抗原特異的Ｔ細胞、核酸、ベクター、ＰＢＭＣ、及び製薬組成物
【課題】抗原特異的Ｔ細胞を提供する。
【解決手段】抗原特異的Ｔ細胞は、患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、及び、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、これらの両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、及びＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程を含む方法によって提供される。
【解決手段】抗原特異的Ｔ細胞は、患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、及び、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、これらの両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、及びＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程を含む方法によって提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法を目的とする。本発明はさらに、抗原特異的Ｔ細胞、単離トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、これを含有する製薬組成物、および養子細胞療法におけるこれらの使用も目的とする。本発明は特に、非選択同種異系Ｔ細胞レパートリーからペプチド−特異的Ｔ細胞を誘発するための、同種異系ＭＨＣ分子および抗原を共発現する細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種異系幹細胞移植（ＳＣＴ）の設定におけるリンパ球の養子転移は、血液悪性腫瘍を根絶するための免疫系の力を実証している（Ｋｏｌｂら、１９９５年）。ＳＣＴはまた、いくつかの症例において、充実性腫瘍、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）を取り除く作用も果たし得るように見える（Ｋｏｌｂら、２００４年およびＤｕｄｌｅｙおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００３年において概説されている）。ＳＣＴ受容者において、悪性細胞の除去は、特異的Ｔ細胞が生体内で活性化されなければならず、次いで移植受容者における新しい造血系の発達後に適切な数まで拡張されなければならないという事実によって、数ヶ月から１年後にのみ発生し得る。あるいはまた、ＳＣＴ受容者において耐性が確立される一定期間（約６０日）後、非初回抗原刺激、非分離リンパ球の転移が、腫瘍細胞に対して向けられた免疫応答の生成を加速させることができる。ここでもまた、腫瘍細胞を攻撃し得る特異的リンパ球は活性化されなければならず、転移されるリンパ球の非選択集団中に存在する低周波数先駆物質リンパ球から拡張されなければならない。ＳＣＴ後の非選択リンパ球集団のドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）は、ゆっくりと成長する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の除去のために良好に作用するが、部分的には、悪性細胞の成長が免疫細胞の拡張能力を凌ぐという事実によって、急性白血病の根絶において効果がより低い。この同じ拡張差はまた、急速に進行する充実性腫瘍の芳しくない免疫除去に対しても影響を与える。ＤＬＩにおける非選択リンパ球集団の使用における第二の不利な条件は、受容者の正常細胞および組織を攻撃する能力を有するＴ細胞もまた転移されることがあり、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、すなわち高い罹患率および致死率を有する疾患に導くということである。
【０００３】
最近の研究は、規定されたペプチド特異性を有する選択されたＴ細胞の養子転移が、特に患者が非骨髄機能廃絶方式で予め治療されているならば、自家設定における全身腫瘍組織量の大きな低減に導き得ることを実証している（Ｄｕｄｌｅｙら、２００２年、２００３年）。このことは、腫瘍患者においてＳＣＴを実施する必要性を取り除き、これによってＧＶＨＤの問題も回避する。効果的な免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の自家混合物を受けた、予め治療された黒色腫患者に見られた。ＣＤ４およびＣＤ８の両方が陽性のＴ細胞を含有する細胞のこれらの混合物は、特定のＭＨＣ−腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）リガンドについて特異的な多数の単一ＣＤ８Ｔ細胞クローンの養子転移よりも、臨床的にはより効果的に見える。この差に寄与する一つの因子は、ＣＤ４Ｔ細胞に長命ＣＤ８Ｔ細胞を維持させるための必要条件である。さらには、単一リガンドに対して向けられた免疫応答は、対応リガンドの発現を喪失した腫瘍細胞変異体の選択に導くことがあり、これによって免疫検出を免れることがある。一方で、Ｔ細胞の複合混合物の転移は、これらが腫瘍浸潤リンパ球の中に存在するので、ＣＤ４およびＣＤ８細胞に多重特異性を与えることによってこれらの問題を克服し得るが、これらはまた、ＴＩＬの混合物が、正常組織によって発現されたリガンドを認識するＴ細胞を含有するならば自己免疫に導き得る。このことは、例えばメラニン細胞中にも発現される黒色腫分化抗原を認識する細胞を用いた養子細胞療法（ＡＣＴ）後に、黒色腫患者における白斑に導く正常メラニン細胞の攻撃によって実証される（Ｄｕｄｌｅｙら、２００２年）。
【０００４】
より急速に成長する腫瘍を有する患者の治療のためにＡＣＴを用いる能力を拡大するために、正常組織の重大な攻撃を避けつつ、腫瘍細胞を効果的に攻撃するためのこれらのリガンド特異性のために選択された強化ペプチド−特異的エフェクターＴ細胞（ＣＤ４Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の両方）を転移することが一つの目標である。これらの細胞は、生体外で急速に多数になるまで拡張させられ、ついでＡＣＴのために用いられることになる。あるいはまた、このようなリガンド−特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、受容者末梢血リンパ球か、または十分に成長し、正常な宿主組織を攻撃する能力を有していない、規定された特異性を有する活性化されたＴ細胞クローンのどちらかを用いてクローンすることができ、活性化されたリンパ球中にＴＣＲ−トランスジーンとして発現させることができる。
【０００５】
例として、受容者によって発現されないＭＨＣ分子について特異的な拡張アロ特異的Ｔ細胞クローン、またはウイルス、例えばサイトメガロウイルスまたはエプスタイン−バーウイルスについて特異的な拡張Ｔ細胞クローンは、トランスジェニックＴＣＲへの受容体細胞として用いられることができるであろう。異なるＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識するトランスジェニックＴＣＲベクターのパネルの利用可能性は、ＣＤ４およびＣＤ８亜類型の両方の多数の予め活性化されたＴ細胞を開発するために利用することができ、これによって多数のエフェクターリンパ球が迅速に調製され、対応ＴＣＲリガンドを発現する腫瘍を有する患者へ転移させることを可能にするであろう。このことは、腫瘍成長を制御するために必要とされる特異的Ｔ細胞の数の達成において時間を節約し、おそらくは、急速に進行する腫瘍のより効果的な腫瘍根絶に導くであろう。
【０００６】
特異的Ｔ細胞が白血病およびリンパ腫、ならびに充実性腫瘍細胞に関して認識する決定因子は、自己−ＭＨＣ分子によって提示される過剰発現タンパク質に由来する自己−ペプチドを代表することが多いことから、これらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の親和性は低い。それは、高い親和性受容体を担っているＴ細胞が、胸腺中のこれらの発達の間にリンパ球へ適用される負の選択プロセスを通して取り除かれているからである。これらのＴ細胞が、胸腺中のこれらの発達の間に自己−ＭＨＣ分子に対して負の選択をされなかったリンパ球集団から生成されるならば、より効果的な腫瘍細胞認識が発生する。
【０００７】
したがって、腫瘍細胞上のこれらのリガンドを認識する能力を有する高い機能的結合活性を有するＴＣＲを担っているＴ細胞を迅速に生成する手段を発見する重要なニーズが存在する。このようなＴ細胞は、潜在的なＡＣＴ受容者へのＭＨＣ−ミスマッチを有する同種異系個人のレパートリー中に存在する。
【０００８】
Ｓｔａｕｓｓおよび共同研究者の研究（Ｇａｏら、１９９９年、２０００年）は、転写因子ＷＴ−１に由来し、かつ同種異系ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するために選択された細胞傷害性エフェクター細胞が高親和性ＴＣＲを有し、正常な幹細胞に損傷を与えずにＷＴ−１陽性白血病を効果的に取り除きうることを証明している。部分的ミスマッチのＳＣＴの設定において、このようなＴ細胞への耐性を確立することができ、これらの特異的養子転移を可能にする。Ｓｔａｕｓｓは、刺激細胞源として、ＷＴ−１ペプチドでパルスされたＴ２細胞株を用いて、このようなアロ制限ＣＤ８Ｔ細胞を得るという問題を解決した。Ｔ２細胞は、内因性ペプチドをこれらのＭＨＣクラスＩ分子中に負荷するこれらの能力を損なう遺伝子欠失を有し、染色体６における欠失によって、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する能力が限定されている。ペプチドがＴ２細胞へ外因的に供給される時、これらは中空ＨＬＡ−Ａ２分子へ結合し、細胞表面において安定な複合体を形成し得る。これらのペプチド−パルスされた細胞は、次いでＨＬＡ−Ａ２陰性個人からの末梢血リンパ球を刺激するために用いられることができる。このような初回抗原刺激条件下、いくつかの異なる活性化リンパ球集団が試験管内に現われる。ＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴ細胞が活性化され、これの一フラクションは、ＷＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２リガンドについて特異的である。これらの探索されたＴ細胞は、ペプチドに関わりなくＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴ細胞から分離されなければならない。残念ながら、Ｔ２細胞の、ＭＨＣクラスＩ分子の正常補体の発現の不成功、ならびに非ＭＨＣ−制限細胞を活性化するその固有の能力は、ＮＫおよびＮＫ様Ｔ細胞の平行活性化に導く（Ｆａｌｋら、２００２年）。これらの集団は多くの場合、これらの培養物を支配し、これらの細胞を取り除くため、および所望のアロ反応性細胞のためのＴ細胞集団を強化するために、冗漫な研究を必要とする。このことは、特異的Ｔ細胞の生成プロセスを遅延させ、したがって重大な臨床的制限を引起こす。さらには、これらの抗原からのペプチドは、前もって知られていなければならないが、それは、これらが外部からＴ２細胞上にパルスされなければならないからであり、その理由は、抗原提示細胞が、この細胞中に発現されたタンパク質からペプチドを生成することを可能にし、かつＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子中でこれらの表面上にこれらを提示する抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）遺伝子をＴ２細胞が欠いているからである。さらには、Ｔ２のみが、内因性ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子を発現する。
【０００９】
米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書は、患者の治療方法であって、細胞の表面上のＨＬＡクラスＩ（または同等）分子によって提示された時に、抗原分子の少なくとも一部を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の治療的有効量を患者に投与する工程を含み、これらの細胞傷害性Ｔリンパ球が患者に由来しない方法を開示している。この出願は、ＣＴＬのドナーから見て同種異系であるか、または異種でさえある刺激細胞の使用について記載している。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書はさらに、好ましくは選択された分子（ペプチド）の負荷が不可能である刺激細胞、および特にＴＡＰ欠乏刺激細胞の使用も開示している。
【００１０】
米国特許第６，８０５，８６１号明細書は、選択された分子に対して反応性がある細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン集団の作製方法であって、（ａ）健康な個人に由来する（すなわち患者に由来しない）ＣＴＬを含有するサンプルを、ＨＬＡクラスＩ（または同等）分子をその表面上に発現し、かつ選択された（抗原）分子の少なくとも一部を促進剤細胞の表面上に提示する促進剤細胞とともに共培養する工程、および（ｂ）前記分子の少なくとも一部が、細胞の表面上のＨＬＡクラスＩ（または同等）分子によって提示される時に前記選択された分子に対して反応性のＣＴＬクローンを選択する工程を含む方法について記載している。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書について言及された考察が、ここでもまた適用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、病原性作用物質、例えば腫瘍細胞上にそのＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識する能力を有する高い機能結合活性を有するＴＣＲを担っているＴ細胞を生成させることが、本発明の基礎となる一つの問題である。養子細胞転移において用いることができる抗原特異的Ｔ細胞の迅速かつ効果的な生成方法を提供することが、本発明の基礎となるさらなる問題である。さらには、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のリスクをともなわずに、病気を患っている患者の治療のために用いることができるＴ細胞ベースの製薬組成物を提供することが、本発明の基礎となる一つの問題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞を得るための代替戦略を開発した。試験管内転写ＲＮＡの転移を通して（Ｎａｉｒら、１９９８年）、樹状細胞（ＤＣ）中に、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し得る他の細胞中にタンパク質を発現させるための周知技術が用いられた。しかしながら、先行技術において通常であるように、抗原源をエンコードするＲＮＡのみを発現する代わりに、本発明者らは、特異的標的分子、例えばモデルＴＡＡとしてチロシナーゼをエンコードするＲＮＡ、および同種異系ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２をエンコードするＲＮＡを、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＤＣまたは他の細胞中にコトランスフェクションした。
【００１３】
これらのトランスフェクションされたＤＣは、次いでＰＢＬ、例えば自家ＰＢＬを初回抗原刺激するために用いられることができる。ＨＬＡ−Ａ２抗原リガンドは、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＤＣドナーのＰＢＬについてのアロ決定因子を表し、従って高親和性ＴＣＲを担っているＴ細胞を得ることができる。ＤＣが自己−ＭＨＣ分子の完全補体を発現するので、リンパ球の非ＭＨＣ−制限集団の出現は、陰性ＭＨＣ調節を通して抑制される。いくつかの様々な戦略を、抗原に由来する特異的ペプチドとは独立してＨＬＡ−Ａ２を認識するＴ細胞からペプチド−特異的／ＨＬＡ−Ａ２アロ制限Ｔ細胞を強化するために用いることができる。これは、サイトカイン捕獲、テトラマー選択、またはその後に拡張される個々のＴ細胞のクローニングによる戦略を包含する。
【００１４】
本研究方法は、（Ｓｔａｕｓｓおよび共同研究者によって記載されているように）アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞を得るために、Ｔ２系またはショウジョウバエ細胞に勝るいくつかの利点を提供する。
【００１５】
第一に、あらゆるクローンされたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ対立遺伝子のために試験管内転写されたＲＮＡを利用することができるので、多様なＭＨＣ分子についてのアロ制限を有するＴ細胞を開発することができる。従って、このようなＡＰＣは、それぞれ転移された同種異系ＭＨＣクラスＩＩまたは同種異系ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を通して、所望の抗原の提示を介してアロ制限ペプチド−特異的ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方を生成するために用いられることができる。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書に記載された研究方法は、ＣＤ８Ｔ細胞の生成に適しているだけであることが注目される。
【００１６】
第二に、選択されたＴＡＡの公知ペプチドのみに対する初回抗原刺激に制限されているわけではないが、それは、全抗原が、ＤＣ中のプロセシングおよび提示のために利用可能だからである。抗原は、タンパク質の形態で、またはＡＰＣ中の対応タンパク質を発現するためのテンプレートとしてその後用いられる核酸の形態のどちらかで提供されてもよい。ここでもまた、先行技術の研究方法との差が著しい：米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書において、ペプチドが刺激細胞上に負荷される（これらは、プロフェッショナルＡＰＣではない）が、それは、刺激細胞が抗原を処理および提示することができないからである。このようにして、公知ペプチドのみを、この研究方法において用いることができ、本発明における場合のように、未知の構造の抗原は用いられることができない。
【００１７】
第三に、高い機能的結合活性を有するこれらの選択されたＴ細胞のＴＣＲ配列は、それぞれのＴＣＲリガンドを担っている腫瘍に対して高い機能的結合活性を有するＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を生成させるために自家ＰＢＭＣ中の発現用に用いられることができる。ＡＣＴは、試験管内でかなりの時間にわたって単離および拡張されなければならない特異的リンパ球の養子転移の代替方法として、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を用いて実施することができる。このことは、ＳＣＴを受けない患者の治療、ならびにトランスジェニックＴＣＲによって見られる対応ＭＨＣ−ペプチドリガンドを発現する他の非血液悪性腫瘍を有する患者における適用を可能にするであろう。
【００１８】
特に本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法であって、健康なドナーに由来し、かつ同じ健康なドナーに由来するＰＢＬに自家性のＡＰＣが用いられる方法を提供する。しかしながら、前記ＡＰＣ中にトランスフェクションされたＭＨＣ分子は、患者由来である。この文脈における患者由来とは、これをエンコードする配列が、患者から直接得られるか、あるいはまた別の源、例えば、治療されることになる患者のＭＨＣ対立遺伝子と同一であるｃＤＮＡもしくはゲノムクローンに由来することを意味する。さらには、本発明は初めて、所望の抗原特異的Ｔ細胞を得るために、一般にこれらのＡＰＣ中にＭＨＣ分子および抗原をコトランスフェクションさせるための研究方法を利用する。
【００１９】
本発明のトランスフェクションされたＡＰＣは、ＡＰＣから見て自家性であるＰＢＬを初回抗原刺激するために用いられることができる。転移されたＭＨＣ−抗原リガンドは、ＡＰＣ中に転移された前記ＭＨＣ分子に対応するＭＨＣ遺伝子を保有しないＡＰＣドナーのＰＢＬについてのアロ決定因子を表わす。従って、高親和性ＴＣＲを担っているＴ細胞を得ることができる。ＡＰＣは、自己−ＭＨＣ分子の完全補体を発現するので、リンパ球の非ＭＨＣ制限集団の出現は、陰性ＭＨＣ調節を通して抑制される。この発明におけるＡＰＣの使用、特にＤＣの使用は特に重要であるが、その理由は、これらの細胞が、これらのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子においてペプチドを効率的に処理し、提示し得るからである。これに加えて、ＡＰＣは、追加の共刺激性分子の発現を特徴とし、これらの分子によって、これらはＴリンパ球上に追加受容体をシグナルすることが可能になり、これは、Ｔ細胞の最適な活性化、拡張、および生存に導く。さらには、ＡＰＣ、特にＤＣは、初回抗原刺激されたリンパ球の機能に影響を与える多様なサイトカインおよびケモカインを分泌する能力を有する。ＡＰＣによって作製された因子に応じて、応答リンパ球は、これらの亜類型、ホーミング能力、および機能的能力に関して修飾され得る。例として、ＤＣによって示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドとこれらのＴＣＲとの相互作用によって、所望の抗原特異性を有するが、ＡＰＣとして用いられた特定のＤＣによって分泌されたサイトカイン／ケモカインに基づく所望の機能も有するＴ細胞を活性化するために、成熟ＤＣを用いることができる。様々な型のサイトカイン／ケモカインを分泌するＤＣを試験管内で生成することができ、Ｔ細胞の所望の型を刺激するために用いることができる。このようにして、これらに多量のサイトカインＩＬ−１２を分泌するようにさせる成熟カクテルでの培養において生成された成熟ＤＣは、抗腫瘍免疫において特に重要なＴヘルパーＩ型のＣＤ４Ｔ細胞を活性化させる良好な能力を有する（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉら、２００５年）。これに対して、ＩＬ−１０を分泌する未成熟ＤＣは、他のリンパ球の活性を抑制し得る調節Ｔ細胞の活性化において特に強力であるように見える（ＬｅｖｉｎｇｓおよびＲｏｎｃａｒｏｌａ、２００５年）。このような調節Ｔ細胞は、これによって、自己免疫疾患、例えば１型糖尿病を患っている患者における自己攻撃性Ｔ細胞の制御において、またはあまりに圧倒的になり、例えばハンセン病のいくつかの形態におけるような免疫病を引起こす病原体への免疫応答の制御において臨床的メリットを有することができる。
【００２０】
ＤＣは、この細胞中の様々な区画において発現された抗原を処理し、提示する能力を有するので、所望の抗原特異性を有するＴ細胞を生成させるために、正確な抗原ペプチドを知る必要はない。例えばＤＣに、完全なタンパク質抗原、またはこのようなタンパク質をエンコードするＲＮＡが備えられる時、これらは、全く同一なタンパク質とは異なるいくつかのペプチドを処理し、これらをＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子中に提示することができる。これらの様々なＭＨＣ−ペプチドリガンドは、今度はＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の様々な集団を初回抗原刺激することができる。同種異系ＭＨＣクラスＩおよび同種異系ＭＨＣクラスＩＩ分子を同時に発現させるためにＤＣを修飾することができない理由はないが、それは、これらが抗原を発現させるために修飾され、これによって同じ培養物中において、ＣＤ４およびＣＤ８アロ制限Ｔ細胞の両方の初回抗原刺激を可能にするからである。活性化されたＣＤ４Ｔ細胞とＤＣとの相互作用は、今度は、これらがＣＤ８Ｔ細胞を最適に活性化することを可能にするシグナルをこれらに与えることができる（Ｔｏｅｓら、１９９８年）。ＤＣはさらに、いくつかの様々な抗原を同時に発現させるために修飾されることができる。実際、ＤＣは、何百ものＲＮＡ種を包含する、腫瘍細胞のＲＮＡ内容物全体を発現するためにトランスフェクションされることができる。ＤＣは、多重ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩリガンドをこれらの表面上で同時に処理され、提示されることができ、多くの様々なＴ細胞型の活性化に導く（ＧｉｌｂｏａおよびＶｉｅｗｉｇ、２００４年；Ｇｅｉｇｅｒら、２００５年；Ｓｃｈａｆｔら、２００５年）。抗原についてのＲＮＡまたはタンパク質の混合物と同時に、同種異系ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を共発現することによって、アロ制限ＭＨＣ−ペプチドリガンドを作成するためにこの同じ特性を獲得することができない理由はない。
【００２１】
本発明は、以下の実験結果によって裏付けられる。
１）第一に、本発明者らは、同種異系ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２をエンコードするＲＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーの細胞中に転移された時に、ＨＬＡ−Ａ２分子が、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体での染色後、フローサイトメトリーを用いて検出されるように、細胞表面に発現されることを実証した。さらには、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ａ２アロ特異的Ｔ細胞クローン（ＪＢ４細胞）を活性化して、サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌することができ、これらの機能的能力を実証している。転移および発現は、ＤＣならびに他の細胞、例えばＫ５６２細胞において達成されることができる。
