抗原の順序付けられた分子提示、提示の方法、および使用
本発明は、順序付けられかつ反復性の抗原または抗原決定基アレイの生成のための組成物およびプロセスを提供する。本発明の組成物は、感染性疾患の予防、アレルギーの処置および癌の処置のためのワクチンの生成に有用である。本発明の種々の実施形態は、特異的相互作用の結果として、非常に順序付けられかつ反復性の様式において、任意の所望の抗原で被覆した、ウイルス、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、ファージ、またはそれらの組換え型形態を提供する。１つの特定の実施形態において、カセット型系（αＶａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に基づく多目的の新しい技術は、抗原で被覆したウイルス粒子の生成を可能にする。他の特定の実施形態は、抗原で被覆したＢ型肝炎ウイルス様粒子または抗原で被覆した麻疹ウイルス様粒子の生成を可能にする。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイを含む組成物を提供する。本発明はまた、順序付けられそして反復性のアレイにおいて抗原または抗原決定基を生成するためのプロセスを提供する。この順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基は、感染性疾患の処置、アレルギーの処置のためのワクチンの産生において、そして癌を予防または治療するための、および規定された自己特異的抗体を作製するためのファルマシン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）として有用である。
【０００２】
（関連技術）
感染性疾患の予防のためのワクチンの開発は、任意の医学的発明のヒトの健康に対して最大の影響を有した。１年あたり３００万人の死亡が、ワクチン接種によって世界中で予防されると見積もられている（Ｈｉｌｌｅｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：５０７（１９９８））。最も通常のワクチン接種ストラテジーである、弱毒化（すなわち、毒性が低い）病原体または近縁の生物の使用は、危険性がより低い牛痘ウイルスの投与によって天然痘に対してワクチン接種したＥｄｗａｒｄ Ｊｅｎｎｅｒによって１７９６年に最初に実証された。多数の生弱毒化ウイルス（例えば、麻疹、おたふくかぜ、風疹、水痘、アデノウイルス、ポリオ、インフルエンザ）および細菌（例えば、結核に対しての桿菌Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））がワクチン接種について好首尾に投与されているが、「ワクチン」生物、特に免疫無防備状態の個体により毒性および感染へと後転することに関連した重篤な合併症を発症する危険性が存在する。
【０００３】
弱毒化ウイルスの具体的設計は、欠失改変体または変異改変体の作製を介する組換えＤＮＡ技術（すなわち、遺伝子操作）によって現在可能にされている。例えば、ｎｅｆ遺伝子内に欠失を有する、操作されたサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の投与は、マカクがその後の病原性ＳＩＶ株での感染から保護されることを示した（Ｄａｎｉｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１９３８−１９４１（１９９２））。しかし、弱毒化ＳＩＶを投与した動物における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）様症状の進行は、安全性の懸念を生じる（Ｂａｂａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１８２０−１８２５（（１９９５））。
【０００４】
代替的なアプローチとして、弱毒化ウイルスまたは細菌が、弱毒化形態で投与するにはあまりにも危険すぎると考えられる病原体（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））の抗原コード遺伝子についてのキャリアとして用いられ得る。宿主への抗原コード遺伝子の送達の際に、この抗原は、インサイチュで合成される。ワクシニアおよび関連のアビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓｅ）は、種々の疾患についての前臨床研究および臨床研究において種々の遺伝子についてのこのようなキャリアとして用いられている（例えば、Ｓｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４４０（１９９１））。このワクチン接種ストラテジーの１つの欠点は、これがビリオンの表面を模倣しないことである。なぜなら、この組換え型タンパク質は、宿主細胞の表面で発現されるからである。さらに、合併症は、生命を脅かす播種性ワクシニア感染によって証明されたように、免疫無防備状態の個体において発症し得る（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３１６：６７３（（１９９８））。
【０００５】
第４のワクチン接種アプローチは、インビトロで増殖させた病原体（例えば、インフルエンザ血球凝集素またはノイラミニダーゼ）から精製されたかまたは単一のウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）の異種発現後に発現されたかのいずれかの、単離された病原体成分の使用を含む。例えば、組換え型の、変異した毒素（無毒化された）は、ジフテリア、破傷風、コレラおよび百日咳の毒素に対するワクチン接種のために用いられ（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第２版，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７）、そしてＨＩＶの組換え型タンパク質（ｇｐ１２０および全長ｇｐ１６０）を、ＨＩＶに対する中和抗体を誘導する手段として評価し、失望した結果となった（Ｃｏｎｎｏｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１５５２（１９９８））。近年、ＨＩＶ−１単離体に対するＣＴＬ応答を誘導し得、そしてＨＩＶ−１単離体に対する中和活性を有する惹起し得る、可溶性オリゴマーｇｐ１６０を用いて有望な結果が得られた（Ｖａｎ Ｃｏｒｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４３１９（１９９７））。さらに、抗原の公知のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが、Ｔ細胞の助けを刺激することによりエピトープの免疫原性を増加させるように設計されたキャリア分子に結合されている、ペプチドワクチンが用いられ得る。しかし、このアプローチに伴う１つの重大な問題は、このアプローチが、全体としてこのタンパク質に対して制限された免疫応答しか提供しないことである。さらに、ワクチンは、異なるＭＨＣハプロタイプについて個々に設計されなければならない。この型のワクチンについての最も深刻な懸念は、防御性抗ウイルス抗体が、ペプチドによって模倣され得ない、複雑な三次元構造を認識することである。
【０００６】
より新規のワクチン接種ストラテジーは、ＤＮＡワクチンの使用であり（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７（１９９７））、これは、（生ベクターを使用することなく）ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を生じ得る。これは、同じウイルスの多くの株に不変の保存された内部タンパク質由来のエピトープを標的化することにより、異なる株のウイルスに対する、より広範な防御を提供し得る。この抗原は、哺乳動物の翻訳後修飾、コンホメーションおよびオリゴマー形成を有して生成されるので、組換え型または化学的に改変されたタンパク質よりも、ウイルス感染によって生成される野生型タンパク質に類似するかまたは同一である可能性がより高い。しかし、この区別は、細菌抗原の適用については欠点となり得る。なぜなら、非ネイティブ翻訳後修飾が、減少した免疫原性を生じ得るからである。さらに、ウイルス表面タンパク質は、マトリックスタンパク質の非存在下において高度に組織化されない。
【０００７】
感染性疾患の予防のための適用に加えて、ワクチン技術は、アレルギーと関連した免疫の問題と取り組むために現在利用される。アレルギー個体では、ＩｇＥアイソタイプの抗体は、特定の抗原（アレルゲン）に向けての不適切な体液性免疫応答において生成される。アレルギー免疫治療によるアレルギーの処置は、３〜５年までの期間にわたる、連続して漸増する用量の特定のアレルゲンの毎週の投与を必要とする。おそらく、脂肪細胞上のＩｇＥ抗体と反応する前に、鼻分泌物または呼吸分泌物中または膜中のアレルゲンを遮断する、「ブロッキング」ＩｇＧ抗体が生成される。しかし、ＩｇＧ力価と症状の軽減との間に一定の関係は存在しない。おそらく、これは、極めて時間がかかりかつコストのかかるプロセスであり、長期にわたって重篤な症状を有する患者について毎年でしか考えられない。
【０００８】
精製されたタンパク質の単独投与は、強力な免疫応答を惹起するに通常充分でないことが充分に確立されている；単離された抗原は一般に、アジュバントと呼ばれるヘルパー物質と一緒に与えられねばならない。これらのアジュバント内では、投与された抗原は、迅速な分解から保護され、そしてアジュバントは、低レベルの抗原の長期の放出を提供する。
【０００９】
単離されたタンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けを伴って、または伴わずにの両方で、任意のアジュバントの非存在下で迅速かつ効率的な免疫応答を誘導する（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウイルスはしばしばほんの少数のタンパク質からなっているが、これらは、単離された成分よりもずっと強力な免疫応答を誘発し得る。Ｂ細胞応答に関しては、ウイルスの免疫原性についての１つの重大な因子が、表面エピトープの反復性および順番であることが公知である。多くのウイルスは、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンを効率的に架橋するエピトープの規則的アレイを提示する準結晶表面を示す（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３−５５８（１９９６））。Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期進行およびＩｇＭ抗体の生成を直接誘導する、強力な活性化シグナルである。さらに、このような誘発されたＢ細胞は、Ｔヘルパー細胞を活性化し得、これは次にＢ細胞におけるＩｇＭ抗体生成からＩｇＧ抗体生成へのスイッチおよび長期に生存するＢ細胞記憶の生成を誘導する（任意のワクチン接種の目的）（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウイルスの構造は、自己免疫疾患における抗抗体の生成に均一に結びつけられ、そして病原体に対する自然な応答の一部である（Ｆｅｈｒ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８５：１７８５−１７９２（１９９７）を参照のこと）。従って、順序付けられかつ反復性のアレイにおいて組織化されたウイルス粒子上の抗原は、非常に免疫原性である。なぜなら、これらは、Ｂ細胞を直接活性化し得るからである。
【００１０】
強力なＢ細胞応答に加えて、ウイルス粒子はまた、免疫系の別の重要なアームである、細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成を誘導し得る。これらの細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＩＶまたはＢ型肝炎ウイルスのような非細胞変性性ウイルスの除去のために、および腫瘍の根絶のために特に重要である。細胞傷害性Ｔ細胞は、ネイティブな抗原を認識しないが、むしろ、ＭＨＣクラスＩ分子と会合したそれらの分解産物を認識する（ＴｏｗｎｓｅｎｄおよびＢｏｄｍｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１−６２４（１９８９））。マクロファージおよび樹状細胞は、内因性ウイルス粒子を取り込み得、そしてプロセシングし得（しかし、それらの可溶性の単離された成分はそうでない）、そして生成された分解産物を細胞傷害性Ｔ細胞に対して提示し得、それらの活性化および増殖をもたらす（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３）；Ｂａｃｈｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２５９５−２６００（１９９６））。
【００１１】
抗原としてのウイルス粒子は、それらの単離された成分に対して２つの利点を示す：（１）それらの高度の反復表面構造に起因して、これらは、Ｂ細胞を直接活性化し得、高い抗体力価および長期に永続するＢ細胞記憶をもたらす；および（２）ウイルスが非感染性であり、そしてアジュバントが存在しなくとも、ウイルス粒子は細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し得るが、可溶性タンパク質は誘導し得ない。
【００１２】
いくつかの新たなワクチンストラテジーは、ウイルスの固有の免疫原性を利用する。これらのアプローチのうちのいくつかは、ウイルス粒子の粒子状の性質に焦点を当てる；例えば、ラテックスビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．およびＳｏｎｇ，Ｒ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４９２５（１９９４））；酸化鉄ビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３））；抗原で被覆したコア粒子を開示する、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ，Ｎ．らに対する米国特許第５，３３４，３９４号；表面に共有結合した１以上のタンパク質を表面に保有する合成ポリマー粒子を開示する、米国特許第５，８７１，７４７号；ならびにコア粒子の表面を少なくとも部分的に被覆する非共有結合した被覆および被覆したコア粒子と接触している少なくとも１つの生物学的活性剤を有するコア粒子（例えば、ＷＯ／９４／１５５８５を参照のこと）を参照のこと。
【００１３】
しかし、これらのウイルス模倣システムの欠点は、ウイルス表面に見出される、順序付けられた抗原提示を回復できないことである。ランダムな方向で表面に結合された抗原は、ＣＴＬ応答を誘導し、Ｂ細胞応答を全く誘導しないかまたは弱くしか誘導しないことが見出されている。効果的なワクチンについては、上記およびＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５（１９９７）に記載されるように、免疫系の両方のアームが強力に活性化されなければならない。
【００１４】
別の例では、組換えウイルスは、抗原送達のために利用される。カプシドタンパク質に融合された抗原を含む糸状ファージウイルスは、非常に免疫原性であることが見出された（Ｐｅｒｈａｍ Ｒ．Ｎ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７：２５−３１（１９９５）；Ｗｉｌｌｉｓら，Ｇｅｎｅ １２８：８５−８８（１９９３）；Ｍｉｎｅｎｋｏｖａら，Ｇｅｎｅ １２８：８５−８８（１９９３）を参照のこと）。しかし、この系は、融合タンパク質が高レベルで発現される場合（Ｉａｎｎｏｌｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：８３５−８４４（１９９５））に非常に小さなペプチド（５または６アミノ酸残基）に制限されるか、またはより大きなタンパク質の低レベルの発現に制限される（ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４３１８−４３２２（１９８８））。低分子ペプチドについては、これまでＣＴＬ応答しか観察されておらず、そしてＢ細胞応答は観察されていないかまたは弱くしか観察されていない。
【００１５】
なお別の系では、組換えアルファウイルスは、抗原送達の手段として提唱される（米国特許第５，７６６，６０２号；同第５，７９２，４６２号；同第５，７３９，０２６号；同第５，７８９，２４５号および同第５，８１４，４８２号を参照のこと）。これまでに記載された組換えウイルス系に伴う問題としては、ウイルス表面上での異種タンパク質の低密度発現および／または異なる適用のために新規でかつ異なる組換えウイルスを好首尾にかつ反復して作製することの困難性が挙げられる。
【００１６】
さらなる開発では、ワクチン生成の領域においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が利用される。なぜなら、それらの構造特性および非感染性性質の両方のためである。ＶＬＰは、対称様式で、１以上の型の多くのタンパク質分子から構築されたスーパー分子（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）構造である。これらはウイルスゲノムを欠き、それゆえ、非感染性である。ＶＬＰはしばしば、異種発現によって大量に生成され得、そして容易に精製され得る。
【００１７】
ＶＬＰの例としては、以下のウイルスのカプシドタンパク質が挙げられる：Ｂ型肝炎ウイルス（Ｕｌｒｉｃｈら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５０：１４１−１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（Ｗａｒｎｅｓら，Ｇｅｎｅ １６０：１７３−１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および同第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１６０３−１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１５８０−１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６−１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９６／３０５２３号）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ ９２／１１２９１）およびヒトパピローマウイルス（ＷＯ ９８／１５６３１）。いくつかの例では、組換え型ＤＮＡ技術は、ＶＬＰタンパク質に対して異種タンパク質を融合するために利用され得る（Ｋｒａｔｚ，Ｐ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１９１５１９２０（１９９９））。
【００１８】
従って、当該分野において、天然の病原体と同等に効率的な、強力なＣＴＬおよびＢ細胞免疫応答を促進する、新規でかつ改善されたワクチンの開発についての必要性が存在する。
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、任意の所望の抗原で被覆された粒子の産生が可能な、新たな融通が利く技術を提供する。この技術は、感染性疾患に対して高度に効果的なワクチンの作製ならびにアレルギーおよび癌の処置のためのワクチンの作製を可能にする。
【００２０】
第１の実施形態において、本発明は、以下を含む新規な化合物を提供する：（Ａ）非天然の分子足場、および（Ｂ）抗原または抗原決定基。
【００２１】
非天然の分子足場は、以下を含む：（ｉ）（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される、コア粒子；ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの第１付着部位を含む形成体であって、少なくとも１つの共有結合によって上記のコア粒子に連結されている、形成体。
【００２２】
抗原または抗原決定基は、少なくとも１つの第２付着部位を有し、この部位は、以下からなる群より選択される：（ｉ）その抗原または抗原決定基とともには天然に存在しない、付着部位；および（ｉｉ）その抗原または抗原決定とともに天然に存在する、付着部位。
【００２３】
本発明は、少なくとも１つの非ペプチド結合による第１付着部位への第２付着部位の結合を介する順序づけられかつ反復性の抗原アレイを提供する。従って、抗原または抗原決定基と非天然の分子足場は、第１付着部位および第２付着部位のこの結合を通じて一緒にされて、順序づけられかつ反復性の抗原アレイを形成する。
【００２４】
別の実施形態において、前述の組成物のコア粒子は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、ウイルスキャプシド粒子、またはそれらからの組換え体を含む。あるいは、このコア粒子は、合成ポリマーまたは金属であり得る。
【００２５】
特定の実施形態において、形成体は、少なくとも１つの第１付着部位を含み得る。第１付着部位および第２付着部位は、本発明の組成物の特に重要なエレメントである。本発明の種々の実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下であり得る：抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；ビオチンおよびアビジン；ストレプトアビジンおよびビオチン；レセプターおよびそのリガンド；リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；アミノ基およびそれに反応する化学基；カルボキシル基およびそれに反応する化学基；スルフヒドリル基およびそれに反応する化学基；またはこれらの組み合わせ。
【００２６】
より好ましい実施形態において、本発明は、選択されたほとんどの任意の抗原の、ウイルス、バクテリオファージ、ウイルス様粒子またはウイルスキャプシド粒子の表面への結合を提供する、抗原を準結晶（ｑｕａｓｉ−ｃｒｙｓｔａｌｌｎｅ）「ウイルス様」構造にすることによって、本発明は、提示された抗原に対する高度に有効な免疫応答の産生（すなわち、ワクチン接種）のための宿主の強力な抗ウイルス免疫反応を開発する。
【００２７】
１つの好ましい実施形態において、コア粒子は、以下からなる群より選択され得る：ロタウイルスの組換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ）ウイルスの組換えタンパク質、およびヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、抗原は、以下からなる群より選択され得る：（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；（２）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；および（４）家畜における免疫応答を誘導するに適したタンパク質。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む。最も好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下からなる群より選択される：（１）ＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメイン；および（２）ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメイン。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下からなる群より選択される：（１）遺伝子操作されたリジン残基、および（２）遺伝子操作されたシステイン残基。これらの２つの残基は、ともに化学的に連結され得る。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、本発明の組成物の産生のためのプロセス、およびこの組成物を使用する医療処置の方法を含む。
【００３２】
前述の一般的な記載および以下の詳細な説明の両方は、模範的および説明的であるのみであること、そして特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図されることが、理解されるべきである。
【００３３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（１．定義）
以下の定義は、本発明者らが本発明であること考慮する主題を明確にするために提供される。
【００３４】
（アルファウイルス）：本明細書中で使用される場合、用語「アルファウイルス」とは、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属内に含まれる任意のＲＮＡウイルスをいう。この属のメンバーの記載は、ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２（１９９４）に含まれる。アルファウイルスの例としては、以下があげられる：アウラウイルス、ベバルウイルス、キャバッソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルスクイジラガッハウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス、ミッデルブルグウイルス、ムカンボウイルス、ヌヅムウイルス、ピクスナウイルス、トネートウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トリニティウイルス、ユナウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロワウイルス、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ），およびロスリバーウイルス。
【００３５】
（抗原）：本明細書中で使用される場合、用語「抗原」とは、抗体によって結合され得る分子である。抗原は、さらに、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導して、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の産生をもたらし得る。抗原は、１以上のエピトープ（ＢエピトープおよびＴエピトープ）を有し得る。上記に言及される特定の反応は、抗原が、高度に選択的な様式で、その対応する抗体とは反応するが、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことが意味される。
【００３６】
（抗原決定基）：本明細書中で使用される場合、用語「抗原決定基」とは、Ｂリンパ球またはＴリンパ球のいずれかによって特異的に認識される抗原の部分をいうことが意味される。Ｂリンパ球は抗体産生を介して外来抗原決定基に応答するのに対し、Ｔリンパ球は、細胞性免疫のメディエータである。従って、抗原決定基またはエピトープは、抗体によって、またはＭＨＣの文脈においてはＴ細胞レセプターによって認識される抗原の部分である。
【００３７】
（結合）：本明細書中で使用される場合、第１付着部位および第２付着部位に適用されるような用語「結合」とは、少なくとも１つの非ペプチド結合をいうために使用される。結合の性質は、共有、イオン性、疎水性、極性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３８】
（付着部位、第１）：本明細書中で使用される場合、句「第１付着部位」とは、非ランダム様式でコア粒子にそれ自体が結合された「形成体」のエレメントをいい、この部位に、抗原または抗原決定基に位置する第２付着部位が結合し得る。第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学的に反応な基であり得る。複数の第１付着部位が、反復性の立体配置にて、非天然の分子足場の表面に存在する。
【００３９】
（付着部位、第２）：本明細書中で使用される場合、句「第２付着部位」とは、非天然分子足場の表面上に位置する「形成体」の第１付着部位が結合し得る抗原または抗原決定基と結合したエレメントをいう。抗原または抗原決定基の第２着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学的に反応な基であり得る。少なくとも１つの第２付着部位が、抗原または抗原決定基に存在する。
【００４０】
（コア粒子）：本明細書中で使用される場合、用語「コア粒子」とは、「形成体」の付着のための基礎を提供する固有の反復性較正を有する剛性構造をいう。本明細書中で使用されるようなコア粒子は、合成プロセスの産物であってもよいし、生物学的プロセスの産物であってもよい。
【００４１】
（シス作用性）：本明細書中で使用される場合、句「シス作用性」配列とは、レプリカーゼが結合してＲＮＡ分子のＲＮＡ依存性複製を触媒する、核酸配列をいう。これらの複製事象は、全長ＲＮＡ分子および部分ＲＮＡ分子の複製を生じ、従って、アルファウイルスサブゲノムプロモーターはまた、「シス作用性」配列である。シス作用性配列は、核酸分子の５’末端、３’末端またはその両末端に位置しての、またはその付近に位置しても、そして内部に位置してもよい。
【００４２】
（融合）：本明細書中で使用される場合、用語「融合」とは、それらのコードヌクレオチド配列のインフレームの組み合わせによる１つのポリペプチド鎖における異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせをいう。用語「融合」は、その末端の１つへの融合に加えて、内部融合（すなわち、ポリペプチド鎖内での異なる起源の配列の挿入）を明示的に包含する。
【００４３】
（異種配列）：本明細書中で使用される場合、用語「異種配列」とは、本発明のベクターに存在する第２のヌクレオチド配列をいう。用語「異種配列」とはまた、本発明のベクターに含まれる異種ＤＮＡ配列によってコードされる任意のアミノ酸配列またはＲＮＡ配列をいう。異種ヌクレオチド配列は、それらが存在する細胞型において通常発現されるタンパク質またはＲＮＡ分子あるいは、その細胞壁では通常発現されない分子（例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【００４４】
（単離された）：本明細書中で使用される場合、用語「単離された（されている）」が分子を参照して使用される場合、この用語は、その分子がそのネイティブ環境から取り除かれたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」。さらに、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されるとみなされる。単離されたＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ複製産物を含む。単離された核酸分子はさらに、合成的に産生された分子を含む。さらに、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子もまた、単離されている。従って、全ての「単離された」分子が「精製されている」必要があるとは限らない。
【００４５】
（免疫治療剤）：本明細書中で使用される場合、用語「免疫治療剤」とは、疾患または障害の処置のための組成物である。より詳細には、この用語は、アレルギーの処置の方法または癌の処置の方法をいうために使用される。
【００４６】
（個体）：本明細書中で使用される場合、用語「個体」とは、多細胞生物をいい、そして植物および動物の両方を含む。好ましい多細胞生物は動物であり、より好ましくは脊椎動物であり、さらにより好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００４７】
（低いまたは検出不可能）：本明細書中で使用される場合、句「低いまたは検出不可能」とは、遺伝子の発現レベルに関して使用される場合、遺伝子が最大に誘導されるときに見られるより有意に低い（例えば、少なくとも５分の１）か、または以下の実施例の節で使用される方法によって容易には検出可能ではないかのいずれかである、発現のレベルをいう。
【００４８】
レクチン：本明細書中で使用される場合、マメ科植物の種から特に得られるが、多くの他の植物供給源および動物供給源からもまた得られる、タンパク質であり、特定の単糖またはオリゴ糖への結合部位を有する。例としては、コンカナバリンＡおよびコムギ胚芽凝集素が挙げられ、これらは、糖タンパク質の研究において、分析薬剤および調製薬剤として広く使用される。
【００４９】
天然起源：本明細書中で使用される場合、用語「天然起源」とは、その全体または一部が、合成的ではなく、そして天然に存在するかまたは天然にて生成されることを、意味する。
【００５０】
非天然：本明細書中で使用される場合、この用語は、一般的には、天然由来でないことを意味し、より詳細には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
【００５１】
非天然起源：本明細書中で使用される場合、用語「非天然起源」は、一般的には、合成的であることまたは天然由来でないことを意味し、より詳細には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
【００５２】
非天然の分子足場：本明細書中で使用される場合、句「非天然の分子足場」とは、第１の付着部位の固定した反復性のアレイを提供するように役立ち得る、ヒトの手によって作製された任意の産物をいう。必ずではないが理想的には、これらの第１の付着部位は、幾何学的順序になっている。この非天然の分子足場は、有機物であっても非有機物であってもよく、そして部分的にかまたは全体として、化学的に合成されても生物学的プロセスを介して合成されてもよい。この非天然の分子足場は、以下から構成される：（ａ）コア粒子（天然起源または非天然起源のいずれかである）；および（ｂ）形成体（それ自体が、少なくとも１つの第１の付着部位を含み、そして少なくとも１つの共有結合によってコア粒子に結合している）。特定の実施形態において、この非天然の分子足場は、ウイルスでも、ウイルス様粒子でも、ウイルスキャプシド粒子でも、ファージでも、その組換え形態でも、または合成ペプチドであってもよい。
【００５３】
順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイ：本明細書中で使用される場合、用語「順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイ」とは、一般的には、抗原または抗原決定基の反復性パターンをいい、足場に関して、その抗原または抗原決定基の均一な空間配置によって特徴付けられる。本発明の１つの実施形態において、この反復性パターンは、幾何学的パターンであり得る。理想の順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイは、５〜１５ナノメーターの間隔で、抗原または抗原決定基の厳密に反復性の準結晶性の序列を保有する。
【００５４】
形成体：本明細書中で使用される場合、用語「形成体」とは、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを作製するための核生成部位を提供する、ランダムでない様式でコア粒子に結合したエレメントをいうために使用される。形成体は、少なくとも１つの共有結合によりコア粒子に結合した、少なくとも１つの第１の付着部位を含む、任意のエレメントである。形成体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、タンパク質の残基、ポリペプチドの残基、またはペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーまたは合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、あるいはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学反応基であり得る。
【００５５】
許容温度：本明細書中で使用される場合、句「許容温度」とは、酵素が、比較的高レベルの触媒活性を有する温度をいう。
【００５６】
精製された：本明細書中で使用される場合、用語「精製（された）」が分子に関して使用される場合、この用語は、精製される分子の濃度が、その分子の天然の環境中にてその分子と結合している分子と比較して、増加したことを意味する。天然に結合した分子とは、タンパク質、核酸、脂質および糖を含むが、一般的には、精製される分子の完全性を維持するためまたは精製を容易にするために添加された、水、緩衝液、および試薬を含まない。例えば、ｍＲＮＡが、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーの間に水性溶媒で希釈されるとしても、天然に結合した核酸および他の生物学的分子がカラムに結合せず、そして対象ＲＮＡ分子から分離している場合は、ｍＲＮＡ分子は、このクロマトグラフィーにより精製される。
【００５７】
レセプター：本明細書中で使用される場合、用語「レセプター」とは、別の分子（リガンドと呼ばれる）と相互作用し得る、タンパク質または糖タンパク質、あるいはそれらのフラグメントをいう。このリガンドは、どの種類の生化学的化合物または化学的化合物にも属し得る。このレセプターは、必ずしも、膜結合タンパク質であることを必要とはしない。可溶性タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質またはレチノール結合タンパク質のようなもの）は、同様にレセプターである。
【００５８】
残基：本明細書中で使用される場合、用語「残基」とは、ポリペプチド骨格または側鎖における、特定のアミノ酸を意味することが、意味される。
【００５９】
温度感受性：本明細書中で使用される場合、句「温度感受性」とは、１つの温度で反応を容易に触媒するが、別の温度では、同じ反応を遅く触媒するか、または全く触媒しない、酵素をいう。温度感受性酵素の例は、ｐＣＹＴｔｓベクターによりコードされるレプリカ−ゼタンパク質であり、これは、３４℃より下の温度にて、容易に検出可能なレプリカ−ゼ活性を有し、そして３７℃にて、低い活性または検出不能な活性を有する。
【００６０】
転写：本明細書中で使用される場合、用語「転写」とは、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ分子の生成をいう。
【００６１】
組換え宿主細胞：本明細書中で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」とは、本発明の１つ以上の核酸分子が導入された、宿主細胞をいう。
【００６２】
組換えウイルス：本明細書中で使用される場合、句「組換えウイルス」とは、ヒトの手によって遺伝子改変されたウイルスをいう。この句は、当該分野で公知の任意のウイルスを包含する。より詳細には、この句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたアルファウイルスをいい、そして最も詳細には、この句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたシンドビス（Ｓｉｎｂｉｓ）ウイルスをいう。
【００６３】
制限温度：本明細書中で使用される場合、句「制限温度」とは、酵素が、低いレベルまたは検出不能なレベルの触媒活性を有する温度をいう。「熱さ」感受性変異体および「冷たさ」感受性変異体の両方が公知であり、従って、制限温度は、許容温度より高くても低くてもよい。
【００６４】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象：本明細書中で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象」とは、ＲＮＡ分子をテンプレートとして使用して、ＲＮＡ分子の形成を生じる、プロセスをいう。
【００６５】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ：本明細書中で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、別のＲＮＡ分子からのＲＮＡ分子の生成を触媒する、ポリメラーゼをいう。この用語は、本明細書中において、用語「レプリカ−ゼ」と同義に使用される。
【００６６】
非翻訳ＲＮＡ：本明細書中で使用される場合、句「非翻訳ＲＮＡ」とは、オープンリーディングフレームをコードしないか、またはオープンリーディングフレームまたはその一部をコードするが、アミノ酸配列が生成しない様式（例えば、開始コドンが存在しない）でコードする、ＲＮＡ配列またはＲＮＡ分子をいう。このような分子の例は、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボソームである。
【００６７】
ベクター：本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、宿主細胞に遺伝子物質を伝達するために使用される因子（例えば、プラスミドまたはウイルス）をいう。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成され得る。
【００６８】
１つの、ａ、またはａｎ：用語「１つの」、「ａ」、または「ａｎ」が、本開示にて使用される場合、これらは、他のように示さない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００６９】
（２．順序付けられそして反復性の抗原または抗原性決定基のアレイの組成物、およびこれを作製するための方法）
開示された発明は、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基を含む、組成物を提供する。さらに、本発明は、実施者が、種々の処置目的のために、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイを構築することを簡便に可能にする。この目的としては、感染性疾患の予防、アレルギーの処置および癌の処置が挙げられる。
【００７０】
本発明の組成物は、本質的に以下２つの要素を含む：（１）非天然の分子足場；および（２）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、この第２の付着部位は、少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、第１の付着部位に結合し得る。
【００７１】
この非天然の分子足場は、（ａ）コア粒子（（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される）；ならびに（ｂ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む、形成体（この形成体は、少なくとも１つの共有結合によってこのコア粒子に結合している）を含む。
【００７２】
この抗原または抗原決定基は、（ａ）この抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位；および（ｂ）この抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位、からなる群より選択される、少なくとも１つの第２の付着部位を有する。
【００７３】
本発明は、少なくとも１つの非ペプチド結合によって第１の付着部位に第２の付着部位が結合することを介して、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを提供する。従って、この抗原または抗原決定基と非天然の分子足場とは、第１の付着部位と第２の付着部位とのこの結合を介して結合されて、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを形成する。
【００７４】
実施者は、この抗原または抗原決定基および第２の付着部位を、非天然の分子足場に結合した抗原または抗原決定基すべての配列が均一であるように、特に設計し得る。例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端に抗原または抗原決定基上の単一の第２の付着部位を配置し得、それにより、設計を介してその非天然の分子足場に結合した抗原または抗原決定基の分子すべてが均一な様式で位置することを確実にし得る。従って、本発明は、任意の抗原または抗原決定基を、規定された順序および反復性にて、非天然の分子足場上に配置する、簡便な手段を提供する。
【００７５】
当業者に明らかであるように、本発明の特定の実施形態は、組換え核酸技術（例えば、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核生物細胞および真核生物細胞中での組換えタンパク質の発現など）の使用を含む。このような方法論は、当業者に周知であり、そして刊行された実験室方法マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ，Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））において、簡単に見出され得る。組織培養細胞株（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））および抗体に基づく技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））を用いて作業するための基本的実験室技術もまた、この文献に十分に記載されており、これらすべてが、本明細書中で参考として援用される。
【００７６】
（Ａ．非天然の分子足場の構築）
本発明の組成物中の１つの要素は、コア粒子および形成体を含む、非天然の分子足場である。本明細書中で使用される場合、句「非天然の分子足場」とは、第１の付着部位の堅固かつ反復性のアレイを提供するように役立ち得る、ヒトの手によって作製された任意の産物をいう。より詳細には、この非天然の分子足場は、（ａ）コア粒子（（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される）；ならびに（ｂ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む、形成体（この形成体は、少なくとも１つの共有結合によって、このコア粒子と結合している）を含む。
【００７７】
当業者に容易に明らかであるように、本発明の非天然の分子足場のコア粒子は、いかなる特定の形態にも限定されない。このコア粒子は、有機物であっても非有機物であってもよく、そして化学合成されてもよいし、生物プロセスを介して合成されてもよい。
【００７８】
１つの実施形態において、非天然のコア粒子は、合成ポリマーであっても、脂質ミセルであっても、金属であってもよい。このようなコア粒子は、当該分野で公知であり、本発明の新規な、非天然の分子足場を構築するための基礎を提供する。例として、合成ポリマーまたは金属コア粒子は、米国特許第５，７７０，３８０号に記載される。この特許は、「抗体模倣物」の作製において複数のペプチドループが結合される、カリクスアーレン有機足場の使用を開示する。そして米国特許第５，３３４，３９４号は、ウイルスデコイとして使用される、ナノ結晶粒子を記載し、この粒子は、金属またはセラミックを含む、広範な種類の無機材料から構成される。この実施形態において好ましい金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、プラチナが挙げられる。この実施形態において好ましいセラミック材料としては、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズが挙げられる。この実施形態のコア粒子は、炭素（ダイヤモンド）を含む有機材料から作製され得る。好ましいポリマーとしては、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースが、挙げられる。この型のナノ結晶粒子について、酸化スズ、酸化チタンまたは炭素（ダイヤモンド）から作製された粒子が、特に好ましい。脂質ミセルは、当該分野で公知の任意の手段によって、調製され得る。例えば、ミセルは、以下の手順に従って調製され得る：ＢａｉｓｅｌｌｅおよびＭｉｌｌａｒ（Ｂａｉｓｅｌｌｅ，Ｃ．Ｊ．およびＭｉｌｌａｒ，Ｄ．Ｂ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４：３５５〜３６１（１９７５））またはＣｏｒｔｉら（Ｃｏｒｔｉ，Ｍ．、Ｄｅｇｒｉｏｒｇｉｏ，Ｖ．、Ｓｏｎｎｉｎｏ，Ｓ．、Ｇｈｉｄｏｎｉ Ｒ．、Ｍａｓｓｅｒｉｎｉ，Ｍ．およびＴｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ．、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ３８：１９７〜２１４（１９８１））またはＬｏｐｅｚら（Ｌｏｐｅｚ，Ｏ．、ｄｅ ｌａ Ｍａｚａ，Ａ．、Ｃｏｄｅｒｃｈ，Ｌ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｃ．、Ｗｅｈｒｌｉ，Ｅ．およびＰａｒｒａ，Ｊ．Ｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：３１４〜３１８（１９９８））またはＴｏｐｃｈｉｅｖａおよびＫａｒｅｚｉｎ（Ｔｏｐｃｈｉｅｖａ，Ｉ．およびＫａｒａｅｚｉｎ，Ｋ．、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．２１３：２９〜３５（１９９９））またはＭｏｒｅｉｎら（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．、Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｂ．、Ｈｏｇｌｕｎｄ，Ｓ．、Ｄａｌｓｇａａｒｄ Ｋ．およびＯｓｔｅｒｂａｕｓ，Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０８：４５７〜６０（１９８４））；これらはすべて、本明細書中で参考として援用される）。
【００７９】
コア粒子はまた、生物学的プロセス（これは、天然であってもよいし、または非天然であってもよい）を通じて生成され得る。例の目的で、この型の実施形態としてはコア粒子（ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスカプシド粒子、またはそれらの組換え形態を含む）が挙げられ得る。より詳細な実施形態において、このコア粒子としては、ロタウイルスの組換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ Ｖｉｒｕｓ）の組換えタンパク質およびヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質が挙げられ得る。
【００８０】
天然であろうと非天然であろうと、本発明のコア粒子は、少なくとも１つの共有結合により天然または非天然のコア粒子に付着される形成体を含むことによって、特徴付けられる。この形成体は、順序付けられそして反復性の抗原アレイを作製するための核形成部位を提供する、ランダムでない様式でコア粒子に結合したエレメントである。理想的には（必要ではないが）、この形成体は、幾何学的順序でコア粒子と会合される。最小には、この形成体は、第１の付着部位を含む。
【００８１】
先に述べたように、この形成体は、少なくとも１つの共有結合によってコア粒子に結合した、少なくとも１つの第１の付着部位を含む、任意のエレメントであり得る。形成体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、タンパク質の残基、ポリペプチドの残基またはペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーまたは合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、あるいはそれらの組合せ、あるいはそれらの化学反応基であり得る。より詳細な実施形態において、この形成体としては、抗原、抗体または抗体フラグメント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用するロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に反応する化学基：カルボキシル基、カルボキシル基に反応する化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に反応する化学基、あるいはそれらの組合せが挙げられ得る。
【００８２】
好ましい実施形態において、非天然の分子足場のコア粒子としては、ウイルス、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、またはそれらの組換え形態が挙げられる。順序付けられそして反復性の被覆および／またはコアタンパク質構造を有する、当該分野で公知の任意のウイルスは、本発明の非天然の分子足場として選択され得る；適切なウイルスの例としては、以下が挙げられる：シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルス；水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス；ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、Ｂａｃｈｍａｎ，Ｍ．Ｆ．およびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３−５５８（１９９６）の表１を参照のこと）。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明は、ウイルスの遺伝的操作を利用して、順序付けられそして反復性のウイルスエンベロープタンパク質と形成体（異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基または選り抜きの反応性アミノ酸残基を含む）との間の融合物を作製する。当業者に公知の他の遺伝的操作は、非天然の分子足場の構築に含まれ得る；例えば、遺伝的変異によって組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましくあり得る。形成体（すなわち、第１の付着部位）タンパク質への融合のために選択されるウイルスタンパク質は、形成されそして反復性の構造、より好ましくは、このウイルスの表面上に５〜１５ｎｍの間隔を最適に有する、準結晶組織化を有するべきである。この型の融合タンパク質の作製は、このウイルスの表面上に、複数の、順序付けられそして反復性の形成体を生じる。従って、それにより生じる第１の付着部位の、順序付けられそして反復性の組織化は、ネイティブウイルスタンパク質の正常な組織化を反映する。
