抗原タンパク質コンジュゲートおよびその製造方法
抗原タンパク質コンジュゲートの、改良された製造方法を提供する。該コンジュゲートは、好ましくは、該抗原タンパク質中の１以上の遊離スルフヒドリル基との反応により形成される。本発明の方法は、好ましくは、トリアルキルホスフィンを還元剤として使用し、好ましくは単一反応容器内（すなわち、「インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）」）での、該抗原タンパク質中のジスルフィド結合の還元およびコンジュゲート部分とのコンジュゲート形成を可能にする。なぜなら、該製造方法は、最適には、後にスルフヒドリル反応剤を添加する前に該還元剤を除去することを必要としないからである。該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造される抗原タンパク質コンジュゲート、診断イムノアッセイにおけるその使用も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
とりわけ、本発明は、タンパク質コンジュゲートの分野、特に、抗原タンパク質のコンジュゲートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標識、タグまたは他の部分がタンパク質に結合したタンパク質コンジュゲートは、当技術分野で公知の多数の方法により形成されうる。タンパク質中のチオール（スルフヒドリル）基の数はアミンのような他の反応性基に比べて少ないため、標識またはタグのコンジュゲート形成するための、チオール基の使用は、タンパク質活性を遮断または不活性化する可能性がより低い、より集中的なアプローチを可能にする。
【０００３】
スルフヒドリル基はシステイン残基の形態でタンパク質中に存在し、しばしば、ジスルフィド結合の形態で存在する。したがって、コンジュゲート形成の前に、スルフヒドリル基を露出させるためにタンパク質を適当な還元剤で処理しなければならない。タンパク質のジスルフィド結合を還元するために典型的に使用される還元剤には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）が含まれる。還元剤としてこれらの化合物のいずれを使用する場合にも、スルフヒドリル反応試薬の導入の前に還元剤を除去する後続工程が必要である。なぜなら、還元剤のチオール官能性は、スルフヒドリル反応剤とも反応して、コンジュゲート形成効率を抑制および軽減しうるからである。したがって、チオール含有還元剤の使用は追加的な精製工程を必要とし、これは処理時間の増加を招き、それに伴い、スルフヒドリル基が酸化されて分子間および分子内ジスルフィド結合を再形成させる可能性を増加させる。
【０００４】
ジスルフィド結合を減少させるために、水溶性トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）も使用される（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６，２６４８−２６５０（１９９１））。ＴＣＥＰには、ＤＴＴおよびβ−ＭＥと比較して無臭であるという利点がある。また、ＴＣＥＰは水溶液中で速度論的に安定であり、広いｐＨ範囲にわたってその還元有効性を保有する。ＴＣＥＰは、７．５を超えるｐＨ値においてＤＴＴより有意に安定であることが示されており、８．０未満のｐＨ値においてＤＴＴより速効かつ強力な還元剤である。
【０００５】
ＴＣＥＰは一般に、ジスルフィド結合の還元に対して選択的であり、多数の他の官能性に対しては無反応性である又は最低限度の反応性しか有さないとみなされているが、いくつかの最近の研究は、ＴＣＥＰが実際には、あるチオール反応性官能性と反応することを示している。ＤＴＴとＴＣＥＰとの特性の比較において、研究者（Ｇｅｔｚ，Ｅ．Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０（１９９９））は、還元剤の非存在下での標識化と比較して、ＤＴＴおよびＴＣＥＰが共に、マレイミドでのスルフヒドリル基の標識化を抑制すること（尤も、この抑制は、ＤＴＴの存在下で、より顕著である）を報告している。ヨードアセトアミドでの標識化の場合には、低濃度（すなわち、０．１ｍＭ）では、ＴＣＥＰまたはＤＴＴのいずれの存在も標識化効率にほとんど影響を及ぼさないことが判明した。しかし、より高い濃度（すなわち、１．０ｍＭ）では、ＴＣＥＰは、対応量のＤＴＴより、ヨードアセトアミド結合に有害である。同様に、他の研究者（Ｓｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８２，１６１−１６４（２０００））は、ＴＣＥＰがヨードアセトアミド基およびマレイミド基の両方と迅速に結びついて、コンジュゲート形成工程の前にチオール−ペプチド溶液から過剰なＴＣＥＰを除去することが必要となると報告している。
【０００６】
タンパク質内のジスルフィド結合のＴＣＥＰ還元は多くの場合に用いられている。例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化および液体二次イオン化質量分析の準備におけるタンパク質の部分的還元（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｈ．ら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，７，２２５−２２８（１９９３））、蛍光偏光またはＦＲＥＴ研究のためのタンパク質の蛍光標識（Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ，Ｖ．ら，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０７，３６８−３７４（２００２））、ならびにマッピング目的のタンパク質ジスルフィド結合の限定的還元（Ｗｕ，Ｊ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６，３９１−３９８（１９９７））の場合が挙げられる。
【０００７】
この背景的情報は、本発明に関連している可能性があると本出願人が考えている情報を知らしめる目的で記載されている。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを必ずしも自認するものではなく、そのように解釈されるべきでもない。
【０００８】
本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物の全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６，２６４８−２６５０（１９９１）
【非特許文献２】Ｇｅｔｚ，Ｅ．Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８２，１６１−１６４（２０００）
【非特許文献４】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｈ．ら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，７，２２５−２２８（１９９３）
【非特許文献５】Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ，Ｖ．ら，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０７，３６８−３７４（２００２）
【非特許文献６】Ｗｕ，Ｊ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６，３９１−３９８（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概略
本発明の目的は、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法を提供することである。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含んでなる、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のもう１つの態様においては、好ましくは、（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される抗原タンパク質コンジュゲートを提供する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様においては、好ましくは、（ａ）抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体の形成を可能にする条件下、サンプルを、抗原タンパク質コンジュゲートと接触させること（ここで、該抗原タンパク質コンジュゲートは、検出可能な標識とコンジュゲート形成された抗原タンパク質を含み、好ましくは、（ｉ）該抗原タンパク質内の１以上のジスルフィド結合の還元を可能にする条件下、該抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｉｉ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、検出可能な標識とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される。）、および（ｂ）ステップ（ａ）において形成されたいずれかの抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体を検出することを含んでなる、サンプル中の抗原タンパク質に対する抗体を検出するための方法を提供する。
【００１３】
本発明のこれらの及び他の特徴は、添付図面を参照する以下の詳細な説明において、より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の例示的実施形態に従う法によりホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート形成されたタンパク質を製造するために用いる還元およびコンジュゲート形成工程の概要図を示す。この同じ方法が、組換え、合成または単離抗原タンパク質に適用されうる。
【図２】図２は、試験条件（Ａ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：８００希釈のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造、（Ｂ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：１６００希釈のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造、（Ｃ）ＤＴＴの非存在下の１：２００希釈の通常製造、（Ｄ）ＴＣＥＰの存在下の１：２００希釈の通常製造、（Ｅ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：２００希釈の通常製造に関する、血清を陰性対照（白抜きの棒グラフ）として使用した場合の、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）および通常技術により製造されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＮＳ３タンパク質コンジュゲートの重複サンプル（黒塗の棒グラフ）の感度の比較の結果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、５モル当量のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドおよび種々の濃度のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用するインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造した種々のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中に存在する抗ＨＩＶ抗体への結合能を示す棒グラフであり、ここで、製造中に以下のモル当量のＴＣＥＰを使用した：（Ａ）０、（Ｂ）２．５、（Ｃ）５、（Ｄ）１０、（Ｅ）２０、（Ｆ）４０、および（Ｇ）参照体（通常技術による製造）。
【図４】図４は、種々の濃度のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドおよび５モル当量のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用するインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造した種々のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中に存在する抗ＨＩＶ抗体への結合能を示す棒グラフであり、ここで、製造中に以下のモル当量のＨＲＰ−マレイミドを使用した：（Ａ）２．５、（Ｂ）５、（Ｃ）１０、（Ｄ）２０、および（Ｅ）参照体（通常技術による製造）。
【図５】図５は、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中の抗ＨＩＶ抗体への結合能を判定するための力価測定研究の結果を示す棒グラフであり、ここで、以下の希釈度の該タンパク質コンジュゲートを試験した：（Ａ）１：１３，０００、（Ｂ）１：２６，０００、および（Ｃ）１：５２，０００。
【図６】図６は、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（Ｘ軸）および通常技術（Ｙ軸）により製造したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの特異性の比較の結果を示す散布図である。ＳＤＳの非存在下で製造した該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）コンジュゲートが白抜きの三角形で示されており、ＳＤＳの存在下で製造した該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）コンジュゲートが黒塗の菱形で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、抗原タンパク質コンジュゲートの、改良された製造方法を提供する。該コンジュゲートは、好ましくは、該抗原タンパク質中の１以上の遊離スルフヒドリル基との反応により形成される。本発明の方法は、好ましくは、トリアルキルホスフィンを還元剤として使用する。さらに、該方法は、好ましくは、単一反応容器内（すなわち、「インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）」）での該抗原タンパク質中のジスルフィド結合の還元およびコンジュゲート部分とのコンジュゲート形成を可能にする。なぜなら、該方法は、後にスルフヒドリル反応剤を添加する前に該還元剤を除去することを必要としないからである。
【００１６】
本発明の１つの態様においては、本発明の方法により提供される抗原タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、通常の方法（例えば、ＤＴＴを使用する方法）により製造される対応コンジュゲートと比較して増強された抗体結合特性を示し、したがって、現在入手可能なスルフヒドリル誘導体化タンパク質コンジュゲートに対する改良に相当する。したがって、本発明は更に、好ましくは、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された改良された抗原タンパク質コンジュゲートを提供する。いずれの特定の理論またはメカニズムにも限定されるものではないが、該タンパク質にコンジュゲート形成されるコンジュゲート部分を含むスルフヒドリル反応剤と共にインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でトリアルキルホスフィン還元剤を使用すると、該タンパク質が、開いたコンホメーションで維持されて、エピトープを遮蔽または隠蔽しうるタンパク質折り畳みを妨げることが可能となると提議される。メカニズムには無関係に、本発明の方法により、システインを含有する鍵エピトープが遮蔽されず、開いたまま維持されることは、新規であり驚くべき結果である。
【００１７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、トリアルキルホスフィン還元剤の存在下の抗原タンパク質の遊離スルフヒドリル基とのコンジュゲート部分のコンジュゲート形成は、該還元剤の非存在下で該コンジュゲート形成工程の前に生じうる分子間または分子内ジスルフィド結合の再形成を最小にする。この実施形態においては、通常の技術により製造されたタンパク質コンジュゲートとは対照的に、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、ついで、追加的な還元剤の非存在下でコグネイト抗体に効率的に結合するよう使用されうる。
【００１８】
本発明のもう１つの態様においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）のような追加的な誘導体化剤を要することなく、抗原タンパク質内への十分なコンジュゲート部分の取込みをもたらす。
【００１９】
もう１つの態様においては、好ましくは、本発明の方法は、該タンパク質コンジュゲートを製造するのに必要な工程の数を最小にすることにより、通常の方法に比べて単純化されたコンジュゲート形成法である。１つの実施形態においては、還元剤を除去するための精製工程の省略は、好ましくは、通常のコンジュゲート形成方法と比べて、該方法の合計所要時間を減少させる。また、本発明の方法に必要な時間の減少は、酸化環境に対する反応物の曝露を最小にし、それにより、スルフヒドリル基が酸化され分子間および分子内ジスルフィド結合を再形成する可能性を減少させる。
【００２０】
もう１つの態様においては、好ましくは、本発明の方法は容易に再現可能であり、通常の方法より一貫した産物を与える。
【００２１】
本発明の方法により提供されるタンパク質コンジュゲートは、該タンパク質と該タンパク質に結合する抗体との間の相互作用の増強および／または産物の一貫性が有利となる多くの状況において有用である。具体例には、検出、精製およびアッセイ開発用途が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートを使用する、抗原タンパク質に対する抗体を検出する方法を提供する。
【００２２】
定義
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。
【００２３】
「シクロアルキル」なる語は、（特に示さない限り）３〜１５個の炭素原子を含有する環状または多環式アルキル基を意味する。多環式基の場合、これらは、遠位環の１つが芳香性でありうる多縮合環（例えば、テトラヒドロナフタレンなど）でありうる。
【００２４】
「アリール」なる語は、少なくとも１つの芳香環を有する芳香族炭素環式基（例えば、フェニルまたはビフェニル）または少なくとも１つの環が芳香性である多縮合環を有する芳香族炭素環式基（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、９−フルオレニルなど）を意味する。
【００２５】
「複素環」または「複素環式基」なる語は、少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、ＯもしくはＳを環内に有し、単一の環を有する（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）、または多縮合環を有する（例えば、ナフトピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニル、インダニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）、飽和、不飽和もしくは芳香族炭素環式基を意味する。
【００２６】
「ヘテロアリール」なる語は、少なくとも１つの複素環が芳香性である複素環を意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる「約」なる語は、示されている値からの凡そ＋／−１０％の変動を意味する。そのような変動は、それに特に言及されているかどうかには無関係に、本明細書に記載されている任意の与えられた値に常に含まれると理解されるべきである。
【００２８】
抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法
