗原である２種のＲＶ ＶＰ８コアタンパク質（各１５９アミノ酸）を含むがこれらに限定されない多様なポリペプチドおよび生物学的関連エピトープが、置換されたＰ粒子の形成および安定性に影響を与えることなく、図９に示すとおり、Ｐ粒子のループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）またはループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）のいずれか１つ以上に挿入されてよい。これはループ２について、図７のパネルＢおよび図８のパネルＤに示すとおり、ゲルろ過によって示される。Ｈｉｓタグの露出はＴａｌｏｎ樹脂との高い親和性によって示された（図７のパネルＡ）ＶＰ８の露出は、ＲＶ ＶＰ８に対する抗体を用いたＥＩＡ（図８のパネルＥ）およびｃｒｙｏ−ＥＭを用いたＶＰ８−Ｐ粒子の３Ｄ構造再構成（図１０のパネルＥ）によって示されている。これらのデータは、Ｐ粒子が多様な外来抗原を提示するための有効なワクチンプラットフォームに発展しうるという我々の仮説を支持している。
【００８４】
抗原−Ｐ粒子ベクターは、クローニングカセットと共に構築されてもよい。Ｐダイマーの結晶構造に基づいて、ループの先端を含むＰ粒子ベクターのループの一つ以上に制限部位を含むクローニングカセットを入れることができる。図９はＰ粒子ベクターのループ２の先端に入れたＳｐｅ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位を含むクローニングカセットを示す。クローニングカセットを含むこのＰ粒子ベクターは、図８および１０に示すように、Ｐ粒子の表面へのＲＶ ＶＰ８およびＧＦＰの挿入成功に使用される。
【００８５】
稀少および固有制限部位を含む制限部位、ならびにＰドメインモノマーまたはＰ粒子の表面ループのいずれか一つ以上に制限部位を挿入する方法の例は、当業者に周知であり、Reed et al.の米国特許出願公開2004/0185556および2008/0085553（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。これらの制限部位はＤＮＡ分子においてコードされ、典型的には二本鎖パリンドローム配列を含む。いくつかの制限酵素について、制限部位を提供するために４〜６ヌクレオチドで十分であるが、いくつかの制限酵素は、８個以上のヌクレオチドの制限部位を必要とする。例えば酵素ＥｃｏＲ１は下記６ヌクレオチド配列を認識する：５’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ３’、ここで５’は「上流」末端と慣習により知られる分子の終点を示し、同様に３’は「下流」末端を示す。制限部位の相補鎖は、その逆平行鎖３’＝Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−５’である。
【００８６】
ＮＯＲ Ｐ粒子は大きな外来抗原挿入に耐えうる。例示のみを目的として、ＮＯＲ Ｐ粒子のループ２に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、２３８アミノ酸）を挿入したところ、得られたキメラ粒子はゲルろ過分析で測定したところ高度に安定である。ＧＦＰの露出は、ＧＦＰ特異的抗体を用いたＥＩＡおよび蛍光顕微鏡で示された（データは示さず）。
【００８７】
ある方法の態様において、修飾されたＮＯＲ Ｐ粒子を用いて、ＮＯＲおよび外来抗原両方に反応性の抗体を誘導する。具体的な、非限定的な例において、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子を用いて、ＲＶおよびＮＯＲの両方に反応性の抗体を誘導する。ＶＰ８−Ｐ粒子キメラで免疫した哺乳類はＮＯＲ Ｐ粒子およびＲＶ ＶＰ８の両方に反応性の抗体のレベルをもたらし、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断し、ＲＶの複製を中和できる。
【００８８】
ＮＯＲの「中和アッセイ」およびＲＶチャレンジのマウスモデルが開発されている。ＮＯＲは未だ細胞培養で培養することが難しく、ＮＯＲの複製に有効な動物モデルが存在しない。ＮＯＲ感染に対する抗体の潜在的保護を測定するため、ＮＯＲとその宿主レセプターの結合の防止における抗体の能力を測定するためのＨＢＧＡレセプター遮断アッセイを開発した。このアッセイは、唾液またはオリゴ糖ベースのレセプター結合アッセイに基づいており、極めて感受性かつ特異性である。
【００８９】
ＲＶ感染に対するワクチンの保護効能を測定するための成体マウスモデルも確立されており、ＲＶワクチン開発を研究するために用いられている。ワクチン候補でマウスを免疫し、次いでマウスＲＶ株でチャレンジした。免疫群におけるＲＶ抗原の糞便排出量を、ワクチン効能の測定のためにコントロールまたは非免疫群における排出量と比較する。ワクチンに対する免疫応答は、抗体レベルおよびＴ細胞応答を測定することでも測定できる。
【００９０】
本発明はまた、外来抗原の複数または複数−多価提示を有する抗原−Ｐ粒子の形成に関する。２個のループ（すなわちループ１および２、ループ２および３またはループ１および３）で２個のクローニングカセットを有する修飾されたＰ粒子ベクターは、多様な組合せで２個のカセットに外来抗原を挿入することによって構築でき、評価できる。３種の組合せの非限定的な例は、１）ループ１および２におけるＨｉｓタグおよびフラグタグ（ＹＤＫＤＤＤＤＫ）；２）ループ１および２におけるＨｉｓタグおよびＶＰ８抗原；ならびに３）ループ１および２における２個のＶＰ８を含む。これらの態様は、同じ置換Ｐ粒子上で効率よく提示される２種の異なる小抗原、または１種の小抗原および１種の大抗原、または２種の大抗原を提供できる。キメラＰ粒子形成はゲルろ過によって測定され、挿入された抗原の露出は特異的抗体を用いたＥＩＡによって試験できる。
【００９１】
３個のループ（ループ１、２および３）全てで３個のクローニングカセットを有する修飾されたＰ粒子ベクターは、多様な組合せで３個のカセットに外来抗原を挿入して構築でき、評価できる。非限定的な例は、１）３個の７ｘＨｉｓタグ；ならびに２）７ｘＨｉｓタグ、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）およびフラグタグを含む。第一の組合せは、置換されたＰ粒子の各Ｐドメインモノマーの３個のループ全てで同じ小さなエピトープを重複して提示し、Ｐ粒子上で抗原の７２個（３×２４）コピーを与える。第二の組合せは、各Ｐドメインモノマーサブユニットで同時に提示される３種の異なる小エピトープを提供し、３種の異なる抗原に対する三価Ｐ粒子ワクチンをもたらす。
【００９２】
したがって本発明は、簡便かつ多様な抗原挿入のためのＰ粒子ベクターを提供する。修飾されたＰ粒子の態様は、それぞれ３個の表面ループの各々で単一の固有のクローニングカセットを含む各々修飾されたＰドメインモノマーである、３種のＰドメインモノマーベクターを含みうる。修飾されたＰ粒子ベクターの別の態様は、３個のループのいずれか一つもしくはいずれか２つ（例えばループ１および２）または３個のループ全てにおいて２個のクローニングカセットを有するＰドメインモノマーベクターを含む。修飾されたＰ粒子ベクターの別の態様は、各Ｐドメインモノマーの３個のループ全てにおいて３個のクローニングカセットを有していてよい。各クローニングカセットの酵素認識部位は、図１３に示すとおり、目的の抗原のＤＮＡ配列のクローニングの必要に応じて修飾されてよい。これらのベクターは、１種類の抗原の単独提示または同一もしくは異なる抗原の複数提示のためものもである。異なるクローニングカセットを有するこれらのＰ粒子ベクターの構築は、当該技術分野で知られているとおり、部位特異的突然変異誘発によって達成されうる。
【００９３】
変異誘発および組換えＤＮＡクローニング手法。様々な修飾または置換されたＰ粒子ベクターの作製は、典型的には、ＮＯＲ（特に、実施例のとおり、ＶＡ３８７株）のＰドメインおよびシステインを有する短ペプチドをコードする配列を好適なプラスミド（特に、例示として、Amersham Biosciencesから入手可能なプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１）中に含む、図１２に示すような、野生型Ｐ粒子発現構築物で開始する。クローニングカセットは、Tan et al., 2003, 「Mutations 448 within the P2 domain of norovirus capsid affect binding to human histo-blood group 449 antigens: evidence for a binding pocket」, J Virol 77:12562-71、Tan et al., 2006, 「C-terminal arginine cluster is essential for receptor binding of norovirus capsid protein」, J Virol 80:7322-31、Tan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30およびTan et al., 2008, 「Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4 norovirus with HBGA receptors by site-directed mutagenesis study」, Virology 379:324-334（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のものを含む周知の方法による部位特異的突然変異誘発によって、一つずつ、図１３に示すように、表面ループの特定部位でＰドメイン配列に導入される。結晶学的研究による３個の表面ループの位置、組成および配列は、Bu et al., 2008, 「Structural basis for the receptor binding specificity of Norwalk virus」, J Virol 82:5340-7およびCao et al., 2007, 「Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides by norovirus」, J Virol 81:5949-57（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。
【００９４】
構造および配列情報に基づいて、クローニングカセットとして特定の酵素認識部位が適切な位置に挿入されたものとして、特定のプライマーを設計し、合成できる。典型的には、表面ループの先端（最も露出した位置）での２個のアミノ酸がクローニングカセットの配列を挿入するために選択されてよく、これは２個のアミノ酸の置換または２個のアミノ酸の間に配列を挿入することによってよい。周知の通り、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いてループにクローニングカセットを導入できる。特定の抗原についての正確な導入位置は、得られる抗原−Ｐ粒子キメラの安定性または効率を改善するために修飾されてもよい。より長い配列でのクローニングカセットの挿入のために、最適な挿入のために段階的部位特異的突然変異誘発を実施できる。次いで、部位特異的突然変異誘発の後得られた置換されたＰ粒子ベクターのプラスミドは、周知の方法によって、プラスミドＤＮＡ調製キット（Qiagen）を用いた大腸菌およびプラスミドＤＮＡ調製物へのプラスミド形質転換のための常套のクローニング手法によって増幅できる。周知の方法により配列決定することによって、挿入されたクローニングカセットの確認の後、抗原−Ｐ粒子ベクターは、抗原挿入の能力、キメラＰ粒子形成の安定性、および有用かつ効果的なワクチンとしての抗原提示の効率について、試験されてよい。
【００９５】
適切なキメラＰ粒子形成は、抗原提示についてのＰ粒子ベクターの能力および効率を評価して決定できる。Ｐ粒子プラットフォームへの抗原またはエピトープの挿入後（すなわち、Ｐドメインモノマーに抗原またはエピトープの挿入後、ダイマー、次いで抗原−Ｐ粒子へのＰドメインモノマーの集合）、得られたキメラタンパク質の各々は、サイズ排除カラム（例えば、Akta ファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー(FPLC、HE healthcare)）を用いたゲルろ過によって、標的抗原−Ｐ粒子キメラの形成について分析されてよい。正しく形成された標的キメラは、モノマーの分子量の〜２４倍の予測分子量（ＭＷ）で単一のピークを形成する。例えば、ＨｉｓタグＰ粒子は８７０ｋＤａのＭＷを有し、ＶＰ８−Ｐ粒子は１２４０ｋＤａのＭＷ、そしてＧＦＰ−Ｐ粒子は１４５０ｋＤａのＭＷを有する。Ｐ粒子による抗原の複数提示は、この計算に従う。予想されるＭＷを有するキメラＰ粒子の形成は、抗原挿入の成功の重要な指標である。キメラＰ粒子形成のさらなる証拠は、ｃｒｙｏ−ＥＭによるＥＭ観察および３Ｄ再構成を含む（図１０参照）。修飾された抗原−Ｐ粒子の安定な形成は、通常、抗原の優れた免疫原性を導き、対応する病原体に対する有望なワクチン候補であろう。
【００９６】
キメラＰ粒子上の抗原露出の測定は、抗原提示についてのＰ粒子ベクターの能力および効率の別の重要な指標である。抗体特異的ＥＩＡおよびＴａｌｏｎ樹脂結合アッセイのいずれかまたは両方が、この測定のために用いられる。抗体特異的ＥＩＡはHuang et al., 「Noroviruses bind to human ABO, Lewis, and secretor histo blood group antigens: identification of 4 distinct strain specific patterns,」 2003, J Infect Dis 188:19-31およびHuang et al., 「Norovirus and histo-blood group antigens: demonstration of a wide spectrum of 23 strain specificities and classification of two major binding groups among multiple 24 binding patterns,」 2005, J Virol 79:6714-22（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されており、図８のパネルＥおよび図１１のパネルＡに図示されている。精製された抗原−Ｐ粒子キメラはマイクロタイタープレートに被覆され、脱脂乳によって遮断されうる。露出している抗原／エピトープは、対応する抗体によって検出できる。シグナル強度は、二次抗体−ＨＲＰコンジュゲート、次いでＨＲＰ基質とインキュベート（inculcation）した後、吸光度（ＯＤ）によって記録されうる。抗原（例えばそれぞれＨｉｓ、フラグおよびｍｙｃタグ）に対して特異的なモノクローナル抗体は、Cell Signalingから商業的に入手可能であるが、図８および１１に示すとおり、ＲＶ ＶＰ８およびＮＯＲ Ｐ粒子に対する特異的抗体は本願出願人によって製造され、それから入手可能である。露出したＨｉｓタグの検出のために、別の強力な方法であるＴａｌｏｎ樹脂結合アッセイを用いてもよく、ここでＴａｌｏｎ樹脂（Clontech）はＨｉｓタグと特異的に結合できる（図７）。樹脂結合ＨｉｓタグＰ粒子キメラはイミダゾール（Sigmaから入手可能）によって容易に放出されるため、このアッセイは、汚染タンパク質からＨｉｓタグＰ粒子キメラを精製するための単純なアプローチである（図７参照）。
【実施例】
【００９７】
実験
キメラＰ粒子の調製。予め製造した［Ｐ］タイプ８株のヒトＶＰ８を含むＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（図８、図１０のパネルＥ）を用いる。マウスＲＶチャレンジ試験のためのマウスＶＰ８を含むキメラワクチンのために、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのヒトＶＰ８をマウス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８で置換する。ヒトおよびマウスＲＶキメラＰ粒子はいずれも、確立された手法を用いて大腸菌で製造される。ＧＳＴアフィニティーカラム（Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、HE Healthcare）による部分的精製の後、キメラＰ粒子はさらにサイズ排除カラムを用いたＦＰＬＣ系（GE Healthcare）で精製される。得られたキメラＰ粒子調製物は、高い純度（〜９５％）に達し、マウスを免疫する免疫源として使用される。図８に見られるとおり、ＳＤＳ ＰＡＧＥのパネルＡは、アフィニティーカラム（レーン１）およびさらにＰ粒子（レーン２）およびＰドメインダイマー（レーン３）フラクションでのゲルろ過（パネルＤ）によって精製された、組換えＲＶ ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（５３．５ｋＤａ）を示す。パネルＢおよびＣは、ＶＰ８（パネルＢ、レーン４および５）またはＮＯＲ ＶＬＰ（パネルＣ、レーン６および７）に対する抗体を用いた、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのウェスタン分析を示す。パネルＤにおいて、アフィニティー精製ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（レーン１）のゲルろ過は、該タンパク質の大部分がＰ粒子（〜１３００ｋＤａ）を形成することを示す。パネルＥは、被覆ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（ＰＰ−ｈＶＰ８Ｃ）、組換えＶＰ８（ｈＶＰ８Ｃ）およびＰ粒子のみ（ＰＰ、コントロール）を検出するためにＶＰ８に対する抗体を用いた、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の結果を示す。レーンＭは、上から１１３、９２、５２、３５、２９ｋＤａのバンドで、予め染色したタンパク質マーカーを示す。図１０は、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラの製造を示す。ループ２にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクター（Ａ）は野生型ＮＯＲ Ｐ粒子（Ｂ）を製造する。ＲＶ ＶＰ８コード配列（Ｃ）がＰ粒子ベクター（Ｄ）にクローン化されると、それはキメラの最も外側表面でのＲＶ ＶＰ８の指標と共に、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（Ｅ）を製造する。
【００９８】
マウスの免疫。６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Labs）を高度精製ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラで、異なる用量で、アジュバント［ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）］ありまたはなしで、経口または鼻腔内で免疫する。野生型Ｐ粒子はコントロールとして含まれる。ワクチン接種の鼻腔内経路のために、体積５０μｌ中、野生型Ｐ粒子およびＶＰ８−Ｐ粒子キメラの３種の初期用量（５、１５および４５μｇ／マウス、３回用量）が投与される（鼻腔あたり２５μｌ）。経口経路のために、１ｍｌのシリンジを備えた２０ゲージのステンレス鋼製給餌針を用いて胃内カニューレによって胃に直接、合計２００μｌの同量のワクチンを送達する。動物（１２匹のマウス／群）を一般的外見および体重減少についてモニターして、ワクチンの有害な効果の可能性を評価する。回復期前および中の血清サンプルを回収し、抗原として組換えＮＯＲ ＶＬＰおよびＲＶ ＶＰ８を用いたＥＩＡによってＮＯＲおよびＲＶに対する抗体応答について試験する。ＮＯＲおよびＲＶに対する分泌ＩｇＡのために、糞便サンプルを回収する。１つのマウス群（Ｎ＝５）を、ネガティブコントロールとして、細菌発現グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で免疫する。
【００９９】
インビトロアッセイによる免疫応答の評価。異なる投与レジメンによるワクチンの免疫前後のマウス血清を回収し、Huang et al., 2003, J Infect Dis 188:19-31およびHuang et al., 2005, J Virol 79:6714-22に記載のように、タイプ特異的抗体検出ＥＩＡを用いてＮＯＲおよびＲＶに対するそれらの特異的抗体力価を測定する。糞便サンプル中の分泌ＩｇＡを、粘膜免疫の指標としてＮＯＲおよびＲＶに対する応答について試験する。ＲＶについて、中和アッセイは、細胞培養中のＲＶ複製の阻害のために血清サンプルで実施される。ＮＯＲについて、ＮＯＲレセプター遮断アッセイを実施して、潜在的「中和」活性として抗体によって、ＮＯＲ ＶＬＰとそれらのＨＢＧＡレセプターとの結合の阻害を測定する。
【０１００】
ＶＡ３８７は世界中のＮＯＲ関連胃腸炎の６５〜８５％に関与する主要なＧＩＩ−４遺伝子型であるため、同じＶＡ３８７ ＶＬＰまたはＰ粒子に対する同種抗体応答を用いる。ＮＯＲレセプター結合のインビトロ遮断アッセイを用いて、ＮＯＲに対する抗体の潜在的中和を評価する。ＶＰ８−Ｐ粒子ワクチンの異なる投与レジメンからのマウス血清を、ＨＢＧＡレセプターとＮＯＲ ＶＬＰの結合に対する遮断効果について試験する。抗体の遮断効果を再度、同種株ＶＡ３８７とそれらに対するＨＢＧＡ（Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｌｅｗｉｓ ＢおよびＬｅｗｉｓ Ｙ抗原）との結合について試験する。簡潔には、既知のＨＢＧＡまたは合成オリゴ糖で十分に特徴付けられた唾液をマイクロタイタープレートに被覆する。脱脂乳でブロックした後、３０分間抗体と共にインキュベートしたＮＯＲ ＶＬＰをプレートに加える。ＨＢＧＡレセプターと結合したＶＬＰを、特異的ＶＡ３８７ ＶＬＰに対するモルモット過免疫血清、次いでＨＲＰ複合化ヤギ抗モルモットＩｇＧ（ICN、Aurora、OH）の添加によって検出する。シグナル強度（吸光度、ＯＤ）は波長４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーによって読み取る。遮断効果は、抗体処理ありとなしとでの結合の比較によって決定する。
【０１０１】
プラーク減少を測定するための細胞培養を用いた中和アッセイを実施して、マウスにおいてＶＰ８−Ｐ粒子キメラに対して誘導される抗体を試験する。［Ｐ］タイプのＶＰ８−Ｐ粒子キメラと他のＲＶタイプの交差中和を、発明者の研究室で入手可能な様々なＲＶ株を用いて試験する。組織培養順応Ｗａ株、マウスＲＶ ＥＤＩＭ株およびＭＡ１０４ミドリザル腎臓細胞株が使用される。簡潔には、ＭＡ１０４細胞を６ウェルプレートで培養し、ＲＶ接種の連続希釈によって〜５０プラーク／ウェルの形成についてＲＶ力価を測定する。アッセイのために、ＲＶは特定希釈の血清と６０分間インキュベートし、６ウェルプレート中の細胞（ＭＡ１０４）に混合物を加える。２時間後プレートを洗浄し、次いで０．８％のアガロースを含む培地で覆う。３７℃で４〜５日間インキュベートした後、各ウェルのプラーク数を計測する。処理していないウェルと比較して、血清を含むウェルでのプラーク数の減少は、血清中に存在する中和抗体の量を決定する。
【０１０２】
マウスＲＶチャレンジモデル。ワクチンの保護効能を試験するためのこのＲＶチャレンジモデルの手法は、Choi et al., 「Functional mapping of protective domains and epitopes in the rotavirus VP6 protein,」 2000, J Virol 74:11574-80; Choi et al., 「Functional mapping of protective epitopes within the rotavirus VP6 protein in mice belonging to different haplotypes,」 2003, Vaccine 21:761-7;およびMcNeal et al., 1999, J Virol 73:7565-73.41（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。ＲＶ抗体を含まない６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、Ind.）をＶＰ８−Ｐ粒子キメラワクチンで経口または鼻腔内的に免疫する。最後の免疫の２〜４週間後、mice are 経口ly (via gavage、generally carried out by passing a feeding tube through the nose or mouth into the esophagus) challenged with murine RV EDIM strain at a dose of １００ ５０％排出用量と等しい４×１０４ＦＦＵ（フコース形成単位）の用量でマウスＲＶ ＥＤＩＭ株でマウスを経口的に（胃管栄養法で、一般的に鼻または口を介して食道へと給餌チューブを通して）チャレンジする。糞便中のＲＶ抗原を測定するため、ＥＤＩＭチャレンジの７日以上後に各マウスから２回糞便ペレットを採取し、１ｍｌのアールバランス化食塩水中に保存する。分析までサンプルを凍結保存し、その時点でそれらをホモジナイズし、遠心分離してデブリを除去する。糞便サンプル中のＲＶ抗原の量は、既報のとおりＥＬＩＳＡで測定する。