【００８４】
本明細書中でより詳細に議論されるように、本発明の好ましい実施形態において、この足場は、組換えアルファウイルス、そしてより詳細には、組換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、感染した細胞の細胞質において、およびＤＮＡ中間体を有さずに、それらのゲノムＲＮＡ全体を複製する、＋鎖ＲＮＡである（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルスファミリーのいくつかのメンバー（シンドビス（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８−２２（１９９３））、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．およびＧａｒｏｆｆ．Ｈ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６−１３６１（１９９１））およびその他（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：１８９−２０４（１９８９）））は、種々の異なるタンパク質についてのウイルスに基づく発現ベクターとして（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８−５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５−５００（１９９４））、およびワクチン開発の候補物としての使用に、かなりの注目を受けた。最近、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためのアルファウイルスの使用に関して、多くの特許が発行されている（米国特許第５，７６６，６０２号；同第５，７９２，４６２号；同第５，７３９，０２６号；同第５；７８９，２４５号および同第５，８１４，４８２号を参照のこと）。本発明のアルファウイルス足場の構築は、前述の文献（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に公知の手段によって行われ得る。
【００８５】
種々の異なる組換え宿主細胞を利用して、抗原または抗原決定付着についてのウイルスに基づくコア粒子を生成し得る。例えば、アルファウイルスは、広範な宿主範囲を有することが公知である；シンドビスウイルスは、培養された哺乳動物細胞、爬虫類細胞および両生類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３５：３３５（１９７７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．ｉｎ ＴＨＥ ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８０），５８３−６２１頁）。従って、多くの組換え宿主細胞は、本発明の実施において使用され得る。ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞は、異種タンパク質の生成のために特に適切である。なぜなら、これらは、ヒト細胞に類似の様式でグリコシル化異種タンパク質における可能性を有し（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：２２７，（１９９４））、そして選択され（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３８９（１９９５））、または遺伝的に操作されて（Ｒｅｎｎｅｒ Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４．４７６（１９９５）；Ｌｅｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、無血清培地中ならびに懸濁液中で増殖され得るからである。
【００８６】
ポリヌクレオチドベクターの宿主細胞中への導入は、標準的な研究室マニュアルに記載される方法によって果たされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），第９章；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７），第１６章を参照のこと）。この方法としては、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染のような方法が挙げられる。外因性ＤＮＡ配列の宿主細胞への導入のための方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号において議論される。
【００８７】
パッケージされたＲＮＡ配列はまた、宿主細胞を感染するために使用され得る。これらのパッケージされたＲＮＡ配列は、それらを培養培地に添加することによって宿主細胞に導入され得る。例えば、非感染アルファウイルス粒子の調製は、多くの出典（「Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｃ，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ７５０−１）を含む）において記載される。
【００８８】
哺乳動物細胞が、ウイルスに基づくコア粒子の生成のための組換え宿主細胞として使用される場合、これらの細胞は、一般に、組織培養中で増殖される。培養中で細胞を増殖するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．，ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照のこと）。
【００８９】
当業者によって理解されるように、第１の付着部位は、任意の適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝物、またはそれらの組合せであり得るか、あるいはそれらの一部であり得る。これらは、足場に対する選り抜きの抗原または抗原決定基を特異的に付着するように作用し得る。１つの実施形態において、この付着部位は、当該分野で公知のタンパク質またはペプチドから選択され得るタンパク質またはペプチドである。例えば、第１の付着部位は、以下の群から選択され得る：リガンド、レセプター、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、エピトープ（例えば、ＨＡまたはＴ７タグ）、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、免疫グロブリンドメイン、および第１の付着部位として有用な、当該分野で公知の任意の他のアミノ酸配列。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、この第１の付着部位が、カプシドタンパク質に対してインフレーム融合を構築することにおいて利用される形成体（すなわち、タンパク質またはポリペプチド）に対して二次的に作製され得ることは、当業者によってさらに理解されるべきである。例えば、タンパク質は、エンベロープタンパク質と、特定の様式においてグリコシル化されていることが公知のアミノ酸配列との融合のために利用され得、そして次いで、結果として付加された糖部分は、ウイルス足場の第１の付着部位で作用し得、これは、抗原の二次付着部位として作用するレクチンへの結合による。あるいは、この形成体配列は、インビボでビオチン化され得、そしてこのビオチン部分は、本発明の第１の付着部位として作用し得るか、またはこの形成体配列は、インビトロにおいて、別個のアミノ酸残基の化学的改変に供され得、この改変は、この第１の付着部位として作用する。
【００９１】
本発明の１つの特定の実施形態は、シンドビスウイルスを利用する。シンドビスウイルスＲＮＡゲノムは、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３と呼ばれる３つのタンパク質を含む脂質二重層によって囲まれる、カプシドタンパク質中にパッケージされる。これらのいわゆるエンベロープタンパク質は、糖タンパク質であり、そしてこのグリコシル化タンパク質は、この脂質二重層の外側上に位置される。ここで、これらのタンパク質の複合体は、このウイルスの表面から外側へ突出することが電子顕微鏡写真において観察され得る「スパイク（ｓｐｉｋｅ）」を形成する。本発明の好ましい実施形態において、この第１の付着部位は、Ｅ２エンベロープタンパク質に対してインフレームで融合されるＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであるように選択される。しかし、他のエンベロープタンパク質が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当業者に明らかである。
【００９２】
本発明の最も好ましい実施形態において、この第１の付着部位はＢ型肝炎カプシド（コア）タンパク質に対してインフレームで融合されるＪＵＮ−ＦＯＳロイシンジッパードメインであるように選択される。しかし、他のウイルスカプシドタンパク質が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当業者に明らかである。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態において、この第１の付着部位は、肝炎コア（カプシド）タンパク質に対してインフレームで融合されるリジン残基またはシステイン残基であるように選択される。しかし、他のウイルスカプシド粒子またはウイルス様粒子が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当該者に明らかである。
【００９４】
実施例１は、Ｈａｈｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３（１９９２））のｐＴＥ５’２Ｊベクターを使用して、シンドビスウイルスＥ２エンベロープタンパク質とＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインとの間のインフレーム融合タンパク質の構築を示すために提供される。この第１の付着部位のために利用されるＪＵＮアミノ酸配列は、以下の通りである：ＣＧＧＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＨＶＧＣ（配列番号５９）。この例において、抗原上の予測される第２の付着部位は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであり、そしてこのアミノ酸配列は、以下の通りである：ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ（配列番号６０）。
【００９５】
これらの配列は、各々、両側にシステイン残基を含む短い配列に隣接する、転写因子ＪＵＮおよびＦＯＳに由来する。これらの配列は、互いに相互作用することが公知である。ＪＵＮ−ＦＯＳ二量体について提唱された元々のハイポセティカル構造は、１つの単量体の疎水性側鎖が、ジッパー様の様式で他の単量体のそれぞれの側鎖と嵌合することを仮定した（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９−１７６４ （１９８８））。しかし、この仮定は誤っていることが判明した。そしてこれらのタンパク質は、αヘリカルコイルドコイルを形成することが公知である（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：５３８−５４２（１９８９）；Ｏ’ Ｓｈｅａら、Ｃｅｌｌ ６８：６９９−７０８（１９９２）；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐａｒｒｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２４５−２４８（１９８６））。従って、用語「ロイシンジッパー」は、頻繁に、構造的理由よりもより歴史的にこれらのタンパク質ドメインをいうために使用される。この特許にわたって、用語「ロイシンジッパー」は、上記の配列、または上記の配列に本質的に類似する配列をいうために使用される。用語ＪＵＮおよびＦＯＳは、ＪＵＮタンパク質全体およびＦＯＳタンパク質全体というよりもむしろ、それぞれのロイシンジッパードメインのために使用される。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明は、ｐＣＹＴｔｓ発現系を使用する、シンドビスウイルスＥ２−ＪＵＮ足場の生成を提供する（米国特許出願番号６０／０７９，５６２；１９９８年３月２７日出願）。このｐＣＹＴｔｓ発現系は、新規な発現ベクターを提供し、このベクターは、真核生物細胞において遺伝子発現の厳重な調節を可能にする。この系のＤＮＡベクターは、転写されてＲＮＡ分子を形成し、次いで、温度感受性レプリカーゼによって複製されて、さらなるＲＮＡ分子を形成する。複製によって生成されるＲＮＡ分子は、目的のタンパク質を生成するために翻訳され得るヌクレオチド配列、または１つ以上の非翻訳ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。従って、この発現系は、組換えシンドビスウイルス粒子の生成を可能にする。
【００９７】
実施例２は、本発明の非天然のＥ２−ＪＵＮシンドビス分子足場の生成に対する詳細を提供する。さらに、実施例３は、実施例１において生成されたｐＴＥ５’２ＪＥ２：ＪＵＮベクターを使用して、組換えＥ２−ＪＵＮシンドビスウイルス足場の生成のための別の方法を提供する。従って、本発明は、２つの手段（ｐＣＹＴｔｓ発現系（実施例２）およびｐＴＥ５’２Ｊベクター系（実施例３）を提供し、これによって、組換えシンドビスウイルスＥ２−ＪＵＮの非天然分子足場が生成され得る。各々の系において生成されたウイルス粒子の分析は、図１および図２において検証される。
【００９８】
先に述べたように、本発明は、ウイルスに基づくコア粒子（これは、ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスカプシド粒子またはそれらの組換え形態を含む）を含む。当業者は、このようなコア粒子を生成し、そしてそのコア粒子に形成体を付着させるための知識を有する。他の例を提供する目的で、本発明は、本明細書中で、コア粒子として、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子および麻疹ウイルスカプシド粒子の生成を提供する（実施例１７〜２２）。このような実施形態において、ＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインは、本発明の非天然の分子足場のための形成体として、そしてそれゆえに、第１の付着部位として、使用され得る。
【００９９】
実施例２３〜２９は、それぞれ、第１の付着部位および第２の付着部位として、反応性リジン残基を有するインフレームで融合されたペプチドを保有するＢ型肝炎コア粒子、および遺伝的に融合されたシステイン残基を保有する抗原、の生成の詳細を提供する。
【０１００】
（Ｂ．第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基の構築）
本発明の組成物内の第２のエレメントは、非天然分子骨格の第１の付着部位と、少なくとも一つの非ペプチド結合を介して会合し得る少なくとも一つの第２の付着部位を保有する抗原または抗原決定基である。本発明は、所望の治療効果の考慮において選択された抗原または抗原決定基に従って変わる組成物を提供する。他の組成物が、第２の付着部位について選択される分子を変えることによって提供される。
【０１０１】
本発明の抗原は、以下からなる群から選択され得る：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｂ）感染疾患に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｄ）家畜における免疫応答を誘導するのに適したタンパク質。
【０１０２】
本発明の一つの特定の実施形態において、抗原または抗原決定基は、感染疾患の予防に対して有用な実施形態である。そのような処置は、広い範囲の宿主（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種および非哺乳動物種も同様）に影響を及ぼす広範に種々の感染疾患を処置するために有用である。処置可能な感染疾患は、当業者に周知であり、例としては、例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン−バー、ポリオ、ウイルス脳炎、麻疹、水痘などのようなウイルス病因の感染；または例えば肺炎、結核、梅毒などの細菌病因感染；または例えばマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症（ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）などの寄生的病因の感染が挙げられる。従って、本発明の組成物のために選択される抗原または抗原決定基は、医療分野における当業者に対して周知である；抗原または抗原決定基の例としては、以下が挙げられる：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０およびｇｐ１６０；インフルエンザ抗原赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、肺炎Ｂ表面抗原、マラリアのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質。
【０１０３】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、アレルギーまたは癌の処置のために使用され得る免疫治療法である。
【０１０４】
組成物のための抗原または抗原決定基の選択およびアレルギーに対する処置の方法は、そのような疾患を処置する医療分野の当業者に対して公知である；この型の抗原または抗原決定基の代表的な例としては、以下が挙げられる；ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、Ｂｅｔ ｖ Ｉ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ Ｄｏｌ ｍ Ｖ（ホワイトフェーススズメバチ（ｗｈｉｔｅ−ｆａｃｅｄ ｈｏｒｎｅｔ）毒アレルゲン）、Ｄｅｒ ｐ Ｉ（イエダニアレルゲン）。
【０１０５】
組成物に対する抗原または抗原決定基の選択および癌に対する処置の方法は、そのような疾患を処置する医療分野における当業者に公知である；この型の抗原または抗原決定基の代表的な例としては、以下が挙げられる：Ｈｅｒ２（乳癌）、ＧＤ２（神経芽細胞腫）、ＥＧＦ−Ｒ（悪性グリア芽細胞腫）、ＣＥＡ（髄質甲状腺（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ）癌）、ＣＤ５２（白血病）。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、抗原または抗原決定基は、以下からなる群より選択される：（ａ）ＨＩＶの組換えタンパク質、（ｂ）インフルエンザウイルスの組換えタンパク質（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、（ｄ）トキソプラスマの組換えタンパク質、（ｅ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組換えタンパク質、（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの組換えタンパク質、（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅの組換えタンパク質、（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅの組換えタンパク質、（ｉ）乳癌細胞の組換えタンパク質、（ｊ）腎臓癌細胞の組換えタンパク質、（ｋ）前立腺癌細胞の組換えタンパク質、（ｌ）皮膚癌細胞の組換えタンパク質、（ｍ）脳癌細胞の組換えタンパク質、（ｎ）白血病細胞の組換えタンパク質、（ｏ）組換えプローブファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、（ｐ）ハチ刺しアレルギーの組換えタンパク質、（ｑ）堅果アレルギーの組換えタンパク質、（ｒ）食物アレルギーの組換えタンパク質、喘息の組換えタンパク質およびクラミジアの組換えタンパク質。
【０１０７】
一旦、組成物の抗原または抗原決定基が選択されると、少なくとも一つの第２の付着部位が、本発明の非天然分子足場と会合した、組織化され、かつ反復性のアレイを構築するように調製する際に、その分子に添加され得る。適切な第２の付着部位を構成するものの知識は、当業者に公知である。第２の付着部位の代表的例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原、抗体または抗体フラグメント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用ロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に対して反応性の化学基；カルボキシル基、カルボキシル基に対して反応性の化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に対して反応性の化学基、またはそれらの組み合わせ。
【０１０８】
第１の付着部位と第２の付着部位との間の結合は、選択されたそれぞれの分子の特徴によって決定されるが、少なくとも一つの非ペプチド結合を含む。第１の付着部位および第２の付着部位の組み合わせに依存して、天然の会合は、共有結合性、イオン性、疎水性、極性、またはその組み合わせであり得る。
【０１０９】
本発明の一つの実施形態において、第２の付着部位は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインであり得る。
【０１１０】
本発明の最も具体的な実施形態では、選択された第２の付着部位ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであり、これは、本発明の非天然分子足場のＪＵＮロイシンジッパータンパク質と特異的に会合する。ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインの会合は、足場の表面上に、組織化され、かつ反復性の抗原または抗原決定基アレイを形成するための基礎を提供する。このＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインは、アミノ末端、カルボキシル末端のいずれかにおける抗原または抗原決定基の選択に対してインフレームで融合され得るか、または所望される場合、そのタンパク質の内部に位置する。
【０１１１】
いくつかのＦＯＳ融合構築物が、例示的目的のために提供される。ヒト成長ホルモン（実施例４）、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）（実施例９）、オボアルブミン（実施例１０）およびＨＩＶｇｐ１４０（実施例１２）。
【０１１２】
ＦＯＳ融合構築物の生成を簡略化するために、抗原または抗原決定基の設計および構築について選択を提供する、いくつかのベクターが開示される（実施例６を参照のこと）。ベクターｐＡＶ１−４を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＯＳ融合発現のために設計した；ベクターｐＡＶ５およびｐＡＶ６を、真核生物細胞におけるＦＯＳ融合タンパク質の発現のために設計した。これらのベクターの特性が、以下に手短に記載される；
１．ｐＡＶ１：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１１３】
２．ｐＡＶ２：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結され得る。
【０１１４】
３．ｐＡＶ３：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１１５】
４．ｐＡＶ３：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結され得る。そのＮ末端メチオニン残基は、タンパク質合成の際に酵素分解的に除去される（Ｈｉｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２４７−８２５１（１９８９））。
【０１１６】
５．ｐＡＶ５：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ｈＧＨシグナル配列をコードする配列とＦＯＳドメインとの間に挿入され得る。あるいは、その自らのシグナル配列を含む遺伝子は、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ＦＯＳコード領域に融合され得る。
【０１１７】
６．ｐＡＶ６：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ（または、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位へ連結され得る。
【０１１８】
当業者によって、理解されるように、ＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の構築は、組換えタンパク質の産生を促進するような特定の遺伝子エレメントの付加を含み得る。実施例４は、翻訳のための特定のＥ．ｃｏｌｉ調節エレメントの添加についてのガイダンスを提供し、そして実施例７は、真核生物シグナル配列の添加についてのガイダンスを提供する。開業医の特定の必要性に依存して、他の遺伝子エレメントが、選択され得る。
【０１１９】
本発明はまた、細菌細胞（実施例５）または真核生物細胞（実施例８）のいずれかにおけるＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の産生を含むことが理解される。融合タンパク質を発現させるために、いずれの細胞型を選択するかは、当業者の知識内にあり、例えば、この組成物の設計において、翻訳後の改変が、重要な考察であるか否かというような因子に依存する。
【０１２０】
以前に注記されたように、本発明は、ｐＡＶベクターの使用を介するＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の構築のための種々の方法を開示する。原核生物発現および真核生物発現を可能にすることに加えて、これらのベクターは、開業医が、ＦＯＳロイシンジッパードメインの抗原への−とＣの間の末端付加を選択すること可能にする。特定の例が、提供され、ここで−およびＣ末端ＦＯＳ融合は、ＰＬＡ（実施例９）およびオボアルブミン（実施例１０）に対してなされる。実施例１１は、ＰＬＡおよびオボアルブミンＦＯＳ融合タンパク質の精製を実証する。
【０１２１】
ほとんどの特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶゲノムによってコードされる抗原または抗原決定基に引き寄せられる。より具体的には、ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１４０である。実施例１１〜１５に提供されるように、ＨＩＶｇｐ１４０は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインおよび合成された融合タンパク質とともに作製され得、そして本発明の非天然分子足場に対する付着のために精製され得る。当業者が公知のように、他のＨＩＶ抗原または抗原決定基が、本発明の組成物の作製の際に使用され得る。
【０１２２】
本発明の最も具体的な実施形態において、選択される第２の付着部位は、システイン残基であり、これは本発明の非天然分子足場のリジン残基と特異的に結合する。リジン残基（Ｌｙｓ）およびシステイン残基（Ｃｙｓ）のその化学結合は、足場の表面上に、組織化され、かつ反復性の抗原または抗原決定基アレイの形成のための基礎を提供する。システイン残基は、アミノ末端、カルボキシル末端のいずれかにおける抗原または抗原決定基の選択に対してインフレームで操作され得るか、または所望される場合、そのタンパク質の内部に位置され得る。例として、ＰＬＡおよびＨＩＶｇｐ１４０が、リジン残基の第１の付着部位に対する結合のためのシステイン残基とともに提供される。
【０１２３】
（Ｃ．αワクチン粒子の調製）
本発明は、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイの構築のための新規の組成物および方法を提供する。当業者が公知のように、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイのアセンブリのための条件は、大きな程度まで、非天然の足場の第１の付着部位の特異的な選択および抗原または抗原決定基の第２の付着部位の特異的な選択に依存する。従って、この組成物の設計における開業医の選択は（すなわち、第１の付着部位および第２の付着部位、抗原および非天然の足場の選択）、αワクチン粒子（順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイおよび結合される非天然分子足場）の集合についての特定の条件を決定する。このαワクチン粒子の集合に関する情報は、十分に開業医の作業知識内であり、そして多くの参考文献が存在し、開業医を援助する（例えば、Ｓａｍｂｏｒｋ，Ｊら、編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆら、編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ、編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．第２版、（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）。これらの全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０１２４】
本発明の特定の実施形態において、ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインはそれぞれ、本発明の第１および第２の付着部位のために利用される。αワクチン粒子の調製において、抗原は、非天然足場上に順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイのアセンブリを促進するような条件下で産生され、そして精製されなければならない。特定のＪＵＮ／ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインの実施形態において、ＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基は、ジスルフィド結合形成の発生を減少または排除するために、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））を用いて処理されるべきである（実施例１５）。
【０１２５】
ＪＵＮ／ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメイン実施形態の非天然足場（すなわち、組換えＳｉｎｂｉｓウイルス）の調製のために、組換えＥ２−ＪＵＮウイルス粒子は、濃縮され、中和、そして還元剤を用いて処理されるべきである（実施例１６を参照のこと）。
【０１２６】
ＪＵＮ／ＦＯＳ実施形態における、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイの集合は、酸化還元シャッフルの存在下でなされる。Ｅ２−ＪＵＮウイルス粒子は、２４０倍モル濃度超過のＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基と４℃で１０時間結合される。次いで、そのαワクチン粒子は、クロマトグラフィーによって濃縮されて、精製される（実施例１６）。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、非天然分子足場と抗原または抗原決定基の結合は、化学的架橋によって、達成され得る。最も好ましい実施形態において、その化学剤は、ヘテロ２官能基架橋剤（例えば、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｔａｎｉｍｏｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．４：８１２（１９８１）；Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４５：１９５（１９８１））であり、これは、（１）アミノ基と反応するスクシンイミド基および（２）ＳＨ基と反応するマレイミド基を含む。第１の付着部位の異種タンパク質またはポリペプチドは、ヘテロ２官能基架橋剤のスクシンイミド部分に対する反応部分として役に立つ、一つ以上のリジン残基を含むように操作され得る。一旦、非天然分子足場の第１の付着部位に化学的に結合されると、ヘテロ２官能基架橋剤のマレイミド基は、抗原または抗原決定基上のシステイン残基のＳＨ基と反応するために、利用可能となる。この場合における抗原または抗原決定基調製は、第２の付着部位として選択されたタンパク質またはポリペプチド内へシステイン残基を操作することを必要とし得、その結果システイン残基を、非天然分子足場の第１の付着部位に結合した架橋剤上の遊離マレイミド官能基と反応させ得る。
【０１２８】
（３．組成物、ワクチン、およびそれらの投与、ならびに処置方法）
１つの実施形態では、本発明は、広範な種々の種（特に、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどのような哺乳動物種）における感染症の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス性病因の感染（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン−バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘など）；または、細菌性病因の感染（例えば、肺炎、結核、梅毒など）；または寄生生物性病因の感染（例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など）を処置するように設計され得る。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明は、広範な種々の種（特に、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどのような哺乳動物種）における癌の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、すべての型の癌（リンパ腫、癌腫、肉腫、黒色腫など）を処置するように設計され得る。
【０１３０】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、アレルギーの処置のためのワクチンの設計において使用され得る。ＩｇＥアイソタイプの抗体は、アレルギー反応において重要な成分である。肥満細胞は、それらの表面上でＩｇＥ抗体を結合し、そして肥満細胞表面上に結合したＩｇＥ分子に対する特異的抗原の結合に際して、ヒスタミンおよびアレルギー反応の他のメディエイタを放出する。従って、ＩｇＥ抗体の産生を阻害することは、アレルギーに対して保護するための有望な標的である。これは、所望されるＴヘルパー細胞応答を達成することによって可能であるはずである。Ｔヘルパー細胞応答は、１型（ＴＨ１）Ｔヘルパー細胞応答および２型（ＴＨ２）Ｔヘルパー細胞応答に分けられ得る（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２６３−２６６（１９９７））。ＴＨ１細胞は、インターフェロン−γ、およびＢ細胞を誘発してＩｇＧ１−３抗体を産生する他のサイトカインを分泌する。対照的に、ＴＨ２細胞により産生される重要なサイトカインはＩＬ−４であり、ＩＬ−４はＢ細胞を駆動してＩｇＧ４およびＩｇＥを産生する。多くの実験系において、ＴＨ１応答およびＴＨ２応答の発生は相互排他的である。なぜなら、ＴＨ１細胞はＴＨ２細胞の誘導を抑制し、そして逆もまた同じであるからである。従って、強力なＴＨ１応答を誘発する抗原は、同時に、ＴＨ２応答の発生を抑制し、従ってＩｇＥ抗体の産生を抑制する。興味深いことに、実質的にすべてのウイルスが、宿主においてＴＨ１応答を誘導し、そしてＩｇＥ抗体の産生を誘発することに失敗する（Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：６４−６９（１９８７））。このアイソタイプパターンは、生存しているウイルスに制限されず、不活化されたウイルス粒子または組換えウイルス粒子についても観察された（Ｌｏ−Ｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１４０１−１４０７（１９９８））。従って、本発明のプロセス（例えば、αワクチン技術）を使用することにより、ウイルス粒子は種々のアレルゲンで修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅ）され得、そして免疫のために使用され得る。生じるアレルゲンの「ウイルス構造」に起因して、ＴＨ１応答が誘発され、「保護的」ＩｇＧ１−３抗体が産生され、そしてアレルギー反応を引き起こすＩｇＥ抗体の産生を妨げる。アレルゲンは、アレルゲン自体よりもヘルパーＴ細胞の異なるセットによって認識されるウイルス粒子によって提示されるので、アレルゲン特異的ＩｇＧ１−３抗体は、このアレルゲンに対して特異的な既存のＴＨ２細胞を保有するアレルギー性個体においてでさえ、誘導される可能性がある。高濃度のＩｇＧ抗体の存在は、肥満細胞結合ＩｇＥへのアレルゲンの結合を妨げ得、それによって、ヒスタミンの放出を阻害する。従って、ＩｇＧ抗体の存在は、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応から保護し得る。アレルギーを引き起こす代表的な物質としては、以下が挙げられる：イネ科草本、ブタクサ、カバノキもしくはマウンテンシーダー（ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ）の花粉、ハウスダスト、ダニ類、動物のフケ、カビ、昆虫毒液、または薬物（例えば、ペニシリン）。従って、アレルゲン修飾されたウイルス粒子での個体の免疫は、アレルギー発症の前のみならず後でも、有益である。
【０１３１】
当業者によって理解されるように、本発明の組成物が個体に投与される場合、それらは、組成物の効力を改善するために所望され得る塩、緩衝剤、アジュバント、または他の物質を含む組成物中であり得る。薬学的組成物を調製する際の使用に適切な物質の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９８０））を含む多数の供給源に提供される。
【０１３２】
本発明の組成物は、それらの投与がレシピエント個体によって耐えられ得る場合に、「薬理学的に受容可能」であるといわれる。さらに、本発明の組成物は、「治療的有効量」（すなわち、所望される生理学的効果を産生する量）で、投与される。
【０１３３】
本発明の組成物は、当該分野において公知の種々の方法によって投与され得るが、通常は、注射、注入、吸入、経口投与、または他の適切な物理的方法によって投与される。あるいは、組成物は、筋内、静脈内、または皮下に投与され得る。投与のための組成物の成分は、滅菌水溶液（例えば、生理的食塩水）または非水系溶液および懸濁液を含む。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブオイル）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。キャリアまたは閉鎖包帯が、皮膚の透過性を増大させるため、および抗原吸着を増強するために使用され得る。
【０１３４】
ワクチン技術に加えて、本発明の他の実施形態は、癌およびアレルギーの医学的処置の方法に向けられる。
【０１３５】
本明細書中で言及される、すべての特許および刊行物は、特に参考として援用される。
【０１３６】
（実施例）
続く実験において使用された酵素および試薬は、以下を含んだ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ；ＱＩＡＧＥＮから入手した、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手した、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ Ｋｉｔ、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、バクト−トリプトン（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）および酵母抽出物；Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した、オリゴヌクレオチド；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手した、制限エンドヌクレアーゼ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した、ＰｗｏポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓ。ＨＰ−１培地を、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧｌａｔｔＢｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。すべての標準的な化学薬品を、Ｆｌｕｋａ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。そして、すべての細胞培養材料を、ＴＰＰから入手した。
【０１３７】
ＤＮＡ操作を、標準的技術を使用して実施した。ＤＮＡを、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを使用して２ｍｌの細菌培養物から、またはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを使用して５０ｍｌの培養物からのいずれかから調製した。制限酵素消化のために、製造業者の推奨される条件（緩衝液および温度）下で、１ｍｇのＤＮＡあたり５〜１０ユニット（Ｕ）の酵素濃度で、ＤＮＡを適切な制限酵素と共に少なくとも２時間インキュベートした。１つより多い酵素での消化を、反応条件がすべての酵素について適切である場合には同時に実施したが、そうでなければ連続して実施した。さらなる操作のために単離されたＤＮＡフラグメントを、０．７〜１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により分離し、このゲルから切除し、そして製造業者によって提供される指示書に従って、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。ＤＮＡフラグメントの連結のために、１００〜２００ｐｇの精製されたベクターＤＮＡを、製造業者によって提供される緩衝液（総容量：１０〜２０μｌ）中で、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下において、３倍モル濃度過剰の挿入物フラグメントと共に、１６℃にて一晩インキュベートした。連結反応物のアリコート（０．１〜０．５μｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換のために使用した。形質転換を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲＡＤ）および０．１ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（ＢｉｏＲＡＤ）を、２００Ω、２５μＦ、１．７ｋＶにて使用するエレクトロポレーションによって実施した。エレクトロポレーション後、選択的Ｓ．Ｏ．Ｂ．アガーにおけるプレーティングの前に、細胞を１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｂ．培地（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）中で１時間振盪しながらインキュベートした。
【０１３８】
（実施例１）
（Ｅ２におけるＪＵＮ両親媒性ヘリックスドメインの挿入）
ベクターｐＴＥ５’２Ｊ（Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３（１９９２））において、ＭｌｎＩおよびＢｓｔＥＩＩの制限酵素部位を、構造タンパク質Ｅ２コード配列のコドン７１（Ｇｌｎ）と７４（Ｔｈｒ）との間に導入し、ベクターｐＴＥ５’２ＪＢＭを得た。これらの制限酵素部位の導入を、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって実施した。
【０１３９】
【化１】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、鋳型ＤＮＡ５ｎｇと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の様式および順序で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、５３℃（６０秒間）７２℃（８０秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、５７℃（６０秒間）、７２℃（８０秒間）の２５サイクル。
【０１４０】
２つのＰＣＲフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって分析および精製した。増幅のためにオリゴ３および４を使用する、２つのＰＣＲフラグメントのアセンブリＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）を、最終構築物を得るために実施した。
【０１４１】
アセンブリＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、２ｎｇの精製されたＰＣＲフラグメントと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の様式および順序で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、５７℃（６０秒間）７２℃（９０秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、５９℃（６０秒間）、７２℃（９０秒間）の２５サイクル。
【０１４２】
最終ＰＣＲ産物を、Ｑｉａ ｓｐｉｎ ＰＣＲカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして適切な緩衝液中で、各１０ユニットのＢｓｓＨＩＩおよびＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、３７℃にて１２時間消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＢｓｓＨＩＩ／ＳｔｕＩ消化されかつゲル精製されたｐＴＥ５’２Ｊベクター（Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３）中に連結した。このＰＣＲ産物の正確な挿入を、まずＢｓｔＥＩＩおよびＭｌｕＩ制限分析により分析し、次いで、ＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０１４３】
ＪＵＮ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ベクターｐＪｕＦｏ（ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｕｔｅｒ、Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））からＰＣＲ増幅した。
【０１４４】
【化２】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、５ｎｇの鋳型ＤＮＡと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の順序および様式で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、６０℃（３０秒間）７２℃（２５秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒間）、７２℃（２０秒間）の２５サイクル。
【０１４５】
最終ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＶ消化されかつゲル精製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＫＳ−）中に連結した。得られたベクターから、ＱｉａＥｘＩＩで精製されたＭｌｕＩ／ＢｓｔＥＩＩでの切断によって、ＪＵＮ配列を単離し、そしてベクターｐＴＥ５’２ＪＢＭ（予め、同一の制限酵素で切断されている）中に連結して、ベクターｐＴＥ５’２Ｊ：Ｅ２ＪＵＮを得た。
【０１４６】
（実施例２）
（ｐＣＹＴｔｓ系を使用する、Ｅ２−ＪＵＮ含有ウイルス粒子の産生）
構造タンパク質を、鋳型としてのｐＴＥ５’２Ｊ：Ｅ２ＪＵＮ、ならびにオリゴヌクレオチドＸｂａｌＳｔｒｕｃｔ（ｃｔａｔｃａＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＴＡＡＣ）（配列番号１２）およびＳｔｒｕｃｔＢｓｐ１２０１（ｔｃｇａａｔＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧ）（配列番号８７）を使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲのために、１００ｐｍｏｌの各オリゴ（Ｉｏｌｉｇｏ）を使用し、そして５ｎｇの鋳型ＤＮＡを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑ（Ｔａｃ）ポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクルは、以下の通りであった：９５℃（３分間）、次いで、９２℃（３０秒間）、５４℃（３５秒間）７２℃（２７０秒間）の５サイクル、次いで、９２℃（３０秒間）、６３℃（３５秒間）、７２℃（２７０秒間）の２５サイクル。このＰＣＲ産物をゲル精製し、そして制限酵素ＸｂａＩ／Ｂｓｐ１２０１で消化し、そして予め同一の酵素で切断されたベクターｐＣＹＴｔｓ（米国特許出願番号６０／０７９，５６２；１９９８年３月２７日出願）中に連結した。
【０１４７】
２０μｇのｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮを、３７℃にて少なくとも４時間、適切な緩衝液中で３０ＵのＳｃａＩと共にインキュベートした。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出により停止し、次いで、直鎖化ＤＮＡのイソプロパノール沈殿を行った。制限反応を、アガロースゲル電気泳動によって確認した。トランスフェクションのために、３０μｌのＨ２Ｏ中において５．４μｇの直鎖化ｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮを０．６μｇの直鎖化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌのＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５秒間ボルテックスし、次いで、室温で２５秒間インキュベーションした。この溶液を、２％のＦＣＳを含有する２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ ＦＣＳ培地）に、すぐ添加した。次いで、６ウェルプレート中の８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養の培地を、ＤＮＡ含有培地と置換した。ＣＯ２インキュベーター内における３７℃での５時間のインキュベーションの後、ＤＮＡ含有培地を取り除き、そして２％ ＦＣＳ培地中の１５％グリセロール２ｍｌと置換した。このグリセロール含有培地を、３０秒間のインキュベーション期の後に取り除き、そして１０％のＦＣＳを含有するＨＰ−１培地５ｍｌでリンスすることによって細胞を洗浄した。最後に、１０％のＦＣＳを含有する新鮮なＨＰ−１培地２ｍｌを添加した。
【０１４８】
安定にトランスフェクトされた細胞を、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、選択培地（Ｇ４１８を補充した、ＨＰ−１培地）中で選択し、そして増殖させた。混合した集団をコンフルーエンシーまで増殖した時点で、培養物を２つのディッシュに分け、次いで、３７℃での１２時間の増殖期を行った。この細胞の一方のディッシュを、ウイルス粒子の発現を誘導するために３０℃に移し；他方のディッシュを、３７℃で維持した。
【０１４９】