本発明は、好ましくは、スルフヒドリル誘導体化抗原タンパク質コンジュゲートを製造するためのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造方法を提供する。該方法は、好ましくは、該タンパク質のジスルフィド結合がトリアルキルホスフィンで還元されて遊離スルフヒドリル基を与える還元工程、およびコンジュゲート形成部分を含むスルフヒドリル反応性試薬と該遊離スルフヒドリル基とを反応させてスルフヒドリル誘導体化抗原タンパク質コンジュゲートを形成させることを含むコンジュゲート形成工程を含む。本発明においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンは、該コンジュゲート形成工程の前に該反応混合物から除去される必要がない。
【００２９】
１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、組換えタンパク質（単離および／または合成抗原タンパク質にも適用可能である）に関して図１に全般的に示す還元およびコンジュゲート形成工程を含む。この実施形態においては、好ましくは、該方法は、例えば該還元工程を３７℃で行った場合、わずか３時間で完了しうる。
【００３０】
コンジュゲート部分のジスルフィド結合の還元またはコンジュゲート形成を促進するために、それぞれ還元および／またはコンジュゲート形成工程の一部として、所望により、他の成分が含まれうる。
【００３１】
該方法は更に、該タンパク質コンジュゲートを下流の用途に最適化するために、所望により、コンジュゲート形成工程後に随意的な追加工程を含みうる。例えば、該方法は、コンジュゲート形成後に残存するいずれかの未反応遊離スルフヒドリル基を保護するための保護工程、１以上の精製工程などを含みうる。これは全て、後記（例えば、「反応条件」の説明）において、そしてまた、それに続く実施例において、より詳細に記載されている。
【００３２】
抗原タンパク質
本発明のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する種々の抗原タンパク質に関して該抗原タンパク質に対する抗体を検出することが望ましい場合のそのような種々の抗原タンパク質に適用されうる。該ジスルフィド結合は、分子内ジスルフィド結合（すなわち、該タンパク質分子内）として、あるいは分子間ジスルフィド結合（すなわち、２つのタンパク質分子間、例えば、二量体タンパク質の２つの分子間）として存在しうる。１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、分子内ジスルフィド結合を含む抗原タンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、分子間ジスルフィド結合を含む抗原タンパク質に適用される。
【００３３】
本発明の方法において使用する適当な抗原タンパク質の具体例には、疾患または感染の存在を示すタンパク質、例えばウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、自己免疫応答を誘発するタンパク質などが含まれるが、これらに限定されるものではない。非限定的な具体例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、の構造および非構造タンパク質が含まれる。呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリインフルエンザウイルス；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）および百日咳属種（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｓｐｐ．）；ならびに例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のようなヒトタンパク質が含まれる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法はウイルスタンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法はＨＣＶまたはＨＩＶタンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法はＨＣＶタンパク質に適用される。
【００３５】
該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法において使用するタンパク質は、単離されたタンパク質、組換えタンパク質または合成タンパク質でありうる。タンパク質の単離方法は、組換えタンパク質の製造方法と同様に、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。あるいは、該タンパク質は、好ましくは、商業的入手源から得られうる。多種多様な単離された又は組換え抗原タンパク質が、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎ．Ｖ．（Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）およびＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から、現在商業的に入手可能である。
【００３６】
本発明のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、１以上のジスルフィド結合を含む完全長タンパク質、末端切断型タンパク質および抗原タンパク質断片に同等に適用可能である。そのような断片は、好ましくは、単離された又は組換えタンパク質から、当技術分野で公知の断片化技術、例えばプロテアーゼ消化により作製されることが可能であり、あるいは、それらは、例えば標準的な固相ペプチド合成により、化学合成されることが可能であり、あるいは組換え技術を用いて製造されうる。同様に、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、天然タンパク質またはその突然変異体（ただし、該突然変異タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、該天然タンパク質のエピトープの１以上を保有する）に適用されうる。
【００３７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は完全長タンパク質または実質的に完全長のタンパク質に適用される。
【００３８】
トリアルキルホスフィン還元剤
該タンパク質のジスルフィド結合は、好ましくは、トリアルキルホスフィン還元剤を使用して還元され、それぞれの還元されたジスルフィド結合は２つのスルフヒドリル基を与え、それらの一方または両方を更にスルフヒドリル反応性試薬と反応させて該タンパク質コンジュゲートを形成させることが可能である。該トリアルキルホスフィンは、好ましくは、一般式（Ｉ）
【００３９】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、置換されている又は置換されていないアルキル基である）を有する。
【００４０】
多数のトリアルキルホスフィンが当技術分野で公知であり、商業的に入手可能である。具体例には、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、トリス（２−シアノエチル）ホスフィン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびトリブチルホスフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。固定化されたＴＣＥＰも（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから）商業的に入手可能であり、本発明の方法において使用されうる。
【００４１】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンは水溶性トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。あるいは、もう１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンはトリス（２−シアノエチル）ホスフィンである。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ＴＣＥＰと比較した場合のトリス−（２−シアノエチル）ホスフィンの疎水性の増加は該タンパク質の疎水性領域内への還元剤のより著しい透過を可能にし、これは、埋もれたジスルフィドとのより大きな反応性をもたらしうる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンはトリブチルホスフィンである。
【００４２】
他の成分
該還元反応には、該タンパク質中のジスルフィド結合の還元を促進する１以上の他の成分が含まれうる。例えば、１つの実施形態においては、該反応混合物に変性剤または界面活性剤を加えることが可能である。界面活性剤／変性剤は該タンパク質の疎水性コア内へのトリアルキルホスフィンの透過を促進しうる。タンパク質中のジスルフィド結合を還元するトリアルキルホスフィンの能力を妨げない適当な変性剤または界面活性剤は当業者により容易に選択されうる。具体例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、グアニジンおよびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。加えるべき変性剤の量は、当技術分野で公知のとおりに決定されうる。例えば、最適な結果を与える濃度を決定するために、種々の量の界面活性剤の存在下で該反応を行うことが可能である。
【００４３】
１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程に界面活性剤が含まれる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程にＳＤＳが含まれる。
【００４４】
タンパク質の疎水性コア内に位置するジスルフィド結合への接近は、好ましくは、反応混合物のｐＨを、それが酸性（例えば、ｐＨ約２．５〜ｐＨ約５．０）または塩基性（例えば、ｐＨ約９．０〜ｐＨ約１１．０）となるよう調節することにより促進されうる。ＴＣＥＰのようなトリアルキルホスフィンは広範なｐＨ領域にわたってそれらの有効性を保有するため、ｐＨの調節は、好ましくは、トリアルキルホスフィンの還元能に影響を及ぼさないであろう。所望により、ｐＨの調節は、酸、塩基およびバッファーのような当技術分野で公知の種々のｐＨ修飾試薬の使用により達成されうる。
【００４５】
１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程にｐＨ修飾試薬が含まれる。
【００４６】
スルフヒドリル反応性試薬
本発明の方法において使用するスルフヒドリル反応性試薬は、好ましくは、チオール反応性官能性に連結されたコンジュゲート部分を含む。該コンジュゲート部分は、好ましくは、該コンジュゲート部分上の官能基を介して直接的に、あるいはリンカーを介して間接的に、該チオール反応性官能性に連結されうる。
【００４７】
コンジュゲート部分
本発明の方法は、好ましくは、還元工程により、遊離スルフヒドリル基を介して、種々の有用な部分を抗原タンパク質にコンジュゲート形成するために使用されうる。本発明により想定されるコンジュゲート部分の具体例には、検出可能な標識、精製を促進する部分、および固定化を促進する又は固定化をもたらす部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、コンジュゲート部分は、検出可能な標識である。適当な検出可能な標識の非限定的な具体例には、直接的に検出されうる標識、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などが含まれる。検出可能な標識は、好ましくは、それ自体が検出可能であり、あるいは、場合によっては、それを１以上の追加的化合物と反応させて、検出可能な産物を生成させることが可能である。したがって、標識の検出を可能にするためには、直接的に検出可能な標識は、基質、誘発試薬、光などのような追加的な成分を要する、と当業者は理解するであろう。検出可能な標識の具体例には、色原体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジルおよびランタニドキレート誘導体）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウムおよびルミノール）、可視または蛍光粒子、核酸、錯化剤および酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼおよびルシフェラーゼ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。酵素使用の場合、例えば色原性、発蛍光性または発光性基質の添加は、好ましくは、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光およびラマン分光法のような他の検出系も有用である。
【００４９】
本発明はまた、望ましくは、間接的に検出される検出可能な標識の使用を提供する。間接的に検出可能な標識は、典型的には、「アフィニティーペア」、すなわち、該ペアの第１メンバーが本発明の検出用ペプチドに結合されており、該ペアの第２メンバーが第１メンバーに特異的に結合する、２つの異なる分子の使用を含む。該ペアの２つのメンバーの間の結合は、典型的には、化学的または物理的な性質のものである。そのような結合ペアの具体例には、抗原および抗体；アビジン／ストレプトアビジンおよびビオチン；ハプテン、およびハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子／基質および酵素などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、コンジュゲート部分は、検出可能な標識である。もう１つの実施形態においては、好ましくは、検出可能な標識は酵素である。もう１つの実施形態においては、好ましくは、検出可能な標識はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼである。
【００５１】
本発明はまた、コンジュゲート部分が固体支持体または粒子、または固体支持体上の固定化を促進する部分であることを想定している。適当な固体支持体および粒子の具体例には、多孔性および無孔性物質、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（例えば、米国特許第５，７０５，３３０号を参照されたい）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチックチューブが含まれる。固体支持体上の固定化を促進する部分の具体例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインおよびチログロブリンが含まれる。
【００５２】
チオール反応性官能性
当技術分野で公知の多数の異なるチオール反応性官能性が、本発明の方法におけるスルフヒドリル反応性試薬としての使用に適している。具体例には、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化ベンジルおよびブロモメチルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。使用されている個々の抗原タンパク質およびコンジュゲート部分ならびに得られるタンパク質コンジュゲートの下流用途に基づいて適当なチオール反応性官能性を選択することは当業者の知見の範囲内である。
【００５３】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、スルフヒドリル反応性試薬に含まれるチオール反応性官能性はマレイミドである。
【００５４】
リンカー
本発明の１つの実施形態においては、コンジュゲート部分は、好ましくは、リンカーを介してチオール反応性基に連結される。当技術分野で公知の種々の長さ及びコンホメーションのリンカーが使用されうる。ただし、それらは、得られるタンパク質コンジュゲートの機能を妨げないものでなければならない。該リンカーは、好ましくは、本発明の還元条件に対して安定である１以上の官能基を含みうる。例えば、そのような官能基は、好ましくは、アルキル、シクロアルキル、エーテル、ペプチドまたはそれらの組合せを含む。
【００５５】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、約１〜約１００個の炭素原子、場合によっては約１〜約５０個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−、−ＮＲ−（ここで、ＲはＨ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）、シクロアルキル基、アリール基、複素環基またはヘテロアリール基であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、アジド、シアノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールおよびヘテロアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００５６】
適当なリンカーの具体例には、好ましくは１〜約１００原子、場合によっては約１〜約５０個の原子の鎖長を有するペプチド；好ましくは、場合によっては約６〜約１００個の炭素原子、場合によっては約６〜約５０個の炭素原子の鎖長を有する、エタノールアミン、エチレングリコールおよびポリエチレンのような群から誘導されたリンカー；フェノキシエタノール；プロパノールアミド；ブチレングリコール；ブチレングリコールアミド；プロピルフェニル；ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチルおよびパルミトイルアルキル鎖が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の具体例には、好ましくは、約３〜約３０個の反復単位を有するポリエチレングリコールに基づくリンカーが含まれる。
【００５７】
１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する、分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−または−ＮＲ−（ここで、Ｒは前記と同意義である）であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００５８】
もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する、分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、シクロアルキル基またはアリール基により置換されていてもよい。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーはシクロヘキシル基またはフェニル基を含む。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは更に、１以上のアミド結合を含む。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する非分枝状の飽和炭化水素鎖であり、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−または−ＮＲ−（ここで、Ｒは前記と同意義である）であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００６０】
標的分子上の第一級アミンと反応しうる活性化エステルならびにマレイミドおよびヨードアセトアミドチオール反応性官能性を有する商業的に入手可能なヘテロ二官能性架橋試薬の非限定的な具体例には、Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート、３−（マレイミド）プロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１１−（マレイミド）ウンデカン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、マレイミド酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレイミド安息香酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミド酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、６−マレイミドヘキサン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、４−（４−マレイミドフェニル）酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、３−（マレイミド）プロピオン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、スクシンイミジル−４−ヨードアセチル−アミノベンゾアートおよび６−（ヨードアセトアミド）ヘキサン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが含まれる。