【００２２】
２）同様に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば黒色腫についてのＴＡＡの一例としてチロシナーゼをエンコードするＲＮＡが転移された時、細胞の内部でタンパク質発現を検出することができるが、それは、これが非膜タンパク質であるからである。このタンパク質発現は、フローサイトメトリー、およびチロシナーゼ−特異的抗体を用いた細胞内染色、および検出のための二次蛍光標識抗体を用いて実証されることができる。転移および発現は、ＤＣおよび他の細胞、例えばＫ５６２において達成されることができる。
【００２３】
３）ＲＮＡの両方の種（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ）を同じ細胞中に転移する時、受容者細胞におけるタンパク質の両方の型の同時発現を検出することができる。これは、ＤＣおよび他の細胞、例えばＫ５６２細胞において達成されることができる。
【００２４】
４）ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２、およびＴＡＡ、例えばチロシナーゼを共発現するＡＰＣを、ＭＨＣ−ペプチド複合体を生成し、対応リガンドについてのＴＣＲを担っているＴ細胞と相互作用することができるような方法でこれらをその表面上に示す。このことは、このような共発現ＡＰＣが、サイトカイン放出によって測定されるような特異性を有するＴ細胞クローンを活性化することができるという事実によって実証される。このことは、ＤＣまたは他の細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞クローンのためのＡＰＣとしてＫ５６２を用いて実証された（Ｔｙｒ−Ｆ８細胞）。
【００２５】
特に本発明は、次の態様および実施形態を目的とする。
第一の態様によれば、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸および抗原、または前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定されているような両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程、
を含む方法を提供する。
【００２６】
これらのＡＰＣは、好ましくは、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、単球、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、抗原提示能力を有する血液悪性腫瘍、および／またはＥＢＶ−形質転換リンパ芽球様細胞株から選択される。
【００２７】
樹状細胞（ＤＣ）が特に好ましい。成熟樹状細胞（ＤＣ）は、非常に多様な共刺激性分子とともに、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方を高いレベルで発現する。これらは、以前に抗原に遭遇しなかったナイーブＴ細胞に初回抗原刺激する完全な能力をこれらに与える。これらはまた、これらのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子中の細胞内タンパク質からの抗原をこれらが処理および提示すること可能にする、すべての必要な遺伝子／タンパク質も有する。このようにしてこれらは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答の両方の誘発のための刺激細胞として用いるのに最適な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。自家ＤＣ中のＴＡＡをエンコードするＲＮＡの発現は、高い親和性を有する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞が、同じ健康なドナーの末梢血リンパ球を用いて試験管内で初回抗原刺激されることを可能にした（Ｌｉａｏら、２００４年）。ＤＣは、自己−エンコードされたＭＨＣクラスＩ分子の正常補体を発現するので、これらは、Ｔ２細胞または他の種の細胞、例えばショウジョウバエの細胞に対して、ＮＫおよびＮＫ様Ｔ細胞の活性の負の調節を行なうことができる。
【００２８】
一つの実施形態によれば、ＭＨＣ分子および抗原は、抗原と、ＭＨＣ分子をエンコードする核酸との混合物として用いられる。代替実施形態として、同種異系ＭＨＣ分子をエンコードする核酸および抗原が、ビシストロンＲＮＡとして準備される。
【００２９】
特異的Ｔ細胞がこれに対して生成させられるべきである抗原は、好ましくは、ウイルス、細菌、原生動物、および寄生虫に由来する病原性作用物質、ならびに腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞関連抗原、自己抗原、またはこれらの機能部分から選択される。
【００３０】
これらのウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルス、はしかおよび呼吸器合胞体ウイルス、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、または乳頭腫ウイルスからなる群から選択される。原生動物は、熱帯マラリア原虫であってもよく、細菌は、結核を引起こすマイコバクテリアであってもよい。
【００３１】
腫瘍関連抗原は、好ましくは、血液悪性腫瘍もしくは充実性腫瘍、より好ましくは結腸癌、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肺癌、肉腫、または黒色腫細胞から選択される。
【００３２】
選択工程ｄ）は、好ましくは、Ｔ細胞のサイトカイン放出の測定、またはＴ細胞活性化の他の測定値によって実施される。例えば活性化Ｔ細胞は、個々の細胞としてクローンされることができ、拡張後、これらのＴ細胞クローンは、これらのＭＨＣ−ペプチド特異性について分析されることができ、所望の特異性を有するものが、さらなる使用のために選択され得る（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、１９７９年、１９９７年）。あるいはまた、様々な形態の可溶性ＭＨＣ−ペプチドリガンド、例えばテトラマーは、蛍光ラベルでマークされることができ、活性化Ｔ細胞でインキュベーションされることができる。テトラマーと相互作用するＴＣＲを担っているこれらのＴ細胞は、次いでフローサイトメトリーによって検出されることができ、これらの蛍光に基づいてソートされることができる（Ｙｅｅら、１９９９年）。Ｔ細胞はさらに、これらが反応すべき腫瘍細胞で短時間刺激することができ、これらのインターフェロンガンマ分泌を、捕獲試薬によって、例えば公開されているように（Ｂｅｃｋｅｒら、２００１年）検出することができる。
【００３３】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法はさらに、ｄ）生体外で選択されたＴ細胞の拡張工程も含む。このことは、選択されたＴ細胞を、これらの当初初回抗原刺激のために用いられたのと同じ方法で生成されたＡＰＣとともに共培養し、新しいＡＰＣをＴ細胞培養物へ７〜１０日毎に添加し、拡張しているＴ細胞の型に応じて、補足サイトカインを含有する新鮮な培地を規則的にこれらの細胞に供給することによって実施されることができ、これは、（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、１９９７年；Ｒｅｇｎら、２００１年；Ｓｕら、２００１年、２００２年）に記載されているように、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、および／または中でも特にＩＬ−１５を包含する。
【００３４】
さらに、本発明の方法はさらに、単離Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローン工程、および／またはＰＢＭＣ中にＴＣＲトランスジーンを発現する工程も含む。これは、確立された方法、例えばＥｎｇｅｌｓら、２００５年に記載された方法に従って行われることができる。
【００３５】
これが特異的ＭＨＣクラスへ制限されないことが、本研究方法の一つの大きい利点である。このようにしてＭＨＣ分子は、これらが患者のＭＨＣ型に対応する限り、ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、もしくはＨＬＡ−Ｅ、またはＭＨＣクラスＩＩ、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲから選択されてもよい。
【００３６】
第二の態様によれば、本発明は、上記の方法によって得ることができる、抗原特異的Ｔ細胞を提供する。
前記Ｔ細胞は好ましくは、エフェクター細胞特徴を有するＴ細胞、より好ましくはサイトカイン生産Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、または調節Ｔ細胞、好ましくはＣＤ4＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３７】
第三の態様において、本発明は、上に説明されたような方法によって得ることができる、トランスジェニックＴＣＲについてコードする核酸を目的とする。
追加の態様は、トランスジェニックＴＣＲについてコードする核酸を含んでいるベクターを目的とする。このベクターは好ましくは、本発明による核酸、および１またはそれ以上の調節核酸配列を含有する発現ベクターである。好ましくはこのベクターは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターである。
【００３８】
本発明はさらに、上に規定されているようなベクターで形質転換されたＰＢＭＣも含んでいる。
さらなる態様において、本発明は、上に説明されているようなＴ細胞もしくはＰＢＭＣ、および製薬的に許容可能な担体を含んでいる製薬組成物を提供する。
【００３９】
本発明のこれらの活性成分は好ましくは、疾病が治療されるか、または少なくとも軽減されうるような製薬組成物において、許容可能な担体もしくは担体材料と混合された用量で用いられる。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）充填材料、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を包含する。これらは、公知の最新技術である。
【００４０】
「製薬的に許容可能な」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない、非毒性材料を規定する。担体の選択は用途に依存している。
製薬組成物は、活性成分の活性を強化するか、または治療を補足する追加成分を含有することができる。このような追加成分および／または因子は、相乗効果を得るため、または副作用もしくは望まれない作用を最小限にするためにこの製薬組成物の一部であってもよい。
【００４１】
本発明の活性成分の配合または調製および適用／薬物適用の技術は、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、ペンシルベニア州イーストンのマック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）の最新版に公開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば筋肉内、皮下、骨髄内注射、ならびに鞘内、直接心室内、静脈内、結節内、腹膜内、または腫瘍内注射である。静脈内注射が、患者の好ましい治療である。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、この製薬組成物は、注入または注射またはワクチンである。
さらなる態様によれば、本発明は、養子細胞療法のため、および特に血液悪性腫瘍もしくは充実性腫瘍および急性もしくは慢性感染の治療のための薬剤の製造について上で説明されているような抗原特異的Ｔ細胞もしくはＰＢＭＣの使用を目的とする（同様に上記参照）。
【００４３】
本発明は、以下において実施例および図面によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】樹状細胞の成熟、および悪性細胞に対する従来の免疫応答における特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を示している。
【図２】ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞によるナイーブ腫瘍特異的Ｔ細胞のデノボ初回抗原刺激を例証している。
【図３】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図４】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図５】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図６】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図７】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図８】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図９】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図１０】ＲＮＡ−発現ＤＣによるＴｙｒＦ８細胞の再刺激に対するＲＮＡ濃度の影響を示している。
【図１１】ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞でのナイーブＴ細胞のデノボ初回抗原刺激プロトコルを例証する。
【図１２】ＲＮＡ−トランスフェクションされた樹状細胞上のＭＨＣ−ペプチドリガンドの発現を示している。
【図１３】ＨＬＡ−Ａ２−陽性およびＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーからの初回抗原刺激されたＴ細胞のテトラマー染色を描いている。
【図１４】特異性およびＴ細胞受容体結合活性についてのテトラマー−ソートされたバルクＴ細胞培養物の評価を示している。
【図１５】特異性、Ｔ細胞受容体結合活性、および機能についてのＴ細胞クローンの評価を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実験および図面の説明
図１．樹状細胞の未成熟および成熟段階
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原に遭遇したことがないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）を活性化するこれらの能力のために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうち最も「プロフェッショナル」であると考えられる。これは、ＤＣについて既に発見されているいくつかの因子に応じており、同様に依然として同定されるべき特徴に依存することがある。ＤＣの様々な形態が存在し、これらの独特の特徴は、継続的に調査中である。臨床研究のために最も普通に用いられているＤＣの型は、ＣＤ１４−陽性血液単球から区別することができる骨髄ＤＣである。サイトカイン、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下におけるこのような単球の試験管内培養を通して、その周囲から（異種抗原を含む）材料を取り上げるその高い能力を特徴とする未成熟骨髄ＤＣが生成される。未成熟ＤＣが、この段階の間に適切なシグナルを受け取る時、これは活性化されて、リンパ管を通って二次リンパ節へ移動する。この移動の間、およびリンパ節に達した時、これはさらなる変化を受け、これが完全成熟段階に導く。成熟段階において、ＤＣは、高いレベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現し、これらによってこれは、細胞内タンパク質に由来するペプチドの形態における抗原を、それぞれＣＤ８−陽性およびＣＤ−４陽性Ｔ細胞へ提示することが可能にされる。ＭＨＣ分子の両方の型によって提示され、ＤＣの表面上に示された抗原は、抗原プロセシングおよび提示の様々な工程を含む、複雑な細胞プロセスにおいてＤＣ中に生成される。ＭＨＣクラスＩ分子中のＤＣ細胞表面において提示されたペプチド（すなわち抗原−断片）の場合、ＡＰＣが抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）遺伝子、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２によってエンコードされた分子を発現する必要がある。
【００４６】
ＤＣ表面に示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドは、Ｔリンパ球（すなわちＴ細胞受容体）上に存在する抗原特異的受容体と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞へ第一シグナル（すなわちシグナル１）をもたらす。このシグナルは、各Ｔ細胞について独自のＴＣＲを通してもたらされるので、これは、適合ＴＣＲを有するＴ細胞を選択することによって、結果として生じる応答の抗原特異性を決定する。成熟ＤＣはまた、いくつか挙げればＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６を包含する非常に多様な共刺激性分子も発現し、これらは、Ｔリンパ球によって発現された追加受容体と相互作用し、これらのさらなる活性化（すなわちシグナル２）を引起こす。ＤＣはさらに、サイトカインおよびケモカインを包含する多様な可溶性分子を分泌する能力を有する。これらは様々な亜型のリンパ球をこれらの近隣へ引き付けることができ、シグナル１およびシグナル２を受け取るＴ細胞の分化に対して影響を与えうる。リンパ球によって発現されたさらなる組の受容体への結合後に、これらの因子は、これらの分化および最終的機能に影響を与えうるリンパ球へさらに別のシグナルをもたらすことができる。これは時にはシグナル３と呼ばれる。
【００４７】
試験管内で未成熟および成熟ＤＣを生成することが可能である。例えば単球を、様々な手順によって（細胞選択用の商業キットを用いたＣＤ１４−陽性細胞の正の選択、プラスチック商品へのこれらの接着特性によって、または細胞溶出法を用いて、これらのサイズおよび密度によって）得ることができる。これらの単球は、次いでＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに培養されて、未成熟ＤＣの集団を生じる。試薬の様々な組み合わせが、ＤＣの成熟を誘発するため、および平行して可溶性メディエーターのこれらの分泌を改変するために用いられることができる。未成熟／成熟ＤＣのこれら様々な形態が、今度はＤＣによって示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドとこれらのＴＣＲとの相互作用によって所望の抗原特異性を有するのみならず、ＤＣによって分泌されたサイトカインに基づいた所望の機能も有するＴ細胞を活性化するために用いられることができる。このようにして、生成されて多量のサイトカインＩＬ−１２を分泌する成熟ＤＣは、抗腫瘍免疫において特に重要なＴヘルパー１型のＣＤ４Ｔ細胞を活性化する良好な能力を有する。
【００４８】
適切に活性化され、選択されるならば、Ｔ細胞は、腫瘍細胞、または様々な病原体に感染した細胞を認識して破壊する能力を有する。腫瘍細胞の場合、ＡＰＣによって処理され、提示された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は多くの場合、腫瘍細胞において過剰発現された自己−タンパク質である分子を表わす。自己分子に由来するＭＨＣ−ペプチドリガンドと相互作用するＴＣＲを担っている大部分のＴ細胞は、「負の選択」として公知の方法で胸腺において取り除かれるので、このようなＴＡＡ−リガンドを発現する腫瘍細胞を認識するのに十分な結合活性をともなうＴＣＲを有するＴ細胞は、レパートリー中にほとんど存在しない。
【００４９】
図２．ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞での、ナイーブ腫瘍特異的Ｔ細胞のデノボ初回抗原刺激
腫瘍細胞または他の細胞、例えば病原体で感染された細胞上でＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識するより良好な能力を有するＴ細胞を得るために、同種異系ＭＨＣ分子を介して、選択された１または複数の抗原に由来するペプチドを提示することによって、健康な個人からのＴ細胞の非選択レパートリーを選ぶ（ｔａｐ）ことができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２でない健康なドナーＡからのＴ細胞は、胸腺においてＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体へ暴露されたことはなく、したがって、高い結合活性を有するＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体と相互作用することができるＴＣＲを発現するこのような個人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のうちで利用可能なＴ細胞が存在する。このような所望のＴＣＲを担っているナイーブＴ細胞を刺激するために、前記ドナーＡのＤＣは単球から生成され、次いで修飾されて、同種異系ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子を発現する。ここで、ＨＬＡ−Ａ２についての一例が与えられる。この分子は、ＨＬＡ−Ａ２でないドナーＡのＴ細胞についての同種異系ＭＨＣ分子である。ＨＬＡ−Ａ２エンコードＲＮＡをドナーＡのＤＣ中に導入することによって、ＨＬＡ−Ａ２分子をその細胞表面において発現するＤＣの集団を作製することが可能である。これによって、ＤＣは依然として、ドナーＡの染色体ＭＨＣ遺伝子によってエンコードされた自己−ＭＨＣ分子のその正常な組を発現するが、これに加えてそれは、導入されたＲＮＡから翻訳された同種異系ＭＨＣ分子を発現する。同時にＤＣは、ペプチドがＤＣによって処理され、細胞表面において同種異系ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示され得るタンパク質抗原をエンコードするＲＮＡが供給されることができる。このような同種異系ＭＨＣ−ペプチドリガンドをその細胞表面において発現するＤＣが、ナイーブＴ細胞を刺激するためにＡＰＣとして用いられる時、これらは、所望の同種異系ＭＨＣ−ペプチドリガンドと相互作用するＴＣＲを有するＴ細胞を活性化することができる。同種異系ＭＨＣ分子を認識するすべてのＴ細胞が、所望のペプチド特異性を有するわけではないであろう。したがって所望のＴＣＲを有するこれらの細胞は、活性化されたＴ細胞の全部の集団から選択されなければならない。この選択を得るための、免疫学者に周知のいくつかの手順がある。例えば活性化されたＴ細胞は、個々の細胞としてクローンすることができ、拡張後にこれらのＴ細胞クローンは、これらのＭＨＣ−ペプチド特異性について分析することができ、所望の特異性を有するものが、さらなる使用のために選択されることができる。あるいはまた、様々な形態の可溶性ＭＨＣ−ペプチドリガンド、例えばテトラマーは、蛍光ラベルでマークすることができ、活性化されたＴ細胞でインキュベーションされることができる。これらのテトラマーと相互作用するＴＣＲを担っているこれらのＴ細胞は、次いでフローサイトメトリーによって検出されることができ、これらの蛍光に基づいてソートされることができる。
【００５０】
所望のＴＣＲ特異性で選択されたＴ細胞は、次いで対応ＨＬＡ−Ａ２−ペプチドリガンドを発現する腫瘍または感染細胞を有する患者の養子細胞療法（ＡＣＴ）における使用のために試験管内で拡張されてもよい。あるいはまた、ＴＣＲ配列を単離し、このようなＴ細胞について決定することができ、リンパ球または他の細胞中に導入して、ＡＣＴのために用いることができるトランスジェニックＴＣＲ細胞を生成することができるＴＣＲ構成体を生成するために用いることができる。
【００５１】
図３．Ｋ５６２細胞中への試験管内転写ＲＮＡの導入
この戦略の実行可能性を実証するための第一実験方法として、本発明者らは、ＲＮＡ転移後の同種異系ＨＬＡ−Ａ２ＭＨＣ分子の発現のために、受容者細胞株としてＫ５６２細胞株を用いた。この細胞株はエリスロミエロイド白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ
ｌｅｕｋａｅｍｉａ）に由来し、細胞免疫学者には周知である。これは腫瘍系であるので、多数になるまで成長させることができ、実験的な取扱いが容易である。これはさらに、その細胞表面上にＭＨＣクラスＩ分子をまったく発現させず、従って、同種異系ＭＨＣ分子の発現は、ＭＨＣクラスＩ分子をエンコードする核酸の導入後、Ｋ５６２の細胞表面において容易に検出することができる。
【００５２】
この図面に要約された実験において、ＨＬＡ−Ａ２−エンコードｃＤＮＡからの試験管内転写によって生成されたＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡが、エレクトロポレーションを介してＫ５６２細胞中に導入された。一時的にＲＮＡトランスフェクションされた細胞は、Ｋ５６２−Ａ２細胞と呼ばれる、ＨＬＡ−Ａ２をエンコードする遺伝子で安定的にトランスフェクションされたＫ５６２細胞の一系列と比較された。
【００５３】