ウイルス粒子の発現を、ウェスタンブロッティングにより決定した（図１）。培養培地（０．５ｍｌ）を、メタノール／クロロホルム沈殿し、そしてペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを、１５％アクリルアミドゲルに適用する前に、５分間、９５℃で加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９〜５５頁によって記載されるように、タンパク質を、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。ＴＢＳ（１リットルあたり１０×ＴＢＳ：８７．７ｇのＮａＣｌ、６６．１ｇのＴｒｉｚｍａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇのＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温にて１時間メンブレンをブロックし、次いで、抗Ｅ１／Ｅ２抗体（ポリクローナル血清）と共に１時間インキュベーションした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ）を用いて１０分間、３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ−抗ウサギＩｇＧ結合体（０．１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔを用いた１０分間の２回の洗浄およびＴＢＳを用いた１０分間の２回の洗浄の後、５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％ジメチルホルムアミド中の７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中の５％ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）と共に、アルカリホスファターゼ検出試薬（１０ｍｌ ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を用いて、発色反応を実施した。
【０１５０】
ウイルス粒子の産生を、図１に示す。ウェスタンブロットのパターンは、Ｅ２−ＪＵＮ（レーン１）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、野生型Ｅ２（レーン２）と比較してより大きな分子量に移動することを示した。そして、ＢＨＫ２１宿主細胞株は、バックグラウンドを全く示さなかった。
【０１５１】
（実施例３）
（ｐＴＥ５’２ＪＥ２：ＪＵＮベクターを用いた、Ｅ２−ＪＵＮを含有するウイルス粒子の産生）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）を、ＰｖｕＩ消化によって直鎖化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ、ＮＶ Ｌｅｅｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによる、ＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を用いて、インビトロでの転写を実施した。生じた５’キャップ化されたｍＲＮＡを、還元アガロースゲルにおいて分析した。
【０１５２】
インビトロで転写されたｍＲＮＡ（５μｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）中にエレクトロポレーションした。３７℃での１０時間のインキュベーションの後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを有さないＨＰ−１培地と交換し、次いで、３７℃で１０時間さらにインキュベーションした。上清を収集し、そして正確に実施例２に記載のように、ウイルス粒子の産生についてウェスタンブロット分析によって分析した。
【０１５３】
得られた結果は、図２に示されるようなｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮで得られた結果と同一であった。
【０１５４】
（実施例４）
（ＦＯＳロイシンジッパードメイン（ＯｍｐＡシグナル配列）へのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合）
ヒトリーダー配列を有さないｈＧＨ遺伝子を、もともとのプラスミド（ＡＴＣＣ ３１３８９）から、ＰＣＲによって増幅した。内部ＸｂａＩ部位を有するオリゴ７を、ｈＧＨ遺伝子の５’末端でのアニーリングのために設計し、そして内部ＥｃｏＲＩ部位を有するオリゴ９を、ｈＧＨ遺伝子の３’末端でプライムした。ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。
【０１５５】
ＰＣＲサイクリングを、以下の様式で実施した：６０℃のアニーリング温度および７２℃での１分間の伸長時間の３０サイクル。
【０１５６】
ゲル精製し、そして単離したＰＣＲ産物を、第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用して、ｏｍｐＡシグナル配列およびシャイン−ダルガーノ配列を導入した。ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌのオリゴ８および９、ならびに１ｎｇのテンプレートＰＣＲフラグメントを、７５μｌの反応混合液（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。最初の５サイクルのアニーリング温度は５５℃で、７２℃での６０秒間の伸長時間を伴い；別の２５サイクルを、６５℃のアニーリング温度および７２℃で６０秒間の伸長時間で実施した。
【０１５７】
【化３】
生じた組換えｈＧＨ遺伝子を、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローン化した。両鎖の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５８】
ＦＯＳ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、ベクターｐＪｕＦｏ（Ｃｒａｍｅｒｉ＆Ｓｕｔｅｒ Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））から、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１５９】
【化４】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。温度サイクルは、以下の通りであった：
９５℃で２分間、次いで、９５℃（４５秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（２５秒間）の５サイクル、次いで、９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒間）、７２℃（２０秒間）の２５サイクル。
【０１６０】
ＰＣＲ産物を精製し、単離し、そしてＳｔｕＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｏｍｐＡ−ｈＧＨ中にクローン化した。次いで、ハイブリッド遺伝子を、ｐＫＫ２２３−３プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にクローン化した。
【０１６１】
（実施例５）
（ＦＯＳ−ｈＧＨの細菌性発現）
ｐｋｋ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨを、誘導性のＩＰＴＧ依存性プロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株としてＪＭ１０１を使用して発現させた。発現を、振盪機フラスコ内で実施した。細胞を、０．５のＯＤ６００において、１ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導した。発現を、３７℃にて１０時間継続した。細胞を、１０℃で１５分間、３６００での遠心分離によって収集した。細胞のペレットを、凍結し（−２０℃または液体Ｎ２）、そして１６時間保存した。次いで、ペレットを４℃にて融解し、そして６００ｍＭスクロースを含有する１０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。４℃での１５分間の攪拌後、ペリプラズムのタンパク質を、浸透圧性ショック手順によって放出した。冷却（４℃）脱イオン水を添加し、そして懸濁液を４℃にて３０分間攪拌した。スラッジを希釈し、再懸濁し、そしてリゾチームを添加して、細菌の細胞壁を破壊した。細胞およびペリプラズムの画分のスフェロプラストを、４℃で２０分間、１１０００ｇでの遠心分離によって分離した。ＦＯＳ−ｈＧＨ含有上清を、還元性および非還元性ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびドットブロットによって分析した。ドットブロットを、実施例８に記載のように、一次抗体として抗ｈＧＨ抗体（Ｓｉｇｍａ）および二次抗体としてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−抗マウス抗体結合体を使用して、実施した。
【０１６２】
全長の正確にプロセスされたＦＯＳ−ｈＧＨが、還元条件および非還元条件下で検出され得た。ＦＯＳ−ｈＧＨの一部は、ＦＯＳ両親媒性ヘリックス中に存在する遊離システインに起因して、他の未同定のタンパク質に結合した。しかし、発現されたＦＯＳ−ｈＧＨの５０％より多くが、そのネイティブなモノマー性コンフォメーションで存在した（図３）。
【０１６３】
精製されたＦＯＳ−ｈＧＨを使用して、ＪＵＮ含有ウイルス粒子を用いる最初のドーピング実験を実施した。
【０１６４】
（実施例６）
（ＦＯＳ融合タンパク質の発現のための、ｐＡＶベクター系列の構築）
−もしくはＥ．ｃｏｌｉにおけるＣ末端ＦＯＳ融合タンパク質の細胞質内産生もしくは分泌、または−もしくは真核生物細胞におけるＣ末端融合タンパク質の産生のいずれかを可能にする、汎用性のベクター系を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＯＳ融合タンパク質の産生のために設計されたベクターｐＡＶ１〜ｐＡＶ４は、以下に列挙されたＤＮＡカセットを含む。このＤＮＡカセットは、異なる順序で配列された以下の遺伝的エレメントを含む：（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡ遺伝子（ａｇｇａｇｇｔａａａａａａｃｇ）（配列番号１３）由来の強力なリボソーム結合部位および５’非翻訳領域；（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質ＯｍｐＡ（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ）（配列番号１４）のシグナルペプチドをコードする配列；（ｃ）２つのグリシン残基および１つのシステイン残基によって両側で隣接されたＦＯＳ二量体化ドメイン（ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ）（配列番号１５）をコードする配列；および（ｄ）目的のタンパク質をＦＯＳ二量体化ドメインに連結する、短いペプチドリンカー（ＡＡＡＳＧＧ）（配列番号１６）またはＧＧＳＡＡＡ（配列番号１７））をコードする領域。関連するコード領域を、大文字で提供する。制限切断部位の配置は、シグナル配列を伴うかまたは伴わない、ＦＯＳ融合遺伝子の容易な構築を可能にする。このカセットを、強力なｔａｃプロモーターの制御下での融合遺伝子の発現のために、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローン化した。
【０１６５】
（ｐＡＶ１）
このベクターは、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ細胞周辺腔への分泌のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１６６】
【化５】
。
【０１６７】
（ｐＡＶ２）
このベクターは、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ細胞周辺腔への分泌のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（または、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結される
【０１６８】
【化６】
。
【０１６９】
（ｐＡＶ３）
このベクターは、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質内産生のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１７０】
【化７】
。
【０１７１】
（ｐＡＶ４）
このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での細胞質産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結し得る。Ｎ末端メチオニン残基を、タンパク質合成に際してタンパク質分解的に除去する（Ｈｉｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２４７−８２５１（１９８９））。
【０１７２】
【化８】
。
【０１７３】
ベクターｐＡＶ５およびｐＡＶ６（これらは、ＦＯＳ融合タンパク質の真核生物産生のために設計される）は、異なる順番で配置された以下の遺伝的エレメントを含む：（ａ）ヒト成長ホルモンのリーダーペプチドをコードする領域（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ）（配列番号２６）；（ｂ）２つのグリシン残基および１つのシステイン残基が両側で隣接する、ＦＯＳ二量体化ドメインをコードする配列（ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ）（配列番号１５）；および（ｃ）ＦＯＳ二量体化ドメインに目的のタンパク質を接続する、短いペプチドリンカーをコードする領域（ＡＡＡＳＧＧ（配列番号１６）またはＧＧＳＡＡＡ（配列番号１７））。関連するコード領域を大文字で示す。制限切断部位の配列は、ＦＯＳ融合遺伝子の容易な構築を可能にする。このカセットを、発現ベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングする。
【０１７４】
（ｐＡＶ５）
このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ｈＧＨシグナル配列をコードする配列とＦＯＳドメインをコードする配列との間に挿入し得る。あるいは、それ自体のシグナル配列を含む遺伝子を、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によってＦＯＳコード領域に融合し得る。
【０１７５】
【化９】
。
【０１７６】
（ｐＡＶ６）
このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ部位（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位）に連結し得る。
【０１７７】
【化１０】
（発現ベクターｐＡＶ１−ｐＡＶ６の構築）
以下のオリゴヌクレオチドを、発現ベクターｐＡＶ１−ｐＡＶ６の構築のために合成した：
【０１７８】
【化１１】
ベクターｐＡＶ２の構築のために、ＯｍｐＡシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＯｍｐＡ−ＦＯＲ１／ＦＯＳ−ＲＥＶ２を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１７９】
ベクターｐＡＶ１の構築のために、ＦＯＳコード領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ１／ＦＯＳ−ＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したベクターｐＡＶ２に連結した。
【０１８０】
ベクターｐＡＶ３の構築のために、ＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ２／ＦＯＳ−ＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＡＶ１から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１８１】
ベクターｐＡＶ４の構築のために、ＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ３／ＦＯＳ−ＲＥＶ２を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１８２】
ベクターｐＡＶ５の構築のために、ｈＧＨシグナル配列をコードする領域を、プライマー対ｈＧＨ−ＦＯＲ１／ｈＧＨＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＳＩＮｒｅｐ５中のｈＧＨ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例７を参照のこと）から増幅する。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し、そしてベクターｐＡＶ１の同じ部位に連結する。次いで、ｈＧＨシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする得られたカセットを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって単離し、そして同じ酵素で消化したベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））にクローニングする。
【０１８３】
ベクターｐＡＶ６の構築のために、ＦＯＳコード領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ４／ＦＯＳＲＥＶ３を使用して、ベクターｐＡＶ２から増幅する。このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断したベクターｐＡＶ５にクローニングする。次いで、ｈＧＨシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする全体のカセットを、プライマー対ｈＧＨ−ＦＯＲ２／ＦＯＳＲＥＶ３を使用して、得られるベクターから再増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして同じ酵素で切断したベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））に連結する。
【０１８４】
（実施例７：ヒト（ｈＧＨ）シグナル配列を有するＦＯＳ−ｈＧＨの構築）
ＦＯＳ−ｈＧＨ融合タンパク質の真核生物発現のために、ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子を、ＸｂａＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉでの消化によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ（実施例４を参照のこと）から単離し、そして同じ酵素で切断したｐＳＩＮｒｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ｈＧＨシグナル配列を、重複するオリゴヌクレオチド
【０１８５】
【化１２】
を使用するＰＣＲ（反応混合物：５０ｐモルの各プライマー、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ（各２００μＭ）、２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、製造業者より供給された緩衝液中、５０μｌの総量；増幅；９２℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、３０サイクル）によって合成した。このＰＣＲ産物を、ＱｉａＥｘｌｌキットを使用して精製し、ＳｔｕＩ／ＸｂａＩで消化し、そして同じ酵素で切断したベクターｐＳＩＮｒｅｐ５：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨに連結した。
【０１８６】
（実施例８：ＦＯＳ−ｈＧＨの真核生物発現）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）（ｐＳＩＮｒｅｐ５：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ）および１．０μｇのＤＨＥＢ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４６６（１９９３））を、ＳｃａＩ制限消化によって線状化した。続いて、インビトロ転写を、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を使用して実行した。得られた５’キャップｍＲＮＡを、還元アガロースゲル上で分析した。
【０１８７】
インビトロで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアルに従って、転写された５μｇのｍＲＮＡを、ＢＨＫ ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）にエレクトロポレーションした（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。３７℃で１０時間のインキュベーション後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含まないＨＰ−１培地で交換し、続いて３７℃で１０時間さらなるインキュベーションを行った。その上清を収集し、そしてＦＯＳ−ｈｇｈの産生についてドットブロット分析によって分析した。
【０１８８】
培養培地（２．５μｌ）を、ニトロセルロース膜上にスポットし、そして室温で１０分間乾燥させた。その膜を、ＴＢＳ（１リットルあたりの１０×ＴＢＳ：８７．７ｇ ＮａＣｌ、６６．１ｇ Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）、および９．７ｇ Ｔｒｉｚｍａベース（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１時間ブロックし、続いて１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ）中の、２μｇのウサギ抗ヒトｈＧＨ抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートした。そのブロットを、ＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、そしてＴＢＳ−Ｔ中で１：５０００希釈した、アルカリホスファターゼと結合体化した抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間、２回の洗浄およびＴＢＳでの１０分間、２回の洗浄の後、そのブロットを、実施例２に記載のようにＡＰ染色によって染色した。結果を図３に示す。
【０１８９】
（実施例９：ＦＯＳ−ＰＬＡ（Ｎ末端およびＣ末端）の構築）
ハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）の触媒的に不活性な改変体（Ｆｏｅｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９５：１２２９−１２３５（１９９５））をコードする以下の遺伝子を、化学的な遺伝子合成によって構築する。
【０１９０】
【化１３】
ＦＯＳ二量体化ドメインのＮ末端へのＰＬＡの融合のために、その領域を、オリゴヌクレオチドＰＬＡ−ＦＯＲ１（ＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣ）（配列番号４５）およびＰＬＡ−ＲＥＶ１（ＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧ）（配列番号４６）を使用して増幅する。そのＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩで切断し、そして制限酵素ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩで事前に切断したベクターｐＡＶＩに連結する。ＦＯＳ二量体化ドメインのＣ末端へのＰＬＡの融合のために、その領域をオリゴヌクレオチドＰＬＡ−ＦＯＲ２（ＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣ）（配列番号４７）およびＰＬＡ−ＲＥＶ２（ＴＴＡＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧ）（配列番号４８）を使用して増幅する。そのＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩで切断し、そして制限酵素ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶで事前に切断したベクターｐＡＶ２に連結する。
【０１９１】
（実施例１０）
（ＦＯＳ−オボアルブミン融合遺伝子（Ｎ末端およびＣ末端）の構築）
オボアルブミンコード配列のクローニングのために、ニワトリ卵管組織由来のｍＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＴＭ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、製造業者の説明書に従って使用して、調製する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、オボアルブミンの成熟部分をコードするｃＤＮＡ（そのｍＲＮＡのヌクレオチド６８〜１２２２に対応する（ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：７２３−７２８（１９７８））を、プライマーＯｖａ−ＦＯＲ１（ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧ）（配列番号４９）およびＯｖａ−ＲＥＶ１（ＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣ）（配列番号５０）を使用して合成する。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化し、そしてＣ末端でＦＯＳ二量体化ドメインを有する融合タンパク質の発現のために、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ消化したベクターｐＡＶ１にクローニングする。Ｎ末端でＦＯＳ二量体化ドメインを有する融合タンパク質の産生のために、オボアルブミンコード領域を、プライマーＯｖａ−ＦＯＲ２（ＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧ）（配列番号５１）およびＯｖａ−ＲＥＶ２（ＴＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣ）（配列番号５２）を使用して、その構築したベクター（ｐＡＶ：：Ｏｖａ）から増幅させる。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ消化したベクターｐＡＶにクローニングする。このクローニングしたフラグメントを、ＤＮＡ配列分析によって確認する。
【０１９２】
（実施例１１）
（ＦＯＳ−ＰＬＡおよびＦＯＳアルブミン融合タンパク質の産生および精製）
ＦＯＳ融合タンパク質の細胞質内産生のために、適切なＥ．ｃｏｌｉ株を、ベクターｐＡＶ３：：ＰＬＡ、ｐＡＶ４：：ＰＬＡ、ｐＡＶ３：：ＯｖａまたはｐＡＶ４：：Ｏｖａで形質転換した。この培養物を、アンピシリン存在下の富化培地中で、３７℃で振盪しながらインキュベートした。吸光度（５５０ｎｍ）１の時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、そしてインキュベーションをさらに５時間続けた。この細胞を遠心分離によって収集し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよびリゾチームを含む適切な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そしてフレンチプレッシャーセルを通過させて破壊した。遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｃ、ＳＳ３４ローター、１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、ペレットを、４℃で２５ｍｌの封入体洗浄緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２３％スクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁し、上記のように再度遠心分離した。この手順を、遠心分離後の上清が実質的に清澄になるまで繰り返した。封入体を、室温で２０ｍｌの可溶化緩衝液（５．５Ｍ 塩酸グアニジウム、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そして不溶性物質を、遠心分離、およびその後、上清を滅菌フィルター（０．４５μｍ）に通過させることによって、除去した。タンパク質溶液を、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ ＤＴＴの存在下で少なくとも１０時間、４℃で維持し、次いで１０容量の５．５Ｍ 塩酸グアニジウム、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６に対して３回透析した。この溶液を、適切な酸化還元混合物（ｒｅｄｏｘ ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下の５リットルの２Ｍ 尿素、４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）に対して２回透析した。次いで、この再折り畳みされたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにアプライした。このタンパク質を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴの存在下の７より大きいｐＨを有する適切な適切な緩衝液中で保存し、ＦＯＳドメインに隣接するシステイン残基を還元形態に維持した。タンパク質のアルファウイルス粒子との結合の前に、このタンパク質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラムに通すことによって、ＤＴＴを除去した。
【０１９３】
（実施例１２）
（ｇｐ１４０−ＦＯＳの構築）
内部プロテアーゼ切断部位を有さないｇｐ１４０遺伝子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０３３７５）を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、全長ｇｐ１６０遺伝子を含む元のプラスミドｐＡｂＴ４６７４（ＡＴＣＣ４０８２９）から、ＰＣＲによって増幅させた：
【０１９４】
【化１４】
ＰＣＲ Ｉについて、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−１およびＨＩＶ−Ｃｌｅａｖ２ならびに５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で２分間の伸長時間での３０サイクル。
【０１９５】
ＰＣＲ ＩＩについて、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−ｅｎｄおよびＨＩＶ−Ｃｌｅａｖならびに５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で５０秒間の伸長時間での３０サイクル。
【０１９６】
両方のＰＣＲフラグメントを精製し、単離し、そしてアセンブリＰＣＲ反応系において使用した。アセンブリＰＣＲ反応について、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ｅｎｄならびに２ｎｇの各ＰＣＲフラグメント（ＰＣＲ ＩおよびＰＣＲ ＩＩ）を、７５μｌの反応（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で２．５分間の伸長時間での３０サイクル。このアセンブリＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化した。ＦＯＳ両親媒性ヘリックスを、ｇｐ−１４０のＣ末端にインフレームで融合した。
【０１９７】
ＦＯＳ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ベクターｐＪｕＦｏ（Ｃｒａｍｅｒｉ＆Ｓｕｔｅｒ Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））からＰＣＲ増幅させた：
【０１９８】
【化１５】
このＰＣＲ反応について、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。温度サイクリングを以下のように行った：９５℃で２分間、その後の９５℃（４５秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（２５秒）の５サイクル、そしてその後の９５℃（４５秒）、６８℃（３０秒）、７２℃（２０秒）の２５サイクル。この得られたＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＢｓｐ１２０Ｌで消化した。
【０１９９】
ＧＰ１４０−ＦＯＳについての最終発現ベクターを、両ＰＣＲフラグメントのｐＳｉｎＲｅｐ５への３フラグメント連結で得た。この得られたベクターｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０−ＦＯＳを、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって評価した。
【０２００】
ＧＰ１４０−ＦＯＳをまた、安定な誘導性ＧＰ１４０−ＦＯＳ発現細胞株を得るために、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌ消化したｐＣＹＴｔｓにクローニングした。
【０２０１】
（実施例１３）
（ｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０ＦＯＳを使用するＧＰ１４０ＦＯＳの発現）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）（ｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０−ＦＯＳ）および１．０μｇのＤＨＥＢ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６（１９９３））を、制限消化によって直線化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を使用して、インビトロ転写を行った。この得られた５’キャップ化ｍＲＮＡを、還元性アガロースゲル上で分析した。
【０２０２】
インビトロ転写したｍＲＮＡ（５μｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアル（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）内にエレクトロポレートした。３７℃で１０時間のインキュベーション後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含まないＨＰ−１培地で交換し、その後さらに１０時間３７℃でインキュベートした。この上清を収集し、そして実施例２の記載のように正確に、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの産生についてウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２０３】
（実施例１４）
（ｐＣＹＴｔｓ−ＧＰ１４０ＦＯＳを使用するＧＰ１４０ＦＯＳの発現）
ｐＣＹＴｔｓ−ＧＰ１４０−ＦＯＳ ２０μｇを、制限消化によって直線化した。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出によって停止し、その後、この直線化ＤＮＡをイソプロパノール沈殿させた。この制限消化を、アガロースゲル電気泳動によって評価した。トランスフェクションのために、５．４μｇの直線化ｐＣＹＴｔｓＧＰ１４０−ＦＯＳを、３０μｌ Ｈ２Ｏ中の０．６μｇの直線化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５秒間ボルテックスし、その後、室温で２５秒間インキュベートした。この溶液を、２％ ＦＣＳを含む２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ ＦＣＳ培地）に直ちに添加した。次いで、８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養物の培地（６ウェルプレート）を、このＤＮＡ含有培地で置換した。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５時間のインキュベーション後、このＤＮＡ含有培地を除去し、そして２％ ＦＣＳ培地中の１５％グリセロール（２ｍＬ）で置換した。このグリセロール含有培地を、３０秒のインキュベーション段階の後で除去し、そしてこの細胞を、１０％ ＦＣＳを含む、５ｍｌのＨＰ−１培地でリンスすることによって洗浄した。最後に、１０％ ＦＣＳを含む、２ｍｌの新鮮ＨＰ−１培地を添加した。
【０２０４】
安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、選択培地（Ｇ４１８を補充したＨＰ−１培地）中で増殖させた。この混合集団がコンフルエントに増殖された時に、この培養物を２つの皿に分割し、その後、３７℃で１２時間増殖させた。一方の細胞の皿を３０℃に移動させて、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を誘導した。もう一方の皿は、３７℃で維持した。
【０２０５】
可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を、ウェスタンブロット分析によって決定した。培養培地（０．５ｍｌ）をメタノール／クロロホルム沈殿させ、そしてこのペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、その後１５％アクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質を、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９−５５頁に記載のように、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。この膜を、ＴＢＳ（１０×ＴＢＳ １リットルあたり：８７．７ｇ ＮａＣｌ ６６．１ｇ 塩酸Ｔｒｉｚｍａ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇのＴｒｉｚｍａ塩基（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１時間ブロックし、その後、抗ＧＰ１４０抗体または抗Ｇｐ−１６０抗体と共に１時間インキュベートした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）で１０分間、３回洗浄し、アルカリホスファターゼ抗マウス／ウサギ／サル／ヒトＩｇＧ結合体と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間の２回の洗浄およびＴＢＳでの１０分間の２回の洗浄後、アルカリホスファターゼ検出試薬（５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％ジメチルホルムアミド中の７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中の５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を含む１０ｍｌのＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を使用して、発色反応を行った。
【０２０６】
（実施例１５）
（ＧＰ１４０ＦＯＳの産生および精製）
抗ｇｐ１２０抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化デキストランに共有結合させ、そしてクロマトグラフィーカラムに充填した。ＧＰ１４０ＦＯＳを含む上清を、このカラム上にロードし、そして十分な洗浄後、ＧＰ１４０ＦＯＳを、０．１Ｍ ＨＣｌを使用して溶出した。この溶出物を、収集チューブ中の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２を用いて、収集中に直接中和した。
【０２０７】
ジスルフィド結合形成は、精製の間に生じ得、従って、この収集したサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３中の１０ｍＭ ＤＴＴで、２５℃で２時間処理した。
【０２０８】
ＤＴＴを、１０ｍＭ Ｍｅｓ；８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に対する、その後の透析によって除去した。最後に、Ｇｐ１４０ＦＯＳを、実施例１６の記載のように、Ｅ２においてＪＵＮロイシンジッパーを含むアルファウイルス粒子と混合した。
【０２０９】
（実施例１６）
（アルファワクチン粒子の調製）
１００ｋＤの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを、製造業者によって供給されるプロトコルに従って使用して、ウイルス粒子（実施例２および３を参照のこと）を濃縮した。あるいは、ウイルス粒子を、Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の説明マニュアルに記載のように、スクロース密度勾配遠心によって濃縮した。ウイルス懸濁液のｐＨを７．５に調整し、そしてウイルス粒子を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴの存在下で数時間インキュベートした。ウイルス粒子を、適切な緩衝液のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウイルス粒子を空隙容量で溶出する）上で、混在タンパク質から精製した。
【０２１０】
精製したウイルス粒子を、適切な酸化還元混合物（ｒｅｄｏｘ ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下の適切な緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）中で、少なくとも２４０倍モル過剰のＦＯＳ−抗原融合タンパク質と共に、４℃で少なくとも１０時間インキュベートした。１００ｋＤの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用して、この粒子を濃縮した後、この混合物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。ウイルス粒子を、空隙容量で溶出させた。
【０２１１】
（実施例１７：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のアミノ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、ＨＢｃＡｇアミノ酸配列１〜１４４のアミノ末端に融合した（ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ構築物）。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ ＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスおよびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いて、ｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）プライマーには、ＥｃｏＲＩ部位、次いで開始ＡＴＧコドンを導入した。ＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）プライマーには、アミノ酸配列ＧＡＡＧＳをコードするリンカーを導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）配列を、プライマーＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミド（ＡＴＣＣ番号３１５１８から得た）から増幅した。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、ＪＵＮヘリックスをコードする配列の３’末端に対応する配列、続いてＧＡＡＧＳリンカーをコードする配列およびＨＢｃＡｇ配列の５’末端を含む。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）に、ＨＢｃＡｇ遺伝子の後ろに終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物において使用する。両方の反応については、温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２１２】
【化１６】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより行った。１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。ＰＣＲサイクリング条件は、以下であった：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。最終的なＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、精製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液中で１６時間にわたり消化した。消化したＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析によりおよびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１３】
（実施例１８：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のカルボキシ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、ＨＢｃＡｇアミノ酸配列１〜１４４に融合した（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ構築物）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ ＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスおよびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いてｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、アミノ酸ＬＡＡＧをコードするリンカーを導入した。この配列はまた、ＳａｃＩＩ部位を含む。ＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）には、終止コドン（ＴＡＡ）、次にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）ＤＮＡ配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）には、ＨＢｃＡｇコード配列の開始ＡＴＧの前に、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）−ＪＵＮ（ａｓ）には、ペプチドリンカー（ＬＡＡＧ）をコードする配列を導入する。これはまた、ＳａｃＩＩ部位を含む。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物において使用した。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２１４】
【化１７】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより行った。ＰＣＲ融合については、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中の、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。ＰＣＲサイクリング条件は、以下であった：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。最終的なＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液中で１６時間にわたり消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析によりおよびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１５】
（実施例１９：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のｃ／ｅ１エピトープへのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの挿入）
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）は、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドの表面上の先端領域に位置することが公知である。タンパク質のこの領域の一部（残基７６〜８２）は、ＪＵＮヘリックスによって遺伝的に置換されて、抗原（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓ構築物）についての付着部位を提供した。このＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓ ＤＮＡ配列を、ＰＣＲにより生成した：ＪＵＮヘリックス配列および２つのＨＢｃＡｇフラグメント（アミノ酸残基１〜７５および８３〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＢａｍＨＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いてｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＢａｍＨＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、ペプチド配列ＧＳＧＧＧをコードするリンカー配列（ＢａｍＨＩ部位もまた含む）を導入した。ＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）には、ペプチドリンカー（ＧＡＡＧＳ）をコードする配列、次いで、ＪＵＮコード配列の３’末端に相補的な配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７５）ＤＮＡ配列を、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ７５−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）には、ＥｃｏＲＩ部位、次いで、ＨＢｃＡｇ配列の５’末端に対応する配列を導入した。ＨＢｃＡｇ７５−ＪＵＮ（ａｓ）には、ＨＢｃＡＧのアミノ酸７５の後にペプチドＧＳＧＧＧをコードするリンカー、次いで、ＪＵＮヘリックスをコードする配列の５’末端に相補的な配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）フラグメントを、プライマーＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ８３（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて増幅した。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ８３（ｓ）は、ＪＵＮコード配列の３’末端に対応する配列、次いで、ペプチドＧＡＡＧＳをコードするリンカー、およびＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）をコードする配列の５’末端に対応する配列を含んでいた。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）には、ＨＢｃＡＧ遺伝子のコドン１４４の後ろに、終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、５０μｌの反応混合物（２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４）において使用した。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。