【００６１】
反応条件
本発明の１つの実施形態のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法を場合によって含む還元およびコンジュゲート形成工程を図１に図示する。抗原タンパク質をトリアルキルホスフィン還元剤と接触させる還元工程は、好ましくは、当技術分野で公知の範囲の反応条件下で行われうる（例えば、Ｈａｎ，Ｊ．Ｃ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２０，５−１０（１９９４）；Ｍｅｒｙ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４２，４４−５２（１９９３）；Ｒｕｅｇｇ，Ｕ．Ｔ．およびＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７，１１１−１２６（１９９７）を参照されたい）。また、適当な反応条件は、商業的に入手可能なトリアルキルホスフィンの製造業者により提供されるとおりのものである。
【００６２】
例えば、ＴＣＥＰまたは他のトリアルキルホスフィンは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約１００倍モル過剰で使用される。本発明の１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約７５倍モル過剰で、還元剤として使用される。もう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約５０倍モル過剰で、還元剤として使用される。もう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約２０倍モル過剰で、還元剤として使用される。さらにもう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して２〜約２０倍モル過剰で、還元剤として使用される。
【００６３】
該反応は、好ましくは、約５℃〜約１００℃の温度範囲にわたって、場合によってはｐＨ約２〜ｐＨ約１１のｐＨで行われうる。最適な反応時間の長さは、該反応が行われる温度に左右されるであろう。したがって、低温では、反応時間は数時間にわたることがあるが、室温またはそれ以上では、反応は一般に、約５分〜約３時間後に完了する。例えば、タンパク質の還元は、好ましくは、約２ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質水溶液に対して約２ｍＭ〜約３ｍＭのＴＣＥＰを使用した場合、約３０分以内に達成されうる。適当な反応条件は当業者により容易に決定されうる。
【００６４】
１つの実施形態においては、好ましくは、該還元工程は、約１００℃の温度で約８分間〜約１５分間、モル過剰のトリアルキルホスフィンの存在下で行われる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該還元工程は、室温で約３０分間〜約３時間、モル過剰のトリアルキルホスフィンの存在下で行われる。
【００６５】
前記のとおり、該トリアルキルホスフィンは、好ましくは、コンジュゲート形成工程前に反応混合物から除去される必要がない。場合によっては、前記のとおり、還元および／またはコンジュゲート形成工程において他の成分が使用されうる。例えば、ＴＰＥＰまたは他のトリアルキルホスフィンと共にＳＤＳが使用されることが可能であり、例えば、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のＳＤＳが使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のＳＤＳが使用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約２〜約８倍モル過剰のＳＤＳが使用される。さらにもう１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約５〜約７倍モル過剰のＳＤＳが使用される。
【００６６】
また、コンジュゲート形成工程は、好ましくは、使用する個々のタンパク質およびスルフヒドリル反応性試薬に応じて種々の条件下で行われうる。適当な条件は当業者により容易に決定されうる。
【００６７】
例えば、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、タンパク質に対して約１〜約２０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬、場合によっては、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、スルフヒドリル含量に対して約２〜約５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。ヨードアセトアミド試薬の場合、コンジュゲート形成反応は、好ましくは、光の非存在下で行われるべきである。
【００６８】
ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約６．０〜約９．０のｐＨおよび約２℃〜約４０℃の温度で行われる。本発明の１つの実施形態においては、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、該反応は約６．０〜約８．５のｐＨで行われる。本発明のもう１つの実施形態においては、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、該反応は約７．５〜約８．５のｐＨで行われる。
【００６９】
ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、用いる反応温度に応じて約１５分間〜約２４時間の反応時間が好ましい。例えば、約２℃〜約１０℃の低温では、約２時間〜約２４時間の反応時間が好ましい。上昇した温度、例えば室温〜約４０℃では、約３０分間〜約４時間の反応時間が好ましい。
【００７０】
もう１つの例として、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合には、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約２０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。もう１つの実施形態においては、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。
【００７１】
マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約６．０〜約８．０のｐＨおよび約２℃〜約４０℃の温度で行われる。用いる反応温度に応じて約３０分間〜約２４時間の反応時間が好ましい。例えば、約２℃〜約１０℃の低温では、約２時間〜約２４時間の反応時間が好ましい。上昇した温度、例えば室温〜約４０℃では、約３０分間〜約４時間の反応時間が好ましい。適当な条件は当業者により容易に決定されうる。
【００７２】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該方法は、マレイミドを含むモル過剰のスルフヒドリル反応性試薬を使用し、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約３０℃〜約４０℃の温度で約３０分間〜約２時間の反応時間にわたって行われる。本発明のもう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法は、マレイミドを含むモル過剰のスルフヒドリル反応性試薬を使用し、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約２℃〜約８℃の温度で、好ましくは約２時間〜約２４時間の反応時間にわたって行われる。
【００７３】
追加的工程
該方法は、場合によっては更に、コンジュゲート形成工程後に１以上の追加的工程を含みうる。例えば、好ましくは、該方法は保護工程、クエンチ工程、脱塩工程、１以上の精製工程またはそれらの組合せを含みうる。
【００７４】
１つの実施形態においては、保護またはクエンチ工程は、コンジュゲート形成工程後に未反応のまま残されたいずれかの遊離スルフヒドリル基の更なる反応を妨げるために用いられうる。保護は、当技術分野で公知のとおりに、例えば、ヨード酢酸、マレイミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルマレイミド）、システイン、ヨードアセトアミド、およびヨード酢酸の種々の塩の使用により達成されうる。クエンチは、好ましくは、適当な還元剤、例えばシステイン、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、β−メルカプトエタノールなどの添加により達成されうる。
【００７５】
脱塩は、好ましくは、適当な脱塩カラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから商業的に入手可能なもの）の使用により達成されうる。
【００７６】
好ましくは、クロマトグラフィーに基づく工程、例えばゲル濾過（例えば、ＰＤ１０カラムを使用するもの）、サイズ排除、イオン交換などを含む（これらに限定されるものではない）種々の精製方法も用いられうる。透析、濾過および接線流動濾過を含む（これらに限定されるものではない）追加的な精製方法も用いられうる。
【００７７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、還元およびコンジュゲート形成工程の後、保護工程、例えば、ヨード酢酸を使用する、例えば室温で約３時間の保護を行う。他の変法は当業者により容易に決定されうる。
【００７８】
抗原タンパク質コンジュゲートの特徴
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、本発明の方法により提供される抗原タンパク質コンジュゲートは、他の方法（例えば、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールを使用するもの）により製造された対応スルフヒドリル誘導体化コンジュゲートと比較して増強された抗体結合特性を示し、したがって、現在入手可能なスルフヒドリル誘導体化タンパク質コンジュゲートに対する改良に相当する。
【００７９】
抗体結合の増強は、例えば、イムノアッセイ形態における感度の増加により示されうる。感度の増加は、例えば、より低い力価の抗体を検出しうること、および／または同じ力価の抗体を、より低い濃度で使用された場合に検出しうることでありうる。１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、同じアッセイ条件下で通常方法により製造された対応スルフヒドリル誘導体化コンジュゲート（すなわち、「通常」スルフヒドリル誘導体化コンジュゲート）と比較された場合に、実質的に等価な力価の抗体を検出するのに、より低い濃度でイムノアッセイにおいて使用されうる。
【００８０】
多数のイムノアッセイの場合、スルフヒドリル基を介して誘導体化されたタンパク質コンジュゲートは、それらのコグネイト抗体に有効に結合するためには、アッセイにおいて還元剤の存在を要する。これとは対照的に、本発明の１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、還元剤の存在を要することなくコグネイト抗体に効率的に結合しうる。
【００８１】
用途
本発明の方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは多くの状況において有用である。例えば、該タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、コグネイト抗体の検出が必要な用途、例えば、コンジュゲート部分が検出可能標識である診断アッセイにおいて、および場合によっては、コグネイト抗体の精製が必要な用途において、例えば、コンジュゲート部分が固体支持体もしくは粒子、または固体支持体上の固定化を促進する部分である、アフィニティーリガンドとして使用されうる。本発明はまた、研究手段としての、例えば、アッセイの開発における、または特定の標的タンパク質に対する抗体の単離における、該抗原タンパク質コンジュゲートの使用を提供する。
【００８２】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、好ましくは該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートを使用して、抗原タンパク質に対する抗体を検出する方法を提供する。１つの実施形態においては、該タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、診断イムノアッセイにおいて使用される。
【００８３】
もう１つの態様において、本発明はまた、好ましくは１以上の抗原タンパク質コンジュゲートを含む、イムノアッセイキットを提供する。該抗原タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、コンジュゲート部分が固体支持体もしくは粒子である捕捉抗原として、および／またはコンジュゲート部分が検出可能標識である検出抗原として、該キットにおいて提供されうる。
【００８４】
特定の実施形態においては、該タンパク質コンジュゲートはＨＣＶ ＮＳ３コンジュゲートであり、これは、好ましくは、組合せＨＣＶ抗体−抗原検出アッセイにおいて使用される。もちろん、言うまでもなく、本明細書における典型的な形態の全て、および本発明の任意のアッセイまたはキットは、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載されている、ならびに例えばＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームを含む（これらに限定されるものではない）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により商業的に販売されている、自動化および半自動化系（微粒子を含む固相が存在するものを含む）における使用に適合化または最適化されうる。
【００８５】
また、本発明のアッセイおよびキットは、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイ系を含むポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）アッセイ系に適合化または最適化されうる。単一使用試験装置におけるイムノセンサーならびにその製造および操作方法が例えば米国特許第５，０６３，０８１号ならびに公開されている米国特許出願２００３０１７０８８１、２００４００１８５７７、２００５００５４０７８および２００６０１６０１６４（それらに関してそれらの教示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００８６】
つぎに、具体的な実施例に関して本発明を説明する。以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を記載するものであり、本発明を何ら限定するものではないと理解されるであろう。
【００８７】
実施例
【実施例１】
【００８８】
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造
組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質ＮＳ３およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートを以下のとおりに製造した。標準的なタンパク質発現方法に従い、組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）を製造した。これはＮＳ３の天然配列を、該天然配列のＮ末端の位置の該ベクターからのリーダー配列と共に含んでいた。
【００８９】
ＨＲＰ−マレイミド溶液を以下のとおりに調製した。２倍モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣをＤＭＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）に溶解された１００ｍｇ／ｍＬ ＨＲＰに加えた。該溶液を穏やかに攪拌し、室温で４５分間放置した。該溶液（２．３ｍＬ）をＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にローディングし、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）（３．２ｍＬ）で溶出することにより、該ＨＲＰ−マレイミドをゲル濾過により精製した。
【００９０】
ｐＨ６．８で、１０倍過剰のＴＣＥＰを含有するＴＣＥＰ（ＰｅｒｂｉｏまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の水溶液中、該ｒＮＳ３を室温で２時間還元して、還元されたｒＮＳ３を得た。前記のとおりに調製した、１０モル当量のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドを、還元されたｒＮＳ３およびＴＣＥＰの溶液に加え、得られた混合物を攪拌し、２〜８℃で１６〜２４時間放置して、ｒＮＳ３−ＨＲＰを得た。ついで未反応のスルフヒドリル基を室温で３時間の過剰のヨード酢酸との反応により保護した。得られた保護されたｒＮＳ３−ＨＲＰを、２．５ｍＬの産物を各カラム上にローディングし３ｍＬ中で溶出することにより、ＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５ Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過により精製して、最終的なｒＮＳ３−ＨＲＰ産物を得た。最終的なｒＮＳ３−ＨＲＰ産物を製造するために該４工程法を行うために必要な総時間は１．５日であった。
【実施例２】
【００９１】
通常技術によるＣ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートの製造
実施例１に記載のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法とは対照的に、ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの製造のための最も効率的な従来方法は９工程（中間産物の精製を含む）を要し、３日間の総時間を要した。
【００９２】
特に、ｒＮＳ３を約３００ｍＭの最終濃度のβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）と共に温置した。ついで、還元されたｒＮＳ３をＧ２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上に負荷し、８Ｍ 尿素／ＥＤＴＡ／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で溶出した。溶出した画分をタンパク質の存在に関して試験し、ついで該タンパク質を含有する画分を集めた。ついで、集めたｒＮＳ３画分を５０倍モル過剰のＳＡＴＡと共に３０℃で１時間温置した。該溶液を６Ｍ 尿素／ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）中、２〜８℃で２回（まず６時間、ついで一晩）透析した。該タンパク質中へのチオール基の取り込みを標準的な方法により分析した。
【００９３】
還元されたｒＮＳ３を１３倍モル過剰のＨＲＰ−マレイミドと共に２〜８℃で一晩温置し、同時に、該タンパク質に対して約１３０倍モル過剰のヒドロキシルアミンの添加によりデマスキングを行った。ついで該タンパク質に対して３０倍モル過剰としてβ−ＭＥを加え、２〜８℃で２０分間温置した。ついでＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）を該タンパク質に対して１００倍過剰として加えて、ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートを得た。これらの最後の２つの工程（β−ＭＥでの保護およびＮＥＭ添加）を省略しても、該通常ＨＣＶコンジュゲートの一部が得られたであろう。
【実施例３】
【００９４】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）および通常技術により製造されたＮＳ３タンパク質コンジュゲートの感度の比較
