説明

抗原性黄色ブドウ球菌タンパク質を含む免疫原性組成物

本出願は、NEATドメインを含むIsdA、IsdB、IsdCまたはIsdHなどのブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む免疫原性組成物に関する。第1のブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよび第2のIsdタンパク質由来のNEATドメインを含む融合タンパク質、ならびに鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質、例えば、ClfA、ClfB、SdrC、SdrDまたはSdrEのリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質も開示する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ブドウ球菌タンパク質抗原、それらをコードする核酸ならびにかかるタンパク質または核酸を含む免疫原性組成物およびワクチンの分野に関する。本発明は、かかる組成物の製造方法および医学におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
鉄分は、ほとんど全ての生物の必須栄養素および細菌感染における必須栄養素であり、細菌増殖を制限するために宿主の防御機構によって隔離されている。宿主の鉄制限と戦うために、細菌性病原体は、宿主の供給源から鉄を得るための複数の獲得システムを進化させてきた。ヘムはヒトの体における鉄の最も一般的な形態であり、全鉄のほぼ75%を占める。
【0003】
Isd(鉄調節表面決定因子(Iron−regulated surface determinant))システムは、ブドウ球菌における主要なヘム獲得経路と同定された。4つの細胞壁結合タンパク質であるIsdA(Mazmanian et al 2002,PNAS 99;2293)、IsdB(Mazmanian et al 2002,PNAS 99;2293)、IsdC(WO06/59247)およびIsdHまたはHarA(Dryla et al Molec.Microbiol.2003,49;37−53)は、ヘムの受容体の機能を果たすと考えられている。
【0004】
Isdタンパク質は、ブドウ球菌ワクチンに使用するためのワクチン候補と提唱されている(WO01/98499、WO02/59148、WO03/11899およびWO06/59247)。
【0005】
黄色ブドウ球菌感染は抗生物質(最適な薬物はペニシリン)で治療されるが、バンコマイシンはメチシリン耐性分離株に対して使用される。抗生物質に広範な耐性を示すブドウ球菌株の割合は1980年代以後増加しており(Panlilo et al 1992,Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13;582)、効果的な抗菌薬治療に対して脅威となっている。さらに、最近のバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌株の出現は、効果的な治療がないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株が出現し、蔓延する恐れを喚起している。
【0006】
受動免疫療法でブドウ球菌抗原に対する抗体を用いる代替的アプローチが研究されている。ポリクローナル抗血清の投与を含む治療が開発中である(WO00/15238、WO00/12132)。
【0007】
ブドウ球菌疾患を予防するワクチンを開発するニーズが依然としてある。黄色ブドウ球菌の莢膜多糖体(capsular polysaccharide conjugates)を用いるアプローチは規制認可を獲得することができず(WO03/61558)、追加のブドウ球菌成分を含むより複雑なワクチンは、効果的な予防を与えることを要求され得る。
【発明の概要】
【0008】
したがって、NEATドメインを含む鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む免疫原性組成物を提供する。
【0009】
本発明のさらなる態様において、リガンド結合ドメイン(例えば、N23ドメイン)を含むブドウ球菌Sdrファミリーメンバー(例えば、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、ClfAまたはClfB)の断片を含む免疫原性組成物を提供する。
【0010】
本発明のさらなる態様において、鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質およびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメイン(例えば、N23ドメイン)を含む融合タンパク質を提供する。
【0011】
本発明のさらなる態様において、第1のブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよび第2のIsdタンパク質由来のNEATドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【0012】
本発明のさらなる態様において、ブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインをコードするポリヌクレオチド配列およびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0013】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物、融合タンパク質またはポリヌクレオチドおよび医薬的に許容される賦形剤を含むワクチンを提供する。
【0014】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物、融合タンパク質またはポリヌクレオチドに、医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む本発明のワクチンを作製する方法を提供する。
【0015】
本発明のさらなる態様において、ブドウ球菌の感染または疾患の治療または予防に使用するための本発明の免疫原性組成物を提供する。
【0016】
本発明のさらなる態様において、ブドウ球菌疾患の治療または予防のための医薬の調製における本発明の免疫原性組成物、融合タンパク質またはポリヌクレオチドの使用を提供する。
【0017】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物、融合タンパク質またはポリヌクレオチドを、それを必要としている患者に投与することを含む、ブドウ球菌疾患を治療または予防する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】天然IsdAおよびIsdA NEATドメイン断片の構造を示す模式図である。
【図2】天然IsdBおよびIsdB断片を示す模式図である。GGSは、グリシン、グリシン、セリンのアミノ酸配列を示す。
【図3】IsdA/IsdB融合タンパク質の模式図である。GGSは、グリシン、グリシン、セリンのアミノ酸配列を示し、IsdHリンカーは配列番号98の配列を示す。
【図4】天然のタンパク質、断片および融合タンパク質でマウスを免疫した後の抗IsdA免疫反応のレベルを測定するELISAアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図5】天然のタンパク質、断片および融合タンパク質でマウスを免疫した後の抗IsdB免疫反応のレベルを測定するELISAアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図6】天然のタンパク質、断片および融合タンパク質の3つの接種後に収集したマウス血清中で生じた免疫反応を測定するオプソニン食作用アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図7】ClfAコーティングプレートへのフィブリノゲン接着を測定する接着アッセイの結果を示すグラフである。ダイヤモンドマークの線はClfA N123の474変異体へのフィブリノゲン結合を示し、四角マークの線はClfA N123の野生型へのフィブリノゲン結合を示す。
【図8】フィブリノゲンコーディングプレートへのClfA接着を測定する接着アッセイの結果を示すグラフである。暗いダイヤモンドマークの線はフィブリノゲンへのClfA N123の野生型の結合を示し、明るいダイヤモンドマークの線はフィブリノゲンへのClfA N123の474変異体の結合を示し、四角マークの線は陰性対照を示す。
【図9】ClfA N123コーティングプレートへのフィブリノゲンの結合を阻害する、ClfA N123の野生型および474変異体に対して作られた抗体の能力を示すグラフである。
【図10】ClfA N123コーティングプレートへの黄色ブドウ球菌の結合を阻害する、ClfAの野生型および474変異体に対して作られた抗体の能力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、NEATドメインを含み、鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む免疫原性組成物を開示する。
【0020】
本明細書に記載の全ての断片は、少なくとも1種類のグラム陽性細菌、例えば、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌に特異的な免疫反応を起こすことができる可能性のある免疫原性断片である。これらは、例えば、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100個のアミノ酸を含む。
【0021】
ブドウ球菌Isdタンパク質は、任意のブドウ球菌細菌、例えば、黄色ブドウ球菌、またはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、例えば、表皮ブドウ球菌に由来し得る。
【0022】
Isd(鉄調節表面決定因子)タンパク質は鉄獲得に関わるタンパク質ファミリーに属し、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH(またはHarA)、IsdD、IsdE、IsdF、IsdGおよびIsdIを含む。
【0023】
本発明の免疫原性組成物は、NEATドメインを含むブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む(Grigg et al Molecular Biology 2007,63;139−149)。これらのドメインは約125個のアミノ酸長であり、鉄輸送タンパク質をコードする遺伝子の近くの染色体位置により命名されている。1〜5つのNEATドメインが、細胞壁結合モチーフで終わるいくつかのタンパク質に見られる。IsdAおよびIsdCは1つのNEATドメインを含み、IsdBは2つのNEATドメインを含み、(いずれか一方または両方が本発明の免疫原性組成物中に含まれ得る)ならびにIsdHは3つのNEATドメインを含む(これらのいずれかが本発明の免疫原性組成物中に含まれ得る)。一実施形態において、このNEATドメインは完全なNEATドメインであるか、または少なくとも100、110、115、120、122、123、124、125、130、135または140個のアミノ酸を含む完全なNEATドメインである。この断片は、ELISAなどのアッセイ、血清殺菌力アッセイ、またはブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌の感染による抗原投与に対する防御を示すアッセイで測定した時に、例えば、抗ブドウ球菌免疫反応を起こすことができる免疫原性断片である。
【0024】
本発明の免疫原性組成物は、40、45、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63または64番目のアミノ酸から始まり、182、183、184、185、186、187、188、189、190、195または200番目のアミノ酸にまで及ぶIsdAのNEATドメインを任意に含む。例として、このIsdA NEATドメインは、IsdAの58〜188、59〜187、60〜186、61〜185または62〜184番目のアミノ酸であり、配列番号1、2、3、4または5と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するポリペプチド配列を任意に有する。本明細書全体を通して、IsdA断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号1に関する。
【0025】
本発明の免疫原性組成物は、IsdBの1つまたは2つのNEATドメインを任意に含む。IsdBの第1のNEATドメインは、138、139、140、141、142、143、144、145または146番目のアミノ酸から始まり、IsdBの263、264、265、266、267、268、269、270、271、または272番目のアミノ酸にまで及び、配列番号6、7または8のポリペプチド配列を任意に有する。IsdBの第2のNEATドメインは、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343または344番目のアミノ酸から始まり、IsdBの458、459、460、461、462、463、464、465または466番目のアミノ酸にまで及び、配列番号6、9または10のポリペプチド配列を任意に有する。一実施形態において、このIsdB NEATドメインは、IsdBの138〜271、140〜169、142〜267、335〜464、337〜462または339〜460番目のアミノ酸である。一実施形態において、このIsdB NEATドメイン断片は、138〜464、140〜462または142〜464番目のアミノ酸に由来する。
【0026】
2つのIsdBのNEATドメインを含む実施形態において、この2つのNEATドメイン間のアミノ酸は保持されるか、除去されるか、かつ/またはリンカーxで置換されるかのいずれかであり、このリンカーxは、ペプチド結合、任意の他の共有結合、または2、4、6、8、10、20、50、100もしくは200個以上のアミノ酸を含むペプチド鎖からなる。一実施形態において、このリンカーxは、グリシン−グリシン−セリン(GGS)などのトリペプチドを含む。さらなる例において、このリンカーxは配列番号98を含む。一実施形態において、267〜339、269〜341または271〜343番目のアミノ酸が除去され、任意にリンカーxで置換される。一例において、本発明の免疫原性組成物は、2つのIsdBを含む。NEATドメインおよびこの断片は、42〜486、42〜462、42〜461、82〜486、82〜462または82〜461番目のアミノ酸に由来する。
【0027】
このIsdB NEATドメイン(複数可)は、配列番号6、7、8、9、10、11、12、13もしくは86またはWO05/09379に開示された配列と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、IsdB断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号6に関する。
【0028】
本発明の免疫原性組成物は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30番目のアミノ酸から始まり、149、150、151、152、153、154、155、156、157または158番目のアミノ酸にまで及ぶIsdCのNEATドメインを任意に含む。一例において、このIsdC NEATドメインは、IsdCの21〜156、22〜155、23〜154、28〜154、24〜153または25〜152番目のアミノ酸であり、配列番号14のポリペプチド配列を任意に有する。このIsdC NEATドメインは、配列番号14または15と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%もしくは100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、IsdC断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号14に関する。
【0029】
本発明の免疫原性組成物は、IsdHの1、2または3つのNEATドメインを任意に含む。IsdHの第1のNEATドメインは、97、98、99、100、101、102、103、104または105番目のアミノ酸から始まり、IsdHの228、229、230、231、232、233、234、235、236、237または238番目のアミノ酸にまで及ぶ。IsdHの第2のNEATドメインは、337、338、339、340、341、342、343、344または345番目のアミノ酸から始まり、IsdHの466、467、468、469、470、471、472、473、474または475番目のアミノ酸にまで及ぶ。IsdHの第3のNEATドメインは、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544または545番目のアミノ酸から始まり、IsdHの660、661、662、663、664、665、666、667、668、669または670番目のアミノ酸にまで及ぶ。それぞれの場合において、IsdHは、配列番号16のポリペプチド配列を任意に有する。一例において、このIsdH NEATドメインは、IsdHの99〜234、100〜233、101〜232、102〜231、103〜230、339〜473、342〜470、341〜471、342〜470、343〜469、537〜666、538〜665、539〜664、540〜663または538〜662番目のアミノ酸である。一実施形態において、このIsdH NEATドメイン断片は、99〜473、101〜471、103〜469、99〜666、101〜664、103〜662、339〜666、341〜664または343〜662番目のアミノ酸に由来し、2または3つのNEATドメイン間のアミノ酸は、任意に除去される、かつ/またはリンカーxで置換され、このリンカーxは、ペプチド結合、任意の他の共有結合、または2、4、6、8、10、20、50、100もしくは200個以上のアミノ酸を含むペプチド鎖からなる。一実施形態において、このリンカーxは、グリシン−グリシン−セリン(GGS)などのトリペプチドを含む。さらなる例において、このリンカーxは配列番号98を含む。例えば、230〜343、232〜341、234〜339、469〜541、471〜539または473〜537番目のアミノ酸が除去される。このIsdH NEATドメイン(複数可)は、配列番号16、17、18または19と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、IsdH断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号16に関する。
【0030】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、NEATドメインを含むIsdタンパク質(複数可)の2、3、4、5または6個の断片を含む。例えば、断片は、IsdA NEATドメインと1つのIsdB NEATドメイン;IsdA NEATドメインと2つのIsdB NEATドメイン;IsdA NEATドメインとIsdC NEATドメイン;IsdA NEATドメインと1つのIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメインと2つのIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメインと3つのIsdH NEATドメイン;1つのIsdB NEATドメインとIsdC NEATドメイン;2つのIsdB NEATドメインとIsdC NEATドメイン;1つのIsdB NEATドメインと1つのIsdH NEATドメイン;2つのIsdB NEATドメインと1つのIsdH NEATドメイン;1つのIsdB NEATドメインと2つのIsdH NEATドメイン;2つのIsdB NEATドメインと2つのIsdH NEATドメイン;1つのIsdB NEATドメインと3つのIsdH NEATドメイン;2つのIsdB NEATドメインと3つのIsdH NEATドメイン;IsdC NEATドメインと1つのIsdH NEATドメイン;IsdC NEATドメインと2つのIsdH NEATドメイン;IsdC NEATドメインと3つのIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、1つのIsdB NEATドメインとIsdC NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、2つのIsdB NEATドメインとIsdC NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、IsdC NEATドメインとIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、IsdC NEATドメインと2つのIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、IsdC NEATドメインと3つのIsdH NEATドメイン;IsdB NEATドメイン、IsdC NEATドメインとIsdH NEATドメイン;IsdA NEATドメイン、IsdB NEATドメインとIsdH NEATドメイン;またはIsdA NEATドメイン、IsdB NEATドメイン、IsdC NEATドメインとIsdH NEATドメインを含む。