ＨＬＡ−Ａ２分子の表面発現は、ＨＬＡ−Ａ２分子について特異的なモノクローナル抗体でのこれらの細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって決定され、データは、陽性細胞のパーセンテージとして示されている（左側の図面）。模擬対照として、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡの代わりに水を収容しているキュベットにおいてエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションに続くすべての時点で、模擬対照において陽性細胞はまったく検出されなかった。ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡの３つの異なる量が、同数のＫ５６２細胞のエレクトロポレーションのために用いられた。ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の最高パーセンテージが、２４マイクログラムの量のＲＮＡを用いて検出され、細胞の最高パーセンテージは、エレクトロポレーションの１１時間後に見られた。ＲＮＡのエレクトロポレーション後のＨＬＡ−Ａ２分子を発現する陽性細胞のパーセンテージは、１１時間および２４時間の時点で、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を安定的に発現する正の対照Ｋ５６２−Ａ２細胞のパーセンテージに匹敵した。ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡの導入後のＨＬＡ−Ａ２の一時的発現は、４８時間の時点での陽性細胞のパーセンテージの減少、および１２０時間の時点での無検出によって実証される。
【００５４】
アロ抗原としてＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴＣＲを担っているＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ−発現細胞によって活性化されうるかどうかを決定するために、ＪＢ４と呼ばれるＴ細胞クローンが研究された。このＴ細胞クローンは、そのＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２−ペプチドリガンドと相互作用する時に、サイトカインインターフェロン−ガンマを分泌する。この認識のために必要とされる正確なペプチドは公知でないが、Ｋ５６２細胞、およびＤＣ、および本発明者らがテストした大部分の他の細胞中に発現され、このようにして、これは、遍在性タンパク質に由来するように見える。ＪＢ４細胞がＫ５６２模擬トランスフェクション細胞とともに共培養された時、ＩＦＮ−ガンマ放出は検出されない（右側の図面）。Ｋ５６２−Ａ２細胞の正の制御では強い放出が見られる。様々な量のＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡでトランスフェクションされたすべてのＫ５６２細胞は、正の対照よりも低いレベルにおいてではあるが、ＪＢ４細胞によってサイトカインの分泌を誘発することができた。それにもかかわらず、これらはサイトカイン放出の実質的なレベルである。ＪＢ４細胞の添加を有しなかったＫ５６２またはＤＣの培養において、サイトカイン放出は測定されず、刺激細胞がインターフェロン−ガンマをそれ自体分泌しないことを実証した。刺激細胞をともなわないＪＢ４細胞の最終対照は、サイトカイン放出を全く示さず、Ｔ細胞が、インターフェロン−ガンマを分泌するのに適切なＭＨＣ−ペプチドリガンドによって活性化されなければならないことを実証した。
【００５５】
これらの研究は、一時的なＲＮＡ発現を介したＫ５６２細胞中への同種異系ＭＨＣ分子の導入が、ＨＬＡ−Ａ２分子の細胞表面発現へ導き、これらの細胞が、ＨＬＡ−Ａ２アロ抗原特異的Ｔ細胞クローンを活性化することができることを証明した。
【００５６】
図４．ＤＣ中への試験管内転写ＲＮＡの導入
ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後にＤＣ上のＨＬＡ−Ａ２分子の表面発現を評価するため、およびＪＢ４細胞からのサイトカイン分泌を刺激するこれらの能力を評価するために、同様な実験方法が、図３に記載されているように用いられた。ここで、２４マイクログラムの量のＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡが全体を通して用いられたが、ｍＲＮＡの３つの異なる源が比較された。これらは、ＲＮＡ発現をＤＣ内部で安定させる意図で、ヒトアルファ−グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲがＨＬＡ−Ａ２遺伝子構成体へ添加されている試験管内転写ＲＮＡの商業源を含んでいた。このＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からの商業的手順およびキットを用いて生成されたポリアデニル化ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ対キュアヴァック（ＣｕｒｅＶａｃ）からの商業的手順およびキットを用いて生成された同様なＲＮＡと比較された。アンビオン手順を用いて生成され、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから培養されたＤＣ中にエレクトロポレーションによって導入されたポリアデニル化ｍＲＮＡが、最良の結果を示した。このｍＲＮＡの場合にＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の最高パーセンテージが見られ、ＤＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２分子の出現は、より早く（６時間の時点で）検出され、ＤＣ中の発現は、このｍＲＮＡ源を用いて、なおも１２０時間の時点で見られた。従って、すべてのさらなる実験は、このｍＲＮＡ源を利用した。
【００５７】
ＤＣは、図３に記載されているように、ＪＢ４細胞からのサイトカイン分泌を刺激するこれらの能力について研究された。模擬対照ＤＣ（最も左の棒）は、サイトカイン放出のバックグラウンドレベルのみを誘発した。より高いレベルは、ｍＲＮＡの３つの異なる源を発現するＤＣを用いて見られたが、アンビオンｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたこれらのＤＣが優れていた。ＪＢ４細胞を含有しないＤＣ培養物は、インターフェロン−ガンマを有しておらず、これがＨＬＡ−Ａ２−ＲＮＡ発現ＤＣでの刺激後にＪＢ４細胞によって放出されるだけであることを実証した。
【００５８】
図５．腫瘍関連抗原チロシナーゼをエンコードする試験管内転写ＲＮＡのＫ５６２−Ａ２細胞中への導入
ＲＮＡは、アンビオン手順を用い、抗原チロシナーゼに対して特異的に生成された。これはＫ５６２−Ａ２細胞中にエレクトロポレーションされ、ＨＬＡ−Ａ２の表面発現が、ＨＬＡ−Ａ２分子に特異的なモノクローナル抗体を用いて測定された。緑の曲線はイソタイプ対照抗体での染色を表わし、青色の曲線はＨＬＡ−Ａ２−特異的抗体での染色を表わす。ここで、ＨＬＡ−Ａ２表面発現がすべての時点で見られたが、それは、Ｋ５６２−Ａ２細胞が、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を構成的に発現するからである。ＨＬＡ−Ａ２の発現の減少は、１２時間の時点で注目され、これは、エレクトロポレーションの結果としてのストレス誘発された衝撃と関連付けることができる。これらの細胞は、その後ＨＬＡ−Ａ２分子の高い発現を回復した。チロシナーゼのタンパク質発現は、チロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を用いて、タンパク質の細胞内検出後に測定された。オレンジ色の曲線は模擬対照の染色を表わし、青色の曲線は、これらの細胞内部のチロシナーゼタンパク質を表わす。染色におけるわずかなシフトを、いくつかの時点で見ることができ、タンパク質が、チロシナーゼＲＮＡの導入後に作製されつつあることを示している。
【００５９】
図６．Ｋ５６２−Ａ２細胞におけるチロシナーゼの発現および機能
チロシナーゼＲＮＡが、Ｋ５６２−Ａ２細胞中にエレクトロポレーションされ、陽性細胞のパーセンテージ、ならびに平均蛍光強度（ＭＦＩ）と呼ばれる染色強度が様々な時点で決定された（左上部分）。赤い棒はＫ５６２−Ａ２細胞上の構成的ＨＬＡ−Ａ２発現を示しており、ここでもまた、１１〜２４時間のレベルにおける低下およびその後の回復をともなう。青い棒は、６時間の時点でピークがあるチロシナーゼタンパク質の細胞内染色を示している。６時間の時点での染色のシフトは、右下部分に図解され、ここでは模擬対照染色がオレンジ色の曲線によって示され、チロシナーゼ染色は青色の曲線によって示されている。模擬対照と比較した、経時的な発現の倍数増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）は左下部分に示され、１１時間の時点で最大を生じる。ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されたチロシナーゼ由来ペプチドが分かるＴ細胞クローンＴｙｒ−Ｆ８のインターフェロン−ガンマ分泌が右上部分に示されている。Ｋ５６２−Ａ２細胞は、Ｔｙｒ−Ｆ８Ｔ細胞によるインターフェロン−ガンマ選択を誘発しないが、これらは、チロシナーゼＲＮＡでのエレクトロポレーション後に可能である。これらのＴ細胞は単独でサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼからの合成ペプチドが負荷されたＫ５６２−Ａ２細胞によって、またはチロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２を共発現する黒色腫細胞（ＭＥＬ−ＩＬ２細胞）によって刺激されることができる。
【００６０】
このことは、Ｋ５６２−Ａ２細胞中へのチロシナーゼについてのＲＮＡの導入によって、これらがＴｙｒ−Ｆ８細胞のＴＣＲによって見られる適切なＭＨＣ−ペプチドリガンドを処理および提示することを可能にし、これらのＴ細胞を活性化して、インターフェロン−ガンマを分泌させることを実証する。エレクトロポレーションの１２時間後および２４時間後に用いられたＲＮＡトランスフェクションされた細胞は、匹敵し得る刺激性能力を有していた。
【００６１】
図７．試験管内転写チロシナーゼＲＮＡの、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから生成されたＤＣ中への導入
同様な一組の実験が、図６に記載されている実験のように行なわれたが、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＤＣがＫ５６２−Ａ２細胞の代わりに用いられた。細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、ＲＮＡのエレクトロポレーション後の様々な時点でＤＣ中に検出された（上の図）。模擬対照全体における最高の平均倍数発現が、ＤＣ中で３時間の時点で見られた。ＤＣ単独ではＴｙｒＦ８細胞によるサイトカイン分泌を刺激することはできなかったが、これらは、チロシナーゼＲＮＡでのエレクトロポレーション後では可能であった。エレクトロポレーションの１２時間後または２４時間後に用いられたＤＣは、Ｔｙｒ−Ｆ８Ｔ細胞を活性化して、インターフェロン−ガンマを分泌させる能力を有していた。
【００６２】
図８．Ｋ５６２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼの共発現
ＨＬＡ分子をまったく発現しないＫ５６２細胞が、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼについてのＲＮＡでエレクトロポレーションされた。ＲＮＡの各種が個々に導入されるか、または両方が組み合わされて導入された。右上図は、異なる時点におけるＨＬＡ−Ａ２単独（最も左側の一組の棒）、チロシナーゼ単独のタンパク質発現、次いでＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡの両方でエレクトロポレーションされた細胞におけるＨＬＡ−Ａ２染色、およびＲＮＡの両方の種を受け取っている細胞におけるチロシナーゼ染色を要約している。ＲＮＡの両方の種でエレクトロポレーションされた細胞中の両方のタンパク質の最適発現が、２４時間の時点で見られた。両方のＲＮＡを共発現するＫ５６２細胞は、エレクトロポレーションの１２時間後および２４時間後にＴｙｒＦ８細胞からのインターフェロン−ガンマ分泌を刺激することができた。
【００６３】
図９．ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから作製されたＤＣにおけるＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼの共発現
ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣにおけるＨＬＡ−Ａ２タンパク質およびチロシナーゼタンパク質の共発現が、図８に記載されているように分析された。両方のタンパク質の共発現が、様々な時点においてＤＣ中に見られた。ＨＬＡ−Ａ２発現のレベルは、チロシナーゼＲＮＡの存在下に低下されるように思われた。それにもかかわらず、両方のＲＮＡを共発現するＤＣは、ＴｙｒＦ８細胞によるインターフェロン−ガンマの有意レベルを、Ｔ細胞単独のもの、またはＲＮＡの単独種でエレクトロポレーションされたＤＣでのインキュベーション後のもの以上に刺激することができた。
【００６４】
図１０．ＲＮＡ発現ＤＣによるＴｙｒＦ８細胞の再刺激へのＲＮＡ濃度の影響
ＤＣがＴｙｒＦ８細胞からのサイトカイン分泌を刺激する能力が、様々な量のＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡでトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣを用いて分析された。模擬対照ＤＣ（最も左側の棒）が、サイトカイン放出のバックグラウンドレベルのみを誘発した。Ｔ細胞単独ではサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２を共発現する黒色腫細胞（ＭＥＬ−ＩＬ２細胞）によっても刺激されることができる。
【００６５】
様々な量の両方のＲＮＡでトランスフェクションされたすべてのＤＣは、ＴｙｒＦ８細胞によるインターフェロン−ガンマの分泌を誘発することができたが、一方で、２４μｇＨＬＡ−Ａ２および２４μｇチロシナーゼＲＮＡ、または４８μｇＲＮＡ ＨＬＡ−Ａ２および２４μｇチロシナーゼＲＮＡでエレクトロポレーションされたこれらのＤＣの方が優れており、Ｔ細胞の再刺激のためにはより少ないＲＮＡがより良好であろうことを示している。
【００６６】
図１１．ＲＮＡパルスされた樹状細胞でのナイーブＴ細胞のデノボ初回抗原刺激プロトコル
ＲＮＡ負荷されたＤＣがナイーブＴ細胞を初回抗原刺激して腫瘍特異的リンパ球になる能力を分析するために、３相初回抗原刺激プロトコルが開発された。初回抗原刺激の開始に先立つ８日前（−８日目）、単球が、記載されているようにＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーおよびＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからプラスチック接着によって調製された。これらの精製された単球集団が未成熟ＤＣを調製するために用いられ、これらは、次いで記載されているように成熟させられた。Ｔ細胞初回抗原刺激プロトコルの最初の日（０日目）に、ＤＣは、記載されているようにエレクトロポレーションを介してＲＮＡが負荷された。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来するＤＣに、モデル腫瘍抗原として２４μｇのチロシナーゼＲＮＡが負荷された。これらのＤＣにおけるＲＮＡから翻訳されたチロシナーゼタンパク質は、ＤＣ表面において自己−エンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子と関連してペプチドとして処理され、提示されるべきである。ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＤＣは、ＨＬＡ−Ａ２（４８μｇ）およびチロシナーゼ（２４μｇ）をエンコードするＲＮＡが負荷された。ここで、転移ＲＮＡによってエンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子は、同種異系ＭＨＣ分子を表わす。チロシナーゼタンパク質に由来するペプチドは、ＤＣへ転移されたＨＬＡ−Ａ２エンコードＲＮＡから翻訳されたＨＬＡ−Ａ２分子によって処理および提示されるべきである。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、アロ制限−ペプチドリガンドを表す。初回抗原刺激プロトコルの０日目に、各ドナーからの自家ＣＤ８＋Ｔリンパ球が、商業的キットおよび製造業者の指示（ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（ヒト）、ドイツ国ベルギッシュ・グラードバッハのミルテニ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ））を用いて負の選択を介して＞８０％純度まで単離された。これらの手のつけられていない自家ＣＤ８＋Ｔ細胞が、エレクトロポレーションの９時間後に、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するエイム（Ａｉｍ）Ｖ培地（ドイツ国カールスルーエのギブコ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ））中に１０：１の比で、成熟ＲＮＡ−パルスされたＤＣへ添加された。ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）が２日後に、ついでその後３日目毎に添加された。第一回刺激の７日後（７日目）、初回抗原刺激培養物の第二回刺激が、第一回刺激についてと同じ方法で調製されたＲＮＡ−パルスされたＤＣを用い、初回抗原刺激の０日目に用いられたのと同じ培養条件を用いて実施された。さらに７日後（１４日目）、ＨＬＡ−Ａ２制限チロシナーゼ特異的Ｔ細胞が、フィコエリトリン（ＰＥ）−標識されたＨＬＡ−Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７ペプチド／ヒトβ２ｍテトラマー（Ｗoｌｆｌら、２００４年；ドイツ国ミュンヘン、技術大学の医学微生物学、免疫学、および衛生研究所、（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｎｉｃｈ）のＰｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって提供された）の助けを借りてソートされた。正の選択をされたＴ細胞のいくつかは、９６ウエルＶ底プレート（スイス国トラサディンゲン（Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ）のＴＰＰ）において、１細胞／ウエルで培養された。これらのウエルに、３日毎に５０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２（ドイツ国マールブルクのヒロン・ベーリンク（Ｃｈｉｒｏｎ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ））を含有するエイムＶ培地、および７日毎に５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７（ドイツ国ハイデルベルクのプロモキネ（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ））および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５（米国ニュージャージー州のペプロ・テック社（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．））が供給された。選択されたクローン、および残りのテトラマー選択された非クローンＴ細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５で上記のようにエイムＶ培地中の培養に維持され、支持細胞が供給された。これらの細胞は、５０Ｇｙが照射された５ドナーのプールに由来する末梢血単核細胞からなっていた。これらのＴ細胞は、２週間毎に抗−ＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍＬ；ドイツ国ミュンヘンの分子免疫学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＧＳＦ）のＤｒ．Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｋｒｅｍｍｅｒから提供された）で非特異的に刺激された。
【００６７】
図１２．ＲＮＡ−トランスフェクションされた樹状細胞上のＭＨＣ−ペプチドリガンドの発現
Ｔ細胞初回抗原刺激のために用いられたＤＣが、予想されたＭＨＣ−ペプチドリガンドを発現することを実証するために、細胞表面におけるＨＬＡ−Ａ２分子および細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、既に記載されているフローサイトメトリーを用いて決定された。ＨＬＡ−Ａ２分子およびチロシナーゼタンパク質の共発現は、両方のドナーに由来するＤＣにおいて高レベルで検出された。細胞内チロシナーゼタンパク質のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＨＬＡ−Ａ２陰性の両方のドナーから調製されたＤＣにおいて匹敵しうるものであった。大部分の細胞上のＨＬＡ−Ａ２表面発現のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから調製されたＤＣにおいて、より高かった。この場合、これらは内因性遺伝子によってエンコードされている。一方、トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２分子のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣ上で、より変わりやすい。
【００６８】
独立実験における同じプロトコルに従って調製された細胞を用いた、このようなＤＣがＴ細胞を刺激する能力は、これらが保有するペプチド（すなわちＨＬＡ−Ａ２＋ｘｙｚペプチド）には関わりなくＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＨＬＡ−Ａ２−アロ応答性Ｔ細胞クローンを用いて決定された。ＤＣの両方の集団は、以前に記載されているような標準的ＥＬＩＳＡにおいて測定されたように、このＴ細胞クローン（ＪＢ４）を刺激してインターフェロン−ガンマを分泌させることができた。ＤＣをともなわずにインキュベーションされたＴ細胞からのサイトカイン放出は、まったく見られなかった。チロシナーゼ由来ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２分子からなるリガンドの存在が、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドについて特異的なＴ細胞クローン（Ｔｙｒ−Ｆ８）によるインターフェロン−ガンマ放出を測定することによって評価された。ＤＣをともなわずにインキュベーションされたＴ細胞は、サイトカインのバックグラウンドレベルのみを放出した。この実験において、ＨＬＡ−Ａ２−陽性ＤＣは、４８μｇのチロシナーゼが供給され、一方、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ＤＣは、２４μｇのチロシナーゼが供給された。
【００６９】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーに由来するＤＣ中へのＲＮＡ転移によって供給されたトランスジェニックＨＬＡ−Ａ２分子が、特異的ＨＬＡ−Ａ２抗体で細胞表面において染色することができ、ＨＬＡ−アロ特異的Ｔ細胞クローン（ＪＢ４）によって認識することができることを実証した。チロシナーゼＲＮＡの転移は、両方のＤＣ集団における細胞内タンパク質発現に導いた。ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡの共転移は、内因的にエンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子を発現するＤＣ中へのチロシナーゼＲＮＡの転移のように、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ特異的Ｔ細胞クローン（ＴｙｒＦ８）が活性化されることを可能にした。
【００７０】
図１３．ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからの初回抗原刺激されたＴ細胞のテトラマー染色
初回抗原刺激されたＴ細胞培養物の中に存在するＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドリガンドについて特異的なＴ細胞受容体を担っているＴ細胞を選択するために、これらのＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７／Ｈβ２ｍテトラマーで染色
され、フローサイトメトリーによって分析された。テトラマー結合を示した２つの異なる初回抗原刺激培養物の各々からの細胞がゲートされ（黒い四角、□）、ＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ショーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ（Ｄａｋｏ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ））において単離された。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーのＣＤ８+テトラマー+Ｔ細胞集団は、低い強度においてのみテトラマー結合を示したが、一方で、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからのＣＤ８+テトラマー+細胞は、より高い強度において染色された。これらのソートされたテトラマー+Ｔ細胞は、単一細胞として培養され、残りの細胞は、非クローンバルク培養物として培養中に保持された。