種々のコンジュゲート希釈度で陽性ＨＣＶ血清サンプル（ＱＣ１６９１）を使用して、ＨＣＶに対する抗体を各コンジュゲートが検出する能力を評価し、固定化ＮＳ３タンパク質を含むＨＣＶイムノアッセイキットを使用して、ＨＣＶ陰性サンプルでバックグラウンドのレベルを決定することにより、実施例１に記載されているとおりのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法および実施例２に記載されているとおりの通常技術により製造されたｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの感度を比較した。このキットは、２００６年９月１日付けで米国特許出願番号６０／８４１，８００（これに関してその教示を参照により本明細書に組み入れることとする）として出願された“Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ”と題する特許出願の対象である。該イムノアッセイキットと共に通常提供されるコンジュゲートの代わりに、実施例１および２において製造されたコンジュゲートを使用した。
【００９５】
該イムノアッセイキットは以下の成分を含んでいた。
【００９６】
１．９６ウェルの各プレートを精製組換えＨＣＶ抗原（ｒＮＳ３）、コアタンパク質ペプチドおよび抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体で被覆した。
【００９７】
２．表１に示す化学的組成および６．２のｐＨを有するサンプル希釈剤。
【００９８】
【表１】
【００９９】
３．表２に示す化学的組成および７．６のｐＨを有する陰性対照
【０１００】
【表２】
【０１０１】
４．表３に示す化学的組成および７．６のｐＨを有する抗体陽性対照
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
５．表４に示す化学的組成および１０．８〜１１．２のｐＨを有する抗原陽性対照
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
６．表５に示す化学的組成および６．８のｐＨを有するコンジュゲート希釈剤
【０１０６】
【表５】
【０１０７】
８．０．０４８％ 過酸化水素溶液、４．２３３％ クエン酸三ナトリウムおよび９５．７１９％ 蒸留水を含有し７．５〜８．５のｐＨを有する基質希釈剤。すべてのパーゼントは重量／重量パーセントとして計算されている。
【０１０８】
９．表６に示す化学的組成および２．０±０．３のｐＨを有する基質濃縮物
【０１０９】
【表６】
【０１１０】
基質溶液
基質溶液を調製するために、透明プラスチック容器において、以下の表７に示すとおりに、ある容量の無色基質希釈剤を等容量のオレンジ色基質濃縮物に加える。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
１０．該キットは洗浄用流体を含む。特に、１２５ｍＬの２０倍実効強度Ｔｗｅｅｎ／食塩水洗浄用流体を含有する１本または２本のボトル。該２０倍実効強度溶液は１．７１４％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標）（１０％溶液）、１．５４１％ プロパン−１，２−ジオール、０．１７３％ ５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、１４．２６６％ 塩化ナトリウム、０．８５７％ Ｔｗｅｅｎ ２０および８３．１３６％ 水を含有する。すべてのパーセントは重量／重量パーセントである。該溶液のｐＨは７であり、該溶液の密度は１．１１ｇ／ｍＬである。該洗浄用流体を蒸留水または脱イオン水のいずれかで２０分の１希釈して必要容量を得、あるいは洗浄用流体の１本のボトルの全内容物を２５００ｍＬの最終容量まで希釈する。希釈されると、該洗浄用流体は０．０１％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標）保存剤を含有する。
【０１１３】
イムノアッセイ法：
以下に記載する工程に従い、イムノアッセイを行った。すべての試薬およびサンプルおよび試薬を、使用前に１８〜３０℃にした。該試薬と共に使用するすべてのガラス器を２Ｍ 塩酸で十分に洗浄し、ついで蒸留水または高品質脱イオン水ですすいだ。
【０１１４】
該方法は以下の工程を含む。
【０１１５】
１．洗浄用流体を調製し、該コンジュゲートを再構成させる。
【０１１６】
２．５０μｌのサンプル希釈剤を各ウェルに加える。
【０１１７】
３．５０μｌのサンプルまたは５０μｌの対照をウェルに加える。白色背景の使用はサンプル添加の可視化を補助するであろう。
【０１１８】
４．該ウェルを蓋で覆い、室温で６０分間温置する（第１温置期間）。
【０１１９】
５．該温置期間の終了時に、「洗浄手順」に記載されているとおりに該プレートを洗浄する。洗浄が完了した後、該プレートを反転させ、残留洗浄用流体を吸収紙上に叩き取る。
【０１２０】
６．直ちに１００μｌのコンジュゲートを各ウェルに加える。
【０１２１】
７．該ウェルを蓋で覆い、室温で６０分間温置する（第２温置期間）。
【０１２２】
８．基質溶液を調製する。
【０１２３】
９．工程５を繰返す。
【０１２４】
１０．該プレートを洗浄した直後に、１００μｌの基質溶液を各ウェルに加える。
【０１２５】
１１．該ウェルを蓋で覆い、３７℃±１℃で温置する（第３温置期間）。直射日光を避ける。
【０１２６】
１２．５０μｌの停止溶液（０．５Ｍ 硫酸）を加える。
【０１２７】
１３．１５分以内に、利用可能であれば参照波長として６９０ｎｍを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取る。該装置を空気中でブランク化する（カートリッジ内にプレート無し）。
【０１２８】
洗浄手順：当技術分野で公知の標準的なプロトコールに従い、該プレートを洗浄した。
【０１２９】
結果：
典型的な実験の結果を図２に示す。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートが、通常のｒＮＳ３−ＨＲＰより高い力価（すなわち、より低い濃度）で使用可能であり、より高いシグナルおよびより低い陰性結果を与えたことを示している。また、該ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートはＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下で使用可能であり、一方、通常方法に従い製造されたｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの場合には、該コンジュゲート希釈剤に６ｍＭ ＤＴＴを加えなければならなかった。該通常ｒＮＳ３−ＨＲＰをＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下で使用した場合には、陽性シグナルが実質的に低下した。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法が該タンパク質構造を、開いたコンホメーションで維持し、予想されうるとおり、嵩張ったＨＲＰ部分が鍵エピトープを遮蔽することなく、それらが安定な様態で露出されることを示唆している。
【実施例４】
【０１３０】
界面活性剤を使用するＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造
ＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートを以下のとおりに製造した。８Ｍ 尿素、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）および該タンパク質に対して６．２５モル過剰のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する水溶液中、該タンパク質に対して５倍モル過剰のＴＣＥＰで、ｄｘ５８９を加熱ブロック中、１００℃で１０分間還元した。
【０１３１】
実施例１に記載のプロトコールを用いて、ＨＲＰ−マレイミドを製造した。ついで、還元されたｄｘ５８９を５倍モル過剰のＨＲＰ−マレイミドと２〜８℃で１５〜２４時間反応させた。
【実施例５】
【０１３２】
ＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造−ＴＣＥＰ濃度の最適化
得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがコグネイト抗体に結合する能力に対する該還元反応における種々の濃度のＴＣＥＰの効果を調べた。還元反応においてＳＤＳを加え、該タンパク質に対して５倍モル当量のＨＲＰ−マレイミドおよび種々の濃度（該タンパク質に対して０〜４０倍モル当量）のＴＣＥＰを使用する以外は実施例４に全般的に記載されているとおりに、種々のｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを製造した。ＨＩＶ陽性パネルＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３に対して該コンジュゲートを試験した。結果を図３に示す。
【０１３３】
通常ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの製造に関して実施例２に記載されている方法に従い、ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート（「Ｇ」、参照体、図３）も製造した。
【０１３４】
陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図３における黒塗の棒グラフ）を使用して、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、およびＨＩＶ陰性サンプル（図３における白抜きの棒グラフ）でのバックグラウンドのレベルの決定を、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｕｒｅｘ ＨＩＶ １．２．０キットを該キットと共に供給されたプロトコールに従い使用して評価し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰと比較した。該キットと共に通常供給されるコンジュゲートの代わりに該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを使用することにより、該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを試験した。典型的な実験の結果を図３に示す。この場合におけるＴＣＥＰの最適濃度は２．５〜２０倍モル当量と決定された。高い陽性シグナルと共に最低陰性シグナルを与えたＴＣＥＰの濃度は５倍モル当量と決定された。
【実施例６】
【０１３５】
ＨＩＶ ｇｐ−４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造−ＨＲＰ−マレイミド濃度の最適化
得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがコグネイト抗体に結合する能力に対するコンジュゲート形成反応における種々の濃度のＨＲＰ−マレイミドの効果を調べた。５倍モル当量のＴＣＥＰおよび種々の濃度（２．５〜２０倍モル当量）のＨＲＰ−マレイミドを使用する以外は実施例５に記載されているとおりの（すなわち、還元反応においてＳＤＳを使用しない）インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により、種々のｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを製造した。
【０１３６】
陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図４における黒塗の棒グラフ）を使用して、得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、およびＨＩＶ陰性サンプル（図４における白抜きの棒グラフ）でのバックグラウンドのレベルの決定を、実施例５に全般的に記載されている方法に従い評価し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰ（「ｒｅｆ」）と比較した。典型的な実験の結果を図４に示す。この目的におけるＨＲＰ−マレイミドの最適濃度は２．５〜１０倍モル当量と決定された。高い陽性シグナルと共に最低陰性シグナルを与えたＨＲＰ−マレイミドの濃度は５倍モル過剰と決定された。
【実施例７】
【０１３７】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの力価測定
実施例４に記載されているとおりに製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの、ＨＩＶ陽性サンプル中の抗体への結合における感度を評価した。該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの調製物を系列希釈し、陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図５における黒塗棒グラフ）を使用して、得られた希釈されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、および図５に全般的に記載されている方法に従いＨＩＶ陰性サンプル（図５における白抜きの棒グラフ）で観察されるバックグラウンドのレベルを決定することにより、該感度を評価した。典型的な実験の結果を図５に示す。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートが、高い希釈度（５２，０００分の１）においてさえ、抗体を特異的に検出可能であったことを示している。
【実施例８】
【０１３８】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術および通常技術により製造されたｄｘ５８９タンパク質コンジュゲートの特異性の比較
実施例５（ＳＤＳ無し）および実施例４（＋ＳＤＳ）に記載されているインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの特異性を、実施例５に記載されているアッセイ法に従い、ＨＩＶ陰性サンプルのパネルに対して評価し、偽陽性の数を決定し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰを使用して同じパネルで得られた偽陽性の数と比較した。
【０１３９】
典型的な実験の結果を図６に示す。白抜きの三角形は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（ＳＤＳ無し）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート、および通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰに関する比較データを示す。黒塗の菱形は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（＋ＳＤＳ）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート、および通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰに関する比較データを示す。水平および垂直の線は「カットオフ」値を示す。カットオフを超える値は「偽陽性」とみなされる。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（＋ＳＤＳ）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートが、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰと同等の特異性を有することを示している。これらの実験において該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（ＳＤＳ無し）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの特異性は満足しうるものではなかった。また、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートは、通常技術により製造されたコンジュゲートより一貫して製造することが可能であり、より再現性のある結果を与えた。
【０１４０】
本明細書中で言及されている全ての特許、刊行物（公開された特許出願を含む）およびデータベース登録の開示の全体を、それぞれのそのような個々の特許、刊行物およびデータベース登録が参照により本明細書に組み入れられると明示的かつ個々に示されているのと同等に、参照により本明細書に明示的に組み入れることとする。
【０１４１】
本発明は或る特定の実施形態に関して記載されているが、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱しないそれらの種々の修飾が当業者に明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
とりわけ、本発明は、タンパク質コンジュゲートの分野、特に、抗原タンパク質のコンジュゲートの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標識、タグまたは他の部分がタンパク質に結合したタンパク質コンジュゲートは、当技術分野で公知の多数の方法により形成されうる。タンパク質中のチオール（スルフヒドリル）基の数はアミンのような他の反応性基に比べて少ないため、標識またはタグのコンジュゲート形成するための、チオール基の使用は、タンパク質活性を遮断または不活性化する可能性がより低い、より集中的なアプローチを可能にする。
【０００３】
スルフヒドリル基はシステイン残基の形態でタンパク質中に存在し、しばしば、ジスルフィド結合の形態で存在する。したがって、コンジュゲート形成の前に、スルフヒドリル基を露出させるためにタンパク質を適当な還元剤で処理しなければならない。タンパク質のジスルフィド結合を還元するために典型的に使用される還元剤には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）が含まれる。還元剤としてこれらの化合物のいずれを使用する場合にも、スルフヒドリル反応試薬の導入の前に還元剤を除去する後続工程が必要である。なぜなら、還元剤のチオール官能性は、スルフヒドリル反応剤とも反応して、コンジュゲート形成効率を抑制および軽減しうるからである。したがって、チオール含有還元剤の使用は追加的な精製工程を必要とし、これは処理時間の増加を招き、それに伴い、スルフヒドリル基が酸化されて分子間および分子内ジスルフィド結合を再形成させる可能性を増加させる。
【０００４】
ジスルフィド結合を減少させるために、水溶性トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）も使用される（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６，２６４８−２６５０（１９９１））。ＴＣＥＰには、ＤＴＴおよびβ−ＭＥと比較して無臭であるという利点がある。また、ＴＣＥＰは水溶液中で速度論的に安定であり、広いｐＨ範囲にわたってその還元有効性を保有する。ＴＣＥＰは、７．５を超えるｐＨ値においてＤＴＴより有意に安定であることが示されており、８．０未満のｐＨ値においてＤＴＴより速効かつ強力な還元剤である。
【０００５】
ＴＣＥＰは一般に、ジスルフィド結合の還元に対して選択的であり、多数の他の官能性に対しては無反応性である又は最低限度の反応性しか有さないとみなされているが、いくつかの最近の研究は、ＴＣＥＰが実際には、あるチオール反応性官能性と反応することを示している。ＤＴＴとＴＣＥＰとの特性の比較において、研究者（Ｇｅｔｚ，Ｅ．Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０（１９９９））は、還元剤の非存在下での標識化と比較して、ＤＴＴおよびＴＣＥＰが共に、マレイミドでのスルフヒドリル基の標識化を抑制すること（尤も、この抑制は、ＤＴＴの存在下で、より顕著である）を報告している。ヨードアセトアミドでの標識化の場合には、低濃度（すなわち、０．１ｍＭ）では、ＴＣＥＰまたはＤＴＴのいずれの存在も標識化効率にほとんど影響を及ぼさないことが判明した。しかし、より高い濃度（すなわち、１．０ｍＭ）では、ＴＣＥＰは、対応量のＤＴＴより、ヨードアセトアミド結合に有害である。同様に、他の研究者（Ｓｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８２，１６１−１６４（２０００））は、ＴＣＥＰがヨードアセトアミド基およびマレイミド基の両方と迅速に結びついて、コンジュゲート形成工程の前にチオール−ペプチド溶液から過剰なＴＣＥＰを除去することが必要となると報告している。