【0031】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶菌酵素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、タンパク質A、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP−1、SSP−2、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コアグラーゼ、FigおよびMAP(WO06/32475、WO06/32472、WO06/32500)からなる群から選択されるブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片を含む。
【0032】
一実施形態において、このブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質は、ClfA、ClfB、SdrD、SdrE、SdrGもしくはSdrCまたはそれらの免疫原性断片からなる群から選択される。このタンパク質がClfAである場合、野生型またはY474、D321、P336および/もしくはY338残基の位置に変異を含むClfAのいずれか一方を用いることができる。Y474は、異なるアミノ酸、例えば、ヒスチジンで置換され得る。D321は、異なるアミノ酸、例えば、チロシンで置換され得る。P336は、異なるアミノ酸、例えば、セリンで置換され得る。Y338は、異なるアミノ酸、例えば、アラニンで置換され得る。
【0033】
本明細書に記載の全断片は、任意に、免疫原性断片である。免疫原性断片は、ブドウ球菌、任意に、黄色ブドウ球菌株に対する免疫反応、任意に、防御免疫反応を起こすことができる。この免疫原性断片は、少なくとも10、20、30、40、50、70または100個の近接アミノ酸を含む。
【0034】
一実施形態において、このブドウ球菌細胞外結合成分は、リガンド結合領域を含む免疫原性断片である。
【0035】
リガンド結合領域は、細胞外成分、例えば、フィブリノゲンに結合するドメインである。ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrEおよびSdrGのリガンド結合領域(A領域)は、このポリペプチドのN末端側の半分にある(McCrea et al Microbiology 2000,146;1535−1546)。リガンド結合領域は、200〜600個のアミノ酸長であり、N1ドメイン、N2ドメインおよびN3ドメインを含む(Clarke and Foster 2006 Advances in Microbial Physiology 51;187−224; Perkins et al 2001 J.Biol.Chem.276;44721−44728)。
【0036】
本発明の免疫原性組成物は、38、39、40、41、42、43、44または45番目のアミノ酸から始まり、214、215、216、217、218、219、220、221または222番目のアミノ酸にまで及ぶClfAのN1ドメインを任意に含む。一例において、このClfA N1ドメインは、ClfAの38〜219、39〜218、40〜217、41〜216または42〜215番目のアミノ酸であり、配列番号20のポリペプチド配列を任意に有する。このClfA NEATドメインは、配列番号21、22、23または24と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、ClfA断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号20に関する。
【0037】
本発明の免疫原性組成物は、48、49、50、51、52、53、54または55番目のアミノ酸から始まり、266、267、268、269、270、271、272、273または274番目のアミノ酸にまで及ぶClfBのN1ドメインを任意に含む。一例において、このClfB N1ドメインは、ClfBの53〜272、52〜272、51〜272、50〜272または51〜272番目のアミノ酸であり、配列番号25のポリペプチド配列を任意に有する。このClfB NEATドメインは、配列番号26、27または28と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、ClfB断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号25に関する。
【0038】
本発明の免疫原性組成物は、48、49、50、51、52、53、54または55番目のアミノ酸から始まり、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273または274番目のアミノ酸にまで及ぶSdrGのN1ドメインを任意に含む。一例において、このSdrG N1ドメインは、SdrGの53〜261、52〜267、52〜261または53〜267番目のアミノ酸であり、配列番号41または44のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrG N1ドメインは、配列番号41、42、44または45と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、SdrG断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は、黄色ブドウ球菌に関しては配列番号41に関し、表皮ブドウ球菌に関しては配列番号44に関する。
【0039】
本発明の免疫原性組成物は、50、51、52、53、54、55、56または57番目のアミノ酸から始まり、228、229、230、231、232、233、234、235または236番目のアミノ酸にまで及ぶSdrDのN1ドメインを任意に含む。一例において、このSdrD N1ドメインは、SdrDの55〜233、54〜233、53〜233、52〜233または51〜233番目のアミノ酸であり、配列番号35のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrD N1ドメインは、配列番号35または36と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、SdrD断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号35に関する。
【0040】
本発明の免疫原性組成物は、50、51、52、53、54、55、56または57番目のアミノ酸から始まり、257、258、259、260、261、262、263、264または265番目のアミノ酸にまで及ぶSdrEのN1ドメインを任意に含む。一例において、このSdrE N1ドメインは、SdrEの55〜261、54〜261、53〜261、52〜261または51〜261番目のアミノ酸であり、配列番号38または39のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrE N1ドメインは、配列番号38または39と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、SdrE断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号38に関する。
【0041】
本発明の免疫原性組成物は、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56または57番目のアミノ酸から始まり、171、172、173、174、175、176、177、178、179または180番目のアミノ酸にまで及ぶSdrCのN1ドメインを任意に含む。一例において、このSdrC N1ドメインは、SdrCの51〜174、51〜175、51〜176、51〜177または51〜178番目のアミノ酸であり、配列番号29または32のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrC N1ドメインは、配列番号29、30、32または33と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。本明細書全体を通して、SdrC断片の最初と最後に関するアミノ酸番号は配列番号29に関する。
【0042】
本発明の免疫原性組成物は、214、215、216、217、218、219、220、221または222番目のアミノ酸から始まり、554、555、556、557、558、559または560番目のアミノ酸にまで及ぶClfAのN23ドメインを任意に含む。一例において、このClfA N23ドメインは、ClfAの214〜559、215〜559、216〜559、216〜558または216〜557番目のアミノ酸であり、配列番号20のポリペプチド配列を任意に有する。このClfA N23ドメインは、配列番号20、21、22、23または24と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0043】
本発明の免疫原性組成物は、193、194、195、196、197、198、199または200番目のアミノ酸から始まり、538、539、540、541、542、543、544または545番目のアミノ酸にまで及ぶClfBのN23ドメインを任意に含む。一例において、このClfB N23ドメインは、ClfBの197〜538、197〜539、197〜540、197〜541または197〜542番目のアミノ酸であり、配列番号25のポリペプチド配列を任意に有する。このClfB N23ドメインは、配列番号25、26、27または28と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0044】
本発明の免疫原性組成物は、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275または276番目のアミノ酸から始まり、524、525、526、527、528、529、530番目のアミノ酸にまで及ぶSdrGのN23ドメインを任意に含む。一例において、このSdrG N23ドメインは、SdrGの267〜526、268〜526、262〜528、268〜527または268〜525番目のアミノ酸であり、配列番号41または44のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrG N23ドメインは、配列番号41、42、43、44、45または46と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0045】
本発明の免疫原性組成物は、230、231、232、233、234、235、236、237または238番目のアミノ酸から始まり、564、565、566、567、568、569、570、571または572番目のアミノ酸にまで及ぶSdrDのN23ドメインを任意に含む。一例において、このSdrD N23ドメインは、SdrDの234〜566、234〜567、234〜568、234〜569または234〜570番目のアミノ酸であり、配列番号35のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrD N23ドメインは、配列番号35、36または37と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0046】
本発明の免疫原性組成物は、259、260、261、262、263、264、265または266番目のアミノ酸から始まり、592、593、594、595、596、597、598または599番目のアミノ酸にまで及ぶSdrEのN23ドメインを任意に含む。一例において、このSdrE N23ドメインは、SdrEの262〜592、262〜593、262〜594、262〜595または262〜596番目のアミノ酸であり、配列番号38のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrE N23ドメインは、配列番号38、39または40と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0047】
本発明の免疫原性組成物は、172、173、174、175、176、177、178、179または180番目のアミノ酸から始まり、424、425、426、427、428、429、430、431または432番目のアミノ酸にまで及ぶSdrCのN23ドメインを任意に含む。一例において、このSdrC N23ドメインは、SdrCの176〜426、176〜427、176〜428、176〜429または176〜430番目のアミノ酸であり、配列番号29または32のポリペプチド配列を任意に有する。このSdrC N23ドメインは、配列番号29、30、31、32、33または34と80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の同一性を有する配列を任意に含む。
【0048】
一実施形態において、このリガンド結合領域は、N2ドメイン、N3ドメイン、N1ドメイン、N2N3ドメインまたはN1N2N3ドメイン(複数可)を含むか、またはこれらからなる。
【0049】
N23ドメインを含むClfB、SdrC、SdrD、SdrEまたはSdrGの断片を含む免疫原性組成物は、本発明のさらなる独立した態様である。この独立した実施形態のN23ドメインは、上記に記載の特徴のいずれかを含み得る。
【0050】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrEまたはSdrGの1、2、3、4、5または6つのN23ドメインを含む。例えば、この免疫原性組成物は、ClfAとClfB、ClfAとSdrC、ClfAとSdrD、ClfAとSdrE、ClfAとSdrG、ClfBとSdrC、ClfBとSdrD、ClfBとSdrE、ClfBとSdrG、SdrCとSdrD、SdrCとSdrE、SdrCとSdrG、SdrDとSdrE、SdrDとSdrGまたはSdrEとSdrGのN23ドメインを含み得る。
【0051】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ブドウ球菌細胞外結合成分、例えば、アドヘシンの断片を含み、配列番号21、22、23、24、26、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45または46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するリガンド結合領域を含む。この断片は、ELISAなどのアッセイ、血清殺菌力アッセイ、またはブドウ球菌、例えば、黄色ブドウ球菌の感染による抗原投与に対する防御を示すアッセイで測定した時に、例えば、抗ブドウ球菌免疫反応を起こすことができる免疫原性断片である。
【0052】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片と共有結合しているブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む。
【0053】
本発明のさらなる態様は、鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質である。
【0054】
融合タンパク質は、同一ポリペプチド鎖に共有結合している少なくとも2つの異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列を含む。少なくとも2つの異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列は、ペプチド結合もしくは任意の他の共有結合によって直接結合され得るか、または、任意に、2、4、6、8、10、20、50、100もしくは200個以上のアミノ酸を含むペプチド鎖であるリンカーxを介して結合され得る。一実施形態において、このリンカーxは、グリシン−グリシン−セリン(GGS)などのトリペプチドを含む。さらなる例において、このリンカーxは配列番号98を含む。2つ以上のリンカーx配列が3つ以上のタンパク質配列を融合する場合、同一リンカーx配列または異なるリンカーx配列が用いられ得る。一実施形態において、このリンカーxが10個未満のアミノ酸長である場合、同一リンカーが用いられる。このリンカーxが10、20、50または100個以上のアミノ酸長である場合、異なるリンカーx配列がこの融合タンパク質中に存在する。
【0055】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、IsdA、IsdB、IsdCおよびIsdHからなる群から任意に選択される黄色ブドウ球菌Isdタンパク質に由来するNEATドメインを含む。
【0056】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ClfA、ClfB、SdrC、SdrDおよびSdrEからなら群から任意に選択される黄色ブドウ球菌タンパク質に由来するか、またはSdrGなどの表皮ブドウ球菌タンパク質に由来するリガンド結合ドメイン(例えば、N1、N2、N3、N23またはN123ドメイン)を含む。
【0057】
独立した実施形態において、本発明は、第1のブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインと第2のIsdタンパク質に由来するNEATドメインを含む融合タンパク質、例えば、IsdAとIsdB、IsdAとIsdC、IsdAとIsdH、IsdBとIsdC、IsdBとIsdH、IsdCとIsdHを含む。
【0058】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、配列番号47〜97からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。これらの配列において、xは、共有結合または1〜3、1〜5、1〜10、1〜20、1〜50、1〜100、90〜120、1〜200もしくは1〜500個のアミノ酸のいずれか一方を意味する。一実施形態において、xは3個のアミノ酸を意味し、任意にGGS配列を有する。一実施形態において、xは配列番号98(DTNDAVVTNDQSSSVASNQTNTNTSNQNISTINNANNQPQATTNMSQPAQPKSSTNADQASSQPAHETNSNGNTNDKTNESSNQSDVNQQYPPADESLQDAIKNPAII)の配列を有する108個のアミノ酸を意味する。
【0059】
2つのリンカーxが表示される場合、これらのリンカーは同一かまたは異なってもよい。例えば、第1および第2のドメインがGGSリンカーによって分けられ得、第2および第3のドメインは、108個のアミノ酸の配列番号98の配列によって分けられる。あるいは、第1および第2のドメインがGGSリンカーによって分けられてもよく、第2および第3のドメインはGGSリンカーによって分けられる。あるいは、第1および第2のドメインが108個のアミノ酸の配列番号98の配列によって分けられてもよく、第2および第3のドメインはGGSリンカーによって分けられる。
【0060】
独立した実施形態において、本発明は、第1のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインおよび第2のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質を含む。例えば、この融合タンパク質は、SdrCとSdrD、SdrCとSdrE、SdrCとSdrG、SdrCとClfA、SdrCとClfB、SdrDとSdrE、SdrDとSdrG、SdrDとClfA、SdrDとClfB、SdrEとSdrG、SdrEとClfA、SdrEとClfB、SdrGとClfA、SdrGとClfBまたはClfAとClfBに由来するリガンド結合ドメインを含み得る。このリガンド結合ドメインは、任意に、N1、N2、N3、N2N3またはN1N2N3のドメインからなり、この融合タンパク質は、任意に、それぞれのタンパク質について同一ドメインの種類、例えば、SdrCとSdrD、SdrCとSdrE、SdrCとSdrG、SdrCとClfA、SdrCとClfB、SdrDとSdrE、SdrDとSdrG、SdrDとClfA、SdrDとClfB、SdrEとSdrG、SdrEとClfA、SdrEとClfB、SdrGとClfA、SdrGとClfBまたはClfAとClfBについてはN2N3ドメインを含む。
【0061】
一実施形態において、この融合タンパク質は、3、4、5または6つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質由来のリガンド結合ドメインを含む。例えば、ClfA、ClfBとSdrC;ClfA、ClfBとSdrD、ClfA、ClfBとSdrE;ClfA、ClfBとSdrG;ClfA、SdrCとSdrG;ClfA、SdrCとSdrD;ClfA、SdrCとSdrE、ClfA、SdrDとSdrE;ClfA、SdrDとSdrG;ClfA、SdrEとSdrG;ClfB、SdrCとSdrD;ClfB、SdrCとSdrG;ClfB、SdrCとSdrE;ClfB、SdrDとSdrE;ClfB、SdrDとSdrG;ClfB、SdrEとSdrG;SdrC、SdrDとSdrE;SdrC、SdrDとSdrG;SdrD、SdrEとSdrGを含む。
【0062】
本発明の全ての断片または融合タンパク質は、例えば、発現用に用いられる宿主細胞から単離または精製され得る。
【0063】
それぞれの場合において、NEATドメインまたはリガンド結合ドメインの配列は、任意に、上記に記載した通りである。
【0064】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は本発明の融合タンパク質を含む。
【0065】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、さらなるブドウ球菌抗原、例えば、以下に記載の糖を含む。本発明の実施形態において、糖抗原が存在する場合、本発明の断片または融合タンパク質は、任意に、遊離タンパク質または非結合タンパク質として存在する。任意に、これらは、キャリアタンパク質として糖抗原に結合している。
【0066】