【０２１６】
【化１８】
３つのＰＣＲフラグメントの融合を、以下のとおりに行った。最初に、ＨＢｃＡｇ１〜７５をコードするフラグメントを、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより、ＪＵＮをコードする配列と融合した。第２に、得られた産物を、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより、ＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）フラグメントと融合した。ＰＣＲ融合に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。同じＰＣＲサイクルを、個々のフラグメントの生成と同じように用いた。最終的なＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含有する適切な緩衝液中で１６時間消化した。ＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓベクターを得た。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１７】
（実施例２０：麻疹ウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質のカルボキシ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、アミノ酸残基１〜４７３を含む短縮化麻疹ウイルスＮタンパク質フラグメントのカルボキシ末端に融合した（Ｎ４７３−ＪＵＮ構築物）。Ｎ４７３−ＪＵＮをコードするＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスをコードする配列およびＮ４７３−ＪＵＮをコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、ペプチドリンカーＬＡＡＧをコードする配列を導入した。この配列はまた、ＳａｃＩＩ部位を含んでいた。ＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）アンチセンスプライマーには、終止コドン、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。Ｎ（１〜４７３）配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−Ｎｍｅａ（ｓ）およびＮｍｅａ−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、完全な麻疹ウイルスＮタンパク質コード配列を含むｐＳＣ−Ｎプラスミド（Ｍ．Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｚｕｒｉｃｈから得た）から増幅した。ＥｃｏＲＩ−Ｎ（ｍｅａ）（ｓ）には、Ｎコード配列の開始ＡＴＧの前にＥｃｏＲＩ部位を導入した。Ｎ（ｍｅａ）−ＪＵＮ（ａｓ）は、Ｎ（１〜４７３）コード配列の３’末端に相補的であり、次は、ペプチドリンカー（ＬＡＡＧ）についてのコード配列に相補的な配列であった。ＰＣＲ反応に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中で用いた。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５５℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。
【０２１８】
【化１９】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−Ｎｍｅａ（ｓ）およびＮｍｅａ−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、さらにＰＣＲにおいて行った。ＰＣＲ融合に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。温度サイクリングを、以下のとおりに行った：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含有する適切な緩衝液中で１６時間消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−Ｎ４７３−ＪＵＮプラスミドを得た。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１９】
（実施例２１）
（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの発現および部分的精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ ｂｌｕｅを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮで形質転換した。細菌の一晩の培養物１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）した。この培養物を、６００ｎｍでおよそ０．８のＯＤに達するまで、３７℃で４時間増殖させた。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの合成の誘導を、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することにより行った。誘導後、細菌を、３７℃で１６時間さらに振蕩した。細菌を、５０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。このペレットを、−２０℃で凍結した。このペレットを融解し、そして２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁した。細胞を、室温で３０分間インキュベートし、そしてＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌを使用して破壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、溶解物に添加して、０．２％の最終濃度にして、そしてこの溶解物を、氷上で３０分間インキュベートし、そして時々振蕩した。図４は、ＩＰＴＧでの誘導の際のＥ．ｃｏｌｉにおけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質発現を示す。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現プラスミドまたはコントロールプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現の誘導のために使用した。ＩＰＴＧの添加前に、サンプルを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮプラスミドを保有する細菌培養物（レーン３）から、およびコントロールプラスミドを保有する培養物（レーン１）から取り除いた。ＩＰＴＧ添加の１６時間後に、サンプルを再度、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを含む培養物（レーン４）から、およびコントロール培養物（レーン２）から除去した。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によってモニターした。
【０２２０】
次いで、この溶解物を、不溶性細胞片を除去するために、１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。この上清およびペレットを、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡから購入）を使用して、ウエスタンブロッティングにより分析した。これは、有意な量のＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質が可溶性であることを示した（図５）。簡潔には、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞からの溶解物、およびコントロール細胞からの溶解物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）およびペレット（＝不溶性画分）を分離し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等しい容量にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でのウエスタンブロッティングによって分析した。レーン１：可溶性画分、コントロール細胞；レーン２：不溶性画分、コントロール細胞；レーン３：可溶性画分、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを発現している細胞；レーン４：不溶性画分、ＨｂｃＡｇ−ＪＵＮを発現している細胞。
【０２２１】
清澄化した細胞溶解物を、３ｍｌの１５％スクロース溶液、続いて４ｍｌの細菌溶解物を重層した４ｍｌの６５％スクロース溶液からなる、スクロース段階的勾配を用いる、段階的勾配遠心分離に使用した。このサンプルを、１００，０００×ｇにて４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、この勾配の頂端から１ｍｌの画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によって分析した（図６）。レーン１：遠心分離前の総Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、レーン１および２：勾配の頂端からの画分１および２、レーン４〜７：画分５〜８（１５％スクロース）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質を、クーマシー染色によって検出した。
【０２２２】
ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質を、１５％スクロースと６５％スクロースとの間の界面に濃縮させた。このことは、このタンパク質がカプシド粒子を形成したことを示す。ほとんどの細菌タンパク質は、この勾配のスクロースを含まない上層に残存し、従って、ＨＢｃＡＧ−ＪＵＮ粒子の段階的勾配遠心分離は、この粒子を濃縮すること、および部分精製することの両方を導く。
【０２２３】
（実施例２２）
（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの共有結合）
ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子へのタンパク質を結合の実証するために、本発明者らは、そのカルボキシ末端がＦＯＳヘリックスに融合したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を、モデルタンパク質（ｈＧＨ−ＦＯＳ）として選択した。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子を、部分的に精製されたｈＧＨ−ＦＯＳと混合し、そして４℃で４時間インキュベートし、このタンパク質の結合を可能にした。次いで、この混合物を、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ溶液およびｈＧＨ−ＦＯＳ溶液の両方に存在するＤＴＴを除去するために、３０００倍容量の透析緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０））に対して一晩透析し、それによって、ジスルフィド結合の確立を通じて、タンパク質の共有結合を可能にする。コントロールとして、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ溶液およびｈＧＨ−ＦＯＳ溶液もまた、透析緩衝液に対して透析した。３つ全ての透析したタンパク質溶液からのサンプルを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの結合を、抗ｈＧＨイムノブロットにおいて検出した（図７）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮに結合したｈＧＨ−ＦＯＳは、およそ５３ｋＤａの見かけの分子量で移動するはずであり、一方、非結合ｈＧＨ−ＦＯＳは、３１ｋＤａの見かけの分子量で移動する。この透析液を、還元剤の非存在下（レーン３）、および還元剤の存在下（レーン２）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてクーマシー染色によって検出した。コントロールとして、カプシド粒子と混合されていないｈＧＨ−ＦＯＳもまた、還元剤の存在下でゲルにロードした（レーン１）。
【０２２４】
およそ５３ｋＤａの分子量へのｈＧＨ−ＦＯＳの変動を、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮカプシドタンパク質の存在下で観察した。このことは、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの効率的な結合が生じたことを示唆する。
【０２２５】
（実施例２３）
（ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）のｃ／ｅ１エピトープへのリジン残基を含むペプチドの挿入）
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面上の先端領域（ｔｉｐ ｒｅｇｉｏｎ）に配置した。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙによって遺伝的に置換した（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構築物）。この導入されたリジン残基は、遊離システイン基を含む任意の抗原を有するＨＢｃＡｇ粒子の分子間化学的架橋のために使用され得る反応性アミノ基を、その側鎖に含む。
【０２２６】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ ＤＮＡ配列を、ＰＣＲによって作製した：ＨＢｃＡｇフラグメントをコードする２つのフラグメント（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）を、ＰＣＲによって別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用されたプライマーもまた、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）フラグメントを、プライマーであるＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を使用して、ｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）フラグメントを、プライマーであるＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーであるＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、相補性ＤＮＡ配列を、２つのＰＣＲ産物の末端に導入し、このことは、その後のアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）ＰＣＲにおいて２つのＰＣＲ産物の融合を可能にした。アセンブリしたフラグメントを、プライマーＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０２２７】
ＰＣＲについては、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む５０μｌの反応混合物において使用した。両方の反応について、温度のサイクリングを、以下の通りに行った：９４℃で２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）を３０サイクル。
【０２２８】
（プライマー配列）
【０２２９】
【化２０】
ＰＣＲによる２つのＰＣＲフラグメントの融合のために、１００ｐｍｏｌのプライマーであるＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を、１００ｎｇの２つの精製されたＰＣＲフラグメントとともに、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む、５０μｌの反応混合物中で使用した。ＰＣＲサイクル条件は、以下であった：９４℃で２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）を３０サイクル。アセンブリされたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、精製し、そしてＥｃｏＲＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって、適切な緩衝液中で１９時間消化した。この消化されたＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクター中に連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを作製した。このベクターへのＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびこのインサートのＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２３０】
（実施例２４）
（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および部分精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ ｂｌｕｅを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。細菌の一晩の培養物１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に接種した。この培養物を、６００ｎｍでおよそ０．８のＯＤに達するまで、３７℃で４時間増殖させた。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘導を、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することにより行った。誘導後、細菌を、３７℃で１６時間さらに振蕩した。細菌を、５０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。このペレットを、−２０℃で凍結した。このペレットを融解し、そして２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁した。細胞を、室温で３０分間インキュベートし、そしてＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌを使用して破壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、溶解物に添加し、０．２％の最終濃度にして、そしてこの溶解物を、氷上で３０分間インキュベートし、そして時々振蕩した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたはコントロールプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現の誘導のために使用した。ＩＰＴＧの添加前に、サンプルを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを保有する細菌培養物から、およびコントロールプラスミドを保有する培養物から取り除いた。ＩＰＴＧ添加の１６時間後に、サンプルを再度、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含む培養物から、およびコントロール培養物から除去した。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くクーマシー染色によってモニターした。
【０２３１】
次いで、この溶解物を、不溶性細胞片を除去するために、１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。この上清およびペレットを、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡから購入）を使用して、ウエスタンブロッティングにより分析した。これは、有意な量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることを示す（図５）。簡潔には、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞からの溶解物、およびコントロール細胞からの溶解物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）およびぺレット（＝不溶性画分）を分離し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等しい容量にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でのウエスタンブロッティングによって分析した。
【０２３２】
清澄化した細胞溶解物を、３ｍｌの１５％スクロース溶液、続いて４ｍｌの細菌溶解物を重層した４ｍｌの６５％スクロース溶液からなる、スクロース段階的勾配を用いる、段階的勾配遠心分離に使用した。このサンプルを、１００，０００×ｇにて４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、勾配の頂端から１ｍｌの画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によって分析した（図６）。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質を、クーマシー染色によって検出した。
【０２３３】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質を、１５％スクロースと６５％スクロースとの間の界面に濃縮させた。このことは、このタンパク質がカプシド粒子を形成したことを示す。ほとんどの細菌タンパク質は、この勾配のスクロースを含まない上層に残存し、従って、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の段階的勾配遠心分離は、この粒子を濃縮すること、および部分精製することの両方を導く。
【０２３４】
（実施例２５）
（異種二機能性架橋剤ＳＰＤＰを用いるＦＬＡＧペプチドのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓへの化学的結合）
アミノ末端にシステイン残基を有する合成ＦＬＡＧペプチド（アミノ酸配列ＣＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、ＦＬＡＧペプチドに対する免疫応答を誘発するために、精製されたＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子に化学的に結合した。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の純度９５％の溶液（２ｍｇ／ｍｌ） ６００μｌを、異種二機能性架橋剤Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）（０．５ｍＭ）と共に３０分間室温でインキュベートした。反応の終了後に、遊離のＳＰＤＰを除くために、混合物を、１リットルの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する）に対して一晩透析した。次いで、５００μｌの誘導体化ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓカプシド（２ｍｇ／ｍｌ）を、金属触媒スフィドリル（ｓｕｆｈｙｄｒｙｌ）酸化を防ぐために１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で０．１ｍＭ ＦＬＡＧペプチド（アミノ末端システインを含む）と混合した。この反応を、ペプチドの遊離システインとの反応における、ＳＰＤＰからのピリミジン−２−チオン（ｔｈｉｏｎｅ）の遊離に起因する３４３ｎＭでの溶液の吸光度の増加により、モニターした。誘導体化Ｌｙｓ残基のペプチドとの反応は、約３０分後に終了した。
【０２３５】
ＦＬＡＧ装飾された粒子を、マウスに注射した。
【０２３６】
（実施例２６）
（ｐＭＰＳＶ−ｇｐ１４０ｃｙｓの構築）
ｇｐ１４０遺伝子を、オリゴｇｐ１４０ＣｙｓＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩｇｐ１４０を用いて、ｐＣｙｔＴＳｇｐ１４０ＦＯＳからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに関して、１００ｐｍｏｌのそれぞれのオリゴおよび５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、５０μｌの反応混合液（２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）中で使用した。両方の反応に対して、温度サイクルを以下のように実施した：９４℃を２分間；９４℃（０．５分間）、５５度（０．５分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２３７】
ＰＣＲ産物を、ＱｉａＥＸＩＩキットを用いて精製し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、そして同一の酵素で切断したベクターｐＭＰＳＶＨＥ中に連結した。（オリゴ配列）
【０２３８】
【化２１】
（実施例２７）
（ｐＭＰＳＶｇｐ１４０Ｃｙｓの発現）
ｐＭＰＳＶｇｐ１４０Ｃｙｓ（２０μｇ）を、制限消化によって直線化した。反応をフェノール／クロロホルム抽出によって停止し、その後直線化ＤＮＡをイソプロパノール沈殿する。制限消化を、アガロースゲル電気泳動により評価した。トランスフェクションのために、５．４μｇの直線化ｐＭＰＳＶｇｐ１４０−Ｃｙｓを、３０μｌの水中で０．６μｇの直線化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０５））の添加後に、この溶液を５秒間ボルテックスし、続いて室温で２５秒間インキュベーションした。この溶液に、２％ＦＣＳを含むＨＰ−１培地（２％ＦＣＳ培地）を２ｍｌ、直ちに添加した。次いで、８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養（６ウェルプレート）の培地を、ＤＮＡ含有培地に置き換えた。３７℃で５時間、ＣＯ２インキュベーター内でのインキュベートの後、ＤＮＡ含有培地を取り出し、２ｍｌの１５％グリセロール含有２％ＦＣＳ培地で置き換えた。グリセロール含有培地を、３０秒間のインキュベート相の後に取り出し、そしてこの細胞を、５ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＨＰ−１培地でのリンスにより洗浄した。最後に、２ｍｌの新鮮なＨＰ−１培地（１０％ＦＣＳを含む）を加えた。
【０２３９】
安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、そしてＣＯ２インキュベーター内で、選択培地（Ｇ４１８を補充したＨＰ−１培地）中で３７℃で増殖した。混合集団がコンフルエントまで増殖したとき、培養物を２つのディッシュに分配し、その後、３７℃で１２時間の増殖期間を続ける。細胞の一方のディッシュを３０℃に移動し、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を誘導させた。他方のディッシュを３７℃に維持した。
【０２４０】
可溶性ＧＰ１４０−Ｃｙｓの発現を、ウエスタンブロット分析によって解析した。培養培地（０．５ｍｌ）を、メタノール／クロロホルム沈殿し、そしてこのペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。サンプルを、９５℃で５分間加熱し、その後、１５％アクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９−５５頁）に記載されたように、タンパク質をＰｒｏｔａｎ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｉｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。この膜を、ＴＢＳ（１０×ＴＢＳ １リットルあたり、８７．７ｇ ＮａＣｌ、６６．１ｇ Ｔｒｉｚｍａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中に１％のウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で一時間ブロックした後、抗ＧＰ１４０抗体または抗ＧＰ１６０抗体を用いて一時間インキュベートした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１０分間３回洗浄し、アルカリホスファターゼ抗マウス／ウサギ／サル／ヒトＩｇＧ結合体を用いて一時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間２回、およびＴＢＳで１０分間２回洗浄した後、アルカリホスファターゼ検出試薬（５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％のジメチルホルムアミド中に７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中に５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を含む１０ｍｌのＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）を用いて現像反応を行った。
【０２４１】
（実施例２８）
（ｇｐ１４０Ｃｙｓの精製）
抗ｇｐ１２０抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化デキストランと共有結合し、そしてクロマトグラフィーカラムに充填した。ＧＰ１４０Ｃｙｓを含む上清をカラムにロードし、そして十分な洗浄後に、ＧＰ１４０Ｃｙｓを、０．１Ｍ ＨＣｌで溶出した。溶出物を、回収チューブ中の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）を用いて回収中に直接中和した。
【０２４２】
精製中に、ジスフィルド結合形成が形成し得、したがって、回収サンプルを、１０ｍＭのＤＴＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中）を用いて、２５℃で２時間処理する。
【０２４３】
ＤＴＴを、１０ｍＭ Ｍｅｓ；８０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対する引き続く分析によって除去する。最終的に、実施例１６に記載されるように、ＧＰ１４０Ｃｙｓを、Ｅ２中のＪＵＮ残基を含むアルファウイルス粒子と混合する。
【０２４４】
（実施例２９）
（ＰＬＡ２−Ｃｙｓの構築）
ＰＬＡ２遺伝子を、オリゴＥｃｏＲＩＰＬＡおよびオリゴＰＬＡ−Ｃｙｓ−ｈｉｎｄを用いて、ｐＡＶ３ＰＬＡｆｏｓからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲについて、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む５０μｌの反応混合液中で用いた。両反応について、温度サイクルを、以下のように行った：９４℃で２分間；９４℃（０．５分間）、５５℃（０．５分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２４５】
ＰＣＲ産物を、ＱｉａＥＸＩＩキットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同一の酵素で消化されたベクターｐＡＶ３に連結した。（オリゴ）
【０２４６】
【化２２】
（実施例３０）
（ＰＬＡ−ｃｙｓの発現および精製）
Ｃｙｓタグ化タンパク質の細胞質内産生のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ株をベクターｐＡＶ３：：ＰＬＡおよびｐＰＬＡ−Ｃｙｓを用いて形質転換した。培養物を、３７℃で振盪しながら、アンピシリン存在下の豊富な培地中でインキュベートした。培養物の吸光度（５５０ｎｍ）で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、インキュベーションをさらに５時間続けた。細胞を遠心分離によって回収し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよびリゾチームを含む適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そしてフレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を通す通過によって破壊した。遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｃ、ＳＳ３４ローター、１５，０００ｒｐｍで４℃１０分間）の後、ペレットを、４℃で２５ｍｌの封入体洗浄緩衝液（２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２３％ スクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８））中に再懸濁し、そして上記のように再遠心分離した。この手順を、遠心分離後の上清が本質的に清澄になるまで反復した。封入体を、２０ｍｌの可溶化緩衝液（５．５Ｍ 塩酸グアニジン、２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中に、室温で再懸濁し、そして不溶性の物質を、遠心分離および引き続く滅菌フィルター（０．４５μｍ）を通す上清の通過で除去した。タンパク質溶液を、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ ＤＴＴの存在下で、４℃で少なくとも１０時間維持し、次いで、１０容量の５．５Ｍ 塩酸グアニジン、２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６）に対して３回透析した。この溶液を、適切な酸化還元シャッフル（ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下で、５１２Ｍの尿素、４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）に対して２回透析した。次いで、再フォールディングタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。このタンパク質を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴ存在下で適切な緩衝液（ｐＨ７以上）中に保存し、システイン残基を還元型で保持した。このタンパク質とαウイルス粒子との結合の前に、ＤＴＴを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すタンパク質溶液の通過によって除去した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＣＹＴｔｓ：：Ｅ２ＪＵＮ発現ベクターを使用するＥ２−ＪＵＮ融合タンパク質を含むウイルス粒子の産生を示すウエスタンブロット。
【図２】 ｐＴＥ５’２Ｊ：：Ｅ２ＪＵＮ発現ベクターから発現されるＥ２−ＪＵＮ融合タンパク質を含むウイルス粒子の産生を示すウエスタンブロット。
【図３】 ＦＯＳ−ｈｇｈ抗原の細菌発現および真核生物発現を示すウエスタンブロット。
【図４】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの発現。
【図５】 ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮがＥ．ｃｏｌｉ溶解物に可溶性であることを示すウエスタンブロット。
【図６】 スクロース密度勾配におけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮキャプシド粒子の濃縮のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図７】 ｈＧＨ−ＦＯＳ粒子およびＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子の結合の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイを含む組成物を提供する。本発明はまた、順序付けられそして反復性のアレイにおいて抗原または抗原決定基を生成するためのプロセスを提供する。この順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基は、感染性疾患の処置、アレルギーの処置のためのワクチンの産生において、そして癌を予防または治療するための、および規定された自己特異的抗体を作製するためのファルマシン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅ）として有用である。
【０００２】
（関連技術）
感染性疾患の予防のためのワクチンの開発は、任意の医学的発明のヒトの健康に対して最大の影響を有した。１年あたり３００万人の死亡が、ワクチン接種によって世界中で予防されると見積もられている（Ｈｉｌｌｅｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：５０７（１９９８））。最も通常のワクチン接種ストラテジーである、弱毒化（すなわち、毒性が低い）病原体または近縁の生物の使用は、危険性がより低い牛痘ウイルスの投与によって天然痘に対してワクチン接種したＥｄｗａｒｄ Ｊｅｎｎｅｒによって１７９６年に最初に実証された。多数の生弱毒化ウイルス（例えば、麻疹、おたふくかぜ、風疹、水痘、アデノウイルス、ポリオ、インフルエンザ）および細菌（例えば、結核に対しての桿菌Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））がワクチン接種について好首尾に投与されているが、「ワクチン」生物、特に免疫無防備状態の個体により毒性および感染へと後転することに関連した重篤な合併症を発症する危険性が存在する。
【０００３】
弱毒化ウイルスの具体的設計は、欠失改変体または変異改変体の作製を介する組換えＤＮＡ技術（すなわち、遺伝子操作）によって現在可能にされている。例えば、ｎｅｆ遺伝子内に欠失を有する、操作されたサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の投与は、マカクがその後の病原性ＳＩＶ株での感染から保護されることを示した（Ｄａｎｉｅｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１９３８−１９４１（１９９２））。しかし、弱毒化ＳＩＶを投与した動物における後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）様症状の進行は、安全性の懸念を生じる（Ｂａｂａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１８２０−１８２５（（１９９５））。
【０００４】
代替的なアプローチとして、弱毒化ウイルスまたは細菌が、弱毒化形態で投与するにはあまりにも危険すぎると考えられる病原体（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））の抗原コード遺伝子についてのキャリアとして用いられ得る。宿主への抗原コード遺伝子の送達の際に、この抗原は、インサイチュで合成される。ワクシニアおよび関連のアビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓｅ）は、種々の疾患についての前臨床研究および臨床研究において種々の遺伝子についてのこのようなキャリアとして用いられている（例えば、Ｓｈｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４４０（１９９１））。このワクチン接種ストラテジーの１つの欠点は、これがビリオンの表面を模倣しないことである。なぜなら、この組換え型タンパク質は、宿主細胞の表面で発現されるからである。さらに、合併症は、生命を脅かす播種性ワクシニア感染によって証明されたように、免疫無防備状態の個体において発症し得る（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ ３１６：６７３（（１９９８））。
【０００５】
第４のワクチン接種アプローチは、インビトロで増殖させた病原体（例えば、インフルエンザ血球凝集素またはノイラミニダーゼ）から精製されたかまたは単一のウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原）の異種発現後に発現されたかのいずれかの、単離された病原体成分の使用を含む。例えば、組換え型の、変異した毒素（無毒化された）は、ジフテリア、破傷風、コレラおよび百日咳の毒素に対するワクチン接種のために用いられ（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第２版，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７）、そしてＨＩＶの組換え型タンパク質（ｇｐ１２０および全長ｇｐ１６０）を、ＨＩＶに対する中和抗体を誘導する手段として評価し、失望した結果となった（Ｃｏｎｎｏｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１５５２（１９９８））。近年、ＨＩＶ−１単離体に対するＣＴＬ応答を誘導し得、そしてＨＩＶ−１単離体に対する中和活性を有する惹起し得る、可溶性オリゴマーｇｐ１６０を用いて有望な結果が得られた（Ｖａｎ Ｃｏｒｔｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４３１９（１９９７））。さらに、抗原の公知のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが、Ｔ細胞の助けを刺激することによりエピトープの免疫原性を増加させるように設計されたキャリア分子に結合されている、ペプチドワクチンが用いられ得る。しかし、このアプローチに伴う１つの重大な問題は、このアプローチが、全体としてこのタンパク質に対して制限された免疫応答しか提供しないことである。さらに、ワクチンは、異なるＭＨＣハプロタイプについて個々に設計されなければならない。この型のワクチンについての最も深刻な懸念は、防御性抗ウイルス抗体が、ペプチドによって模倣され得ない、複雑な三次元構造を認識することである。
【０００６】
より新規のワクチン接種ストラテジーは、ＤＮＡワクチンの使用であり（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７（１９９７））、これは、（生ベクターを使用することなく）ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を生じ得る。これは、同じウイルスの多くの株に不変の保存された内部タンパク質由来のエピトープを標的化することにより、異なる株のウイルスに対する、より広範な防御を提供し得る。この抗原は、哺乳動物の翻訳後修飾、コンホメーションおよびオリゴマー形成を有して生成されるので、組換え型または化学的に改変されたタンパク質よりも、ウイルス感染によって生成される野生型タンパク質に類似するかまたは同一である可能性がより高い。しかし、この区別は、細菌抗原の適用については欠点となり得る。なぜなら、非ネイティブ翻訳後修飾が、減少した免疫原性を生じ得るからである。さらに、ウイルス表面タンパク質は、マトリックスタンパク質の非存在下において高度に組織化されない。
【０００７】
感染性疾患の予防のための適用に加えて、ワクチン技術は、アレルギーと関連した免疫の問題と取り組むために現在利用される。アレルギー個体では、ＩｇＥアイソタイプの抗体は、特定の抗原（アレルゲン）に向けての不適切な体液性免疫応答において生成される。アレルギー免疫治療によるアレルギーの処置は、３〜５年までの期間にわたる、連続して漸増する用量の特定のアレルゲンの毎週の投与を必要とする。おそらく、脂肪細胞上のＩｇＥ抗体と反応する前に、鼻分泌物または呼吸分泌物中または膜中のアレルゲンを遮断する、「ブロッキング」ＩｇＧ抗体が生成される。しかし、ＩｇＧ力価と症状の軽減との間に一定の関係は存在しない。おそらく、これは、極めて時間がかかりかつコストのかかるプロセスであり、長期にわたって重篤な症状を有する患者について毎年でしか考えられない。
【０００８】
精製されたタンパク質の単独投与は、強力な免疫応答を惹起するに通常充分でないことが充分に確立されている；単離された抗原は一般に、アジュバントと呼ばれるヘルパー物質と一緒に与えられねばならない。これらのアジュバント内では、投与された抗原は、迅速な分解から保護され、そしてアジュバントは、低レベルの抗原の長期の放出を提供する。
【０００９】
単離されたタンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けを伴って、または伴わずにの両方で、任意のアジュバントの非存在下で迅速かつ効率的な免疫応答を誘導する（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウイルスはしばしばほんの少数のタンパク質からなっているが、これらは、単離された成分よりもずっと強力な免疫応答を誘発し得る。Ｂ細胞応答に関しては、ウイルスの免疫原性についての１つの重大な因子が、表面エピトープの反復性および順番であることが公知である。多くのウイルスは、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンを効率的に架橋するエピトープの規則的アレイを提示する準結晶表面を示す（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３−５５８（１９９６））。Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期進行およびＩｇＭ抗体の生成を直接誘導する、強力な活性化シグナルである。さらに、このような誘発されたＢ細胞は、Ｔヘルパー細胞を活性化し得、これは次にＢ細胞におけるＩｇＭ抗体生成からＩｇＧ抗体生成へのスイッチおよび長期に生存するＢ細胞記憶の生成を誘導する（任意のワクチン接種の目的）（ＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウイルスの構造は、自己免疫疾患における抗抗体の生成に均一に結びつけられ、そして病原体に対する自然な応答の一部である（Ｆｅｈｒ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８５：１７８５−１７９２（１９９７）を参照のこと）。従って、順序付けられかつ反復性のアレイにおいて組織化されたウイルス粒子上の抗原は、非常に免疫原性である。なぜなら、これらは、Ｂ細胞を直接活性化し得るからである。
【００１０】
強力なＢ細胞応答に加えて、ウイルス粒子はまた、免疫系の別の重要なアームである、細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成を誘導し得る。これらの細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＩＶまたはＢ型肝炎ウイルスのような非細胞変性性ウイルスの除去のために、および腫瘍の根絶のために特に重要である。細胞傷害性Ｔ細胞は、ネイティブな抗原を認識しないが、むしろ、ＭＨＣクラスＩ分子と会合したそれらの分解産物を認識する（ＴｏｗｎｓｅｎｄおよびＢｏｄｍｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１−６２４（１９８９））。マクロファージおよび樹状細胞は、内因性ウイルス粒子を取り込み得、そしてプロセシングし得（しかし、それらの可溶性の単離された成分はそうでない）、そして生成された分解産物を細胞傷害性Ｔ細胞に対して提示し得、それらの活性化および増殖をもたらす（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３）；Ｂａｃｈｍａｎｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２５９５−２６００（１９９６））。
【００１１】
抗原としてのウイルス粒子は、それらの単離された成分に対して２つの利点を示す：（１）それらの高度の反復表面構造に起因して、これらは、Ｂ細胞を直接活性化し得、高い抗体力価および長期に永続するＢ細胞記憶をもたらす；および（２）ウイルスが非感染性であり、そしてアジュバントが存在しなくとも、ウイルス粒子は細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し得るが、可溶性タンパク質は誘導し得ない。
【００１２】
いくつかの新たなワクチンストラテジーは、ウイルスの固有の免疫原性を利用する。これらのアプローチのうちのいくつかは、ウイルス粒子の粒子状の性質に焦点を当てる；例えば、ラテックスビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．およびＳｏｎｇ，Ｒ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４９２５（１９９４））；酸化鉄ビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４９４２−４９４６（１９９３））；抗原で被覆したコア粒子を開示する、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ，Ｎ．らに対する米国特許第５，３３４，３９４号；表面に共有結合した１以上のタンパク質を表面に保有する合成ポリマー粒子を開示する、米国特許第５，８７１，７４７号；ならびにコア粒子の表面を少なくとも部分的に被覆する非共有結合した被覆および被覆したコア粒子と接触している少なくとも１つの生物学的活性剤を有するコア粒子（例えば、ＷＯ／９４／１５５８５を参照のこと）を参照のこと。
【００１３】
しかし、これらのウイルス模倣システムの欠点は、ウイルス表面に見出される、順序付けられた抗原提示を回復できないことである。ランダムな方向で表面に結合された抗原は、ＣＴＬ応答を誘導し、Ｂ細胞応答を全く誘導しないかまたは弱くしか誘導しないことが見出されている。効果的なワクチンについては、上記およびＢａｃｈｍａｎｎおよびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５（１９９７）に記載されるように、免疫系の両方のアームが強力に活性化されなければならない。
【００１４】
別の例では、組換えウイルスは、抗原送達のために利用される。カプシドタンパク質に融合された抗原を含む糸状ファージウイルスは、非常に免疫原性であることが見出された（Ｐｅｒｈａｍ Ｒ．Ｎ．ら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７：２５−３１（１９９５）；Ｗｉｌｌｉｓら，Ｇｅｎｅ １２８：８５−８８（１９９３）；Ｍｉｎｅｎｋｏｖａら，Ｇｅｎｅ １２８：８５−８８（１９９３）を参照のこと）。しかし、この系は、融合タンパク質が高レベルで発現される場合（Ｉａｎｎｏｌｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：８３５−８４４（１９９５））に非常に小さなペプチド（５または６アミノ酸残基）に制限されるか、またはより大きなタンパク質の低レベルの発現に制限される（ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４３１８−４３２２（１９８８））。低分子ペプチドについては、これまでＣＴＬ応答しか観察されておらず、そしてＢ細胞応答は観察されていないかまたは弱くしか観察されていない。
【００１５】
なお別の系では、組換えアルファウイルスは、抗原送達の手段として提唱される（米国特許第５，７６６，６０２号；同第５，７９２，４６２号；同第５，７３９，０２６号；同第５，７８９，２４５号および同第５，８１４，４８２号を参照のこと）。これまでに記載された組換えウイルス系に伴う問題としては、ウイルス表面上での異種タンパク質の低密度発現および／または異なる適用のために新規でかつ異なる組換えウイルスを好首尾にかつ反復して作製することの困難性が挙げられる。
【００１６】
さらなる開発では、ワクチン生成の領域においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が利用される。なぜなら、それらの構造特性および非感染性性質の両方のためである。ＶＬＰは、対称様式で、１以上の型の多くのタンパク質分子から構築されたスーパー分子（ｓｕｐｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ）構造である。これらはウイルスゲノムを欠き、それゆえ、非感染性である。ＶＬＰはしばしば、異種発現によって大量に生成され得、そして容易に精製され得る。
【００１７】