【００７１】
これらの結果は、初回抗原刺激プロトコルが、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ特異的テトラマーを結合することができるＴＣＲを保有するＴ細胞を生じたことを実証した。より多くのＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーに由来するＤＣを用いて初回抗原刺激された培養物においてより高い強度でテトラマーを結合させ、ＨＬＡ−Ａ２同種異系ペプチドリガンドによるより良い刺激を示している。
【００７２】
図１４．特異性およびＴ細胞受容体結合活性についての、テトラマーソートされたバルクＴ細胞培養物の評価
バルク培養物として保持された、ソートされた細胞は、８日後テトラマー染色について再分析された。予想されたように、ソートされた細胞の大部分は、初回抗原刺激培養物の両方に由来する、ソートされたバルク培養物中のＣＤ８+であった。テトラマー+Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＤＣを用いて初回抗原刺激された培養物中に約８％の頻度で存在した。これらの細胞は、テトラマー結合の中間的強度（ＭＦＩ＝１２７．４９）を有したが、一方で、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからのバルク培養Ｔ細胞の８０％が、はるかに高い強度（ＭＦＩ＝３２４８．７７）を有するテトラマーを結合させた。テトラマー結合の強度は、特定のＭＨＣ−ペプチドリガンドについてのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合活性を評価するために用いられる１つのパラメーターである（Ｙｅｅら、１９９９年）。テトラマー結合のより高い強度は、このリガンドとＴＣＲとのより良い相互作用を示している。ＴＣＲ結合活性の第二パラメーターは、テトラマーオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）である（Ｐａｌｅｒｍｏら、２００５年）。Ｔ細胞は、テトラマーでインキュベーションされ、次いで洗浄され、テトラマーの不存在下、およびＨＬＡ−Ａ２分子について特異的な抗体の存在下にインキュベーションされる。この抗体の存在は、これらのＴ細胞の表面から落ちたテトラマーが、細胞表面へ再結合するのを防ぐ。これらのＴ細胞上のテトラマー染色の強度は、洗浄後の様々な時点：０時間、１時間、２時間の時点で決定される。テトラマー染色が急速に失われるならば、このことは、ＴＣＲが、テトラマーのＭＨＣ−ペプチドリガンドに対して低い結合活性しか有していないことを示している。テトラマー結合が経時的により安定であるならば、このことは、ＭＨＣ−ペプチドリガンドに対してのより高いＴＣＲ結合活性を示す。これら２つのバルク培養物の比較において、もとのテトラマー−結合細胞（１．７％対８．３％）の２０％のみが、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来する細胞において２時間後に依然としてテトラマー＋であることが発見された。これに対して、これらの細胞の７５％が、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＴ細胞において２時間後に依然としてテトラマー＋であった（６０．５％対８０．６％）。
【００７３】
テトラマー結合の特異性が、サイトメガロウイルスに由来するペプチドを提示するＨＬＡ−Ｂ７分子からなるテトラマー（Ｐｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって提供されたＢ７−ＣＭＶテトラマー）を用いて決定された。バルクＴ細胞培養物はどちらも、低レベルの染色（０．３〜０．４％）しか示さなかった。
【００７４】
これに加えて、ＨＬＡ−Ａ２−ＣＭＶペプチドテトラマーも用いられた。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＴ細胞の０．４％のみが、このテトラマーを結合させたが、一方で、第二ドナーからのバルクＴ細胞の１２．７％が陽性であった。これらのＴ細胞は、これらが提示するペプチドとは関わりなく、アロ抗原としてＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴＣＲを有するＴ細胞を表わす可能性がある。テトラマー結合の強度は、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−テトラマー結合の強度（ＭＦＩ＝３２４８．７７）と比較して低かった（ＭＦＩ＝１６６．９８）。
【００７５】
これらの結果は、テトラマー染色の強度として規定されるようなより高い結合活性およびより遅いテトラマーオフレートを有するＴＣＲを担っているＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＤＣを用いて、これらの培養物に由来することを実証しており、同種異系−ペプチドリガンドを用いて、非負選択されたＴ細胞レパートリーにおいて応答を誘発する優位性を実証している。
【００７６】
図１５．特異性、Ｔ細胞受容体結合活性、および機能についてのＴ細胞クローンの評価
単一細胞培養実験から、２つのクローンがさらなる特徴決定のために選択された。１つのクローン（ＰＳ Ｐ４Ｄ１１）がＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来し、１つのクローン（ＳＷ Ｐ１２Ｂ１０）がＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来した。
【００７７】
ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＰＳ Ｐ４Ｄ１１クローンは、１時間および２時間の時点で測定された時の急速なテトラマー放出をともなって、テトラマー染色の中間的強度（ＭＦＩ＝１６６．９８）を示した。このＴ細胞クローンは、特異的ペプチドが負荷されたＴ２細胞（コネチカット州ニューヘブン、イエール大学のＰｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌによって提供されたＴ２細胞）でのインキュベーション後も、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する腫瘍細胞（Ｍｅｌ ６２４．３８およびＭｅｌ ＩＬ−２）での刺激後も、インターフェロン−ガンマを分泌するよう刺激することはできなかった。しかしながらこれは、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋黒色腫腫瘍細胞を殺すことはできるが、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−腫瘍細胞を殺すことはできず、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼリガンドについてのその特異性を実証した。
【００７８】
ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＳＷ Ｐ１２Ｂ１０クローンは、テトラマー結合のより高い強度（ＭＦＩ＝１００９．０４）を示し、テトラマー結合の安定性は、２時間後にテトラマー対して依然として陽性である細胞のすべての場合により高かった。このクローンは、チロシナーゼ由来ペプチドが負荷されたＴ２細胞での刺激後に特異的インターフェロン−ガンマ放出を示したが、ペプチドをともなわないＴ２細胞に対しては可能ではなく、ペプチド特異性を実証した。これはまた、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋黒色腫腫瘍細胞での刺激後インターフェロン−ガンマを放出するように刺激することもできたが、ＨＬＡ−Ａ２陰性、チロシナーゼ陽性黒色腫細胞（ＳＫ Ｍｅｌ ２８）に対して、またはＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陰性黒色腫腫瘍細胞（Ｍｅｌ Ａ３７５）に対しては可能ではなかった。このパターンは、このクローンがＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドに特異的であることを実証した。このクローンはまた、ＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陽性黒色腫腫瘍細胞を殺すこともできたが、ＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陰性腫瘍細胞を殺すことができなかった。
【００７９】
これらの結果は、これら２つの異なる初回抗原刺激培養物に由来するＴ細胞クローンが、テトラマー結合の強度およびテトラマーオフレートによって検出された場合、ＴＣＲ結合活性に関して差を示し、アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞クローンが、この定義によってより高い結合活性のＴＣＲを有することを示している。さらにはこのＴ細胞クローンが機能的優位性を示したが、それは、これが黒色腫細胞を特異的に殺すことができるだけでなく、ペプチド刺激後、および腫瘍細胞での刺激後、ＨＬＡ−Ａ２、チロシナーゼ特異的にインターフェロン−ガンマを分泌するように活性化することもできたからである。
【００８０】
材料および方法
接着性腫瘍細胞株、Ｍｅｌ Ａ３７５、Ｍｅｌ ＩＬ−２、Ｍｅｌ ６２４．３８、およびＳＫ Ｍｅｌ ２８
これらのヒト黒色腫細胞株が、１２％ウシ胎児血清、１×非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭナトリウムピルベートが補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコ中の培地の容積は、１０ｍＬであった。ほぼ３〜４日毎に、細胞は密集成長した。個々の細胞株の成長率に応じて、これらは１：２〜１：１０に分けられた。培地が除去され、細胞はＰＢＳで一回洗浄され、ついで２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ２×で３分間、室温でインキュベーションされた。脱離細胞が、新鮮なＲＰＭＩ １６４０培地＋補足物中に再縣濁された。
【００８１】
Ｔ細胞クローン、ＪＢ４、およびＴｙｒ−Ｆ８
Ｔ細胞クローンがまず、標準的再刺激培養物中で拡張された。大きい保存材料（ｓｔｏｃｋ）がアリコートされて冷凍された。実験に必要とされる度に、Ｔ細胞は保存材料から取られて解凍され、２４−ウエルプレートのウエル中に入れられ、標準化されたプロトコルにしたがって再刺激された。
【００８２】
縣濁腫瘍細胞株、Ｔ２、Ｋ５６２、およびＫ５６２−Ａ２細胞
Ｔ２、Ｋ５６２、およびＫ５６２−Ａ２が、１２％ＦＢＳ、１×ＭＥＭ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭナトリウムピルベートが補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコにおいてこの培地の容積は１０ｍＬであった。ほぼ４日毎に、この細胞縣濁液の３／４が除去され、同じ容積の新鮮な培地が添加された。Ｋ５６２−Ａ２細胞について、この培地は、１ｍｇ／ｍＬの選択抗生物質Ｇ４１８が補足された。
【００８３】
ＤＣ生成および培養
ドナーからのＰＢＭＣが、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。ＰＢＭＣは、Ｔ７５培養フラスコ１あたり７．５×１０６細胞で１％自家血漿が補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中に再縣濁された。これらのフラスコは３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベーションされた。非接着性細胞が注意深く洗い流された。接着性単球が、１％自家血漿、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、および８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地の１フラスコあたり１０ｍＬ中に培養された。３日間の培養後、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が再び添加された。培養の６日目に、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β、９ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６、９ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α、および１ｍＬあたり２μＭ ＰＧＥ２が、成熟を誘発するために未成熟ＤＣへ添加された。成熟ＤＣが、培養の８日目に収穫された。
【００８４】
フローサイトメトリー
選択された分子の細胞発現を測定するために、フローサイトメトリーが用いられた。これらの分子は、蛍光染料へ付着されたモノクローナル抗体で特異的に染色される。フローサイトメトリー分析は、蛍光−活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ（商標））において実施された。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）において、染色された細胞の縣濁液がノズルを強制的に通され、１つずつ間隔をあけて配置された細胞を含有する液体の細い流れを生じた。各細胞がレーザービームを通過する時、これはレーザー光を散乱させ、この細胞と関連した蛍光分子が励起された。感受性光電倍増管が、細胞のサイズおよび粒度についての情報を与える両方の散乱光、および標識されたモノクローナル抗体の結合、および従って各細胞による標的分子の発現についての情報を与える蛍光発光を検出した。該細胞のソートのために、ＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）が、２５，０００事象（ｅｖｅｎｔｓ）／ｓおよび最大１ｐｓｉで用いられた。
【００８５】
細胞表面分子の直接染色
表面上のＨＬＡ−Ａ２分子の発現を測定するために、ハイブリドーマ上澄み液ＨＢ８２（メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のＡＴＣＣ）、およびＰＥ（フィコエリトリン）と共役された二次ヤギ抗マウス抗体が、細胞表面上の直接染色のために用いられた。約１×１０５ＤＣ、Ｋ５６２、またはＫ５６２−Ａ２細胞が、１回洗浄された。各洗浄工程は、６００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の細胞の再縣濁、３００×ｇで４分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、５０μＬのＨＢ８２がこれらのペレットへ別々に添加された。氷上の３０分のインキュベーション時間後、細胞は１回洗浄された。ついで０．５μＬの二次抗体（１／１００希釈；５０μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．５μＬ抗体）が、これらのペレットへ別々に添加された。氷上および暗室での３０分のインキュベーション時間後、細胞は１回洗浄された。最後に、細胞は２００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
【００８６】
細胞内分子の間接染色
ＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＣの内部のチロシナーゼの発現を測定するために、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞がまず固定された。固定後、これらの細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％および０．２５％サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）を用いて透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓｅ）された。簡単に言えば、約３×１０５細胞が１回洗浄された。各洗浄工程は、５００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中、またはＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％サポニン中の細胞の再縣濁、３００×ｇで４分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液（固定培地）中の５００μＬの１％パラホルムアルデヒドがこれらのペレットへ添加され、静かに混合された。氷上の３０分のインキュベーション時間後、細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液で２回洗浄された。これらの細胞を５００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中に４℃で７日まで保存することが可能であった。これらのペレットは、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中５００μＬの０．１％サポニンで１回洗浄された。その後、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液（透過性化培地）中の５０μＬの０．２５％サポニン、および５μＬのチロシナーゼ特異的一次抗体が、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温で１時間のインキュベーション後、細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％サポニンで1回洗浄され、ついでＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の５０μＬの０．２５％サポニン中一
次抗体（１／１００希釈）について特異的なＣｙ５−共役二次抗体０．５μＬが、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温および暗室での３０分のインキュベーション後、これらの細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の５００μＬの０．１％サポニンで洗浄された。最後に、ペレット化された細胞が、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の２００μＬの０．１％サポニン中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
【００８７】
テトラマー染色およびテトラマーオフレート
ＨＬＡ−Ａ２−制限チロシナーゼ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の結合活性を評価するため、およびＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）でのソートを実施するために、これらのＴ細胞が、ＰＥ−標識Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３
６９−３７７／Ｈβ２ｍテトラマー（Ｐｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって供給された）で染色された。これらの細胞は２回洗浄された。各洗浄工程は、冷ＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の細胞の再縣濁、３００×ｇで５分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。インキュベーション容積は細胞数に依存している。１０６までの細胞が、５０μＬ中２５分、ＰＥ−標識テトラマーで、氷上で暗室においてインキュベーションされた（１／２５希釈、５０μＬＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の２μＬテトラマー）。ＨＬＡ−Ａ２−制限チロシナーゼ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のソートのために、５×１０６細胞までが、１００μＬＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の６μＬ Ａ２／ペプチドテトラマーでインキュベーションされた。次いで、さらに２５分間、１／５０の比においてＣＤ８−ＡＰＣ抗体（米国フランクリンレイクスのＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ））が添加された。染色後、これらの細胞は２回洗浄され、最後にＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドで固定され、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カリフォルニア州マウンテンビューのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって分析されるか、またはＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）においてテトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のソートのためにＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中に希釈された。
【００８８】
テトラマーオフレートアッセイのために、洗浄後、脱離テトラマーの再結合は、飽和量のハイブリドーマ上澄み液ＨＢ８２（メリーランド州ベセスダのＡＴＣＣ）でのインキュベーションによって防がれた。これは、複合ペプチドとは独立してＨＬＡ−Ａ２を結合する。時間間隔を増加した後、サンプルが採取されて固定され、テトラマー染色の強度についてフローサイトメトリーによって分析された。
【００８９】
単一種ｃＲＮＡの生産
ここではｃＲＮＡと呼ばれる、単一種試験管内転写ＲＮＡの生産は、４つの工程を含んでいた。すなわち、ｃＤＮＡ挿入断片を含有するプラスミドの線形化、プロモーター配列および線形化されたプラスミド中のｃＤＮＡテンプレートに基づく試験管内転写、合成ｃＲＮＡのポリアデニル化、およびｃＲＮＡ精製である。実質量のｃＤＮＡテンプレート、すなわちプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が試験管内転写反応に必要とされるので、このプラスミドは、コンピテント細菌中で増幅されなければならなかった。
【００９０】
プラスミドＤＮＡでのコンピテント細菌の形質転換
他の基から親切な贈り物（ｋｉｎｄ ｇｉｆｔ）として受け取られる、より多量のｐＤＮＡを得るために、コンピテント細菌は該ｐＤＮＡで形質転換されて拡張されなければならなかった。一回大量トップ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ）１０Ｆ’コンピテント細胞の５０μＬガラス瓶が、融解しつつある氷上でゆっくりと霜取りされ、小さい容積のｐＤＮＡが添加され、静かに栓を抜く（ｔａｐ）ことによって細菌と混合された。これらの細胞は、氷上で３０分間インキュベーションされ、次いで４２℃で正確に３０秒間加熱され、最後に氷上に載せられて２分間冷却された。コンピテント細胞とともに供給されたリッチなＳＯＣ培地が添加され、形質転換された細菌が、適切な選択抗生物質とともにＬＢ培地寒天プレート上に培養された。プレートが細菌インキュベーター中に３７℃で一晩入れられた。抗生物質ゼオシンが光感受性であり、その活性は高い塩濃度によって阻害されるので、ｐＺｅｏＳＶ２＋／ｈｕＴｙｒで形質転換された細菌用のプレートは低塩ＬＢ寒天培地を含有し、暗室に保存された。
【００９１】
形質転換細菌の選択および拡張
抗生物質への耐性をエンコードする、ｐＤＮＡで形質転換された細菌のみが、寒天培地中の対応抗生物質の存在にもかかわらず、選択プレート上で成長してコロニーを形成することができた。一晩の成長後、コロニーは、滅菌つま楊枝を用いてこれらのプレートから引き出された。各々の個々のコロニーは、１５ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管において、適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＬＢ培地中に接種された。予め選択され、凍結された形質転換細菌が拡張されることになるならば、凍結ガラス瓶が、−８０℃フリーザーから、融解しつつある氷上へ移された。約５μＬの一部解凍された細菌縣濁液が、次いで、適切な抗生物質とともに５ｍＬのＬＢ培地を収容している１５ｍＬファルコン管に移された。これらの管は、一晩（約１２時間）３７℃で激しい振とうをともなって、１５０ｒｐｍで、形質転換された細菌の効率的な成長のためにインキュベーションされた。
【００９２】
形質転換細菌の凍結
細菌は、凍結培地が１５％のグリセリンを含有するならば、凍結プロセスによって害されることが最も少ない。したがって４００μＬの一晩細菌縣濁液が、８４μＬのオートクレーブされた８７％グリセリンへ添加され、渦巻き撹拌され、液体窒素中に急速凍結され、−８０℃へ移された。
【００９３】
形質転換細菌からのプラスミドＤＮＡ抽出