【０００６】
タンパク質内のジスルフィド結合のＴＣＥＰ還元は多くの場合に用いられている。例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化および液体二次イオン化質量分析の準備におけるタンパク質の部分的還元（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｈ．ら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，７，２２５−２２８（１９９３））、蛍光偏光またはＦＲＥＴ研究のためのタンパク質の蛍光標識（Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ，Ｖ．ら，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０７，３６８−３７４（２００２））、ならびにマッピング目的のタンパク質ジスルフィド結合の限定的還元（Ｗｕ，Ｊ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６，３９１−３９８（１９９７））の場合が挙げられる。
【０００７】
この背景的情報は、本発明に関連している可能性があると本出願人が考えている情報を知らしめる目的で記載されている。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを必ずしも自認するものではなく、そのように解釈されるべきでもない。
【０００８】
本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物の全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５６，２６４８−２６５０（１９９１）
【非特許文献２】Ｇｅｔｚ，Ｅ．Ｂ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，７３−８０（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｅ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８２，１６１−１６４（２０００）
【非特許文献４】Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｗ．Ｈ．ら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，７，２２５−２２８（１９９３）
【非特許文献５】Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ，Ｖ．ら，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０７，３６８−３７４（２００２）
【非特許文献６】Ｗｕ，Ｊ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，６，３９１−３９８（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概略
本発明の目的は、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法を提供することである。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含んでなる、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のもう１つの態様においては、好ましくは、（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される抗原タンパク質コンジュゲートを提供する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様においては、好ましくは、（ａ）抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体の形成を可能にする条件下、サンプルを、抗原タンパク質コンジュゲートと接触させること（ここで、該抗原タンパク質コンジュゲートは、検出可能な標識とコンジュゲート形成された抗原タンパク質を含み、好ましくは、（ｉ）該抗原タンパク質内の１以上のジスルフィド結合の還元を可能にする条件下、該抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および（ｉｉ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、検出可能な標識とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される。）、および（ｂ）ステップ（ａ）において形成されたいずれかの抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体を検出することを含んでなる、サンプル中の抗原タンパク質に対する抗体を検出するための方法を提供する。
【００１３】
本発明のこれらの及び他の特徴は、添付図面を参照する以下の詳細な説明において、より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の例示的実施形態に従う法によりホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート形成されたタンパク質を製造するために用いる還元およびコンジュゲート形成工程の概要図を示す。この同じ方法が、組換え、合成または単離抗原タンパク質に適用されうる。
【図２】図２は、試験条件（Ａ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：８００希釈のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造、（Ｂ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：１６００希釈のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造、（Ｃ）ＤＴＴの非存在下の１：２００希釈の通常製造、（Ｄ）ＴＣＥＰの存在下の１：２００希釈の通常製造、（Ｅ）ＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下の１：２００希釈の通常製造に関する、血清を陰性対照（白抜きの棒グラフ）として使用した場合の、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）および通常技術により製造されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＮＳ３タンパク質コンジュゲートの重複サンプル（黒塗の棒グラフ）の感度の比較の結果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、５モル当量のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドおよび種々の濃度のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用するインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造した種々のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中に存在する抗ＨＩＶ抗体への結合能を示す棒グラフであり、ここで、製造中に以下のモル当量のＴＣＥＰを使用した：（Ａ）０、（Ｂ）２．５、（Ｃ）５、（Ｄ）１０、（Ｅ）２０、（Ｆ）４０、および（Ｇ）参照体（通常技術による製造）。
【図４】図４は、種々の濃度のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドおよび５モル当量のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用するインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造した種々のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中に存在する抗ＨＩＶ抗体への結合能を示す棒グラフであり、ここで、製造中に以下のモル当量のＨＲＰ−マレイミドを使用した：（Ａ）２．５、（Ｂ）５、（Ｃ）１０、（Ｄ）２０、および（Ｅ）参照体（通常技術による製造）。
【図５】図５は、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの、ＨＩＶ陰性サンプル（白抜きの棒グラフ）およびＨＩＶ陽性血清サンプル（黒塗棒グラフ−第１棒グラフ，ＱＣ１３６２；第２棒グラフ，ＱＣ１３６３）中の抗ＨＩＶ抗体への結合能を判定するための力価測定研究の結果を示す棒グラフであり、ここで、以下の希釈度の該タンパク質コンジュゲートを試験した：（Ａ）１：１３，０００、（Ｂ）１：２６，０００、および（Ｃ）１：５２，０００。
【図６】図６は、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（Ｘ軸）および通常技術（Ｙ軸）により製造したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）コンジュゲートの特異性の比較の結果を示す散布図である。ＳＤＳの非存在下で製造した該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）コンジュゲートが白抜きの三角形で示されており、ＳＤＳの存在下で製造した該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）コンジュゲートが黒塗の菱形で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、抗原タンパク質コンジュゲートの、改良された製造方法を提供する。該コンジュゲートは、好ましくは、該抗原タンパク質中の１以上の遊離スルフヒドリル基との反応により形成される。本発明の方法は、好ましくは、トリアルキルホスフィンを還元剤として使用する。さらに、該方法は、好ましくは、単一反応容器内（すなわち、「インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）」）での該抗原タンパク質中のジスルフィド結合の還元およびコンジュゲート部分とのコンジュゲート形成を可能にする。なぜなら、該方法は、後にスルフヒドリル反応剤を添加する前に該還元剤を除去することを必要としないからである。
【００１６】
本発明の１つの態様においては、本発明の方法により提供される抗原タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、通常の方法（例えば、ＤＴＴを使用する方法）により製造される対応コンジュゲートと比較して増強された抗体結合特性を示し、したがって、現在入手可能なスルフヒドリル誘導体化タンパク質コンジュゲートに対する改良に相当する。したがって、本発明は更に、好ましくは、インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された改良された抗原タンパク質コンジュゲートを提供する。いずれの特定の理論またはメカニズムにも限定されるものではないが、該タンパク質にコンジュゲート形成されるコンジュゲート部分を含むスルフヒドリル反応剤と共にインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）でトリアルキルホスフィン還元剤を使用すると、該タンパク質が、開いたコンホメーションで維持されて、エピトープを遮蔽または隠蔽しうるタンパク質折り畳みを妨げることが可能となると提議される。メカニズムには無関係に、本発明の方法により、システインを含有する鍵エピトープが遮蔽されず、開いたまま維持されることは、新規であり驚くべき結果である。
【００１７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、トリアルキルホスフィン還元剤の存在下の抗原タンパク質の遊離スルフヒドリル基とのコンジュゲート部分のコンジュゲート形成は、該還元剤の非存在下で該コンジュゲート形成工程の前に生じうる分子間または分子内ジスルフィド結合の再形成を最小にする。この実施形態においては、通常の技術により製造されたタンパク質コンジュゲートとは対照的に、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、ついで、追加的な還元剤の非存在下でコグネイト抗体に効率的に結合するよう使用されうる。
【００１８】
本発明のもう１つの態様においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）のような追加的な誘導体化剤を要することなく、抗原タンパク質内への十分なコンジュゲート部分の取込みをもたらす。
【００１９】
もう１つの態様においては、好ましくは、本発明の方法は、該タンパク質コンジュゲートを製造するのに必要な工程の数を最小にすることにより、通常の方法に比べて単純化されたコンジュゲート形成法である。１つの実施形態においては、還元剤を除去するための精製工程の省略は、好ましくは、通常のコンジュゲート形成方法と比べて、該方法の合計所要時間を減少させる。また、本発明の方法に必要な時間の減少は、酸化環境に対する反応物の曝露を最小にし、それにより、スルフヒドリル基が酸化され分子間および分子内ジスルフィド結合を再形成する可能性を減少させる。
【００２０】
もう１つの態様においては、好ましくは、本発明の方法は容易に再現可能であり、通常の方法より一貫した産物を与える。
【００２１】
本発明の方法により提供されるタンパク質コンジュゲートは、該タンパク質と該タンパク質に結合する抗体との間の相互作用の増強および／または産物の一貫性が有利となる多くの状況において有用である。具体例には、検出、精製およびアッセイ開発用途が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、もう１つの態様においては、本発明は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートを使用する、抗原タンパク質に対する抗体を検出する方法を提供する。
【００２２】
定義
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意義を有する。
【００２３】
「シクロアルキル」なる語は、（特に示さない限り）３〜１５個の炭素原子を含有する環状または多環式アルキル基を意味する。多環式基の場合、これらは、遠位環の１つが芳香性でありうる多縮合環（例えば、テトラヒドロナフタレンなど）でありうる。
【００２４】
「アリール」なる語は、少なくとも１つの芳香環を有する芳香族炭素環式基（例えば、フェニルまたはビフェニル）または少なくとも１つの環が芳香性である多縮合環を有する芳香族炭素環式基（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、フェナントリル、９−フルオレニルなど）を意味する。
【００２５】
「複素環」または「複素環式基」なる語は、少なくとも１つのヘテロ原子、例えばＮ、ＯもしくはＳを環内に有し、単一の環を有する（例えば、モルホリノ、ピリジルまたはフリル）、または多縮合環を有する（例えば、ナフトピリジル、キノキサリル、キノリニル、インドリジニル、インダニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）、飽和、不飽和もしくは芳香族炭素環式基を意味する。
【００２６】
「ヘテロアリール」なる語は、少なくとも１つの複素環が芳香性である複素環を意味する。
【００２７】
本明細書中で用いる「約」なる語は、示されている値からの凡そ＋／−１０％の変動を意味する。そのような変動は、それに特に言及されているかどうかには無関係に、本明細書に記載されている任意の与えられた値に常に含まれると理解されるべきである。
【００２８】
抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法
本発明は、好ましくは、スルフヒドリル誘導体化抗原タンパク質コンジュゲートを製造するためのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造方法を提供する。該方法は、好ましくは、該タンパク質のジスルフィド結合がトリアルキルホスフィンで還元されて遊離スルフヒドリル基を与える還元工程、およびコンジュゲート形成部分を含むスルフヒドリル反応性試薬と該遊離スルフヒドリル基とを反応させてスルフヒドリル誘導体化抗原タンパク質コンジュゲートを形成させることを含むコンジュゲート形成工程を含む。本発明においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンは、該コンジュゲート形成工程の前に該反応混合物から除去される必要がない。
【００２９】
１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、組換えタンパク質（単離および／または合成抗原タンパク質にも適用可能である）に関して図１に全般的に示す還元およびコンジュゲート形成工程を含む。この実施形態においては、好ましくは、該方法は、例えば該還元工程を３７℃で行った場合、わずか３時間で完了しうる。
【００３０】
コンジュゲート部分のジスルフィド結合の還元またはコンジュゲート形成を促進するために、それぞれ還元および／またはコンジュゲート形成工程の一部として、所望により、他の成分が含まれうる。
【００３１】
該方法は更に、該タンパク質コンジュゲートを下流の用途に最適化するために、所望により、コンジュゲート形成工程後に随意的な追加工程を含みうる。例えば、該方法は、コンジュゲート形成後に残存するいずれかの未反応遊離スルフヒドリル基を保護するための保護工程、１以上の精製工程などを含みうる。これは全て、後記（例えば、「反応条件」の説明）において、そしてまた、それに続く実施例において、より詳細に記載されている。
【００３２】
抗原タンパク質
本発明のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する種々の抗原タンパク質に関して該抗原タンパク質に対する抗体を検出することが望ましい場合のそのような種々の抗原タンパク質に適用されうる。該ジスルフィド結合は、分子内ジスルフィド結合（すなわち、該タンパク質分子内）として、あるいは分子間ジスルフィド結合（すなわち、２つのタンパク質分子間、例えば、二量体タンパク質の２つの分子間）として存在しうる。１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、分子内ジスルフィド結合を含む抗原タンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、分子間ジスルフィド結合を含む抗原タンパク質に適用される。
【００３３】
本発明の方法において使用する適当な抗原タンパク質の具体例には、疾患または感染の存在を示すタンパク質、例えばウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、自己免疫応答を誘発するタンパク質などが含まれるが、これらに限定されるものではない。非限定的な具体例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、の構造および非構造タンパク質が含まれる。呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリインフルエンザウイルス；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲラ属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）および百日咳属種（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｓｐｐ．）；ならびに例えばヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のようなヒトタンパク質が含まれる。
【００３４】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法はウイルスタンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法はＨＣＶまたはＨＩＶタンパク質に適用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法はＨＣＶタンパク質に適用される。
【００３５】