ＶＬＰの例としては、以下のウイルスのカプシドタンパク質が挙げられる：Ｂ型肝炎ウイルス（Ｕｌｒｉｃｈら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５０：１４１−１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（Ｗａｒｎｅｓら，Ｇｅｎｅ １６０：１７３−１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および同第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１６０３−１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１５８０−１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．，ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６−１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９６／３０５２３号）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ ９２／１１２９１）およびヒトパピローマウイルス（ＷＯ ９８／１５６３１）。いくつかの例では、組換え型ＤＮＡ技術は、ＶＬＰタンパク質に対して異種タンパク質を融合するために利用され得る（Ｋｒａｔｚ，Ｐ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１９１５１９２０（１９９９））。
【００１８】
従って、当該分野において、天然の病原体と同等に効率的な、強力なＣＴＬおよびＢ細胞免疫応答を促進する、新規でかつ改善されたワクチンの開発についての必要性が存在する。
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、任意の所望の抗原で被覆された粒子の産生が可能な、新たな融通が利く技術を提供する。この技術は、感染性疾患に対して高度に効果的なワクチンの作製ならびにアレルギーおよび癌の処置のためのワクチンの作製を可能にする。
【００２０】
第１の実施形態において、本発明は、以下を含む新規な化合物を提供する：（Ａ）非天然の分子足場、および（Ｂ）抗原または抗原決定基。
【００２１】
非天然の分子足場は、以下を含む：（ｉ）（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される、コア粒子；ならびに（ｉｉ）少なくとも１つの第１付着部位を含む形成体であって、少なくとも１つの共有結合によって上記のコア粒子に連結されている、形成体。
【００２２】
抗原または抗原決定基は、少なくとも１つの第２付着部位を有し、この部位は、以下からなる群より選択される：（ｉ）その抗原または抗原決定基とともには天然に存在しない、付着部位；および（ｉｉ）その抗原または抗原決定とともに天然に存在する、付着部位。
【００２３】
本発明は、少なくとも１つの非ペプチド結合による第１付着部位への第２付着部位の結合を介する順序づけられかつ反復性の抗原アレイを提供する。従って、抗原または抗原決定基と非天然の分子足場は、第１付着部位および第２付着部位のこの結合を通じて一緒にされて、順序づけられかつ反復性の抗原アレイを形成する。
【００２４】
別の実施形態において、前述の組成物のコア粒子は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、ウイルスキャプシド粒子、またはそれらからの組換え体を含む。あるいは、このコア粒子は、合成ポリマーまたは金属であり得る。
【００２５】
特定の実施形態において、形成体は、少なくとも１つの第１付着部位を含み得る。第１付着部位および第２付着部位は、本発明の組成物の特に重要なエレメントである。本発明の種々の実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下であり得る：抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；ビオチンおよびアビジン；ストレプトアビジンおよびビオチン；レセプターおよびそのリガンド；リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；アミノ基およびそれに反応する化学基；カルボキシル基およびそれに反応する化学基；スルフヒドリル基およびそれに反応する化学基；またはこれらの組み合わせ。
【００２６】
より好ましい実施形態において、本発明は、選択されたほとんどの任意の抗原の、ウイルス、バクテリオファージ、ウイルス様粒子またはウイルスキャプシド粒子の表面への結合を提供する、抗原を準結晶（ｑｕａｓｉ−ｃｒｙｓｔａｌｌｎｅ）「ウイルス様」構造にすることによって、本発明は、提示された抗原に対する高度に有効な免疫応答の産生（すなわち、ワクチン接種）のための宿主の強力な抗ウイルス免疫反応を開発する。
【００２７】
１つの好ましい実施形態において、コア粒子は、以下からなる群より選択され得る：ロタウイルスの組換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ）ウイルスの組換えタンパク質、およびヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、抗原は、以下からなる群より選択され得る：（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；（２）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するに適したタンパク質；および（４）家畜における免疫応答を誘導するに適したタンパク質。
【００２９】
本発明の特に好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む。最も好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下からなる群より選択される：（１）ＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメイン；および（２）ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメイン。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、第１付着部位および／または第２付着部位は、以下からなる群より選択される：（１）遺伝子操作されたリジン残基、および（２）遺伝子操作されたシステイン残基。これらの２つの残基は、ともに化学的に連結され得る。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、本発明の組成物の産生のためのプロセス、およびこの組成物を使用する医療処置の方法を含む。
【００３２】
前述の一般的な記載および以下の詳細な説明の両方は、模範的および説明的であるのみであること、そして特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図されることが、理解されるべきである。
【００３３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（１．定義）
以下の定義は、本発明者らが本発明であること考慮する主題を明確にするために提供される。
【００３４】
（アルファウイルス）：本明細書中で使用される場合、用語「アルファウイルス」とは、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属内に含まれる任意のＲＮＡウイルスをいう。この属のメンバーの記載は、ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２（１９９４）に含まれる。アルファウイルスの例としては、以下があげられる：アウラウイルス、ベバルウイルス、キャバッソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングンヤウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルスクイジラガッハウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス、ミッデルブルグウイルス、ムカンボウイルス、ヌヅムウイルス、ピクスナウイルス、トネートウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トリニティウイルス、ユナウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロワウイルス、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ），およびロスリバーウイルス。
【００３５】
（抗原）：本明細書中で使用される場合、用語「抗原」とは、抗体によって結合され得る分子である。抗原は、さらに、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導して、Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の産生をもたらし得る。抗原は、１以上のエピトープ（ＢエピトープおよびＴエピトープ）を有し得る。上記に言及される特定の反応は、抗原が、高度に選択的な様式で、その対応する抗体とは反応するが、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことが意味される。
【００３６】
（抗原決定基）：本明細書中で使用される場合、用語「抗原決定基」とは、Ｂリンパ球またはＴリンパ球のいずれかによって特異的に認識される抗原の部分をいうことが意味される。Ｂリンパ球は抗体産生を介して外来抗原決定基に応答するのに対し、Ｔリンパ球は、細胞性免疫のメディエータである。従って、抗原決定基またはエピトープは、抗体によって、またはＭＨＣの文脈においてはＴ細胞レセプターによって認識される抗原の部分である。
【００３７】
（結合）：本明細書中で使用される場合、第１付着部位および第２付着部位に適用されるような用語「結合」とは、少なくとも１つの非ペプチド結合をいうために使用される。結合の性質は、共有、イオン性、疎水性、極性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３８】
（付着部位、第１）：本明細書中で使用される場合、句「第１付着部位」とは、非ランダム様式でコア粒子にそれ自体が結合された「形成体」のエレメントをいい、この部位に、抗原または抗原決定基に位置する第２付着部位が結合し得る。第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学的に反応な基であり得る。複数の第１付着部位が、反復性の立体配置にて、非天然の分子足場の表面に存在する。
【００３９】
（付着部位、第２）：本明細書中で使用される場合、句「第２付着部位」とは、非天然分子足場の表面上に位置する「形成体」の第１付着部位が結合し得る抗原または抗原決定基と結合したエレメントをいう。抗原または抗原決定基の第２着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝産物もしくは化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学的に反応な基であり得る。少なくとも１つの第２付着部位が、抗原または抗原決定基に存在する。
【００４０】
（コア粒子）：本明細書中で使用される場合、用語「コア粒子」とは、「形成体」の付着のための基礎を提供する固有の反復性較正を有する剛性構造をいう。本明細書中で使用されるようなコア粒子は、合成プロセスの産物であってもよいし、生物学的プロセスの産物であってもよい。
【００４１】
（シス作用性）：本明細書中で使用される場合、句「シス作用性」配列とは、レプリカーゼが結合してＲＮＡ分子のＲＮＡ依存性複製を触媒する、核酸配列をいう。これらの複製事象は、全長ＲＮＡ分子および部分ＲＮＡ分子の複製を生じ、従って、アルファウイルスサブゲノムプロモーターはまた、「シス作用性」配列である。シス作用性配列は、核酸分子の５’末端、３’末端またはその両末端に位置しての、またはその付近に位置しても、そして内部に位置してもよい。
【００４２】
（融合）：本明細書中で使用される場合、用語「融合」とは、それらのコードヌクレオチド配列のインフレームの組み合わせによる１つのポリペプチド鎖における異なる起源のアミノ酸配列の組み合わせをいう。用語「融合」は、その末端の１つへの融合に加えて、内部融合（すなわち、ポリペプチド鎖内での異なる起源の配列の挿入）を明示的に包含する。
【００４３】
（異種配列）：本明細書中で使用される場合、用語「異種配列」とは、本発明のベクターに存在する第２のヌクレオチド配列をいう。用語「異種配列」とはまた、本発明のベクターに含まれる異種ＤＮＡ配列によってコードされる任意のアミノ酸配列またはＲＮＡ配列をいう。異種ヌクレオチド配列は、それらが存在する細胞型において通常発現されるタンパク質またはＲＮＡ分子あるいは、その細胞壁では通常発現されない分子（例えば、シンドビス構造タンパク質）をコードし得る。
【００４４】
（単離された）：本明細書中で使用される場合、用語「単離された（されている）」が分子を参照して使用される場合、この用語は、その分子がそのネイティブ環境から取り除かれたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」。さらに、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されるとみなされる。単離されたＲＮＡ分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ複製産物を含む。単離された核酸分子はさらに、合成的に産生された分子を含む。さらに、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子もまた、単離されている。従って、全ての「単離された」分子が「精製されている」必要があるとは限らない。
【００４５】
（免疫治療剤）：本明細書中で使用される場合、用語「免疫治療剤」とは、疾患または障害の処置のための組成物である。より詳細には、この用語は、アレルギーの処置の方法または癌の処置の方法をいうために使用される。
【００４６】
（個体）：本明細書中で使用される場合、用語「個体」とは、多細胞生物をいい、そして植物および動物の両方を含む。好ましい多細胞生物は動物であり、より好ましくは脊椎動物であり、さらにより好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００４７】
（低いまたは検出不可能）：本明細書中で使用される場合、句「低いまたは検出不可能」とは、遺伝子の発現レベルに関して使用される場合、遺伝子が最大に誘導されるときに見られるより有意に低い（例えば、少なくとも５分の１）か、または以下の実施例の節で使用される方法によって容易には検出可能ではないかのいずれかである、発現のレベルをいう。
【００４８】
レクチン：本明細書中で使用される場合、マメ科植物の種から特に得られるが、多くの他の植物供給源および動物供給源からもまた得られる、タンパク質であり、特定の単糖またはオリゴ糖への結合部位を有する。例としては、コンカナバリンＡおよびコムギ胚芽凝集素が挙げられ、これらは、糖タンパク質の研究において、分析薬剤および調製薬剤として広く使用される。
【００４９】
天然起源：本明細書中で使用される場合、用語「天然起源」とは、その全体または一部が、合成的ではなく、そして天然に存在するかまたは天然にて生成されることを、意味する。
【００５０】
非天然：本明細書中で使用される場合、この用語は、一般的には、天然由来でないことを意味し、より詳細には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
【００５１】
非天然起源：本明細書中で使用される場合、用語「非天然起源」は、一般的には、合成的であることまたは天然由来でないことを意味し、より詳細には、この用語は、ヒトの手によることを意味する。
【００５２】
非天然の分子足場：本明細書中で使用される場合、句「非天然の分子足場」とは、第１の付着部位の固定した反復性のアレイを提供するように役立ち得る、ヒトの手によって作製された任意の産物をいう。必ずではないが理想的には、これらの第１の付着部位は、幾何学的順序になっている。この非天然の分子足場は、有機物であっても非有機物であってもよく、そして部分的にかまたは全体として、化学的に合成されても生物学的プロセスを介して合成されてもよい。この非天然の分子足場は、以下から構成される：（ａ）コア粒子（天然起源または非天然起源のいずれかである）；および（ｂ）形成体（それ自体が、少なくとも１つの第１の付着部位を含み、そして少なくとも１つの共有結合によってコア粒子に結合している）。特定の実施形態において、この非天然の分子足場は、ウイルスでも、ウイルス様粒子でも、ウイルスキャプシド粒子でも、ファージでも、その組換え形態でも、または合成ペプチドであってもよい。
【００５３】
順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイ：本明細書中で使用される場合、用語「順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイ」とは、一般的には、抗原または抗原決定基の反復性パターンをいい、足場に関して、その抗原または抗原決定基の均一な空間配置によって特徴付けられる。本発明の１つの実施形態において、この反復性パターンは、幾何学的パターンであり得る。理想の順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイは、５〜１５ナノメーターの間隔で、抗原または抗原決定基の厳密に反復性の準結晶性の序列を保有する。
【００５４】
形成体：本明細書中で使用される場合、用語「形成体」とは、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを作製するための核生成部位を提供する、ランダムでない様式でコア粒子に結合したエレメントをいうために使用される。形成体は、少なくとも１つの共有結合によりコア粒子に結合した、少なくとも１つの第１の付着部位を含む、任意のエレメントである。形成体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、タンパク質の残基、ポリペプチドの残基、またはペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーまたは合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、あるいはそれらの組み合わせ、あるいはそれらの化学反応基であり得る。
【００５５】
許容温度：本明細書中で使用される場合、句「許容温度」とは、酵素が、比較的高レベルの触媒活性を有する温度をいう。
【００５６】
精製された：本明細書中で使用される場合、用語「精製（された）」が分子に関して使用される場合、この用語は、精製される分子の濃度が、その分子の天然の環境中にてその分子と結合している分子と比較して、増加したことを意味する。天然に結合した分子とは、タンパク質、核酸、脂質および糖を含むが、一般的には、精製される分子の完全性を維持するためまたは精製を容易にするために添加された、水、緩衝液、および試薬を含まない。例えば、ｍＲＮＡが、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィーの間に水性溶媒で希釈されるとしても、天然に結合した核酸および他の生物学的分子がカラムに結合せず、そして対象ＲＮＡ分子から分離している場合は、ｍＲＮＡ分子は、このクロマトグラフィーにより精製される。
【００５７】
レセプター：本明細書中で使用される場合、用語「レセプター」とは、別の分子（リガンドと呼ばれる）と相互作用し得る、タンパク質または糖タンパク質、あるいはそれらのフラグメントをいう。このリガンドは、どの種類の生化学的化合物または化学的化合物にも属し得る。このレセプターは、必ずしも、膜結合タンパク質であることを必要とはしない。可溶性タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質またはレチノール結合タンパク質のようなもの）は、同様にレセプターである。
【００５８】
残基：本明細書中で使用される場合、用語「残基」とは、ポリペプチド骨格または側鎖における、特定のアミノ酸を意味することが、意味される。
【００５９】
温度感受性：本明細書中で使用される場合、句「温度感受性」とは、１つの温度で反応を容易に触媒するが、別の温度では、同じ反応を遅く触媒するか、または全く触媒しない、酵素をいう。温度感受性酵素の例は、ｐＣＹＴｔｓベクターによりコードされるレプリカ−ゼタンパク質であり、これは、３４℃より下の温度にて、容易に検出可能なレプリカ−ゼ活性を有し、そして３７℃にて、低い活性または検出不能な活性を有する。
【００６０】
転写：本明細書中で使用される場合、用語「転写」とは、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡ分子の生成をいう。
【００６１】
組換え宿主細胞：本明細書中で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」とは、本発明の１つ以上の核酸分子が導入された、宿主細胞をいう。
【００６２】
組換えウイルス：本明細書中で使用される場合、句「組換えウイルス」とは、ヒトの手によって遺伝子改変されたウイルスをいう。この句は、当該分野で公知の任意のウイルスを包含する。より詳細には、この句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたアルファウイルスをいい、そして最も詳細には、この句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたシンドビス（Ｓｉｎｂｉｓ）ウイルスをいう。
【００６３】
制限温度：本明細書中で使用される場合、句「制限温度」とは、酵素が、低いレベルまたは検出不能なレベルの触媒活性を有する温度をいう。「熱さ」感受性変異体および「冷たさ」感受性変異体の両方が公知であり、従って、制限温度は、許容温度より高くても低くてもよい。
【００６４】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象：本明細書中で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製事象」とは、ＲＮＡ分子をテンプレートとして使用して、ＲＮＡ分子の形成を生じる、プロセスをいう。
【００６５】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ：本明細書中で使用される場合、句「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、別のＲＮＡ分子からのＲＮＡ分子の生成を触媒する、ポリメラーゼをいう。この用語は、本明細書中において、用語「レプリカ−ゼ」と同義に使用される。
【００６６】
非翻訳ＲＮＡ：本明細書中で使用される場合、句「非翻訳ＲＮＡ」とは、オープンリーディングフレームをコードしないか、またはオープンリーディングフレームまたはその一部をコードするが、アミノ酸配列が生成しない様式（例えば、開始コドンが存在しない）でコードする、ＲＮＡ配列またはＲＮＡ分子をいう。このような分子の例は、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、およびリボソームである。
【００６７】
ベクター：本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、宿主細胞に遺伝子物質を伝達するために使用される因子（例えば、プラスミドまたはウイルス）をいう。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成され得る。
【００６８】
１つの、ａ、またはａｎ：用語「１つの」、「ａ」、または「ａｎ」が、本開示にて使用される場合、これらは、他のように示さない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００６９】
（２．順序付けられそして反復性の抗原または抗原性決定基のアレイの組成物、およびこれを作製するための方法）
開示された発明は、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基を含む、組成物を提供する。さらに、本発明は、実施者が、種々の処置目的のために、順序付けられそして反復性の抗原または抗原決定基のアレイを構築することを簡便に可能にする。この目的としては、感染性疾患の予防、アレルギーの処置および癌の処置が挙げられる。
【００７０】
本発明の組成物は、本質的に以下２つの要素を含む：（１）非天然の分子足場；および（２）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、この第２の付着部位は、少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、第１の付着部位に結合し得る。
【００７１】
この非天然の分子足場は、（ａ）コア粒子（（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される）；ならびに（ｂ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む、形成体（この形成体は、少なくとも１つの共有結合によってこのコア粒子に結合している）を含む。
【００７２】
この抗原または抗原決定基は、（ａ）この抗原または抗原決定基に天然に存在しない付着部位；および（ｂ）この抗原または抗原決定基に天然に存在する付着部位、からなる群より選択される、少なくとも１つの第２の付着部位を有する。
【００７３】
本発明は、少なくとも１つの非ペプチド結合によって第１の付着部位に第２の付着部位が結合することを介して、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを提供する。従って、この抗原または抗原決定基と非天然の分子足場とは、第１の付着部位と第２の付着部位とのこの結合を介して結合されて、順序付けられそして反復性の抗原のアレイを形成する。
【００７４】
実施者は、この抗原または抗原決定基および第２の付着部位を、非天然の分子足場に結合した抗原または抗原決定基すべての配列が均一であるように、特に設計し得る。例えば、カルボキシル末端またはアミノ末端に抗原または抗原決定基上の単一の第２の付着部位を配置し得、それにより、設計を介してその非天然の分子足場に結合した抗原または抗原決定基の分子すべてが均一な様式で位置することを確実にし得る。従って、本発明は、任意の抗原または抗原決定基を、規定された順序および反復性にて、非天然の分子足場上に配置する、簡便な手段を提供する。
【００７５】
当業者に明らかであるように、本発明の特定の実施形態は、組換え核酸技術（例えば、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核生物細胞および真核生物細胞中での組換えタンパク質の発現など）の使用を含む。このような方法論は、当業者に周知であり、そして刊行された実験室方法マニュアル（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ，Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））において、簡単に見出され得る。組織培養細胞株（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８））および抗体に基づく技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４））を用いて作業するための基本的実験室技術もまた、この文献に十分に記載されており、これらすべてが、本明細書中で参考として援用される。
【００７６】
（Ａ．非天然の分子足場の構築）
本発明の組成物中の１つの要素は、コア粒子および形成体を含む、非天然の分子足場である。本明細書中で使用される場合、句「非天然の分子足場」とは、第１の付着部位の堅固かつ反復性のアレイを提供するように役立ち得る、ヒトの手によって作製された任意の産物をいう。より詳細には、この非天然の分子足場は、（ａ）コア粒子（（１）非天然起源のコア粒子および（２）天然起源のコア粒子からなる群より選択される）；ならびに（ｂ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む、形成体（この形成体は、少なくとも１つの共有結合によって、このコア粒子と結合している）を含む。
【００７７】
当業者に容易に明らかであるように、本発明の非天然の分子足場のコア粒子は、いかなる特定の形態にも限定されない。このコア粒子は、有機物であっても非有機物であってもよく、そして化学合成されてもよいし、生物プロセスを介して合成されてもよい。
【００７８】
１つの実施形態において、非天然のコア粒子は、合成ポリマーであっても、脂質ミセルであっても、金属であってもよい。このようなコア粒子は、当該分野で公知であり、本発明の新規な、非天然の分子足場を構築するための基礎を提供する。例として、合成ポリマーまたは金属コア粒子は、米国特許第５，７７０，３８０号に記載される。この特許は、「抗体模倣物」の作製において複数のペプチドループが結合される、カリクスアーレン有機足場の使用を開示する。そして米国特許第５，３３４，３９４号は、ウイルスデコイとして使用される、ナノ結晶粒子を記載し、この粒子は、金属またはセラミックを含む、広範な種類の無機材料から構成される。この実施形態において好ましい金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、プラチナが挙げられる。この実施形態において好ましいセラミック材料としては、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズが挙げられる。この実施形態のコア粒子は、炭素（ダイヤモンド）を含む有機材料から作製され得る。好ましいポリマーとしては、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースが、挙げられる。この型のナノ結晶粒子について、酸化スズ、酸化チタンまたは炭素（ダイヤモンド）から作製された粒子が、特に好ましい。脂質ミセルは、当該分野で公知の任意の手段によって、調製され得る。例えば、ミセルは、以下の手順に従って調製され得る：ＢａｉｓｅｌｌｅおよびＭｉｌｌａｒ（Ｂａｉｓｅｌｌｅ，Ｃ．Ｊ．およびＭｉｌｌａｒ，Ｄ．Ｂ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４：３５５〜３６１（１９７５））またはＣｏｒｔｉら（Ｃｏｒｔｉ，Ｍ．、Ｄｅｇｒｉｏｒｇｉｏ，Ｖ．、Ｓｏｎｎｉｎｏ，Ｓ．、Ｇｈｉｄｏｎｉ Ｒ．、Ｍａｓｓｅｒｉｎｉ，Ｍ．およびＴｅｔｔａｍａｎｔｉ，Ｇ．、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ ３８：１９７〜２１４（１９８１））またはＬｏｐｅｚら（Ｌｏｐｅｚ，Ｏ．、ｄｅ ｌａ Ｍａｚａ，Ａ．、Ｃｏｄｅｒｃｈ，Ｌ．、Ｌｏｐｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｃ．、Ｗｅｈｒｌｉ，Ｅ．およびＰａｒｒａ，Ｊ．Ｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２６：３１４〜３１８（１９９８））またはＴｏｐｃｈｉｅｖａおよびＫａｒｅｚｉｎ（Ｔｏｐｃｈｉｅｖａ，Ｉ．およびＫａｒａｅｚｉｎ，Ｋ．、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．２１３：２９〜３５（１９９９））またはＭｏｒｅｉｎら（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．、Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｂ．、Ｈｏｇｌｕｎｄ，Ｓ．、Ｄａｌｓｇａａｒｄ Ｋ．およびＯｓｔｅｒｂａｕｓ，Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ ３０８：４５７〜６０（１９８４））；これらはすべて、本明細書中で参考として援用される）。
【００７９】
コア粒子はまた、生物学的プロセス（これは、天然であってもよいし、または非天然であってもよい）を通じて生成され得る。例の目的で、この型の実施形態としてはコア粒子（ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスカプシド粒子、またはそれらの組換え形態を含む）が挙げられ得る。より詳細な実施形態において、このコア粒子としては、ロタウイルスの組換えタンパク質、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ Ｖｉｒｕｓ）の組換えタンパク質およびヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質が挙げられ得る。
【００８０】
天然であろうと非天然であろうと、本発明のコア粒子は、少なくとも１つの共有結合により天然または非天然のコア粒子に付着される形成体を含むことによって、特徴付けられる。この形成体は、順序付けられそして反復性の抗原アレイを作製するための核形成部位を提供する、ランダムでない様式でコア粒子に結合したエレメントである。理想的には（必要ではないが）、この形成体は、幾何学的順序でコア粒子と会合される。最小には、この形成体は、第１の付着部位を含む。
【００８１】
先に述べたように、この形成体は、少なくとも１つの共有結合によってコア粒子に結合した、少なくとも１つの第１の付着部位を含む、任意のエレメントであり得る。形成体は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸（すなわち、タンパク質の残基、ポリペプチドの残基またはペプチドの残基）、糖、ポリヌクレオチド、天然ポリマーまたは合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、あるいはそれらの組合せ、あるいはそれらの化学反応基であり得る。より詳細な実施形態において、この形成体としては、抗原、抗体または抗体フラグメント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用するロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に反応する化学基：カルボキシル基、カルボキシル基に反応する化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に反応する化学基、あるいはそれらの組合せが挙げられ得る。
【００８２】
好ましい実施形態において、非天然の分子足場のコア粒子としては、ウイルス、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ウイルスカプシド粒子、またはそれらの組換え形態が挙げられる。順序付けられそして反復性の被覆および／またはコアタンパク質構造を有する、当該分野で公知の任意のウイルスは、本発明の非天然の分子足場として選択され得る；適切なウイルスの例としては、以下が挙げられる：シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルス；水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス；ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、Ｂａｃｈｍａｎ，Ｍ．Ｆ．およびＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：５５３−５５８（１９９６）の表１を参照のこと）。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明は、ウイルスの遺伝的操作を利用して、順序付けられそして反復性のウイルスエンベロープタンパク質と形成体（異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基または選り抜きの反応性アミノ酸残基を含む）との間の融合物を作製する。当業者に公知の他の遺伝的操作は、非天然の分子足場の構築に含まれ得る；例えば、遺伝的変異によって組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましくあり得る。形成体（すなわち、第１の付着部位）タンパク質への融合のために選択されるウイルスタンパク質は、形成されそして反復性の構造、より好ましくは、このウイルスの表面上に５〜１５ｎｍの間隔を最適に有する、準結晶組織化を有するべきである。この型の融合タンパク質の作製は、このウイルスの表面上に、複数の、順序付けられそして反復性の形成体を生じる。従って、それにより生じる第１の付着部位の、順序付けられそして反復性の組織化は、ネイティブウイルスタンパク質の正常な組織化を反映する。
【００８４】
本明細書中でより詳細に議論されるように、本発明の好ましい実施形態において、この足場は、組換えアルファウイルス、そしてより詳細には、組換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、感染した細胞の細胞質において、およびＤＮＡ中間体を有さずに、それらのゲノムＲＮＡ全体を複製する、＋鎖ＲＮＡである（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．およびＳｔｒａｕｓｓ，Ｅ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２（１９９４））。アルファウイルスファミリーのいくつかのメンバー（シンドビス（Ｘｉｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１（１９８９）；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８−２２（１９９３））、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．およびＧａｒｏｆｆ．Ｈ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６−１３６１（１９９１））およびその他（Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｌ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１：１８９−２０４（１９８９）））は、種々の異なるタンパク質についてのウイルスに基づく発現ベクターとして（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５７８−５８２（１９９７）；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４９５−５００（１９９４））、およびワクチン開発の候補物としての使用に、かなりの注目を受けた。最近、異種タンパク質の発現およびワクチンの開発のためのアルファウイルスの使用に関して、多くの特許が発行されている（米国特許第５，７６６，６０２号；同第５，７９２，４６２号；同第５，７３９，０２６号；同第５；７８９，２４５号および同第５，８１４，４８２号を参照のこと）。本発明のアルファウイルス足場の構築は、前述の文献（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、組換えＤＮＡ技術の当該分野で一般に公知の手段によって行われ得る。
【００８５】
種々の異なる組換え宿主細胞を利用して、抗原または抗原決定付着についてのウイルスに基づくコア粒子を生成し得る。例えば、アルファウイルスは、広範な宿主範囲を有することが公知である；シンドビスウイルスは、培養された哺乳動物細胞、爬虫類細胞および両生類細胞、ならびにいくつかの昆虫細胞に感染する（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５１：６４５（１９７３）；Ｌｅａｋｅ，Ｃ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３５：３３５（１９７７）；Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｖ．ｉｎ ＴＨＥ ＴＯＧＡＶＩＲＵＳＥＳ，Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９８０），５８３−６２１頁）。従って、多くの組換え宿主細胞は、本発明の実施において使用され得る。ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞は、異種タンパク質の生成のために特に適切である。なぜなら、これらは、ヒト細胞に類似の様式でグリコシル化異種タンパク質における可能性を有し（Ｗａｔｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ４：２２７，（１９９４））、そして選択され（Ｚａｎｇ，Ｍ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３８９（１９９５））、または遺伝的に操作されて（Ｒｅｎｎｅｒ Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４．４７６（１９９５）；Ｌｅｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５０：３３６（１９９６））、無血清培地中ならびに懸濁液中で増殖され得るからである。
【００８６】
ポリヌクレオチドベクターの宿主細胞中への導入は、標準的な研究室マニュアルに記載される方法によって果たされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），第９章；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７），第１６章を参照のこと）。この方法としては、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染のような方法が挙げられる。外因性ＤＮＡ配列の宿主細胞への導入のための方法は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．ら、米国特許第５，５８０，８５９号において議論される。
【００８７】
パッケージされたＲＮＡ配列はまた、宿主細胞を感染するために使用され得る。これらのパッケージされたＲＮＡ配列は、それらを培養培地に添加することによって宿主細胞に導入され得る。例えば、非感染アルファウイルス粒子の調製は、多くの出典（「Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｃ，（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ７５０−１）を含む）において記載される。
【００８８】
哺乳動物細胞が、ウイルスに基づくコア粒子の生成のための組換え宿主細胞として使用される場合、これらの細胞は、一般に、組織培養中で増殖される。培養中で細胞を増殖するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９９８）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．，ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８３）を参照のこと）。
【００８９】
当業者によって理解されるように、第１の付着部位は、任意の適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然ポリマーもしくは合成ポリマー、二次代謝物、またはそれらの組合せであり得るか、あるいはそれらの一部であり得る。これらは、足場に対する選り抜きの抗原または抗原決定基を特異的に付着するように作用し得る。１つの実施形態において、この付着部位は、当該分野で公知のタンパク質またはペプチドから選択され得るタンパク質またはペプチドである。例えば、第１の付着部位は、以下の群から選択され得る：リガンド、レセプター、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、エピトープ（例えば、ＨＡまたはＴ７タグ）、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、免疫グロブリンドメイン、および第１の付着部位として有用な、当該分野で公知の任意の他のアミノ酸配列。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、この第１の付着部位が、カプシドタンパク質に対してインフレーム融合を構築することにおいて利用される形成体（すなわち、タンパク質またはポリペプチド）に対して二次的に作製され得ることは、当業者によってさらに理解されるべきである。例えば、タンパク質は、エンベロープタンパク質と、特定の様式においてグリコシル化されていることが公知のアミノ酸配列との融合のために利用され得、そして次いで、結果として付加された糖部分は、ウイルス足場の第１の付着部位で作用し得、これは、抗原の二次付着部位として作用するレクチンへの結合による。あるいは、この形成体配列は、インビボでビオチン化され得、そしてこのビオチン部分は、本発明の第１の付着部位として作用し得るか、またはこの形成体配列は、インビトロにおいて、別個のアミノ酸残基の化学的改変に供され得、この改変は、この第１の付着部位として作用する。
【００９１】
本発明の１つの特定の実施形態は、シンドビスウイルスを利用する。シンドビスウイルスＲＮＡゲノムは、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３と呼ばれる３つのタンパク質を含む脂質二重層によって囲まれる、カプシドタンパク質中にパッケージされる。これらのいわゆるエンベロープタンパク質は、糖タンパク質であり、そしてこのグリコシル化タンパク質は、この脂質二重層の外側上に位置される。ここで、これらのタンパク質の複合体は、このウイルスの表面から外側へ突出することが電子顕微鏡写真において観察され得る「スパイク（ｓｐｉｋｅ）」を形成する。本発明の好ましい実施形態において、この第１の付着部位は、Ｅ２エンベロープタンパク質に対してインフレームで融合されるＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであるように選択される。しかし、他のエンベロープタンパク質が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当業者に明らかである。
【００９２】
本発明の最も好ましい実施形態において、この第１の付着部位はＢ型肝炎カプシド（コア）タンパク質に対してインフレームで融合されるＪＵＮ−ＦＯＳロイシンジッパードメインであるように選択される。しかし、他のウイルスカプシドタンパク質が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当業者に明らかである。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態において、この第１の付着部位は、肝炎コア（カプシド）タンパク質に対してインフレームで融合されるリジン残基またはシステイン残基であるように選択される。しかし、他のウイルスカプシド粒子またはウイルス様粒子が、本発明の足場において第１の付着部位を位置付けるためにこの融合タンパク質構築物において利用され得ることは、当該者に明らかである。
【００９４】
実施例１は、Ｈａｈｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３（１９９２））のｐＴＥ５’２Ｊベクターを使用して、シンドビスウイルスＥ２エンベロープタンパク質とＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインとの間のインフレーム融合タンパク質の構築を示すために提供される。この第１の付着部位のために利用されるＪＵＮアミノ酸配列は、以下の通りである：ＣＧＧＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＶＭＮＨＶＧＣ（配列番号５９）。この例において、抗原上の予測される第２の付着部位は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであり、そしてこのアミノ酸配列は、以下の通りである：ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ（配列番号６０）。
【００９５】
これらの配列は、各々、両側にシステイン残基を含む短い配列に隣接する、転写因子ＪＵＮおよびＦＯＳに由来する。これらの配列は、互いに相互作用することが公知である。ＪＵＮ−ＦＯＳ二量体について提唱された元々のハイポセティカル構造は、１つの単量体の疎水性側鎖が、ジッパー様の様式で他の単量体のそれぞれの側鎖と嵌合することを仮定した（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９−１７６４ （１９８８））。しかし、この仮定は誤っていることが判明した。そしてこれらのタンパク質は、αヘリカルコイルドコイルを形成することが公知である（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：５３８−５４２（１９８９）；Ｏ’ Ｓｈｅａら、Ｃｅｌｌ ６８：６９９−７０８（１９９２）；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐａｒｒｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２４５−２４８（１９８６））。従って、用語「ロイシンジッパー」は、頻繁に、構造的理由よりもより歴史的にこれらのタンパク質ドメインをいうために使用される。この特許にわたって、用語「ロイシンジッパー」は、上記の配列、または上記の配列に本質的に類似する配列をいうために使用される。用語ＪＵＮおよびＦＯＳは、ＪＵＮタンパク質全体およびＦＯＳタンパク質全体というよりもむしろ、それぞれのロイシンジッパードメインのために使用される。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明は、ｐＣＹＴｔｓ発現系を使用する、シンドビスウイルスＥ２−ＪＵＮ足場の生成を提供する（米国特許出願番号６０／０７９，５６２；１９９８年３月２７日出願）。このｐＣＹＴｔｓ発現系は、新規な発現ベクターを提供し、このベクターは、真核生物細胞において遺伝子発現の厳重な調節を可能にする。この系のＤＮＡベクターは、転写されてＲＮＡ分子を形成し、次いで、温度感受性レプリカーゼによって複製されて、さらなるＲＮＡ分子を形成する。複製によって生成されるＲＮＡ分子は、目的のタンパク質を生成するために翻訳され得るヌクレオチド配列、または１つ以上の非翻訳ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む。従って、この発現系は、組換えシンドビスウイルス粒子の生成を可能にする。
【００９７】
実施例２は、本発明の非天然のＥ２−ＪＵＮシンドビス分子足場の生成に対する詳細を提供する。さらに、実施例３は、実施例１において生成されたｐＴＥ５’２ＪＥ２：ＪＵＮベクターを使用して、組換えＥ２−ＪＵＮシンドビスウイルス足場の生成のための別の方法を提供する。従って、本発明は、２つの手段（ｐＣＹＴｔｓ発現系（実施例２）およびｐＴＥ５’２Ｊベクター系（実施例３）を提供し、これによって、組換えシンドビスウイルスＥ２−ＪＵＮの非天然分子足場が生成され得る。各々の系において生成されたウイルス粒子の分析は、図１および図２において検証される。
【００９８】
先に述べたように、本発明は、ウイルスに基づくコア粒子（これは、ウイルス、ウイルス様粒子、ファージ、ウイルスカプシド粒子またはそれらの組換え形態を含む）を含む。当業者は、このようなコア粒子を生成し、そしてそのコア粒子に形成体を付着させるための知識を有する。他の例を提供する目的で、本発明は、本明細書中で、コア粒子として、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子および麻疹ウイルスカプシド粒子の生成を提供する（実施例１７〜２２）。このような実施形態において、ＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインは、本発明の非天然の分子足場のための形成体として、そしてそれゆえに、第１の付着部位として、使用され得る。
【００９９】
実施例２３〜２９は、それぞれ、第１の付着部位および第２の付着部位として、反応性リジン残基を有するインフレームで融合されたペプチドを保有するＢ型肝炎コア粒子、および遺伝的に融合されたシステイン残基を保有する抗原、の生成の詳細を提供する。
【０１００】
（Ｂ．第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基の構築）
本発明の組成物内の第２のエレメントは、非天然分子骨格の第１の付着部位と、少なくとも一つの非ペプチド結合を介して会合し得る少なくとも一つの第２の付着部位を保有する抗原または抗原決定基である。本発明は、所望の治療効果の考慮において選択された抗原または抗原決定基に従って変わる組成物を提供する。他の組成物が、第２の付着部位について選択される分子を変えることによって提供される。
【０１０１】
本発明の抗原は、以下からなる群から選択され得る：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｂ）感染疾患に対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適したタンパク質；（ｄ）家畜における免疫応答を誘導するのに適したタンパク質。
【０１０２】