ポリN−アセチル化グルコサミン(PNAG)
PNAGは多糖細胞間アドヘシンであり、任意に、N−アセチルおよび/またはO−スクシニル構成要素で置換されたβ−(1→6)結合グルコサミンのポリマーで構成される。この多糖は黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌の両方に存在し、いずれかの供給源から単離することができる(Joyce et al 2003,Carbohydrate Research 338;903;Maira−Litran et al 2002,Infect.Imun.70;4433)。例えば、PNAGは、黄色ブドウ球菌株MN8mから単離され得る(WO04/43407)。dPNAGの調製は、WO04/43405に記載されている。
【0067】
以前にポリ−N−スクシニル−β−(1→6)−グルコサミン(PNSG)として知られた多糖は、N−スクシニル化の同定が不正確であったため、予想される構造を持たないことが最近示された(Maira−Litran et al 2002,Infect.Imun.70;4433)。したがって、正式にはPNSGとして知られ、現在はPNAGであると判明した多糖も、PNAGという用語に包含される。
【0068】
PNAGは、400kDa超、75〜400kDa、10〜75kDaのサイズから、(任意に、N−アセチルおよびO−スクシニル構成要素で置換されたβ−(1→6)結合グルコサミンの)反復単位を最高で30個含むオリゴ糖にまで変化する異なるサイズのものであってもよい。任意のサイズのPNAG多糖またはオリゴ糖は、本発明の免疫原性組成物に用いられ、例えば、40kDa超のサイズを用いることができる。サイズ化は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、顕微溶液化、超音波照射または化学的切断によって達成され得る(WO03/53462、EP497524、EP497525)。
【0069】
PNAGのサイズ範囲は、例えば、40〜400kDa、50〜350kDa、40〜300kDa、60〜300kDa、50〜250kDaおよび60〜200kDaである。
【0070】
PNAGは、アセテート(acetate)によるアミノ基上での置換により、アセチル化の程度が異なり得る。インビトロで生成したPNAGは、ほぼ完全にアミノ基上で置換されている(95〜100%)。あるいは、50%、40%、30%、20%、10%または5%未満のN−アセチル化を有する脱アセチル化PNAGを用いることができる。脱アセチル化PNAGの使用により、グラム陽性細菌、任意に、黄色ブドウ球菌および/または表皮ブドウ球菌(WO04/43405)のオプソニン殺傷が可能になる。一実施形態において、このPNAGは、40kDa〜300kDaの間のサイズを有し、50%、40%、30%、20%、10%または5%未満のアミノ基がN−アセチル化されるように脱アセチル化される。
【0071】
一実施形態において、このPNAGはO−スクシニル化されていないか、または25、20、15、10、5、2、1または0.1%未満の残基上でO−スクシニル化されている。
【0072】
脱アセチル化PNAG(dPNAG)という用語は、50%、40%、30%、20%、10%または5%未満のアミノ基がアセチル化されたPNAG多糖またはオリゴ糖を表す。
【0073】
本明細書で使用するPNAGという用語は、糖のアセチル化形態および脱アセチル化形態の両方を包含する。
【0074】
一実施形態において、PNAGは脱アセチル化され、天然多糖を化学的に処理することによってdPNAGを形成する。例えば、天然のPNAGを、pHが10以上に上昇するように塩基溶液で処理する。例えば、PNAGを、0.1〜5M、0.2〜4M、0.3〜3M、0.5〜2M、0.75〜1.5Mもしくは1MのNaOH、KOHまたはNHOHで処理する。処理は、20〜100、25〜80、30〜60、30〜50または35〜45℃の温度で、少なくとも10もしくは30分間、または1、2、3、4、5、10、15もしくは20時間ある。dPNAGは、WO04/43405に記載される通りに調製され得る。
【0075】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に含まれる多糖(複数可)は、以下に記載のキャリアタンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【0076】
黄色ブドウ球菌由来の5型多糖および8型多糖
ヒトに感染を引き起こす黄色ブドウ球菌のほとんどの株は、5型多糖または8型多糖のいずれか一方を含む。ヒト株の約60%が8型であり、約30%が5型である。5型および8型の莢膜多糖抗原の構造については、Moreau et al Carbohydrate Res.201;285(1990)and Fournier et al Infect.Immun.45;87(1984)に記載されている。両方ともそれらの反復単位中にFucNAcpおよびManNAcAを有し、ManNAcAはスルフヒドリル基を導入するために用いることができる。
【0077】
最近(Jones Carbohydrate Research 340、1097−1106(2005))、NMR分光法によりこれらの莢膜多糖の構造が以下のように修正された:
5型
→4)−β−D−ManNAcA−(1→4)−α−L−FucNAc(3OAc)−(1→3)−β−D−FucNAc−(1→
8型
→3)−β−D−ManNAcA(4OAc)−(1→3)−α−L−FucNAc(1→3)−α−D−FucNAc(1→
【0078】
多糖は、例えば、米国特許第6294177号またはInfection and Immunity(1990)58(7);2367に記載の通りに、当業者に公知の方法を用いて、黄色ブドウ球菌の適切な株から抽出され得る。例えば、ATCC12902は5型黄色ブドウ球菌株であり、ATCC12605は、8型黄色ブドウ球菌株である。
【0079】
多糖は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、顕微溶液化、超音波照射または化学的処理によってサイズ化され得る。本発明は、黄色ブドウ球菌の5型多糖および8型多糖に由来するオリゴ糖も対象とする。
【0080】
糖の重量平均分子量は、1000〜2000000、5000〜1000000、10000〜500000、50000〜400000、75000〜300000、または100000〜200000であり得る。本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、結合前に測定された糖の重量平均分子量(Mw)を表し、MALLSによって測定される。このMALLS技術は当該技術分野で公知であり、典型的には、実施例2に記載の通りに実行される。糖のMALLS分析には、2つのカラム(TSKG6000および5000PWxl)を組み合わせて用いることができ、糖を水中に溶出させる。糖を、光散乱検出器(例えば、488nmでの10mWのアルゴンレーザーを備えるWyatt Dawn DSP)および干渉屈折計(例えば、P100セルおよび498nmでの赤色フィルターを備えたWyatt Otilab DSP)を用いて検出する。一実施形態において、糖の多分散性は、1〜1.5、1〜1.3、1〜1.2、1〜1.1または1〜1.05であり、キャリアタンパク質への結合後には、この複合体の多分散性は、1.0〜2.5、1.0〜2.1.0〜1.5、1.0〜1.2、1.5〜2.5、1.7〜2.2または1.5〜2.0である。全ての多分散性測定はMALLSによる。
【0081】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる5型および/もしくは8型の莢膜多糖またはオリゴ糖は、O−アセチル化されている。一実施形態において、5型の莢膜多糖またはオリゴ糖のO−アセチル化の程度は、10〜100%、20〜100%、30〜100%、40〜100%、50〜100%、60〜100%、70〜100%、80〜100%、90〜100%、50〜90%、60〜90%、70〜90%または80〜90%である。一実施形態において、8型の莢膜多糖またはオリゴ糖のO−アセチル化の程度は、10〜100%、20〜100%、30〜100%、40〜100%、50〜100%、60〜100%、70〜100%、80〜100%、90〜100%、50〜90%、60〜90%、70〜90%または80〜90%である。一実施形態において、5型および8型の莢膜多糖またはオリゴ糖のO−アセチル化の程度は、10〜100%、20〜100%、30〜100%、40〜100%、50〜100%、60〜100%、70〜100%、80〜100%、90〜100%、50〜90%、60〜90%、70〜90%または80〜90%である。
【0082】
この多糖またはオリゴ糖のO−アセチル化の程度を、当該技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、プロトンNMR(Lemercinier and Jones 1996,Carbohydrate Resarch 296;83−96,Jones and Lemercinier 2002,J Pharmaceutical and Biomedical analysis 30;1233−1247,WO05/033148またはWO00/56357)によって決定することができる。さらに一般的に用いられる方法は、Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180;249−261に記載される方法である。
【0083】
O−アセチル基を加水分解によって、例えば、無水ヒドラジンなどの塩基での処理(Konadu et al 1994;Infect.Immun.62;5048−5054)または1〜8時間、0.1NのNaOHで処理することによって除去することができる。5型および/もしくは8型の多糖またはオリゴ糖上での高レベルのO−アセチル化を維持するために、O−アセチル基の加水分解をもたらす処理を最小限にする。例えば、極端なpHでの処理を最小限にする。
【0084】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる5型および8型の多糖は、任意に、以下に記載のキャリアタンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【0085】
あるいは、本発明の免疫原性組成物は、5型多糖または8型多糖のいずれか一方を含む。
【0086】
黄色ブドウ球菌336抗原
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、米国特許第6294177号に記載の黄色ブドウ球菌336抗原を含む。
【0087】
この336抗原はβ結合ヘキソサミンを含み、O−アセチル基を含まず、ATCC55804の登録番号で寄託された336型黄色ブドウ球菌に対する抗体に特異的に結合する。
【0088】
一実施形態において、この336抗原は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、顕微溶液化、超音波照射または化学的処理によってサイズ化され得る多糖である。本発明は、336抗原由来のオリゴ糖も対象である。
【0089】
本発明の免疫原性組成物中に含まれる336抗原は、任意に、以下に記載のキャリアタンパク質に結合しているか、あるいは結合してない。
【0090】
表皮ブドウ球菌のI型、II型およびIII型多糖
表皮ブドウ球菌のATCC−31432株、SE−360株およびSE−10株は、それぞれ、I型、II型およびIII型の3つの異なる莢膜型の特徴を示す(Ichiman and Yoshida 1981,J.Appl.Bacteriol.51;229)。表皮ブドウ球菌の各血清型から抽出された莢膜多糖は、I型、II型およびIII型の多糖を構成する。多糖は、米国特許第4197290号に記載の方法またはIchiman et al 1991,J.Appl.Bacteriol.71;176に記載の方法を含むいくつかの方法によって抽出され得る。
【0091】
本発明の一実施形態において、この免疫原性組成物は、表皮ブドウ球菌のI型および/もしくはII型および/もしくはIII型の多糖またはオリゴ糖を含む。
【0092】
多糖は天然サイズのものであるか、あるいは、例えば、顕微溶液化、超音波照射または化学的切断によってサイズ化され得る。本発明は、表皮ブドウ球菌から抽出されたオリゴ糖も対象である。
【0093】
これらの多糖は結合していないか、または、任意に、以下に記載の通りに結合している。
【0094】
多糖の結合(コンジュゲート)
ワクチン接種における多糖の使用に関連する問題の中に、多糖それ自体が弱い免疫原であるという事実がある。この免疫原性の欠如を克服するように設計された戦略には、この多糖の巨大タンパク質キャリアへの結合が含まれ、この結合は、バイスタンダーT細胞ヘルプ(bystander T−cell help)を提供する。一実施形態において、本明細書で利用する多糖をタンパク質キャリアに結合させ、バイスタンダーT細胞ヘルプを提供する。多糖またはオリゴ糖の免疫原と結合させるのに用いられ得るこれらのキャリアの例として、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(DT、DT Crm197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、緑膿菌エキソプロテインA(rEPA)およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、インフルエンザ菌のプロテインD、ニューモリシンまたは上記のいずれかの断片が挙げられる。使用に適する断片には、ヘルパーTエピトープを包含する断片が含まれる。特に、プロテインD断片は、任意に、このタンパク質のN末端の1/3を含む。プロテインDは、インフルエンザ菌のIgD結合タンパク質である(EP0 594 610 B1)。
【0095】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物に用いられるキャリアタンパク質は、上記に記載のブドウ球菌Isdタンパク質の断片、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質の断片または本発明の融合タンパク質の断片を含むか、またはこれらからなる。
【0096】
一実施形態において、EsxA、EsxB、EsaCまたはEsaBは、結合していないタンパク質または遊離タンパク質として本発明の免疫原性組成物中に存在する(WO08/19162、WO10/14304)。
【0097】
これらの多糖は、任意の公知の方法(例えば、Likhiteによる米国特許第4,372,945号、Armorらによる米国特許第4,474,757号、Jenningsらによる米国特許第4,356,170号)によって、このキャリアタンパク質(複数可)に結合され得る。任意に、CDAP結合化学が実行される(WO95/08348参照)。
【0098】
CDAPにおいて、シアニル化剤の1−シアノ−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)が、任意に、多糖−タンパク質複合体の合成に用いられる。このシアニル化反応を比較的穏やかな条件下で行うことができ、これによって、アルカリ感受性多糖の加水分解を阻止する。この合成により、キャリアタンパク質への直接結合が可能になる。
【0099】
この多糖を、水溶液または生理食塩水中に可溶化することができる。CDAPをアセトニトリルに溶解させ、すぐにこの多糖溶液に添加してもよい。このCDAPはこの多糖のヒドロキシル基と反応して、シアネートエステルを形成する。活性化ステップ後、このキャリアタンパク質を添加する。リジンのアミノ基がこの活性化多糖と反応して、イソ尿素共有結合を形成する。この結合反応後、過剰のグリシンを添加し、残留活性化官能基をクエンチングする。その後、この生成物をゲル浸透カラムに透過させ、未反応キャリアタンパク質および残留試薬を除去する。
【0100】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、任意に、黄色ブドウ球菌タンパク質または表皮ブドウ球菌タンパク質である、さらなるブドウ球菌タンパク質を含む。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、任意に、WO06/32475(参照により組込まれる)に記載の配列を有するWO06/32475に記載のタンパク質の1つ以上
またはそれらの免疫原性断片をさらに含む。これらのタンパク質の多くは、細胞外成分結合タンパク質、トランスポータータンパク質または病原性の毒素および調節因子のカテゴリーに分類される。本発明の免疫原性組成物は、任意に、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質、ブドウ球菌トランスポータータンパク質、またはブドウ球菌の病原性の毒素もしくは調節因子をさらに含む。本発明の免疫原性組成物は、任意に、少なくともまたは正確に、1、2、3、4、5もしくは6つのブドウ球菌タンパク質を含む。
【0101】
本発明の好ましい免疫原性組成物は、ブドウ球菌内で異なる機能を有する、少なくとも2つの異なるタンパク質のカテゴリーから選択される多数のタンパク質を含む。タンパク質のかかるカテゴリーの例として、細胞外結合タンパク質、鉄獲得タンパク質などのトランスポータータンパク質、病原性の毒素または調節因子、および他の免疫優性タンパク質が挙げられる。
【0102】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、
グループa)細胞外成分結合タンパク質;
グループb)トランスポータータンパク質;
グループc)病原性の毒素または調節因子
グループd)構造タンパク質
から選択される2、3または4つの異なるグループから選択される2、3、4、5または6以上のいくつかのタンパク質をさらに含む。
【0103】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、以下のグループの2、3または4から選択される2、3、4、5または6以上のいくつかのタンパク質をさらに含む:
グループa)ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、SasF、リパーゼGehD、SasA、SasB、SasC、SasD、SasK、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP−1、SSP−2、HBP、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コアグラーゼ、FigおよびMAPからなる群から選択される少なくとも1つのブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片;
グループb)免疫優性ABCトランスポーター、IsdA、IsdB、IsdC、Mg2+トランスポーター、HarA、SitCおよびNi ABCトランスポーターからなる群から選択される少なくとも1つのブドウ球菌トランスポータータンパク質またはその断片;
グループc)EsaC、EsxA、EsxB、RNA III活性化タンパク質(RAP)、EsaBからなる群から選択される少なくとも1つのブドウ球菌の病原性の調節因子、毒素またはその断片;
グループd)MRPIIおよび自己溶菌酵素からなる群から選択される少なくとも1つのブドウ球菌構造タンパク質またはその免疫原性断片。
【0104】
本発明の免疫原性組成物中に存在する任意の組み合わせには、IsdA、IsdBとEsaC;SdrC、IsdAとEsaC;IsdAとEsxA;IsdBとEsxA;IsdA、IsdBとEsxA;SdrC、IsdAとEsxA;ClfA、IsdAとEsxB;IsdBとEsxB;IsdA、IsdBとEsxB;SdrC、IsdAとEsxB;SdrD、IsdAとIsdB;SdrC、IsdAとIsdB;SdrE、IsdAとIsdB;SdrG、IsdAとIsdB;IsdAとIsdB;ClfB、IsdAとIsdB;EsaCとIsdA;EsaCとIsdB;EsaCとEsxA;EsaCとEsxB;EsaCとSdrCが含まれる。
【0105】
本発明のさらなる態様は、ブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインをコードするポリヌクレオチド配列およびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。一実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、21、22、23、24、26、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45または46と少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を有する。
【0106】
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物、本発明の融合タンパク質または本発明のポリヌクレオチド、および医薬的に許容される賦形剤を含むワクチンである。
【0107】
本発明のワクチンは、特に、高齢者集団における使用だけでなく幼児集団における使用を対象とする時に、アジュバンド化され得る。適切なアジュバントには、水酸化アルミニウムゲルまたはリン酸アルミニウムまたはミョウバンなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩などの他の金属塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオン誘導体化糖もしくは陰イオン誘導体化糖、またはポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【0108】
TH1型の反応の優先的な誘導因子であるアジュバントが選択されることが好ましい。かかる高レベルのTh1型サイトカインは、特定の抗原に対して細胞媒介性免疫反応の誘導を助ける傾向があるが、高レベルのTh2型サイトカインは、この抗原に対して体液性免疫反応の誘導を助ける傾向がある。
【0109】
Th1型およびTh2型の免疫反応の区別は絶対的ではない。実際には、個体が、主にTh1または主にTh2として記載される免疫反応を支持する。しかし、MosmannおよびCoffman(Mosmann,T.R.and Coffman,R.L.(1989)TH1 and TH2 cells:different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties.(Annual Review of Immunology,7,p145−173)によりマウスCD4陽性T細胞クローンについて記載されているような観点から、サイトカインのファミリーを考慮することが好都合である場合がある。伝統的には、Th1型反応は、Tリンパ球によるINF−γサイトカインおよびIL−2サイトカインの産生と関連する。IL−12などの、Th1型免疫反応の誘導に直接関連する場合が多い他のサイトカインは、T細胞によって産生されない。対照的に、Th2型反応は、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10の分泌と関連する。主にTh1反応を促進する適切なアジュバント系には、モノホスホリルリピドAもしくはその誘導体(または、一般に、解毒されたリピドA−例えば、WO2005107798参照)、特に、3−de−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL)(その調製については、GB2220211 A参照)、およびアルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム)または水中油型エマルションのいずれか一方とモノホスホリルリピドA、好ましくは3−de−O−アシル化モノホスホリルリピドAとの組み合わせが含まれる。かかる組み合わせにおいて、同一の粒子構造に抗原および3D−MPLを含めることにより、抗原シグナルおよび免疫賦活性シグナルのより効率的な送達が可能になる。3D−MPLがミョウバン吸着抗原の免疫原性をさらに増強することができることを複数の研究が示している(Thoelen et al.Vaccine(1998)16:708−14;EP689454−B1)。
【0110】
増強した系には、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体の組み合わせ、特に、WO94/00153に開示されているQS21と3D−MPLの組み合わせ、またはWO96/33739に開示されている、QS21がコレステロールでクエンチングされる低反応性組成物が含まれる。水中油型エマルション中のQS21、3D−MPLおよびトコフェロールを含む特に効力の高いアジュバント製剤については、WO95/17210に記載されている。一実施形態において、この免疫原性組成物は、QS21であり得るサポニンをさらに含む。この製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールも含んでもよい(WO95/17210)。非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド(WO96/02555)および他の免疫調節オリゴヌクレオチド(WO0226757およびWO03507822)も、TH1反応の好ましい誘導因子であり、本発明における使用に適する。
【0111】
特定のアジュバントは、金属塩、水中油型エマルション、Toll様受容体アゴニスト、(特に、Toll様受容体2アゴニスト、Toll様受容体3アゴニスト、Toll様受容体4アゴニスト、Toll様受容体7アゴニスト、Toll様受容体8アゴニストおよびToll様受容体9アゴニスト)、サポニンまたはそれらの組み合わせのグループから選択されるアジュバントである。
【0112】
本発明のワクチン組成物と共に用いることができるアジュバントは、WO02/09746に教示されている菌株などのグラム陰性細菌株、特に、N.meningitidisのブレブ(bleb)由来のブレブまたは外膜小胞の調製物である。ブレブのアジュバント特性は、(例えば、低濃度の界面活性剤(例えば、0〜0.1%のデオキシコール酸)での抽出を介して)その表面にLOS(リポオリゴ糖)を保持することによって改善することができる。LOSは、WO02/09746で論じられるmsbB(−)またはhtrB(−)変異を経て解毒することができる。アジュバント特性は、髄膜炎菌のブレブのPorBを保持することによって(および任意に、PorAを除去することによって)も改善することができる。アジュバント特性は、髄膜炎菌のブレブ上のLOSの外核糖構造を切断することによって、例えば、WO2004/014417で論じられるlgtB(−)変異によっても改善することができる。あるいは、(例えば、msbB(−)および/またはlgtB(−)株から単離された)前述のLOSを精製し、本発明の組成物中でアジュバントとして用いることができる。
【0113】
本発明の組成物と共に用いられ得るさらなるアジュバントは、サポニン、リピドAもしくはその誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、リン酸アルキルグルコサミニド、水中油型エマルションまたはそれらの組み合わせのグループから選択され得る。さらに好ましいアジュバントは、別のアジュバントと組み合わせた金属塩である。このアジュバントは、Toll様受容体アゴニスト、特に、Toll様受容体2、3、4、7、8もしくは9のアゴニスト、またはサポニン、特に、Qs21であることが好ましい。このアジュバント系が、上記のリストのアジュバントを2種類以上含むことがさらに好ましい。特に、これらの組み合わせは、好ましくは、サポニン(特に、Qs21)アジュバントおよび/またはCpG含有免疫賦活性オリゴヌクレオチドなどのToll様受容体9アゴニストを含む。他の好ましい組み合わせは、サポニン(特に、Qs21)とToll様受容体4アゴニスト、例えば、モノホスホリルリピドAもしくはその3脱アシル化誘導体3D−MPL、またはサポニン(特に、Qs21)とToll様受容体4リガンド、例えば、リン酸アルキルグルコサミニドを含む。
【0114】
特に好ましいアジュバントは、3D−MPLとQS21の組み合わせ(EP0 671 948 B1)、3D−MPLおよびQS21を含む水中油型エマルション(WO95/17210、WO98/56414)、または他の担体で製剤化された3D−MPL(EP0 689 454 B1)である。他の好ましいアジュバント系には、米国特許第6558670号、同第6544518号に記載の3D−MPL、QS21とCpGオリゴヌクレオチドの組み合わせが含まれる。
【0115】
このアジュバントは水中油型エマルションであってもよく、または他のアジュバントと組み合わせた水中油型エマルションを含んでもよい。このエマルション系の油相は、好ましくは、代謝可能な油を含む。代謝可能な油という用語の意味は当該技術分野で公知である。代謝可能は、「代謝によって変換され得る」と定義することができる(Dorland’s Illustrated Medical Dictionary,W.B.Sanders Company,25th edition(1974))。この油は、任意の植物油、魚油、動物性油または合成油であってもよく、これは受け手に対して毒性がなく、代謝によって変換され得る。ナッツ、種子、および穀物は一般的な植物油の供給源である。合成油は本発明の一部でもあり、NEOBEE(登録商標)などの市販の油などを含むことができる。スクアレン(2,6,10,15,19,23−ヘキサメチル−2,6,10,14,18,22−テトラコサヘキサエン)は不飽和油であり、サメの肝油中に大量に見られ、オリーブ油、小麦胚芽油、ぬか油、および酵母中に少量見られ、本発明の使用に特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成の中間体であるという事実に基づき、代謝可能な油である(Merck index,10th Edition,entry no.8619)。
【0116】
トコール類(例えば、ビタミンE)は、油エマルションアジュバント中でも用いられる場合が多い(EP0 382 271 B1;米国特許第5667784号;WO95/17210)。本発明の油エマルション中で用いられるトコール類(好ましくは、水中油型エマルション)は、これらのトコールが、好ましくは、直径1ミクロン未満の、任意に乳化剤を含むトコール小滴の分散系であり得るという点において、EP0 382 271 B1に記載される通りに製剤化され得る。あるいは、これらのトコールを別の油と組み合わせて用い、油エマルションの油相を形成することができる。上記の記載の代謝可能な油などの、トコールと組み合わせて用いられ得る油エマルションの例を本明細書に記載する。
【0117】
水中油型エマルションアジュバントそれ自体は、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており(EP0 399 843B)、水中油型エマルションと他の活性剤の組み合わせもワクチンのアジュバントとして記載されている(WO95/17210;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)。油中水型エマルション(米国特許第5,422,109号;EP0 480 982 B2)および水中油中水型エマルション(米国特許第5,424,067号;EP0 480 981 B)などの他の油エマルションアジュバントについても記載されている。これらの全ては、(特に、トコール類を包含する時)アジュバントおよび本発明の組成物を形成するのに好ましい油エマルション系を形成する。
【0118】
最も好ましくは、この油エマルション(例えば、水中油型エマルション)は、TWEEN 80などの乳化剤および/またはコレステロールなどのステロールをさらに含む。
【0119】
好ましい油エマルション(好ましくは、水中油型エマルション)は、スクアラン、スクアレンなどの代謝可能な無毒の油、またはα−トコフェロールなどのトコフェロール(および、好ましくは、スクアレンおよびα−トコフェロールの両方)ならびに任意に、Tween 80などの乳化剤(または界面活性剤)を含む。ステロール(好ましくは、コレステロール)も含まれ得る。
【0120】
水中油型エマルションの生成法は当業者に公知である。一般に、この方法は、トコール含有油相と、PBS/TWEEN80(商標)溶液などの界面活性剤とを混合し、その後、ホモジナイザーを用いて均質化することを含み、この混合物を2回注射針に通すことを含む方法が、少量の液体を均質化するのに適することは当業者には明らかである。同様に、当業者は、顕微溶液化装置による乳化プロセス(M110S Microfluidics machine、最大50回通過、6barの最大入口圧力で2分間(出口圧力約850bar))を適合させて、小量または大量のエマルションを生成することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する製剤が得られるまで、得られたエマルションの測定を含む通常の実験によって達成することができる。
【0121】
水中油型エマルションにおいて、この油および乳化剤は水性担体中に存在するべきである。この水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【0122】
安定な水中油型エマルション中に見られる油滴のサイズは、光子相関分光法により測定した場合に、好ましくは、直径が1ミクロン未満であり、実質的に30〜600nm、好ましくは、実質的に約30〜500nm、最も好ましくは、直径が実施的に150〜500nmの範囲、特に、直径が約150nmであり得る。この点で、数基準で油滴の80%は好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは、数基準で油滴の90%以上、最も好ましくは、95%以上が規定のサイズの範囲内にある。本発明の油エマルション中に存在する成分量は、従来的には、スクアレンなどの油が0.5〜20%または2〜10%の範囲であり、存在する時、α−トコフェロールが2〜10%、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が0.3〜3%の範囲である。好ましくは、油(好ましくは、スクアレン):トコール(好ましくは、α−トコフェロール)の比は、これがより安定なエマルションを提供するように1以下である。Tween80またはSpan85などの乳化剤も、約1%のレベルで存在してもよい。いくつかの場合において、本発明のワクチンが安定剤をさらに含むことは好都合であり得る。
【0123】
好ましいエマルション系の例については、WO95/17210、WO99/11241およびWO99/12565に記載されており、これらは、任意に、免疫賦活剤QS21および/または3D−MPLで製剤化された、スクアレン、α−トコフェロールおよびTWEEN 80に基づくエマルションアジュバントを開示している。したがって、本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のアジュバントは、LPSもしくはその誘導体、および/またはサポニンなどのさらなる免疫賦活剤を追加として含んでもよい。さらなる免疫賦活剤の例については、本明細書および「Vaccine Design−The Subunit and Adjuvant Approach」1995,Pharmaceutical Biotechnology,Volume 6,Eds.Powell,M.F.,and Newman,M.J.,Plenum Press,New York and London,ISBN 0−306−44867−Xに記載されている。
【0124】
好ましい態様において、アジュバントおよび本発明に係る免疫原性組成物は、上記に記載の油エマルション中に、任意に、ステロール(好ましくは、コレステロール)と共に、サポニン(好ましくは、QS21)および/またはLPS誘導体(好ましくは、3D−MPL)を含む。さらに、この油エマルション(好ましくは、水中油型エマルション)は、span85および/またはレシチンおよび/またはトリカプリリンを含んでもよい。水中油型エマルション、ステロールおよびサポニンを含むアジュバントについてはWO99/12565に記載されている。
【0125】