【０１０３】
結果。結果は、ＶＰ８−Ｐ粒子が処置マウスにおいてＲＶ−およびＮＯＲ−特異的抗体を誘導し、該抗体がＮＯＲ ＶＬＰとそのＨＢＧＡレセプターとの結合を遮断し、細胞培養中のＲＶの複製を中和し、そしてマウスチャレンジモデルにおいて免疫保護を提供することを示す。ＶＰ８−Ｐ粒子ワクチンは細胞傷害性または副作用を示さない。
【０１０４】
発現構築物。ＶＡ３８７ノロウイルス（ＧＩＩ．４）Ｐドメインコード配列およびシステイン含有ペプチドを含むｐＧＥＸ−４Ｔ−１［グルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ) Gene fusion System、GE Healthcare life sciences］のＰ粒子発現ベクターを多様なキメラＰ粒子の構築のためのテンプレートとして用いた。Ｐ粒子Ｈｉｓタグキメラを作製するために、Ｈｉｓタグコード配列を部位特異的突然変異誘発によってＮ３７２とＤ３７４（図７および図１４Ａ）の間のループ２に挿入した（下記参照）。ヒトロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子のために、まずループ２にＳｐｅＩおよびＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩの酵素部位を有するクローニングカセットを導入して、部位特異的突然変異誘発によってＴ３６９からＤ３７４の配列を置換した（図１６Ａ）。［Ｐ］８株（Ｗａ、L65-L223、GenBank accession: VPXRWA）および［Ｐ］４株（ＤＳ１、L65-l223、GenBank accession: VPXRDS）のＶＰ８抗原ｃＤＮＡ配列をカセットにクローン化した。Ｐ粒子にマウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８抗原（L65-L222、GenBank accession: AF039219）のｃＤＮＡ配列をクローニングするため、ＸｂａＩおよびＢｇｌ ＩＩ部位を有する別のクローニングカセットをＮ３７２とＮ３７３の間に挿入した。ＰダイマーＨｉｓタグキメラの作製のために、ヒンジを有するＰドメインのＮ末端とＨｉｓタグを連結した。ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むキメラマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を作製するため、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のベクターにＭＢＰのＮ末端と該ペプチドを融合した。ｐＤＥＳＴ１７（Gateway、Invitrogen）（２９）におけるＨｉｓタグ化サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）α−Ｌ−フコシダーゼ（GenBank accession: TM0306）の発現構築物は、Dr. HenrissatおよびDr. Bourne（Architecture et Fonction des Macromolecules Biologiques、UMR 6098、CNRSおよび Universites Aix-Marseille I and II、31 Chemin J. Aiguier、F-13402 Marseille、Cedex 20、France）から快く譲っていただいた。
【０１０５】
組換えタンパク質の発現および精製。０．２５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の誘導により大腸菌（ＢＬ２１）において、室温（〜２５℃）で一夜、他に記載のとおりに組換えタンパク質を発現した。組換えＧＳＴ融合タンパク質の精製は、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare life Sciences）の樹脂を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。ビーズ上または溶液中（リン酸緩衝化食塩水、ＰＢＳ，ｐＨ７．４）のいずれかでトロンビン（GE Healthcare life Sciences）切断によって標的タンパク質からＧＳＴを除去し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した。Ｈｉｓタグタンパク質の精製は、TALON His-Tag Purification Resins（Clontech、Mountain View、CA）を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。２５０ｍＭのイミダゾール（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を含むＰＢＳによって樹脂からＨｉｓタグタンパク質を溶出させた。樹脂精製タンパク質のさらなる精製は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって実施した。
【０１０６】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、既報の通りAKTA FPLC System（GE Healthcare life Sciences）で実施した。簡潔には、AKTA FPLC system（model 920、GE Healthcare life Sciences）で動力供給したサイズ排除カラムSuperdex 200（GE Healthcare life Sciences）にアフィニティーカラム精製タンパク質をロードした。溶出フラクションの分子量は、Gel Filtration Calibration Kits（GE Healthcare life Sciences）でキャリブレートした。あるいは、空ボリューム、キメラＰ粒子およびＰダイマーのピークを、それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、GE Healthcare life Sciences）、野生型Ｐ粒子（８３０ｋＤａ）およびノロウイルスＶ３８７（ＧＩＩ．４）の野生型Ｐダイマー（６９ｋＤａ）で決定できる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）および／またはウェスタンブロット分析によって興味あるフラクションのタンパク質をさらに分析した。
【０１０７】
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。１０％ゲルを用いたＳＤＳ ＰＡＧＥによって組換えタンパク質を分析した。他に記載のとおり、ノロウイルスＶＬＰ（ＶＡ３８７、GII.4、1:3000）またはロタウイルスＶＰ８抗原（Ｗａ、1:3000）に対する過免疫血清を用いたウェスタンブロット分析によって、組換えタンパク質の特異的組成を検出した。ブロットした膜を５％脱脂乳でブロックした。二次抗体−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲート（1:5,000、ICN Pharmaceuticals、Costa Mesa、CA）を用い、そしてECL Eastern Blotting Detection Reagents （GE Healthcare life Sciences、Buckinghamshire、England）によってＨＲＰを検出した。ＥＣＬシグナルはHyperfilm ECL（GE Healthcare life Sciences、Buckinghamshire、England）で捕捉した。
【０１０８】
既報の通り製造業者によって提供されたQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene、La Jolla、CA）の手法に従って部位特異的突然変異誘発を実施して、Ｈｉｓタグおよび構成クローニングカセットをノロウイルスＰドメインのループ２に挿入した。Ｎ３７２とＤ３７４との間のループ２（図７および図１４Ａ）に７個のヒスチジンの紐を挿入するためにプライマー対：caccactgacacaaaccaccaccaccatcatcaccacgatcttcaaactggcc/ggccagtttgaagatcgtggtgatgatggtggtggtggtttgt gtcagtggtgを用いた。さらに、ヒトロタウイルスＶＰ８抗原のコード配列の挿入を促進するために、プライマー対：gttcaatacaccactagtacaaacatcgatatccttcaaactggc/ gccagtttgaaggatatcgatgtttgtactagtggtgtattgaacを用いて、ノロウイルスＰドメインのループ２に３個の酵素部位（Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩ）を有するクローニングカセットを構築した。マウスロタウイルスＶＰ８抗原のコード配列の挿入を補助するため、プライマー対：tacaccactgacavaaa ctc tagacacagatctaatgatcttcaaactgg/ccagtttgaagatcattagatctgtgtctagagtttgt gtcagtggtgtaを用いて、ＸｂａＩおよびＢｇｌ ＩＩ部位を有する別のクローニングカセットを作製した。
【０１０９】
低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）技術。
【０１１０】
Ｃｒｙｏ−ＥＭイメージ取得。我々の以前の研究に記載の野生型Ｐ粒子の構造再構成に用いた手法をここで採用した。簡潔には、精製Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラのアリコート（３〜４μｌ）を液体窒素によって冷却した液体のエタン中、Quantifoil格子上でフラッシュ凍結した。サンプル格子を顕微鏡にのせ、２００ＫＶで操作するフィールド放出銃を備えたＣＭ２００低温顕微鏡を用いて、フィルム上で低線量イメージ（〜２０ｅ／Ａ２）を記録した。公称倍率ｘ５０，０００、デフォーカスレンジ２．０〜４．０μｍでイメージを撮影した。顕微鏡写真を選択し、Nikon Super CoolScan 9000EDスキャナーをステップサイズ６．３５μｍ／ピクセルで用いてデジタル化した。スキャンしたイメージをビニングして、さらなるイメージ処理および３Ｄ再構成のために、２．４９Å／ピクセルでイメージの最終サンプリングを得た。
【０１１１】
Ｃｒｙｏ−ＥＭイメージ処理および３Ｄ再構成。ＥＭＡＮのｂｏｘｅｒプログラムを用いてキメラＰ粒子のイメージを選択した。選択されたイメージを手作業で選別して、偽陽性を排除した。ＥＭＡＮのｃｔｆｉｔプログラムを用いて、同じ顕微鏡写真に由来する粒子のセットに関連した、コントラスト−トランスファー関数（ＣＴＦ）パラメーターを手作業で決定した。ＥＭＡＮのｓｔａｒｔｏｃｔプログラムを用いて、キメラＰ粒子の初期モデルを作製した。次いで、ＥＭＡＮのｒｅｆｉｎｅプログラムを用いて、新たなキメラ粒子の中心および方向を繰り返し決定し、収束するまでＥＭＡＮのｍａｋｅ３ｄプログラムによって２Ｄイメージから３Ｄマップを再構成した。キメラＰ粒子の再構成によって八面体シンメトリーが与えられた。
【０１１２】
Ｃｒｙｏ ＥＭモデル評価および分析。UCSF Chimeraソフトウェアを用いて、ロタウイルスＶＰ８抗原（Ｗａ、2DWr、L65-L223）の結晶構造をＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラの３Ｄ構造の伸長した突起に重ね合わせた。単純剛体運動がキメラＰ粒子の３Ｄ構造とＸ線構造の最良のマッチングの発見と考えられた。
【０１１３】
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いて、Ｐ粒子−抗原キメラによって誘導されたマウス抗血清の免疫反応性および抗体力価を測定した。可変の抗血清のために異なる抗原を用いた：Ｐ粒子Ｈｉｓタグキメラによって誘導された血清についてＨｉｓタグ化T. maritimaα−Ｌ−フコシダーゼ、非露出ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むＰ粒子によって誘導された血清についてＭＰＢ−ＣＮＧＲＣまたはＭＰＢ−ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導された血清について遊離ＶＰ８、そして内部コントロールとしてＰ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導された血清についてＧＳＴ。抗原を９６ウェルマイクロタイタープレート（Dynex Immulon; Dynatech、Franklin、Mass）に被覆した。５％脱脂乳でブロックした後、被覆した抗原と共に指定の希釈での血清をインキュベートした。他に記載のとおりに二次抗体−ＨＲＰコンジュゲートによって、結合した抗体を検出した。抗原に対する抗体の力価は、カットオフシグナル強度０．１５での終点希釈として定義された。野生型Ｐ粒子またはＰＢＳで免疫した動物由来の血清をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１４】
ＨＢＧＡ結合および遮断アッセイ。基本的には他に記載のとおりに、唾液を利用した結合アッセイを実施した。簡潔には、既知のＨＢＧＡ表現型を有する煮沸した唾液サンプルを１０００倍に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Dynex Immulon; Dynatech、Franklin、MA）に被覆した。５％脱脂乳でブロックした後、ＶＬＰまたはノロウイルス（ＶＡ３８７、ＧＩＩ．４）のＰ粒子を加えた。我々自身が作製したウサギ抗ＶＡ３８７ ＶＬＰ抗血清（１：３，３００）を用いて結合したＶＬＰ／Ｐ粒子を検出し、次いでＨＲＰ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ICN、Pharmaceuticals、Costa Mesa、CA）を加えた。ＶＬＰを被覆した唾液に加えた後、希釈した血清と共に３０分間プレインキュベートして、ノロウイルスＶＬＰ−唾液結合に対するＰ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導されたマウス血清の遮断効果を測定した。免疫した動物由来のマウス血清による遮断ありおよびなしで測定したＯＤを比較することにより、遮断率を計算した。遊離ＶＰ８免疫動物由来の血清の遮断率をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１５】
抗体応答のためのマウス免疫。６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、IN）を精製キメラＰ粒子または遊離抗原で、用量５〜１５μｇ／マウス、２週間間隔で３〜４回で免疫した。Ｐ粒子−またはＰダイマー−提示Ｈｉｓタグに対する免疫応答の比較のため、マウスに５μｇ／マウスの組換えＰ粒子−Ｈｉｓタグキメラ、およびＰダイマー−Ｈｉｓタグまたは野生型Ｐ粒子を投与した（ｎ＝５）。非露出ペプチドに対する免疫応答の比較のため、マウスに非露出ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含む組換えＰ粒子５μｇ／マウスを投与した。免疫源はフロイントアジュバントと共に皮下的に４回与えた。Ｐ粒子提示ＶＰ８および遊離ＶＰ８に対する免疫応答の比較のため、マウスに５μｇ／マウスの遊離ＶＰ８および１５μｇ／マウスのＰ粒子−ＶＰ８キメラ（両抗原はＶＰ８のモル量として同量である）を、アジュバントなしで鼻腔内またはフロイントアジュバントと共に皮下的に、３回投与で投与した（ｎ＝５〜７）。内部コントロールとして免疫源に等モル量のＧＳＴを加えた。保護のためのマウスのＰ粒子−ＶＰ８ワクチンの免疫は下に記載した。免疫前および最終免疫の２週間後に、逆軌道毛細血管叢の穿刺によって血液を採取した。血清は、血液から４℃で一夜静置後遠心分離によって処理した。
【０１１６】
ロタウイルスプラークアッセイを実施して、細胞培養中のロタウイルス複製に対する、ロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子によって誘導される抗血清の中和を測定した。ＭＡ１０４サル腎臓細胞で成長させた組織培養適応ロタウイルスＷａ株をこのアッセイに用いた。ＭＡ１０４細胞を６ウェルプレートで培養し、接種として〜５０プラーク／ウェルのロタウイルス力価を用いた。アッセイのために、ロタウイルスを所定の希釈のマウス血清と共に６０分間インキュベートした。次いで混合物を６ウェルプレート中のＭＡ１０４細胞に加えた。２時間後、プレートを洗浄し、次いで５μｇ／ｍｌのトリプシン（Invitrogen、Carlsbad、CA）および０．８％のアガロースを含む培地で被覆した。３７℃で４〜５日インキュベーション後、各ウェルのプラーク数を計測した。無処理コントロールウェルのものと比較した抗血清処理したウェルにおけるプラーク数の減少によって、血清中の中和抗体の量を測定した。
【０１１７】
マウスロタウイルスチャレンジモデル。以前の研究に記載のロタウイルスチャレンジモデルに従って、Ｐ粒子−ＶＰ８ワクチンの保護効率を試験した。ロタウイルス抗体を含まない６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５〜７）（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、IN）をアジュバントなしで、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子（１５μｇ／マウス）で３回、鼻腔内免疫した。遊離マウスロタウイルスＶＰ８抗原（５μｇ／マウス）およびヒトロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子（１５μｇ／マウス）を比較のために含めた。さらに、野生型Ｐ粒子（ベクターコントロール）およびＰＢＳをネガティブコントロールとして投与した。最後の免疫の２週間後、１０５の５０％排出用量と等しい４×１０４ＦＦＵ（フォーカス形成単位）の用量のマウスロタウイルスＥＤＩＭ株で、経口胃管栄養法によってチャレンジした。糞便中のロタウイルス排出を測定するため、ＥＤＩＭチャレンジ後６日間毎日各マウスから２個の糞便ペレットを採取し、１ｍｌのアールバランス化食塩水中に保存した。分析までサンプルを凍結保存し、その時点でそれらをホモジナイズし、遠心分離してデブリを除去した。糞便サンプル中のロタウイルス抗原の量（μｇ／ｍｌ）は、既報のとおりＥＬＩＳＡで測定した。
【０１１８】
統計的分析。GraphPad Prism version 5.00 for Windows（GraphPad Software、San Diego CA）およびMicrosoft Office Excel 2007を用いてグラフを作製した。GraphPad Prism version 5.00 for Windowsを用いたデータ群のｔ検定によってＰ値を決定した。
【０１１９】
結果
Ｈｉｓタグを含むキメラＰ粒子の製造。我々の研究は、Ｐ粒子のループ２に小さなエピトープ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを挿入することで開始した（図３および１４）。ＧＳＴ遺伝子融合系を用いた大腸菌におけるこのＰタンパク質の発現および精製は、高収率（＞１０ｍｇ／リットル培養）で予測したサイズ（〜３５ｋＤａ）を有するタンパク質が得られ、次いでトロンビンでＧＳＴタグを除去するために（〜２７ｋＤａ）タンパク質を消化した（図１４Ｃ）。ゲルろ過クロマトグラフィー、次いでＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によってキメラＰタンパク質のＰ粒子形成が示され、ここでキメラＰ粒子は〜８４０ｋＤａの主要なピークを形成した（図１４ＤおよびＥ、データは示さず）。キメラＰ粒子上での挿入したＨｉｓタグの露出は、Ｔａｌｏｎ樹脂へのその特異的結合、続く２５０ｍＭのイミダゾールによる溶出によって示され（図７Ａ、溶出１および２）、これは高純度のキメラＰ粒子をもたらした。したがって、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラはまた、アフィニティーＴａｌｏｎ樹脂を用いて大腸菌からも精製できる（データは示さず）。
【０１２０】
Ｐ粒子担体によるＨｉｓタグの免疫増進。Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラで免疫した後マウスにおけるＨｉｓタグに対する免疫応答の試験によってこれを測定した（ｎ＝５）。Ｐダイマー提示ＨｉｓタグよりもＰ粒子提示Ｈｉｓタグで免疫したマウスにおいて、有為に高いＨｉｓタグに対する抗体力価が検出された（Ｐ＜０．０５、図１５ＡおよびＢ）。ＰドメインのＮ末端（ＣＮＧＲＣ）またはＣ末端（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）に融合した２種の短いペプチドは、Ｐ粒子提示Ｈｉｓタグによって誘導されるものと比較して、有為に弱い免疫応答を誘導した（図１５Ｃ〜Ｆ）。これらの２種のペプチドは、Ｐ粒子の内側に埋め込まれることが示されており、このことは、免疫増進のためにＰ粒子の表面上に挿入された抗原が適切に露出されることが重要であると示している。予想通り、全ての血清はノロウイルスＰ粒子プラットフォームと強く反応した（図１５、データは示さず）。
【０１２１】
ロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子の開発。我々は次に、１５９アミノ酸を含むロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原の挿入によって、より大きなポリペプチドを得るためのＰ粒子プラットフォームの能力を試験した。ＶＰ８挿入を促進するために、Ｐ粒子のループ２に３個の酵素部位（Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩ）を有するクローニングカセットを構築した（図１６Ａ）。大腸菌における構築物の発現によって、高収率（＞１５ｍｇ／リットル培養）でＧＳＴ−Ｐ−ＶＰ８融合タンパク質（〜７８ｋＤａ、図１６Ｂの左パネル）が得られた。溶液中または精製ビーズ上のいずれかで、ＧＳＴ融合タンパク質のトロンビン消化によって、放出されたＰ−ＶＰ８キメラ（〜５２ｋＤａ）が得られた（図１６Ｂ、それぞれ中央および右パネル）。ゲルろ過クロマトグラフィーによってＰ−ＶＰ８キメラタンパク質が高い割合（＞９５％）でＰ粒子を形成することが示された（図１６Ｃ）。ウェスタンブロット分析によって、Ｐ−ＶＰ８キメラタンパク質がノロウイルスＶＬＰ（ＶＡ３８７）およびロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８に対する抗体両方と反応することが示された（図１６Ｄ）。
【０１２２】
Ｃｒｙｏ−ＥＭおよび３次元イメージ再構成によって、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラが野生型Ｐ粒子と同様の八面体シンメトリーのままであるが、キメラＰ粒子が顕著に大きいことが示された（図１ＡおよびＢ）。伸長した突起は、おそらく、Ｐダイマー由来の潜在的境界としてのニックによって認識されうる挿入されたＶＰ８である。キメラの伸長した突起の密度マップにおける同じＷａ株（２）のロタウイルスＶＰ８抗原の結晶構造の重ね合わせによって、伸長した突起が実際にＶＰ８であることが確認された（図１Ｃ〜Ｅ）。
【０１２３】
ＶＰ８に対するＰ粒子増進免疫応答。次に我々は、マウスにおけるＰ粒子提示ＶＰ８抗原に対する免疫応答を試験した。等モル量のＰ粒子−ＶＰ８キメラおよび遊離ＶＰ８での免疫後、抗原として遊離ＶＰ８を用いたＥＩＡによって得られたマウス血清を試験した。Ｐ粒子提示ＶＰ８に対する抗体力価は、アジュバントなしでの鼻腔内免疫による遊離ＶＰ８に対するものよりも有為に高かった（Ｐ＜０．００５）。同様の結果が、それぞれロタウイルスＷａおよびＤＳ−１のＶＰ８抗原を含む２種のキメラＰ粒子とそれらの対応遊離ＶＰ８の比較において観察された（図１７ＡおよびＢ）。これらの動物において遊離ＧＳＴに対してはわずかにのみ抗体力価が検出され、Ｐ粒子提示ＶＰ８の特異的免疫増進がさらに確認された。フロイントアジュバントと共に上記抗原で皮下免疫したマウスの免疫応答も試験したところ、遊離ＶＰ８とＰ粒子提示ＶＰ８の間でＶＰ８に対する抗体力価の差はほとんど観察されなかった（図１７Ｃ）。
【０１２４】
Ｐ粒子−ＶＰ８キメラはロタウイルスに対する中和抗体を誘導した。鼻腔内免疫を介したＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ、［Ｐ］８）キメラによって誘導された過免疫抗血清は（図１７Ａ）、細胞培養中の同族ロタウイルス（Ｗａ）複製を強く低減した。この中和力価は、遊離ＶＰ８での免疫によって誘導した中和力価よりも有為に高かった（Ｐ＜０．０００２）（図１８Ａ）。Ｐ粒子−ＶＰ８（ＤＳ−１、［Ｐ］４）キメラでの免疫後、Ｗａに対する低レベルの交差中和も観察された（Ｐ＜０．０５、図１８Ｂ）。反対に、ＤＳ−１の遊離ＶＰ８で免疫した動物由来の血清は、かかる交差中和を示さなかった。さらに、フロイントアジュバントと共に皮下免疫した動物由来の血清を用いた中和力価も測定した。驚くべきことに、ＥＩＡにおいて遊離ＶＰ８抗原と同様の免疫反応性を有する４対のマウス血清のうち（図１８Ｃ）、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）で免疫した動物由来の血清が全て、同じＷａ株の遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清のものよりも有為に高い中和力価を示した（Ｐ＜０．００５、図１８Ｄ）。これらのデータは、キメラＰ粒子上のＶＰ８がより良好に提示され、中和エピトープに必要な適切なコンホメーションを維持しうることを示した。