本発明の一つの特定の実施形態において、抗原または抗原決定基は、感染疾患の予防に対して有用な実施形態である。そのような処置は、広い範囲の宿主（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種および非哺乳動物種も同様）に影響を及ぼす広範に種々の感染疾患を処置するために有用である。処置可能な感染疾患は、当業者に周知であり、例としては、例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン−バー、ポリオ、ウイルス脳炎、麻疹、水痘などのようなウイルス病因の感染；または例えば肺炎、結核、梅毒などの細菌病因感染；または例えばマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症（ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）などの寄生的病因の感染が挙げられる。従って、本発明の組成物のために選択される抗原または抗原決定基は、医療分野における当業者に対して周知である；抗原または抗原決定基の例としては、以下が挙げられる：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０およびｇｐ１６０；インフルエンザ抗原赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、肺炎Ｂ表面抗原、マラリアのサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質。
【０１０３】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、アレルギーまたは癌の処置のために使用され得る免疫治療法である。
【０１０４】
組成物のための抗原または抗原決定基の選択およびアレルギーに対する処置の方法は、そのような疾患を処置する医療分野の当業者に対して公知である；この型の抗原または抗原決定基の代表的な例としては、以下が挙げられる；ハチ毒ホスホリパーゼＡ２、Ｂｅｔ ｖ Ｉ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ Ｄｏｌ ｍ Ｖ（ホワイトフェーススズメバチ（ｗｈｉｔｅ−ｆａｃｅｄ ｈｏｒｎｅｔ）毒アレルゲン）、Ｄｅｒ ｐ Ｉ（イエダニアレルゲン）。
【０１０５】
組成物に対する抗原または抗原決定基の選択および癌に対する処置の方法は、そのような疾患を処置する医療分野における当業者に公知である；この型の抗原または抗原決定基の代表的な例としては、以下が挙げられる：Ｈｅｒ２（乳癌）、ＧＤ２（神経芽細胞腫）、ＥＧＦ−Ｒ（悪性グリア芽細胞腫）、ＣＥＡ（髄質甲状腺（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ）癌）、ＣＤ５２（白血病）。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、抗原または抗原決定基は、以下からなる群より選択される：（ａ）ＨＩＶの組換えタンパク質、（ｂ）インフルエンザウイルスの組換えタンパク質（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、（ｄ）トキソプラスマの組換えタンパク質、（ｅ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組換えタンパク質、（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘの組換えタンパク質、（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅの組換えタンパク質、（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅの組換えタンパク質、（ｉ）乳癌細胞の組換えタンパク質、（ｊ）腎臓癌細胞の組換えタンパク質、（ｋ）前立腺癌細胞の組換えタンパク質、（ｌ）皮膚癌細胞の組換えタンパク質、（ｍ）脳癌細胞の組換えタンパク質、（ｎ）白血病細胞の組換えタンパク質、（ｏ）組換えプローブファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、（ｐ）ハチ刺しアレルギーの組換えタンパク質、（ｑ）堅果アレルギーの組換えタンパク質、（ｒ）食物アレルギーの組換えタンパク質、喘息の組換えタンパク質およびクラミジアの組換えタンパク質。
【０１０７】
一旦、組成物の抗原または抗原決定基が選択されると、少なくとも一つの第２の付着部位が、本発明の非天然分子足場と会合した、組織化され、かつ反復性のアレイを構築するように調製する際に、その分子に添加され得る。適切な第２の付着部位を構成するものの知識は、当業者に公知である。第２の付着部位の代表的例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原、抗体または抗体フラグメント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、レセプター、レセプターリガンド、リガンド、リガンド結合タンパク質、相互作用ロイシンジッパーポリペプチド、アミノ基、アミノ基に対して反応性の化学基；カルボキシル基、カルボキシル基に対して反応性の化学基、スルフヒドリル基、スルフヒドリル基に対して反応性の化学基、またはそれらの組み合わせ。
【０１０８】
第１の付着部位と第２の付着部位との間の結合は、選択されたそれぞれの分子の特徴によって決定されるが、少なくとも一つの非ペプチド結合を含む。第１の付着部位および第２の付着部位の組み合わせに依存して、天然の会合は、共有結合性、イオン性、疎水性、極性、またはその組み合わせであり得る。
【０１０９】
本発明の一つの実施形態において、第２の付着部位は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインまたはＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメインであり得る。
【０１１０】
本発明の最も具体的な実施形態では、選択された第２の付着部位ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインであり、これは、本発明の非天然分子足場のＪＵＮロイシンジッパータンパク質と特異的に会合する。ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインの会合は、足場の表面上に、組織化され、かつ反復性の抗原または抗原決定基アレイを形成するための基礎を提供する。このＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインは、アミノ末端、カルボキシル末端のいずれかにおける抗原または抗原決定基の選択に対してインフレームで融合され得るか、または所望される場合、そのタンパク質の内部に位置する。
【０１１１】
いくつかのＦＯＳ融合構築物が、例示的目的のために提供される。ヒト成長ホルモン（実施例４）、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）（実施例９）、オボアルブミン（実施例１０）およびＨＩＶｇｐ１４０（実施例１２）。
【０１１２】
ＦＯＳ融合構築物の生成を簡略化するために、抗原または抗原決定基の設計および構築について選択を提供する、いくつかのベクターが開示される（実施例６を参照のこと）。ベクターｐＡＶ１−４を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＯＳ融合発現のために設計した；ベクターｐＡＶ５およびｐＡＶ６を、真核生物細胞におけるＦＯＳ融合タンパク質の発現のために設計した。これらのベクターの特性が、以下に手短に記載される；
１．ｐＡＶ１：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１１３】
２．ｐＡＶ２：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔への分泌のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結され得る。
【０１１４】
３．ｐＡＶ３：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１１５】
４．ｐＡＶ３：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結され得る。そのＮ末端メチオニン残基は、タンパク質合成の際に酵素分解的に除去される（Ｈｉｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２４７−８２５１（１９８９））。
【０１１６】
５．ｐＡＶ５：このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ｈＧＨシグナル配列をコードする配列とＦＯＳドメインとの間に挿入され得る。あるいは、その自らのシグナル配列を含む遺伝子は、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ＦＯＳコード領域に融合され得る。
【０１１７】
６．ｐＡＶ６：このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計した。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ（または、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位へ連結され得る。
【０１１８】
当業者によって、理解されるように、ＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の構築は、組換えタンパク質の産生を促進するような特定の遺伝子エレメントの付加を含み得る。実施例４は、翻訳のための特定のＥ．ｃｏｌｉ調節エレメントの添加についてのガイダンスを提供し、そして実施例７は、真核生物シグナル配列の添加についてのガイダンスを提供する。開業医の特定の必要性に依存して、他の遺伝子エレメントが、選択され得る。
【０１１９】
本発明はまた、細菌細胞（実施例５）または真核生物細胞（実施例８）のいずれかにおけるＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の産生を含むことが理解される。融合タンパク質を発現させるために、いずれの細胞型を選択するかは、当業者の知識内にあり、例えば、この組成物の設計において、翻訳後の改変が、重要な考察であるか否かというような因子に依存する。
【０１２０】
以前に注記されたように、本発明は、ｐＡＶベクターの使用を介するＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基融合タンパク質の構築のための種々の方法を開示する。原核生物発現および真核生物発現を可能にすることに加えて、これらのベクターは、開業医が、ＦＯＳロイシンジッパードメインの抗原への−とＣの間の末端付加を選択すること可能にする。特定の例が、提供され、ここで−およびＣ末端ＦＯＳ融合は、ＰＬＡ（実施例９）およびオボアルブミン（実施例１０）に対してなされる。実施例１１は、ＰＬＡおよびオボアルブミンＦＯＳ融合タンパク質の精製を実証する。
【０１２１】
ほとんどの特定の実施形態において、本発明は、ＨＩＶゲノムによってコードされる抗原または抗原決定基に引き寄せられる。より具体的には、ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１４０である。実施例１１〜１５に提供されるように、ＨＩＶｇｐ１４０は、ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインおよび合成された融合タンパク質とともに作製され得、そして本発明の非天然分子足場に対する付着のために精製され得る。当業者が公知のように、他のＨＩＶ抗原または抗原決定基が、本発明の組成物の作製の際に使用され得る。
【０１２２】
本発明の最も具体的な実施形態において、選択される第２の付着部位は、システイン残基であり、これは本発明の非天然分子足場のリジン残基と特異的に結合する。リジン残基（Ｌｙｓ）およびシステイン残基（Ｃｙｓ）のその化学結合は、足場の表面上に、組織化され、かつ反復性の抗原または抗原決定基アレイの形成のための基礎を提供する。システイン残基は、アミノ末端、カルボキシル末端のいずれかにおける抗原または抗原決定基の選択に対してインフレームで操作され得るか、または所望される場合、そのタンパク質の内部に位置され得る。例として、ＰＬＡおよびＨＩＶｇｐ１４０が、リジン残基の第１の付着部位に対する結合のためのシステイン残基とともに提供される。
【０１２３】
（Ｃ．αワクチン粒子の調製）
本発明は、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイの構築のための新規の組成物および方法を提供する。当業者が公知のように、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイのアセンブリのための条件は、大きな程度まで、非天然の足場の第１の付着部位の特異的な選択および抗原または抗原決定基の第２の付着部位の特異的な選択に依存する。従って、この組成物の設計における開業医の選択は（すなわち、第１の付着部位および第２の付着部位、抗原および非天然の足場の選択）、αワクチン粒子（順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイおよび結合される非天然分子足場）の集合についての特定の条件を決定する。このαワクチン粒子の集合に関する情報は、十分に開業医の作業知識内であり、そして多くの参考文献が存在し、開業医を援助する（例えば、Ｓａｍｂｏｒｋ，Ｊら、編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆら、編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ、編、ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．第２版、（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）。これらの全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０１２４】
本発明の特定の実施形態において、ＪＵＮおよびＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインはそれぞれ、本発明の第１および第２の付着部位のために利用される。αワクチン粒子の調製において、抗原は、非天然足場上に順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイのアセンブリを促進するような条件下で産生され、そして精製されなければならない。特定のＪＵＮ／ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメインの実施形態において、ＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基は、ジスルフィド結合形成の発生を減少または排除するために、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））を用いて処理されるべきである（実施例１５）。
【０１２５】
ＪＵＮ／ＦＯＳロイシンジッパータンパク質ドメイン実施形態の非天然足場（すなわち、組換えＳｉｎｂｉｓウイルス）の調製のために、組換えＥ２−ＪＵＮウイルス粒子は、濃縮され、中和、そして還元剤を用いて処理されるべきである（実施例１６を参照のこと）。
【０１２６】
ＪＵＮ／ＦＯＳ実施形態における、順序付けされ、かつ反復性の抗原アレイの集合は、酸化還元シャッフルの存在下でなされる。Ｅ２−ＪＵＮウイルス粒子は、２４０倍モル濃度超過のＦＯＳ抗原またはＦＯＳ抗原決定基と４℃で１０時間結合される。次いで、そのαワクチン粒子は、クロマトグラフィーによって濃縮されて、精製される（実施例１６）。
【０１２７】
本発明の別の実施形態において、非天然分子足場と抗原または抗原決定基の結合は、化学的架橋によって、達成され得る。最も好ましい実施形態において、その化学剤は、ヘテロ２官能基架橋剤（例えば、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｔａｎｉｍｏｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｙｎ．４：８１２（１９８１）；Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４５：１９５（１９８１））であり、これは、（１）アミノ基と反応するスクシンイミド基および（２）ＳＨ基と反応するマレイミド基を含む。第１の付着部位の異種タンパク質またはポリペプチドは、ヘテロ２官能基架橋剤のスクシンイミド部分に対する反応部分として役に立つ、一つ以上のリジン残基を含むように操作され得る。一旦、非天然分子足場の第１の付着部位に化学的に結合されると、ヘテロ２官能基架橋剤のマレイミド基は、抗原または抗原決定基上のシステイン残基のＳＨ基と反応するために、利用可能となる。この場合における抗原または抗原決定基調製は、第２の付着部位として選択されたタンパク質またはポリペプチド内へシステイン残基を操作することを必要とし得、その結果システイン残基を、非天然分子足場の第１の付着部位に結合した架橋剤上の遊離マレイミド官能基と反応させ得る。
【０１２８】
（３．組成物、ワクチン、およびそれらの投与、ならびに処置方法）
１つの実施形態では、本発明は、広範な種々の種（特に、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどのような哺乳動物種）における感染症の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、ウイルス性病因の感染（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウイルス性肝炎、エプスタイン−バー、ポリオ、ウイルス性脳炎、麻疹、水痘など）；または、細菌性病因の感染（例えば、肺炎、結核、梅毒など）；または寄生生物性病因の感染（例えば、マラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症など）を処置するように設計され得る。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明は、広範な種々の種（特に、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどのような哺乳動物種）における癌の予防のためのワクチンを提供する。ワクチンは、すべての型の癌（リンパ腫、癌腫、肉腫、黒色腫など）を処置するように設計され得る。
【０１３０】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は、アレルギーの処置のためのワクチンの設計において使用され得る。ＩｇＥアイソタイプの抗体は、アレルギー反応において重要な成分である。肥満細胞は、それらの表面上でＩｇＥ抗体を結合し、そして肥満細胞表面上に結合したＩｇＥ分子に対する特異的抗原の結合に際して、ヒスタミンおよびアレルギー反応の他のメディエイタを放出する。従って、ＩｇＥ抗体の産生を阻害することは、アレルギーに対して保護するための有望な標的である。これは、所望されるＴヘルパー細胞応答を達成することによって可能であるはずである。Ｔヘルパー細胞応答は、１型（ＴＨ１）Ｔヘルパー細胞応答および２型（ＴＨ２）Ｔヘルパー細胞応答に分けられ得る（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２６３−２６６（１９９７））。ＴＨ１細胞は、インターフェロン−γ、およびＢ細胞を誘発してＩｇＧ１−３抗体を産生する他のサイトカインを分泌する。対照的に、ＴＨ２細胞により産生される重要なサイトカインはＩＬ−４であり、ＩＬ−４はＢ細胞を駆動してＩｇＧ４およびＩｇＥを産生する。多くの実験系において、ＴＨ１応答およびＴＨ２応答の発生は相互排他的である。なぜなら、ＴＨ１細胞はＴＨ２細胞の誘導を抑制し、そして逆もまた同じであるからである。従って、強力なＴＨ１応答を誘発する抗原は、同時に、ＴＨ２応答の発生を抑制し、従ってＩｇＥ抗体の産生を抑制する。興味深いことに、実質的にすべてのウイルスが、宿主においてＴＨ１応答を誘導し、そしてＩｇＥ抗体の産生を誘発することに失敗する（Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：６４−６９（１９８７））。このアイソタイプパターンは、生存しているウイルスに制限されず、不活化されたウイルス粒子または組換えウイルス粒子についても観察された（Ｌｏ−Ｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１４０１−１４０７（１９９８））。従って、本発明のプロセス（例えば、αワクチン技術）を使用することにより、ウイルス粒子は種々のアレルゲンで修飾（ｄｅｃｏｒａｔｅ）され得、そして免疫のために使用され得る。生じるアレルゲンの「ウイルス構造」に起因して、ＴＨ１応答が誘発され、「保護的」ＩｇＧ１−３抗体が産生され、そしてアレルギー反応を引き起こすＩｇＥ抗体の産生を妨げる。アレルゲンは、アレルゲン自体よりもヘルパーＴ細胞の異なるセットによって認識されるウイルス粒子によって提示されるので、アレルゲン特異的ＩｇＧ１−３抗体は、このアレルゲンに対して特異的な既存のＴＨ２細胞を保有するアレルギー性個体においてでさえ、誘導される可能性がある。高濃度のＩｇＧ抗体の存在は、肥満細胞結合ＩｇＥへのアレルゲンの結合を妨げ得、それによって、ヒスタミンの放出を阻害する。従って、ＩｇＧ抗体の存在は、ＩｇＥ媒介性アレルギー反応から保護し得る。アレルギーを引き起こす代表的な物質としては、以下が挙げられる：イネ科草本、ブタクサ、カバノキもしくはマウンテンシーダー（ｍｏｕｎｔａｉｎ ｃｅｄａｒ）の花粉、ハウスダスト、ダニ類、動物のフケ、カビ、昆虫毒液、または薬物（例えば、ペニシリン）。従って、アレルゲン修飾されたウイルス粒子での個体の免疫は、アレルギー発症の前のみならず後でも、有益である。
【０１３１】
当業者によって理解されるように、本発明の組成物が個体に投与される場合、それらは、組成物の効力を改善するために所望され得る塩、緩衝剤、アジュバント、または他の物質を含む組成物中であり得る。薬学的組成物を調製する際の使用に適切な物質の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９８０））を含む多数の供給源に提供される。
【０１３２】
本発明の組成物は、それらの投与がレシピエント個体によって耐えられ得る場合に、「薬理学的に受容可能」であるといわれる。さらに、本発明の組成物は、「治療的有効量」（すなわち、所望される生理学的効果を産生する量）で、投与される。
【０１３３】
本発明の組成物は、当該分野において公知の種々の方法によって投与され得るが、通常は、注射、注入、吸入、経口投与、または他の適切な物理的方法によって投与される。あるいは、組成物は、筋内、静脈内、または皮下に投与され得る。投与のための組成物の成分は、滅菌水溶液（例えば、生理的食塩水）または非水系溶液および懸濁液を含む。非水系溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブオイル）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。キャリアまたは閉鎖包帯が、皮膚の透過性を増大させるため、および抗原吸着を増強するために使用され得る。
【０１３４】
ワクチン技術に加えて、本発明の他の実施形態は、癌およびアレルギーの医学的処置の方法に向けられる。
【０１３５】
本明細書中で言及される、すべての特許および刊行物は、特に参考として援用される。
【０１３６】
（実施例）
続く実験において使用された酵素および試薬は、以下を含んだ：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ；ＱＩＡＧＥＮから入手した、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手した、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ Ｋｉｔ、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、バクト−トリプトン（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）および酵母抽出物；Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した、オリゴヌクレオチド；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手した、制限エンドヌクレアーゼ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した、ＰｗｏポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓ。ＨＰ−１培地を、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧｌａｔｔＢｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。すべての標準的な化学薬品を、Ｆｌｕｋａ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。そして、すべての細胞培養材料を、ＴＰＰから入手した。
【０１３７】
ＤＮＡ操作を、標準的技術を使用して実施した。ＤＮＡを、製造業者の指示書に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔを使用して２ｍｌの細菌培養物から、またはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを使用して５０ｍｌの培養物からのいずれかから調製した。制限酵素消化のために、製造業者の推奨される条件（緩衝液および温度）下で、１ｍｇのＤＮＡあたり５〜１０ユニット（Ｕ）の酵素濃度で、ＤＮＡを適切な制限酵素と共に少なくとも２時間インキュベートした。１つより多い酵素での消化を、反応条件がすべての酵素について適切である場合には同時に実施したが、そうでなければ連続して実施した。さらなる操作のために単離されたＤＮＡフラグメントを、０．７〜１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により分離し、このゲルから切除し、そして製造業者によって提供される指示書に従って、ＱｉａＥｘＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。ＤＮＡフラグメントの連結のために、１００〜２００ｐｇの精製されたベクターＤＮＡを、製造業者によって提供される緩衝液（総容量：１０〜２０μｌ）中で、１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下において、３倍モル濃度過剰の挿入物フラグメントと共に、１６℃にて一晩インキュベートした。連結反応物のアリコート（０．１〜０．５μｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換のために使用した。形質転換を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲＡＤ）および０．１ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅｓ（ＢｉｏＲＡＤ）を、２００Ω、２５μＦ、１．７ｋＶにて使用するエレクトロポレーションによって実施した。エレクトロポレーション後、選択的Ｓ．Ｏ．Ｂ．アガーにおけるプレーティングの前に、細胞を１ｍｌのＳ．Ｏ．Ｂ．培地（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）中で１時間振盪しながらインキュベートした。
【０１３８】
（実施例１）
（Ｅ２におけるＪＵＮ両親媒性ヘリックスドメインの挿入）
ベクターｐＴＥ５’２Ｊ（Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３（１９９２））において、ＭｌｎＩおよびＢｓｔＥＩＩの制限酵素部位を、構造タンパク質Ｅ２コード配列のコドン７１（Ｇｌｎ）と７４（Ｔｈｒ）との間に導入し、ベクターｐＴＥ５’２ＪＢＭを得た。これらの制限酵素部位の導入を、以下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって実施した。
【０１３９】
【化１】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、鋳型ＤＮＡ５ｎｇと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の様式および順序で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、５３℃（６０秒間）７２℃（８０秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、５７℃（６０秒間）、７２℃（８０秒間）の２５サイクル。
【０１４０】
２つのＰＣＲフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって分析および精製した。増幅のためにオリゴ３および４を使用する、２つのＰＣＲフラグメントのアセンブリＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ）を、最終構築物を得るために実施した。
【０１４１】
アセンブリＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、２ｎｇの精製されたＰＣＲフラグメントと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の様式および順序で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、５７℃（６０秒間）７２℃（９０秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、５９℃（６０秒間）、７２℃（９０秒間）の２５サイクル。
【０１４２】
最終ＰＣＲ産物を、Ｑｉａ ｓｐｉｎ ＰＣＲカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして適切な緩衝液中で、各１０ユニットのＢｓｓＨＩＩおよびＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、３７℃にて１２時間消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＢｓｓＨＩＩ／ＳｔｕＩ消化されかつゲル精製されたｐＴＥ５’２Ｊベクター（Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２６７９−２６８３）中に連結した。このＰＣＲ産物の正確な挿入を、まずＢｓｔＥＩＩおよびＭｌｕＩ制限分析により分析し、次いで、ＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０１４３】
ＪＵＮ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ベクターｐＪｕＦｏ（ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｕｔｅｒ、Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））からＰＣＲ増幅した。
【０１４４】
【化２】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で、５ｎｇの鋳型ＤＮＡと共に使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクリングを、以下の順序および様式で実施した：９５℃（２分間）；９５℃（４５秒間）、６０℃（３０秒間）７２℃（２５秒間）の５サイクル；そして、９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒間）、７２℃（２０秒間）の２５サイクル。
【０１４５】
最終ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＶ消化されかつゲル精製されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＫＳ−）中に連結した。得られたベクターから、ＱｉａＥｘＩＩで精製されたＭｌｕＩ／ＢｓｔＥＩＩでの切断によって、ＪＵＮ配列を単離し、そしてベクターｐＴＥ５’２ＪＢＭ（予め、同一の制限酵素で切断されている）中に連結して、ベクターｐＴＥ５’２Ｊ：Ｅ２ＪＵＮを得た。
【０１４６】
（実施例２）
（ｐＣＹＴｔｓ系を使用する、Ｅ２−ＪＵＮ含有ウイルス粒子の産生）
構造タンパク質を、鋳型としてのｐＴＥ５’２Ｊ：Ｅ２ＪＵＮ、ならびにオリゴヌクレオチドＸｂａｌＳｔｒｕｃｔ（ｃｔａｔｃａＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＴＡＡＣ）（配列番号１２）およびＳｔｒｕｃｔＢｓｐ１２０１（ｔｃｇａａｔＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧ）（配列番号８７）を使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲのために、１００ｐｍｏｌの各オリゴ（Ｉｏｌｉｇｏ）を使用し、そして５ｎｇの鋳型ＤＮＡを、１００μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑ（Ｔａｃ）ポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）中で使用した。すべてのＤＮＡ濃度を、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測光により決定した。ポリメラーゼを、ＰＣＲ反応を開始する直前（開始点は、９５℃）に添加した。温度サイクルは、以下の通りであった：９５℃（３分間）、次いで、９２℃（３０秒間）、５４℃（３５秒間）７２℃（２７０秒間）の５サイクル、次いで、９２℃（３０秒間）、６３℃（３５秒間）、７２℃（２７０秒間）の２５サイクル。このＰＣＲ産物をゲル精製し、そして制限酵素ＸｂａＩ／Ｂｓｐ１２０１で消化し、そして予め同一の酵素で切断されたベクターｐＣＹＴｔｓ（米国特許出願番号６０／０７９，５６２；１９９８年３月２７日出願）中に連結した。
【０１４７】
２０μｇのｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮを、３７℃にて少なくとも４時間、適切な緩衝液中で３０ＵのＳｃａＩと共にインキュベートした。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出により停止し、次いで、直鎖化ＤＮＡのイソプロパノール沈殿を行った。制限反応を、アガロースゲル電気泳動によって確認した。トランスフェクションのために、３０μｌのＨ２Ｏ中において５．４μｇの直鎖化ｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮを０．６μｇの直鎖化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌのＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５秒間ボルテックスし、次いで、室温で２５秒間インキュベーションした。この溶液を、２％のＦＣＳを含有する２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ ＦＣＳ培地）に、すぐ添加した。次いで、６ウェルプレート中の８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養の培地を、ＤＮＡ含有培地と置換した。ＣＯ２インキュベーター内における３７℃での５時間のインキュベーションの後、ＤＮＡ含有培地を取り除き、そして２％ ＦＣＳ培地中の１５％グリセロール２ｍｌと置換した。このグリセロール含有培地を、３０秒間のインキュベーション期の後に取り除き、そして１０％のＦＣＳを含有するＨＰ−１培地５ｍｌでリンスすることによって細胞を洗浄した。最後に、１０％のＦＣＳを含有する新鮮なＨＰ−１培地２ｍｌを添加した。
【０１４８】
安定にトランスフェクトされた細胞を、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて、選択培地（Ｇ４１８を補充した、ＨＰ−１培地）中で選択し、そして増殖させた。混合した集団をコンフルーエンシーまで増殖した時点で、培養物を２つのディッシュに分け、次いで、３７℃での１２時間の増殖期を行った。この細胞の一方のディッシュを、ウイルス粒子の発現を誘導するために３０℃に移し；他方のディッシュを、３７℃で維持した。
【０１４９】
ウイルス粒子の発現を、ウェスタンブロッティングにより決定した（図１）。培養培地（０．５ｍｌ）を、メタノール／クロロホルム沈殿し、そしてペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを、１５％アクリルアミドゲルに適用する前に、５分間、９５℃で加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９〜５５頁によって記載されるように、タンパク質を、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。ＴＢＳ（１リットルあたり１０×ＴＢＳ：８７．７ｇのＮａＣｌ、６６．１ｇのＴｒｉｚｍａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇのＴｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温にて１時間メンブレンをブロックし、次いで、抗Ｅ１／Ｅ２抗体（ポリクローナル血清）と共に１時間インキュベーションした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ）を用いて１０分間、３回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ−抗ウサギＩｇＧ結合体（０．１μｇ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔを用いた１０分間の２回の洗浄およびＴＢＳを用いた１０分間の２回の洗浄の後、５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％ジメチルホルムアミド中の７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中の５％ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）と共に、アルカリホスファターゼ検出試薬（１０ｍｌ ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を用いて、発色反応を実施した。
【０１５０】
ウイルス粒子の産生を、図１に示す。ウェスタンブロットのパターンは、Ｅ２−ＪＵＮ（レーン１）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、野生型Ｅ２（レーン２）と比較してより大きな分子量に移動することを示した。そして、ＢＨＫ２１宿主細胞株は、バックグラウンドを全く示さなかった。
【０１５１】
（実施例３）
（ｐＴＥ５’２ＪＥ２：ＪＵＮベクターを用いた、Ｅ２−ＪＵＮを含有するウイルス粒子の産生）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）を、ＰｖｕＩ消化によって直鎖化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ、ＮＶ Ｌｅｅｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによる、ＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を用いて、インビトロでの転写を実施した。生じた５’キャップ化されたｍＲＮＡを、還元アガロースゲルにおいて分析した。
【０１５２】
インビトロで転写されたｍＲＮＡ（５μｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの説明書（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）中にエレクトロポレーションした。３７℃での１０時間のインキュベーションの後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを有さないＨＰ−１培地と交換し、次いで、３７℃で１０時間さらにインキュベーションした。上清を収集し、そして正確に実施例２に記載のように、ウイルス粒子の産生についてウェスタンブロット分析によって分析した。
【０１５３】
得られた結果は、図２に示されるようなｐＣＹＴｔｓＥ２：ＪＵＮで得られた結果と同一であった。
【０１５４】
（実施例４）
（ＦＯＳロイシンジッパードメイン（ＯｍｐＡシグナル配列）へのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合）
ヒトリーダー配列を有さないｈＧＨ遺伝子を、もともとのプラスミド（ＡＴＣＣ ３１３８９）から、ＰＣＲによって増幅した。内部ＸｂａＩ部位を有するオリゴ７を、ｈＧＨ遺伝子の５’末端でのアニーリングのために設計し、そして内部ＥｃｏＲＩ部位を有するオリゴ９を、ｈＧＨ遺伝子の３’末端でプライムした。ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。
【０１５５】
ＰＣＲサイクリングを、以下の様式で実施した：６０℃のアニーリング温度および７２℃での１分間の伸長時間の３０サイクル。
【０１５６】
ゲル精製し、そして単離したＰＣＲ産物を、第２のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用して、ｏｍｐＡシグナル配列およびシャイン−ダルガーノ配列を導入した。ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌのオリゴ８および９、ならびに１ｎｇのテンプレートＰＣＲフラグメントを、７５μｌの反応混合液（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。最初の５サイクルのアニーリング温度は５５℃で、７２℃での６０秒間の伸長時間を伴い；別の２５サイクルを、６５℃のアニーリング温度および７２℃で６０秒間の伸長時間で実施した。
【０１５７】
【化３】
生じた組換えｈＧＨ遺伝子を、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローン化した。両鎖の正確な配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１５８】
ＦＯＳ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、ベクターｐＪｕＦｏ（Ｃｒａｍｅｒｉ＆Ｓｕｔｅｒ Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））から、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１５９】
【化４】
ＰＣＲ反応のために、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑポリメラーゼまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。温度サイクルは、以下の通りであった：
９５℃で２分間、次いで、９５℃（４５秒間）、６０℃（３０秒間）、７２℃（２５秒間）の５サイクル、次いで、９５℃（４５秒間）、６８℃（３０秒間）、７２℃（２０秒間）の２５サイクル。
【０１６０】
ＰＣＲ産物を精製し、単離し、そしてＳｔｕＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｏｍｐＡ−ｈＧＨ中にクローン化した。次いで、ハイブリッド遺伝子を、ｐＫＫ２２３−３プラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にクローン化した。
【０１６１】
（実施例５）
（ＦＯＳ−ｈＧＨの細菌性発現）
ｐｋｋ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨを、誘導性のＩＰＴＧ依存性プロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株としてＪＭ１０１を使用して発現させた。発現を、振盪機フラスコ内で実施した。細胞を、０．５のＯＤ６００において、１ｍＭ ＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導した。発現を、３７℃にて１０時間継続した。細胞を、１０℃で１５分間、３６００での遠心分離によって収集した。細胞のペレットを、凍結し（−２０℃または液体Ｎ２）、そして１６時間保存した。次いで、ペレットを４℃にて融解し、そして６００ｍＭスクロースを含有する１０ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。４℃での１５分間の攪拌後、ペリプラズムのタンパク質を、浸透圧性ショック手順によって放出した。冷却（４℃）脱イオン水を添加し、そして懸濁液を４℃にて３０分間攪拌した。スラッジを希釈し、再懸濁し、そしてリゾチームを添加して、細菌の細胞壁を破壊した。細胞およびペリプラズムの画分のスフェロプラストを、４℃で２０分間、１１０００ｇでの遠心分離によって分離した。ＦＯＳ−ｈＧＨ含有上清を、還元性および非還元性ＳＤＳ−Ｐａｇｅおよびドットブロットによって分析した。ドットブロットを、実施例８に記載のように、一次抗体として抗ｈＧＨ抗体（Ｓｉｇｍａ）および二次抗体としてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−抗マウス抗体結合体を使用して、実施した。
【０１６２】
全長の正確にプロセスされたＦＯＳ−ｈＧＨが、還元条件および非還元条件下で検出され得た。ＦＯＳ−ｈＧＨの一部は、ＦＯＳ両親媒性ヘリックス中に存在する遊離システインに起因して、他の未同定のタンパク質に結合した。しかし、発現されたＦＯＳ−ｈＧＨの５０％より多くが、そのネイティブなモノマー性コンフォメーションで存在した（図３）。
【０１６３】
精製されたＦＯＳ−ｈＧＨを使用して、ＪＵＮ含有ウイルス粒子を用いる最初のドーピング実験を実施した。
【０１６４】
（実施例６）
（ＦＯＳ融合タンパク質の発現のための、ｐＡＶベクター系列の構築）
−もしくはＥ．ｃｏｌｉにおけるＣ末端ＦＯＳ融合タンパク質の細胞質内産生もしくは分泌、または−もしくは真核生物細胞におけるＣ末端融合タンパク質の産生のいずれかを可能にする、汎用性のベクター系を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＯＳ融合タンパク質の産生のために設計されたベクターｐＡＶ１〜ｐＡＶ４は、以下に列挙されたＤＮＡカセットを含む。このＤＮＡカセットは、異なる順序で配列された以下の遺伝的エレメントを含む：（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡ遺伝子（ａｇｇａｇｇｔａａａａａａｃｇ）（配列番号１３）由来の強力なリボソーム結合部位および５’非翻訳領域；（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質ＯｍｐＡ（ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ）（配列番号１４）のシグナルペプチドをコードする配列；（ｃ）２つのグリシン残基および１つのシステイン残基によって両側で隣接されたＦＯＳ二量体化ドメイン（ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ）（配列番号１５）をコードする配列；および（ｄ）目的のタンパク質をＦＯＳ二量体化ドメインに連結する、短いペプチドリンカー（ＡＡＡＳＧＧ）（配列番号１６）またはＧＧＳＡＡＡ（配列番号１７））をコードする領域。関連するコード領域を、大文字で提供する。制限切断部位の配置は、シグナル配列を伴うかまたは伴わない、ＦＯＳ融合遺伝子の容易な構築を可能にする。このカセットを、強力なｔａｃプロモーターの制御下での融合遺伝子の発現のために、発現ベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローン化した。
【０１６５】
（ｐＡＶ１）
このベクターは、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ細胞周辺腔への分泌のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１６６】
【化５】
。
【０１６７】
（ｐＡＶ２）
このベクターは、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ細胞周辺腔への分泌のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（または、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結される
【０１６８】
【化６】
。
【０１６９】
（ｐＡＶ３）
このベクターは、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質内産生のために設計された。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）は、このベクターのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位に連結され得る。
【０１７０】
【化７】
。
【０１７１】
（ｐＡＶ４）
このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ中での細胞質産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）部位に連結し得る。Ｎ末端メチオニン残基を、タンパク質合成に際してタンパク質分解的に除去する（Ｈｉｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２４７−８２５１（１９８９））。
【０１７２】
【化８】
。
【０１７３】
ベクターｐＡＶ５およびｐＡＶ６（これらは、ＦＯＳ融合タンパク質の真核生物産生のために設計される）は、異なる順番で配置された以下の遺伝的エレメントを含む：（ａ）ヒト成長ホルモンのリーダーペプチドをコードする領域（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ）（配列番号２６）；（ｂ）２つのグリシン残基および１つのシステイン残基が両側で隣接する、ＦＯＳ二量体化ドメインをコードする配列（ＣＧＧＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＶＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＦＩＬＡＡＨＧＧＣ）（配列番号１５）；および（ｃ）ＦＯＳ二量体化ドメインに目的のタンパク質を接続する、短いペプチドリンカーをコードする領域（ＡＡＡＳＧＧ（配列番号１６）またはＧＧＳＡＡＡ（配列番号１７））。関連するコード領域を大文字で示す。制限切断部位の配列は、ＦＯＳ融合遺伝子の容易な構築を可能にする。このカセットを、発現ベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングする。
【０１７４】
（ｐＡＶ５）
このベクターを、Ｃ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によって、ｈＧＨシグナル配列をコードする配列とＦＯＳドメインをコードする配列との間に挿入し得る。あるいは、それ自体のシグナル配列を含む遺伝子を、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ部位への連結によってＦＯＳコード領域に融合し得る。
【０１７５】
【化９】
。
【０１７６】
（ｐＡＶ６）
このベクターを、Ｎ末端にＦＯＳを有する融合タンパク質の真核生物産生のために設計する。目的の遺伝子（ｇ．ｏ．ｉ．）を、ベクターのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ部位（またはＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位）に連結し得る。
【０１７７】
【化１０】
（発現ベクターｐＡＶ１−ｐＡＶ６の構築）
以下のオリゴヌクレオチドを、発現ベクターｐＡＶ１−ｐＡＶ６の構築のために合成した：
【０１７８】
【化１１】
ベクターｐＡＶ２の構築のために、ＯｍｐＡシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＯｍｐＡ−ＦＯＲ１／ＦＯＳ−ＲＥＶ２を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１７９】
ベクターｐＡＶ１の構築のために、ＦＯＳコード領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ１／ＦＯＳ−ＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したベクターｐＡＶ２に連結した。
【０１８０】
ベクターｐＡＶ３の構築のために、ＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ２／ＦＯＳ−ＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＡＶ１から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１８１】
ベクターｐＡＶ４の構築のために、ＦＯＳドメインをコードする領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ３／ＦＯＳ−ＲＥＶ２を使用して、ベクターｐＫＫ２２３−３中のｏｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例５を参照のこと）から増幅した。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の同じ部位に連結した。