一晩の培養後、細菌縣濁液が、５３００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離された。細菌細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出が、ＱＩＡｗｅｌｌ（登録商標）８ウルトラプラスミドキットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ペレット化された細胞が溶解された。溶解物中の塩およびｐＨ条件が、ＤＮＡのこの膜への独占的結合を保証したが、一方、分解されたＲＮＡおよび細胞タンパク質は保持されなかった。この膜はついで、あらゆる核酸結合タンパク質およびｐＤＮＡからの他の残留汚染物質の除去を可能にする、あらゆるＤＮＡ−タンパク質相互作用を乱す緩衝液で洗浄された。追加の洗浄工程は、塩および他の非−ＤＮＡ成分を除去した。精製ｐＤＮＡは最終的にトリス緩衝液中に溶出された。抽出ｐＤＮＡの収率は、プラスミドに応じて、５ｍＬの一晩細菌培養あたり４〜８μｇであった。
【００９４】
ｃＲＮＡ中への単一種ｃＤＮＡの試験管内転写
各プラスミドが、試験管内転写に適したテンプレートを生産するために、適切な制限酵素で線形化された。すべてのプラスミドが、所望のタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの５’末端においてＴ７プロモーターを含有するので、転写は、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７キットからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて製造業者の指示に従って実施された。ＲＮＡ分子の安定性、およびタンパク質中への翻訳用テンプレートとしてのその効率的な使用は、その５’末端におけるキャップおよび３’末端におけるポリ（Ａ）テイルの存在に依存している。ポリ（Ａ）テイルは常に、細胞によって合成されたｍＲＮＡ分子の一部である。従って、上述された全細胞ｍＲＮＡ増幅手順は、試験管内転写反応においてキャップ類似体の添加のみを含んでいた。しかしながら、プラスミド中のｃＤＮＡを用いて生産された単一種ｃＲＮＡは、テイルが構成体においてエンコードされるか否かに応じて、ポリ（Ａ）テイルを含有してもよいし含有しなくてもよい。試験管内転写反応における５’末端でのキャップ類似体の統合に加えて、チロシナーゼ、ＨＬＡ−Ａ２ ｃＲＮＡは、ポリ（Ａ）テイリングキットを用いて３’末端においてポリアデニル化された。両方の反応は、製造業者によって提案された条件下で実施された。試験管内転写およびｃＲＮＡ精製後、ｃＲＮＡの測定された収率は、１００μＬのポリアデニル化反応混合物あたり６０〜７０μｇであった。
【００９５】
ｃＲＮＡの精製
増幅された全細胞ｃＤＮＡまたはプラスミド中の単一種ｃＤＮＡのどちらかをテンプレートとして用いて、試験管内転写反応において得られたｃＲＮＡの精製は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて、製造業者の指示にしたがって実施された。精製のために、この手順は、試験管内転写反応混合物のＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム上への転移から開始された。ＲＮＡはＤＥＰＣ水中に溶出され、アリコートが−８０℃で保存された。
【００９６】
ＤＣ中へのＲＮＡトランスフェクション
細胞血漿膜は、細胞の分子内容物をその外部環境から分離するという生命維持機能を果たしている。これらの膜は、高度に絶縁性の二層中に自己集合する両親媒性脂質から大部分なっている。可能な限り多くの抗原を捕獲しようとして、未成熟ＤＣは、ＲＮＡを包含する、これらの周囲からの様々な構造（サイズが小さい分子から、アポトーシス体までの範囲のもの）を取り上げることが周知である。これらは、マクロ飲作用およびエンドサイトーシスを通して可能である。ＲＮＡとの単純ＤＣコインキュベーションは、Ｔ細胞初回抗原刺激を達成することが証明されてはいるが、より攻撃的な方法、例えばリポフェクションおよびエレクトロポレーションは、より良好なトランスフェクション方法であることが証明された。
【００９７】
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは、細胞が、強い外部電場の短いパルスへ暴露された時、血漿膜の可逆性透過性を誘発する。親水性細孔の形成は、二層膜中の脂質の再配向の結果である。この現象の分子メカニズムは依然としてよく理解されていない。細孔数およびこれらの直径は、パルス振幅およびパルス持続時間の積とともに増加する。小さい分子が、これらの細孔を通って細胞質中に単純に拡散するが、より大きい分子、例えば核酸は、電気泳動力によって細胞中に駆動される。核酸の存在が細孔形成を促進することも証明されている。細孔は、電場への暴露の１マイクロ秒以内に現われるが、これらが再閉するには数分かかる。
【００９８】
最初に、２〜３×１０６ＤＣまたはＫ５６２細胞が、少なくとも１７０μＬ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地中に再縣濁され、０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベット中に入れられ、氷上で約３分間インキュベーションされた。エレクトロポレーション前の縣濁液の冷却は有利であるが、その理由は、これが細胞代謝を遅くしたからである。これによって電気による過熱が避けられた。さらには電気ショックによって、および死んだ細胞から放出された分子によって引起こされた損傷が最小限にされた。その後、１００μＬ以下のＤＥＰＣ水中に再縣濁されたＲＮＡが添加され、２７０μＬの総エレクトロポレーション縣濁液容積を生じた。この縣濁液は、ピペットによって短時間混合され、ついで急速にエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションは、２５０Ｖおよび１５０μＦで実施された。エレクトロポレーションの直後に、細胞が、２％自家血漿、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、および８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中に移された。これらの細胞が計数され、縣濁液が、ＦＡＣＳ（商標）分析、ＲＮＡ単離、または機能的アッセイのために迅速にアリコートされ、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター中に入れられた。
【００９９】
機能的アッセイ
機能的アッセイにおいて、ＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＣまたはＫ５６２細胞、ペプチド−パルスされたＤＣまたは腫瘍細胞が、促進剤として役立った。抗原特異的ＣＴＬクローンが、エフェクターとして役立った。促進剤の刺激能力を測定するために、ＤＣまたは他の細胞がまず、Ｔ細胞とともにコインキュベーションされ、これらは収穫され、解凍および再刺激の８〜１４日後にコインキュベーション培養において用いられた。活性化されたＴ細胞によって分泌されたＩＦＮ−γの量が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において測定された。
【０１００】
Ｔ細胞とのペプチド−パルスされたＴ２細胞コインキュベーション
Ｔ２細胞のＣＴＬとのコインキュベーションのために、より低い細胞数が利用された。外因性ペプチドパルシングのために、１×１０６Ｔ２細胞が、１０μｇ／ｍＬ ＹＭＤチロシナーゼペプチド（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、ミュンヘンＬＭＵのジーンセンター）および１０μｇ／ｍＬヒトβ２−マイクログロブリン（米国サンディエゴのカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））でインキュベーションされた。２０分毎に細胞縣濁液が振とうされた。３７℃、５％ＣＯ２での２時間のインキュベーション後、細胞縣濁液が、非結合ペプチドを除去するために１回洗浄された。１００μＬのペプチド−パルスされたＴ２縣濁液（１２％ＦＣＳが補足されたＲＰＭＩ １６４０中の１×１０４細胞）が、１００μＬのＣＴＬ縣濁液（１５％ヒト血清が補足されたＣＴＬ培地中の２×１０３細胞）とコインキュベーションされ、５：１の促進剤対エフェクター比を生じた。
【０１０１】
エフェクターおよび促進剤の２４時間のコインキュベーション後、１５０μＬの各上澄み液が収穫され、−２０℃で保存された。上澄み液が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において分析された。
【０１０２】
Ｔ細胞とのＤＣもしくはＫ５６２コインキュベーション
エレクトロポレーションの１２時間もしくは2４時間後、１００μＬのＴ細胞縣濁液（コインキュベーション培地中２×１０４細胞）が、１００μＬのトランスフェクションされた細胞縣濁液（２％自家血漿および８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中の２×１０４または４×１０４細胞）へ添加され、９６ウエルプレートの１ウエルあたり全部で２００μＬ、および１：４、１：２、１：１、２：１、または４：１の促進剤対エフェクター比を生じた。
【０１０３】
非トランスフェクションＤＣが、１０μＬのペプチド溶液（１００μＬ／ｍＬ）を１００μＬのＤＣ縣濁液（２％自家血漿および８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中の４×１０４細胞）へ添加することによって、ペプチドで外因的にパルスされた。３７℃および５％ＣＯ２での２時間のインキュベーション後、１００μＬのＣＴＬ縣濁液（ＣＴＬコインキュベーション培地中の２×１０４細胞）が添加され、２：１の促進剤対エフェクター比を生じた。エフェクターおよび促進剤の２４時間のコインキュベーション後、１５０μＬの各上澄み液が収穫され、−２０℃で保存された。
【０１０４】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＡ
共培養上澄み液中のＩＦＮ−γの測定が、ＥＬＩＳＡにおいてＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＦＮ−γセットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートは、マウス抗−ＩＦＮ−γ捕獲抗体でコーティングされ、次いでＦＢＳ−含有溶液で遮断された。いくつかの事例では、上澄み液は、コインキュベーション培地中において１：２．５で希釈された。同じ培地が、ＩＦＮ−γ標準の連続希釈液を作るために用いられた。細胞培養上澄み液または標準溶液からのＩＦＮ−γが、これらのプレート中の捕獲抗体へ結合された後、ビオチチニル化マウス抗−ＩＦＮ−γ検出抗体が、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼへ共役されたアビジンとともに添加された。捕獲抗体からなる複合体を視覚化するために、ＩＦＮ−γ、検出抗体、ビオチン、アビジン、およびホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼのための基質）が、テトラメチルベンジジン（基質試薬ＡおよびＢミックス）とともに添加され、溶液の色彩を青色に変えた。酵素反応が、１Ｍオルト−リン酸で停止された。これによって、溶液の色彩が黄色に変わり、その強度は、処理された基質の量に正比例した。すなわち捕獲されたＩＦＮ−γの量に間接的に比例した。反応溶液中の光吸収が、４５０ｎｍで測定された。不明なＩＦＮ−γ濃度が、ＩＦＮ−γ標準の公知濃度および対応測定吸光度に基づいて描かれた標準曲線の助けを借りて計算された。
【０１０５】
細胞傷害性アッセイ
それぞれテトラマー＋ＣＤ８＋ソートされたバルク細胞株およびＴ細胞クローンの細胞溶解活性が、標準４時間クロム放出アッセイにおいて分析された。これら２つのＨＬＡ−マッチされた黒色腫細胞株Ｍｅｌ Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２−陽性、チロシナーゼ−陰性）およびＭｅｌ ＩＬ−２（ＨＬＡ−Ａ２−陽性、チロシナーゼ−陽性）が用いられた。簡単に言えば、１０６標的黒色腫細胞が、２００μＣｉ５１Ｃｒで１〜１．５時間標識された。５１Ｃｒ−標識された標的細胞が、Ｖ底９６ウエル組織培養プレート（ドイツ国ゾリンゲンのグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｓｏｌｉｎｇｅｎ））において１００μＬ／ウエルの１２％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ １６４０中でＴ細胞とともに培養された。ＣＴＬ−媒介溶解の有効性を評価するために、Ｔ細胞は連続的に希釈され、ついで段階的エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を生じるために１０３標的細胞／ウエルと共培養された。３７℃で４時間の共培養後、５０μＬの上澄み液が収集され、放射能がガンマカウンターで測定された。特異的溶解のパーセンテージは、１００×（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）として計算された。自然放出は、エフェクター細胞の不存在下に標的細胞をインキュベーションすることによって評価され、一般に１４％未満であった。
【０１０６】
参照
Becker, C, Pohla, H., Frankenberger, B., Assenmacher, M., Schendel, D.J. and Th. Blankenstein. 2001. Adoptive tumor therapy with T lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162.
Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Robbins, P. F., Yang, J. C., Hwu, P., Schwartzentruber, D. J., Topalian, S. L., Sherry, R., Restifo, N. P., Hubicki, A. M., Robinson, M. R., Raffeld, M., Duray, P., Seipp, C. A., Rogers-Freezer, L., Morton, K. E., Mavroukakis, S. A., White, D. E., Rosenberg, S. A. (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonalrepopulation with antitumor lymphocytes. Science 298:850-854.
Dudley, M.E. and Rosenberg, S.A.(2003). Adoptive-cell-transfer therapy for the treatment of patients with cancer. Nature Reviews Cancer 3: 666-675.
Engels, B., Nossner, E., Frankenberger, B., Blankenstein, Th., Schendel, D. J., and W. Uckert. 2005. Redirecting human T lymphocytes towards renal cell carcinoma-specificity by retroviral transfer of T cell receptor genes. Human Gene Then, 16(7). -79.9-810
FaIk, C. S. and Schendel, D. J. (2002). Allogeneic MHC class I ligandsand their role in positive and negative regulation of human cytotoxiceffector cells. Human Immunol. 63:8-19.
Gao, L., Bellantuono, I., Elsasser, A., Marley, S. B., Gordon, M. Y., Goldmann, J. M., Stauss, H. J. (2000). Selective elimination of leukemic CD34+ progenitor cells by cytotoxicT lymphocytes specific for WTl . Blood 95: 2198-2203.
Gao, L., Yang, T. H., Tourdot, S., Sadovnikova, E., Hasserjian, R. and Stauss H. J. (1999). AlIo- major-histocompatibility complex restricted cytotoxic T lymphocytes engraft in bone marrow transplant recipients without causing graft- versus-host disease. Blood 94: 2999-3006.
Geiger, C, Regn, S., Noessner, E., Wilde, S., Frankenberger, B., Papier, B., Pohla, H., and D.J. Schendel. 2005. Development of a generic RNA-pulsed dendriticcell vaccine for renal cell carcinoma, J. Translational Medicine in press.
Gilboa-E and J. Viewig. 2004. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendriticcells. Immunol. Rev. 199:251-63.
KoIb, H. J., Schmid, C, Barrett, A. J. and Schendel, D. J. (2004). Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras. Blood 103:767-776.
KoIb, H.J., Schattenberg, A., Goldman, J.M., Hertenstein, B., Jacobsen, H., ArceseW., Ljungman, P., Ferrant, A., Verdonck, L. Niederwieser, B. et al. 1995. Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusions in marrow grafted patients. Blood 86:2041.
Levings, M.K. and M.G. Roncarolo. 2005. Phenotypic and functional differences between human CD4+CD25+ and type 1 regulatory T cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 293:303-326.
Liao, X., Yongging, L., Bonini, C, Nair, S., Gilboa, E., Greenberg, P. D., Yee, C. (2004). Transfection of RNA encoding tumor antigens following maturation of dendritic cells leads to prolonged presentation of antigen and the generation of high-affinity tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes. MoI. Ther. 9: 757-764.
Nair, S. K., Boczkowski, D., Morse, M., Cumming, R.I., Lyerly, H. K. and Gilboa, E. (1998). Induction of primary carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes in vitro using human dendritic cells transfectedwith RNA. Nat. Biotechnol. 16(4): 364-369.
Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Salllusto, F. and A. Lanzavecchia. 2005. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type-1 polarizing programme in dendritic cells. Nat. Immunol. 6(8): 769-76.
Regn, S., Chen, X., Schendel, D., KoIb, H.-J. and M.A. Roskrow. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T lymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64.
Schaft, N, Dorrie, J., Thuman, P., Beck, V. E., Muller, I., Schultz, E. S., Kampgen, E., Dieckmann, D. and Schuler, G. 2005. Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfectingdefined RNA after rather than before maturation. J. Immunol. 174(5): 3087-97.
Schendel, D. J., Wank, R. and B. Dupont. 1979. Standardization of the human in vitro cell-mediated lympholysis technique. Tissue Antigens 13: 112-120.
Schendel, D. J., Maget, B., FaIk, C. S. and R. Wank. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. In: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) pp 670-690, Academic Press Ltd., London.
Su, Z., Peluso, M. V., Raffegerst, S. H., Schendel, D. J., and M. A. Roskrow. 2001. LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes for the treatment of patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease. Eur. J. Immunol. 31: 947-958.
Su, Z., Peluso, M. V., Raffergerst, S. H., Schendel, D. J. and Roskrow, M. 2002. Antigen presenting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specif[iota]c cytotoxic T lymphocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-62.
Toes, R. E., Schoenberger, S. P., van der Voort, E. I., Offringa, R. and Melief, C. J. 1998. CD40- CD40Ligand interactions and their role in cytotoxic T lymphocyte priming and anti-tumor immunity. Semin. Immunol. 10(6): 443-8.
Yee, C, Savage, P. A., Lee, P. P., Davis, M. M. and P. D. Greenberg. 1999. Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogenouspopulations using peptide-MHC-tetramers. J. Immunol. 162(4): 2227-34.
更なる参照
Belinda Palermo, Silvia Garbelli, StefaniaMantovani, Elisabetta Scoccia, Gian Antonio Da Prada, Paola Bernabei, M. Antonietta Avanzini, Valeria Brazzelli, Giovanni Borroni and Claudia Giachino(2005). Qualitative difference between the cytotoxicT lymphocyte responses to melanocyte antigens in melanoma and vitiligo. Eur. J. Immunol. 35: 3153-3162.
Cassian Yee, Peter A. Savage, Peter P. Lee, Mark M. Davis, and Philip D. Greenberg (1999). Isolation of High Avidity Melanoma-Reactive CTL from Heterogeneous Populations Using Peptide-MHC Tetramers. The Journal of Immunology: 2227-2234.