【０１２５】
Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのワクチン接種はマウスロタウイルスチャレンジ後の低下した排出を引き起こした。次に我々は、マウスロタウイルスモデル（ＥＤＩＭ株）を用いてインビボで、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラワクチンが保護を与えうるかを試験した。この目的で、ＥＤＩＭ ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子を材料および方法に記載のとおりに構築し、マウスに投与した（Ｎ＝５〜７）。同モル量の遊離ＥＤＩＭ ＶＰ８、ヒトＶＰ８（Ｗａ）を有するキメラＰ粒子または野生型Ｐ粒子で免疫した動物は、コントロールとして含めた。最後の免疫の２週間後、マウスＥＤＩＭロタウイルスで動物をチャレンジした。チャレンジの６日後に糞便サンプルを採取し、ＥＩＡで排出を検出した（表１、図１９）。Ｐ粒子−ＶＰ８（ＥＤＩＭ）キメラをワクチン接種されたマウスは、最も少ない量のウイルス抗原を排出した。排出の減少は６日間で８９％であった（Ｐ＜０．０５）。ＥＤＩＭでのチャレンジの１日後では９９．２％の減少であった。遊離マウスＶＰ８で免疫したマウスは、次に少ない排出量であり、７７％の平均保護であった（Ｐ＜０．０５、２〜５日）。ヒトロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８を含むキメラＰ粒子ワクチンでの免疫は、２３％減少と排出に対してわずかな効果を有し、これはＥＤＩＭに対する何らかの交差保護を示唆している。この群での６日目に、排出が顕著に減少した（６３％、Ｐ＜０．０５）。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
ノロウイルスとＨＢＧＡの結合を遮断するＰ粒子−ＶＰ８キメラ誘導性抗体での免疫。また、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラでの免疫によって、マウスでの免疫応答におけるＰ粒子骨格の役割を試験した。予測したとおり、キメラ誘導性抗体は、ＥＩＡで測定したときノロウイルスＶＬＰおよびＰ粒子と強く反応した（図２０、データは示さず）。これらの血清はまた、ＨＢＧＡレセプターとノロウイルスＶＬＰの結合も遮断した（タイプＡ唾液、図２０Ｂ）。ネガティブコントロールとして遊離ＶＰ８（Ｗａ）で免疫した動物由来の血清はかかる遮断を示さなかった。この結果は、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラがロタウイルスおよびノロウイルスの両方に対するデュアルワクチンであり得ることを示している。
【０１２８】
我々の以前の研究により、ノロウイルスＰ粒子が容易に製造でき、極めて安定で高度に免疫原性であり、これはノロウイルスに対するサブユニットワクチンとして使用できることが示された。我々はさらに、外来抗原の免疫増進のための新規ワクチンプラットフォームとしてＰ粒子が使用できることを示した。我々は、１）Ｐ粒子の表面ループがＰ粒子の形成および作製に影響を与えることなく外来抗原を挿入するための優れた部位であること、２）Ｐ粒子が少なくとも１５９アミノ酸までのサイズの外来抗原に耐えること、３）挿入抗原に対する増進された免疫応答がインビトロおよびインビボ両方での中和および保護実験によって示されることを示した。Ｐ粒子−ＶＰ８キメラはまた、ロタウイルスおよびノロウイルスの両方に対する有望なデュアルワクチンを提供した。したがって、複数多価外来挿入の能力を有するキメラ粒子およびその複数の表面ループを作製するための単純な手法は、Ｐ粒子を感染症および効果的なワクチンから利益を得るであろう他の状態の抗原提示のための魅力的なワクチンプラットフォームにする。
【０１２９】
本発明の第一次的な目標は、一般に免疫原性が低い小ポリペプチド抗原の免疫原性をＰ粒子が増進できるかを試験することである。我々は、モデルとしてＨｉｓタグを用いてこの問題を研究し、すばらしい結果を得た。２つの主要な要因、複数コピー数および挿入された抗原の表面露出が、観察された免疫増進に寄与している可能性がある。Ｐ粒子はＰモノマーの２４個のコピーからなり、このことはＰダイマーと融合したＨｉｓタグとの比較において増進した免疫応答を説明できる（図１５Ａ）。抗原の表面露出の重要性は、ＰドメインのＮまたはＣ末端と結合した２個の非露出ペプチドに対する低い免疫応答性によって示された（図１５ＢおよびＣ）。したがって、Ｐ粒子はその大きなサイズ（８３０ｋＤａ）および適切な外来抗原の提示（これと異なるものは低い免疫原性を有する）によってアジュバントとして作用しうる。粒子あたりの抗原の増加した複数コピーは、増加した免疫応答を説明しうる別の特徴である。
【０１３０】
Ｈｉｓタグペプチドに加えて、我々はＰ粒子に多数の他の小ペプチド、例えばマウスサイトメガロウイルスのＴ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属Ｅｐｉ８エピトープ（１４アミノ酸）およびインフルエンザＡのＭ２細胞外エピトープ（２３アミノ酸）の挿入に成功した（Tan and Jiang、未公表）。これらのデータは、Ｐ粒子が多様な小ペプチド抗原の免疫増進に容易に利用できることを示唆している。Ｐ粒子への様々なロタウイルスＶＰ８の挿入成功は、広範な大型外来抗原のためのＰ粒子プラットフォームの適用を大きく拡張する。ロタウイルスＶＰ８はウイルスカプシド上の突起タンパク質であり、ロタウイルス感染性に重要であると考えられている。また、それは中和抗体を誘導する２種の抗体の一つでもある。ＶＰ８タンパク質について多数の中和エピトープが同定されている。Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの中和抗体誘導成功は、マウスにおけるロタウイルス排出に対して応答し、それに対する保護を提供する。このことは、これらのエピトープがＰ粒子担体上で提示されていることを示唆している。
【０１３１】
２種の近年導入されたロタウイルスワクチンは極めて有効であるが、新たな出現ウイルスのための新世代ワクチンが潜在的に必要とされうる。非感染性サブユニットワクチンは、現在のワクチンで心配されうる毒性株への復帰の危険がない。ロタウイルスのＶＬＰワクチンの開発は数年来提案されている。ロタウイルスＶＬＰワクチンは、バキュロウイルス宿主に複数のカプシドをコトランスフェクションする必要があるため、低い発現効率と高い製造コストの問題がある。反対に、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの作製は常套の大腸菌ベースのクローニングおよび発現手法のみを必要とし、これは効率がよくコストが低い。さらに、ＶＰ８についての交差中和エピトープが記載されている。我々は本稿において、Ｐ［４］ウイルス由来ＶＰ８を含むキメラＰ粒子でのマウスの免疫がＰ［８］ロタウイルスに対する交差中和を有することを示した。最小数のＰタイプを含むカクテルワクチンもコスト的に有効であり得る。
【０１３２】
Ｐ粒子−ＢＰ８キメラによって誘導される抗体の、ノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡの結合を遮断する能力は、予測外である。図１に示すとおり、Ｐ粒子のＨＢＧＡ結合界面を含むＰダイマーの遠位表面は、挿入されたＶＰ８によってほとんど被覆されている。これはＨＢＧＡレセプターに対する該キメラの結合能の喪失を導く（データは示さず）。継続して遮断能が見られたことの一つの可能性は、挿入されたＶＰ８抗原によって被覆されていても、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのＨＢＧＡ結合界面のエピトープが抗体誘導のためになおもアクセス可能であるということである。あるいは、観察された糖遮断は、糖結合部位の近くでの抗体結合のためでありうる。どのようなメカニズムが関与するにせよ、キメラ誘導性抗体のノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡとの結合を遮断する能力は、Ｐ粒子プラットフォームにさらなる価値を付け加える。ノロウイルスおよびロタウイルス両方に対するＰ粒子−ＶＰ８キメラのデュアルワクチンのコンセプトは、両方の感染の危険がある特定の集団に特に有用でありうる。
【０１３３】
ループ２のみがこの研究では試験されたが、他の２つのループにおける抗原挿入成功の可能性が予測され、我々の研究室で現在試験している。Ｐモノマーあたり３個の表面ループの利用可能性は、多目的ワクチン設計の機会を提供する。例えば、免疫応答を上昇させるため、同じエピトープまたは抗原を３個のループ全てに挿入して、粒子あたり７２コピーの抗原に到達できる。それぞれの抗原のタンデム反復の挿入によって、より多いコピー数すらも作製できる。あるいは、異なる抗原を３個のループに挿入して、異なる病原体またはロタウイルスについて異なるＶＰ８抗原に対する多価ワクチンを得ることができる。様々な目的のための機能的タグの挿入によって、さらなるワクチンテンプレートも作製できる。例えばＨｉｓタグの挿入は、精製手法をさらに単純にする。特定のリガンドまたはシグナル分子を用いて、宿主の特定の臓器、組織または細胞を標的とすることによって、免疫応答を刺激してもよい。
【０１３４】
Ｐ粒子プラットフォームのさらなる適用は、研究および診断的使用のための小ペプチドに対する抗体の製造用である。多様な疾患バイオマーカー（主としてペプチドエピトープ）が同定されており、これらのバイオマーカーに対する抗体が診断目的では重要である。小ペプチドは、ＤＮＡクローニングの単純な手法によってＰ粒子のループに容易に挿入できる。我々は、そのプロセスをさらに促進するクローニングカセットを含む簡便なＰ粒子ベクターを開発した。細菌における組換えキメラＰ粒子の発現の後、本研究で確立された手法にしたがって実験動物を免疫することによって、挿入したペプチド抗原に特異的な抗体を高力価で誘導できる。この方法による抗体製造は、ペプチド合成および免疫増進のためのキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のような巨大分子とペプチドとのコンジュゲートのようなコストのかかる工程を回避する。ノロウイルスＰドメインは他のタンパク質のいずれとも相同性を有さない固有の配列を有しているため、他のタンパク質との交差反応性の心配にはおよばない。したがって、Ｐ粒子ワクチンプラットフォームは、生物医学的研究の多くの領域における抗体製造のための簡便なツールとして使用できる。
【０１３５】
本発明をその態様の解説によって説明し、その態様をかなり詳細に説明してきたが、いかなる方法においても、添付の特許請求の範囲がかかる詳細に限定されることを意図していない。さらなる利点および修飾が当業者に容易に理解される。したがって本発明は、そのより広い局面において、特定の詳細、代表的な系および方法、ならびに示し記載した実施例に限定されない。したがって、本発明の範囲または精神から離れることなく、かかる詳細から逸脱してもよい。
【技術分野】
【０００１】
利害関係
本発明は、合衆国政府の支援の下になされ、National Institute of Health（NIH）、National Institute of Allergy and Infectious（認可番号R01 AI37093およびR01 AI055649）およびDepartment of Defense（認可番号PR033018）によってXi Jiangへと表彰された。この研究はUniversity of CincinnatiおよびCincinnati Children's Hospital Medical Center（Center for Clinical and Translational Science and TrainingからのＴ１助成金）によってMing Tanへも支援された。さらに、Ming TanへのNipert Foundationが出資する感染症助成金がこの研究に寄与した。合衆国政府は本発明についての一定の権利を保有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ノロウイルス（ＮＯＲ）カプシドタンパク質のＰドメインおよびＮＯＲ Ｐ粒子、抗原−ノロウイルスＰドメインモノマー、抗原−ノロウイルスＰドメインダイマーおよび抗原−ノロウイルスＰ粒子分子の製造、ならびに抗ウイルス剤、薬物送達系およびワクチン開発のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
生体材料および生物工学は、現代医学の重要な部分となりつつある急速に成長している分野である。ウイルス性タンパク質ケージは、その万能性およびアレイを形成する傾向のため、提示系を構築するための理想的な基板である。遺伝子操作を通じて、自己集合性ウイルス構造タンパク質は、生体材料合成のための傑出したプラットフォームであり、そして設計されたパターンで外来分子を統合するためのスキャフォールドであり、これはワクチンまたは薬物として使用できる。
【０００４】
抗原提示のためにウイルス粒子を用いる最近の例は、Manayani et alに記載の、炭疽菌（Bacillus anthracis）の１８０アミノ酸抗原挿入を有するフロックハウスウイルス（ＦＨＶ）ＶＬＰのキメラである。組換えウイルス様粒子は、炭疽抗毒素として、かつ、炭疽菌ワクチンのための分子スキャフォールドとして機能し、炭疽抗毒素およびワクチンの機能を１個の化合物に組み合わせる。別の例は、Chatterji et al.に記載のCowpeaモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）であり、これは、エピトープ提示ならびにペプチドおよびタンパク質の付着のためのマトリックスとしての両方のための、Cowpeaモザイクウイルスの使用を含む。全タンパク質は、正二十面体のＣＰＭＶ粒子のコートタンパク質において遺伝的に操作されたリシンおよびシステイン残基と、化学的に架橋結合されている。また、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）の表面抗原（ＯｓｐＡ）を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）カプシド様粒子（ＣＬＰ）が記載されている。
【０００５】
ノロウイルス（ＮＯＲ）は、以前は「ノーウォーク様ウイルス」（ＮＬＶ）または小型球形ウイルスとして知られており、先進国および発展途上国の両方で生じる、伝染性急性胃腸炎の最も重要なウイルス性病原体である。これらの遺伝的に多様なウイルスは、２個の主要な遺伝子グループ（ＧＩおよびＧＩＩ）ならびに約３０個の遺伝子型を含む。ＮＯＲはカリシウイルス科（Caliciviridae）に属し、正二十面体の一本鎖のポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、そのカプシドは１個の主要構造タンパク質の１８０個のコピーからなる。
【０００６】
過去、ヒトＮＯＲの生物学的特徴付けは、該ウイルスが細胞培養では効率的に増殖せず、ウイルス複製のための好適な動物モデルが構築されなかったために、妨害されていた。発生およびヒトボランティア試験から得られたヒト糞便サンプルが唯一のウイルス源であったが、糞便中のウイルス濃度は、通常の電子顕微鏡によるウイルス検出が不可能であったほど低い。しかし、近年の昆虫細胞中のバキュロウイルス（主として昆虫に感染する二本鎖ＤＮＡウイルス）によるＮＯＲカプシドタンパク質発現の成功が、ＮＯＲの免疫学、疫学および発症機序の研究のための有用な別法を提供している。ウイルスカプシドタンパク質モノマーは、自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作り出す。これらのＶＬＰは形態学的および抗原的にヒト糞便において見られる真菌とは区別不可能であり、免疫学的アッセイの開発およびレセプター−ウイルス相互作用の研究に有用なツールを提供する。
【０００７】
組換えＮＯＲカプシドタンパク質の原子構造は、それがＴ＝３正二十面体を形成する９０個のダイマーカプソメアに組織された１８０個のカプシドタンパク質モノマーを含むことを示している。低温電子顕微鏡およびＸ線結晶学からのデータは、該ウイルスカプシドタンパク質が２個の主要なドメイン、Ｎ末端シェル（Ｓ）ドメインおよびＣ末端突起（Ｐ）ドメインに折り畳まれることを示した。Ｓドメインは内部のシェルを形成し、一方でＰドメインは、シェルから伸長もしくは突出するアーチ様構造を構築する。形態形成の研究により、Ｓドメインがカプシドの内部シェルの構築に必要な要素を含むが、Ｐドメインのダイマーサブユニット間の分子間接触がカプシドの安定性を増加することが示された。これら２個のドメインは、８〜１０残基（アミノ酸）のヒンジを介して結合している。ＰドメインはさらにＰ１およびＰ２ドメインに分けられ、後者はカプシドの最も外側表面に位置する。ＳおよびＰ１ドメインとは異なって、Ｐ２ドメインは高い配列バリエーションを有する。Ｐドメインはウイルス粒子の最も外側表面に位置し、最も変化しうる配列を有するため、Ｐドメインが宿主相互作用、免疫認識、レセプター結合および免疫応答に関与すると考えられている。ヒンジを有する（しかしＳドメインを欠く）単離されたＰドメインが、ヒト組織−血液グループ抗原（ＨＢＧＡ）レセプターの構築を維持するダイマーをインビトロで形成することが示されている。
【０００８】
ＨＢＧＡは、複合グリカンと関連糖の異種グループである。ＮＯＲは多様な、株特異的な手法で、ヒトＨＢＧＡをレセプターとして認識する。ＨＢＧＡの中で、最も一般に遭遇する血液グループはＡＢＯ（ＡＢＨ）およびLewisである。ＡＢＨおよびLewis血液グループ系において抗原の形成に使用される生合成経路は、相互に関連している。
【０００９】
ヒトＨＢＧＡは赤血球および血管内皮細胞を含む多くの細胞タイプ、ならびに消化器、尿生殖器および呼吸管の粘膜上皮に存在する。それらはまた、血液、唾液、消化器内容物および乳のような生物学的液体中で可溶形態でも存在しうる。ＨＢＧＡは遺伝子的に制御され、ＡＢＯ、Lewisおよび分泌遺伝子ファミリーとして知られる一組のグリコシルトランスフェラーゼを介して、単糖ユニットの段階的添加によって、一連の前駆体構造から合成される。
【００１０】
ヒトＨＢＧＡ系は高度に多形性であり、サイレントアレルを含む複数の遺伝子ファミリーによって制御される。細胞表面上でのＨＢＧＡのような多様化した分子の存在は、外部環境変化に対する宿主防御メカニズムの可能性を示す。それにもかかわらず、ＨＢＧＡは多様な細菌性およびウイルス性病原体による感染と関連しており、ノロウイルスの「ドッキングステーション」を提供しうる。すなわち、ＨＢＧＡは病原体にとっての認識標的であり、抗原とのレセプターリガンド結合を発現または形成する細胞への侵入を促進しうる。かかる相互作用の正確な性質は未だ知られていないが、生じる病原体と抗原構築との密接な関連は、感染プロセスにおける最初のステップとして、細胞への病原体の係留に重要な役割を果たしうる。
【００１１】
ＮＯＲによるヒトＨＢＧＡの認識は典型的なタンパク質−糖相互作用であり、ここで、ウイルスカプシドタンパク質の突起ドメインは、様々な株において広い多様性を有するＨＢＧＡ抗原のオリゴ糖側鎖による界面を形成する。腸管内でのみ複製可能な病原体として、ＮＯＲは、宿主防御系を克服するユニークな戦略を開発している。これは、なぜＮＯＲ関連疾患が世界中のあらゆる集団で一般的であり拡がっているかを説明する、それらの遺伝的および構造的バリエーションによって示されている。
【００１２】
２００３年１２月２日に公開されたＰＣＴ公開公報US2003/101176（その全体について参照により本明細書に組み込む）は、複数の異なる組織−血液グループパターンの一つにおけるＮＯＲ株とＡＢＯおよびLewisＨＢＧＡの結合に関する。ＮＯＲによるＨＢＧＡの認識は株特異的であり、多数の異なるＨＢＧＡ結合パターンが同定されている。ＮＯＲの多様性および宿主細胞表面における糖の多形性に基づいて、より多くの結合パターンが発見されうる。
【００１３】
２００６年１２月２８日に公開されたＰＣＴ公開公報US2006/138,514（その全体について参照により本明細書に組み込む）は、ＨＢＧＡとの向上した結合親和性を示す、Ｐ粒子として知られる小さな粒子に関する。Ｐ粒子は、１２個の同一のＰドメインダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーによって構築されるＴ＝１正二十面体である。１２個（Ｐドメインダイマー）および２４個（Ｐドメインモノマー）は、植物および動物ウイルスについて頻繁に生じる正二十面体シンメトリーについての完全単位数である。単離された、モノマーカプシドタンパク質のＳドメインまたはヒンジを含まないＰドメインは、１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーからなる複合体である、Ｔ＝１正二十面体Ｐ粒子を自然発生的に形成できる。Ｐ粒子は対応するＨＢＧＡと結合でき、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡとの結合の強い遮断を示す。Ｐ粒子の自然発生的形成は、ＶＡ３８７、ＭＯＨおよびノーウォークウイルス（ＮＶ）を含む多様なＮＯＲ株で観察されている。ＮＯＲ Ｐ粒子は、ＮＯＲ感染の治療処置およびＮＯＲ感染に対するワクチンの作製において有用である。
【００１４】
ロタウイルス（ＲＶ）およびＮＯＲはいずれも、疾患の大きな負担を招く世界中で一般的な病原体である。世界基準で、５歳未満の小児において毎年、全原因の胃腸炎が最大10億事象生じており、その１３〜２５％（〜1億3000万事象）がＲＶによって引き起こされる。ＲＶは、小児の様々な下痢および脱水の主たる原因であり、毎年重度のＲＶ胃腸炎によって35万〜60万人の５歳未満の小児が死亡している。それはまた、年間200万人の小児の入院に寄与しており、その費用は10億ドルを超えると予測される。他方、ＮＯＲはあらゆる年齢の個体が罹患する急性胃腸炎の非細菌性流行の最も重要な原因である。ＮＯＲは極めて接触感染性であり、急速に拡大して多様な状況で大流行を導く。近年の報告では、発展途上国においてＮＯＲは、毎年５歳未満の小児における1,091,000件の入院および218,000人の死亡を引き起こしていると予測された。米国において、食品媒介性病原体は、毎年推定7600万人に感染しており、325,000件の入院の原因である。ＮＯＲは単独で、臨床治療およびリコールされた食品による損失のために、毎年3億5000万〜7億5000万ドルの損害を引き起こしている。
【００１５】
２種の新たなＲＶワクチン（Rotarix(商標), GlaxoSmithKline および RotaTeq(登録商標), Merck）が近年導入されているが、これらのワクチンに関する十分に解決されていない次のような様々な問題が存在する：ａ）ワクチンにおいて見られるものよりも広い範囲のＲＶ血清型にワクチン接種およびワクチン非接種小児が曝露された際の有効性；ｂ）ワクチンが最も必要とされる貧困国にこれらのワクチンをどのように分配するかという問題を導く、ワクチンのコストおよび分配コスト；ならびにｃ）死亡率が最も高い発展途上国における保護のレベル。これらの弱毒化生ワクチンは、復帰し、最集合して、毒性株を生じる可能性がある。したがって、極めて有効なＲＶ中和エピトープを含む、新世代のサブユニットワクチンが必要とされている。現在、ＮＯＲ関連疾患に対する処置は存在しない。したがって、ＮＯＲおよびＲＶに対して有効なワクチン、特に両方に対して保護ができる単一のワクチンの開発は、主要な臨床的必要を充足し、さらに本明細書に記載のＰ粒子ワクチンプラットフォームの顕著な販売潜在力を強調する。
【００１６】
ＮＯＲ感染の治療処置およびそれに対するワクチン開発における進歩にもかかわらず、他のウイルスタイプによって引き起こされる感染の同定の改善、他のウイルスタイプの治療処置、他のウイルスタイプに対するワクチン開発、ならびに特定の組織または臓器を標的とする改善された薬物送達系を開発する必要がなおも存在する。
【発明の概要】
【００１７】
発明の概要
本発明は、ＮＯＲ Ｐドメインモノマーの遠位部分が外来抗原、特に外来ウイルス性抗原を挿入できるペプチド鎖を含むという発見に関する。得られる抗原−Ｐドメインモノマーは、１２個のダイマーに組織される２４個の抗原−Ｐドメインモノマーからなる、典型的には八面体形態の、抗原−Ｐ粒子と称される、ナノ粒子に自然発生的に集合しうる。このＰ粒子は大腸菌において容易に製造され、極めて安定であり、免疫原性が高い。Ｐドメインモノマーあたり３個の表面ループが存在し、これは粒子あたり合計７２個のループとなり、免疫増進のための外来抗原提示の潜在的部位である。抗原−Ｐ粒子は自然発生的に形成され、そしてＰドメインモノマーの遠位部分で提示される外来抗原を有する。この抗原−Ｐ粒子形成プロセスは、抗原−Ｐダイマーの濃度に基づいて交換し、または動的に平衡化しうる。抗原−Ｐ粒子は、外来ウイルス性抗原に対する抗体を産生し、またかかる外来ウイルス感染のためのワクチンを作製するために有用である。
【００１８】
本発明の第一の局面は、多様な感染性病原体の抗原を提示するためのプラットフォームとして使用するための修飾ＮＯＲ Ｐ粒子に関し、したがってこれらの疾患に対する新たなワクチン戦略を提供する。このプラットフォームはまた、ワクチンの開発のため、あるいはがん、アレルギーおよび自己免疫疾患を含む非感染性疾患の処置のための、薬物の担体または薬物送達ビークルとしても有用である。多数の他のワクチンプラットフォームと比較して、本抗原−Ｐ粒子系は、単純な精製手法に伴う高収率および低製造コスト、ならびに高い抗原提示効率を含む多くの利点を有する。