【０１８２】
ベクターｐＡＶ５の構築のために、ｈＧＨシグナル配列をコードする領域を、プライマー対ｈＧＨ−ＦＯＲ１／ｈＧＨＲＥＶ１を使用して、ベクターｐＳＩＮｒｅｐ５中のｈＧＨ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子（実施例７を参照のこと）から増幅する。このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化し、そしてベクターｐＡＶ１の同じ部位に連結する。次いで、ｈＧＨシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする得られたカセットを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって単離し、そして同じ酵素で消化したベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））にクローニングする。
【０１８３】
ベクターｐＡＶ６の構築のために、ＦＯＳコード領域を、プライマー対ＦＯＳ−ＦＯＲ４／ＦＯＳＲＥＶ３を使用して、ベクターｐＡＶ２から増幅する。このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断したベクターｐＡＶ５にクローニングする。次いで、ｈＧＨシグナル配列およびＦＯＳドメインをコードする全体のカセットを、プライマー対ｈＧＨ−ＦＯＲ２／ＦＯＳＲＥＶ３を使用して、得られるベクターから再増幅し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そして同じ酵素で切断したベクターｐＭＰＳＶＥＨ（Ａｒｔｅｌｔら、Ｇｅｎｅ ６８：２１３−２１９（１９８８））に連結する。
【０１８４】
（実施例７：ヒト（ｈＧＨ）シグナル配列を有するＦＯＳ−ｈＧＨの構築）
ＦＯＳ−ｈＧＨ融合タンパク質の真核生物発現のために、ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ融合遺伝子を、ＸｂａＩ／Ｂｓｐ１２０Ｉでの消化によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ（実施例４を参照のこと）から単離し、そして同じ酵素で切断したｐＳＩＮｒｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ｈＧＨシグナル配列を、重複するオリゴヌクレオチド
【０１８５】
【化１２】
を使用するＰＣＲ（反応混合物：５０ｐモルの各プライマー、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ（各２００μＭ）、２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、製造業者より供給された緩衝液中、５０μｌの総量；増幅；９２℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、３０サイクル）によって合成した。このＰＣＲ産物を、ＱｉａＥｘｌｌキットを使用して精製し、ＳｔｕＩ／ＸｂａＩで消化し、そして同じ酵素で切断したベクターｐＳＩＮｒｅｐ５：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨに連結した。
【０１８６】
（実施例８：ＦＯＳ−ｈＧＨの真核生物発現）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）（ｐＳＩＮｒｅｐ５：：ＯｍｐＡ−ＦＯＳ−ｈＧＨ）および１．０μｇのＤＨＥＢ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４６６（１９９３））を、ＳｃａＩ制限消化によって線状化した。続いて、インビトロ転写を、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を使用して実行した。得られた５’キャップｍＲＮＡを、還元アガロースゲル上で分析した。
【０１８７】
インビトロで、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアルに従って、転写された５μｇのｍＲＮＡを、ＢＨＫ ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）にエレクトロポレーションした（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。３７℃で１０時間のインキュベーション後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含まないＨＰ−１培地で交換し、続いて３７℃で１０時間さらなるインキュベーションを行った。その上清を収集し、そしてＦＯＳ−ｈｇｈの産生についてドットブロット分析によって分析した。
【０１８８】
培養培地（２．５μｌ）を、ニトロセルロース膜上にスポットし、そして室温で１０分間乾燥させた。その膜を、ＴＢＳ（１リットルあたりの１０×ＴＢＳ：８７．７ｇ ＮａＣｌ、６６．１ｇ Ｔｒｉｚｍａ塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）、および９．７ｇ Ｔｒｉｚｍａベース（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１時間ブロックし、続いて１０ｍｌのＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を有するＴＢＳ）中の、２μｇのウサギ抗ヒトｈＧＨ抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートした。そのブロットを、ＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回洗浄し、そしてＴＢＳ−Ｔ中で１：５０００希釈した、アルカリホスファターゼと結合体化した抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間、２回の洗浄およびＴＢＳでの１０分間、２回の洗浄の後、そのブロットを、実施例２に記載のようにＡＰ染色によって染色した。結果を図３に示す。
【０１８９】
（実施例９：ＦＯＳ−ＰＬＡ（Ｎ末端およびＣ末端）の構築）
ハチ毒ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ）の触媒的に不活性な改変体（Ｆｏｅｓｔｅｒら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９５：１２２９−１２３５（１９９５））をコードする以下の遺伝子を、化学的な遺伝子合成によって構築する。
【０１９０】
【化１３】
ＦＯＳ二量体化ドメインのＮ末端へのＰＬＡの融合のために、その領域を、オリゴヌクレオチドＰＬＡ−ＦＯＲ１（ＣＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣ）（配列番号４５）およびＰＬＡ−ＲＥＶ１（ＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧ）（配列番号４６）を使用して増幅する。そのＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩで切断し、そして制限酵素ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩで事前に切断したベクターｐＡＶＩに連結する。ＦＯＳ二量体化ドメインのＣ末端へのＰＬＡの融合のために、その領域をオリゴヌクレオチドＰＬＡ−ＦＯＲ２（ＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣ）（配列番号４７）およびＰＬＡ−ＲＥＶ２（ＴＴＡＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＡＧＧＴＣＧ）（配列番号４８）を使用して増幅する。そのＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩで切断し、そして制限酵素ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶで事前に切断したベクターｐＡＶ２に連結する。
【０１９１】
（実施例１０）
（ＦＯＳ−オボアルブミン融合遺伝子（Ｎ末端およびＣ末端）の構築）
オボアルブミンコード配列のクローニングのために、ニワトリ卵管組織由来のｍＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐＴＭ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、製造業者の説明書に従って使用して、調製する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、オボアルブミンの成熟部分をコードするｃＤＮＡ（そのｍＲＮＡのヌクレオチド６８〜１２２２に対応する（ＭｃＲｅｙｎｏｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：７２３−７２８（１９７８））を、プライマーＯｖａ−ＦＯＲ１（ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧ）（配列番号４９）およびＯｖａ−ＲＥＶ１（ＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣ）（配列番号５０）を使用して合成する。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化し、そしてＣ末端でＦＯＳ二量体化ドメインを有する融合タンパク質の発現のために、ＳｔｕＩ／ＮｏｔＩ消化したベクターｐＡＶ１にクローニングする。Ｎ末端でＦＯＳ二量体化ドメインを有する融合タンパク質の産生のために、オボアルブミンコード領域を、プライマーＯｖａ−ＦＯＲ２（ＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＡＧ）（配列番号５１）およびＯｖａ−ＲＥＶ２（ＴＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＣ）（配列番号５２）を使用して、その構築したベクター（ｐＡＶ：：Ｏｖａ）から増幅させる。このＰＣＲ産物をＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶ消化したベクターｐＡＶにクローニングする。このクローニングしたフラグメントを、ＤＮＡ配列分析によって確認する。
【０１９２】
（実施例１１）
（ＦＯＳ−ＰＬＡおよびＦＯＳアルブミン融合タンパク質の産生および精製）
ＦＯＳ融合タンパク質の細胞質内産生のために、適切なＥ．ｃｏｌｉ株を、ベクターｐＡＶ３：：ＰＬＡ、ｐＡＶ４：：ＰＬＡ、ｐＡＶ３：：ＯｖａまたはｐＡＶ４：：Ｏｖａで形質転換した。この培養物を、アンピシリン存在下の富化培地中で、３７℃で振盪しながらインキュベートした。吸光度（５５０ｎｍ）１の時点で、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、そしてインキュベーションをさらに５時間続けた。この細胞を遠心分離によって収集し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよびリゾチームを含む適切な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そしてフレンチプレッシャーセルを通過させて破壊した。遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｃ、ＳＳ３４ローター、１５０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、ペレットを、４℃で２５ｍｌの封入体洗浄緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２３％スクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁し、上記のように再度遠心分離した。この手順を、遠心分離後の上清が実質的に清澄になるまで繰り返した。封入体を、室温で２０ｍｌの可溶化緩衝液（５．５Ｍ 塩酸グアニジウム、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そして不溶性物質を、遠心分離、およびその後、上清を滅菌フィルター（０．４５μｍ）に通過させることによって、除去した。タンパク質溶液を、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ ＤＴＴの存在下で少なくとも１０時間、４℃で維持し、次いで１０容量の５．５Ｍ 塩酸グアニジウム、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６に対して３回透析した。この溶液を、適切な酸化還元混合物（ｒｅｄｏｘ ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下の５リットルの２Ｍ 尿素、４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）に対して２回透析した。次いで、この再折り畳みされたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにアプライした。このタンパク質を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴの存在下の７より大きいｐＨを有する適切な適切な緩衝液中で保存し、ＦＯＳドメインに隣接するシステイン残基を還元形態に維持した。タンパク質のアルファウイルス粒子との結合の前に、このタンパク質溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラムに通すことによって、ＤＴＴを除去した。
【０１９３】
（実施例１２）
（ｇｐ１４０−ＦＯＳの構築）
内部プロテアーゼ切断部位を有さないｇｐ１４０遺伝子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０３３７５）を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、全長ｇｐ１６０遺伝子を含む元のプラスミドｐＡｂＴ４６７４（ＡＴＣＣ４０８２９）から、ＰＣＲによって増幅させた：
【０１９４】
【化１４】
ＰＣＲ Ｉについて、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−１およびＨＩＶ−Ｃｌｅａｖ２ならびに５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で２分間の伸長時間での３０サイクル。
【０１９５】
ＰＣＲ ＩＩについて、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−ｅｎｄおよびＨＩＶ−Ｃｌｅａｖならびに５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で５０秒間の伸長時間での３０サイクル。
【０１９６】
両方のＰＣＲフラグメントを精製し、単離し、そしてアセンブリＰＣＲ反応系において使用した。アセンブリＰＣＲ反応について、１００ｐｍｏｌのオリゴＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ｅｎｄならびに２ｎｇの各ＰＣＲフラグメント（ＰＣＲ ＩおよびＰＣＲ ＩＩ）を、７５μｌの反応（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。ＰＣＲサイクリングを以下の様式で行った：６０℃のアニーリング温度および７２℃で２．５分間の伸長時間での３０サイクル。このアセンブリＰＣＲ産物を、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化した。ＦＯＳ両親媒性ヘリックスを、ｇｐ−１４０のＣ末端にインフレームで融合した。
【０１９７】
ＦＯＳ両親媒性ヘリックスドメインをコードするＤＮＡ配列を、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ベクターｐＪｕＦｏ（Ｃｒａｍｅｒｉ＆Ｓｕｔｅｒ Ｇｅｎｅ １３７：６９（１９９３））からＰＣＲ増幅させた：
【０１９８】
【化１５】
このＰＣＲ反応について、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５ｎｇのテンプレートＤＮＡを、７５μｌの反応混合物（４ユニットのＴａｑまたはＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４）中で使用した。温度サイクリングを以下のように行った：９５℃で２分間、その後の９５℃（４５秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（２５秒）の５サイクル、そしてその後の９５℃（４５秒）、６８℃（３０秒）、７２℃（２０秒）の２５サイクル。この得られたＰＣＲフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＢｓｐ１２０Ｌで消化した。
【０１９９】
ＧＰ１４０−ＦＯＳについての最終発現ベクターを、両ＰＣＲフラグメントのｐＳｉｎＲｅｐ５への３フラグメント連結で得た。この得られたベクターｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０−ＦＯＳを、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって評価した。
【０２００】
ＧＰ１４０−ＦＯＳをまた、安定な誘導性ＧＰ１４０−ＦＯＳ発現細胞株を得るために、ＸｂａＩおよびＢｓｐ１２０Ｌ消化したｐＣＹＴｔｓにクローニングした。
【０２０１】
（実施例１３）
（ｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０ＦＯＳを使用するＧＰ１４０ＦＯＳの発現）
ＲＮａｓｅを含まないベクター（１．０μｇ）（ｐＳｉｎＲｅｐ５−ＧＰ１４０−ＦＯＳ）および１．０μｇのＤＨＥＢ（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６（１９９３））を、制限消化によって直線化した。続いて、ＳＰ６インビトロ転写キット（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ，ＮＶ Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによるＩｎｖｉｔｒｏｓｃｒｉｐＣＡＰ）を使用して、インビトロ転写を行った。この得られた５’キャップ化ｍＲＮＡを、還元性アガロースゲル上で分析した。
【０２０２】
インビトロ転写したｍＲＮＡ（５μｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのマニュアル（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って、ＢＨＫ２１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ１０）内にエレクトロポレートした。３７℃で１０時間のインキュベーション後、ＦＣＳ含有培地を、ＦＣＳを含まないＨＰ−１培地で交換し、その後さらに１０時間３７℃でインキュベートした。この上清を収集し、そして実施例２の記載のように正確に、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの産生についてウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２０３】
（実施例１４）
（ｐＣＹＴｔｓ−ＧＰ１４０ＦＯＳを使用するＧＰ１４０ＦＯＳの発現）
ｐＣＹＴｔｓ−ＧＰ１４０−ＦＯＳ ２０μｇを、制限消化によって直線化した。この反応を、フェノール／クロロホルム抽出によって停止し、その後、この直線化ＤＮＡをイソプロパノール沈殿させた。この制限消化を、アガロースゲル電気泳動によって評価した。トランスフェクションのために、５．４μｇの直線化ｐＣＹＴｔｓＧＰ１４０−ＦＯＳを、３０μｌ Ｈ２Ｏ中の０．６μｇの直線化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０５）の添加後、この溶液を５秒間ボルテックスし、その後、室温で２５秒間インキュベートした。この溶液を、２％ ＦＣＳを含む２ｍｌのＨＰ−１培地（２％ ＦＣＳ培地）に直ちに添加した。次いで、８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養物の培地（６ウェルプレート）を、このＤＮＡ含有培地で置換した。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５時間のインキュベーション後、このＤＮＡ含有培地を除去し、そして２％ ＦＣＳ培地中の１５％グリセロール（２ｍＬ）で置換した。このグリセロール含有培地を、３０秒のインキュベーション段階の後で除去し、そしてこの細胞を、１０％ ＦＣＳを含む、５ｍｌのＨＰ−１培地でリンスすることによって洗浄した。最後に、１０％ ＦＣＳを含む、２ｍｌの新鮮ＨＰ−１培地を添加した。
【０２０４】
安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、選択培地（Ｇ４１８を補充したＨＰ−１培地）中で増殖させた。この混合集団がコンフルエントに増殖された時に、この培養物を２つの皿に分割し、その後、３７℃で１２時間増殖させた。一方の細胞の皿を３０℃に移動させて、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を誘導した。もう一方の皿は、３７℃で維持した。
【０２０５】
可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を、ウェスタンブロット分析によって決定した。培養培地（０．５ｍｌ）をメタノール／クロロホルム沈殿させ、そしてこのペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、その後１５％アクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質を、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９−５５頁に記載のように、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。この膜を、ＴＢＳ（１０×ＴＢＳ １リットルあたり：８７．７ｇ ＮａＣｌ ６６．１ｇ 塩酸Ｔｒｉｚｍａ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇのＴｒｉｚｍａ塩基（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中の１％ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で１時間ブロックし、その後、抗ＧＰ１４０抗体または抗Ｇｐ−１６０抗体と共に１時間インキュベートした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ）で１０分間、３回洗浄し、アルカリホスファターゼ抗マウス／ウサギ／サル／ヒトＩｇＧ結合体と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの１０分間の２回の洗浄およびＴＢＳでの１０分間の２回の洗浄後、アルカリホスファターゼ検出試薬（５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％ジメチルホルムアミド中の７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中の５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を含む１０ｍｌのＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５））を使用して、発色反応を行った。
【０２０６】
（実施例１５）
（ＧＰ１４０ＦＯＳの産生および精製）
抗ｇｐ１２０抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化デキストランに共有結合させ、そしてクロマトグラフィーカラムに充填した。ＧＰ１４０ＦＯＳを含む上清を、このカラム上にロードし、そして十分な洗浄後、ＧＰ１４０ＦＯＳを、０．１Ｍ ＨＣｌを使用して溶出した。この溶出物を、収集チューブ中の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２を用いて、収集中に直接中和した。
【０２０７】
ジスルフィド結合形成は、精製の間に生じ得、従って、この収集したサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．３中の１０ｍＭ ＤＴＴで、２５℃で２時間処理した。
【０２０８】
ＤＴＴを、１０ｍＭ Ｍｅｓ；８０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に対する、その後の透析によって除去した。最後に、Ｇｐ１４０ＦＯＳを、実施例１６の記載のように、Ｅ２においてＪＵＮロイシンジッパーを含むアルファウイルス粒子と混合した。
【０２０９】
（実施例１６）
（アルファワクチン粒子の調製）
１００ｋＤの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓを、製造業者によって供給されるプロトコルに従って使用して、ウイルス粒子（実施例２および３を参照のこと）を濃縮した。あるいは、ウイルス粒子を、Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の説明マニュアルに記載のように、スクロース密度勾配遠心によって濃縮した。ウイルス懸濁液のｐＨを７．５に調整し、そしてウイルス粒子を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴの存在下で数時間インキュベートした。ウイルス粒子を、適切な緩衝液のＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウイルス粒子を空隙容量で溶出する）上で、混在タンパク質から精製した。
【０２１０】
精製したウイルス粒子を、適切な酸化還元混合物（ｒｅｄｏｘ ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下の適切な緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）中で、少なくとも２４０倍モル過剰のＦＯＳ−抗原融合タンパク質と共に、４℃で少なくとも１０時間インキュベートした。１００ｋＤの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅを使用して、この粒子を濃縮した後、この混合物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。ウイルス粒子を、空隙容量で溶出させた。
【０２１１】
（実施例１７：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のアミノ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、ＨＢｃＡｇアミノ酸配列１〜１４４のアミノ末端に融合した（ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ構築物）。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ ＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスおよびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いて、ｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）プライマーには、ＥｃｏＲＩ部位、次いで開始ＡＴＧコドンを導入した。ＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）プライマーには、アミノ酸配列ＧＡＡＧＳをコードするリンカーを導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）配列を、プライマーＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミド（ＡＴＣＣ番号３１５１８から得た）から増幅した。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、ＪＵＮヘリックスをコードする配列の３’末端に対応する配列、続いてＧＡＡＧＳリンカーをコードする配列およびＨＢｃＡｇ配列の５’末端を含む。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）に、ＨＢｃＡｇ遺伝子の後ろに終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入する。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物において使用する。両方の反応については、温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２１２】
【化１６】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより行った。１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。ＰＣＲサイクリング条件は、以下であった：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。最終的なＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、精製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液中で１６時間にわたり消化した。消化したＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析によりおよびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１３】
（実施例１８：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のカルボキシ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、ＨＢｃＡｇアミノ酸配列１〜１４４に融合した（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ構築物）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ ＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスおよびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いてｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、アミノ酸ＬＡＡＧをコードするリンカーを導入した。この配列はまた、ＳａｃＩＩ部位を含む。ＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）には、終止コドン（ＴＡＡ）、次にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）ＤＮＡ配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）には、ＨＢｃＡｇコード配列の開始ＡＴＧの前に、ＥｃｏＲＩ部位を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）−ＪＵＮ（ａｓ）には、ペプチドリンカー（ＬＡＡＧ）をコードする配列を導入する。これはまた、ＳａｃＩＩ部位を含む。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物において使用した。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２１４】
【化１７】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより行った。ＰＣＲ融合については、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中の、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。ＰＣＲサイクリング条件は、以下であった：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。最終的なＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分析し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含む適切な緩衝液中で１６時間にわたり消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現ベクターを生成した。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析によりおよびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１５】
（実施例１９：ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）のｃ／ｅ１エピトープへのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの挿入）
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）は、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドの表面上の先端領域に位置することが公知である。タンパク質のこの領域の一部（残基７６〜８２）は、ＪＵＮヘリックスによって遺伝的に置換されて、抗原（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓ構築物）についての付着部位を提供した。このＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓ ＤＮＡ配列を、ＰＣＲにより生成した：ＪＵＮヘリックス配列および２つのＨＢｃＡｇフラグメント（アミノ酸残基１〜７５および８３〜１４４）をコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＢａｍＨＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いてｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＢａｍＨＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、ペプチド配列ＧＳＧＧＧをコードするリンカー配列（ＢａｍＨＩ部位もまた含む）を導入した。ＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）には、ペプチドリンカー（ＧＡＡＧＳ）をコードする配列、次いで、ＪＵＮコード配列の３’末端に相補的な配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７５）ＤＮＡ配列を、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ７５−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、ｐＥｃｏ６３プラスミドから増幅した。ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）には、ＥｃｏＲＩ部位、次いで、ＨＢｃＡｇ配列の５’末端に対応する配列を導入した。ＨＢｃＡｇ７５−ＪＵＮ（ａｓ）には、ＨＢｃＡＧのアミノ酸７５の後にペプチドＧＳＧＧＧをコードするリンカー、次いで、ＪＵＮヘリックスをコードする配列の５’末端に相補的な配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）フラグメントを、プライマーＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ８３（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて増幅した。ＪＵＮ−ＨＢｃＡｇ８３（ｓ）は、ＪＵＮコード配列の３’末端に対応する配列、次いで、ペプチドＧＡＡＧＳをコードするリンカー、およびＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）をコードする配列の５’末端に対応する配列を含んでいた。ＨＢｃＡｇ（１〜１４４）Ｈｉｎｄ（ａｓ）には、ＨＢｃＡＧ遺伝子のコドン１４４の後ろに、終止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＰＣＲ反応については、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、５０μｌの反応混合物（２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４）において使用した。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間、および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。
【０２１６】
【化１８】
３つのＰＣＲフラグメントの融合を、以下のとおりに行った。最初に、ＨＢｃＡｇ１〜７５をコードするフラグメントを、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＪＵＮ−ＳａｃＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより、ＪＵＮをコードする配列と融合した。第２に、得られた産物を、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ＰＣＲにより、ＨＢｃＡｇ（８３〜１４４）フラグメントと融合した。ＰＣＲ融合に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。同じＰＣＲサイクルを、個々のフラグメントの生成と同じように用いた。最終的なＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含有する適切な緩衝液中で１６時間消化した。ＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮＩｎｓベクターを得た。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１７】
（実施例２０：麻疹ウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質のカルボキシ末端へのＪＵＮ両親媒性ヘリックスの融合）
ＪＵＮヘリックスを、アミノ酸残基１〜４７３を含む短縮化麻疹ウイルスＮタンパク質フラグメントのカルボキシ末端に融合した（Ｎ４７３−ＪＵＮ構築物）。Ｎ４７３−ＪＵＮをコードするＤＮＡ配列を構築するために、ＪＵＮヘリックスをコードする配列およびＮ４７３−ＪＵＮをコードする配列を、ＰＣＲにより別々に増幅した。ＪＵＮ配列を、プライマーＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）およびＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）を用いて、ｐＪｕＦｏプラスミドから増幅した。ＳａｃＩＩ−ＪＵＮ（ｓ）には、ペプチドリンカーＬＡＡＧをコードする配列を導入した。この配列はまた、ＳａｃＩＩ部位を含んでいた。ＪＵＮ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ａｓ）アンチセンスプライマーには、終止コドン、次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。Ｎ（１〜４７３）配列を、プライマーＥｃｏＲＩ−Ｎｍｅａ（ｓ）およびＮｍｅａ−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、完全な麻疹ウイルスＮタンパク質コード配列を含むｐＳＣ−Ｎプラスミド（Ｍ．Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｚｕｒｉｃｈから得た）から増幅した。ＥｃｏＲＩ−Ｎ（ｍｅａ）（ｓ）には、Ｎコード配列の開始ＡＴＧの前にＥｃｏＲＩ部位を導入した。Ｎ（ｍｅａ）−ＪＵＮ（ａｓ）は、Ｎ（１〜４７３）コード配列の３’末端に相補的であり、次は、ペプチドリンカー（ＬＡＡＧ）についてのコード配列に相補的な配列であった。ＰＣＲ反応に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中で用いた。温度サイクリングを以下のとおりに行った：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５５℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。
【０２１８】
【化１９】
２つのＰＣＲフラグメントの融合を、プライマーＥｃｏＲＩ−Ｎｍｅａ（ｓ）およびＮｍｅａ−ＪＵＮ（ａｓ）を用いて、さらにＰＣＲにおいて行った。ＰＣＲ融合に関しては、１００ｐｍｏｌの各オリゴを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含有する５０μｌの反応混合物中、１００ｎｇの精製ＰＣＲフラグメントとともに用いた。温度サイクリングを、以下のとおりに行った：９４℃で２分間；および９４℃（１分間）、５０℃（１分間）、７２℃（２分間）を３５サイクル。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を含有する適切な緩衝液中で１６時間消化した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクターに連結して、ｐＫＫ−Ｎ４７３−ＪＵＮプラスミドを得た。ＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびインサートのＤＮＡ配列決定により分析した。
【０２１９】
（実施例２１）
（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの発現および部分的精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ ｂｌｕｅを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮで形質転換した。細菌の一晩の培養物１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に接種（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）した。この培養物を、６００ｎｍでおよそ０．８のＯＤに達するまで、３７℃で４時間増殖させた。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの合成の誘導を、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することにより行った。誘導後、細菌を、３７℃で１６時間さらに振蕩した。細菌を、５０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。このペレットを、−２０℃で凍結した。このペレットを融解し、そして２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁した。細胞を、室温で３０分間インキュベートし、そしてＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌを使用して破壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、溶解物に添加して、０．２％の最終濃度にして、そしてこの溶解物を、氷上で３０分間インキュベートし、そして時々振蕩した。図４は、ＩＰＴＧでの誘導の際のＥ．ｃｏｌｉにおけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質発現を示す。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現プラスミドまたはコントロールプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ発現の誘導のために使用した。ＩＰＴＧの添加前に、サンプルを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮプラスミドを保有する細菌培養物（レーン３）から、およびコントロールプラスミドを保有する培養物（レーン１）から取り除いた。ＩＰＴＧ添加の１６時間後に、サンプルを再度、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを含む培養物（レーン４）から、およびコントロール培養物（レーン２）から除去した。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によってモニターした。
【０２２０】
次いで、この溶解物を、不溶性細胞片を除去するために、１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。この上清およびペレットを、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡから購入）を使用して、ウエスタンブロッティングにより分析した。これは、有意な量のＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質が可溶性であることを示した（図５）。簡潔には、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞からの溶解物、およびコントロール細胞からの溶解物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）およびペレット（＝不溶性画分）を分離し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等しい容量にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でのウエスタンブロッティングによって分析した。レーン１：可溶性画分、コントロール細胞；レーン２：不溶性画分、コントロール細胞；レーン３：可溶性画分、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮを発現している細胞；レーン４：不溶性画分、ＨｂｃＡｇ−ＪＵＮを発現している細胞。
【０２２１】
清澄化した細胞溶解物を、３ｍｌの１５％スクロース溶液、続いて４ｍｌの細菌溶解物を重層した４ｍｌの６５％スクロース溶液からなる、スクロース段階的勾配を用いる、段階的勾配遠心分離に使用した。このサンプルを、１００，０００×ｇにて４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、この勾配の頂端から１ｍｌの画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によって分析した（図６）。レーン１：遠心分離前の総Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、レーン１および２：勾配の頂端からの画分１および２、レーン４〜７：画分５〜８（１５％スクロース）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質を、クーマシー染色によって検出した。
【０２２２】
ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮタンパク質を、１５％スクロースと６５％スクロースとの間の界面に濃縮させた。このことは、このタンパク質がカプシド粒子を形成したことを示す。ほとんどの細菌タンパク質は、この勾配のスクロースを含まない上層に残存し、従って、ＨＢｃＡＧ−ＪＵＮ粒子の段階的勾配遠心分離は、この粒子を濃縮すること、および部分精製することの両方を導く。
【０２２３】
（実施例２２）
（ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの共有結合）
ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子へのタンパク質を結合の実証するために、本発明者らは、そのカルボキシ末端がＦＯＳヘリックスに融合したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を、モデルタンパク質（ｈＧＨ−ＦＯＳ）として選択した。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子を、部分的に精製されたｈＧＨ−ＦＯＳと混合し、そして４℃で４時間インキュベートし、このタンパク質の結合を可能にした。次いで、この混合物を、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ溶液およびｈＧＨ−ＦＯＳ溶液の両方に存在するＤＴＴを除去するために、３０００倍容量の透析緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０））に対して一晩透析し、それによって、ジスルフィド結合の確立を通じて、タンパク質の共有結合を可能にする。コントロールとして、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ溶液およびｈＧＨ−ＦＯＳ溶液もまた、透析緩衝液に対して透析した。３つ全ての透析したタンパク質溶液からのサンプルを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの結合を、抗ｈＧＨイムノブロットにおいて検出した（図７）。ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮに結合したｈＧＨ−ＦＯＳは、およそ５３ｋＤａの見かけの分子量で移動するはずであり、一方、非結合ｈＧＨ−ＦＯＳは、３１ｋＤａの見かけの分子量で移動する。この透析液を、還元剤の非存在下（レーン３）、および還元剤の存在下（レーン２）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてクーマシー染色によって検出した。コントロールとして、カプシド粒子と混合されていないｈＧＨ−ＦＯＳもまた、還元剤の存在下でゲルにロードした（レーン１）。
【０２２４】
およそ５３ｋＤａの分子量へのｈＧＨ−ＦＯＳの変動を、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮカプシドタンパク質の存在下で観察した。このことは、ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮへのｈＧＨ−ＦＯＳの効率的な結合が生じたことを示唆する。
【０２２５】
（実施例２３）
（ＨＢｃＡｇ（１〜１４９）のｃ／ｅ１エピトープへのリジン残基を含むペプチドの挿入）
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスカプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面上の先端領域（ｔｉｐ ｒｅｇｉｏｎ）に配置した。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙによって遺伝的に置換した（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構築物）。この導入されたリジン残基は、遊離システイン基を含む任意の抗原を有するＨＢｃＡｇ粒子の分子間化学的架橋のために使用され得る反応性アミノ基を、その側鎖に含む。
【０２２６】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ ＤＮＡ配列を、ＰＣＲによって作製した：ＨＢｃＡｇフラグメントをコードする２つのフラグメント（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）を、ＰＣＲによって別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用されたプライマーもまた、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙペプチドをコードするＤＮＡ配列を導入した。ＨＢｃＡｇ（１〜７８）フラグメントを、プライマーであるＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を使用して、ｐＥｃｏ６３から増幅した。ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）フラグメントを、プライマーであるＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーであるＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、相補性ＤＮＡ配列を、２つのＰＣＲ産物の末端に導入し、このことは、その後のアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）ＰＣＲにおいて２つのＰＣＲ産物の融合を可能にした。アセンブリしたフラグメントを、プライマーＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を使用して、ＰＣＲによって増幅した。