Matthias Wolfl, Stefan Schalk, Martin Hellmich, Katharina M. Huster, Dirk H. Busch, and Frank Berthold(2004). Quantitation of MHC Tetramer-Positive Cells From Whole Blood: Evaluation of a Single-Platform, Six-Parameter Flow Cytometric Method. Wiley-Liss, Inc. Cytometry Part A 57A: 120-130.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法を目的とする。本発明はさらに、抗原特異的Ｔ細胞、単離トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、これを含有する製薬組成物、および養子細胞療法におけるこれらの使用も目的とする。本発明は特に、非選択同種異系Ｔ細胞レパートリーからペプチド−特異的Ｔ細胞を誘発するための、同種異系ＭＨＣ分子および抗原を共発現する細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種異系幹細胞移植（ＳＣＴ）の設定におけるリンパ球の養子転移は、血液悪性腫瘍を根絶するための免疫系の力を実証している（Ｋｏｌｂら、１９９５年）。ＳＣＴはまた、いくつかの症例において、充実性腫瘍、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）を取り除く作用も果たし得るように見える（Ｋｏｌｂら、２００４年およびＤｕｄｌｅｙおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００３年において概説されている）。ＳＣＴ受容者において、悪性細胞の除去は、特異的Ｔ細胞が生体内で活性化されなければならず、次いで移植受容者における新しい造血系の発達後に適切な数まで拡張されなければならないという事実によって、数ヶ月から１年後にのみ発生し得る。あるいはまた、ＳＣＴ受容者において耐性が確立される一定期間（約６０日）後、非初回抗原刺激、非分離リンパ球の転移が、腫瘍細胞に対して向けられた免疫応答の生成を加速させることができる。ここでもまた、腫瘍細胞を攻撃し得る特異的リンパ球は活性化されなければならず、転移されるリンパ球の非選択集団中に存在する低周波数先駆物質リンパ球から拡張されなければならない。ＳＣＴ後の非選択リンパ球集団のドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）は、ゆっくりと成長する慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の除去のために良好に作用するが、部分的には、悪性細胞の成長が免疫細胞の拡張能力を凌ぐという事実によって、急性白血病の根絶において効果がより低い。この同じ拡張差はまた、急速に進行する充実性腫瘍の芳しくない免疫除去に対しても影響を与える。ＤＬＩにおける非選択リンパ球集団の使用における第二の不利な条件は、受容者の正常細胞および組織を攻撃する能力を有するＴ細胞もまた転移されることがあり、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、すなわち高い罹患率および致死率を有する疾患に導くということである。
【０００３】
最近の研究は、規定されたペプチド特異性を有する選択されたＴ細胞の養子転移が、特に患者が非骨髄機能廃絶方式で予め治療されているならば、自家設定における全身腫瘍組織量の大きな低減に導き得ることを実証している（Ｄｕｄｌｅｙら、２００２年、２００３年）。このことは、腫瘍患者においてＳＣＴを実施する必要性を取り除き、これによってＧＶＨＤの問題も回避する。効果的な免疫応答は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の自家混合物を受けた、予め治療された黒色腫患者に見られた。ＣＤ４およびＣＤ８の両方が陽性のＴ細胞を含有する細胞のこれらの混合物は、特定のＭＨＣ−腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）リガンドについて特異的な多数の単一ＣＤ８Ｔ細胞クローンの養子転移よりも、臨床的にはより効果的に見える。この差に寄与する一つの因子は、ＣＤ４Ｔ細胞に長命ＣＤ８Ｔ細胞を維持させるための必要条件である。さらには、単一リガンドに対して向けられた免疫応答は、対応リガンドの発現を喪失した腫瘍細胞変異体の選択に導くことがあり、これによって免疫検出を免れることがある。一方で、Ｔ細胞の複合混合物の転移は、これらが腫瘍浸潤リンパ球の中に存在するので、ＣＤ４およびＣＤ８細胞に多重特異性を与えることによってこれらの問題を克服し得るが、これらはまた、ＴＩＬの混合物が、正常組織によって発現されたリガンドを認識するＴ細胞を含有するならば自己免疫に導き得る。このことは、例えばメラニン細胞中にも発現される黒色腫分化抗原を認識する細胞を用いた養子細胞療法（ＡＣＴ）後に、黒色腫患者における白斑に導く正常メラニン細胞の攻撃によって実証される（Ｄｕｄｌｅｙら、２００２年）。
【０００４】
より急速に成長する腫瘍を有する患者の治療のためにＡＣＴを用いる能力を拡大するために、正常組織の重大な攻撃を避けつつ、腫瘍細胞を効果的に攻撃するためのこれらのリガンド特異性のために選択された強化ペプチド−特異的エフェクターＴ細胞（ＣＤ４Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の両方）を転移することが一つの目標である。これらの細胞は、生体外で急速に多数になるまで拡張させられ、ついでＡＣＴのために用いられることになる。あるいはまた、このようなリガンド−特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、受容者末梢血リンパ球か、または十分に成長し、正常な宿主組織を攻撃する能力を有していない、規定された特異性を有する活性化されたＴ細胞クローンのどちらかを用いてクローンすることができ、活性化されたリンパ球中にＴＣＲ−トランスジーンとして発現させることができる。
【０００５】
例として、受容者によって発現されないＭＨＣ分子について特異的な拡張アロ特異的Ｔ細胞クローン、またはウイルス、例えばサイトメガロウイルスまたはエプスタイン−バーウイルスについて特異的な拡張Ｔ細胞クローンは、トランスジェニックＴＣＲへの受容体細胞として用いられることができるであろう。異なるＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識するトランスジェニックＴＣＲベクターのパネルの利用可能性は、ＣＤ４およびＣＤ８亜類型の両方の多数の予め活性化されたＴ細胞を開発するために利用することができ、これによって多数のエフェクターリンパ球が迅速に調製され、対応ＴＣＲリガンドを発現する腫瘍を有する患者へ転移させることを可能にするであろう。このことは、腫瘍成長を制御するために必要とされる特異的Ｔ細胞の数の達成において時間を節約し、おそらくは、急速に進行する腫瘍のより効果的な腫瘍根絶に導くであろう。
【０００６】
特異的Ｔ細胞が白血病およびリンパ腫、ならびに充実性腫瘍細胞に関して認識する決定因子は、自己−ＭＨＣ分子によって提示される過剰発現タンパク質に由来する自己−ペプチドを代表することが多いことから、これらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の親和性は低い。それは、高い親和性受容体を担っているＴ細胞が、胸腺中のこれらの発達の間にリンパ球へ適用される負の選択プロセスを通して取り除かれているからである。これらのＴ細胞が、胸腺中のこれらの発達の間に自己−ＭＨＣ分子に対して負の選択をされなかったリンパ球集団から生成されるならば、より効果的な腫瘍細胞認識が発生する。
【０００７】
したがって、腫瘍細胞上のこれらのリガンドを認識する能力を有する高い機能的結合活性を有するＴＣＲを担っているＴ細胞を迅速に生成する手段を発見する重要なニーズが存在する。このようなＴ細胞は、潜在的なＡＣＴ受容者へのＭＨＣ−ミスマッチを有する同種異系個人のレパートリー中に存在する。
【０００８】
Ｓｔａｕｓｓおよび共同研究者の研究（Ｇａｏら、１９９９年、２０００年）は、転写因子ＷＴ−１に由来し、かつ同種異系ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するために選択された細胞傷害性エフェクター細胞が高親和性ＴＣＲを有し、正常な幹細胞に損傷を与えずにＷＴ−１陽性白血病を効果的に取り除きうることを証明している。部分的ミスマッチのＳＣＴの設定において、このようなＴ細胞への耐性を確立することができ、これらの特異的養子転移を可能にする。Ｓｔａｕｓｓは、刺激細胞源として、ＷＴ−１ペプチドでパルスされたＴ２細胞株を用いて、このようなアロ制限ＣＤ８Ｔ細胞を得るという問題を解決した。Ｔ２細胞は、内因性ペプチドをこれらのＭＨＣクラスＩ分子中に負荷するこれらの能力を損なう遺伝子欠失を有し、染色体６における欠失によって、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する能力が限定されている。ペプチドがＴ２細胞へ外因的に供給される時、これらは中空ＨＬＡ−Ａ２分子へ結合し、細胞表面において安定な複合体を形成し得る。これらのペプチド−パルスされた細胞は、次いでＨＬＡ−Ａ２陰性個人からの末梢血リンパ球を刺激するために用いられることができる。このような初回抗原刺激条件下、いくつかの異なる活性化リンパ球集団が試験管内に現われる。ＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴ細胞が活性化され、これの一フラクションは、ＷＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２リガンドについて特異的である。これらの探索されたＴ細胞は、ペプチドに関わりなくＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴ細胞から分離されなければならない。残念ながら、Ｔ２細胞の、ＭＨＣクラスＩ分子の正常補体の発現の不成功、ならびに非ＭＨＣ−制限細胞を活性化するその固有の能力は、ＮＫおよびＮＫ様Ｔ細胞の平行活性化に導く（Ｆａｌｋら、２００２年）。これらの集団は多くの場合、これらの培養物を支配し、これらの細胞を取り除くため、および所望のアロ反応性細胞のためのＴ細胞集団を強化するために、冗漫な研究を必要とする。このことは、特異的Ｔ細胞の生成プロセスを遅延させ、したがって重大な臨床的制限を引起こす。さらには、これらの抗原からのペプチドは、前もって知られていなければならないが、それは、これらが外部からＴ２細胞上にパルスされなければならないからであり、その理由は、抗原提示細胞が、この細胞中に発現されたタンパク質からペプチドを生成することを可能にし、かつＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子中でこれらの表面上にこれらを提示する抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）遺伝子をＴ２細胞が欠いているからである。さらには、Ｔ２のみが、内因性ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子を発現する。
【０００９】
米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書は、患者の治療方法であって、細胞の表面上のＨＬＡクラスＩ（または同等）分子によって提示された時に、抗原分子の少なくとも一部を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の治療的有効量を患者に投与する工程を含み、これらの細胞傷害性Ｔリンパ球が患者に由来しない方法を開示している。この出願は、ＣＴＬのドナーから見て同種異系であるか、または異種でさえある刺激細胞の使用について記載している。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書はさらに、好ましくは選択された分子（ペプチド）の負荷が不可能である刺激細胞、および特にＴＡＰ欠乏刺激細胞の使用も開示している。
【００１０】
米国特許第６，８０５，８６１号明細書は、選択された分子に対して反応性がある細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローン集団の作製方法であって、（ａ）健康な個人に由来する（すなわち患者に由来しない）ＣＴＬを含有するサンプルを、ＨＬＡクラスＩ（または同等）分子をその表面上に発現し、かつ選択された（抗原）分子の少なくとも一部を促進剤細胞の表面上に提示する促進剤細胞とともに共培養する工程、および（ｂ）前記分子の少なくとも一部が、細胞の表面上のＨＬＡクラスＩ（または同等）分子によって提示される時に前記選択された分子に対して反応性のＣＴＬクローンを選択する工程を含む方法について記載している。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書について言及された考察が、ここでもまた適用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、病原性作用物質、例えば腫瘍細胞上にそのＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識する能力を有する高い機能結合活性を有するＴＣＲを担っているＴ細胞を生成させることが、本発明の基礎となる一つの問題である。養子細胞転移において用いることができる抗原特異的Ｔ細胞の迅速かつ効果的な生成方法を提供することが、本発明の基礎となるさらなる問題である。さらには、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のリスクをともなわずに、病気を患っている患者の治療のために用いることができるＴ細胞ベースの製薬組成物を提供することが、本発明の基礎となる一つの問題である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞を得るための代替戦略を開発した。試験管内転写ＲＮＡの転移を通して（Ｎａｉｒら、１９９８年）、樹状細胞（ＤＣ）中に、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し得る他の細胞中にタンパク質を発現させるための周知技術が用いられた。しかしながら、先行技術において通常であるように、抗原源をエンコードするＲＮＡのみを発現する代わりに、本発明者らは、特異的標的分子、例えばモデルＴＡＡとしてチロシナーゼをエンコードするＲＮＡ、および同種異系ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２をエンコードするＲＮＡを、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＤＣまたは他の細胞中にコトランスフェクションした。
【００１３】
これらのトランスフェクションされたＤＣは、次いでＰＢＬ、例えば自家ＰＢＬを初回抗原刺激するために用いられることができる。ＨＬＡ−Ａ２抗原リガンドは、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＤＣドナーのＰＢＬについてのアロ決定因子を表し、従って高親和性ＴＣＲを担っているＴ細胞を得ることができる。ＤＣが自己−ＭＨＣ分子の完全補体を発現するので、リンパ球の非ＭＨＣ−制限集団の出現は、陰性ＭＨＣ調節を通して抑制される。いくつかの様々な戦略を、抗原に由来する特異的ペプチドとは独立してＨＬＡ−Ａ２を認識するＴ細胞からペプチド−特異的／ＨＬＡ−Ａ２アロ制限Ｔ細胞を強化するために用いることができる。これは、サイトカイン捕獲、テトラマー選択、またはその後に拡張される個々のＴ細胞のクローニングによる戦略を包含する。
【００１４】
本研究方法は、（Ｓｔａｕｓｓおよび共同研究者によって記載されているように）アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞を得るために、Ｔ２系またはショウジョウバエ細胞に勝るいくつかの利点を提供する。
【００１５】
第一に、あらゆるクローンされたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ対立遺伝子のために試験管内転写されたＲＮＡを利用することができるので、多様なＭＨＣ分子についてのアロ制限を有するＴ細胞を開発することができる。従って、このようなＡＰＣは、それぞれ転移された同種異系ＭＨＣクラスＩＩまたは同種異系ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を通して、所望の抗原の提示を介してアロ制限ペプチド−特異的ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方を生成するために用いられることができる。米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書に記載された研究方法は、ＣＤ８Ｔ細胞の生成に適しているだけであることが注目される。
【００１６】
第二に、選択されたＴＡＡの公知ペプチドのみに対する初回抗原刺激に制限されているわけではないが、それは、全抗原が、ＤＣ中のプロセシングおよび提示のために利用可能だからである。抗原は、タンパク質の形態で、またはＡＰＣ中の対応タンパク質を発現するためのテンプレートとしてその後用いられる核酸の形態のどちらかで提供されてもよい。ここでもまた、先行技術の研究方法との差が著しい：米国特許出願第２００２００９０３６２号明細書において、ペプチドが刺激細胞上に負荷される（これらは、プロフェッショナルＡＰＣではない）が、それは、刺激細胞が抗原を処理および提示することができないからである。このようにして、公知ペプチドのみを、この研究方法において用いることができ、本発明における場合のように、未知の構造の抗原は用いられることができない。
【００１７】
第三に、高い機能的結合活性を有するこれらの選択されたＴ細胞のＴＣＲ配列は、それぞれのＴＣＲリガンドを担っている腫瘍に対して高い機能的結合活性を有するＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を生成させるために自家ＰＢＭＣ中の発現用に用いられることができる。ＡＣＴは、試験管内でかなりの時間にわたって単離および拡張されなければならない特異的リンパ球の養子転移の代替方法として、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を用いて実施することができる。このことは、ＳＣＴを受けない患者の治療、ならびにトランスジェニックＴＣＲによって見られる対応ＭＨＣ−ペプチドリガンドを発現する他の非血液悪性腫瘍を有する患者における適用を可能にするであろう。
【００１８】
特に本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法であって、健康なドナーに由来し、かつ同じ健康なドナーに由来するＰＢＬに自家性のＡＰＣが用いられる方法を提供する。しかしながら、前記ＡＰＣ中にトランスフェクションされたＭＨＣ分子は、患者由来である。この文脈における患者由来とは、これをエンコードする配列が、患者から直接得られるか、あるいはまた別の源、例えば、治療されることになる患者のＭＨＣ対立遺伝子と同一であるｃＤＮＡもしくはゲノムクローンに由来することを意味する。さらには、本発明は初めて、所望の抗原特異的Ｔ細胞を得るために、一般にこれらのＡＰＣ中にＭＨＣ分子および抗原をコトランスフェクションさせるための研究方法を利用する。
【００１９】
本発明のトランスフェクションされたＡＰＣは、ＡＰＣから見て自家性であるＰＢＬを初回抗原刺激するために用いられることができる。転移されたＭＨＣ−抗原リガンドは、ＡＰＣ中に転移された前記ＭＨＣ分子に対応するＭＨＣ遺伝子を保有しないＡＰＣドナーのＰＢＬについてのアロ決定因子を表わす。従って、高親和性ＴＣＲを担っているＴ細胞を得ることができる。ＡＰＣは、自己−ＭＨＣ分子の完全補体を発現するので、リンパ球の非ＭＨＣ制限集団の出現は、陰性ＭＨＣ調節を通して抑制される。この発明におけるＡＰＣの使用、特にＤＣの使用は特に重要であるが、その理由は、これらの細胞が、これらのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子においてペプチドを効率的に処理し、提示し得るからである。これに加えて、ＡＰＣは、追加の共刺激性分子の発現を特徴とし、これらの分子によって、これらはＴリンパ球上に追加受容体をシグナルすることが可能になり、これは、Ｔ細胞の最適な活性化、拡張、および生存に導く。さらには、ＡＰＣ、特にＤＣは、初回抗原刺激されたリンパ球の機能に影響を与える多様なサイトカインおよびケモカインを分泌する能力を有する。ＡＰＣによって作製された因子に応じて、応答リンパ球は、これらの亜類型、ホーミング能力、および機能的能力に関して修飾され得る。例として、ＤＣによって示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドとこれらのＴＣＲとの相互作用によって、所望の抗原特異性を有するが、ＡＰＣとして用いられた特定のＤＣによって分泌されたサイトカイン／ケモカインに基づく所望の機能も有するＴ細胞を活性化するために、成熟ＤＣを用いることができる。様々な型のサイトカイン／ケモカインを分泌するＤＣを試験管内で生成することができ、Ｔ細胞の所望の型を刺激するために用いることができる。このようにして、これらに多量のサイトカインＩＬ−１２を分泌するようにさせる成熟カクテルでの培養において生成された成熟ＤＣは、抗腫瘍免疫において特に重要なＴヘルパーＩ型のＣＤ４Ｔ細胞を活性化させる良好な能力を有する（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉら、２００５年）。これに対して、ＩＬ−１０を分泌する未成熟ＤＣは、他のリンパ球の活性を抑制し得る調節Ｔ細胞の活性化において特に強力であるように見える（ＬｅｖｉｎｇｓおよびＲｏｎｃａｒｏｌａ、２００５年）。このような調節Ｔ細胞は、これによって、自己免疫疾患、例えば１型糖尿病を患っている患者における自己攻撃性Ｔ細胞の制御において、またはあまりに圧倒的になり、例えばハンセン病のいくつかの形態におけるような免疫病を引起こす病原体への免疫応答の制御において臨床的メリットを有することができる。
【００２０】
ＤＣは、この細胞中の様々な区画において発現された抗原を処理し、提示する能力を有するので、所望の抗原特異性を有するＴ細胞を生成させるために、正確な抗原ペプチドを知る必要はない。例えばＤＣに、完全なタンパク質抗原、またはこのようなタンパク質をエンコードするＲＮＡが備えられる時、これらは、全く同一なタンパク質とは異なるいくつかのペプチドを処理し、これらをＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子中に提示することができる。これらの様々なＭＨＣ−ペプチドリガンドは、今度はＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の様々な集団を初回抗原刺激することができる。同種異系ＭＨＣクラスＩおよび同種異系ＭＨＣクラスＩＩ分子を同時に発現させるためにＤＣを修飾することができない理由はないが、それは、これらが抗原を発現させるために修飾され、これによって同じ培養物中において、ＣＤ４およびＣＤ８アロ制限Ｔ細胞の両方の初回抗原刺激を可能にするからである。活性化されたＣＤ４Ｔ細胞とＤＣとの相互作用は、今度は、これらがＣＤ８Ｔ細胞を最適に活性化することを可能にするシグナルをこれらに与えることができる（Ｔｏｅｓら、１９９８年）。ＤＣはさらに、いくつかの様々な抗原を同時に発現させるために修飾されることができる。実際、ＤＣは、何百ものＲＮＡ種を包含する、腫瘍細胞のＲＮＡ内容物全体を発現するためにトランスフェクションされることができる。ＤＣは、多重ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩリガンドをこれらの表面上で同時に処理され、提示されることができ、多くの様々なＴ細胞型の活性化に導く（ＧｉｌｂｏａおよびＶｉｅｗｉｇ、２００４年；Ｇｅｉｇｅｒら、２００５年；Ｓｃｈａｆｔら、２００５年）。抗原についてのＲＮＡまたはタンパク質の混合物と同時に、同種異系ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を共発現することによって、アロ制限ＭＨＣ−ペプチドリガンドを作成するためにこの同じ特性を獲得することができない理由はない。
【００２１】