【００１９】
本発明の抗原−Ｐ粒子は、ＮＯＲカプシドの突起（Ｐ）ドメインによって形成され、ダイマーに組織されるＰドメインモノマーの２４個のコピーを含む。抗原−Ｐ粒子の分子量およびサイズ（ＭＷ＝約８３０ｋＤａおよびΦ＝２０ｎｍ）は、サブユニットワクチンとして有効なサイズである。外来抗原は各Ｐドメインモノマーに存在する３個の表面ループの１個以上に挿入され、それによって各抗原−Ｐ粒子の表面で、外来抗原の７２個までのコピーを提示する。１個の抗原−Ｐ粒子上の外来抗原の多重性は、外来抗原の抗原性および免疫原性を大きく向上させる。小さなポリペプチドから大きなタンパク質まで多様なタイプおよびサイズの外来抗原が３個の表面ループのいずれか１個以上に挿入されてよく、外来抗原の代表例としては次のものを含む：Ｈｉｓタグ（７個のヒスチジン）、マウスサイトメガロウイルスのＴ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属のＥｐｉ８抗原（１０アミノ酸）、ロタウイルス（ＲＶ）のＶＰ８（１５９アミノ酸）および緑色蛍光タンパク質（２３８アミノ酸）。
【００２０】
ＮＯＲ Ｐ粒子は、極めて安定であり、広範な物理化学的条件に耐性である。最も重要なことに、製造のために真核細胞系を必要とする多くの他の組換えサブユニットワクチンとは異なって、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子同様、抗原−Ｐ粒子は、大腸菌および酵母または他の細菌源において、極めて高い収率および単純な精製手段で容易に製造できる。
【００２１】
本発明の第二の局面は、簡便なクローニングカセットの挿入によって、各Ｐドメインモノマー上に存在する表面ループの１個以上に候補外来抗原を挿入するためのユーザーフレンドリーな方法である。クローニングカセットは、典型的には、Ｐドメインベクターの１個以上のループに、制限部位または制限認識部位としても知られる特異的認識ヌクレオチド配列の１個以上、典型的には少なくとも１個の対を含む。制限部位は制限酵素によって認識される特異的なヌクレオチド配列である。該部位は一般にパリンドロームであり（制限酵素は通常ホモダイマーとして結合するため）、特定の制限酵素は典型的には、その認識部位内またはその近くのどこかの２個のヌクレオチド間の特定のＤＮＡ配列を切断する。例えば、一般的な制限酵素ＥｃｏＲＩは、パリンドローム配列ＧＡＡＴＴＣを認識し、ＤＮＡ鎖の上下両方のＧとＡの間を切断し、各末端にオーバーハング（結合した相補鎖のないＤＮＡ鎖の末端部分）を残す。次いでこのオーバーハングまたは「付着末端」は、相補的オーバーハングを有するＤＮＡ片（例えばＤＮＡの他のＥｃｏＲＩ切断断片）を加えまたはライゲート（ＤＮＡリガーゼを介して）するために使用できる。各Ｐドメインモノマー上に存在する表面ループの１個以上における制限部位を使用することで、表面ループのいずれか１個以上にクローニングカセットに含まれる外来遺伝子を置換でき、またＰドメインモノマーの３個のループの異なる一つに、２個以上の異なる外来抗原または他のクローニングカセットを置換できる。
【００２２】
本発明の別の局面は、１２個のダイマーの対として、２４個のＰドメインモノマーの自然発生的集合による、抗原−Ｐ粒子の形成である。全てのＰドメインモノマーが同一である場合、抗原−Ｐ粒子は同種Ｐ粒子と呼ばれる。
【００２３】
本発明の別の局面は、２個以上の異なって修飾された抗原−Ｐドメインモノマー、または少なくとも１個の種々に修飾された抗原−Ｐドメインモノマーおよび野生型Ｐドメインモノマーを含む、異種抗原−Ｐ粒子の形成である。種々に修飾された抗原−Ｐドメインモノマーまたは野生型Ｐドメインモノマーは、広範な抗原−Ｐ粒子を得るために、任意の比（分子量または重量比）で使用できる。
【００２４】
本発明の別の局面は、ウイルスに対する免疫保護を与えるための候補ワクチンとしての、Ｐ粒子内の各Ｐドメインモノマーの表面ループの少なくとも１個に挿入された特異的ウイルス性抗原、例えばロタウイルス（ＲＶ）抗原を有する、抗原−Ｐ粒子の使用である。
【００２５】
本発明の別の局面は、ウイルス性疾患からヒトを保護する方法であって、滅菌、非毒性の薬学的に許容される担体中の、本明細書に記載のＰ粒子内のＰドメインモノマーの表面ループの少なくとも１個に挿入された特異的ウイルス性抗原を有する抗原−Ｐ粒子の免疫量をヒトに投与することを含み、ここで前記抗原がウイルス性抗原である、方法に関する。
【００２６】
本発明の別の局面は、ウイルス性疾患に対する個体の免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載の抗原−Ｐ粒子および医薬担体を含む組成物の少なくとも１個の免疫学的有効量を個体に経口または非経口投与する工程を含み、ここで前記抗原がウイルス性抗原であり、量が個体の免疫応答を誘導するのに有効である、方法に関する。
【００２７】
本発明の別の局面は、抗原−Ｐ粒子ベクター／ワクチンプラットフォームキットである。
【００２８】
本発明の別の局面は、Ｐドメインモノマーの１個以上の完全に露出したループのクローニングカセットへの、固有または稀少な制限部位を含む制限部位の導入に関する。制限部位を含むクローニングカセットの挿入に関して、ループのクローニングカセットへのプロテアーゼ認識配列の挿入を避けることが推奨される。例えば、ＢｇＩＩＩ部位（ＡＧＡＴＣＴ）は、典型的なトリプシン切断部位であるジアミノ酸制限部位をコードし、避けられるべきである。
【００２９】
本発明の別の局面は、最適にある外来抗原を適合させるために、ループの露出を伸長するスペーサーまたはアームを加えることを含む、ループの１個以上の修飾に関する。
【００３０】
本発明の別の局面は、ＲＶ ＶＰ８のような大きな抗原がより小さな外来抗原を有する隣のループを、このループにおける小さなエピトープの提示が困難となるように覆わないように、異なる抗原が複数挿入されている設計に関する。
【００３１】
本発明の別の局面は、遠位表面の１個以上に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有する置換Ｐ粒子がもたらされる、Ｐドメインモノマーの表面ループの１個以上へのリガンドまたはシグナルペプチドの挿入に関する。このリガンドまたはシグナルペプチドは、次いで、特定の臓器または組織の対応するレセプターに置換Ｐ粒子を標的化し、それらの位置に移動させられる。例えば、ペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸）を有する置換Ｐ粒子は、ＣＮＧＲＣのレセプター（ＣＤ１３）が高度に発現している腫瘍組織（すなわち癌）に移動できる。
【００３２】
本発明の別の局面は、化学反応によって表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されている薬物のコンジュゲートを有する、置換Ｐ粒子モノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子に関する。この場合、置換Ｐ粒子は薬物の担体として使用される。
【００３３】
本発明の別の局面は、表面ループの少なくとも１個に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有し、そして表面ループの少なくとも１個に挿入された薬物のコンジュゲートを有する、置換Ｐモノマーならびにそれから形成されたダイマーおよびＰ粒子に関する。
【００３４】
本発明の別の局面は、修飾または抗原−Ｐドメインモノマーの修飾された遺伝子コードの遺伝子配列である。
【００３５】
本発明の別の局面は、修飾または抗原−Ｐドメインモノマーの修飾された遺伝子コードを有する複製生物学的物体（例えば大腸菌）である。
【００３６】
本発明の性質および利点は、本明細書に記載の、そして添付の特許請求の範囲によってより具体的に定義されている意図する新規構成、組合せおよび要素を示す下記図面および詳細な説明からより十分に理解されるが、先行技術によって除外されない限り、本発明の正確な態様における変化が特許請求の範囲に含まれることを意味すると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのＣｒｙｏ−ＥＭ構造を示す。（Ａ）野生型Ｐ粒子。（Ｂ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラ。野生型Ｐ粒子と比較して、キメラは、中央にニックを伴う伸長された突起を示し、これはＰ２サブドメインと挿入されたＶＰ８抗原との間の境界を示唆する。（Ａ）および（Ｂ）における粒子の半径は、示したとおり異なるカラースキームによって示される。（Ｃ）ロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原の２つのコピーの結晶構造（模式図、緑および青）の、キメラの伸長された突起の密度マップ（透明なグレー）への重ね合わせであり、キメラＰ粒子上でのＶＰ８抗原の露出が確認される。（Ｄ〜Ｅ）Ｐ粒子−ＶＰ８の突起を拡大した側面図（Ｄ）および上面図（Ｅ）。
【図２】ＮＯＲカプシドおよびカプシドタンパク質（ＶＰ１）を示す。ＡおよびＢは、ノーウォークウイルス様粒子（ＮＯＲ ＶＬＰ）の表面構造（Ａ）および断面（Ｂ）を示す。ＣはＶＬＰの基本単位であるＶＰ１のダイマー（リボンモデル）を示す。各ＶＰ１は、Ｎ末端アーム（緑）、シェル（Ｓ）ドメイン（黄色）および突起（Ｐ）ドメインに分けられる。Ｐドメインはさらに、Ｐ１およびＰ２サブドメイン（それぞれ赤および青）に分けられ、Ｐ２はＶＬＰの最も外側の表面に存在する。ＶＰ１の直線構造を同じカラーテーマでＤに示す。
【００３８】
【図３】ＮＯＲ Ｐ粒子およびその表面ループの構造を示す。（Ａ）はｃｒｙｏ−ＥＭによって再構成されたノロウイルスＰ粒子の構造を示し、（Ｂ）は結晶構造（リボンモデル）において解明された、Ｐダイマーの最も外側の領域であるその突起の一つを示し、ダイマーの６個の表面ループを示している。赤−緑および青−黄色は、それぞれ２個のＰドメインを示す。抗原挿入に好適な部位である各モノマーの３個の表面ループが示されている。２個のＰドメインモノマーは安定なグローバルＰダイマーを形成する。次いで、１２個の同一のＰダイマーが集合して、Ｐダイマーの濃度に依存して動力学的に交換および／または平衡するＴ＝１正二十面体Ｐ粒子となる。Ｐドメイン間の分子内相互作用がＰ粒子形成の原動力である。末端結合システインは、分子内ジスルフィド結合を形成してＰ粒子を安定化できる。
【００３９】
【図４】ＮＯＲ Ｐダイマー−Ｂ−トリサッカライド複合体の結晶構造を示す。トリサッカライド（ウイルス性レセプター）は、リボンモデル中に存在するアーチ様Ｐダイマーの上部に、球で存在する。
【００４０】
【図５】ＮＯＲ Ｐ粒子が野生型ＮＯＲ ＶＬＰと同様の免疫原性および免疫反応性を有することを示す。Ａにおいて、ＮＯＲ株ＶＡ３８７のＰ粒子によって誘導される過免疫抗体が、ＶＬＰ誘導性抗体と同様の力価でＶＬＰと反応した。ＶＬＰ−（Ｂ）およびＰ粒子−（Ｃ）誘導性抗体は、ＮＯＲ ＶＬＰとタイプＡ ＨＢＧＡレセプターとの結合に対して同様の遮断効果を示した。
【００４１】
【図６】ｃｒｙｏ−ＥＭによる小Ｐ粒子の３Ｄ構造再構成を示す。ＡおよびＢは小Ｐ粒子の側面図および上面図を示し、Ｃは小Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせを示す。
【００４２】
【図７】Ｐ粒子形成および安定性の妥協なしに完全に露出される、Ｐ粒子のループ２での７ｘＨｉｓタグの露出を示す。（Ａ）は７ｘＨｉｓタグを有するＰ粒子がＴａｌｏｎ樹脂に良好に結合することを示す。ＧＳＴ−Ｐドメイン−Ｈｉｓタグ融合タンパク質はトロンビンによって消化されて、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＰ−Ｈｉｓタグ）、ＧＳＴおよび他の共に精製されたタンパク質の混合物をもたらした。共に精製されたタンパク質と７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子（ロード前）をＴａｌｏｎ樹脂と共にインキュベートした。７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子全ておよびわずかな共に精製されたタンパク質は、樹脂に結合した（フロースルー）。洗浄した後、結合した７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子をイミダゾールで樹脂から溶出した（溶出１および２）。マーカーは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドを有する予め染色したタンパク質標準であった。（Ｂ）において、（Ａ）の溶出のゲルろ過分析は、溶出した７ｘＨｉｓ−Ｐ粒子の＞９８％がＰ粒子を形成したことを示した。
【００４３】
【図８】露出したＲＶ ＶＰ８を有するＮＯＲ Ｐ粒子を示す。ＳＤＳ ＰＡＧＥのパネルＡは、アフィニティーカラム（レーン１）およびさらにＰ粒子（レーン２）およびＰドメインダイマー（レーン３）フラクションでのゲルろ過によって精製された、組換えＲＶ ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（５３．５ｋＤａ）を示す。パネルＢおよびＣは、ＶＰ８（パネルＢ、レーン４および５）またはＮＯＲ ＶＬＰ（パネルＣ、レーン６および７）に対する抗体を用いた、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのウェスタン分析を示す。パネルＤにおいて、アフィニティー精製ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（レーン１）のゲルろ過は、該タンパク質の大部分がＰ粒子（〜１３００ｋＤａ）を形成することを示す。パネルＥは、被覆ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（赤、ＰＰ−ｈＶＰ８Ｃ）、組換えＶＰ８（青、ｈＶＰ８Ｃ）およびＰ粒子のみ（緑、ＰＰ、コントロール）を検出するためにＶＰ８に対する抗体を用いた、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の結果を示す。レーンＭは、上から１１３、９２、５２、３５、２９ｋＤａのバンドで、予め染色したタンパク質マーカーを示す。
【００４４】
【図９】ループ２上にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクターを示す。Ｐ粒子の最も外側の結晶構造（リボンモデル）は、３個の表面ループの表示を有する図の下半分に示し、Ｐ粒子ベクターのクローニングカセットの詳細は、図の上半分に示す。
【００４５】
【図１０】ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラの製造を示す。ループ２にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクター（Ａ）は野生型ＮＯＲ Ｐ粒子（Ｂ）を製造する。ＲＶ ＶＰ８コード配列（Ｃ）がＰ粒子ベクター（Ｄ）にクローン化されると、それはキメラの最も外側表面でのＲＶ ＶＰ８の指標と共に、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（Ｅ）を製造する。
【００４６】
【図１１】ＶＰ８−Ｐ粒子キメラによって誘導された抗体が、ＮＯＲおよびＲＶの両方に反応性であり、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合の遮断を示した。グラフＡは、それぞれＰ粒子およびＲＶ ＶＰ８に対する抗体の反応性を示す。グラフＢは、該抗体がＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断することを示す。Ｘ軸は抗血清の希釈（倍率）を示す。
【００４７】
【図１２】Ｐ粒子ベクター、Ｐ粒子プラットフォームおよびキメラＰ粒子ワクチンの構築のフローチャートを示す。ＧＳＴ、ＰドメインおよびＣは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子、ＮＯＲ Ｐドメインおよびシステイン含有短ペプチドをそれぞれコードする配列を示す。両末端の太線は、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のプラスミドを示す。
【００４８】
【図１３】Ｐ粒子ベクターのデザインを示す。３個の表面ループの指標と共にＰ粒子の最も外側部分の結晶構造を、図の下側に示す。各表面ループで異なる制限酵素認識部位を含むクローニングカセットを有するＰ粒子ベクターの一つの代表的なデザイン選択肢を、図の上側部分に示す。
【図１４】Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの製造および分析を示す。（Ａ）Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの発現構築物。ＨｉｓタグはＮ３７２とＤ３７４の間のループ２に挿入した。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１は、ＧＳＴ遺伝子融合システムの発現ベクターである。丸で囲んだＣは、システイン含有ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を示す。（Ｂ）結晶構造（模式図）においてＰ粒子の突起の遠位末端は、挿入されたＨｉｓタグが位置すると予測される、２個のＮ３７３の位置を示す（グレーおよびシアンのドットモデル）。（Ｃ）Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラの発現および精製。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、ＧＳＴ−Ｐドメイン−Ｈｉｓタグ融合タンパク質（ＧＳＴ融合体）が〜５２ｋＤａであることを示した。トロンビンによる溶液中での融合タンパク質の消化は、ＧＳＴ（〜２７ｋＤａ）およびＰドメイン−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＤ−Ｈｉｓタグ）（〜３５ｋＤａ、左パネル）をもたらした。ＰドメインＨｉｓタグキメラは、トロンビン消化によって精製樹脂からも放出されうる（右パネル）。Ｍは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドで、予め染色したタンパク質マーカーである。（Ｄ）サイズ排除カラムＳｐｅｒｄｅｘ ２００を用いたトロンビン放出Ｐドメイン−Ｈｉｓタグタンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出曲線。３つの主要ピークはそれぞれ、空、Ｐ粒子−ＨｉｓタグおよびＰダイマー−Ｈｉｓタグを示した。これらの３つのピークのサイズは、それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、空）、野生型Ｐ粒子（〜８３０ｋＤａ）および野生型Ｐダイマー（〜７０ｋＤａ）でキャリブレートした。（Ｅ）ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｄ）のフラクションをＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。
【００４９】
【図１５】Ｐ粒子提示短ペプチドに対するマウスの反応を示す。（Ａ）それぞれ等量のＰ粒子−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＰ−Ｈｉｓ、青）、Ｐダイマー−Ｈｉｓタグキメラ（ＰＤ−Ｈｉｓ、紫）または野生型Ｐ粒子（ＷＴ ＰＰ、コントロール、黒）で免疫した後、ＥＩＡにおけるT. Maritimaの組換えＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応性（ｎ＝５）。（Ｂ）（Ａ）における血清の抗体力価を終点希釈アプローチによって測定した。（Ｃ）〜（Ｆ）Ｐ粒子の非露出短ペプチドに対するマウスの抗体反応。（Ｃ）埋め込みペプチドＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むＰ粒子（ＰＰ−ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）で免疫した後の、ＥＩＡにおける、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣタグ化マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（to CDCRGDCFC、紫）および野生型Ｐ粒子（to WT PP、ポジティブコントロール、緑）に対するマウス血清の免疫反応性（ｎ＝５）。（Ａ）（PP-His to His-tag、青）が比較のために含まれた場合の、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグで免疫した後の、T. MaritimaのＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応。（Ｄ）終点希釈アプローチによって、（Ｃ）における血清の抗体力価を測定した。（Ｅ）埋め込みペプチドＣＮＧＲＣを含むＰ粒子で免疫した後、ＣＮＧＲＣタグ化ＭＢＰ（to CNGRC、紫）および野生型Ｐ粒子（to WT PP、ポジティブコントロール、緑）に対するマウス血清の免疫反応性。Ｐ粒子−Ｈｉｓタグで免疫した後の、（Ａ）（ＰＰ−Ｈｉｓ、青）のT. MaritimaのＨｉｓタグ化αフコシダーゼに対するマウス血清の免疫反応性を比較のために加えた。（Ｆ）終点希釈アプローチによって、（Ｅ）における血清の抗体力価を測定した。ＥＩＡアッセイのために、５ｎｇ／μｌの異なる抗原［（Ａ）および（Ｂ）についてＨｉｓタグ化αフコシダーゼ、（Ｃ）および（Ｄ）についてＣＤＣＲＧＤＣＦＣタグ化ＭＢＰ、（Ｅ）および（Ｆ）についてＣＮＧＲＣタグ化ＭＢＰ、ならびに（Ｃ）〜（Ｆ）について野生型Ｐ粒子］をマイクロタイタープレートに被覆した。指定の希釈での対応する血清を用いて、免疫反応性を測定した。＊Ｐ＜０．０５。
【００５０】
【図１６】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの製造および分析を示す。（Ａ）Ｐドメインコード化ｃＤＮＡ配列を含むベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１に基づく、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの発現構築物。酵素部位Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩを有するクローニングカセットのＴ３６８とＬ３７５との間のＰドメインのループ２中に、ロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原を挿入した。丸で囲んだＣはシステイン含有ペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を示す。（Ｂ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの発現および精製。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、ＧＳＴ−Ｐ−ＶＰ８融合タンパク質（ＧＳＴ融合体）が〜８０ｋＤａであることを示した（左パネル）。トロンビンによる融合タンパク質の消化は、ＧＳＴ（〜２７ｋＤａ）およびＰ−ＶＰ８キメラ（〜５２ｋＤａ、中央パネル）をもたらした。遊離Ｐ−ＶＰ８キメラは、トロンビン消化によって精製ビーズからも放出されうる（右パネル）。レーンＭは、上から下に１１３、９２、５０、３５、２９、２１ｋＤａを示すバンドで、予め染色したタンパク質マーカーであった。（Ｃ）サイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００によるトロンビン放出Ｐ−ＶＰ８タンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの溶出曲線。ピークフラクションのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を上に示す。それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、空）、野生型Ｐ粒子（〜８３０ｋＤａ）および野生型Ｐダイマー（〜７０ｋＤａ）でカラムをキャリブレートした。空のそばの単一主要ピークは、ほぼ全てのＰ−ＶＰ８タンパク質がキメラＰ粒子を形成したことを示す。（Ｄ）Ｐ−ＶＰ８タンパク質（左パネル）は、ロタウイルスＶＰ８（中央パネル）およびノロウイルスＶＬＰ（右パネル）に対する抗体と反応した。
【００５１】
【図１７】Ｐ粒子提示ＶＰ８に対するマウスの免疫応答を示す。等モル量のＰ粒子−ＶＰ８キメラおよび遊離ＶＰ８を用いて、アジュバントなしで鼻腔内（ＡおよびＢ、ｎ＝５〜７）またはフロイントアジュバントと共に皮下（Ｃ、ｎ＝６〜７）で、マウスを免疫した。遊離ＶＰ８およびＧＳＴをＥＩＡにおける抗体力価測定のための抗原として使用した。（ＡおよびＢ）ＷａのＶＰ８（Ａ）およびＤＳ１（Ｂ）それぞれを含む遊離ＶＰ８抗原（遊離ＶＰ８）およびキメラＰ粒子（ＰＰ−ＶＰ８）で免疫した後の、ＶＰ８／ＧＳＴに対するマウス血清の抗体力価。（Ｃ）遊離ＶＰ８抗原（遊離ＶＰ８）、およびＷａ株のＶＰ８を含むキメラＰ粒子（ＰＰ−ＶＰ８）で免疫した後の、ＶＰ８に対する抗体力価。共精製したＧＳＴは内部コントロールとして利用した。＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５２】