該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法において使用するタンパク質は、単離されたタンパク質、組換えタンパク質または合成タンパク質でありうる。タンパク質の単離方法は、組換えタンパク質の製造方法と同様に、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。あるいは、該タンパク質は、好ましくは、商業的入手源から得られうる。多種多様な単離された又は組換え抗原タンパク質が、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎ．Ｖ．（Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）およびＳｅｒｏｔｅｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から、現在商業的に入手可能である。
【００３６】
本発明のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、１以上のジスルフィド結合を含む完全長タンパク質、末端切断型タンパク質および抗原タンパク質断片に同等に適用可能である。そのような断片は、好ましくは、単離された又は組換えタンパク質から、当技術分野で公知の断片化技術、例えばプロテアーゼ消化により作製されることが可能であり、あるいは、それらは、例えば標準的な固相ペプチド合成により、化学合成されることが可能であり、あるいは組換え技術を用いて製造されうる。同様に、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は、好ましくは、天然タンパク質またはその突然変異体（ただし、該突然変異タンパク質は少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、該天然タンパク質のエピトープの１以上を保有する）に適用されうる。
【００３７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法は完全長タンパク質または実質的に完全長のタンパク質に適用される。
【００３８】
トリアルキルホスフィン還元剤
該タンパク質のジスルフィド結合は、好ましくは、トリアルキルホスフィン還元剤を使用して還元され、それぞれの還元されたジスルフィド結合は２つのスルフヒドリル基を与え、それらの一方または両方を更にスルフヒドリル反応性試薬と反応させて該タンパク質コンジュゲートを形成させることが可能である。該トリアルキルホスフィンは、好ましくは、一般式（Ｉ）
【００３９】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、置換されている又は置換されていないアルキル基である）を有する。
【００４０】
多数のトリアルキルホスフィンが当技術分野で公知であり、商業的に入手可能である。具体例には、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、トリス（２−シアノエチル）ホスフィン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびトリブチルホスフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。固定化されたＴＣＥＰも（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから）商業的に入手可能であり、本発明の方法において使用されうる。
【００４１】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンは水溶性トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。あるいは、もう１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンはトリス（２−シアノエチル）ホスフィンである。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ＴＣＥＰと比較した場合のトリス−（２−シアノエチル）ホスフィンの疎水性の増加は該タンパク質の疎水性領域内への還元剤のより著しい透過を可能にし、これは、埋もれたジスルフィドとのより大きな反応性をもたらしうる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該トリアルキルホスフィンはトリブチルホスフィンである。
【００４２】
他の成分
該還元反応には、該タンパク質中のジスルフィド結合の還元を促進する１以上の他の成分が含まれうる。例えば、１つの実施形態においては、該反応混合物に変性剤または界面活性剤を加えることが可能である。界面活性剤／変性剤は該タンパク質の疎水性コア内へのトリアルキルホスフィンの透過を促進しうる。タンパク質中のジスルフィド結合を還元するトリアルキルホスフィンの能力を妨げない適当な変性剤または界面活性剤は当業者により容易に選択されうる。具体例には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、グアニジンおよびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。加えるべき変性剤の量は、当技術分野で公知のとおりに決定されうる。例えば、最適な結果を与える濃度を決定するために、種々の量の界面活性剤の存在下で該反応を行うことが可能である。
【００４３】
１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程に界面活性剤が含まれる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程にＳＤＳが含まれる。
【００４４】
タンパク質の疎水性コア内に位置するジスルフィド結合への接近は、好ましくは、反応混合物のｐＨを、それが酸性（例えば、ｐＨ約２．５〜ｐＨ約５．０）または塩基性（例えば、ｐＨ約９．０〜ｐＨ約１１．０）となるよう調節することにより促進されうる。ＴＣＥＰのようなトリアルキルホスフィンは広範なｐＨ領域にわたってそれらの有効性を保有するため、ｐＨの調節は、好ましくは、トリアルキルホスフィンの還元能に影響を及ぼさないであろう。所望により、ｐＨの調節は、酸、塩基およびバッファーのような当技術分野で公知の種々のｐＨ修飾試薬の使用により達成されうる。
【００４５】
１つの実施形態においては、好ましくは、該方法の還元工程にｐＨ修飾試薬が含まれる。
【００４６】
スルフヒドリル反応性試薬
本発明の方法において使用するスルフヒドリル反応性試薬は、好ましくは、チオール反応性官能性に連結されたコンジュゲート部分を含む。該コンジュゲート部分は、好ましくは、該コンジュゲート部分上の官能基を介して直接的に、あるいはリンカーを介して間接的に、該チオール反応性官能性に連結されうる。
【００４７】
コンジュゲート部分
本発明の方法は、好ましくは、還元工程により、遊離スルフヒドリル基を介して、種々の有用な部分を抗原タンパク質にコンジュゲート形成するために使用されうる。本発明により想定されるコンジュゲート部分の具体例には、検出可能な標識、精製を促進する部分、および固定化を促進する又は固定化をもたらす部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、コンジュゲート部分は、検出可能な標識である。適当な検出可能な標識の非限定的な具体例には、直接的に検出されうる標識、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子などが含まれる。検出可能な標識は、好ましくは、それ自体が検出可能であり、あるいは、場合によっては、それを１以上の追加的化合物と反応させて、検出可能な産物を生成させることが可能である。したがって、標識の検出を可能にするためには、直接的に検出可能な標識は、基質、誘発試薬、光などのような追加的な成分を要する、と当業者は理解するであろう。検出可能な標識の具体例には、色原体、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジルおよびランタニドキレート誘導体）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウムおよびルミノール）、可視または蛍光粒子、核酸、錯化剤および酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼおよびルシフェラーゼ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。酵素使用の場合、例えば色原性、発蛍光性または発光性基質の添加は、好ましくは、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光およびラマン分光法のような他の検出系も有用である。
【００４９】
本発明はまた、望ましくは、間接的に検出される検出可能な標識の使用を提供する。間接的に検出可能な標識は、典型的には、「アフィニティーペア」、すなわち、該ペアの第１メンバーが本発明の検出用ペプチドに結合されており、該ペアの第２メンバーが第１メンバーに特異的に結合する、２つの異なる分子の使用を含む。該ペアの２つのメンバーの間の結合は、典型的には、化学的または物理的な性質のものである。そのような結合ペアの具体例には、抗原および抗体；アビジン／ストレプトアビジンおよびビオチン；ハプテン、およびハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子／基質および酵素などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、コンジュゲート部分は、検出可能な標識である。もう１つの実施形態においては、好ましくは、検出可能な標識は酵素である。もう１つの実施形態においては、好ましくは、検出可能な標識はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼである。
【００５１】
本発明はまた、コンジュゲート部分が固体支持体または粒子、または固体支持体上の固定化を促進する部分であることを想定している。適当な固体支持体および粒子の具体例には、多孔性および無孔性物質、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（例えば、米国特許第５，７０５，３３０号を参照されたい）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチックチューブが含まれる。固体支持体上の固定化を促進する部分の具体例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインおよびチログロブリンが含まれる。
【００５２】
チオール反応性官能性
当技術分野で公知の多数の異なるチオール反応性官能性が、本発明の方法におけるスルフヒドリル反応性試薬としての使用に適している。具体例には、ヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化ベンジルおよびブロモメチルケトンが含まれるが、これらに限定されるものではない。使用されている個々の抗原タンパク質およびコンジュゲート部分ならびに得られるタンパク質コンジュゲートの下流用途に基づいて適当なチオール反応性官能性を選択することは当業者の知見の範囲内である。
【００５３】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、スルフヒドリル反応性試薬に含まれるチオール反応性官能性はマレイミドである。
【００５４】
リンカー
本発明の１つの実施形態においては、コンジュゲート部分は、好ましくは、リンカーを介してチオール反応性基に連結される。当技術分野で公知の種々の長さ及びコンホメーションのリンカーが使用されうる。ただし、それらは、得られるタンパク質コンジュゲートの機能を妨げないものでなければならない。該リンカーは、好ましくは、本発明の還元条件に対して安定である１以上の官能基を含みうる。例えば、そのような官能基は、好ましくは、アルキル、シクロアルキル、エーテル、ペプチドまたはそれらの組合せを含む。
【００５５】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、約１〜約１００個の炭素原子、場合によっては約１〜約５０個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−、−ＮＲ−（ここで、ＲはＨ、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）、シクロアルキル基、アリール基、複素環基またはヘテロアリール基であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、アジド、シアノ、ニトロ、ハロ、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリールおよびヘテロアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００５６】
適当なリンカーの具体例には、好ましくは１〜約１００原子、場合によっては約１〜約５０個の原子の鎖長を有するペプチド；好ましくは、場合によっては約６〜約１００個の炭素原子、場合によっては約６〜約５０個の炭素原子の鎖長を有する、エタノールアミン、エチレングリコールおよびポリエチレンのような群から誘導されたリンカー；フェノキシエタノール；プロパノールアミド；ブチレングリコール；ブチレングリコールアミド；プロピルフェニル；ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチルおよびパルミトイルアルキル鎖が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の具体例には、好ましくは、約３〜約３０個の反復単位を有するポリエチレングリコールに基づくリンカーが含まれる。
【００５７】
１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する、分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−または−ＮＲ−（ここで、Ｒは前記と同意義である）であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００５８】
もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する、分枝状または非分枝状の飽和または不飽和炭化水素鎖であり、ここで、該炭素原子の１以上は、場合によっては、シクロアルキル基またはアリール基により置換されていてもよい。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーはシクロヘキシル基またはフェニル基を含む。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは更に、１以上のアミド結合を含む。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、好ましくは、該リンカーは、場合によっては１〜約５０個の炭素原子を有する非分枝状の飽和炭化水素鎖であり、該炭素原子の１以上は、場合によっては、−Ｏ−または−ＮＲ−（ここで、Ｒは前記と同意義である）であり、該鎖は、場合によっては、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１−Ｃ６）アルカノイルオキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、アミド、ヒドロキシ、オキソ（＝Ｏ）、カルボキシ、アリールおよびアリールオキシの群から選ばれる１以上の置換基により炭素上で置換されていてもよい。
【００６０】
標的分子上の第一級アミンと反応しうる活性化エステルならびにマレイミドおよびヨードアセトアミドチオール反応性官能性を有する商業的に入手可能なヘテロ二官能性架橋試薬の非限定的な具体例には、Ｎ−スクシンイミジル ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート、３−（マレイミド）プロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１１−（マレイミド）ウンデカン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、マレイミド酢酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレイミド安息香酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−マレイミド酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、６−マレイミドヘキサン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、４−（４−マレイミドフェニル）酪酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、３−（マレイミド）プロピオン酸 Ｎ−スクシンイミジルエステル、スクシンイミジル−４−ヨードアセチル−アミノベンゾアートおよび６−（ヨードアセトアミド）ヘキサン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが含まれる。
【００６１】
反応条件
本発明の１つの実施形態のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法を場合によって含む還元およびコンジュゲート形成工程を図１に図示する。抗原タンパク質をトリアルキルホスフィン還元剤と接触させる還元工程は、好ましくは、当技術分野で公知の範囲の反応条件下で行われうる（例えば、Ｈａｎ，Ｊ．Ｃ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２０，５−１０（１９９４）；Ｍｅｒｙ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，４２，４４−５２（１９９３）；Ｒｕｅｇｇ，Ｕ．Ｔ．およびＲｕｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７，１１１−１２６（１９９７）を参照されたい）。また、適当な反応条件は、商業的に入手可能なトリアルキルホスフィンの製造業者により提供されるとおりのものである。
【００６２】
例えば、ＴＣＥＰまたは他のトリアルキルホスフィンは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約１００倍モル過剰で使用される。本発明の１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約７５倍モル過剰で、還元剤として使用される。もう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約５０倍モル過剰で、還元剤として使用される。もう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して１〜約２０倍モル過剰で、還元剤として使用される。さらにもう１つの実施形態においては、ＴＣＥＰは、好ましくは、タンパク質濃度に対して２〜約２０倍モル過剰で、還元剤として使用される。
【００６３】
該反応は、好ましくは、約５℃〜約１００℃の温度範囲にわたって、場合によってはｐＨ約２〜ｐＨ約１１のｐＨで行われうる。最適な反応時間の長さは、該反応が行われる温度に左右されるであろう。したがって、低温では、反応時間は数時間にわたることがあるが、室温またはそれ以上では、反応は一般に、約５分〜約３時間後に完了する。例えば、タンパク質の還元は、好ましくは、約２ｍｇ〜約１０ｍｇのタンパク質水溶液に対して約２ｍＭ〜約３ｍＭのＴＣＥＰを使用した場合、約３０分以内に達成されうる。適当な反応条件は当業者により容易に決定されうる。
【００６４】
１つの実施形態においては、好ましくは、該還元工程は、約１００℃の温度で約８分間〜約１５分間、モル過剰のトリアルキルホスフィンの存在下で行われる。もう１つの実施形態においては、好ましくは、該還元工程は、室温で約３０分間〜約３時間、モル過剰のトリアルキルホスフィンの存在下で行われる。
【００６５】
前記のとおり、該トリアルキルホスフィンは、好ましくは、コンジュゲート形成工程前に反応混合物から除去される必要がない。場合によっては、前記のとおり、還元および／またはコンジュゲート形成工程において他の成分が使用されうる。例えば、ＴＰＥＰまたは他のトリアルキルホスフィンと共にＳＤＳが使用されることが可能であり、例えば、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のＳＤＳが使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のＳＤＳが使用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約２〜約８倍モル過剰のＳＤＳが使用される。さらにもう１つの実施形態においては、好ましくは、タンパク質に対して約５〜約７倍モル過剰のＳＤＳが使用される。