【０２２７】
ＰＣＲについては、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む５０μｌの反応混合物において使用した。両方の反応について、温度のサイクリングを、以下の通りに行った：９４℃で２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）を３０サイクル。
【０２２８】
（プライマー配列）
【０２２９】
【化２０】
ＰＣＲによる２つのＰＣＲフラグメントの融合のために、１００ｐｍｏｌのプライマーであるＥｃｏＲＩ ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１〜１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を、１００ｎｇの２つの精製されたＰＣＲフラグメントとともに、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む、５０μｌの反応混合物中で使用した。ＰＣＲサイクル条件は、以下であった：９４℃で２分間；９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）を３０サイクル。アセンブリされたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、精製し、そしてＥｃｏＲＩ制限酵素およびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって、適切な緩衝液中で１９時間消化した。この消化されたＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＫベクター中に連結して、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを作製した。このベクターへのＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限分析およびこのインサートのＤＮＡ配列決定によって分析した。
【０２３０】
（実施例２４）
（ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および部分精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ ｂｌｕｅを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓで形質転換した。細菌の一晩の培養物１ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に接種した。この培養物を、６００ｎｍでおよそ０．８のＯＤに達するまで、３７℃で４時間増殖させた。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘導を、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することにより行った。誘導後、細菌を、３７℃で１６時間さらに振蕩した。細菌を、５０００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。このペレットを、−２０℃で凍結した。このペレットを融解し、そして２００μｇ／ｍｌリゾチームおよび１０μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）を補充した細菌溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中に再懸濁した。細胞を、室温で３０分間インキュベートし、そしてＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌを使用して破壊した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、溶解物に添加し、０．２％の最終濃度にして、そしてこの溶解物を、氷上で３０分間インキュベートし、そして時々振蕩した。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたはコントロールプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、ＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現の誘導のために使用した。ＩＰＴＧの添加前に、サンプルを、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを保有する細菌培養物から、およびコントロールプラスミドを保有する培養物から取り除いた。ＩＰＴＧ添加の１６時間後に、サンプルを再度、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含む培養物から、およびコントロール培養物から除去した。タンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くクーマシー染色によってモニターした。
【０２３１】
次いで、この溶解物を、不溶性細胞片を除去するために、１２，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。この上清およびペレットを、ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡから購入）を使用して、ウエスタンブロッティングにより分析した。これは、有意な量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることを示す（図５）。簡潔には、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現しているＥ．ｃｏｌｉ細胞からの溶解物、およびコントロール細胞からの溶解物を、１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清（＝可溶性画分）およびぺレット（＝不溶性画分）を分離し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液で希釈して等しい容量にした。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１でのウエスタンブロッティングによって分析した。
【０２３２】
清澄化した細胞溶解物を、３ｍｌの１５％スクロース溶液、続いて４ｍｌの細菌溶解物を重層した４ｍｌの６５％スクロース溶液からなる、スクロース段階的勾配を用いる、段階的勾配遠心分離に使用した。このサンプルを、１００，０００×ｇにて４℃で３時間遠心分離した。遠心分離後、勾配の頂端から１ｍｌの画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシー染色によって分析した（図６）。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質を、クーマシー染色によって検出した。
【０２３３】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質を、１５％スクロースと６５％スクロースとの間の界面に濃縮させた。このことは、このタンパク質がカプシド粒子を形成したことを示す。ほとんどの細菌タンパク質は、この勾配のスクロースを含まない上層に残存し、従って、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の段階的勾配遠心分離は、この粒子を濃縮すること、および部分精製することの両方を導く。
【０２３４】
（実施例２５）
（異種二機能性架橋剤ＳＰＤＰを用いるＦＬＡＧペプチドのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓへの化学的結合）
アミノ末端にシステイン残基を有する合成ＦＬＡＧペプチド（アミノ酸配列ＣＧＧＤＹＫＤＤＤＤＫ）を、ＦＬＡＧペプチドに対する免疫応答を誘発するために、精製されたＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子に化学的に結合した。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の純度９５％の溶液（２ｍｇ／ｍｌ） ６００μｌを、異種二機能性架橋剤Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）（０．５ｍＭ）と共に３０分間室温でインキュベートした。反応の終了後に、遊離のＳＰＤＰを除くために、混合物を、１リットルの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（１５０ｍＭ ＮａＣｌを有する）に対して一晩透析した。次いで、５００μｌの誘導体化ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓカプシド（２ｍｇ／ｍｌ）を、金属触媒スフィドリル（ｓｕｆｈｙｄｒｙｌ）酸化を防ぐために１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で０．１ｍＭ ＦＬＡＧペプチド（アミノ末端システインを含む）と混合した。この反応を、ペプチドの遊離システインとの反応における、ＳＰＤＰからのピリミジン−２−チオン（ｔｈｉｏｎｅ）の遊離に起因する３４３ｎＭでの溶液の吸光度の増加により、モニターした。誘導体化Ｌｙｓ残基のペプチドとの反応は、約３０分後に終了した。
【０２３５】
ＦＬＡＧ装飾された粒子を、マウスに注射した。
【０２３６】
（実施例２６）
（ｐＭＰＳＶ−ｇｐ１４０ｃｙｓの構築）
ｇｐ１４０遺伝子を、オリゴｇｐ１４０ＣｙｓＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩｇｐ１４０を用いて、ｐＣｙｔＴＳｇｐ１４０ＦＯＳからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに関して、１００ｐｍｏｌのそれぞれのオリゴおよび５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、５０μｌの反応混合液（２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む）中で使用した。両方の反応に対して、温度サイクルを以下のように実施した：９４℃を２分間；９４℃（０．５分間）、５５度（０．５分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２３７】
ＰＣＲ産物を、ＱｉａＥＸＩＩキットを用いて精製し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、そして同一の酵素で切断したベクターｐＭＰＳＶＨＥ中に連結した。（オリゴ配列）
【０２３８】
【化２１】
（実施例２７）
（ｐＭＰＳＶｇｐ１４０Ｃｙｓの発現）
ｐＭＰＳＶｇｐ１４０Ｃｙｓ（２０μｇ）を、制限消化によって直線化した。反応をフェノール／クロロホルム抽出によって停止し、その後直線化ＤＮＡをイソプロパノール沈殿する。制限消化を、アガロースゲル電気泳動により評価した。トランスフェクションのために、５．４μｇの直線化ｐＭＰＳＶｇｐ１４０−Ｃｙｓを、３０μｌの水中で０．６μｇの直線化ｐＳＶ２Ｎｅｏと混合し、そして３０μｌの１Ｍ ＣａＣｌ２溶液を添加した。６０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０５））の添加後に、この溶液を５秒間ボルテックスし、続いて室温で２５秒間インキュベーションした。この溶液に、２％ＦＣＳを含むＨＰ−１培地（２％ＦＣＳ培地）を２ｍｌ、直ちに添加した。次いで、８０％コンフルエントなＢＨＫ２１細胞培養（６ウェルプレート）の培地を、ＤＮＡ含有培地に置き換えた。３７℃で５時間、ＣＯ２インキュベーター内でのインキュベートの後、ＤＮＡ含有培地を取り出し、２ｍｌの１５％グリセロール含有２％ＦＣＳ培地で置き換えた。グリセロール含有培地を、３０秒間のインキュベート相の後に取り出し、そしてこの細胞を、５ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＨＰ−１培地でのリンスにより洗浄した。最後に、２ｍｌの新鮮なＨＰ−１培地（１０％ＦＣＳを含む）を加えた。
【０２３９】
安定にトランスフェクトされた細胞を選択し、そしてＣＯ２インキュベーター内で、選択培地（Ｇ４１８を補充したＨＰ−１培地）中で３７℃で増殖した。混合集団がコンフルエントまで増殖したとき、培養物を２つのディッシュに分配し、その後、３７℃で１２時間の増殖期間を続ける。細胞の一方のディッシュを３０℃に移動し、可溶性ＧＰ１４０−ＦＯＳの発現を誘導させた。他方のディッシュを３７℃に維持した。
【０２４０】
可溶性ＧＰ１４０−Ｃｙｓの発現を、ウエスタンブロット分析によって解析した。培養培地（０．５ｍｌ）を、メタノール／クロロホルム沈殿し、そしてこのペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。サンプルを、９５℃で５分間加熱し、その後、１５％アクリルアミドゲルにアプライした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＢａｓｓおよびＹａｎｇ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９７）、２９−５５頁）に記載されたように、タンパク質をＰｒｏｔａｎ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｉｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。この膜を、ＴＢＳ（１０×ＴＢＳ １リットルあたり、８７．７ｇ ＮａＣｌ、６６．１ｇ Ｔｒｉｚｍａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）および９．７ｇ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）中に１％のウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、室温で一時間ブロックした後、抗ＧＰ１４０抗体または抗ＧＰ１６０抗体を用いて一時間インキュベートした。このブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１０分間３回洗浄し、アルカリホスファターゼ抗マウス／ウサギ／サル／ヒトＩｇＧ結合体を用いて一時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間２回、およびＴＢＳで１０分間２回洗浄した後、アルカリホスファターゼ検出試薬（５０μｌのＮＢＴ溶液（７０％のジメチルホルムアミド中に７．７％ Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ））および３７μｌのＸ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ジメチルホルムアミド中に５％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を含む１０ｍｌのＡＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）を用いて現像反応を行った。
【０２４１】
（実施例２８）
（ｇｐ１４０Ｃｙｓの精製）
抗ｇｐ１２０抗体を、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化デキストランと共有結合し、そしてクロマトグラフィーカラムに充填した。ＧＰ１４０Ｃｙｓを含む上清をカラムにロードし、そして十分な洗浄後に、ＧＰ１４０Ｃｙｓを、０．１Ｍ ＨＣｌで溶出した。溶出物を、回収チューブ中の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）を用いて回収中に直接中和した。
【０２４２】
精製中に、ジスフィルド結合形成が形成し得、したがって、回収サンプルを、１０ｍＭのＤＴＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中）を用いて、２５℃で２時間処理する。
【０２４３】
ＤＴＴを、１０ｍＭ Ｍｅｓ；８０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対する引き続く分析によって除去する。最終的に、実施例１６に記載されるように、ＧＰ１４０Ｃｙｓを、Ｅ２中のＪＵＮ残基を含むアルファウイルス粒子と混合する。
【０２４４】
（実施例２９）
（ＰＬＡ２−Ｃｙｓの構築）
ＰＬＡ２遺伝子を、オリゴＥｃｏＲＩＰＬＡおよびオリゴＰＬＡ−Ｃｙｓ−ｈｉｎｄを用いて、ｐＡＶ３ＰＬＡｆｏｓからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲについて、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、２ユニットのＰｗｏポリメラーゼ、０．１ｍＭ ｄＮＴＰおよび２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む５０μｌの反応混合液中で用いた。両反応について、温度サイクルを、以下のように行った：９４℃で２分間；９４℃（０．５分間）、５５℃（０．５分間）、７２℃（２分間）を３０サイクル。
【０２４５】
ＰＣＲ産物を、ＱｉａＥＸＩＩキットを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして同一の酵素で消化されたベクターｐＡＶ３に連結した。（オリゴ）
【０２４６】
【化２２】
（実施例３０）
（ＰＬＡ−ｃｙｓの発現および精製）
Ｃｙｓタグ化タンパク質の細胞質内産生のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ株をベクターｐＡＶ３：：ＰＬＡおよびｐＰＬＡ−Ｃｙｓを用いて形質転換した。培養物を、３７℃で振盪しながら、アンピシリン存在下の豊富な培地中でインキュベートした。培養物の吸光度（５５０ｎｍ）で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、インキュベーションをさらに５時間続けた。細胞を遠心分離によって回収し、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよびリゾチームを含む適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そしてフレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を通す通過によって破壊した。遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｃ、ＳＳ３４ローター、１５，０００ｒｐｍで４℃１０分間）の後、ペレットを、４℃で２５ｍｌの封入体洗浄緩衝液（２０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２３％ スクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８））中に再懸濁し、そして上記のように再遠心分離した。この手順を、遠心分離後の上清が本質的に清澄になるまで反復した。封入体を、２０ｍｌの可溶化緩衝液（５．５Ｍ 塩酸グアニジン、２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中に、室温で再懸濁し、そして不溶性の物質を、遠心分離および引き続く滅菌フィルター（０．４５μｍ）を通す上清の通過で除去した。タンパク質溶液を、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ ＤＴＴの存在下で、４℃で少なくとも１０時間維持し、次いで、１０容量の５．５Ｍ 塩酸グアニジン、２５ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６）に対して３回透析した。この溶液を、適切な酸化還元シャッフル（ｓｈｕｆｆｌｅ）（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン；シスチン／システイン）の存在下で、５１２Ｍの尿素、４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．３）に対して２回透析した。次いで、再フォールディングタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。このタンパク質を、２〜１０ｍＭ ＤＴＴ存在下で適切な緩衝液（ｐＨ７以上）中に保存し、システイン残基を還元型で保持した。このタンパク質とαウイルス粒子との結合の前に、ＤＴＴを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すタンパク質溶液の通過によって除去した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＣＹＴｔｓ：：Ｅ２ＪＵＮ発現ベクターを使用するＥ２−ＪＵＮ融合タンパク質を含むウイルス粒子の産生を示すウエスタンブロット。
【図２】 ｐＴＥ５’２Ｊ：：Ｅ２ＪＵＮ発現ベクターから発現されるＥ２−ＪＵＮ融合タンパク質を含むウイルス粒子の産生を示すウエスタンブロット。
【図３】 ＦＯＳ−ｈｇｈ抗原の細菌発現および真核生物発現を示すウエスタンブロット。
【図４】 Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮの発現。
【図５】 ＨＢｃＡｇ−ＪＵＮがＥ．ｃｏｌｉ溶解物に可溶性であることを示すウエスタンブロット。
【図６】 スクロース密度勾配におけるＨＢｃＡｇ−ＪＵＮキャプシド粒子の濃縮のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図７】 ｈＧＨ−ＦＯＳ粒子およびＨＢｃＡｇ−ＪＵＮ粒子の結合の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、組成物：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群から選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、ここで、該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に連結している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および、
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対して少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得、そして
ここで、該結合により該抗原または抗原決定基ならびに該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ここで；
ａ）前記コア粒子は、以下：
（ｉ）ウイルス；
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型、
からなる群より選択され；そして、
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
組成物。
【請求項３】
請求項２の組成物であって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、組成物。
【請求項４】
前記第２の付着部位が、前記抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記コア粒子が、組換え型アルファウイルスである、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、ここで、前記組換え型アルファウイルスが、シンドビスウイルスであり、そして、前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、組成物。
【請求項７】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記コア粒子が、ウイルス様粒子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の付着部位がアミノ基であり、そして、前記第２の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウイルス様粒子が、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の付着部位が、ＪＵＮポリペプチドであり、そして、前記第２の付着部位がＦＯポリペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１の付着部位がリジン残基であり、そして、前記第２の付着部位がシステイン残基である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子が、麻疹ウイルスカプシドタンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項２の組成物であって、ここで、前記コア粒子が以下：
ａ）ロタウイルスの組換え型タンパク質、
ｂ）ノーウォークウイルスの組換え型タンパク質、
ｃ）アルファウイルスの組換え型タンパク質、
ｄ）口蹄疫ウイルスの組換え型タンパク質、
ｅ）レトロウイルスの組換え型タンパク質、
ｆ）Ｂ型肝炎ウイルスの組換え型タンパク質、
ｇ）タバコモザイクウイルスの組換え型タンパク質、
ｈ）フロックハウスウイルスの組換え型タンパク質、および
ｉ）ヒトパピローマウイルスの組換え型タンパク質、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項１８】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１の付着部位がアミノ基であり、そして、前記第２の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記コア粒子が、非天然の起源である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ここで、前記コア粒子が、以下：
ａ）合成ポリマー、
ｂ）脂質ミセル、および
ｃ）金属、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項２２】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記抗原が、以下：
ａ）癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、
ｂ）感染症に対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、
ｃ）アレルゲンに対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、および
ｄ）家畜の免疫応答を誘導することに適しているタンパク質、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記抗原が、以下：
ａ）ＨＩＶの組換え型タンパク質、
ｂ）インフルエンザウイルスの組換え型タンパク質、
ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組換え型タンパク質、
ｄ）トキソプラズマの組換え型タンパク質、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｆ）三日熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｇ）卵形マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｈ）四日熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｉ）乳がん細胞の組換え型タンパク質、
ｊ）腎臓癌細胞の組換え型タンパク質、
ｋ）前立腺癌細胞の組換え型タンパク質、
ｌ）皮ふ癌細胞の組換え型タンパク質、
ｍ）脳癌細胞の組換え型タンパク質、
ｎ）白血病細胞の組換え型タンパク質、
ｏ）組換え型プロファイリング、
ｐ）ミツバチ針アレルギーの組換え型タンパク質、
ｑ）堅果アレルギーの組換え型タンパク質、
ｒ）食物アレルギーの組換え型タンパク質、
ｓ）喘息の組換え型タンパク質、または
ｔ）クラミジアの組換え型タンパク質、
である、組成物。
【請求項２６】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
天然に存在しない、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを生産するためのプロセスであって、以下の工程：
ａ）天然には存在しない分子足場を提供する工程であって、該天然には存在しない分子足場は、以下：
（ｉ）以下からなる群から選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および、
（２）天然起源のコア粒子；ならびに、
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、
ここで、該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に結合している、形成体、
を含む工程；ならびに
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基を提供する工程であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および、
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得る、工程；ならびに
ｃ）天然に存在しない該分子足場および該抗原または抗原決定基を組み合わせる工程であって、ここで、該会合により該抗原または抗原決定基ならびに該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、工程、
を包含するプロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプロセスであって、ここで、
ａ）前記コア粒子は、以下：
（ｉ）ウイルス
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型、
からなる群より選択され；そして、
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
プロセス。
【請求項２９】
請求項２８のプロセスであって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、プロセス。
【請求項３０】
前記第２の付着部位が、前記抗原または抗原決定基によって天然に存在しない、請求項２９に記載のプロセス、
【請求項３１】
単離された組換え型アルファウイルスであって、該アルファウイルスが以下：
ａ）ＲＮＡパッケージングシグナル配列の欠失；および
ｂ）前記アルファウイルスのＥ２エンベロープタンパク質核酸配列とインフレームなＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメイン核酸配列の天然に存在しない挿入、
をそのゲノム中に含む、アルファウイルス。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組換え型アルファウイルスを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載の組成物を、被験体に投与する工程を含む、医療処置の方法。
【請求項３４】
薬学的組成物であって、以下：
ａ）請求項１に記載の組成物；および、
ｂ）受容可能な薬学的キャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
以下を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する免疫化の方法：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群より選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、ここで、少なくとも１つの該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に結合している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基との天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、
ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対する少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得；そして、
ここで、該会合を通じて該抗原または抗原決定基および該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項３６】
前記免疫化が、免疫応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫化が、体液性免疫応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫化が、細胞免疫反応を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫化が、体液性免疫応答および細胞免疫反応を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記免疫化が、防御応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
以下を含むワクチン組成物：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群より選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、
ここで、少なくとも１つの該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に連結している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され：ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対する少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得；そして、
ここで、該会合を通じて該抗原または抗原決定基および該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項４２】
アジュバントをさらに含む、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載のワクチン組成物であって、ここで：
ａ）前記コア粒子が、以下：
（ｉ）ウイルス
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型；からなる群より選択され；そして
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして、
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
ワクチン組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項４５】
前記コア粒子が、ウイルス様粒子を含む、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記コア粒子が、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を含む、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記コア粒子が、麻疹ウイルス様粒子を含む、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
前記コア粒子が、ウイルスを含む、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４９】
前記コア粒子が、シンドビスウイルスを含む、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【請求項１】
以下を含む、組成物：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群から選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、ここで、該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に連結している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および、
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対して少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得、そして
ここで、該結合により該抗原または抗原決定基ならびに該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、ここで；
ａ）前記コア粒子は、以下：
（ｉ）ウイルス；
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型、
からなる群より選択され；そして、
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
組成物。
【請求項３】
請求項２の組成物であって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、組成物。
【請求項４】
前記第２の付着部位が、前記抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記コア粒子が、組換え型アルファウイルスである、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物であって、ここで、前記組換え型アルファウイルスが、シンドビスウイルスであり、そして、前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、組成物。
【請求項７】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記コア粒子が、ウイルス様粒子である、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の付着部位がアミノ基であり、そして、前記第２の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウイルス様粒子が、Ｂ型肝炎ウイルスカプシドタンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の付着部位が、ＪＵＮポリペプチドであり、そして、前記第２の付着部位がＦＯポリペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１の付着部位がリジン残基であり、そして、前記第２の付着部位がシステイン残基である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルス様粒子が、麻疹ウイルスカプシドタンパク質である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１４の組成物。
【請求項１６】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項２の組成物であって、ここで、前記コア粒子が以下：
ａ）ロタウイルスの組換え型タンパク質、
ｂ）ノーウォークウイルスの組換え型タンパク質、
ｃ）アルファウイルスの組換え型タンパク質、
ｄ）口蹄疫ウイルスの組換え型タンパク質、
ｅ）レトロウイルスの組換え型タンパク質、
ｆ）Ｂ型肝炎ウイルスの組換え型タンパク質、
ｇ）タバコモザイクウイルスの組換え型タンパク質、
ｈ）フロックハウスウイルスの組換え型タンパク質、および
ｉ）ヒトパピローマウイルスの組換え型タンパク質、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項１８】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１の付着部位がアミノ基であり、そして、前記第２の付着部位がスルフヒドリル基である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記コア粒子が、非天然の起源である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ここで、前記コア粒子が、以下：
ａ）合成ポリマー、
ｂ）脂質ミセル、および
ｃ）金属、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項２２】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、ＪＵＮロイシンジッパーポリペプチドおよび／またはＦＯＳロイシンジッパーポリペプチドである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物であって、ここで、前記抗原が、以下：
ａ）癌細胞に対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、
ｂ）感染症に対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、
ｃ）アレルゲンに対して免疫応答を誘導するのに適しているタンパク質、および
ｄ）家畜の免疫応答を誘導することに適しているタンパク質、
からなる群より選択される、組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、前記抗原が、以下：
ａ）ＨＩＶの組換え型タンパク質、
ｂ）インフルエンザウイルスの組換え型タンパク質、
ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの組換え型タンパク質、
ｄ）トキソプラズマの組換え型タンパク質、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｆ）三日熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｇ）卵形マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｈ）四日熱マラリア原虫の組換え型タンパク質、
ｉ）乳がん細胞の組換え型タンパク質、
ｊ）腎臓癌細胞の組換え型タンパク質、
ｋ）前立腺癌細胞の組換え型タンパク質、
ｌ）皮ふ癌細胞の組換え型タンパク質、
ｍ）脳癌細胞の組換え型タンパク質、
ｎ）白血病細胞の組換え型タンパク質、
ｏ）組換え型プロファイリング、
ｐ）ミツバチ針アレルギーの組換え型タンパク質、
ｑ）堅果アレルギーの組換え型タンパク質、
ｒ）食物アレルギーの組換え型タンパク質、
ｓ）喘息の組換え型タンパク質、または
ｔ）クラミジアの組換え型タンパク質、
である、組成物。
【請求項２６】
前記第１の付着部位および前記第２の付着部位が、それぞれ、相互作用するロイシンジッパーポリペプチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
天然に存在しない、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを生産するためのプロセスであって、以下の工程：
ａ）天然には存在しない分子足場を提供する工程であって、該天然には存在しない分子足場は、以下：
（ｉ）以下からなる群から選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および、
（２）天然起源のコア粒子；ならびに、
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、
ここで、該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に結合している、形成体、
を含む工程；ならびに
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基を提供する工程であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および、
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得る、工程；ならびに
ｃ）天然に存在しない該分子足場および該抗原または抗原決定基を組み合わせる工程であって、ここで、該会合により該抗原または抗原決定基ならびに該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、工程、
を包含するプロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載のプロセスであって、ここで、
ａ）前記コア粒子は、以下：
（ｉ）ウイルス
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型、
からなる群より選択され；そして、
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
プロセス。
【請求項２９】
請求項２８のプロセスであって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、プロセス。
【請求項３０】
前記第２の付着部位が、前記抗原または抗原決定基によって天然に存在しない、請求項２９に記載のプロセス、
【請求項３１】
単離された組換え型アルファウイルスであって、該アルファウイルスが以下：
ａ）ＲＮＡパッケージングシグナル配列の欠失；および
ｂ）前記アルファウイルスのＥ２エンベロープタンパク質核酸配列とインフレームなＪＵＮロイシンジッパータンパク質ドメイン核酸配列の天然に存在しない挿入、
をそのゲノム中に含む、アルファウイルス。
【請求項３２】
請求項３１に記載の組換え型アルファウイルスを含む、宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載の組成物を、被験体に投与する工程を含む、医療処置の方法。
【請求項３４】
薬学的組成物であって、以下：
ａ）請求項１に記載の組成物；および、
ｂ）受容可能な薬学的キャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
以下を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する免疫化の方法：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群より選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、ここで、少なくとも１つの該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に結合している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基との天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され、
ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対する少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得；そして、
ここで、該会合を通じて該抗原または抗原決定基および該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項３６】
前記免疫化が、免疫応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫化が、体液性免疫応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫化が、細胞免疫反応を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫化が、体液性免疫応答および細胞免疫反応を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記免疫化が、防御応答を生成する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
以下を含むワクチン組成物：
ａ）以下を含む、天然には存在しない分子足場：
（ｉ）以下からなる群より選択されるコア粒子：
（１）非天然起源のコア粒子；および
（２）天然起源のコア粒子；ならびに
（ｉｉ）少なくとも１つの第１の付着部位を含む形成体であって、
ここで、少なくとも１つの該形成体は、少なくとも１つの共有結合によって該コア粒子に連結している、形成体；ならびに、
ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原または抗原決定基であって、該第２の付着部位が、以下：
（ｉ）該抗原または抗原決定基と一緒には天然に存在しない付着部位；および
（ｉｉ）該抗原または抗原決定基と一緒に天然に存在する付着部位、
からなる群より選択され：ここで、該第２の付着部位が、該第１の付着部位に対する少なくとも１つの非ペプチド結合により会合し得；そして、
ここで、該会合を通じて該抗原または抗原決定基および該足場が相互作用して、順序付けられかつ反復性の抗原アレイを形成する、抗原または抗原決定基。
【請求項４２】
アジュバントをさらに含む、請求項４１に記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載のワクチン組成物であって、ここで：
ａ）前記コア粒子が、以下：
（ｉ）ウイルス
（ｉｉ）ウイルス様粒子；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ；
（ｉｖ）ウイルスのカプシド粒子；および
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の組換え型；からなる群より選択され；そして
ｂ）前記形成体は、ポリペプチドまたはその残基であり；そして、
ｃ）前記第２の付着部位が、ポリペプチドまたはその残基である、
ワクチン組成物。
【請求項４４】
請求項４３に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記第１の付着部位および／または前記第２の付着部位が、以下：
ａ）抗原およびそれに対する抗体または抗体フラグメント；
ｂ）ビオチンおよびアビジン；
ｃ）ストレプトアビジンおよびビオチン；
ｄ）レセプターおよびそのリガンド；
ｅ）リガンド結合タンパク質およびそのリガンド；
ｆ）相互作用するロイシンジッパーポリペプチド；
ｇ）アミノ基およびそれに対して反応性の化学基；
ｈ）カルボキシル基およびそれに対して反応性の化学基；
ｉ）スルフヒドリル基およびそれに対して反応性の化学基；または
ｊ）それらの組み合わせ、
を含む、ワクチン組成物。
【請求項４５】
前記コア粒子が、ウイルス様粒子を含む、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４６】
前記コア粒子が、Ｂ型肝炎ウイルス様粒子を含む、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４７】
前記コア粒子が、麻疹ウイルス様粒子を含む、請求項４５に記載のワクチン組成物。
【請求項４８】
前記コア粒子が、ウイルスを含む、請求項４３に記載のワクチン組成物。
【請求項４９】
前記コア粒子が、シンドビスウイルスを含む、請求項４８に記載のワクチン組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５１０９６０（Ｐ２０１０−５１０９６０Ａ）
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０００−５８４９１８（Ｐ２０００−５８４９１８）
【出願日】平成１１年１１月３０日（１９９９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ１９９９／００１９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０００／０３２２２７
【国際公開日】平成１２年６月８日（２０００．６．８）
【出願人】（５９９１１８４６９）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年１１月３０日（１９９９．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ１９９９／００１９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０００／０３２２２７
【国際公開日】平成１２年６月８日（２０００．６．８）
【出願人】（５９９１１８４６９）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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