【図１８】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラでの免疫によって誘導されるマウス血清による、ロタウイルスの中和を示す。（Ａ）アジュバントなしでＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ、［Ｐ］８）キメラで鼻腔内免疫したマウス由来のマウス血清は、同じＷａ株（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）の強い中和を示すが、遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清は顕著に低い中和を示す（ＶＰ８血清、黒）。抗原を投与されていないマウス由来の血清をネガティブコントロールとして用いた（コントロール血清、紫）。（Ｂ）Ｐ粒子ＶＰ８（ＤＳ１、［Ｐ］４）キメラで免疫したマウス由来の血清は、Ｗａとの弱い交差中和を示し（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）、一方でＤＳ１の遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清（ＶＰ８血清）およびネガティブコントロール血清は、中和を示さなかった（黒および紫）。（Ｃ）遊離Ｗａ ＶＰ８（ＶＰ８血清、黒）およびＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラ（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）でフロイントアジュバントと共に皮下免疫したマウス由来の血清のＶＰ８に対する免疫反応性。抗原なしでの血清は、ネガティブコントロールとして用いる（コントロール血清、紫）。（Ｄ）Ｐ粒子−ＶＰ８キメラによるマウスの免疫によって誘導される（Ｃ）由来の血清（ＰＰ−ＶＰ８血清、青）は、遊離ＶＰ８による免疫によって誘導される血清（ＶＰ８血清、黒）のものよりも、顕著に高いロタウイルス（Ｗａ）に対する中和力価を示した。抗原を投与されていないマウス由来のコントロール血清をネガティブコントロールとして用いた（コントロール血清、紫）。星印は２つの形態のＶＰ８によって誘導される血清の中和間のＰ値を示す：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【００５３】
【図１９】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラワクチンでマウスを免疫した後の、マウスロタウイルス感染に対する保護を示す。４種の異なるワクチンでワクチン接種後、マウスのロタウイルス排出（μｇ／ｍｌ）を測定し、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）でチャレンジした。ＷＴ ＰＰでは、野生型ノロウイルスＰ粒子（ベクターコントロール）をマウスにワクチン接種した（ｎ＝７）。ＰＰ−ｈＶＰ８では、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラをマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。遊離ｍＶＰ８では、遊離マウスＶＰ８（ＥＤＩＭ）抗原をマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。ＰＰ−ｍＶＰ８では、Ｐ粒子−ＶＰ８（ＥＤＩＭ）キメラをマウスにワクチン接種した（ｎ＝５）。データ計算および統計分析は表１に示す。
【００５４】
【図２０】Ｐ粒子−ＶＰ８キメラでの免疫によって誘導された抗体が、ノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断することを示す。（Ａ）Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラで免疫した後のマウス血清は、ノロウイルスＰ粒子と強く反応したが（ＰＰ−ＶＰ８）、遊離ＶＰ８誘導血清は、この反応性を示さなかった（遊離ＶＰ８）。（Ｂ）（Ａ）由来のマウス血清はノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断したが（タイプＡ唾液、ＰＰ−ＶＰ８血清、青）、遊離ＶＰ８での免疫後に得られた血清は、この遮断を示さなかった（ＶＰ８血清、黒）。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本明細書において使用するとき、用語「ノロウイルス」、「ＮＯＲ」、「ノーウォーク様ウイルス」または「ＮＬＶ」は、ノロウイルスファミリーの任意のウイルスを意味し、限定されないが次のものを含む：ノーウォークウイルス（ＮＶ）、ＭＯＨ、Ｍｅｘｉｃｏ、ＶＡ ２０７、ＶＡ ３８７、０２−１４１９、Ｃ５９、ＶＡ １１５、Ｈａｗａｉｉ、Ｓｎｏｗ Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ｈｉｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｌｅｅｄｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｉｄａｈｏ Ｆａｌｌｓ、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ、Ｇｒｉｍｓｂｙ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、Ｄｅｓｅｒｔ Ｓｈｉｅｌｄ、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍおよびＷｈｉｔｅ Ｒｉｖｅｒｃａｐ。
【００５６】
本明細書において使用するとき、用語「Ｐドメインモノマー」および「Ｐ粒子」は、それぞれ野生型ノロウイルスＰドメインモノマーおよび野生型ノロウイルスＰ粒子を意味する。
【００５７】
本明細書において使用するとき、用語「修飾されたＰドメインモノマー」および「修飾されたＰ粒子」は、分子クローニングによって各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に、１個以上の制限部位を（典型的には対で）挿入し、それによって後で外来抗原、リガンド、薬物コンジュゲートまたはシグナルペプチドを挿入できるように表面ループにクローニングカセットを作成するように修飾されている、ノロウイルスＰドメインモノマーおよびＰ粒子を（それぞれ）意味する。
【００５８】
本明細書において使用するとき、用語「置換Ｐドメインモノマー」および「置換されたＰ粒子」は、分子クローニングによって各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入された少なくとも１個の外来抗原、リガンド、薬物コンジュゲートまたはシグナルペプチドを含む、ノロウイルスＰドメインモノマーおよびＰ粒子を（それぞれ）意味する。
【００５９】
本明細書において使用するとき、用語「抗原−Ｐドメインモノマー」または「抗原−ノロウイルスＰドメインモノマー」は、外来抗原がＰドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入されている、置換Ｐドメインモノマーを意味する。
【００６０】
本明細書において使用するとき、用語「抗原−Ｐ粒子」または「抗原−ノロウイルスＰ粒子」は、外来抗原が各Ｐドメインモノマー上に存在する３個の表面ループの１個以上に挿入されている、置換されたＰ粒子を意味する。
【００６１】
４種の固有の非感染性ＮＯＲ粒子、すなわちウイルス様粒子（ＶＬＰ）、Ｓ粒子、Ｐ粒子および小Ｐ粒子は、多機能性を設計するための優れた候補を表すウイルス性タンパク質ケージであり、Tan et al., 2004, 「The P-domai of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 78:6233-42およびTan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30に記載されている（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）。これらの粒子は、分子量４２０ｋＤａ（小Ｐ粒子）〜１０．５ｍＤａ（ＶＬＰ）を有し、サイズ１４〜３７ｎｍを有する。ＮＯＲ ＶＬＰは１８０個の完全カプシドタンパク質（ＶＰ１）から成り、３個のサブウイルス性粒子はＶＰ１の一部から成る。シェル（Ｓ）ドメイン由来のＳ粒子、突起（Ｐ）ドメイン由来のＰ粒子および同じＰドメイン由来であるがＮ末端にさらなるフラグタグを有する小Ｐ粒子。これら全ての粒子は、Tan et al., 2004, 上記; Tan et al., 2004, 「E. coli-expressed recombinant norovirus capsid proteins maintain authentic antigenicity and receptor binding capability」, J Med Virol 74:641-9; および Xia et al., 2007, 「Norovirus capsid protein expressed in yeast forms virus-like particles and stimulates systemic and mucosal immunity in mice following an oral administration of raw yeast extracts」, J Med Virol 79:74-83（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、タンパク質がインビトロで発現されたとき自然発生的に集合する。
【００６２】
野生型ＮＯＲカプシドは、昆虫細胞において発現されたときウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合する、５５〜６０ｋＤａの単一の主要構造タンパク質（ＶＰ１）から成る（図２）。ＶＬＰは天然ウイルス粒子と形態学的および抗原的に同一であるが、感染性ではない。ノーウォークウイルスのＸ線結晶学的構造に基づくと、カプシドはＶＰ１の９０個のダイマーから成り、Ｔ＝３正二十面体シンメトリーを示す。各ＶＰ１モノマー（５３０アミノ酸[aa］）は、短いＮ末端領域（１〜４９アミノ酸）、続いてシェル（Ｓ）ドメイン（５０〜２２５アミノ酸）、ならびにＰ１（２２６〜２７８および４０６〜５２０アミノ酸）およびＰ２（２７９〜４０５アミノ酸）に分類できる突起（Ｐ）ドメインを含む。Ｎ末端／シェル（Ｎ／Ｓ）ドメインはカプシドの内部コアを形成し、ＶＰ１の最も保存的な部分であるが、Ｐドメインはカプシドの突出したアーチを形成し、より多様である。カプシドの表面に位置するＰ２サブドメインは、ＮＯＲ株のゲノムにおいて最も高い多様性度を含む。それは株特異性、レセプター結合および潜在的中和抗体認識部位の決定基を含む。
【００６３】
原子構造に従って、ＮＯＲカプシドタンパク質のシェル（Ｓ）および突起（Ｐ１、Ｐ２）ドメイン（図２）は、８〜１０アミノ酸ヒンジによって連結されている。Ｐ粒子のカプシドタンパク質（ＶＰ１）のレセプター結合領域は、Tan et al., 2004, 「The P domain of norovirus capsid protein forms dimer and binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 78:6233-42（その全体について、参照によりその開示を本明細書に組み込む）に記載されているとおり、マッピングされている。
【００６４】
ＮＯＲは、感染のための宿主レセプターとしてヒト組織−血液グループ抗原（ＨＢＧＡ）を認識することが知られている。Ｓドメインの発現は宿主レセプターに結合する機能を有さない平滑粒子を形成するが、ヒンジを有するＰドメインの発現は、レセプター結合機能を有するダイマーを形成するが、その結合親和性は低い。ヒンジなしのＰドメインが発現されると、それはＶＬＰのものと同様の顕著に高いレセプター結合親和性を有するサブウイルスＰ粒子（図１）を自然発生的に形成する。Ｐ粒子は１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーからなる。Ｐ粒子は、対応するＨＢＧＡに結合でき、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合の強い遮断を示す。Ｐ粒子の自然発生的形成は、株ＶＡ３８７、ＭＯＨおよびノーウォークウイルス（ＮＶ）を含む多様なＮＯＲ株で観察されている。これらのＰ粒子は、電子顕微鏡（ＥＭ）下で中心に空洞を有するリング状のイメージを示し、分子量〜８３０ｋＤａでゲルろ過で単一ピークを形成した。Ｐ粒子は極めて安定であり、Tan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30、およびTan et al., 2006, 「C-terminal arginine cluster is essential for receptor binding of norovirus capsid protein」, J Virol 80:7322-31（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、大腸菌および酵母発現系の両方で、高収率で容易に製造できる。
【００６５】
ＮＯＲ Ｐ粒子は、ヒトＮＯＲの２つの主要な遺伝子群の異なる遺伝子群からのＮＯＲ Ｐ粒子の構築によって示されるように、ＮＯＲに共通の特徴である。ＧＩ−１（ノーウォークウイルス）、ＧＩ−４（Ｋｏｂｌｅｎｚ４３３）、ＧＩ−８（Ｂｏｘｅｒ）、ＧＩＩ−２（Ｍｅｌｋｓｈａｍ）、ＧＩＩ−３（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ３２１）、ＧＩＩ−４、ＧＩＩ−５（ＭＯＨ）、ＧＩＩ−９（ＶＡ２０７）を含む異なるＮＯＲ遺伝子型を示す、４０種類以上のＮＯＲ Ｐ粒子がこれまでに構築されている。世界中のＮＯＲ胃腸炎の６５〜８５％に関与する主たるＮＯＲタイプ（ＧＩＩ−４）について、２５種類のＰ粒子が作成されている。これは、過去２５年間で２５種類の株が広まっていることを示す。
【００６６】
Ｐ粒子の３Ｄ構造は、図１および３に示すとおり、７．６Åの分解能のｃｒｙｏ−ＥＭによって再構成されている。Ｐ粒子は、１２個のダイマーに組織される２４個のＰドメインモノマーを含む八面体シンメトリーである。Ｐ粒子の中心に空洞が存在する。Ｐダイマーの方向は、野生型カプシドのものと同様であり、Ｐ１サブドメインが空洞の中心に対して内側にあり、Ｐ２サブドメインがＰ粒子の最も外側の表面に対して外側にある。Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせ（図４）は、ＨＢＧＡレセプター結合界面がＰ粒子の最も外側の表面に位置することを示している。これは、ＨＢＧＡレセプターとの強い結合機能を保持しているＰ粒子の観察と一致している。
【００６７】
Ｐダイマーの原子構造は、プロトタイプノーウォークウイルスおよび主なＧＩＩ−４株（ＶＡ３８７）においてＸ線結晶学によって解明されている（図４）。これらの結晶構造は、Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップに良好にフィットする（図１）。３個の表面ループは、これらはアーチ様Ｐダイマーの上部（６個の表面ループ／Ｐダイマー、図３）またはＮＯＲカプシドおよびＰ粒子の最も外側の表面に対応する各Ｐモノマーの最も遠い末端で同定された。これらの表面ループは外来抗原提示のための優れた部位を提供し、詳細な結晶構造は、本明細書に開示するＰ粒子ワクチンプラットフォームの構造に基づく設計のための確かな基礎を提供する。
【００６８】
ＨＢＧＡレセプターとの結合について、Ｐ粒子はその外側表面に依存する。いずれか１個以上の制限酵素部位、抗原、リガンド、シグナルペプチドまたは薬物コンジュゲートが野生型Ｐドメインモノマーの表面ループに挿入されている場合、制限酵素部位、抗原、リガンド、シグナルペプチドまたは薬物コンジュゲートのサイズに部分的または完全に基づいて、それは形成されたＰ粒子の最も外側の部分を被覆し、１個以上の修飾もしくは置換されたループへのアクセスを隠すことができ、または修飾もしくは置換されたループのタンパク質構造を変化させて、形成されたＰ粒子がＨＢＧＡレセプターと結合するその能力を失わせることができる。我々は未だＰ粒子が最早ＨＢＧＡに結合しないという前にはどの程度のループの変化が必要かということについての系統立てた分析は行っていない。しかし、我々は、制限部位をＰドメインモノマーの中央ループ２に加えた場合に修飾されたＰ粒子がＨＢＧＡと結合しないことを見出している。
【００６９】
ウイルスレセプター結合界面の同定は、図４に示すとおり、ノーウォークウイルスおよびＶＡ３８７におけるＡ−またはＢ−トリサッカライド（ノロウイルスレセプター）との複合体におけるＰダイマーの結晶化によって示されている。図示したとおり、図４は、Ｂ−トリサッカライド複合体（球体モデル）と関連したＮＯＲ Ｐダイマーの結晶構造（リボンモデル）を示す。レセプター結合界面はＮＯＲカプシドおよびＰ粒子の最も外側の表面と等しいアーチ様Ｐダイマーの上部に位置する。トリサッカライドとＰダイマーのアミノ酸との間の大規模な水素結合ネットワークが観察される。ウイルスレセプターと相互作用していると予測されるこれらのアミノ酸の重要性は、Tan et al., 2008, 「Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4 norovirus with HBGA receptors by site-directed mutagenesis study」,Virology 379:324-334（その全体について、参照によりその開示を本明細書に組み込む）に記載されているとおり、部位特異的突然変異誘発によって証明されている。
【００７０】
４個のＮＯＲ粒子（ＶＬＰ、Ｓ粒子、Ｐ粒子および小Ｐ粒子）のうち、Ｐ粒子は最も安定であり容易に製造できる。それは高度に免疫原性であり、広範な温度、ｐＨならびに化学的および物理的条件に耐える。ｃｒｙｏ−ＥＭによるＰ粒子の３Ｄ構造（図１）およびＰダイマーの原子構造（図２）は、Cao et al., 2007, 「Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides by norovirus」, J Virol 81:5949-57、およびTan, 2008, 「Noroviral P-particle: Structure, function and applications in virus-host interaction」, Virology, Vol. 382, Issue 1, 5 December 2008, Pages 115-123（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のとおり、Ｐ粒子の２４個のモノマーまたは１２個のＰダイマーの各々の最も外側の表面に高度に露出している（図１、３および４）。構造に基づく配列アラインメントは、これらの露出ループが大きな配列の挿入に耐えることを示唆している。
【００７１】
本発明の一つの局面において、タンパク質またはポリペプチド抗原性エピトープがこれらのループ、すなわちループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）またはループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の一つで、あるいはその中に挿入されている場合、抗原−Ｐドメインモノマーまたはダイマーの自然発生的自己集合は、集合した抗原−Ｐ粒子の表面で２４個の抗原エピトープを提示する。本発明のこの特徴は抗原提示、したがって下記の通りワクチンのための利点を提供する。Ｐダイマーの解明された分子構造は、したがって、かかる抗原挿入のための構造に基づく設計の確かな、詳細な情報を提供する。
【００７２】
野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、抗原−Ｐドメインモノマーがダイマーを、そしてダイマーが抗原−Ｐ粒子を形成するプロセスは、Ｐダイマーの濃度に基づいて動力学的に交換または平衡しうる。また野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、システインが抗原−Ｐドメインモノマーの末端に結合しているとき、得られる抗原−Ｐ粒子は、システイン末端を有さないものよりもより安定となり、抗原−Ｐドメインモノマーの濃度に依存しない。各抗原−Ｐダイマーは、５本の折り畳み軸に沿った五角形を形成する、５個の周囲抗原−Ｐダイマーとの相互作用において同じ方向を有するべきである。結果として、抗原−Ｐ粒子の外側層はノロウイルスカプシドのアーチ構造と類似のＰ２サブドメインによって形成されるが、内側層はＰ２アーチに支えを提供するＰ１サブドメインによって作成される。他の正二十面体ウイルス粒子と同様に、抗原−Ｐ粒子の内側に空洞が存在すべきである。
【００７３】
また野生型Ｐドメインモノマーおよびダイマーのように、本発明の抗原−Ｐドメインモノマーおよびダイマーは、インビトロで抗原−Ｐ粒子を自然発生的に形成することを防止するために、周知の方法で変性されていてもよい。同様に、本発明の抗原−Ｐ粒子は、それぞれの抗原−Ｐドメインモノマーおよびダイマーに自然発生的に分離しないように、変性されていてもよい。これは、所望により野生型Ｐドメインモノマーと共に、多様な抗原タイプの抗原−Ｐドメインモノマーの形成の、多様な分子割合へのインビトロでの混和または混合を可能として、次いで変性の影響が除かれたときに自然発生的に抗原−Ｐ粒子へと形成されうる。
【００７４】
本発明の置換されたまたは抗原−Ｐ粒子は、安定であり、Tan et al., 2004, J Virol 78:6233-42およびTan et al., 2005, Virol 79:14017-30に記載のもののような周知の方法によって大腸菌および酵母において容易に製造できるため、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子のように、抗原ディスプレイのための魅力的な候補である。先行技術のManayani et al.のキメラＦＨＶ粒子およびChatterji et al.のキメラＣＰＭＶ粒子はそれぞれ、昆虫および植物に感染するが（ヒトに対する影響は知られていない）、非感染性野生型ＮＯＲ Ｐ粒子はヒトウイルスに由来し、候補ヒトワクチンとして同定されている。
【００７５】
多くの固有の特徴のため、本発明の抗原−Ｐ粒子は、野生型ＮＯＲ Ｐ粒子のように、ワクチンプラットフォームとして有用な商品となる。第一に、ベースのＮＯＲ Ｐ粒子はサブユニットワクチンにほぼ理想的なサイズ（〜８４０ｋＤａ、Φ＝２０ｎｍ）を有し、多価であり、完全サイズのウイルス様粒子（ＶＬＰ）よりも容易に製造でき、単一ポリペプチドまたはタンパク質抗原よりも免疫原性である。第二に、抗原−Ｐ粒子は高収率かつ低コストで大腸菌で容易に製造でき、これは発展途上国にとって特に有用である。第三に、Ｐドメインモノマーの複数の（３個）表面ループおよび外来抗原の挿入のためのそれらの高い能力（少なくとも〜２３８アミノ酸まで）は、異なる複数の抗原の挿入を可能とする。したがって、得られたキメラ置換Ｐ粒子ワクチンは、多くの感染症および非感染症に対してさえも、広い適応を提供できる。第四に、外来抗原が挿入された少なくとも２４個のコピーを含む均一なキメラ置換Ｐ粒子を作成するために、２〜３段階の単純な遺伝子操作のみが必要とされる。したがってこれらのワクチンは速やかに開発でき、インフルエンザウイルスのような急速に変化するウイルスファミリーに特に有用であり得る。第五に、制限部位を含む表面ループにクローニングカセットを有するＰドメインモノマーベクターは、ユーザーフレンドリーなベクターであり、簡便なワクチンプラットフォームである。そして第六に、抗原−Ｐ粒子は、両方のヒトＮＯＲについての下痢および他の感染症に対する優れた候補ワクチンである。
【００７６】
主たる感染症に加えて、本ＰドメインベクターおよびＰ粒子ワクチンプラットフォームは、抗原提示および／または薬物の担体もしくはがん、アレルギー、自己免疫疾患を含む非感染性疾患の処置のための薬物送達ビークルとしても有用であり得る。一つの態様において、薬物は、化学反応によって表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されていてよい。この場合、置換されたＰ粒子は、薬物の担体として用いられる。他の態様において、リガンドまたはシグナルペプチドは、表面ループの少なくとも一つに挿入されてよく、そして薬物のコンジュゲートも、表面ループの少なくとも一つに挿入されていてよい。これらの置換されたＰ粒子は、薬物に特定の組織または臓器を標的とさせる薬物送達系を提供する。
【００７７】
本発明のＰ粒子は、さらに特異性を高め、当該技術分野の有用な進歩を利用するために、他の薬物送達アプローチと組み合わせてもよい。一つの例は、病原体感染または特定の化学的もしくは酵素的切断がないかぎり、そしてそれまで、生物学的に不活性であり、植栽棒哺乳類細胞の内部で活性薬物形態に変換される、プロドラッグを含む。かかる態様は、特定の微生物に感染した細胞または特定の腫瘍に罹患した細胞でのみプロドラッグが活性化される、プロドラッグ−Ｐ粒子の開発を特に含みうる。
【００７８】