本発明は、以下の実験結果によって裏付けられる。
１）第一に、本発明者らは、同種異系ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２をエンコードするＲＮＡが、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーの細胞中に転移された時に、ＨＬＡ−Ａ２分子が、ＨＬＡ−Ａ２特異的モノクローナル抗体での染色後、フローサイトメトリーを用いて検出されるように、細胞表面に発現されることを実証した。さらには、これらの細胞は、ＨＬＡ−Ａ２アロ特異的Ｔ細胞クローン（ＪＢ４細胞）を活性化して、サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ）を分泌することができ、これらの機能的能力を実証している。転移および発現は、ＤＣならびに他の細胞、例えばＫ５６２細胞において達成されることができる。
【００２２】
２）同様に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば黒色腫についてのＴＡＡの一例としてチロシナーゼをエンコードするＲＮＡが転移された時、細胞の内部でタンパク質発現を検出することができるが、それは、これが非膜タンパク質であるからである。このタンパク質発現は、フローサイトメトリー、およびチロシナーゼ−特異的抗体を用いた細胞内染色、および検出のための二次蛍光標識抗体を用いて実証されることができる。転移および発現は、ＤＣおよび他の細胞、例えばＫ５６２において達成されることができる。
【００２３】
３）ＲＮＡの両方の種（ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ）を同じ細胞中に転移する時、受容者細胞におけるタンパク質の両方の型の同時発現を検出することができる。これは、ＤＣおよび他の細胞、例えばＫ５６２細胞において達成されることができる。
【００２４】
４）ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２、およびＴＡＡ、例えばチロシナーゼを共発現するＡＰＣを、ＭＨＣ−ペプチド複合体を生成し、対応リガンドについてのＴＣＲを担っているＴ細胞と相互作用することができるような方法でこれらをその表面上に示す。このことは、このような共発現ＡＰＣが、サイトカイン放出によって測定されるような特異性を有するＴ細胞クローンを活性化することができるという事実によって実証される。このことは、ＤＣまたは他の細胞、例えばＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−ペプチド特異的ＣＤ８Ｔ細胞クローンのためのＡＰＣとしてＫ５６２を用いて実証された（Ｔｙｒ−Ｆ８細胞）。
【００２５】
特に本発明は、次の態様および実施形態を目的とする。
第一の態様によれば、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生成方法であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸および抗原、または前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定されているような両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程、
を含む方法を提供する。
【００２６】
これらのＡＰＣは、好ましくは、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、単球、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、抗原提示能力を有する血液悪性腫瘍、および／またはＥＢＶ−形質転換リンパ芽球様細胞株から選択される。
【００２７】
樹状細胞（ＤＣ）が特に好ましい。成熟樹状細胞（ＤＣ）は、非常に多様な共刺激性分子とともに、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方を高いレベルで発現する。これらは、以前に抗原に遭遇しなかったナイーブＴ細胞に初回抗原刺激する完全な能力をこれらに与える。これらはまた、これらのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子中の細胞内タンパク質からの抗原をこれらが処理および提示すること可能にする、すべての必要な遺伝子／タンパク質も有する。このようにしてこれらは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答の両方の誘発のための刺激細胞として用いるのに最適な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。自家ＤＣ中のＴＡＡをエンコードするＲＮＡの発現は、高い親和性を有する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞が、同じ健康なドナーの末梢血リンパ球を用いて試験管内で初回抗原刺激されることを可能にした（Ｌｉａｏら、２００４年）。ＤＣは、自己−エンコードされたＭＨＣクラスＩ分子の正常補体を発現するので、これらは、Ｔ２細胞または他の種の細胞、例えばショウジョウバエの細胞に対して、ＮＫおよびＮＫ様Ｔ細胞の活性の負の調節を行なうことができる。
【００２８】
一つの実施形態によれば、ＭＨＣ分子および抗原は、抗原と、ＭＨＣ分子をエンコードする核酸との混合物として用いられる。代替実施形態として、同種異系ＭＨＣ分子をエンコードする核酸および抗原が、ビシストロンＲＮＡとして準備される。
【００２９】
特異的Ｔ細胞がこれに対して生成させられるべきである抗原は、好ましくは、ウイルス、細菌、原生動物、および寄生虫に由来する病原性作用物質、ならびに腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞関連抗原、自己抗原、またはこれらの機能部分から選択される。
【００３０】
これらのウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルス、はしかおよび呼吸器合胞体ウイルス、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、または乳頭腫ウイルスからなる群から選択される。原生動物は、熱帯マラリア原虫であってもよく、細菌は、結核を引起こすマイコバクテリアであってもよい。
【００３１】
腫瘍関連抗原は、好ましくは、血液悪性腫瘍もしくは充実性腫瘍、より好ましくは結腸癌、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、肺癌、肉腫、または黒色腫細胞から選択される。
【００３２】
選択工程ｄ）は、好ましくは、Ｔ細胞のサイトカイン放出の測定、またはＴ細胞活性化の他の測定値によって実施される。例えば活性化Ｔ細胞は、個々の細胞としてクローンされることができ、拡張後、これらのＴ細胞クローンは、これらのＭＨＣ−ペプチド特異性について分析されることができ、所望の特異性を有するものが、さらなる使用のために選択され得る（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、１９７９年、１９９７年）。あるいはまた、様々な形態の可溶性ＭＨＣ−ペプチドリガンド、例えばテトラマーは、蛍光ラベルでマークされることができ、活性化Ｔ細胞でインキュベーションされることができる。テトラマーと相互作用するＴＣＲを担っているこれらのＴ細胞は、次いでフローサイトメトリーによって検出されることができ、これらの蛍光に基づいてソートされることができる（Ｙｅｅら、１９９９年）。Ｔ細胞はさらに、これらが反応すべき腫瘍細胞で短時間刺激することができ、これらのインターフェロンガンマ分泌を、捕獲試薬によって、例えば公開されているように（Ｂｅｃｋｅｒら、２００１年）検出することができる。
【００３３】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法はさらに、ｄ）生体外で選択されたＴ細胞の拡張工程も含む。このことは、選択されたＴ細胞を、これらの当初初回抗原刺激のために用いられたのと同じ方法で生成されたＡＰＣとともに共培養し、新しいＡＰＣをＴ細胞培養物へ７〜１０日毎に添加し、拡張しているＴ細胞の型に応じて、補足サイトカインを含有する新鮮な培地を規則的にこれらの細胞に供給することによって実施されることができ、これは、（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、１９９７年；Ｒｅｇｎら、２００１年；Ｓｕら、２００１年、２００２年）に記載されているように、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、および／または中でも特にＩＬ−１５を包含する。
【００３４】
さらに、本発明の方法はさらに、単離Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローン工程、および／またはＰＢＭＣ中にＴＣＲトランスジーンを発現する工程も含む。これは、確立された方法、例えばＥｎｇｅｌｓら、２００５年に記載された方法に従って行われることができる。
【００３５】
これが特異的ＭＨＣクラスへ制限されないことが、本研究方法の一つの大きい利点である。このようにしてＭＨＣ分子は、これらが患者のＭＨＣ型に対応する限り、ＭＨＣクラスＩ、好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、もしくはＨＬＡ−Ｅ、またはＭＨＣクラスＩＩ、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲから選択されてもよい。
【００３６】
第二の態様によれば、本発明は、上記の方法によって得ることができる、抗原特異的Ｔ細胞を提供する。
前記Ｔ細胞は好ましくは、エフェクター細胞特徴を有するＴ細胞、より好ましくはサイトカイン生産Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、または調節Ｔ細胞、好ましくはＣＤ4＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３７】
第三の態様において、本発明は、上に説明されたような方法によって得ることができる、トランスジェニックＴＣＲについてコードする核酸を目的とする。
追加の態様は、トランスジェニックＴＣＲについてコードする核酸を含んでいるベクターを目的とする。このベクターは好ましくは、本発明による核酸、および１またはそれ以上の調節核酸配列を含有する発現ベクターである。好ましくはこのベクターは、プラスミドまたはレトロウイルスベクターである。
【００３８】
本発明はさらに、上に規定されているようなベクターで形質転換されたＰＢＭＣも含んでいる。
さらなる態様において、本発明は、上に説明されているようなＴ細胞もしくはＰＢＭＣ、および製薬的に許容可能な担体を含んでいる製薬組成物を提供する。
【００３９】
本発明のこれらの活性成分は好ましくは、疾病が治療されるか、または少なくとも軽減されうるような製薬組成物において、許容可能な担体もしくは担体材料と混合された用量で用いられる。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）充填材料、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および他の材料を包含する。これらは、公知の最新技術である。
【００４０】
「製薬的に許容可能な」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない、非毒性材料を規定する。担体の選択は用途に依存している。
製薬組成物は、活性成分の活性を強化するか、または治療を補足する追加成分を含有することができる。このような追加成分および／または因子は、相乗効果を得るため、または副作用もしくは望まれない作用を最小限にするためにこの製薬組成物の一部であってもよい。
【００４１】
本発明の活性成分の配合または調製および適用／薬物適用の技術は、「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、ペンシルベニア州イーストンのマック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）の最新版に公開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば筋肉内、皮下、骨髄内注射、ならびに鞘内、直接心室内、静脈内、結節内、腹膜内、または腫瘍内注射である。静脈内注射が、患者の好ましい治療である。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、この製薬組成物は、注入または注射またはワクチンである。
さらなる態様によれば、本発明は、養子細胞療法のため、および特に血液悪性腫瘍もしくは充実性腫瘍および急性もしくは慢性感染の治療のための薬剤の製造について上で説明されているような抗原特異的Ｔ細胞もしくはＰＢＭＣの使用を目的とする（同様に上記参照）。
【００４３】
本発明は、以下において実施例および図面によって例証される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】樹状細胞の成熟、および悪性細胞に対する従来の免疫応答における特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を示している。
【図２】ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞によるナイーブ腫瘍特異的Ｔ細胞のデノボ初回抗原刺激を例証している。
【図３】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図４】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図５】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図６】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図７】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図８】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図９】試験管内転写ＲＮＡの導入を示している。
【図１０】ＲＮＡ−発現ＤＣによるＴｙｒＦ８細胞の再刺激に対するＲＮＡ濃度の影響を示している。
【図１１】ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞でのナイーブＴ細胞のデノボ初回抗原刺激プロトコルを例証する。
【図１２】ＲＮＡ−トランスフェクションされた樹状細胞上のＭＨＣ−ペプチドリガンドの発現を示している。
【図１３】ＨＬＡ−Ａ２−陽性およびＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーからの初回抗原刺激されたＴ細胞のテトラマー染色を描いている。
【図１４】特異性およびＴ細胞受容体結合活性についてのテトラマー−ソートされたバルクＴ細胞培養物の評価を示している。
【図１５】特異性、Ｔ細胞受容体結合活性、および機能についてのＴ細胞クローンの評価を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
実験および図面の説明
図１．樹状細胞の未成熟および成熟段階
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原に遭遇したことがないＴ細胞（ナイーブＴ細胞）を活性化するこれらの能力のために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のうち最も「プロフェッショナル」であると考えられる。これは、ＤＣについて既に発見されているいくつかの因子に応じており、同様に依然として同定されるべき特徴に依存することがある。ＤＣの様々な形態が存在し、これらの独特の特徴は、継続的に調査中である。臨床研究のために最も普通に用いられているＤＣの型は、ＣＤ１４−陽性血液単球から区別することができる骨髄ＤＣである。サイトカイン、顆粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下におけるこのような単球の試験管内培養を通して、その周囲から（異種抗原を含む）材料を取り上げるその高い能力を特徴とする未成熟骨髄ＤＣが生成される。未成熟ＤＣが、この段階の間に適切なシグナルを受け取る時、これは活性化されて、リンパ管を通って二次リンパ節へ移動する。この移動の間、およびリンパ節に達した時、これはさらなる変化を受け、これが完全成熟段階に導く。成熟段階において、ＤＣは、高いレベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現し、これらによってこれは、細胞内タンパク質に由来するペプチドの形態における抗原を、それぞれＣＤ８−陽性およびＣＤ−４陽性Ｔ細胞へ提示することが可能にされる。ＭＨＣ分子の両方の型によって提示され、ＤＣの表面上に示された抗原は、抗原プロセシングおよび提示の様々な工程を含む、複雑な細胞プロセスにおいてＤＣ中に生成される。ＭＨＣクラスＩ分子中のＤＣ細胞表面において提示されたペプチド（すなわち抗原−断片）の場合、ＡＰＣが抗原プロセシング関連輸送体（ＴＡＰ）遺伝子、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２によってエンコードされた分子を発現する必要がある。
【００４６】
ＤＣ表面に示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドは、Ｔリンパ球（すなわちＴ細胞受容体）上に存在する抗原特異的受容体と相互作用する。この相互作用は、Ｔ細胞へ第一シグナル（すなわちシグナル１）をもたらす。このシグナルは、各Ｔ細胞について独自のＴＣＲを通してもたらされるので、これは、適合ＴＣＲを有するＴ細胞を選択することによって、結果として生じる応答の抗原特異性を決定する。成熟ＤＣはまた、いくつか挙げればＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６を包含する非常に多様な共刺激性分子も発現し、これらは、Ｔリンパ球によって発現された追加受容体と相互作用し、これらのさらなる活性化（すなわちシグナル２）を引起こす。ＤＣはさらに、サイトカインおよびケモカインを包含する多様な可溶性分子を分泌する能力を有する。これらは様々な亜型のリンパ球をこれらの近隣へ引き付けることができ、シグナル１およびシグナル２を受け取るＴ細胞の分化に対して影響を与えうる。リンパ球によって発現されたさらなる組の受容体への結合後に、これらの因子は、これらの分化および最終的機能に影響を与えうるリンパ球へさらに別のシグナルをもたらすことができる。これは時にはシグナル３と呼ばれる。
【００４７】
試験管内で未成熟および成熟ＤＣを生成することが可能である。例えば単球を、様々な手順によって（細胞選択用の商業キットを用いたＣＤ１４−陽性細胞の正の選択、プラスチック商品へのこれらの接着特性によって、または細胞溶出法を用いて、これらのサイズおよび密度によって）得ることができる。これらの単球は、次いでＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに培養されて、未成熟ＤＣの集団を生じる。試薬の様々な組み合わせが、ＤＣの成熟を誘発するため、および平行して可溶性メディエーターのこれらの分泌を改変するために用いられることができる。未成熟／成熟ＤＣのこれら様々な形態が、今度はＤＣによって示されたＭＨＣ−ペプチドリガンドとこれらのＴＣＲとの相互作用によって所望の抗原特異性を有するのみならず、ＤＣによって分泌されたサイトカインに基づいた所望の機能も有するＴ細胞を活性化するために用いられることができる。このようにして、生成されて多量のサイトカインＩＬ−１２を分泌する成熟ＤＣは、抗腫瘍免疫において特に重要なＴヘルパー１型のＣＤ４Ｔ細胞を活性化する良好な能力を有する。
【００４８】
適切に活性化され、選択されるならば、Ｔ細胞は、腫瘍細胞、または様々な病原体に感染した細胞を認識して破壊する能力を有する。腫瘍細胞の場合、ＡＰＣによって処理され、提示された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は多くの場合、腫瘍細胞において過剰発現された自己−タンパク質である分子を表わす。自己分子に由来するＭＨＣ−ペプチドリガンドと相互作用するＴＣＲを担っている大部分のＴ細胞は、「負の選択」として公知の方法で胸腺において取り除かれるので、このようなＴＡＡ−リガンドを発現する腫瘍細胞を認識するのに十分な結合活性をともなうＴＣＲを有するＴ細胞は、レパートリー中にほとんど存在しない。
【００４９】
図２．ＲＮＡ−パルスされた樹状細胞での、ナイーブ腫瘍特異的Ｔ細胞のデノボ初回抗原刺激
腫瘍細胞または他の細胞、例えば病原体で感染された細胞上でＭＨＣ−ペプチドリガンドを認識するより良好な能力を有するＴ細胞を得るために、同種異系ＭＨＣ分子を介して、選択された１または複数の抗原に由来するペプチドを提示することによって、健康な個人からのＴ細胞の非選択レパートリーを選ぶ（ｔａｐ）ことができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２でない健康なドナーＡからのＴ細胞は、胸腺においてＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体へ暴露されたことはなく、したがって、高い結合活性を有するＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体と相互作用することができるＴＣＲを発現するこのような個人の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のうちで利用可能なＴ細胞が存在する。このような所望のＴＣＲを担っているナイーブＴ細胞を刺激するために、前記ドナーＡのＤＣは単球から生成され、次いで修飾されて、同種異系ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子を発現する。ここで、ＨＬＡ−Ａ２についての一例が与えられる。この分子は、ＨＬＡ−Ａ２でないドナーＡのＴ細胞についての同種異系ＭＨＣ分子である。ＨＬＡ−Ａ２エンコードＲＮＡをドナーＡのＤＣ中に導入することによって、ＨＬＡ−Ａ２分子をその細胞表面において発現するＤＣの集団を作製することが可能である。これによって、ＤＣは依然として、ドナーＡの染色体ＭＨＣ遺伝子によってエンコードされた自己−ＭＨＣ分子のその正常な組を発現するが、これに加えてそれは、導入されたＲＮＡから翻訳された同種異系ＭＨＣ分子を発現する。同時にＤＣは、ペプチドがＤＣによって処理され、細胞表面において同種異系ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示され得るタンパク質抗原をエンコードするＲＮＡが供給されることができる。このような同種異系ＭＨＣ−ペプチドリガンドをその細胞表面において発現するＤＣが、ナイーブＴ細胞を刺激するためにＡＰＣとして用いられる時、これらは、所望の同種異系ＭＨＣ−ペプチドリガンドと相互作用するＴＣＲを有するＴ細胞を活性化することができる。同種異系ＭＨＣ分子を認識するすべてのＴ細胞が、所望のペプチド特異性を有するわけではないであろう。したがって所望のＴＣＲを有するこれらの細胞は、活性化されたＴ細胞の全部の集団から選択されなければならない。この選択を得るための、免疫学者に周知のいくつかの手順がある。例えば活性化されたＴ細胞は、個々の細胞としてクローンすることができ、拡張後にこれらのＴ細胞クローンは、これらのＭＨＣ−ペプチド特異性について分析することができ、所望の特異性を有するものが、さらなる使用のために選択されることができる。あるいはまた、様々な形態の可溶性ＭＨＣ−ペプチドリガンド、例えばテトラマーは、蛍光ラベルでマークすることができ、活性化されたＴ細胞でインキュベーションされることができる。これらのテトラマーと相互作用するＴＣＲを担っているこれらのＴ細胞は、次いでフローサイトメトリーによって検出されることができ、これらの蛍光に基づいてソートされることができる。
【００５０】
所望のＴＣＲ特異性で選択されたＴ細胞は、次いで対応ＨＬＡ−Ａ２−ペプチドリガンドを発現する腫瘍または感染細胞を有する患者の養子細胞療法（ＡＣＴ）における使用のために試験管内で拡張されてもよい。あるいはまた、ＴＣＲ配列を単離し、このようなＴ細胞について決定することができ、リンパ球または他の細胞中に導入して、ＡＣＴのために用いることができるトランスジェニックＴＣＲ細胞を生成することができるＴＣＲ構成体を生成するために用いることができる。