【００６６】
また、コンジュゲート形成工程は、好ましくは、使用する個々のタンパク質およびスルフヒドリル反応性試薬に応じて種々の条件下で行われうる。適当な条件は当業者により容易に決定されうる。
【００６７】
例えば、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、タンパク質に対して約１〜約２０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬、場合によっては、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。もう１つの実施形態においては、好ましくは、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、スルフヒドリル含量に対して約２〜約５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。ヨードアセトアミド試薬の場合、コンジュゲート形成反応は、好ましくは、光の非存在下で行われるべきである。
【００６８】
ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約６．０〜約９．０のｐＨおよび約２℃〜約４０℃の温度で行われる。本発明の１つの実施形態においては、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、該反応は約６．０〜約８．５のｐＨで行われる。本発明のもう１つの実施形態においては、ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、該反応は約７．５〜約８．５のｐＨで行われる。
【００６９】
ヨードアセトアミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、用いる反応温度に応じて約１５分間〜約２４時間の反応時間が好ましい。例えば、約２℃〜約１０℃の低温では、約２時間〜約２４時間の反応時間が好ましい。上昇した温度、例えば室温〜約４０℃では、約３０分間〜約４時間の反応時間が好ましい。
【００７０】
もう１つの例として、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合には、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約２０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用されうる。本発明の１つの実施形態においては、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。もう１つの実施形態においては、マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、タンパク質に対して約１〜約１０倍モル過剰のスルフヒドリル反応性試薬が使用される。
【００７１】
マレイミドを含むスルフヒドリル反応性試薬の場合、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約６．０〜約８．０のｐＨおよび約２℃〜約４０℃の温度で行われる。用いる反応温度に応じて約３０分間〜約２４時間の反応時間が好ましい。例えば、約２℃〜約１０℃の低温では、約２時間〜約２４時間の反応時間が好ましい。上昇した温度、例えば室温〜約４０℃では、約３０分間〜約４時間の反応時間が好ましい。適当な条件は当業者により容易に決定されうる。
【００７２】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、該方法は、マレイミドを含むモル過剰のスルフヒドリル反応性試薬を使用し、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約３０℃〜約４０℃の温度で約３０分間〜約２時間の反応時間にわたって行われる。本発明のもう１つの実施形態においては、好ましくは、該方法は、マレイミドを含むモル過剰のスルフヒドリル反応性試薬を使用し、好ましくは、コンジュゲート形成工程は約２℃〜約８℃の温度で、好ましくは約２時間〜約２４時間の反応時間にわたって行われる。
【００７３】
追加的工程
該方法は、場合によっては更に、コンジュゲート形成工程後に１以上の追加的工程を含みうる。例えば、好ましくは、該方法は保護工程、クエンチ工程、脱塩工程、１以上の精製工程またはそれらの組合せを含みうる。
【００７４】
１つの実施形態においては、保護またはクエンチ工程は、コンジュゲート形成工程後に未反応のまま残されたいずれかの遊離スルフヒドリル基の更なる反応を妨げるために用いられうる。保護は、当技術分野で公知のとおりに、例えば、ヨード酢酸、マレイミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルマレイミド）、システイン、ヨードアセトアミド、およびヨード酢酸の種々の塩の使用により達成されうる。クエンチは、好ましくは、適当な還元剤、例えばシステイン、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、β−メルカプトエタノールなどの添加により達成されうる。
【００７５】
脱塩は、好ましくは、適当な脱塩カラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから商業的に入手可能なもの）の使用により達成されうる。
【００７６】
好ましくは、クロマトグラフィーに基づく工程、例えばゲル濾過（例えば、ＰＤ１０カラムを使用するもの）、サイズ排除、イオン交換などを含む（これらに限定されるものではない）種々の精製方法も用いられうる。透析、濾過および接線流動濾過を含む（これらに限定されるものではない）追加的な精製方法も用いられうる。
【００７７】
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、還元およびコンジュゲート形成工程の後、保護工程、例えば、ヨード酢酸を使用する、例えば室温で約３時間の保護を行う。他の変法は当業者により容易に決定されうる。
【００７８】
抗原タンパク質コンジュゲートの特徴
本発明の１つの実施形態においては、好ましくは、本発明の方法により提供される抗原タンパク質コンジュゲートは、他の方法（例えば、ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールを使用するもの）により製造された対応スルフヒドリル誘導体化コンジュゲートと比較して増強された抗体結合特性を示し、したがって、現在入手可能なスルフヒドリル誘導体化タンパク質コンジュゲートに対する改良に相当する。
【００７９】
抗体結合の増強は、例えば、イムノアッセイ形態における感度の増加により示されうる。感度の増加は、例えば、より低い力価の抗体を検出しうること、および／または同じ力価の抗体を、より低い濃度で使用された場合に検出しうることでありうる。１つの実施形態においては、好ましくは、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、同じアッセイ条件下で通常方法により製造された対応スルフヒドリル誘導体化コンジュゲート（すなわち、「通常」スルフヒドリル誘導体化コンジュゲート）と比較された場合に、実質的に等価な力価の抗体を検出するのに、より低い濃度でイムノアッセイにおいて使用されうる。
【００８０】
多数のイムノアッセイの場合、スルフヒドリル基を介して誘導体化されたタンパク質コンジュゲートは、それらのコグネイト抗体に有効に結合するためには、アッセイにおいて還元剤の存在を要する。これとは対照的に、本発明の１つの実施形態においては、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは、還元剤の存在を要することなくコグネイト抗体に効率的に結合しうる。
【００８１】
用途
本発明の方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートは多くの状況において有用である。例えば、該タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、コグネイト抗体の検出が必要な用途、例えば、コンジュゲート部分が検出可能標識である診断アッセイにおいて、および場合によっては、コグネイト抗体の精製が必要な用途において、例えば、コンジュゲート部分が固体支持体もしくは粒子、または固体支持体上の固定化を促進する部分である、アフィニティーリガンドとして使用されうる。本発明はまた、研究手段としての、例えば、アッセイの開発における、または特定の標的タンパク質に対する抗体の単離における、該抗原タンパク質コンジュゲートの使用を提供する。
【００８２】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、好ましくは該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造された抗原タンパク質コンジュゲートを使用して、抗原タンパク質に対する抗体を検出する方法を提供する。１つの実施形態においては、該タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、診断イムノアッセイにおいて使用される。
【００８３】
もう１つの態様において、本発明はまた、好ましくは１以上の抗原タンパク質コンジュゲートを含む、イムノアッセイキットを提供する。該抗原タンパク質コンジュゲートは、好ましくは、コンジュゲート部分が固体支持体もしくは粒子である捕捉抗原として、および／またはコンジュゲート部分が検出可能標識である検出抗原として、該キットにおいて提供されうる。
【００８４】
特定の実施形態においては、該タンパク質コンジュゲートはＨＣＶ ＮＳ３コンジュゲートであり、これは、好ましくは、組合せＨＣＶ抗体−抗原検出アッセイにおいて使用される。もちろん、言うまでもなく、本明細書における典型的な形態の全て、および本発明の任意のアッセイまたはキットは、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載されている、ならびに例えばＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームを含む（これらに限定されるものではない）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により商業的に販売されている、自動化および半自動化系（微粒子を含む固相が存在するものを含む）における使用に適合化または最適化されうる。
【００８５】
また、本発明のアッセイおよびキットは、場合によっては、ＡｂｂｏｔｔのＰｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（商標））電気化学イムノアッセイ系を含むポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）アッセイ系に適合化または最適化されうる。単一使用試験装置におけるイムノセンサーならびにその製造および操作方法が例えば米国特許第５，０６３，０８１号ならびに公開されている米国特許出願２００３０１７０８８１、２００４００１８５７７、２００５００５４０７８および２００６０１６０１６４（それらに関してそれらの教示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００８６】
つぎに、具体的な実施例に関して本発明を説明する。以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を記載するものであり、本発明を何ら限定するものではないと理解されるであろう。
【００８７】
実施例
【実施例１】
【００８８】
Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造
組換えＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質ＮＳ３およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートを以下のとおりに製造した。標準的なタンパク質発現方法に従い、組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）を製造した。これはＮＳ３の天然配列を、該天然配列のＮ末端の位置の該ベクターからのリーダー配列と共に含んでいた。
【００８９】
ＨＲＰ−マレイミド溶液を以下のとおりに調製した。２倍モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣをＤＭＳＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解し、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）に溶解された１００ｍｇ／ｍＬ ＨＲＰに加えた。該溶液を穏やかに攪拌し、室温で４５分間放置した。該溶液（２．３ｍＬ）をＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にローディングし、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）（３．２ｍＬ）で溶出することにより、該ＨＲＰ−マレイミドをゲル濾過により精製した。
【００９０】
ｐＨ６．８で、１０倍過剰のＴＣＥＰを含有するＴＣＥＰ（ＰｅｒｂｉｏまたはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の水溶液中、該ｒＮＳ３を室温で２時間還元して、還元されたｒＮＳ３を得た。前記のとおりに調製した、１０モル当量のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−マレイミドを、還元されたｒＮＳ３およびＴＣＥＰの溶液に加え、得られた混合物を攪拌し、２〜８℃で１６〜２４時間放置して、ｒＮＳ３−ＨＲＰを得た。ついで未反応のスルフヒドリル基を室温で３時間の過剰のヨード酢酸との反応により保護した。得られた保護されたｒＮＳ３−ＨＲＰを、２．５ｍＬの産物を各カラム上にローディングし３ｍＬ中で溶出することにより、ＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５ Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過により精製して、最終的なｒＮＳ３−ＨＲＰ産物を得た。最終的なｒＮＳ３−ＨＲＰ産物を製造するために該４工程法を行うために必要な総時間は１．５日であった。
【実施例２】
【００９１】
通常技術によるＣ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートの製造
実施例１に記載のインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法とは対照的に、ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの製造のための最も効率的な従来方法は９工程（中間産物の精製を含む）を要し、３日間の総時間を要した。
【００９２】
特に、ｒＮＳ３を約３００ｍＭの最終濃度のβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）と共に温置した。ついで、還元されたｒＮＳ３をＧ２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上に負荷し、８Ｍ 尿素／ＥＤＴＡ／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で溶出した。溶出した画分をタンパク質の存在に関して試験し、ついで該タンパク質を含有する画分を集めた。ついで、集めたｒＮＳ３画分を５０倍モル過剰のＳＡＴＡと共に３０℃で１時間温置した。該溶液を６Ｍ 尿素／ＥＤＴＡ／５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）中、２〜８℃で２回（まず６時間、ついで一晩）透析した。該タンパク質中へのチオール基の取り込みを標準的な方法により分析した。
【００９３】
還元されたｒＮＳ３を１３倍モル過剰のＨＲＰ−マレイミドと共に２〜８℃で一晩温置し、同時に、該タンパク質に対して約１３０倍モル過剰のヒドロキシルアミンの添加によりデマスキングを行った。ついで該タンパク質に対して３０倍モル過剰としてβ−ＭＥを加え、２〜８℃で２０分間温置した。ついでＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）を該タンパク質に対して１００倍過剰として加えて、ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートを得た。これらの最後の２つの工程（β−ＭＥでの保護およびＮＥＭ添加）を省略しても、該通常ＨＣＶコンジュゲートの一部が得られたであろう。
【実施例３】
【００９４】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）および通常技術により製造されたＮＳ３タンパク質コンジュゲートの感度の比較
種々のコンジュゲート希釈度で陽性ＨＣＶ血清サンプル（ＱＣ１６９１）を使用して、ＨＣＶに対する抗体を各コンジュゲートが検出する能力を評価し、固定化ＮＳ３タンパク質を含むＨＣＶイムノアッセイキットを使用して、ＨＣＶ陰性サンプルでバックグラウンドのレベルを決定することにより、実施例１に記載されているとおりのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法および実施例２に記載されているとおりの通常技術により製造されたｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの感度を比較した。このキットは、２００６年９月１日付けで米国特許出願番号６０／８４１，８００（これに関してその教示を参照により本明細書に組み入れることとする）として出願された“Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ”と題する特許出願の対象である。該イムノアッセイキットと共に通常提供されるコンジュゲートの代わりに、実施例１および２において製造されたコンジュゲートを使用した。
【００９５】
該イムノアッセイキットは以下の成分を含んでいた。
【００９６】
１．９６ウェルの各プレートを精製組換えＨＣＶ抗原（ｒＮＳ３）、コアタンパク質ペプチドおよび抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体で被覆した。
【００９７】
２．表１に示す化学的組成および６．２のｐＨを有するサンプル希釈剤。
【００９８】
【表１】
【００９９】
３．表２に示す化学的組成および７．６のｐＨを有する陰性対照
【０１００】
【表２】
【０１０１】
４．表３に示す化学的組成および７．６のｐＨを有する抗体陽性対照
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
５．表４に示す化学的組成および１０．８〜１１．２のｐＨを有する抗原陽性対照
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
６．表５に示す化学的組成および６．８のｐＨを有するコンジュゲート希釈剤
【０１０６】
【表５】
【０１０７】
８．０．０４８％ 過酸化水素溶液、４．２３３％ クエン酸三ナトリウムおよび９５．７１９％ 蒸留水を含有し７．５〜８．５のｐＨを有する基質希釈剤。すべてのパーゼントは重量／重量パーセントとして計算されている。
【０１０８】
９．表６に示す化学的組成および２．０±０．３のｐＨを有する基質濃縮物
【０１０９】
【表６】
【０１１０】
基質溶液
基質溶液を調製するために、透明プラスチック容器において、以下の表７に示すとおりに、ある容量の無色基質希釈剤を等容量のオレンジ色基質濃縮物に加える。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
１０．該キットは洗浄用流体を含む。特に、１２５ｍＬの２０倍実効強度Ｔｗｅｅｎ／食塩水洗浄用流体を含有する１本または２本のボトル。該２０倍実効強度溶液は１．７１４％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標）（１０％溶液）、１．５４１％ プロパン−１，２−ジオール、０．１７３％ ５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、１４．２６６％ 塩化ナトリウム、０．８５７％ Ｔｗｅｅｎ ２０および８３．１３６％ 水を含有する。すべてのパーセントは重量／重量パーセントである。該溶液のｐＨは７であり、該溶液の密度は１．１１ｇ／ｍＬである。該洗浄用流体を蒸留水または脱イオン水のいずれかで２０分の１希釈して必要容量を得、あるいは洗浄用流体の１本のボトルの全内容物を２５００ｍＬの最終容量まで希釈する。希釈されると、該洗浄用流体は０．０１％ Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（登録商標）保存剤を含有する。