Ｐ粒子ベクターの固有の特徴のために、ワクチンプラットフォームは広い適応を有することができる。それは既知の保護エピトープを有する多くのワクチンを製造するために使用できる。したがって、Ｐ粒子ベクターワクチンプラットフォームの適応は、広範な臨床状態に潜在的に有益であり得る。さらに、このナノ粒子プラットフォームの柔軟性は、容易に拡張されうる。例えば、ＰドメインモノマーまたはＰ粒子の１個の表面ループが特定のレセプターを有するある組織または臓器にＰ粒子を誘導するシグナルペプチド（リガンド）を発現するが、ワクチンまたは薬物が効果を奏するように送達される第２の表面ループに結合されるように、粒子を開発できる。例えば、ペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸の鎖）で置換されたＰ粒子は、ＣＮＧＲＣのレセプター（ＣＤ１３）が重度に発現されている腫瘍組織（すなわち癌腫）に移動できる。膜結合メタロプロテアーゼＣＤ１３のリガンドであるペプチド部分ＣＮＧＲＣは、ＣＤ１３を発現する血管形成血管系の内皮細胞に結合でき、ＣＤ１３を発現する内皮細胞におけるアポトーシスを誘導し、それによって腫瘍関連血管新生を阻害できる。
【００７９】
さらに、２個以上のループが同一または異なる病原体由来の異なる抗原を発現するように、多価ワクチンが作製できる。置換されたＰ粒子は、野生型Ｐドメインモノマーおよび抗原−Ｐドメインモノマーを含む、異なる抗原−Ｐドメインモノマーの混合物から集合して、異種抗原−Ｐ粒子を形成できる。多様な外来抗原を同じループまたは３個のループの異なる一つに挿入して、広範な異種抗原−Ｐ粒子を提供できる。したがって、本Ｐ粒子およびＰドメインモノマーベクタープラットフォームの市場価値は極めて高い。
【００８０】
本発明の態様は、ＮＯＲおよびロタウイルス（ＲＶ）に対するワクチンとして使用するための抗原−Ｐ粒子を含んでいてもよい。抗原−Ｐ粒子の一つの例は、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラである。ロタウイルス（ＲＶ）およびＮＯＲは、疾患の大きな負担を生じる世界中で共通の病原体である。この抗原−Ｐ粒子は、毒性株を生じる復帰または再集合の可能性のない、単独ワクチンでＮＯＲおよびＲＶに対して有効なワクチンを提供する。
【００８１】
１個以上のループの修飾の前に、Ｐ粒子形成を促進し安定化するためにＰドメインのいずれかの末端にシステインを加え、そしてＰ粒子を不安定化しうるトリプシン処理に対する耐性を与えるためにＰドメインのＣ末端に短いペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を加えて、野生型Ｐドメインモノマーを製造できる。また、Ｐ粒子形成のために、ＰドメインモノマーのインタクトなＣ末端が必要であり、ワクチンプラットフォームとしてのＰ粒子形成および安定性のために、Ｃ末端でのアルギニンクラスターが重要である。
【００８２】
小ペプチドタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、フラグタグ）がＰドメインのＣ末端に結合したとき、ＮＯＲ Ｐドメインモノマーはまた、小Ｐ粒子と呼ばれる別の複合体を形成した。この小Ｐ粒子は、６個のＰダイマーに組織される１２個のＰモノマーを含む四面体シンメトリーを示す（図６）。小Ｐ粒子のｃｒｙｏ−ＥＭの密度マップへのＰダイマーの結晶構造の重ね合わせは、Ｐダイマーの方向がＰ粒子のものと同様であることを示した。インビトロでのＨＢＧＡ結合アッセイは、小Ｐ粒子がＮＯＲ ＶＬＰおよびＰ粒子と同様の結合プロファイルを有することを示した。小Ｐ粒子の発見は、より小さなＰ粒子が特定の用途に必要である場合における、我々のＰ粒子系のさらなる候補を提供する。
【００８３】
本発明のＮＯＲベースの抗原−Ｐ粒子は、各Ｐドメインダイマーまたはモノマーサブユニットの提示ループの１個以上において外来抗原を担持するように構築されうる。Ｈｉｓタグ（７ｘヒスチジン）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）Ｔ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属エピトープＥｐｉ８（１４アミノ酸）およびＲＶ表面抗原である２種のＲＶ ＶＰ８コアタンパク質（各１５９アミノ酸）を含むがこれらに限定されない多様なポリペプチドおよび生物学的関連エピトープが、置換されたＰ粒子の形成および安定性に影響を与えることなく、図９に示すとおり、Ｐ粒子のループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）またはループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）のいずれか１つ以上に挿入されてよい。これはループ２について、図７のパネルＢおよび図８のパネルＤに示すとおり、ゲルろ過によって示される。Ｈｉｓタグの露出はＴａｌｏｎ樹脂との高い親和性によって示された（図７のパネルＡ）ＶＰ８の露出は、ＲＶ ＶＰ８に対する抗体を用いたＥＩＡ（図８のパネルＥ）およびｃｒｙｏ−ＥＭを用いたＶＰ８−Ｐ粒子の３Ｄ構造再構成（図１０のパネルＥ）によって示されている。これらのデータは、Ｐ粒子が多様な外来抗原を提示するための有効なワクチンプラットフォームに発展しうるという我々の仮説を支持している。
【００８４】
抗原−Ｐ粒子ベクターは、クローニングカセットと共に構築されてもよい。Ｐダイマーの結晶構造に基づいて、ループの先端を含むＰ粒子ベクターのループの一つ以上に制限部位を含むクローニングカセットを入れることができる。図９はＰ粒子ベクターのループ２の先端に入れたＳｐｅ Ｉ部位およびＣｌａ Ｉ部位を含むクローニングカセットを示す。クローニングカセットを含むこのＰ粒子ベクターは、図８および１０に示すように、Ｐ粒子の表面へのＲＶ ＶＰ８およびＧＦＰの挿入成功に使用される。
【００８５】
稀少および固有制限部位を含む制限部位、ならびにＰドメインモノマーまたはＰ粒子の表面ループのいずれか一つ以上に制限部位を挿入する方法の例は、当業者に周知であり、Reed et al.の米国特許出願公開2004/0185556および2008/0085553（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。これらの制限部位はＤＮＡ分子においてコードされ、典型的には二本鎖パリンドローム配列を含む。いくつかの制限酵素について、制限部位を提供するために４〜６ヌクレオチドで十分であるが、いくつかの制限酵素は、８個以上のヌクレオチドの制限部位を必要とする。例えば酵素ＥｃｏＲ１は下記６ヌクレオチド配列を認識する：５’Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ３’、ここで５’は「上流」末端と慣習により知られる分子の終点を示し、同様に３’は「下流」末端を示す。制限部位の相補鎖は、その逆平行鎖３’＝Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−５’である。
【００８６】
ＮＯＲ Ｐ粒子は大きな外来抗原挿入に耐えうる。例示のみを目的として、ＮＯＲ Ｐ粒子のループ２に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、２３８アミノ酸）を挿入したところ、得られたキメラ粒子はゲルろ過分析で測定したところ高度に安定である。ＧＦＰの露出は、ＧＦＰ特異的抗体を用いたＥＩＡおよび蛍光顕微鏡で示された（データは示さず）。
【００８７】
ある方法の態様において、修飾されたＮＯＲ Ｐ粒子を用いて、ＮＯＲおよび外来抗原両方に反応性の抗体を誘導する。具体的な、非限定的な例において、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子を用いて、ＲＶおよびＮＯＲの両方に反応性の抗体を誘導する。ＶＰ８−Ｐ粒子キメラで免疫した哺乳類はＮＯＲ Ｐ粒子およびＲＶ ＶＰ８の両方に反応性の抗体のレベルをもたらし、ＮＯＲ ＶＬＰとＨＢＧＡレセプターの結合を遮断し、ＲＶの複製を中和できる。
【００８８】
ＮＯＲの「中和アッセイ」およびＲＶチャレンジのマウスモデルが開発されている。ＮＯＲは未だ細胞培養で培養することが難しく、ＮＯＲの複製に有効な動物モデルが存在しない。ＮＯＲ感染に対する抗体の潜在的保護を測定するため、ＮＯＲとその宿主レセプターの結合の防止における抗体の能力を測定するためのＨＢＧＡレセプター遮断アッセイを開発した。このアッセイは、唾液またはオリゴ糖ベースのレセプター結合アッセイに基づいており、極めて感受性かつ特異性である。
【００８９】
ＲＶ感染に対するワクチンの保護効能を測定するための成体マウスモデルも確立されており、ＲＶワクチン開発を研究するために用いられている。ワクチン候補でマウスを免疫し、次いでマウスＲＶ株でチャレンジした。免疫群におけるＲＶ抗原の糞便排出量を、ワクチン効能の測定のためにコントロールまたは非免疫群における排出量と比較する。ワクチンに対する免疫応答は、抗体レベルおよびＴ細胞応答を測定することでも測定できる。
【００９０】
本発明はまた、外来抗原の複数または複数−多価提示を有する抗原−Ｐ粒子の形成に関する。２個のループ（すなわちループ１および２、ループ２および３またはループ１および３）で２個のクローニングカセットを有する修飾されたＰ粒子ベクターは、多様な組合せで２個のカセットに外来抗原を挿入することによって構築でき、評価できる。３種の組合せの非限定的な例は、１）ループ１および２におけるＨｉｓタグおよびフラグタグ（ＹＤＫＤＤＤＤＫ）；２）ループ１および２におけるＨｉｓタグおよびＶＰ８抗原；ならびに３）ループ１および２における２個のＶＰ８を含む。これらの態様は、同じ置換Ｐ粒子上で効率よく提示される２種の異なる小抗原、または１種の小抗原および１種の大抗原、または２種の大抗原を提供できる。キメラＰ粒子形成はゲルろ過によって測定され、挿入された抗原の露出は特異的抗体を用いたＥＩＡによって試験できる。
【００９１】
３個のループ（ループ１、２および３）全てで３個のクローニングカセットを有する修飾されたＰ粒子ベクターは、多様な組合せで３個のカセットに外来抗原を挿入して構築でき、評価できる。非限定的な例は、１）３個の７ｘＨｉｓタグ；ならびに２）７ｘＨｉｓタグ、ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）およびフラグタグを含む。第一の組合せは、置換されたＰ粒子の各Ｐドメインモノマーの３個のループ全てで同じ小さなエピトープを重複して提示し、Ｐ粒子上で抗原の７２個（３×２４）コピーを与える。第二の組合せは、各Ｐドメインモノマーサブユニットで同時に提示される３種の異なる小エピトープを提供し、３種の異なる抗原に対する三価Ｐ粒子ワクチンをもたらす。
【００９２】
したがって本発明は、簡便かつ多様な抗原挿入のためのＰ粒子ベクターを提供する。修飾されたＰ粒子の態様は、それぞれ３個の表面ループの各々で単一の固有のクローニングカセットを含む各々修飾されたＰドメインモノマーである、３種のＰドメインモノマーベクターを含みうる。修飾されたＰ粒子ベクターの別の態様は、３個のループのいずれか一つもしくはいずれか２つ（例えばループ１および２）または３個のループ全てにおいて２個のクローニングカセットを有するＰドメインモノマーベクターを含む。修飾されたＰ粒子ベクターの別の態様は、各Ｐドメインモノマーの３個のループ全てにおいて３個のクローニングカセットを有していてよい。各クローニングカセットの酵素認識部位は、図１３に示すとおり、目的の抗原のＤＮＡ配列のクローニングの必要に応じて修飾されてよい。これらのベクターは、１種類の抗原の単独提示または同一もしくは異なる抗原の複数提示のためものもである。異なるクローニングカセットを有するこれらのＰ粒子ベクターの構築は、当該技術分野で知られているとおり、部位特異的突然変異誘発によって達成されうる。
【００９３】
変異誘発および組換えＤＮＡクローニング手法。様々な修飾または置換されたＰ粒子ベクターの作製は、典型的には、ＮＯＲ（特に、実施例のとおり、ＶＡ３８７株）のＰドメインおよびシステインを有する短ペプチドをコードする配列を好適なプラスミド（特に、例示として、Amersham Biosciencesから入手可能なプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ−１）中に含む、図１２に示すような、野生型Ｐ粒子発現構築物で開始する。クローニングカセットは、Tan et al., 2003, 「Mutations 448 within the P2 domain of norovirus capsid affect binding to human histo-blood group 449 antigens: evidence for a binding pocket」, J Virol 77:12562-71、Tan et al., 2006, 「C-terminal arginine cluster is essential for receptor binding of norovirus capsid protein」, J Virol 80:7322-31、Tan et al., 2005, 「The p domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle that binds to histo-blood group antigen receptors」, J Virol 79:14017-30およびTan et al., 2008, 「Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4 norovirus with HBGA receptors by site-directed mutagenesis study」, Virology 379:324-334（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載のものを含む周知の方法による部位特異的突然変異誘発によって、一つずつ、図１３に示すように、表面ループの特定部位でＰドメイン配列に導入される。結晶学的研究による３個の表面ループの位置、組成および配列は、Bu et al., 2008, 「Structural basis for the receptor binding specificity of Norwalk virus」, J Virol 82:5340-7およびCao et al., 2007, 「Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides by norovirus」, J Virol 81:5949-57（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。
【００９４】
構造および配列情報に基づいて、クローニングカセットとして特定の酵素認識部位が適切な位置に挿入されたものとして、特定のプライマーを設計し、合成できる。典型的には、表面ループの先端（最も露出した位置）での２個のアミノ酸がクローニングカセットの配列を挿入するために選択されてよく、これは２個のアミノ酸の置換または２個のアミノ酸の間に配列を挿入することによってよい。周知の通り、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いてループにクローニングカセットを導入できる。特定の抗原についての正確な導入位置は、得られる抗原−Ｐ粒子キメラの安定性または効率を改善するために修飾されてもよい。より長い配列でのクローニングカセットの挿入のために、最適な挿入のために段階的部位特異的突然変異誘発を実施できる。次いで、部位特異的突然変異誘発の後得られた置換されたＰ粒子ベクターのプラスミドは、周知の方法によって、プラスミドＤＮＡ調製キット（Qiagen）を用いた大腸菌およびプラスミドＤＮＡ調製物へのプラスミド形質転換のための常套のクローニング手法によって増幅できる。周知の方法により配列決定することによって、挿入されたクローニングカセットの確認の後、抗原−Ｐ粒子ベクターは、抗原挿入の能力、キメラＰ粒子形成の安定性、および有用かつ効果的なワクチンとしての抗原提示の効率について、試験されてよい。
【００９５】
適切なキメラＰ粒子形成は、抗原提示についてのＰ粒子ベクターの能力および効率を評価して決定できる。Ｐ粒子プラットフォームへの抗原またはエピトープの挿入後（すなわち、Ｐドメインモノマーに抗原またはエピトープの挿入後、ダイマー、次いで抗原−Ｐ粒子へのＰドメインモノマーの集合）、得られたキメラタンパク質の各々は、サイズ排除カラム（例えば、Akta ファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー(FPLC、HE healthcare)）を用いたゲルろ過によって、標的抗原−Ｐ粒子キメラの形成について分析されてよい。正しく形成された標的キメラは、モノマーの分子量の〜２４倍の予測分子量（ＭＷ）で単一のピークを形成する。例えば、ＨｉｓタグＰ粒子は８７０ｋＤａのＭＷを有し、ＶＰ８−Ｐ粒子は１２４０ｋＤａのＭＷ、そしてＧＦＰ−Ｐ粒子は１４５０ｋＤａのＭＷを有する。Ｐ粒子による抗原の複数提示は、この計算に従う。予想されるＭＷを有するキメラＰ粒子の形成は、抗原挿入の成功の重要な指標である。キメラＰ粒子形成のさらなる証拠は、ｃｒｙｏ−ＥＭによるＥＭ観察および３Ｄ再構成を含む（図１０参照）。修飾された抗原−Ｐ粒子の安定な形成は、通常、抗原の優れた免疫原性を導き、対応する病原体に対する有望なワクチン候補であろう。
【００９６】
キメラＰ粒子上の抗原露出の測定は、抗原提示についてのＰ粒子ベクターの能力および効率の別の重要な指標である。抗体特異的ＥＩＡおよびＴａｌｏｎ樹脂結合アッセイのいずれかまたは両方が、この測定のために用いられる。抗体特異的ＥＩＡはHuang et al., 「Noroviruses bind to human ABO, Lewis, and secretor histo blood group antigens: identification of 4 distinct strain specific patterns,」 2003, J Infect Dis 188:19-31およびHuang et al., 「Norovirus and histo-blood group antigens: demonstration of a wide spectrum of 23 strain specificities and classification of two major binding groups among multiple 24 binding patterns,」 2005, J Virol 79:6714-22（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されており、図８のパネルＥおよび図１１のパネルＡに図示されている。精製された抗原−Ｐ粒子キメラはマイクロタイタープレートに被覆され、脱脂乳によって遮断されうる。露出している抗原／エピトープは、対応する抗体によって検出できる。シグナル強度は、二次抗体−ＨＲＰコンジュゲート、次いでＨＲＰ基質とインキュベート（inculcation）した後、吸光度（ＯＤ）によって記録されうる。抗原（例えばそれぞれＨｉｓ、フラグおよびｍｙｃタグ）に対して特異的なモノクローナル抗体は、Cell Signalingから商業的に入手可能であるが、図８および１１に示すとおり、ＲＶ ＶＰ８およびＮＯＲ Ｐ粒子に対する特異的抗体は本願出願人によって製造され、それから入手可能である。露出したＨｉｓタグの検出のために、別の強力な方法であるＴａｌｏｎ樹脂結合アッセイを用いてもよく、ここでＴａｌｏｎ樹脂（Clontech）はＨｉｓタグと特異的に結合できる（図７）。樹脂結合ＨｉｓタグＰ粒子キメラはイミダゾール（Sigmaから入手可能）によって容易に放出されるため、このアッセイは、汚染タンパク質からＨｉｓタグＰ粒子キメラを精製するための単純なアプローチである（図７参照）。
【実施例】
【００９７】
実験
キメラＰ粒子の調製。予め製造した［Ｐ］タイプ８株のヒトＶＰ８を含むＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（図８、図１０のパネルＥ）を用いる。マウスＲＶチャレンジ試験のためのマウスＶＰ８を含むキメラワクチンのために、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのヒトＶＰ８をマウス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８で置換する。ヒトおよびマウスＲＶキメラＰ粒子はいずれも、確立された手法を用いて大腸菌で製造される。ＧＳＴアフィニティーカラム（Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、HE Healthcare）による部分的精製の後、キメラＰ粒子はさらにサイズ排除カラムを用いたＦＰＬＣ系（GE Healthcare）で精製される。得られたキメラＰ粒子調製物は、高い純度（〜９５％）に達し、マウスを免疫する免疫源として使用される。図８に見られるとおり、ＳＤＳ ＰＡＧＥのパネルＡは、アフィニティーカラム（レーン１）およびさらにＰ粒子（レーン２）およびＰドメインダイマー（レーン３）フラクションでのゲルろ過（パネルＤ）によって精製された、組換えＲＶ ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（５３．５ｋＤａ）を示す。パネルＢおよびＣは、ＶＰ８（パネルＢ、レーン４および５）またはＮＯＲ ＶＬＰ（パネルＣ、レーン６および７）に対する抗体を用いた、ＶＰ８−Ｐ粒子キメラのウェスタン分析を示す。パネルＤにおいて、アフィニティー精製ＶＰ８−Ｐドメインキメラ（レーン１）のゲルろ過は、該タンパク質の大部分がＰ粒子（〜１３００ｋＤａ）を形成することを示す。パネルＥは、被覆ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（ＰＰ−ｈＶＰ８Ｃ）、組換えＶＰ８（ｈＶＰ８Ｃ）およびＰ粒子のみ（ＰＰ、コントロール）を検出するためにＶＰ８に対する抗体を用いた、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の結果を示す。レーンＭは、上から１１３、９２、５２、３５、２９ｋＤａのバンドで、予め染色したタンパク質マーカーを示す。図１０は、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラの製造を示す。ループ２にクローニングカセットを有するＰ粒子ベクター（Ａ）は野生型ＮＯＲ Ｐ粒子（Ｂ）を製造する。ＲＶ ＶＰ８コード配列（Ｃ）がＰ粒子ベクター（Ｄ）にクローン化されると、それはキメラの最も外側表面でのＲＶ ＶＰ８の指標と共に、ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラ（Ｅ）を製造する。
【００９８】
マウスの免疫。６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Labs）を高度精製ＲＶ ＶＰ８−Ｐ粒子キメラで、異なる用量で、アジュバント［ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）］ありまたはなしで、経口または鼻腔内で免疫する。野生型Ｐ粒子はコントロールとして含まれる。ワクチン接種の鼻腔内経路のために、体積５０μｌ中、野生型Ｐ粒子およびＶＰ８−Ｐ粒子キメラの３種の初期用量（５、１５および４５μｇ／マウス、３回用量）が投与される（鼻腔あたり２５μｌ）。経口経路のために、１ｍｌのシリンジを備えた２０ゲージのステンレス鋼製給餌針を用いて胃内カニューレによって胃に直接、合計２００μｌの同量のワクチンを送達する。動物（１２匹のマウス／群）を一般的外見および体重減少についてモニターして、ワクチンの有害な効果の可能性を評価する。回復期前および中の血清サンプルを回収し、抗原として組換えＮＯＲ ＶＬＰおよびＲＶ ＶＰ８を用いたＥＩＡによってＮＯＲおよびＲＶに対する抗体応答について試験する。ＮＯＲおよびＲＶに対する分泌ＩｇＡのために、糞便サンプルを回収する。１つのマウス群（Ｎ＝５）を、ネガティブコントロールとして、細菌発現グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で免疫する。
【００９９】
インビトロアッセイによる免疫応答の評価。異なる投与レジメンによるワクチンの免疫前後のマウス血清を回収し、Huang et al., 2003, J Infect Dis 188:19-31およびHuang et al., 2005, J Virol 79:6714-22に記載のように、タイプ特異的抗体検出ＥＩＡを用いてＮＯＲおよびＲＶに対するそれらの特異的抗体力価を測定する。糞便サンプル中の分泌ＩｇＡを、粘膜免疫の指標としてＮＯＲおよびＲＶに対する応答について試験する。ＲＶについて、中和アッセイは、細胞培養中のＲＶ複製の阻害のために血清サンプルで実施される。ＮＯＲについて、ＮＯＲレセプター遮断アッセイを実施して、潜在的「中和」活性として抗体によって、ＮＯＲ ＶＬＰとそれらのＨＢＧＡレセプターとの結合の阻害を測定する。
【０１００】