典型的には、ヒトへの投与には、サポニン(好ましくは、QS21)および/またはLPS誘導体(好ましくは、3D−MPL)は、1用量あたり1μg〜200μg、例えば、10〜100μg、好ましくは、10μg〜50μgの範囲の免疫原性組成物のヒト用量中に存在する。典型的には、この油エマルション(好ましくは、水中油型エマルション)は、2〜10%の代謝可能な油を含む。好ましくは、この油エマルションは、2〜10%のスクアレン、2〜10%のα−トコフェロール、および0.3〜3%(好ましくは、0.4〜2%)の乳化剤(好ましくは、tween 80(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート))を含む。スクアレンおよびα−トコフェロールの両方が存在する時、好ましくは、スクアレン:α−トコフェロールの比は、これがより安定なエマルションを提供するように1以下である。Span 85(ソルビタントリオレエート)も、本発明に使用するエマルション中に0.5〜1%のレベルで存在してもよい。いくつかの場合において、本発明の免疫原性組成物およびワクチンが、安定剤、例えば、カプリル酸(merck index 10th Edition,entry no.1739)(トリカプリリンが特に好ましい)を含む他の乳化剤/界面活性剤をさらに含むことは好都合であり得る。
【0126】
スクアレンおよびサポニン(好ましくは、QS21)が含まれる場合、このエマルション中の油の全レベルの減少を可能にするように、この製剤にステロール(好ましくは、コレステロール)も含めることは有益である。これは、製造コストの減少、ワクチン接種の全体的な快適性の改善、また、IFN−γ産生の改善などの結果として起こる免疫反応の定性的および定量的な改善ももたらす。したがって、本発明のアジュバント系は、典型的には、200:1〜300:1の範囲の代謝可能な油:サポニン(w/w)の比を含み、また本発明は、1:1〜200:1、好ましくは、20:1〜100:1、最も好ましくは、実質的に、48:1である好ましい範囲の「低油」形態で使用することができ、このワクチンは、全ての成分の有益なアジュバント特性を保持し、反応原性プロファイルは非常に低減されている。したがって、特定の好ましい実施形態は、1:1〜250:1の範囲のスクアレン:QS21(w/w)の比を有し、好ましい範囲は20:1〜200:1、好ましくは20:1〜100:1、最も好ましくは、実質的に48:1である。好ましくは、本明細書に記載のサポニン:ステロールの比で存在するステロール(最も好ましくは、コレステロール)も含まれる。
【0127】
本発明のエマルション系は、好ましくは、サブミクロンの範囲の小さい油滴サイズを有する。最も好ましくは、この油滴サイズは、直径が120〜750nm、最も好ましくは、120〜600nmの範囲である。
【0128】
(本発明の免疫原性組成物におけるAlPO4との最高の組み合わせのために、)特定の有力なアジュバント製剤は、WO95/17210またはWO99/12565に記載のサポニン(好ましくは、QS21)、LPS誘導体(好ましくは、3D−MPL)および油エマルション(好ましくは、水中油型エマルション中のスクアレンおよびαトコフェロール)(特に、実施例2の表1のアジュバント製剤11)を含む。
【0129】
TLR2アゴニストの例として、ペプチドグリカンまたはリポタンパク質が挙げられる。イミキモドおよびレシキモドなどのイミダゾキノリンは、既知のTLR7アゴニストである。一本鎖RNAも既知のTLRアゴニスト(ヒトにおいてはTLR8、およびマウスにおいてはTLR7)であるが、2本鎖RNAおよびpoly IC(ポリイノシン−ポリシチジン酸−ウイルスRNAの市販の合成模倣剤)は、TLR3アゴニストの例である。3D−MPLはTLR4アゴニストの例であり、CPGはTLR9アゴニストの例である。
【0130】
この免疫原性組成物は、金属塩上に吸着される抗原および免疫賦活剤を含んでもよい。抗原および免疫賦活剤3−de−O−アシル化モノホスホリルリピドA(3D−MPL)が同一粒子上に吸着されているアルミニウムベースのワクチン製剤については、EP0 576 478 B1、EP0 689 454 B1、およびEP0 633 784 B1に記載されている。これらの場合において、その後、抗原は、このアルミニウム塩に最初に吸着され、同一のアルミニウム塩粒子上への免疫賦活剤3D−MPLの吸着が続く。かかるプロセスは、最初に、これらの粒子が80〜500nmの間のサイズに達するまで、水浴中の超音波処理による3D−MPLの懸濁を含む。この抗原を、典型的には、撹拌しながら、室温で1時間、アルミニウム塩上に吸着させる。その後、この3D−MPL懸濁液を吸着抗原に添加し、この製剤を室温で1時間インキュベートし、その後、使用するまで4℃で保つ。
【0131】
本発明のワクチン製剤を用いて、全身経路または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、感染の影響を受けやすい哺乳類を保護または治療することができる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射、または、口腔/消化管、気管、尿生殖路への粘膜投与による注射が含まれ得る。肺炎または中耳炎の治療には、(肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に防ぎ、その最も早い段階で感染を弱めることができるので、)ワクチンの鼻内投与が好ましい。本発明のワクチンを単回用量として投与することができるが、その成分を同時にまたは異なる時点で同時投与することもできる(例えば、肺炎球菌多糖を、それぞれに対する免疫反応を最適に協調させるために、同時に、またはワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与後1〜2週間目に別々に投与することができる)。同時投与には、任意のTh1アジュバントが、異なる投与のいずれかまたは全てに存在し得る。例えば、Th1アジュバントは、このワクチンの細菌タンパク質成分と組み合わせて存在してもよい。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、多糖をIM(またはID)投与し、細菌タンパク質をIN(またはID)投与してもよい。さらに、本発明のワクチンを、プライミング用量についてはIM投与を、追加免疫用量についてはIN投与してもよい。
【0132】
各ワクチン用量中の結合抗原量は、典型的なワクチンにおいて非常に有害な副作用なしに免疫防御反応を引き起こす量として選択される。かかる量は、特定の免疫原が利用されることおよび、どのようにそれが存在するかによって変わる。一般に、各用量は、多糖を0.1〜100μg、典型的には、多糖複合体を0.1〜50μg、0.1〜10μg、1〜10μgまたは1〜5μg含むことが期待される。
【0133】
このワクチン中のタンパク質抗原の含有量は、典型的には、1〜100μg、5〜50μgまたは5〜25μgの範囲である。最初のワクチン接種後、対象は1回または、適切な間隔をあけて、数回の追加免疫を受けてもよい。
【0134】
ワクチン製剤については、一般に、ワクチン設計(「The subunit and adjuvant approach」(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York))に記載されている。リポソーム内へのカプセル化については、Fullertonの米国特許第4,235,877号に記載されている。
【0135】
本発明のワクチンは溶液中で保存されるか、または凍結乾燥されてもよい。任意に、この溶液は、ショ糖、トレハロースまたはラクトースなどの糖の存在下で凍結乾燥される。これらのワクチンは凍結乾燥され、使用前に即座に再構成されることが典型的である。凍結乾燥は、より安定な組成物(ワクチン)をもたらし得る。
【0136】
本発明のさらなる態様は、本発明の免疫原性組成物、NEATドメインもしくは他の断片、融合タンパク質またはポリヌクレオチドに医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、本発明のワクチンを作製する方法である。
【0137】
本発明は、ブドウ球菌感染、特に、院内感染の治療法も包含する。
【0138】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、待機手術の場合に使用するのに特に都合がよい。かかる患者は、あらかじめ手術の日が分かっており、あらかじめ接種され得る。この患者が、黄色ブドウ球菌感染または表皮ブドウ球菌感染に暴露されるか否かは分からないので、上記に記載のように、両方に効く本発明のワクチンを接種することが好ましい。典型的には、待機手術を待つ16歳以上の成人が、本発明の免疫原性組成物およびワクチンで治療される。あるいは、待機手術を待つ3〜16歳の子供達が本発明の免疫原性組成物およびワクチンで治療される。
【0139】
本発明のワクチンを医療従事者に接種することも可能である。
【0140】
本発明のワクチン製剤を用いて、全身経路または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、感染の影響を受けやすい哺乳類を保護または治療することができる。これらの投与には、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路による注射、または、口腔/消化管、気管、尿生殖路への粘膜投与による注射が含まれ得る。
【0141】
各ワクチン用量の抗原量は、典型的なワクチンにおいて非常に有害な副作用なしに免疫防御反応を引き起こす量として選択される。かかる量は、特定の免疫原が利用されることおよび、どのようにそれが存在するかによって変わる。このワクチンのタンパク質含有量は、典型的には、1〜100μg、5〜50μgの範囲、典型的には、10〜25μgの範囲である。特定のワクチンの最適量は、対象における適切な免疫反応の観察を含む標準的な試験によって確かめることができる。最初のワクチン接種後、対象は1回または、適切な間隔をあけて、数回の追加免疫を受けてもよい。
【0142】
本発明のワクチンはいずれの経路によっても投与できるが、皮膚内(ID)への記載したワクチンの投与は本発明の一実施形態を形作る。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる外側の「角質」表皮を含み、これは表皮を覆っている。この表皮の下に、真皮と呼ばれる層があり、この層は、皮下組織を同様に覆っている。研究者らは、皮膚、特に真皮へのワクチン注射が免疫反応を刺激することを示したが、これは多くのさらなる利点も伴い得る。本明細書に記載のワクチンでの皮内ワクチン接種は、本発明の任意の特徴を形作る。
【0143】
皮内注射の従来技術、すなわち、「マントウー法」は、皮膚を清浄するステップ、その後、一方の手で引き伸ばすステップ、狭いゲージ針(26〜31ゲージ)の斜端を上方に向け、10〜15°の間の角度で針を挿入するステップを含む。針の斜端を挿入したら、針のバレルを低くし、わずかに圧力を加えながらさらに進め、皮膚の下でそれを持ち上げる。その後、非常にゆっくりと液体を注入することにより、皮膚表面に水泡又は隆起を形成させた後、針をゆっくりと引き抜く。
【0144】
さらに最近になって、皮膚内または皮膚を横断して液体薬剤を投与するように特別に設計されたデバイスについて記載されており、例えば、これらのデバイスは、WO99/34850およびEP1092444に記載され、ジェット式注射デバイスは、例えば、WO01/13977、米国特許第5,480,381号、同第5,599,302号、同第5,334,144号、同第5,993,412号、同第5,649,912号、同第5,569,189号、同第5,704,911号、同第5,383,851号、同第5,893,397号、同第5,466,220号、同第5,339,163号、同第5,312,335号、同第5,503,627号、同第5,064,413号、同第5,520,639号、同第4,596,556号、同第4,790,824号、同第4,941,880号、同第4,940,460、WO97/37705およびWO97/13537に記載されている。ワクチン製剤の皮内投与の別の方法には、従来の注射器と針、または固形ワクチンの弾道的送達(ballistic delivery)用に設計されたデバイス(WO99/27961)、経皮パッチ(WO97/48440;WO98/28037)、または皮膚の表面に適用する方法(経皮(transdermal)もしくは経皮(transcutaneous)送達(WO98/20734;WO98/28037)が含まれ得る。
【0145】
本発明のワクチンを皮膚、またはより具体的には、真皮に投与する時、このワクチンは、低液量、特に、約0.05ml〜0.2mlの間の量である。
【0146】
本発明の皮膚ワクチンまたは皮内ワクチンにおける抗原の含有量は、筋内ワクチンに見られる従来の用量(上記参照)と同様であってもよい。しかし、これらの製剤が「低用量」であり得ることが皮膚ワクチンまたは皮内ワクチンの特徴である。従って、「低用量」ワクチンにおけるタンパク質抗原は、任意に、1用量当たり0.1〜10μg、任意に、0.1〜5μgほどの少量で存在し、これらの(任意に、結合している)多糖抗原は、1用量当たりの多糖が0.01〜1μg、任意に、0.01〜0.5μgの間の範囲で存在し得る。
【0147】
本明細書で使用する「皮内送達」という用語は、皮膚内の真皮の領域にワクチンを送達することを意味する。しかし、このワクチンは、必ずしも真皮だけに位置づけられるわけではない。真皮は、ヒトの皮膚表面から約1.0〜約2.0mmの間に位置する皮膚の層であるが、個体間や、身体の異なる部分でいくらかの差異がある。一般に、皮膚の表面から1.5mm下に進むと、真皮に到達することが予想され得る。真皮は、表面の角質層および表皮と、下の皮下層との間に位置する。送達方法によって、このワクチンを最終的に真皮内だけ、または主として真皮内に位置づけてもよく、または最終的に表皮および真皮内に分布させてもよい。
【0148】
本発明の実施形態は、ブドウ球菌の感染または疾患を予防または治療する方法であって、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要としている患者に投与するステップを含む方法である。
【0149】
本発明のさらなる実施形態は、ブドウ球菌の感染または疾患、任意に、手術後のブドウ球菌感染の治療または予防のためのワクチンの製造における本発明の免疫原性組成物の使用である。
【0150】
「ブドウ球菌感染」という用語は、哺乳類、任意に、ヒトの宿主において、感染を引き起こすことができる黄色ブドウ球菌および/または表皮ブドウ球菌ならびに他のブドウ球菌株によって引き起こされる感染を包含する。
【0151】
「含む(comprising)」、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」という用語は、本明細書で、全ての場合において、それぞれ、「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」および「からなる(consists of)」という用語と任意に代用可能であると発明者らは意図する。
【0152】
本明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組込まれる。
【0153】
本発明がよりよく理解され得るために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、例示のみの目的であり、いかなる方法においても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0154】
実施例1 IsdA/IsdBコンストラクトおよびマウスにおける免疫原性
本実施例において使用するIsdAおよびIsdBのタンパク質、断片および融合タンパク質の詳細を図1〜3に示す。
【0155】
15匹のメスのBalb/Cマウスのグループを、水中油型エマルション中に3D−MPLおよびQS21を含むアジュバント(AS02V)でアジュバント化した以下のタンパク質のそれぞれを10μg用いて、0、14および28日目に筋肉注射で免疫した。対照グループの10匹のマウスをアジュバントのみで免疫した:
グループ1→全長IsdAタンパク質
グループ2→全長IsdBタンパク質
グループ3→LVL230 IsdA NEATドメイン(62〜184番目のアミノ酸)
グループ4→LVL231 IsdA NEATドメイン(58〜188番目のアミノ酸)
グループ5→LVL235 IsdB NEAT1ドメイン(140〜269番目のアミノ酸)
グループ6→LVL237 IsdB NEAT1/2ドメイン(155〜460番目のアミノ酸)
グループ7→LVL238 NEAT1−NEAT2 IsdB(140〜462番目のアミノ酸)
グループ8→LVL294 IsdA NEAT(58〜188)−GGS−IsdB NEAT1−IsdH−IsdB NEAT2
グループ9→LVL295 IsdA NEAT(58〜188)−IsdH−IsdB−NEAT1−GGS−IsdB NEAT2
グループ10→LVL296 IsdA NEAT(58〜188)−GGS−IsdB NEAT1−GGS−IsdB NEAT2
グループ11→LVL321 IsdB NEAT1−GGS−IsdB NEAT2(140〜462番目のアミノ酸)
グループ12→アジュバント
GGSはグリシン、グリシン、セリンのアミノ酸で構成されているリンカーを示す。
【0156】
IsdHは配列番号98の配列を示す。
【0157】
抗IsdBおよび抗IsdA
ELISA力価を、42日目に収集した個体の血清(post III)において測定した。OPA力価を、収集したpost III血清で測定した。
【0158】
抗IsdAおよび抗IsdBのELISA反応
精製したIsdAまたはIsdBを、4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中1μg/mlで高結合マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)上にコーティングした。これらのプレートを、撹拌しながら室温で30分間、PBS−1%BSAでブロッキングした。マウス抗血清を1/500に事前に希釈し、その後、マイクロプレート中でさらに2倍希釈を行い、撹拌しながら室温で30分間インキュベートした。洗浄後、結合したマウス抗体を、PBS−0.2%BSA−0.05%tweenで1:5000希釈したJackson ImmunoLaboratories社のペルオキシダーゼ結合affiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(ref:115−035−003)を用いて検出した。この検出抗体を、撹拌しながら室温で30分間インキュベートした。pH4.5の0.1Mクエン酸緩衝液10mlあたりOPD4mg+H2O2 5μlを用いて、暗所で、室温で15分間発色させた。この反応をHCl50μlで停止させ、光学密度(OD)を、620nmに対する490nmで読みとった。