【０１１３】
イムノアッセイ法：
以下に記載する工程に従い、イムノアッセイを行った。すべての試薬およびサンプルおよび試薬を、使用前に１８〜３０℃にした。該試薬と共に使用するすべてのガラス器を２Ｍ 塩酸で十分に洗浄し、ついで蒸留水または高品質脱イオン水ですすいだ。
【０１１４】
該方法は以下の工程を含む。
【０１１５】
１．洗浄用流体を調製し、該コンジュゲートを再構成させる。
【０１１６】
２．５０μｌのサンプル希釈剤を各ウェルに加える。
【０１１７】
３．５０μｌのサンプルまたは５０μｌの対照をウェルに加える。白色背景の使用はサンプル添加の可視化を補助するであろう。
【０１１８】
４．該ウェルを蓋で覆い、室温で６０分間温置する（第１温置期間）。
【０１１９】
５．該温置期間の終了時に、「洗浄手順」に記載されているとおりに該プレートを洗浄する。洗浄が完了した後、該プレートを反転させ、残留洗浄用流体を吸収紙上に叩き取る。
【０１２０】
６．直ちに１００μｌのコンジュゲートを各ウェルに加える。
【０１２１】
７．該ウェルを蓋で覆い、室温で６０分間温置する（第２温置期間）。
【０１２２】
８．基質溶液を調製する。
【０１２３】
９．工程５を繰返す。
【０１２４】
１０．該プレートを洗浄した直後に、１００μｌの基質溶液を各ウェルに加える。
【０１２５】
１１．該ウェルを蓋で覆い、３７℃±１℃で温置する（第３温置期間）。直射日光を避ける。
【０１２６】
１２．５０μｌの停止溶液（０．５Ｍ 硫酸）を加える。
【０１２７】
１３．１５分以内に、利用可能であれば参照波長として６９０ｎｍを用いて４５０ｎｍの吸光度を読み取る。該装置を空気中でブランク化する（カートリッジ内にプレート無し）。
【０１２８】
洗浄手順：当技術分野で公知の標準的なプロトコールに従い、該プレートを洗浄した。
【０１２９】
結果：
典型的な実験の結果を図２に示す。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートが、通常のｒＮＳ３−ＨＲＰより高い力価（すなわち、より低い濃度）で使用可能であり、より高いシグナルおよびより低い陰性結果を与えたことを示している。また、該ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートはＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下で使用可能であり、一方、通常方法に従い製造されたｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの場合には、該コンジュゲート希釈剤に６ｍＭ ＤＴＴを加えなければならなかった。該通常ｒＮＳ３−ＨＲＰをＤＴＴまたはＴＣＥＰの非存在下で使用した場合には、陽性シグナルが実質的に低下した。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法が該タンパク質構造を、開いたコンホメーションで維持し、予想されうるとおり、嵩張ったＨＲＰ部分が鍵エピトープを遮蔽することなく、それらが安定な様態で露出されることを示唆している。
【実施例４】
【０１３０】
界面活性剤を使用するＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造
ＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のコンジュゲートを以下のとおりに製造した。８Ｍ 尿素、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）および該タンパク質に対して６．２５モル過剰のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する水溶液中、該タンパク質に対して５倍モル過剰のＴＣＥＰで、ｄｘ５８９を加熱ブロック中、１００℃で１０分間還元した。
【０１３１】
実施例１に記載のプロトコールを用いて、ＨＲＰ−マレイミドを製造した。ついで、還元されたｄｘ５８９を５倍モル過剰のＨＲＰ−マレイミドと２〜８℃で１５〜２４時間反応させた。
【実施例５】
【０１３２】
ＨＩＶ ｇｐ４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造−ＴＣＥＰ濃度の最適化
得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがコグネイト抗体に結合する能力に対する該還元反応における種々の濃度のＴＣＥＰの効果を調べた。還元反応においてＳＤＳを加え、該タンパク質に対して５倍モル当量のＨＲＰ−マレイミドおよび種々の濃度（該タンパク質に対して０〜４０倍モル当量）のＴＣＥＰを使用する以外は実施例４に全般的に記載されているとおりに、種々のｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを製造した。ＨＩＶ陽性パネルＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３に対して該コンジュゲートを試験した。結果を図３に示す。
【０１３３】
通常ｒＮＳ３−ＨＲＰコンジュゲートの製造に関して実施例２に記載されている方法に従い、ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート（「Ｇ」、参照体、図３）も製造した。
【０１３４】
陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図３における黒塗の棒グラフ）を使用して、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、およびＨＩＶ陰性サンプル（図３における白抜きの棒グラフ）でのバックグラウンドのレベルの決定を、Ａｂｂｏｔｔ Ｍｕｒｅｘ ＨＩＶ １．２．０キットを該キットと共に供給されたプロトコールに従い使用して評価し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰと比較した。該キットと共に通常供給されるコンジュゲートの代わりに該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを使用することにより、該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを試験した。典型的な実験の結果を図３に示す。この場合におけるＴＣＥＰの最適濃度は２．５〜２０倍モル当量と決定された。高い陽性シグナルと共に最低陰性シグナルを与えたＴＣＥＰの濃度は５倍モル当量と決定された。
【実施例６】
【０１３５】
ＨＩＶ ｇｐ−４１−ｐ２４組換えタンパク質（ｄｘ５８９）およびホースラディッシュペルオキシダーゼのコンジュゲートのインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）製造−ＨＲＰ−マレイミド濃度の最適化
得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがコグネイト抗体に結合する能力に対するコンジュゲート形成反応における種々の濃度のＨＲＰ−マレイミドの効果を調べた。５倍モル当量のＴＣＥＰおよび種々の濃度（２．５〜２０倍モル当量）のＨＲＰ−マレイミドを使用する以外は実施例５に記載されているとおりの（すなわち、還元反応においてＳＤＳを使用しない）インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により、種々のｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートを製造した。
【０１３６】
陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図４における黒塗の棒グラフ）を使用して、得られたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、およびＨＩＶ陰性サンプル（図４における白抜きの棒グラフ）でのバックグラウンドのレベルの決定を、実施例５に全般的に記載されている方法に従い評価し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰ（「ｒｅｆ」）と比較した。典型的な実験の結果を図４に示す。この目的におけるＨＲＰ−マレイミドの最適濃度は２．５〜１０倍モル当量と決定された。高い陽性シグナルと共に最低陰性シグナルを与えたＨＲＰ−マレイミドの濃度は５倍モル過剰と決定された。
【実施例７】
【０１３７】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの力価測定
実施例４に記載されているとおりに製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの、ＨＩＶ陽性サンプル中の抗体への結合における感度を評価した。該ｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの調製物を系列希釈し、陽性ＨＩＶ血清サンプル（ＱＣ１３６２およびＱＣ１３６３、図５における黒塗棒グラフ）を使用して、得られた希釈されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートがＨＩＶに対する抗体を検出する能力、および図５に全般的に記載されている方法に従いＨＩＶ陰性サンプル（図５における白抜きの棒グラフ）で観察されるバックグラウンドのレベルを決定することにより、該感度を評価した。典型的な実験の結果を図５に示す。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートが、高い希釈度（５２，０００分の１）においてさえ、抗体を特異的に検出可能であったことを示している。
【実施例８】
【０１３８】
インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）技術および通常技術により製造されたｄｘ５８９タンパク質コンジュゲートの特異性の比較
実施例５（ＳＤＳ無し）および実施例４（＋ＳＤＳ）に記載されているインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの特異性を、実施例５に記載されているアッセイ法に従い、ＨＩＶ陰性サンプルのパネルに対して評価し、偽陽性の数を決定し、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰを使用して同じパネルで得られた偽陽性の数と比較した。
【０１３９】
典型的な実験の結果を図６に示す。白抜きの三角形は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（ＳＤＳ無し）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート、および通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰに関する比較データを示す。黒塗の菱形は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（＋ＳＤＳ）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲート、および通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰに関する比較データを示す。水平および垂直の線は「カットオフ」値を示す。カットオフを超える値は「偽陽性」とみなされる。該結果は、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（＋ＳＤＳ）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートが、通常技術により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰと同等の特異性を有することを示している。これらの実験において該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法（ＳＤＳ無し）により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートの特異性は満足しうるものではなかった。また、該インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）方法により製造されたｄｘ５８９−ＨＲＰコンジュゲートは、通常技術により製造されたコンジュゲートより一貫して製造することが可能であり、より再現性のある結果を与えた。
【０１４０】
本明細書中で言及されている全ての特許、刊行物（公開された特許出願を含む）およびデータベース登録の開示の全体を、それぞれのそのような個々の特許、刊行物およびデータベース登録が参照により本明細書に組み入れられると明示的かつ個々に示されているのと同等に、参照により本明細書に明示的に組み入れることとする。
【０１４１】
本発明は或る特定の実施形態に関して記載されているが、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱しないそれらの種々の修飾が当業者に明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および
（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含んでなる、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法。
【請求項２】
該トリアルキルホスフィンが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、トリス（２−シアノエチル）ホスフィンおよびトリブチルホスフィンよりなる群から選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該抗原タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該抗原タンパク質がＣ型肝炎ウイルスタンパク質またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
該抗原タンパク質がＣ型肝炎ウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
該Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質が非構造タンパク質ＮＳ３である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
該コンジュゲート部分が検出可能な標識である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
該コンジュゲート部分が酵素である、請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
該酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該チオール反応性官能性がマレイミドまたはヨードアセトアミドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
該チオール反応性官能性がマレイミドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および
（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される抗原タンパク質コンジュゲート。
【請求項１３】
サンプル中の抗原タンパク質に対する抗体を検出するための方法であって、
（ｉ）抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体の形成を可能にする条件下、該サンプルを請求項１２記載の抗原タンパク質コンジュゲートと接触させること、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されたいずれかの抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体を検出することを含んでなる、方法。
【請求項１】
（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および
（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含んでなる、抗原タンパク質コンジュゲートの製造方法。
【請求項２】
該トリアルキルホスフィンが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、トリス（２−シアノエチル）ホスフィンおよびトリブチルホスフィンよりなる群から選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該抗原タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該抗原タンパク質がＣ型肝炎ウイルスタンパク質またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
該抗原タンパク質がＣ型肝炎ウイルスタンパク質である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
該Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質が非構造タンパク質ＮＳ３である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
該コンジュゲート部分が検出可能な標識である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
該コンジュゲート部分が酵素である、請求項１記載の製造方法。
【請求項９】
該酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
該チオール反応性官能性がマレイミドまたはヨードアセトアミドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１１】
該チオール反応性官能性がマレイミドである、請求項１記載の製造方法。
【請求項１２】
（ａ）１以上のジスルフィド結合の少なくとも１つの還元を可能にする条件下、１以上のジスルフィド結合を含む抗原タンパク質をトリアルキルホスフィンと接触させて、少なくとも一対のスルフヒドリル残基を含む還元された抗原タンパク質を得る工程、および
（ｂ）該スルフヒドリル残基の少なくとも１つとスルフヒドリル反応性試薬との反応を可能にする条件下、前記の還元された抗原タンパク質を、コンジュゲート部分とチオール反応性官能性とを含むスルフヒドリル反応性試薬と接触させて、該抗原タンパク質コンジュゲートを形成させる工程を含む製造方法により製造される抗原タンパク質コンジュゲート。
【請求項１３】
サンプル中の抗原タンパク質に対する抗体を検出するための方法であって、
（ｉ）抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体の形成を可能にする条件下、該サンプルを請求項１２記載の抗原タンパク質コンジュゲートと接触させること、
（ｉｉ）工程（ｉ）において形成されたいずれかの抗体：抗原タンパク質コンジュゲート複合体を検出することを含んでなる、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５０９１９２（Ｐ２０１０−５０９１９２Ａ）
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２６８８３（Ｐ２００９−５２６８８３）
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７０６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７９４４
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７７０６７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２７９４４
【国際公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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