ＶＡ３８７は世界中のＮＯＲ関連胃腸炎の６５〜８５％に関与する主要なＧＩＩ−４遺伝子型であるため、同じＶＡ３８７ ＶＬＰまたはＰ粒子に対する同種抗体応答を用いる。ＮＯＲレセプター結合のインビトロ遮断アッセイを用いて、ＮＯＲに対する抗体の潜在的中和を評価する。ＶＰ８−Ｐ粒子ワクチンの異なる投与レジメンからのマウス血清を、ＨＢＧＡレセプターとＮＯＲ ＶＬＰの結合に対する遮断効果について試験する。抗体の遮断効果を再度、同種株ＶＡ３８７とそれらに対するＨＢＧＡ（Ａ、Ｂ、Ｈ、Ｌｅｗｉｓ ＢおよびＬｅｗｉｓ Ｙ抗原）との結合について試験する。簡潔には、既知のＨＢＧＡまたは合成オリゴ糖で十分に特徴付けられた唾液をマイクロタイタープレートに被覆する。脱脂乳でブロックした後、３０分間抗体と共にインキュベートしたＮＯＲ ＶＬＰをプレートに加える。ＨＢＧＡレセプターと結合したＶＬＰを、特異的ＶＡ３８７ ＶＬＰに対するモルモット過免疫血清、次いでＨＲＰ複合化ヤギ抗モルモットＩｇＧ（ICN、Aurora、OH）の添加によって検出する。シグナル強度（吸光度、ＯＤ）は波長４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーによって読み取る。遮断効果は、抗体処理ありとなしとでの結合の比較によって決定する。
【０１０１】
プラーク減少を測定するための細胞培養を用いた中和アッセイを実施して、マウスにおいてＶＰ８−Ｐ粒子キメラに対して誘導される抗体を試験する。［Ｐ］タイプのＶＰ８−Ｐ粒子キメラと他のＲＶタイプの交差中和を、発明者の研究室で入手可能な様々なＲＶ株を用いて試験する。組織培養順応Ｗａ株、マウスＲＶ ＥＤＩＭ株およびＭＡ１０４ミドリザル腎臓細胞株が使用される。簡潔には、ＭＡ１０４細胞を６ウェルプレートで培養し、ＲＶ接種の連続希釈によって〜５０プラーク／ウェルの形成についてＲＶ力価を測定する。アッセイのために、ＲＶは特定希釈の血清と６０分間インキュベートし、６ウェルプレート中の細胞（ＭＡ１０４）に混合物を加える。２時間後プレートを洗浄し、次いで０．８％のアガロースを含む培地で覆う。３７℃で４〜５日間インキュベートした後、各ウェルのプラーク数を計測する。処理していないウェルと比較して、血清を含むウェルでのプラーク数の減少は、血清中に存在する中和抗体の量を決定する。
【０１０２】
マウスＲＶチャレンジモデル。ワクチンの保護効能を試験するためのこのＲＶチャレンジモデルの手法は、Choi et al., 「Functional mapping of protective domains and epitopes in the rotavirus VP6 protein,」 2000, J Virol 74:11574-80; Choi et al., 「Functional mapping of protective epitopes within the rotavirus VP6 protein in mice belonging to different haplotypes,」 2003, Vaccine 21:761-7;およびMcNeal et al., 1999, J Virol 73:7565-73.41（それらの全体について、参照によりそれらの開示を本明細書に組み込む）に記載されている。ＲＶ抗体を含まない６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、Ind.）をＶＰ８−Ｐ粒子キメラワクチンで経口または鼻腔内的に免疫する。最後の免疫の２〜４週間後、mice are 経口ly (via gavage、generally carried out by passing a feeding tube through the nose or mouth into the esophagus) challenged with murine RV EDIM strain at a dose of １００ ５０％排出用量と等しい４×１０４ＦＦＵ（フコース形成単位）の用量でマウスＲＶ ＥＤＩＭ株でマウスを経口的に（胃管栄養法で、一般的に鼻または口を介して食道へと給餌チューブを通して）チャレンジする。糞便中のＲＶ抗原を測定するため、ＥＤＩＭチャレンジの７日以上後に各マウスから２回糞便ペレットを採取し、１ｍｌのアールバランス化食塩水中に保存する。分析までサンプルを凍結保存し、その時点でそれらをホモジナイズし、遠心分離してデブリを除去する。糞便サンプル中のＲＶ抗原の量は、既報のとおりＥＬＩＳＡで測定する。
【０１０３】
結果。結果は、ＶＰ８−Ｐ粒子が処置マウスにおいてＲＶ−およびＮＯＲ−特異的抗体を誘導し、該抗体がＮＯＲ ＶＬＰとそのＨＢＧＡレセプターとの結合を遮断し、細胞培養中のＲＶの複製を中和し、そしてマウスチャレンジモデルにおいて免疫保護を提供することを示す。ＶＰ８−Ｐ粒子ワクチンは細胞傷害性または副作用を示さない。
【０１０４】
発現構築物。ＶＡ３８７ノロウイルス（ＧＩＩ．４）Ｐドメインコード配列およびシステイン含有ペプチドを含むｐＧＥＸ−４Ｔ−１［グルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ) Gene fusion System、GE Healthcare life sciences］のＰ粒子発現ベクターを多様なキメラＰ粒子の構築のためのテンプレートとして用いた。Ｐ粒子Ｈｉｓタグキメラを作製するために、Ｈｉｓタグコード配列を部位特異的突然変異誘発によってＮ３７２とＤ３７４（図７および図１４Ａ）の間のループ２に挿入した（下記参照）。ヒトロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子のために、まずループ２にＳｐｅＩおよびＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩの酵素部位を有するクローニングカセットを導入して、部位特異的突然変異誘発によってＴ３６９からＤ３７４の配列を置換した（図１６Ａ）。［Ｐ］８株（Ｗａ、L65-L223、GenBank accession: VPXRWA）および［Ｐ］４株（ＤＳ１、L65-l223、GenBank accession: VPXRDS）のＶＰ８抗原ｃＤＮＡ配列をカセットにクローン化した。Ｐ粒子にマウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８抗原（L65-L222、GenBank accession: AF039219）のｃＤＮＡ配列をクローニングするため、ＸｂａＩおよびＢｇｌ ＩＩ部位を有する別のクローニングカセットをＮ３７２とＮ３７３の間に挿入した。ＰダイマーＨｉｓタグキメラの作製のために、ヒンジを有するＰドメインのＮ末端とＨｉｓタグを連結した。ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むキメラマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を作製するため、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１のベクターにＭＢＰのＮ末端と該ペプチドを融合した。ｐＤＥＳＴ１７（Gateway、Invitrogen）（２９）におけるＨｉｓタグ化サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）α−Ｌ−フコシダーゼ（GenBank accession: TM0306）の発現構築物は、Dr. HenrissatおよびDr. Bourne（Architecture et Fonction des Macromolecules Biologiques、UMR 6098、CNRSおよび Universites Aix-Marseille I and II、31 Chemin J. Aiguier、F-13402 Marseille、Cedex 20、France）から快く譲っていただいた。
【０１０５】
組換えタンパク質の発現および精製。０．２５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の誘導により大腸菌（ＢＬ２１）において、室温（〜２５℃）で一夜、他に記載のとおりに組換えタンパク質を発現した。組換えＧＳＴ融合タンパク質の精製は、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare life Sciences）の樹脂を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。ビーズ上または溶液中（リン酸緩衝化食塩水、ＰＢＳ，ｐＨ７．４）のいずれかでトロンビン（GE Healthcare life Sciences）切断によって標的タンパク質からＧＳＴを除去し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製した。Ｈｉｓタグタンパク質の精製は、TALON His-Tag Purification Resins（Clontech、Mountain View、CA）を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。２５０ｍＭのイミダゾール（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を含むＰＢＳによって樹脂からＨｉｓタグタンパク質を溶出させた。樹脂精製タンパク質のさらなる精製は、ゲルろ過クロマトグラフィーによって実施した。
【０１０６】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、既報の通りAKTA FPLC System（GE Healthcare life Sciences）で実施した。簡潔には、AKTA FPLC system（model 920、GE Healthcare life Sciences）で動力供給したサイズ排除カラムSuperdex 200（GE Healthcare life Sciences）にアフィニティーカラム精製タンパク質をロードした。溶出フラクションの分子量は、Gel Filtration Calibration Kits（GE Healthcare life Sciences）でキャリブレートした。あるいは、空ボリューム、キメラＰ粒子およびＰダイマーのピークを、それぞれ青色デキストラン２０００（〜２０００ｋＤａ、GE Healthcare life Sciences）、野生型Ｐ粒子（８３０ｋＤａ）およびノロウイルスＶ３８７（ＧＩＩ．４）の野生型Ｐダイマー（６９ｋＤａ）で決定できる。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）および／またはウェスタンブロット分析によって興味あるフラクションのタンパク質をさらに分析した。
【０１０７】
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。１０％ゲルを用いたＳＤＳ ＰＡＧＥによって組換えタンパク質を分析した。他に記載のとおり、ノロウイルスＶＬＰ（ＶＡ３８７、GII.4、1:3000）またはロタウイルスＶＰ８抗原（Ｗａ、1:3000）に対する過免疫血清を用いたウェスタンブロット分析によって、組換えタンパク質の特異的組成を検出した。ブロットした膜を５％脱脂乳でブロックした。二次抗体−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲート（1:5,000、ICN Pharmaceuticals、Costa Mesa、CA）を用い、そしてECL Eastern Blotting Detection Reagents （GE Healthcare life Sciences、Buckinghamshire、England）によってＨＲＰを検出した。ＥＣＬシグナルはHyperfilm ECL（GE Healthcare life Sciences、Buckinghamshire、England）で捕捉した。
【０１０８】
既報の通り製造業者によって提供されたQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene、La Jolla、CA）の手法に従って部位特異的突然変異誘発を実施して、Ｈｉｓタグおよび構成クローニングカセットをノロウイルスＰドメインのループ２に挿入した。Ｎ３７２とＤ３７４との間のループ２（図７および図１４Ａ）に７個のヒスチジンの紐を挿入するためにプライマー対：caccactgacacaaaccaccaccaccatcatcaccacgatcttcaaactggcc/ggccagtttgaagatcgtggtgatgatggtggtggtggtttgt gtcagtggtgを用いた。さらに、ヒトロタウイルスＶＰ８抗原のコード配列の挿入を促進するために、プライマー対：gttcaatacaccactagtacaaacatcgatatccttcaaactggc/ gccagtttgaaggatatcgatgtttgtactagtggtgtattgaacを用いて、ノロウイルスＰドメインのループ２に３個の酵素部位（Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩ）を有するクローニングカセットを構築した。マウスロタウイルスＶＰ８抗原のコード配列の挿入を補助するため、プライマー対：tacaccactgacavaaa ctc tagacacagatctaatgatcttcaaactgg/ccagtttgaagatcattagatctgtgtctagagtttgt gtcagtggtgtaを用いて、ＸｂａＩおよびＢｇｌ ＩＩ部位を有する別のクローニングカセットを作製した。
【０１０９】
低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＥＭ）技術。
【０１１０】
Ｃｒｙｏ−ＥＭイメージ取得。我々の以前の研究に記載の野生型Ｐ粒子の構造再構成に用いた手法をここで採用した。簡潔には、精製Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラのアリコート（３〜４μｌ）を液体窒素によって冷却した液体のエタン中、Quantifoil格子上でフラッシュ凍結した。サンプル格子を顕微鏡にのせ、２００ＫＶで操作するフィールド放出銃を備えたＣＭ２００低温顕微鏡を用いて、フィルム上で低線量イメージ（〜２０ｅ／Ａ２）を記録した。公称倍率ｘ５０，０００、デフォーカスレンジ２．０〜４．０μｍでイメージを撮影した。顕微鏡写真を選択し、Nikon Super CoolScan 9000EDスキャナーをステップサイズ６．３５μｍ／ピクセルで用いてデジタル化した。スキャンしたイメージをビニングして、さらなるイメージ処理および３Ｄ再構成のために、２．４９Å／ピクセルでイメージの最終サンプリングを得た。
【０１１１】
Ｃｒｙｏ−ＥＭイメージ処理および３Ｄ再構成。ＥＭＡＮのｂｏｘｅｒプログラムを用いてキメラＰ粒子のイメージを選択した。選択されたイメージを手作業で選別して、偽陽性を排除した。ＥＭＡＮのｃｔｆｉｔプログラムを用いて、同じ顕微鏡写真に由来する粒子のセットに関連した、コントラスト−トランスファー関数（ＣＴＦ）パラメーターを手作業で決定した。ＥＭＡＮのｓｔａｒｔｏｃｔプログラムを用いて、キメラＰ粒子の初期モデルを作製した。次いで、ＥＭＡＮのｒｅｆｉｎｅプログラムを用いて、新たなキメラ粒子の中心および方向を繰り返し決定し、収束するまでＥＭＡＮのｍａｋｅ３ｄプログラムによって２Ｄイメージから３Ｄマップを再構成した。キメラＰ粒子の再構成によって八面体シンメトリーが与えられた。
【０１１２】
Ｃｒｙｏ ＥＭモデル評価および分析。UCSF Chimeraソフトウェアを用いて、ロタウイルスＶＰ８抗原（Ｗａ、2DWr、L65-L223）の結晶構造をＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラの３Ｄ構造の伸長した突起に重ね合わせた。単純剛体運動がキメラＰ粒子の３Ｄ構造とＸ線構造の最良のマッチングの発見と考えられた。
【０１１３】
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いて、Ｐ粒子−抗原キメラによって誘導されたマウス抗血清の免疫反応性および抗体力価を測定した。可変の抗血清のために異なる抗原を用いた：Ｐ粒子Ｈｉｓタグキメラによって誘導された血清についてＨｉｓタグ化T. maritimaα−Ｌ−フコシダーゼ、非露出ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含むＰ粒子によって誘導された血清についてＭＰＢ−ＣＮＧＲＣまたはＭＰＢ−ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導された血清について遊離ＶＰ８、そして内部コントロールとしてＰ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導された血清についてＧＳＴ。抗原を９６ウェルマイクロタイタープレート（Dynex Immulon; Dynatech、Franklin、Mass）に被覆した。５％脱脂乳でブロックした後、被覆した抗原と共に指定の希釈での血清をインキュベートした。他に記載のとおりに二次抗体−ＨＲＰコンジュゲートによって、結合した抗体を検出した。抗原に対する抗体の力価は、カットオフシグナル強度０．１５での終点希釈として定義された。野生型Ｐ粒子またはＰＢＳで免疫した動物由来の血清をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１４】
ＨＢＧＡ結合および遮断アッセイ。基本的には他に記載のとおりに、唾液を利用した結合アッセイを実施した。簡潔には、既知のＨＢＧＡ表現型を有する煮沸した唾液サンプルを１０００倍に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Dynex Immulon; Dynatech、Franklin、MA）に被覆した。５％脱脂乳でブロックした後、ＶＬＰまたはノロウイルス（ＶＡ３８７、ＧＩＩ．４）のＰ粒子を加えた。我々自身が作製したウサギ抗ＶＡ３８７ ＶＬＰ抗血清（１：３，３００）を用いて結合したＶＬＰ／Ｐ粒子を検出し、次いでＨＲＰ複合化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ICN、Pharmaceuticals、Costa Mesa、CA）を加えた。ＶＬＰを被覆した唾液に加えた後、希釈した血清と共に３０分間プレインキュベートして、ノロウイルスＶＬＰ−唾液結合に対するＰ粒子−ＶＰ８キメラによって誘導されたマウス血清の遮断効果を測定した。免疫した動物由来のマウス血清による遮断ありおよびなしで測定したＯＤを比較することにより、遮断率を計算した。遊離ＶＰ８免疫動物由来の血清の遮断率をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１５】
抗体応答のためのマウス免疫。６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、IN）を精製キメラＰ粒子または遊離抗原で、用量５〜１５μｇ／マウス、２週間間隔で３〜４回で免疫した。Ｐ粒子−またはＰダイマー−提示Ｈｉｓタグに対する免疫応答の比較のため、マウスに５μｇ／マウスの組換えＰ粒子−Ｈｉｓタグキメラ、およびＰダイマー−Ｈｉｓタグまたは野生型Ｐ粒子を投与した（ｎ＝５）。非露出ペプチドに対する免疫応答の比較のため、マウスに非露出ペプチドＣＮＧＲＣまたはＣＤＣＲＧＤＣＦＣを含む組換えＰ粒子５μｇ／マウスを投与した。免疫源はフロイントアジュバントと共に皮下的に４回与えた。Ｐ粒子提示ＶＰ８および遊離ＶＰ８に対する免疫応答の比較のため、マウスに５μｇ／マウスの遊離ＶＰ８および１５μｇ／マウスのＰ粒子−ＶＰ８キメラ（両抗原はＶＰ８のモル量として同量である）を、アジュバントなしで鼻腔内またはフロイントアジュバントと共に皮下的に、３回投与で投与した（ｎ＝５〜７）。内部コントロールとして免疫源に等モル量のＧＳＴを加えた。保護のためのマウスのＰ粒子−ＶＰ８ワクチンの免疫は下に記載した。免疫前および最終免疫の２週間後に、逆軌道毛細血管叢の穿刺によって血液を採取した。血清は、血液から４℃で一夜静置後遠心分離によって処理した。
【０１１６】
ロタウイルスプラークアッセイを実施して、細胞培養中のロタウイルス複製に対する、ロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子によって誘導される抗血清の中和を測定した。ＭＡ１０４サル腎臓細胞で成長させた組織培養適応ロタウイルスＷａ株をこのアッセイに用いた。ＭＡ１０４細胞を６ウェルプレートで培養し、接種として〜５０プラーク／ウェルのロタウイルス力価を用いた。アッセイのために、ロタウイルスを所定の希釈のマウス血清と共に６０分間インキュベートした。次いで混合物を６ウェルプレート中のＭＡ１０４細胞に加えた。２時間後、プレートを洗浄し、次いで５μｇ／ｍｌのトリプシン（Invitrogen、Carlsbad、CA）および０．８％のアガロースを含む培地で被覆した。３７℃で４〜５日インキュベーション後、各ウェルのプラーク数を計測した。無処理コントロールウェルのものと比較した抗血清処理したウェルにおけるプラーク数の減少によって、血清中の中和抗体の量を測定した。
【０１１７】
マウスロタウイルスチャレンジモデル。以前の研究に記載のロタウイルスチャレンジモデルに従って、Ｐ粒子−ＶＰ８ワクチンの保護効率を試験した。ロタウイルス抗体を含まない６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５〜７）（Harlan-Sprague-Dawley、Indianapolis、IN）をアジュバントなしで、マウスロタウイルス（ＥＤＩＭ）ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子（１５μｇ／マウス）で３回、鼻腔内免疫した。遊離マウスロタウイルスＶＰ８抗原（５μｇ／マウス）およびヒトロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子（１５μｇ／マウス）を比較のために含めた。さらに、野生型Ｐ粒子（ベクターコントロール）およびＰＢＳをネガティブコントロールとして投与した。最後の免疫の２週間後、１０５の５０％排出用量と等しい４×１０４ＦＦＵ（フォーカス形成単位）の用量のマウスロタウイルスＥＤＩＭ株で、経口胃管栄養法によってチャレンジした。糞便中のロタウイルス排出を測定するため、ＥＤＩＭチャレンジ後６日間毎日各マウスから２個の糞便ペレットを採取し、１ｍｌのアールバランス化食塩水中に保存した。分析までサンプルを凍結保存し、その時点でそれらをホモジナイズし、遠心分離してデブリを除去した。糞便サンプル中のロタウイルス抗原の量（μｇ／ｍｌ）は、既報のとおりＥＬＩＳＡで測定した。
【０１１８】
統計的分析。GraphPad Prism version 5.00 for Windows（GraphPad Software、San Diego CA）およびMicrosoft Office Excel 2007を用いてグラフを作製した。GraphPad Prism version 5.00 for Windowsを用いたデータ群のｔ検定によってＰ値を決定した。
【０１１９】
結果
Ｈｉｓタグを含むキメラＰ粒子の製造。我々の研究は、Ｐ粒子のループ２に小さなエピトープ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを挿入することで開始した（図３および１４）。ＧＳＴ遺伝子融合系を用いた大腸菌におけるこのＰタンパク質の発現および精製は、高収率（＞１０ｍｇ／リットル培養）で予測したサイズ（〜３５ｋＤａ）を有するタンパク質が得られ、次いでトロンビンでＧＳＴタグを除去するために（〜２７ｋＤａ）タンパク質を消化した（図１４Ｃ）。ゲルろ過クロマトグラフィー、次いでＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によってキメラＰタンパク質のＰ粒子形成が示され、ここでキメラＰ粒子は〜８４０ｋＤａの主要なピークを形成した（図１４ＤおよびＥ、データは示さず）。キメラＰ粒子上での挿入したＨｉｓタグの露出は、Ｔａｌｏｎ樹脂へのその特異的結合、続く２５０ｍＭのイミダゾールによる溶出によって示され（図７Ａ、溶出１および２）、これは高純度のキメラＰ粒子をもたらした。したがって、Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラはまた、アフィニティーＴａｌｏｎ樹脂を用いて大腸菌からも精製できる（データは示さず）。
【０１２０】
Ｐ粒子担体によるＨｉｓタグの免疫増進。Ｐ粒子−Ｈｉｓタグキメラで免疫した後マウスにおけるＨｉｓタグに対する免疫応答の試験によってこれを測定した（ｎ＝５）。Ｐダイマー提示ＨｉｓタグよりもＰ粒子提示Ｈｉｓタグで免疫したマウスにおいて、有為に高いＨｉｓタグに対する抗体力価が検出された（Ｐ＜０．０５、図１５ＡおよびＢ）。ＰドメインのＮ末端（ＣＮＧＲＣ）またはＣ末端（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）に融合した２種の短いペプチドは、Ｐ粒子提示Ｈｉｓタグによって誘導されるものと比較して、有為に弱い免疫応答を誘導した（図１５Ｃ〜Ｆ）。これらの２種のペプチドは、Ｐ粒子の内側に埋め込まれることが示されており、このことは、免疫増進のためにＰ粒子の表面上に挿入された抗原が適切に露出されることが重要であると示している。予想通り、全ての血清はノロウイルスＰ粒子プラットフォームと強く反応した（図１５、データは示さず）。
【０１２１】
ロタウイルスＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子の開発。我々は次に、１５９アミノ酸を含むロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８抗原の挿入によって、より大きなポリペプチドを得るためのＰ粒子プラットフォームの能力を試験した。ＶＰ８挿入を促進するために、Ｐ粒子のループ２に３個の酵素部位（Ｓｐｅ ＩおよびＣｌａ Ｉ／ＥｃｏＲＩ）を有するクローニングカセットを構築した（図１６Ａ）。大腸菌における構築物の発現によって、高収率（＞１５ｍｇ／リットル培養）でＧＳＴ−Ｐ−ＶＰ８融合タンパク質（〜７８ｋＤａ、図１６Ｂの左パネル）が得られた。溶液中または精製ビーズ上のいずれかで、ＧＳＴ融合タンパク質のトロンビン消化によって、放出されたＰ−ＶＰ８キメラ（〜５２ｋＤａ）が得られた（図１６Ｂ、それぞれ中央および右パネル）。ゲルろ過クロマトグラフィーによってＰ−ＶＰ８キメラタンパク質が高い割合（＞９５％）でＰ粒子を形成することが示された（図１６Ｃ）。ウェスタンブロット分析によって、Ｐ−ＶＰ８キメラタンパク質がノロウイルスＶＬＰ（ＶＡ３８７）およびロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８に対する抗体両方と反応することが示された（図１６Ｄ）。