【0159】
この血清中に存在する抗IsdA抗体または抗IsdB抗体のレベルを、中点力価で表した。GMTを15個の試料について算出した(対照については10個)。
【0160】
オプソニン食作用アッセイ
オプソニン食作用アッセイ(OPA)を、(6.7 10e7/mlに調整した)HL−60食細胞15μl、黄色ブドウ球菌15μl、試験血清希釈物15μlおよび子ブタの補体15μl(最終濃度1%)を用いて、丸底マイクロプレート中で行った。
【0161】
最初に、不活化試験血清を、MEM−1%BSA 25mM HEPESで希釈し(1/25)、振盪しながら室温で40分間、(この試験の最後に300CFU/ウェルが得られるように希釈した)黄色ブドウ球菌のNewman D spa株とインキュベートした。希釈前に、前もって、この株を鉄欠乏培地(RPMI 1640)で一晩増殖させた。
【0162】
その後、(6.7 10e7/mlに調整した)HL−60細胞および子ブタの補体を各ウェルに添加した。不活化補体を有する対照も各試験試料用に含めた。
【0163】
この反応混合物を、撹拌しながら37℃で90分間インキュベートした。1/20希釈後、この50μl量を平底マイクロプレートに移した。MH寒天50μl、続いてPBS−0.9%寒天50μlを添加した。37℃で一晩インキュベートした後、コロニーの自動計数を行った。
【0164】
オプソニン食作用活性を、少なくとも50%が死滅する血清希釈の逆数として表した。
【0165】
ELISAの結果
図4に示す結果は、LVL230およびLVL231の両方の2つのIsdA NEATドメイン断片が、IsdAに対して良好な免疫反応を誘発し、ELISA結果は天然タンパク質に対して生じる免疫反応と同じくらい良好であることを示す。同様に、3つのIsdA/IsdB融合タンパク質(LVL294、LVL295およびLVL296)は、全長IsdAによって得られる反応とそれほど異ならない抗IsdA反応を与えた。
【0166】
図5に示す結果は、IsdBに対する免疫反応において第2のNEATドメインが重要であることを示す。N末端NEATドメインの一部のみとC末端NEATドメインの全てを含むLVL237に対して起こる免疫反応(中点力価537,644)に比べて、LVL235に存在するN末端NEATドメインは、わずかなELISA反応(中点力価9,043)のみを生じさせた。これは、LVL235に対する反応が、LVL237、LVL238、LVL294、LVL295、LVL296またはLVL321を用いて得られた反応よりも低いことによって証明される。
【0167】
オプソニン食作用の結果
オプソニン食作用アッセイで得られた結果を図6に示す。LVL230およびLVL231の両方を有するIsdAのNEATドメイン断片での免疫後に、非常に良好なオプソニン食作用力価が得られ、全長のIsdAまたはIsdBによって得られる結果よりも高い非常に良好な結果が得られた。これらの結果は、N末端NEATドメインの一部のみとC末端NEATドメインの全てを含むLVL237と比較して、IsdBのN末端NEATドメイン(LVL235)がより低いオプソニン反応を生じさせたので、IsdBのC末端NEATドメインの重要性も確証した。IsdANEATドメイン、IsdBNEATドメイン1とIsdBNEATドメイン2の組み合わせを含む融合タンパク質は、さらに高いオプソニン反応を示した(LVL294、LVL295、LVL296)。LVL294に、2つのIsdBNEATドメイン間のリンカーとして配列番号98を存在させると、特に良好なオプソニン反応がもたらされた。
【0168】
結論
遊離ドメインまたは融合タンパク質の一部のいずれか一方として、62〜184番目および58〜188番目のアミノ酸由来のIsdA NEATドメインの両方は、すばらしい免疫原性の結果を示した。抗IsdA抗体も、抗IsdB抗体よりも高いオプソニン食作用結果を示した。
【0169】
IsdBのC末端NEATドメインは、免疫原性、特にオプソニン活性の発生について、N末端NEATドメインよりも重要である。
【0170】
実施例2 ClfA N123ドメインの発現および精製
B2312:
黄色ブドウ球菌NCTC8325株由来の40〜559番目のアミノ酸をコードするclfA遺伝子断片のコドンを最適化し、GeneArt(レーゲンスブルク、ドイツ)によって2つの部分に合成した。この遺伝子断片は、N1、N2およびN3と同定された3つの構造ドメインをコードし、ClfAのフィブリノゲン結合活性を含む。ライゲーションができるようにするために、制限酵素部位のNdeIおよびSacIIを第一の合成遺伝子部分の末端に加え、SacIIおよびXhoIを第2の合成遺伝子部分に加えた。
【0171】
PCR反応を用いて、XhoI部位のすぐ前のその3’末端にストップコドンを加え、第2の合成断片中の474番目の位置のチロシン残基をヒスチジン残基に置換した。このようにして、これらの2つの断片を、rapid DNA ligation kit(Roche,マンハイム、ドイツ)を用いてpET24b(+)発現ベクター(Novagen)にクローニングし、それによって、このDNA断片およびこのプラスミドは同時に構築される。最後に、標準手順に従って、(mut474を有する)N123ドメインを含む発現ベクターで大腸菌BLR(DE3)株を形質転換した後に、最終コンストラクトが作られた。
【0172】
大腸菌BLR(DE3)株:F ompT hsdS(r)gal dcm(DE3)(srl−recA)306::Tn10(Tet)(Novagen)
BLRは、プラスミドモノマーの収率を改善するBL21のrecA誘導体であり、反復配列を含む標的プラスミドを安定化するのを助けることができるか、またはその生成物はDE3プロファージの減少をもたらすことができる。この株はテトラサイクリン耐性(12.5μg/ml)である。
【0173】
DE3は、この宿主がDE3の溶原菌であるので、lacUV5プロモーターの制御下でT7RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを保因することを示す。かかる株は、IPTGでの誘導により、pETベクターにクローニングされた標的遺伝子からタンパク質を産生するのに適する。
【0174】
B2378:
鋳型として(mut474を有する)N123変異を含む発現ベクターを用いる部位特異的変異誘発(Quickchange Site−directed Mutagenesis Kit;Stratagene)により、N123ドメインの野生型配列(474番目に変異がない40〜559番目のアミノ酸)を回復させた。標準手順に従って、N123ドメイン(野生型配列)を含む発現ベクターで大腸菌BLR(DE3)株を形質転換することにより、最終株が作られた。
【0175】
474番目のアミノ酸を変異させたClfAの精製(B2312株)
培養槽で増殖させた培養物から収集した大腸菌細胞ペーストを、50mM NaCl、2mM EDTAおよび1mM PMSFを含む50mMリン酸緩衝液pH7.2に懸濁し、OD650nmは120に達した。この懸濁液をPandaホモジナイザー中で機械的に破砕(2回通過、750bar)し、50%酢酸でpH4.0に調整した。4℃で30分間、12200gで遠心分離した後、上清を0.45〜0.20μmフィルターで浄化し、その1容積分の0.5M Tris pH8.1で、続いて、4容積分の20mM Tris−120mM NaCl pH 8.1でdiafilterにより濾過した。残余分を、20mM Tris−120mM NaCl pH8.1で平衡化したCaptoQカラム(レジン1mlあたり残余分約10ml)上に添加した。平衡用緩衝液で洗浄した後、ClfAを、20mM Tris−215mM NaCl pH8.1で溶出し、さらに、平衡化したSephacryl HR300カラムで精製して、10mM ホウ酸ナトリウム pH9.5で溶出した。ClfAを含む画分を、SDS−PAGEによる純度に基づいて選択し、収集して、0.22μmで滅菌濾過した。
【0176】
野生型ClfA(B2378株)の精製
振盪フラスコ中の培養物から収集した大腸菌細胞ペーストを、50mM NaCl、2mM EDTAおよび1mM PMSFを含む50mMリン酸緩衝液pH7.2に懸濁し、OD650nmは120に達した。この懸濁液をPandaホモジナイザー中で機械的に破砕(2回通過、750bar)し、50%酢酸でpH3.8に調整した。4℃で30分間、12200gで遠心分離した後、上清を0.45〜0.20μmの濾過により浄化し、平衡化したSephacryl HR300カラムで精製して、10mM ホウ酸ナトリウム pH9.5で溶出した。ClfAを含む画分を、SDS−PAGEによる純度に基づいて選択し、収集して、0.22μmで滅菌濾過した。
【0177】
実施例3 フィブリノゲン結合実験
コーティングしたClfAへのフィブリノゲン接着
ClfAタンパク質を、4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlで高結合マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で30分間、PBS−1%BSAでブロッキングした。
【0178】
洗浄後、ヒトフィブリノゲン(ref:SIGMA F4883−16)を、1mg/mlの出発濃度で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに2倍希釈し、これを振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。
【0179】
洗浄後、この結合したフィブリノゲンを、PBS−0.2%BSA−0.05%Tweenで1:5000希釈したペルオキシダーゼ結合抗フィブリノゲンヤギポリクローナル抗体(ref:ABCAM 7539−1)を用いて検出した。この検出抗体を、撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。
【0180】
pH4.5の0.1M クエン酸緩衝液10mlあたりOPD(Sigma)4mg+H2O2 5μlを用いて、暗所で、室温で15分間発色させた。この反応をHCl50μlで停止させ、光学密度を620nmに対する490nmで読みとった。
【0181】
これらの結果を図7に示し、図7は、ClfA N123の474変異体タンパク質が、ClfA N123の野生型タンパク質に比べてフィブリノゲンへの結合が弱いことを示す。
【0182】
コーティングしたフィブリノゲンへのClfA接着
ヒトフィブリノゲン(ref:SIGMA F4883−16)を、4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlで高結合マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で30分間、PBS−1%BSAでブロッキングした。
【0183】
洗浄後、このClfAを50μg/mlの出発濃度で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに2倍希釈し、これを振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。
【0184】
洗浄後、この結合したClfAを、PBS−0.2%BSA−0.05%Tweenで1:500希釈した(hisタグ付きClfA N123で免疫した後に得た)抗ClfAウサギポリクローナル(抗体)を用いて検出し、振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。
【0185】
洗浄後、結合したウサギ抗体を、PBS−0.05%Tweenで1:5000希釈したJackson ImmunoLaboratories社のペルオキシダーゼ結合affiniPureヤギ抗ウサギIgG(ref:111−035−003)を用いて検出した。この検出抗体を、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
【0186】
pH4.5の0.1M クエン酸緩衝液10mlあたりOPD(Sigma)4mg+H2O2 5μlを用いて、暗所で、室温で15分間発色させた。この反応をHCl50μlで停止させ、光学密度(OD)を、620nmに対する490nmで読みとった。
【0187】
図8に示す結果は、ClfA N123の474変異体タンパク質が、ClfA N123の野生型タンパク質に比べてフィブリノゲンへの結合が弱いことを再度証明する。
【0188】
実施例4 コーティングしたClfAへのフィブリノゲン接着の阻害アッセイ
20匹のマウスのグループに、0、14および28日目に、アジュバントAS02Vで製剤化したClfA N123またはClfAの474変異体10μgを筋肉注射により接種した。対照グループにはアジュバントのみを接種した。
【0189】
42日目に、血清をマウスから収集し、各グループから集めた血清を、コーティングしたClfAへのフィブリノゲン接着の阻害アッセイで試験した。
【0190】
精製したClfAを、4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlで高結合マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)上にコーティングした。これらのプレートを、撹拌しながら室温で30分間、PBS−1%BSAでブロッキングした。洗浄後、マウス抗血清を最初に10倍希釈で添加し、その後、マイクロプレート中でさらに2倍希釈し、これを振盪しながら室温で1時間インキュベートした。洗浄ステップをせず、ヒトフィブリノゲン(Ref:SIGMA F4883−16)を、PBS−0.2%BSA−0.05%Tween中400μg/ml濃度で添加し、振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。
【0191】
洗浄後、結合したフィブリノゲンを、PBS−0.2%BSA−0.05%Tweenで1:5000希釈したペルオキシダーゼ結合抗フィブリノゲンヤギポリクローナル抗体(ref:ABCAM 7539−1)を用いて検出した。この検出抗体を、撹拌しながら室温で60分間インキュベートした。pH4.5の0.1M クエン酸緩衝液10mlあたりOPD(Sigma)4mg+H2O2 5μlを用いて、暗所で、室温で15分間発色させた。この反応をHCl50μlで停止させ、光学密度を620nmに対する490nmで読みとった。
【0192】
図9に示す結果は、ClfA N123の野生型および474変異体の両方に対する抗体は、ほぼ同じ程度で、ClfA N123コーティングプレートへのフィブリノゲンの結合を阻害することができたことを証明する。
【0193】
コーティングフィブリノゲンへの黄色ブドウ球菌接着の阻害アッセイ
20匹のマウスのグループに、0、14および28日目に、アジュバントAS02Vで製剤化したClfA N123またはClfAの474変異体10μgを筋肉注射により接種した。対照グループにはアジュバントのみを接種した。
【0194】
42日目に、血清をマウスから収集し、各グループから集めた血清を、コーティングしたフィブリノゲンへの黄色ブドウ球菌接着の阻害アッセイで試験した。
【0195】
ヒトフィブリノゲン(ref:SIGMA F4883−16)を、4℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中10μg/mlで高結合マイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)上にコーティングした。これらのプレートを、振盪しながら室温で30分間、PBS−1%BSAでブロッキングした。
【0196】
この飽和ステップ中、別のマイクロプレートで、マウス抗血清の連続2倍希釈をPBS−0.2%BSA−0.05%Tweenで行った。その後、熱失活させたNewman D spa 黄色ブドウ球菌(2 10e6 CFU/ウェル)を添加し、これらのマイクロプレートを、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
【0197】
フィブリノゲンコーティングプレートの洗浄後、抗血清−細菌混合物を添加し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
【0198】
洗浄後、結合した細菌を、PBS−0.2%BSA−0.05%Tweenで1:50000希釈した(死滅させた黄色ブドウ球菌Lowensteinで免疫した後に得た)抗死滅全細胞ウサギポリクローナル(抗体)を用いて検出し、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
【0199】
洗浄後、結合したウサギ抗体を、PBS−0.05%Tweenで1:5000希釈したJackson ImmunoLaboratories社のペルオキシダーゼ結合affiniPureヤギ抗ウサギIgG(ref:111−035−003)を用いて検出した。この検出抗体を、振盪しながら室温で30分間インキュベートした。
【0200】
pH4.5の0.1M クエン酸緩衝液10mlあたりOPD(Sigma)4mg+H2O2 5μlを用いて、暗所で、室温で15分間発色させた。この反応をHCl50μlで停止させ、光学密度(OD)を、620nmに対する490nmで読みとった。
【0201】
図10に示す結果は、ClfA N123の野生型および474変異体の両方に対する抗体が、ほぼ同じ程度で、フィブリノゲンコーティングプレートへの黄色ブドウ球菌の結合を阻害することができたことを証明する。
【0202】
配列:
配列番号1
MTKHYLNSKYQSEQRSSAMKKITMGTASIILGSLVYIGADSQQVNAATEATNATNNQSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKPNNVKPVQPKPAQPKTPTEQTKPVQPKVEKVKPTVTTTSKVEDNHSTKVVSTDTTKDQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号2
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号3
SQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADA

配列番号4
DSQQVNAATEATNATNNQSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号5
SQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLA

配列番号6
MNKQQKEFKSFYSIRKSSLGVASVAISTLLLLMSNGEAQAAAEETGGTNTEAQPKTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVSVSNKEVEAPTSETKEAKEVKEVKAPKETKEVKPAAKATNNTYPILNQELREAIKNPAIKDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSNKKEQQDNSAKKEATPATPSKPTPSPVEKESQKQDSQKDDNKQLPSVEKENDASSESGKDKTPATKPTKGEVESSSTTPTKVVSTTQNVAKPTTASSKTTKDVVQTSAGSSEAKDSAPLQKANIKNTNDGHTQSQNNKNTQENKAKSLPQTGEESNKDMTLPLMALLALSSIVAFVLPRKRKN

配列番号7
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号8
SAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSA

配列番号9
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号10
KMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANT

配列番号11
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号12
SAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANT

配列番号13
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTKLGGSPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号14
MKNILKVFNTTILALIIIIATFSNSANAADSGTLNYEVYKYNTNDTSIANDYFNKPAKYIKKNGKLYVQITVNHSHWITGMSIEGHKENIISKNTAKDERTSEFEVSKLNGKIDGKIDVYIDEKVNGKPFKYDHHYNITYKFNGPTDVAGANAPGKDDKNSASGSDKGSDGTTTGQSESNSSNKDKVENPQTNAGTPAYIYAIPVASLALLIAITLFVRKKSKGNVE

配列番号15
NSANAADSGTLNYEVYKYNTNDTSIANDYFNKPAKYIKKNGKLYVQITVNHSHWITGMSIEGHKENIISKNTAKDERTSEFEVSKLNGKIDGKIDVYIDEKVNGKPFKYDHHYNITYKFNGPTDVAGANAP

配列番号16
MNKHHPKLRSFYSIRKSTLGVASVIVSTLFLITSQHQAQAAENTNTSDKISENQNNNATTTQPPKDTNQT
QPATQPANTAKNYPAADESLKDAIKDPALENKEHDIGPREQVNFQLLDKNNETQYYHFFSIKDPADVYYTKKKAEVELDINTASTWKKFEVYENNQKLPVRLVSYSPVPEDHAYIRFPVSDGTQELKIVSSTQIDDGEETNYDYTKLVFAKPIYNDPSLVKSDTNDAVVTNDQSSSVASNQTNTNTSNQNISTINNANNQPQATTNMSQPAQPKSSTNADQASSQPAHETNSNGNTNDKTNESSNQSDVNQQYPPADESLQDAIKNPAIIDKEHTADNWR
PIDFQMKNDKGERQFYHYASTVEPATVIFTKTGPIIELGLKTASTWKKFEVYEGDKKLPVELVSYDSDKDYAYIRFPVSNGTREVKIVSSIEYGENIHEDYDYTLMVFAQPITNNPDDYVDEETYNLQKLLAPYHKAKTLERQVYELEKLQEKLPEKYKAEYKKKLDQTRVELADQVKSAVTEFENVTPTNDQLTDLQEAHFVVFESEENSESVMDGFVEHPFYTATLNGQKYVVMKTKDDSYWKDLIVEGKRVTTVSKDPKNNSRTLIFPYIPDKAVYNAIVKVVVANIGYEGQYHVRIINQDINTKDDDTSQNNTSEPLNVQTGQEGKVADTDVAENSSTATNPKDASDKADVIEPESDVVKDADNNIDKDVQHDVDHLSDMSDNNHFDKYDLKEMDTQIAKDTDRNVDKDADNSVGMSSNVDTDKDSNKNKDKVIQLNHIADKNNHTGKAAKLDVVKQNYNNTDKVTDKKTTEHLPSDIHKTVDKTVKTKEKAGTPSKENKLSQSKMLPKTGETTSSQSWWGLYALLGMLALFIPKFRKESK

配列番号17
NKEHDIGPREQVNFQLLDKNNETQYYHFFSIKDPADVYYTKKKAEVELDINTASTWKKFEVYENNQKLPVRLVSYSPVPEDHAYIRFPVSDGTQELKIVSSTQIDDGEETNYDYTKLVFAKPIYNDPSLVKS

配列番号18
KEHTADNWRPIDFQMKNDKGERQFYHYASTVEPATVIFTKTGPIIELGLKTASTWKKFEVYEGDKKLPVE
LVSYDSDKDYAYIRFPVSNGTREVKIVSSIEYGENIHEDYDYTLMVFAQPITNNPDDYVD

配列番号19
TNDQLTDLQEAHFVVFESEENSESVMDGFVEHPFYTATLNGQKYVVMKTKDDSYWKDLIVEGKRVTTVSK
DPKNNSRTLIFPYIPDKAVYNAIVKVVVANIGYEGQYHVRIINQDINTKDDDTSQ

配列番号20
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPEDSDSDPGSDSGSDSNSDSGSDSGSDSTSDSGSDSASDSDSA
SDSDSASDSDSASDSDSASDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSDSDSDSD
SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSASDSDSGSD
SDSSSDSDSESDSNSDSESVSNNNVVPPNSPKNGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEAN
TSLIWGLLASIGSLLLFRRKKENKDKK

配列番号21
MNMKKKEKHAIRKKSIGVASVLVGTLIGFGLLSSKEADASENSVTQSDSASNESKSNDSS
SVSAAPKTDDTNVSDTKTSSNTNNGETSVAQNPAQQETTQSSSTNATTEETPVTGEATTT
TTNQANTPATTQSSNTNAEELVNQTSNETTSNDTNTVSSVNSPQNSTNAENVSTTQDTST
EATPSNNESAPQSTDASNKDVVNQAVNTSAPRMRAFSLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号22
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号23
GTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号24
MAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMSAAIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号25
LKKRIDYLSNKQNKYSIRRFTVGTTSVIVGATILFGIGNHQAQASEQSNDTTQSSKNNAS
ADSEKNNMIETPQLNTTANDTSDISANTNSANVDSTTKPMSTQTSNTTTTEPASTNETPQ
PTAIKNQATAAKMQDQTVPQEANSQVDNKTTNDANSIATNSELKNSQTLDLPQSSPQTIS
NAQGTSKPSVRTRAVRSLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VNPKDPTPGPPVDPEPSPDPEPEPTPDPEPSPDPEPEPSPDPDPDSDSDSDSGSDSDSGS
DSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSESDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSRVTPPNNEQKAPSNPKGEVNHSNKVSKQHKTDALPE
TGDKSENTNATLFGAMMALLGSLLLFRKRKQDHKEKA

配列番号26
LKKRIDYLSNKQNKYSIRRFTVGTTSVIVGATILFGIGNHQAQASEQSNDTTQSSKNNAS
ADSEKNNMIETPQLNTTANDTSDISANTNSANVDSTTKPMSTQTSNTTTTEPASTNETPQ
PTAIKNQATAAKMQDQTVPQEANSQVDNKTTNDANSIATNSELKNSQTLDLPQSSPQTIS
NAQGTSKPSVRTRAVRSLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VN

配列番号27
SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VN

配列番号28
GTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSAVN

配列番号29
MNNKKTATNRKGMIPNRLNKFSIRKYSVGTASILVGTTLIFGLSGHEAKAAEHTNGELNQSKNETTAPSENKTTEKVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATASQSTTQTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQAKNVSTTPKTTTIKQRALNRMAVNTVAAPQQGTNVNDKVHFTNIDIAIDKGHVNKTTGNTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSKTNTTTYTFTNYVDQYTNVSGSFEQVAFAKRENATTDKTAYKMEVTLGNDTYSKDVIVDYGNQKGQQLISSTNYINNEDLSRNMTVYVNQPKKTYTKETFVTNLTGYKFNPDAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTGQFDVIYSNDNKTATVDLLNGQSSSDKQYIIQQVAYPDNSSTDNGKIDYTLETQNGKSSWSNSYSNVNGSSTANGDQKKYNLGDYVWEDTNKDGKQDANEKGIKGVYVILKDSNGKELDRTTTDENGKYQFTGLSNGTYSVEFSTPAGYTPTTANAGTDDAVDSDGLTTTGVIKDADNMTLDSGFYKTPKYSLGDYVWYDSNKDGKQDSTEKGIKGVKVTLQNEKGEVIGTTETDENGKYRFDNLDSGKYKVIFEKPAGLTQTGTNTTEDDKDADGGEVDVTITDHDDFTLDNGYYEEETSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDAGKHTPTKPMSTVKDQHKTAKALPETGSENNNSNNGTLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

配列番号30
AEHTNGELNQSKNETTAPSENKTTEKVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATASQSTTQTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQAKNVSTTPKTTTIKQRALNRMAVNTVAAPQQGTNVNDKVHFTNIDIAIDKGHVNKTTGNTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSKTNTTTYTFTNYVDQYTNVSGSFEQVAFAKRENATTDKTAYKMEVTLGNDTYSKDVIVDYGNQKGQQLISSTNYINNEDLSRNMTVYVNQPKKTYTKETFVTNLTGYKFNPDAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTGQFDVIYSNDN

配列番号31
VAAPQQGTNVNDKVHFTNIDIAIDKGHVNKTTGNTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSKTNTTTYTFTNYVDQYTNVSGSFEQVAFAKRENATTDKTAYKMEVTLGNDTYSKDVIVDYGNQKGQQLISSTNYINNEDLSRNMTVYVNQPKKTYTKETFVTNLTGYKFNPDAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTGQFDVIYSNDN

配列番号32
MNNKKTATNRKGMIPNRLNKFSIRKYSVGTASILVGTTLIFGLSGHEAKAAEHTNGELNQ
SKNETTAPSENKTTKKVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATAN
QSTTKTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQAKDVSTTPKTTTIKPRTLNRMAVNTVAAPQ
QGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTF
KYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQ
VAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMT
AYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQF
DVIYSNDNKTATVDLMKGQTSSNKQYIIQQVAYPDNSSTDNGKIDYTLDTDKTKYSWSNS
YSNVNGSSTANGDQKKYNLGDYVWEDTNKDGKQDANEKGIKGVYVILKDSNGKELDRTTT
DENGKYQFTGLSNGTYSVEFSTPAGYTPTTANVGTDDAVDSDGLTTTGVIKDADNMTLDS
GFYKTPKYSLGDYVWYDSNKDGKQDSTEKGIKGVKVTLQNEKGEVIGTTETDENGKYRFD
NLDSGKYKVIFEKPAGLTQTGTNTTEDDKDADGGEVDVTITDHDDFTLDNGYYEEETSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDAGKHTPAKPMSTVKDQHKTAKALPE
TGSENNNSNNGTLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

配列番号33
AEHTNGELNQSKNETTAPSENKTTKKVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATANQSTTKTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQAKDVSTTPKTTTIKPRTLNRMAVNTVAAPQ
QGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN

配列番号34
VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN

配列番号35
MLNRENKTAITRKGMVSNRLNKFSIRKYTVGTASILVGTTLIFGLGNQEAKAAESTNKELNEATTSASDNQSSDKVDMQQLNQEDNTKNDNQKEMVSSQGNETTSNGNKLIEKESVQSTTGNKVEVSTAKSDEQASPKSTNEDLNTKQTISNQEALQPDLQENKSVVNVQPTNEENKKVDAKTESTTLNVKSDAIKSNDETLVDNNSNSNNENNADIILPKSTAPKRLNTRMRIAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQEVYKIGNYVWEDTNKNGVQELGEKGVGNVTVTVFDNNTNTKVGEAVTKEDGSYLIPNLPNGDYRVEFSNLPKGYEVTPSKQGNNEELDSNGLSSVITVNGKDNLSADLGIYKPKYNLGDYVWEDTNKNGIQDQDEKGISGVTVTLKDENGNVLKTVTTDADGKYKFTDLDNGNYKVEFTTPEGYTPTTVTSGSDIEKDSNGLTTTGVINGADNMTLDSGFYKTPKYNLGNYVWEDTNKDGKQDSTEKGISGVTVTLKNENGEVLQTTKTDKDGKYQFTGLENGTYKVEFETPSGYTPTQVGSGTDEGIDSNGTSTTGVIKDKDNDTIDSGFYKPTYNLGDYVWEDTNKNGVQDKDEKGISGVTVTLKDENDKVLKTVTTDENGKYQFTDLNNGTYKVEFETPSGYTPTSVTSGNDTEKDSNGLTTTGVIKDADNMTLDSGFYKTPKYSLGDYVWYDSNKDGKQDSTEKGIKDVKVTLLNEKGEVIGTTKTDENGKYCFDNLDSGKYKVIFEKPAGLTQTVTNTTEDDKDADGGEVDVTITDHDDFTLDNGYFEEDTSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDAGKHTPVKPMSTTKDHHNKAKALPETGSENNGSNNATLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

配列番号36
AESTNKELNEATTSASDNQSSDKVDMQQLNQEDNTKNDNQKEMVSSQGNETTSNGNKLIEKESVQSTTGNKVEVSTAKSDEQASPKSTNEDLNTKQTISNQEALQPDLQENKSVVNVQPTNEENKKVDAKTESTTLNVKSDAIKSNDETLVDNNSNSNNENNADIILPKSTAPKRLNTRMRIAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE

配列番号37
IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE

配列番号38
MINRDNKKAITKKGMISNRLNKFSIRKYTVGTASILVGTTLIFGLGNQEAKAAENTSTENAKQDDATTSDNKEVVSETENNSTTENDSTNPIKKETNTDSQPEAKEESTTSSTQQQQNNVTATTETKPQNIEKENVKPSTDKTATEDTSVILEEKKAPNYTNNDVTTKPSTSEIQTKPTTPQESTNIENSQPQPTPSKVDNQVTDATNPKEPVNVSKEELKNNPEKLKELVRNDNNTDRSTKPVATAPTSVAPKRLNAKMRFAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTVKPEEKLYKIGDYVWEDVDKDGVQGTDSKEKPMANVLVTLTYPDGTTKSVRTDANGHYEFGGLKDGETYTVKFETPAGYLPTKVNGTTDGEKDSNGSSITVKINGKDDMSLDTGFYKEPKYNLGDYVWEDTNKDGIQDANEPGIKDVKVTLKDSTGKVIGTTTTDASGKYKFTDLDNGNYTVEFETPAGYTPTVKNTTAEDKDSNGLTTTGVIKDADNMTLDSGFYKTPKYSLGDYVWYDSNKDGKQDSTEKGIKDVKVTLLNEKGEVIGTTKTDENGKYRFDNLDSGKYKVIFEKPAGLTQTVTNTTEDDKDADGGEVDVTITDHDDFILDNGYFEEDTSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDAGKHTPVKPMSTTKDHHNKAKALPETGSENNGSNNATLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

配列番号39
AENTSTENAKQDDATTSDNKEVVSETENNSTTENDSTNPIKKETNTDSQPEAKEESTTSSTQQQQNNVTATTETKPQNIEKENVKPSTDKTATEDTSVILEEKKAPNYTNNDVTTKPSTSEIQTKPTTPQESTNIENSQPQPTPSKVDNQVTDATNPKEPVNVSKEELKNNPEKLKELVRNDNNTDRSTKPVATAPTSVAPKRLNAKMRFAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV

配列番号40
FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV

配列番号41
MINRDNKKAITKKGMISNRLNKFSIRKYTVGTASILVGTTLIFGLGNQEAKAAENTSTENAKQDDATTSDNKEVVSETENNSTTENDSTNPIKKETNTDSQPEAKEESTTSSTQQQQNNVTATTETKPQNIEKENVKPSTDKTATEDTSVILEEKKAPNYTNNDVTTKPSTSEIQTKPTTPQESTNIENSQPQPTPSKVDNQVTDATNPKEPVNVSKEELKNNPEKLKELVRNDNNTDRSTKPVATAPTSVAPKRLNAKMRFAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTVKPEEKLYKIGDYVWEDVDKDGVQGTDSKEKPMANVLVTLTYPDGTTKSVRTDANGHYEFGGLKDGETYTVKFETPAGYLPTKVNGTTDGEKDSNGSSITVKINGKDDMSLDTGFYKEPKYNLGDYVWEDTNKDGIQDANEPGIKDVKVTLKDSTGKVIGTTTTDASGKYKFTDLDNGNYTVEFETPAGYTPTVKNTTAEDKDSNGLTTTGVIKDADNMTLDSGFYKTPKYSLGDYVWYDSNKDGKQDSTEKGIKDVKVTLLNEKGEVIGTTKTDENGKYRFDNLDSGKYKVIFEKPAGLTQTVTNTTEDDKDADGGEVDVTITDHDDFILDNGYFEEDTSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDAGKHTPVKPMSTTKDHHNKAKALPETGSENNGSNNATLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK

配列番号42
AENTSTENAKQDDATTSDNKEVVSETENNSTTENDSTNPIKKETNTDSQPEAKEESTTSSTQQQQNNVTATTETKPQNIEKENVKPSTDKTATEDTSVILEEKKAPNYTNNDVTTKPSTSEIQTKPTTPQESTNIENSQPQPTPSKVDNQVTDATNPKEPVNVSKEELKNNPEKLKELVRNDNNTDRSTKPVATAPTSVAPKRLNAKMRFAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNN

配列番号43
FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNN

配列番号44
MINKKNNLLTKKKPIANKSNKYAIRKFTVGTASIVIGATLLFGLGHNEAKAEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDELLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNYVWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDLGNSSDKSTKDKLPDTGANEDYGSKGTLLGTLFAGLGALLLGKRRKNRKNKN

配列番号45
EENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDELLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN

配列番号46
VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN

以下の配列において、xは共有結合または1〜200個のアミノ酸のいずれかを示す。
【0203】

配列番号47
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号48
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSAVN

配列番号49
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN

配列番号50
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE

配列番号51
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV

配列番号52
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN

配列番号53
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号54
SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSAVN
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号55
VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号56
IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号57
FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号58
VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号59
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
DQITTPYIVVVNGHIDPNSKGDLALRSTLYGYNSNIIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGID
KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号60
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VN

配列番号60
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VN

配列番号61
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN

配列番号62
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE

配列番号63
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV

配列番号64
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTx VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN

配列番号65
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
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KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号66
SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSAVN
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号67
VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号68
IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号69
FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号70
VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN
xDKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKT

配列番号71
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
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DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
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KPVVPEQPDEPGEIEPIPE

配列番号72
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
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SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSA
VN

配列番号73
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN

配列番号74
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE

配列番号75
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV

配列番号76
PTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKSx VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN

配列番号77
SLAAVAADAPVAGTDITNQLTNVT
VGIDSGTTVYPHQAGYVKLNYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTSTAKVPPIMAG
DQVLANGVIDSDGNVIYTFTDYVNTKDDVKATLTMPAYIDPENVKKTGNVTLATGIGSTT
ANKTVLVDYEKYGKFYNLSIKGTIDQIDKTNNTYRQTIYVNPSGDNVIAPVLTGNLKPNT
DSNALIDQQNTSIKVYKVDNAADLSESYFVNPENFEDVTNSVNITFPNPNQYKVEFNTPD
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KPVVPEQPDEPGEIEPIPE
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号78
SLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFKLEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKSGDYFTAKLPDSLTGNGDVDYSNSNNTMPIADIKSTNGDVVAKATYDI
LTKTYTFVFTDYVNNKENINGQFSLPLFTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYS
SPIAGIDKPNGANISSQIIGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQRVLGNTWVYIKGYQDKIEES
SGKVSATDTKLRIFEVNDTSKLSDSYYADPNDSNLKEVTDQFKNRIYYEHPNVASIKFGD
ITKTYVVLVEGHYDNTGKNLKTQVIQENVDPVTNRDYSIFGWNNENVVRYGGGSADGDSAVN
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号79
VAAPQQGTNVNDKVHFSNIDIAIDKGHVNQTTGKTEFWATSSDVLKLKANYTIDDSVKEGDTFTFKYGQYFRPGSVRLPSQTQNLYNAQGNIIAKGIYDSTTNTTTYTFTNYVDQYTNVRGSFEQVAFAKRKNATTDKTAYKMEVTLGNDTYSEEIIVDYGNKKAQPLISSTNYINNEDLSRNMTAYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQFDVIYSNDN
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号80
IAAVQPSSTEAKNVNDLITSNTTLTVVDADKNNKIVPAQDYLSLKSQITVDDKVKSGDYFTIKYSDTVQVYGLNPEDIKNIGDIKDPNNGETIATAKHDTANNLITYTFTDYVDRFNSVQMGINYSIYMDADTIPVSKNDVEFNVTIGNTTTKTTANIQYPDYVVNEKNSIGSAFTETVSHVGNKENPGYYKQTIYVNPSENSLTNAKLKVQAYHSSYPNNIGQINKDVTDIKIYQVPKGYTLNKGYDVNTKELTDVTNQYLQKITYGDNNSAVIDFGNADSAYVVMVNTKFQYTNSESPTLVQMATLSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQE
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号81
FAVAQPAAVASNNVNDLITVTKQTIKVGDGKDNVAAAHDGKDIEYDTEFTIDNKVKKGDTMTINYDKNVIPSDLTDKNDPIDITDPSGEVIAKGTFDKATKQITYTFTDYVDKYEDIKARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQDPMVHGDSNIQSIFTKLDENKQTIEQQIYVNPLKKTATNTKVDIAGSQVDDYGNIKLGNGSTIIDQNTEIKVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSAYIIKVVSKYTPTSDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNFIVTSNDTGGGDGTV
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号82
VTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNN
xPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号83
STQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAKx DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS

配列番号84
DKDHSAPNSRPIDFEMKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTDKS
xSTQVSQATSQPINFQVQKDGSSEKSHMDDYMQHPGKVIKQNNKYYFQTVLNNASFWKEYKFYNANNQELATTVVNDNKKADTRTINVAVEPGYKSLTTKVHIVVPQINYNHRYTTHLEFEKAIPTLADAAK

配列番号85
DQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号86
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配列番号87
DQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESKx MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKAHTD

配列番号88
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xDQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号89
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配列番号90
MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTEEDYKAEKLLAPYKKAKTLERQVYELNKIQDKLPEKLKAEYKKKLEDTKKALDEQVKSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTD
xDQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号91
DQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESKx MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTxPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKAHTD

配列番号92
MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTxPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKAHTD
xDQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号93
DQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESKx MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTxPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTD

配列番号94
MKKKDGTQQFYHYASSVKPARVIFTDSKPEIELGLQSGQFWRKFEVYEGDKKLPIKLVSYDTVKDYAYIRFSVSNGTKAVKIVSSTHFNNKEEKYDYTLMEFAQPIYNSADKFKTxPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVKHPIKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQRVRTISKDAKNNTRTIIFPYVEGKTLYDAIVKVHVKTIDYDGQYHVRIVDKEAFTKANTD
xDQTKTQTAHTVKTAQTAQEQNKVQTPVKDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPKTGLTSVDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK

配列番号95
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配列番号96
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配列番号97
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配列番号98
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
NEATドメインを含むブドウ球菌Isdタンパク質の断片を含む免疫原性組成物。
【請求項2】
前記ブドウ球菌Isdタンパク質が黄色ブドウ球菌に由来する、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
前記ブドウ球菌Isdタンパク質がIsdA、IsdB、IsdHおよびIsdCからなる群から選択される、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdAの58〜188番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdBの140〜269番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdBの337〜462番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdBの140〜462番目のアミノ酸であり、任意に、269〜337番目のアミノ酸が除去されているか、または置換されている、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
IsdBの前記N末端NEATドメイン(140〜269番目のアミノ酸)の少なくとも一部、任意に、その全部が存在しない、請求項6または7に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdCの23〜154または28〜154番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdHの101〜232番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdHの341〜471番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片がIsdHの539〜664番目のアミノ酸である、請求項3に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
前記断片が、配列番号2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18および19、またはそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
ラミニン受容体、SitC/MntC/唾液結合タンパク質、EbhA、EbhB、エラスチン結合タンパク質(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自己溶菌酵素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、リパーゼGehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP−1、SSP−2、ビトロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コアグラーゼ、FigおよびMAPからなる群から選択されるブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
前記ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質が、ClfA、ClfB、SdrD、SdrE、SdrGもしくはSdrCまたはその免疫原性断片からなる群から選択される、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項16】
前記ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質がリガンド結合領域を含む断片である、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
ClfAのN23ドメインを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項18】
ClfBのN23ドメインを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項19】
SdrCのN23ドメインを含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項20】
SdrDのN23ドメインを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項21】
SdrEのN23ドメインを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項22】
SdrGのN23ドメインを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項23】
リガンド結合領域を含む前記断片が、配列番号21、22、23、24、26、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、45および46またはその免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項24】
ブドウ球菌Isdタンパク質の前記断片が、ブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質またはその断片と共有結合している、請求項14〜23のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項25】
N23ドメインを含むClfB、SdrC、SdrD、SdrEまたはSdrGの断片を含む免疫原性組成物。
【請求項26】
追加のブドウ球菌抗原を含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項27】
前記追加のブドウ球菌抗原が、黄色ブドウ球菌の5型および/または8型の莢膜糖を含み、任意にキャリアタンパク質に結合している、請求項26に記載の免疫原性組成物。
【請求項28】
前記追加のブドウ球菌抗原が、キャリアタンパク質に任意に結合しているPNAGを含む、請求項26〜27のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項29】
前記PNAGの50%、40%、30%、20%または10%未満がNアセチル化されている、請求項28に記載の免疫原性組成物。
【請求項30】
前記追加のブドウ球菌抗原がIsdタンパク質もしくはその免疫原性断片または請求項1〜24のいずれか1項に記載されている断片である、請求項26〜29のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項31】
EsxA、EsxBまたはEsxAとEsxBの組み合わせを含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項32】
前記EsxAまたはEsxBが糖抗原に結合している、請求項31に記載の免疫原性組成物。
【請求項33】
EsaC抗原またはEsaB抗原を含む、請求項1〜32のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項34】
鉄/ヘム取り込みシステムに関わるブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項35】
前記NEATドメインが、任意に、IsdA、IsdB、IsdCおよびIsdHからなる群から選択される、黄色ブドウ球菌Isdタンパク質に由来する、請求項34に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
前記リガンド結合ドメインが、任意に、ClfA、ClfB、SdrC、SdrDおよびSdrEからなる群から選択される、黄色ブドウ球菌タンパク質に由来する、請求項34または35に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
前記リガンド結合ドメインがClfA、ClfB、SdrC、SdrDまたはSdrEのN23ドメインからなる、請求項36に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
前記リガンド結合ドメインがClfA、ClfB、SdrC、SdrDまたはSdrEのN123ドメインからなる、請求項36に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
前記リガンド結合ドメインが表皮ブドウ球菌のタンパク質、任意に、SdrGに由来する、請求項34または35に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記リガンド結合ドメインがSdrGのN23ドメインからなる、請求項39に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記リガンド結合ドメインがSdrGのN123ドメインからなる、請求項39に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
配列番号47〜97からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項34〜41のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
第1のブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインおよび第2のIsdタンパク質由来のNEATドメインを含む融合タンパク質。
【請求項44】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdAである、請求項43に記載の融合タンパク質。
【請求項45】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdBである、請求項43に記載の融合タンパク質。
【請求項46】
IsdB由来の前記NEATドメインが、(任意に、IsdBの337〜462番目のアミノ酸を含む)C末端NEATドメインである、請求項45に記載の融合タンパク質。
【請求項47】
IsdBのN末端NEATドメイン(140〜269番目のアミノ酸)の少なくとも一部、任意に、その全てが前記融合タンパク質に存在しない、請求項46に記載の融合タンパク質。
【請求項48】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdCである、請求項43に記載の融合タンパク質。
【請求項49】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdHである、請求項43に記載の融合タンパク質。
【請求項50】
前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdAである、請求項43または45〜49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項51】
前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdBである、請求項43、44、48または49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項52】
前記第2のIsdタンパク質がIsdBのC末端NEATドメインである、請求項51に記載の融合タンパク質。
【請求項53】
IsdBのN末端NEATドメイン(140〜269番目のアミノ酸)の少なくとも一部、任意に、その全てが前記融合タンパク質に存在しない、請求項51または52に記載の融合タンパク質。
【請求項54】
前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdCである、請求項43〜47または49のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項55】
前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質がIsdHである、請求項43〜48のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項56】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質が前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質に対してN末端側にある、請求項43〜55のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項57】
前記第1のブドウ球菌Isdタンパク質が前記第2のブドウ球菌Isdタンパク質に対してC末端側にある、請求項43〜55のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項58】
配列番号47〜97からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項43〜56のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項59】
第1のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインおよび第2のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインを含む融合タンパク質。
【請求項60】
前記第1のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質が、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、ClfAおよびClfBからなる群から選択される、請求項58に記載の融合タンパク質。
【請求項61】
前記第2のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質が、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、ClfAおよびClfBからなる群から選択される、請求項58または59に記載の融合タンパク質。
【請求項62】
前記第1のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質の前記リガンド結合ドメインがN2N3ドメインからなる、請求項58〜60のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項63】
前記第2のブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質の前記リガンド結合ドメインがN2N3ドメインからなる、請求項58〜61のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項64】
ブドウ球菌Isdタンパク質のNEATドメインをコードするポリヌクレオチド配列およびブドウ球菌細胞外成分結合タンパク質のリガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項65】
配列番号47〜82からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも85%の同一性を有する配列をコードする、請求項63に記載のポリヌクレオチド。
【請求項66】
請求項1〜33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、請求項34〜62のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項63〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、および医薬的に許容される賦形剤を含むワクチン。
【請求項67】
請求項1〜33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、請求項34〜62のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項63〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドに医薬的に許容される賦形剤を添加するステップを含む、請求項65に記載のワクチンを作製する方法。
【請求項68】
ブドウ球菌の感染または疾患の治療または予防において使用するための、請求項1〜33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項69】
ブドウ球菌疾患の治療または予防のための医薬の調製における、請求項1〜33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、請求項34〜62のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項63〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項70】
請求項1〜33のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、請求項34〜62のいずれか1項に記載の融合タンパク質または請求項63〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを、それを必要としている患者に投与することを含む、ブドウ球菌疾患を治療または予防する方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【公表番号】特表2013−501027(P2013−501027A)
【公表日】平成25年1月10日(2013.1.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−523324(P2012−523324)
【出願日】平成22年8月3日(2010.8.3)
【国際出願番号】PCT/EP2010/061314
【国際公開番号】WO2011/015591
【国際公開日】平成23年2月10日(2011.2.10)
【出願人】(305060279)グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Fターム(参考)】