【０１２２】
Ｃｒｙｏ−ＥＭおよび３次元イメージ再構成によって、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラが野生型Ｐ粒子と同様の八面体シンメトリーのままであるが、キメラＰ粒子が顕著に大きいことが示された（図１ＡおよびＢ）。伸長した突起は、おそらく、Ｐダイマー由来の潜在的境界としてのニックによって認識されうる挿入されたＶＰ８である。キメラの伸長した突起の密度マップにおける同じＷａ株（２）のロタウイルスＶＰ８抗原の結晶構造の重ね合わせによって、伸長した突起が実際にＶＰ８であることが確認された（図１Ｃ〜Ｅ）。
【０１２３】
ＶＰ８に対するＰ粒子増進免疫応答。次に我々は、マウスにおけるＰ粒子提示ＶＰ８抗原に対する免疫応答を試験した。等モル量のＰ粒子−ＶＰ８キメラおよび遊離ＶＰ８での免疫後、抗原として遊離ＶＰ８を用いたＥＩＡによって得られたマウス血清を試験した。Ｐ粒子提示ＶＰ８に対する抗体力価は、アジュバントなしでの鼻腔内免疫による遊離ＶＰ８に対するものよりも有為に高かった（Ｐ＜０．００５）。同様の結果が、それぞれロタウイルスＷａおよびＤＳ−１のＶＰ８抗原を含む２種のキメラＰ粒子とそれらの対応遊離ＶＰ８の比較において観察された（図１７ＡおよびＢ）。これらの動物において遊離ＧＳＴに対してはわずかにのみ抗体力価が検出され、Ｐ粒子提示ＶＰ８の特異的免疫増進がさらに確認された。フロイントアジュバントと共に上記抗原で皮下免疫したマウスの免疫応答も試験したところ、遊離ＶＰ８とＰ粒子提示ＶＰ８の間でＶＰ８に対する抗体力価の差はほとんど観察されなかった（図１７Ｃ）。
【０１２４】
Ｐ粒子−ＶＰ８キメラはロタウイルスに対する中和抗体を誘導した。鼻腔内免疫を介したＰ粒子−ＶＰ８（Ｗａ、［Ｐ］８）キメラによって誘導された過免疫抗血清は（図１７Ａ）、細胞培養中の同族ロタウイルス（Ｗａ）複製を強く低減した。この中和力価は、遊離ＶＰ８での免疫によって誘導した中和力価よりも有為に高かった（Ｐ＜０．０００２）（図１８Ａ）。Ｐ粒子−ＶＰ８（ＤＳ−１、［Ｐ］４）キメラでの免疫後、Ｗａに対する低レベルの交差中和も観察された（Ｐ＜０．０５、図１８Ｂ）。反対に、ＤＳ−１の遊離ＶＰ８で免疫した動物由来の血清は、かかる交差中和を示さなかった。さらに、フロイントアジュバントと共に皮下免疫した動物由来の血清を用いた中和力価も測定した。驚くべきことに、ＥＩＡにおいて遊離ＶＰ８抗原と同様の免疫反応性を有する４対のマウス血清のうち（図１８Ｃ）、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）で免疫した動物由来の血清が全て、同じＷａ株の遊離ＶＰ８で免疫したマウス由来の血清のものよりも有為に高い中和力価を示した（Ｐ＜０．００５、図１８Ｄ）。これらのデータは、キメラＰ粒子上のＶＰ８がより良好に提示され、中和エピトープに必要な適切なコンホメーションを維持しうることを示した。
【０１２５】
Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのワクチン接種はマウスロタウイルスチャレンジ後の低下した排出を引き起こした。次に我々は、マウスロタウイルスモデル（ＥＤＩＭ株）を用いてインビボで、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラワクチンが保護を与えうるかを試験した。この目的で、ＥＤＩＭ ＶＰ８抗原を含むキメラＰ粒子を材料および方法に記載のとおりに構築し、マウスに投与した（Ｎ＝５〜７）。同モル量の遊離ＥＤＩＭ ＶＰ８、ヒトＶＰ８（Ｗａ）を有するキメラＰ粒子または野生型Ｐ粒子で免疫した動物は、コントロールとして含めた。最後の免疫の２週間後、マウスＥＤＩＭロタウイルスで動物をチャレンジした。チャレンジの６日後に糞便サンプルを採取し、ＥＩＡで排出を検出した（表１、図１９）。Ｐ粒子−ＶＰ８（ＥＤＩＭ）キメラをワクチン接種されたマウスは、最も少ない量のウイルス抗原を排出した。排出の減少は６日間で８９％であった（Ｐ＜０．０５）。ＥＤＩＭでのチャレンジの１日後では９９．２％の減少であった。遊離マウスＶＰ８で免疫したマウスは、次に少ない排出量であり、７７％の平均保護であった（Ｐ＜０．０５、２〜５日）。ヒトロタウイルス（Ｗａ）ＶＰ８を含むキメラＰ粒子ワクチンでの免疫は、２３％減少と排出に対してわずかな効果を有し、これはＥＤＩＭに対する何らかの交差保護を示唆している。この群での６日目に、排出が顕著に減少した（６３％、Ｐ＜０．０５）。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
ノロウイルスとＨＢＧＡの結合を遮断するＰ粒子−ＶＰ８キメラ誘導性抗体での免疫。また、Ｐ粒子−ＶＰ８（Ｗａ）キメラでの免疫によって、マウスでの免疫応答におけるＰ粒子骨格の役割を試験した。予測したとおり、キメラ誘導性抗体は、ＥＩＡで測定したときノロウイルスＶＬＰおよびＰ粒子と強く反応した（図２０、データは示さず）。これらの血清はまた、ＨＢＧＡレセプターとノロウイルスＶＬＰの結合も遮断した（タイプＡ唾液、図２０Ｂ）。ネガティブコントロールとして遊離ＶＰ８（Ｗａ）で免疫した動物由来の血清はかかる遮断を示さなかった。この結果は、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラがロタウイルスおよびノロウイルスの両方に対するデュアルワクチンであり得ることを示している。
【０１２８】
我々の以前の研究により、ノロウイルスＰ粒子が容易に製造でき、極めて安定で高度に免疫原性であり、これはノロウイルスに対するサブユニットワクチンとして使用できることが示された。我々はさらに、外来抗原の免疫増進のための新規ワクチンプラットフォームとしてＰ粒子が使用できることを示した。我々は、１）Ｐ粒子の表面ループがＰ粒子の形成および作製に影響を与えることなく外来抗原を挿入するための優れた部位であること、２）Ｐ粒子が少なくとも１５９アミノ酸までのサイズの外来抗原に耐えること、３）挿入抗原に対する増進された免疫応答がインビトロおよびインビボ両方での中和および保護実験によって示されることを示した。Ｐ粒子−ＶＰ８キメラはまた、ロタウイルスおよびノロウイルスの両方に対する有望なデュアルワクチンを提供した。したがって、複数多価外来挿入の能力を有するキメラ粒子およびその複数の表面ループを作製するための単純な手法は、Ｐ粒子を感染症および効果的なワクチンから利益を得るであろう他の状態の抗原提示のための魅力的なワクチンプラットフォームにする。
【０１２９】
本発明の第一次的な目標は、一般に免疫原性が低い小ポリペプチド抗原の免疫原性をＰ粒子が増進できるかを試験することである。我々は、モデルとしてＨｉｓタグを用いてこの問題を研究し、すばらしい結果を得た。２つの主要な要因、複数コピー数および挿入された抗原の表面露出が、観察された免疫増進に寄与している可能性がある。Ｐ粒子はＰモノマーの２４個のコピーからなり、このことはＰダイマーと融合したＨｉｓタグとの比較において増進した免疫応答を説明できる（図１５Ａ）。抗原の表面露出の重要性は、ＰドメインのＮまたはＣ末端と結合した２個の非露出ペプチドに対する低い免疫応答性によって示された（図１５ＢおよびＣ）。したがって、Ｐ粒子はその大きなサイズ（８３０ｋＤａ）および適切な外来抗原の提示（これと異なるものは低い免疫原性を有する）によってアジュバントとして作用しうる。粒子あたりの抗原の増加した複数コピーは、増加した免疫応答を説明しうる別の特徴である。
【０１３０】
Ｈｉｓタグペプチドに加えて、我々はＰ粒子に多数の他の小ペプチド、例えばマウスサイトメガロウイルスのＴ細胞エピトープ（９アミノ酸）、シュードモナス属Ｅｐｉ８エピトープ（１４アミノ酸）およびインフルエンザＡのＭ２細胞外エピトープ（２３アミノ酸）の挿入に成功した（Tan and Jiang、未公表）。これらのデータは、Ｐ粒子が多様な小ペプチド抗原の免疫増進に容易に利用できることを示唆している。Ｐ粒子への様々なロタウイルスＶＰ８の挿入成功は、広範な大型外来抗原のためのＰ粒子プラットフォームの適用を大きく拡張する。ロタウイルスＶＰ８はウイルスカプシド上の突起タンパク質であり、ロタウイルス感染性に重要であると考えられている。また、それは中和抗体を誘導する２種の抗体の一つでもある。ＶＰ８タンパク質について多数の中和エピトープが同定されている。Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの中和抗体誘導成功は、マウスにおけるロタウイルス排出に対して応答し、それに対する保護を提供する。このことは、これらのエピトープがＰ粒子担体上で提示されていることを示唆している。
【０１３１】
２種の近年導入されたロタウイルスワクチンは極めて有効であるが、新たな出現ウイルスのための新世代ワクチンが潜在的に必要とされうる。非感染性サブユニットワクチンは、現在のワクチンで心配されうる毒性株への復帰の危険がない。ロタウイルスのＶＬＰワクチンの開発は数年来提案されている。ロタウイルスＶＬＰワクチンは、バキュロウイルス宿主に複数のカプシドをコトランスフェクションする必要があるため、低い発現効率と高い製造コストの問題がある。反対に、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラの作製は常套の大腸菌ベースのクローニングおよび発現手法のみを必要とし、これは効率がよくコストが低い。さらに、ＶＰ８についての交差中和エピトープが記載されている。我々は本稿において、Ｐ［４］ウイルス由来ＶＰ８を含むキメラＰ粒子でのマウスの免疫がＰ［８］ロタウイルスに対する交差中和を有することを示した。最小数のＰタイプを含むカクテルワクチンもコスト的に有効であり得る。
【０１３２】
Ｐ粒子−ＢＰ８キメラによって誘導される抗体の、ノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡの結合を遮断する能力は、予測外である。図１に示すとおり、Ｐ粒子のＨＢＧＡ結合界面を含むＰダイマーの遠位表面は、挿入されたＶＰ８によってほとんど被覆されている。これはＨＢＧＡレセプターに対する該キメラの結合能の喪失を導く（データは示さず）。継続して遮断能が見られたことの一つの可能性は、挿入されたＶＰ８抗原によって被覆されていても、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラのＨＢＧＡ結合界面のエピトープが抗体誘導のためになおもアクセス可能であるということである。あるいは、観察された糖遮断は、糖結合部位の近くでの抗体結合のためでありうる。どのようなメカニズムが関与するにせよ、キメラ誘導性抗体のノロウイルスＶＬＰとＨＢＧＡとの結合を遮断する能力は、Ｐ粒子プラットフォームにさらなる価値を付け加える。ノロウイルスおよびロタウイルス両方に対するＰ粒子−ＶＰ８キメラのデュアルワクチンのコンセプトは、両方の感染の危険がある特定の集団に特に有用でありうる。
【０１３３】
ループ２のみがこの研究では試験されたが、他の２つのループにおける抗原挿入成功の可能性が予測され、我々の研究室で現在試験している。Ｐモノマーあたり３個の表面ループの利用可能性は、多目的ワクチン設計の機会を提供する。例えば、免疫応答を上昇させるため、同じエピトープまたは抗原を３個のループ全てに挿入して、粒子あたり７２コピーの抗原に到達できる。それぞれの抗原のタンデム反復の挿入によって、より多いコピー数すらも作製できる。あるいは、異なる抗原を３個のループに挿入して、異なる病原体またはロタウイルスについて異なるＶＰ８抗原に対する多価ワクチンを得ることができる。様々な目的のための機能的タグの挿入によって、さらなるワクチンテンプレートも作製できる。例えばＨｉｓタグの挿入は、精製手法をさらに単純にする。特定のリガンドまたはシグナル分子を用いて、宿主の特定の臓器、組織または細胞を標的とすることによって、免疫応答を刺激してもよい。
【０１３４】
Ｐ粒子プラットフォームのさらなる適用は、研究および診断的使用のための小ペプチドに対する抗体の製造用である。多様な疾患バイオマーカー（主としてペプチドエピトープ）が同定されており、これらのバイオマーカーに対する抗体が診断目的では重要である。小ペプチドは、ＤＮＡクローニングの単純な手法によってＰ粒子のループに容易に挿入できる。我々は、そのプロセスをさらに促進するクローニングカセットを含む簡便なＰ粒子ベクターを開発した。細菌における組換えキメラＰ粒子の発現の後、本研究で確立された手法にしたがって実験動物を免疫することによって、挿入したペプチド抗原に特異的な抗体を高力価で誘導できる。この方法による抗体製造は、ペプチド合成および免疫増進のためのキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のような巨大分子とペプチドとのコンジュゲートのようなコストのかかる工程を回避する。ノロウイルスＰドメインは他のタンパク質のいずれとも相同性を有さない固有の配列を有しているため、他のタンパク質との交差反応性の心配にはおよばない。したがって、Ｐ粒子ワクチンプラットフォームは、生物医学的研究の多くの領域における抗体製造のための簡便なツールとして使用できる。
【０１３５】
本発明をその態様の解説によって説明し、その態様をかなり詳細に説明してきたが、いかなる方法においても、添付の特許請求の範囲がかかる詳細に限定されることを意図していない。さらなる利点および修飾が当業者に容易に理解される。したがって本発明は、そのより広い局面において、特定の詳細、代表的な系および方法、ならびに示し記載した実施例に限定されない。したがって、本発明の範囲または精神から離れることなく、かかる詳細から逸脱してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の表面ループを有するノロウイルス（ＮＯＲ）Ｐドメインモノマーおよび該少なくとも１個の表面ループに挿入されたタンパク質またはポリペプチド抗原を含む、抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項２】
少なくとも１個の表面ループが、ループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）およびループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の少なくとも１個を含む、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項３】
抗原がロタウイルス（ＲＶ）ＶＰ８抗原である、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項４】
タンパク質またはポリペプチド抗原が少なくとも２個の類似または異なる抗原を含む、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項５】
２４個のモノマーからなる抗原−Ｐ粒子であって、Ｐ粒子が少なくとも１個の請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー、および所望により１個以上の野生型ＮＯＲ Ｐドメインモノマーを含み、ここで、抗原−Ｐ粒子が抗原単独と比較して抗原の免疫原性を向上しうる、抗原−Ｐ粒子。
【請求項６】
少なくとも１個の表面ループを有するＮＯＲ Ｐドメインモノマーを含むＰドメインモノマーベクターであって、前記少なくとも１個の表面ループが少なくとも１個の制限部位の対を含む、Ｐドメインモノマーベクター。
【請求項７】
少なくとも１個の表面ループがループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）およびループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の少なくとも１個を含む、請求項６のＰドメインモノマーベクター。
【請求項８】
少なくとも１個の表面ループが、該少なくとも１個の表面ループの長さおよび露出を拡大するために、スペーサーを含む、請求項６のＰドメインモノマー。
【請求項９】
哺乳動物にウイルス性抗原に対する免疫保護を与える方法であって、ワクチンとして請求項５の抗原−Ｐ粒子を哺乳動物に投与する段階を含む、方法。
【請求項１０】
抗原がＲＶ ＶＰ８抗原であり、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラがロタウイルスおよびノロウイルス両方に対するデュアルワクチンとして作用する、請求項９の方法。
【請求項１１】
少なくとも１個の表面ループが３個のループであり、ＲＶ ＶＰ８のような大きな抗原がより小さな外来抗原を有する隣のループを、小さなエピトープの露出が困難となるように覆わないように、モノマーの３個のループに異なる抗原が複数挿入されている、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１２】
Ｐドメインモノマーの１個以上の表面ループにリガンドまたはシグナルペプチドの挿入が存在することによって、遠位表面の１個以上に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有する置換Ｐ粒子の自然発生的形成がもたらされる、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１３】
挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドによって、置換Ｐ粒子が特定の臓器または組織を標的として、それらの位置へと移動することが可能となる、請求項１２の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１４】
置換Ｐ粒子がＰドメインモノマーの１個以上の表面ループに挿入されたペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸）を有する、請求項１３の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１５】
置換Ｐ粒子モノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子が、薬物の担体として使用するために化学反応によって、表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されている薬物のコンジュゲートを有する、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１６】
形成される置換ＰモノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子が、表面ループの少なくとも１個に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチド、ならびに表面ループの少なくとも１個に挿入された薬物のコンジュゲートを有し、それによって疾患を有する特定の組織または臓器を標的とする薬物送達系を提供する、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１】
少なくとも１個の表面ループを有するノロウイルス（ＮＯＲ）Ｐドメインモノマーおよび該少なくとも１個の表面ループに挿入されたタンパク質またはポリペプチド抗原を含む、抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項２】
少なくとも１個の表面ループが、ループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）およびループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の少なくとも１個を含む、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項３】
抗原がロタウイルス（ＲＶ）ＶＰ８抗原である、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項４】
タンパク質またはポリペプチド抗原が少なくとも２個の類似または異なる抗原を含む、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項５】
２４個のモノマーからなる抗原−Ｐ粒子であって、Ｐ粒子が少なくとも１個の請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー、および所望により１個以上の野生型ＮＯＲ Ｐドメインモノマーを含み、ここで、抗原−Ｐ粒子が抗原単独と比較して抗原の免疫原性を向上しうる、抗原−Ｐ粒子。
【請求項６】
少なくとも１個の表面ループを有するＮＯＲ Ｐドメインモノマーを含むＰドメインモノマーベクターであって、前記少なくとも１個の表面ループが少なくとも１個の制限部位の対を含む、Ｐドメインモノマーベクター。
【請求項７】
少なくとも１個の表面ループがループ１（Ｉ２９３−Ｈ２９７）、ループ２（Ｔ３７１−Ｄ３７４）およびループ３（Ｄ３９１−Ｎ３９４）の少なくとも１個を含む、請求項６のＰドメインモノマーベクター。
【請求項８】
少なくとも１個の表面ループが、該少なくとも１個の表面ループの長さおよび露出を拡大するために、スペーサーを含む、請求項６のＰドメインモノマー。
【請求項９】
哺乳動物にウイルス性抗原に対する免疫保護を与える方法であって、ワクチンとして請求項５の抗原−Ｐ粒子を哺乳動物に投与する段階を含む、方法。
【請求項１０】
抗原がＲＶ ＶＰ８抗原であり、Ｐ粒子−ＶＰ８キメラがロタウイルスおよびノロウイルス両方に対するデュアルワクチンとして作用する、請求項９の方法。
【請求項１１】
少なくとも１個の表面ループが３個のループであり、ＲＶ ＶＰ８のような大きな抗原がより小さな外来抗原を有する隣のループを、小さなエピトープの露出が困難となるように覆わないように、モノマーの３個のループに異なる抗原が複数挿入されている、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１２】
Ｐドメインモノマーの１個以上の表面ループにリガンドまたはシグナルペプチドの挿入が存在することによって、遠位表面の１個以上に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドを有する置換Ｐ粒子の自然発生的形成がもたらされる、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１３】
挿入されたリガンドまたはシグナルペプチドによって、置換Ｐ粒子が特定の臓器または組織を標的として、それらの位置へと移動することが可能となる、請求項１２の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１４】
置換Ｐ粒子がＰドメインモノマーの１個以上の表面ループに挿入されたペプチドＣＮＧＲＣ（５アミノ酸）を有する、請求項１３の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１５】
置換Ｐ粒子モノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子が、薬物の担体として使用するために化学反応によって、表面露出リシンおよびシステインを介してＰ粒子のループに挿入されている薬物のコンジュゲートを有する、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【請求項１６】
形成される置換ＰモノマーならびにそのダイマーおよびＰ粒子が、表面ループの少なくとも１個に挿入されたリガンドまたはシグナルペプチド、ならびに表面ループの少なくとも１個に挿入された薬物のコンジュゲートを有し、それによって疾患を有する特定の組織または臓器を標的とする薬物送達系を提供する、請求項１の抗原−Ｐドメインモノマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５２９２９８（Ｐ２０１２−５２９２９８Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５１０９（Ｐ２０１２−５１５１０９）
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８００８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４６０２
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月９日（２０１０．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８００８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４４６０２
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５００４６９２３５）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター (40)
【Ｆターム（参考）】
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