【００５１】
図３．Ｋ５６２細胞中への試験管内転写ＲＮＡの導入
この戦略の実行可能性を実証するための第一実験方法として、本発明者らは、ＲＮＡ転移後の同種異系ＨＬＡ−Ａ２ＭＨＣ分子の発現のために、受容者細胞株としてＫ５６２細胞株を用いた。この細胞株はエリスロミエロイド白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｌｏｉｄ
ｌｅｕｋａｅｍｉａ）に由来し、細胞免疫学者には周知である。これは腫瘍系であるので、多数になるまで成長させることができ、実験的な取扱いが容易である。これはさらに、その細胞表面上にＭＨＣクラスＩ分子をまったく発現させず、従って、同種異系ＭＨＣ分子の発現は、ＭＨＣクラスＩ分子をエンコードする核酸の導入後、Ｋ５６２の細胞表面において容易に検出することができる。
【００５２】
この図面に要約された実験において、ＨＬＡ−Ａ２−エンコードｃＤＮＡからの試験管内転写によって生成されたＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡが、エレクトロポレーションを介してＫ５６２細胞中に導入された。一時的にＲＮＡトランスフェクションされた細胞は、Ｋ５６２−Ａ２細胞と呼ばれる、ＨＬＡ−Ａ２をエンコードする遺伝子で安定的にトランスフェクションされたＫ５６２細胞の一系列と比較された。
【００５３】
ＨＬＡ−Ａ２分子の表面発現は、ＨＬＡ−Ａ２分子について特異的なモノクローナル抗体でのこれらの細胞のインキュベーション後にフローサイトメトリーによって決定され、データは、陽性細胞のパーセンテージとして示されている（左側の図面）。模擬対照として、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡの代わりに水を収容しているキュベットにおいてエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションに続くすべての時点で、模擬対照において陽性細胞はまったく検出されなかった。ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡの３つの異なる量が、同数のＫ５６２細胞のエレクトロポレーションのために用いられた。ＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の最高パーセンテージが、２４マイクログラムの量のＲＮＡを用いて検出され、細胞の最高パーセンテージは、エレクトロポレーションの１１時間後に見られた。ＲＮＡのエレクトロポレーション後のＨＬＡ−Ａ２分子を発現する陽性細胞のパーセンテージは、１１時間および２４時間の時点で、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を安定的に発現する正の対照Ｋ５６２−Ａ２細胞のパーセンテージに匹敵した。ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡの導入後のＨＬＡ−Ａ２の一時的発現は、４８時間の時点での陽性細胞のパーセンテージの減少、および１２０時間の時点での無検出によって実証される。
【００５４】
アロ抗原としてＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴＣＲを担っているＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ−発現細胞によって活性化されうるかどうかを決定するために、ＪＢ４と呼ばれるＴ細胞クローンが研究された。このＴ細胞クローンは、そのＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２−ペプチドリガンドと相互作用する時に、サイトカインインターフェロン−ガンマを分泌する。この認識のために必要とされる正確なペプチドは公知でないが、Ｋ５６２細胞、およびＤＣ、および本発明者らがテストした大部分の他の細胞中に発現され、このようにして、これは、遍在性タンパク質に由来するように見える。ＪＢ４細胞がＫ５６２模擬トランスフェクション細胞とともに共培養された時、ＩＦＮ−ガンマ放出は検出されない（右側の図面）。Ｋ５６２−Ａ２細胞の正の制御では強い放出が見られる。様々な量のＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡでトランスフェクションされたすべてのＫ５６２細胞は、正の対照よりも低いレベルにおいてではあるが、ＪＢ４細胞によってサイトカインの分泌を誘発することができた。それにもかかわらず、これらはサイトカイン放出の実質的なレベルである。ＪＢ４細胞の添加を有しなかったＫ５６２またはＤＣの培養において、サイトカイン放出は測定されず、刺激細胞がインターフェロン−ガンマをそれ自体分泌しないことを実証した。刺激細胞をともなわないＪＢ４細胞の最終対照は、サイトカイン放出を全く示さず、Ｔ細胞が、インターフェロン−ガンマを分泌するのに適切なＭＨＣ−ペプチドリガンドによって活性化されなければならないことを実証した。
【００５５】
これらの研究は、一時的なＲＮＡ発現を介したＫ５６２細胞中への同種異系ＭＨＣ分子の導入が、ＨＬＡ−Ａ２分子の細胞表面発現へ導き、これらの細胞が、ＨＬＡ−Ａ２アロ抗原特異的Ｔ細胞クローンを活性化することができることを証明した。
【００５６】
図４．ＤＣ中への試験管内転写ＲＮＡの導入
ＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後にＤＣ上のＨＬＡ−Ａ２分子の表面発現を評価するため、およびＪＢ４細胞からのサイトカイン分泌を刺激するこれらの能力を評価するために、同様な実験方法が、図３に記載されているように用いられた。ここで、２４マイクログラムの量のＨＬＡ−Ａ２ ｍＲＮＡが全体を通して用いられたが、ｍＲＮＡの３つの異なる源が比較された。これらは、ＲＮＡ発現をＤＣ内部で安定させる意図で、ヒトアルファ−グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲがＨＬＡ−Ａ２遺伝子構成体へ添加されている試験管内転写ＲＮＡの商業源を含んでいた。このＲＮＡは、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）からの商業的手順およびキットを用いて生成されたポリアデニル化ＨＬＡ−Ａ２ ＲＮＡ対キュアヴァック（ＣｕｒｅＶａｃ）からの商業的手順およびキットを用いて生成された同様なＲＮＡと比較された。アンビオン手順を用いて生成され、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから培養されたＤＣ中にエレクトロポレーションによって導入されたポリアデニル化ｍＲＮＡが、最良の結果を示した。このｍＲＮＡの場合にＨＬＡ−Ａ２陽性細胞の最高パーセンテージが見られ、ＤＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２分子の出現は、より早く（６時間の時点で）検出され、ＤＣ中の発現は、このｍＲＮＡ源を用いて、なおも１２０時間の時点で見られた。従って、すべてのさらなる実験は、このｍＲＮＡ源を利用した。
【００５７】
ＤＣは、図３に記載されているように、ＪＢ４細胞からのサイトカイン分泌を刺激するこれらの能力について研究された。模擬対照ＤＣ（最も左の棒）は、サイトカイン放出のバックグラウンドレベルのみを誘発した。より高いレベルは、ｍＲＮＡの３つの異なる源を発現するＤＣを用いて見られたが、アンビオンｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたこれらのＤＣが優れていた。ＪＢ４細胞を含有しないＤＣ培養物は、インターフェロン−ガンマを有しておらず、これがＨＬＡ−Ａ２−ＲＮＡ発現ＤＣでの刺激後にＪＢ４細胞によって放出されるだけであることを実証した。
【００５８】
図５．腫瘍関連抗原チロシナーゼをエンコードする試験管内転写ＲＮＡのＫ５６２−Ａ２細胞中への導入
ＲＮＡは、アンビオン手順を用い、抗原チロシナーゼに対して特異的に生成された。これはＫ５６２−Ａ２細胞中にエレクトロポレーションされ、ＨＬＡ−Ａ２の表面発現が、ＨＬＡ−Ａ２分子に特異的なモノクローナル抗体を用いて測定された。緑の曲線はイソタイプ対照抗体での染色を表わし、青色の曲線はＨＬＡ−Ａ２−特異的抗体での染色を表わす。ここで、ＨＬＡ−Ａ２表面発現がすべての時点で見られたが、それは、Ｋ５６２−Ａ２細胞が、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を構成的に発現するからである。ＨＬＡ−Ａ２の発現の減少は、１２時間の時点で注目され、これは、エレクトロポレーションの結果としてのストレス誘発された衝撃と関連付けることができる。これらの細胞は、その後ＨＬＡ−Ａ２分子の高い発現を回復した。チロシナーゼのタンパク質発現は、チロシナーゼに特異的なモノクローナル抗体を用いて、タンパク質の細胞内検出後に測定された。オレンジ色の曲線は模擬対照の染色を表わし、青色の曲線は、これらの細胞内部のチロシナーゼタンパク質を表わす。染色におけるわずかなシフトを、いくつかの時点で見ることができ、タンパク質が、チロシナーゼＲＮＡの導入後に作製されつつあることを示している。
【００５９】
図６．Ｋ５６２−Ａ２細胞におけるチロシナーゼの発現および機能
チロシナーゼＲＮＡが、Ｋ５６２−Ａ２細胞中にエレクトロポレーションされ、陽性細胞のパーセンテージ、ならびに平均蛍光強度（ＭＦＩ）と呼ばれる染色強度が様々な時点で決定された（左上部分）。赤い棒はＫ５６２−Ａ２細胞上の構成的ＨＬＡ−Ａ２発現を示しており、ここでもまた、１１〜２４時間のレベルにおける低下およびその後の回復をともなう。青い棒は、６時間の時点でピークがあるチロシナーゼタンパク質の細胞内染色を示している。６時間の時点での染色のシフトは、右下部分に図解され、ここでは模擬対照染色がオレンジ色の曲線によって示され、チロシナーゼ染色は青色の曲線によって示されている。模擬対照と比較した、経時的な発現の倍数増加（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）は左下部分に示され、１１時間の時点で最大を生じる。ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されたチロシナーゼ由来ペプチドが分かるＴ細胞クローンＴｙｒ−Ｆ８のインターフェロン−ガンマ分泌が右上部分に示されている。Ｋ５６２−Ａ２細胞は、Ｔｙｒ−Ｆ８Ｔ細胞によるインターフェロン−ガンマ選択を誘発しないが、これらは、チロシナーゼＲＮＡでのエレクトロポレーション後に可能である。これらのＴ細胞は単独でサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼからの合成ペプチドが負荷されたＫ５６２−Ａ２細胞によって、またはチロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２を共発現する黒色腫細胞（ＭＥＬ−ＩＬ２細胞）によって刺激されることができる。
【００６０】
このことは、Ｋ５６２−Ａ２細胞中へのチロシナーゼについてのＲＮＡの導入によって、これらがＴｙｒ−Ｆ８細胞のＴＣＲによって見られる適切なＭＨＣ−ペプチドリガンドを処理および提示することを可能にし、これらのＴ細胞を活性化して、インターフェロン−ガンマを分泌させることを実証する。エレクトロポレーションの１２時間後および２４時間後に用いられたＲＮＡトランスフェクションされた細胞は、匹敵し得る刺激性能力を有していた。
【００６１】
図７．試験管内転写チロシナーゼＲＮＡの、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから生成されたＤＣ中への導入
同様な一組の実験が、図６に記載されている実験のように行なわれたが、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＤＣがＫ５６２−Ａ２細胞の代わりに用いられた。細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、ＲＮＡのエレクトロポレーション後の様々な時点でＤＣ中に検出された（上の図）。模擬対照全体における最高の平均倍数発現が、ＤＣ中で３時間の時点で見られた。ＤＣ単独ではＴｙｒＦ８細胞によるサイトカイン分泌を刺激することはできなかったが、これらは、チロシナーゼＲＮＡでのエレクトロポレーション後では可能であった。エレクトロポレーションの１２時間後または２４時間後に用いられたＤＣは、Ｔｙｒ−Ｆ８Ｔ細胞を活性化して、インターフェロン−ガンマを分泌させる能力を有していた。
【００６２】
図８．Ｋ５６２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼの共発現
ＨＬＡ分子をまったく発現しないＫ５６２細胞が、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼについてのＲＮＡでエレクトロポレーションされた。ＲＮＡの各種が個々に導入されるか、または両方が組み合わされて導入された。右上図は、異なる時点におけるＨＬＡ−Ａ２単独（最も左側の一組の棒）、チロシナーゼ単独のタンパク質発現、次いでＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡの両方でエレクトロポレーションされた細胞におけるＨＬＡ−Ａ２染色、およびＲＮＡの両方の種を受け取っている細胞におけるチロシナーゼ染色を要約している。ＲＮＡの両方の種でエレクトロポレーションされた細胞中の両方のタンパク質の最適発現が、２４時間の時点で見られた。両方のＲＮＡを共発現するＫ５６２細胞は、エレクトロポレーションの１２時間後および２４時間後にＴｙｒＦ８細胞からのインターフェロン−ガンマ分泌を刺激することができた。
【００６３】
図９．ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから作製されたＤＣにおけるＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼの共発現
ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣにおけるＨＬＡ−Ａ２タンパク質およびチロシナーゼタンパク質の共発現が、図８に記載されているように分析された。両方のタンパク質の共発現が、様々な時点においてＤＣ中に見られた。ＨＬＡ−Ａ２発現のレベルは、チロシナーゼＲＮＡの存在下に低下されるように思われた。それにもかかわらず、両方のＲＮＡを共発現するＤＣは、ＴｙｒＦ８細胞によるインターフェロン−ガンマの有意レベルを、Ｔ細胞単独のもの、またはＲＮＡの単独種でエレクトロポレーションされたＤＣでのインキュベーション後のもの以上に刺激することができた。
【００６４】
図１０．ＲＮＡ発現ＤＣによるＴｙｒＦ８細胞の再刺激へのＲＮＡ濃度の影響
ＤＣがＴｙｒＦ８細胞からのサイトカイン分泌を刺激する能力が、様々な量のＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡでトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣを用いて分析された。模擬対照ＤＣ（最も左側の棒）が、サイトカイン放出のバックグラウンドレベルのみを誘発した。Ｔ細胞単独ではサイトカインを分泌しないが、これらはまた、チロシナーゼおよびＨＬＡ−Ａ２を共発現する黒色腫細胞（ＭＥＬ−ＩＬ２細胞）によっても刺激されることができる。
【００６５】
様々な量の両方のＲＮＡでトランスフェクションされたすべてのＤＣは、ＴｙｒＦ８細胞によるインターフェロン−ガンマの分泌を誘発することができたが、一方で、２４μｇＨＬＡ−Ａ２および２４μｇチロシナーゼＲＮＡ、または４８μｇＲＮＡ ＨＬＡ−Ａ２および２４μｇチロシナーゼＲＮＡでエレクトロポレーションされたこれらのＤＣの方が優れており、Ｔ細胞の再刺激のためにはより少ないＲＮＡがより良好であろうことを示している。
【００６６】
図１１．ＲＮＡパルスされた樹状細胞でのナイーブＴ細胞のデノボ初回抗原刺激プロトコル
ＲＮＡ負荷されたＤＣがナイーブＴ細胞を初回抗原刺激して腫瘍特異的リンパ球になる能力を分析するために、３相初回抗原刺激プロトコルが開発された。初回抗原刺激の開始に先立つ８日前（−８日目）、単球が、記載されているようにＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーおよびＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからプラスチック接着によって調製された。これらの精製された単球集団が未成熟ＤＣを調製するために用いられ、これらは、次いで記載されているように成熟させられた。Ｔ細胞初回抗原刺激プロトコルの最初の日（０日目）に、ＤＣは、記載されているようにエレクトロポレーションを介してＲＮＡが負荷された。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来するＤＣに、モデル腫瘍抗原として２４μｇのチロシナーゼＲＮＡが負荷された。これらのＤＣにおけるＲＮＡから翻訳されたチロシナーゼタンパク質は、ＤＣ表面において自己−エンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子と関連してペプチドとして処理され、提示されるべきである。ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＤＣは、ＨＬＡ−Ａ２（４８μｇ）およびチロシナーゼ（２４μｇ）をエンコードするＲＮＡが負荷された。ここで、転移ＲＮＡによってエンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子は、同種異系ＭＨＣ分子を表わす。チロシナーゼタンパク質に由来するペプチドは、ＤＣへ転移されたＨＬＡ−Ａ２エンコードＲＮＡから翻訳されたＨＬＡ−Ａ２分子によって処理および提示されるべきである。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、アロ制限−ペプチドリガンドを表す。初回抗原刺激プロトコルの０日目に、各ドナーからの自家ＣＤ８＋Ｔリンパ球が、商業的キットおよび製造業者の指示（ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（ヒト）、ドイツ国ベルギッシュ・グラードバッハのミルテニ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ））を用いて負の選択を介して＞８０％純度まで単離された。これらの手のつけられていない自家ＣＤ８＋Ｔ細胞が、エレクトロポレーションの９時間後に、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するエイム（Ａｉｍ）Ｖ培地（ドイツ国カールスルーエのギブコ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ））中に１０：１の比で、成熟ＲＮＡ−パルスされたＤＣへ添加された。ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）が２日後に、ついでその後３日目毎に添加された。第一回刺激の７日後（７日目）、初回抗原刺激培養物の第二回刺激が、第一回刺激についてと同じ方法で調製されたＲＮＡ−パルスされたＤＣを用い、初回抗原刺激の０日目に用いられたのと同じ培養条件を用いて実施された。さらに７日後（１４日目）、ＨＬＡ−Ａ２制限チロシナーゼ特異的Ｔ細胞が、フィコエリトリン（ＰＥ）−標識されたＨＬＡ−Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７ペプチド／ヒトβ２ｍテトラマー（Ｗoｌｆｌら、２００４年；ドイツ国ミュンヘン、技術大学の医学微生物学、免疫学、および衛生研究所、（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｎｉｃｈ）のＰｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって提供された）の助けを借りてソートされた。正の選択をされたＴ細胞のいくつかは、９６ウエルＶ底プレート（スイス国トラサディンゲン（Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ）のＴＰＰ）において、１細胞／ウエルで培養された。これらのウエルに、３日毎に５０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２（ドイツ国マールブルクのヒロン・ベーリンク（Ｃｈｉｒｏｎ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ））を含有するエイムＶ培地、および７日毎に５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７（ドイツ国ハイデルベルクのプロモキネ（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ））および１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５（米国ニュージャージー州のペプロ・テック社（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．））が供給された。選択されたクローン、および残りのテトラマー選択された非クローンＴ細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５で上記のようにエイムＶ培地中の培養に維持され、支持細胞が供給された。これらの細胞は、５０Ｇｙが照射された５ドナーのプールに由来する末梢血単核細胞からなっていた。これらのＴ細胞は、２週間毎に抗−ＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍＬ；ドイツ国ミュンヘンの分子免疫学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＧＳＦ）のＤｒ．Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｋｒｅｍｍｅｒから提供された）で非特異的に刺激された。
【００６７】
図１２．ＲＮＡ−トランスフェクションされた樹状細胞上のＭＨＣ−ペプチドリガンドの発現
Ｔ細胞初回抗原刺激のために用いられたＤＣが、予想されたＭＨＣ−ペプチドリガンドを発現することを実証するために、細胞表面におけるＨＬＡ−Ａ２分子および細胞内チロシナーゼタンパク質の発現が、既に記載されているフローサイトメトリーを用いて決定された。ＨＬＡ−Ａ２分子およびチロシナーゼタンパク質の共発現は、両方のドナーに由来するＤＣにおいて高レベルで検出された。細胞内チロシナーゼタンパク質のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＨＬＡ−Ａ２陰性の両方のドナーから調製されたＤＣにおいて匹敵しうるものであった。大部分の細胞上のＨＬＡ−Ａ２表面発現のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから調製されたＤＣにおいて、より高かった。この場合、これらは内因性遺伝子によってエンコードされている。一方、トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２分子のレベルは、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから調製されたＤＣ上で、より変わりやすい。
【００６８】
独立実験における同じプロトコルに従って調製された細胞を用いた、このようなＤＣがＴ細胞を刺激する能力は、これらが保有するペプチド（すなわちＨＬＡ−Ａ２＋ｘｙｚペプチド）には関わりなくＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＨＬＡ−Ａ２−アロ応答性Ｔ細胞クローンを用いて決定された。ＤＣの両方の集団は、以前に記載されているような標準的ＥＬＩＳＡにおいて測定されたように、このＴ細胞クローン（ＪＢ４）を刺激してインターフェロン−ガンマを分泌させることができた。ＤＣをともなわずにインキュベーションされたＴ細胞からのサイトカイン放出は、まったく見られなかった。チロシナーゼ由来ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２分子からなるリガンドの存在が、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドについて特異的なＴ細胞クローン（Ｔｙｒ−Ｆ８）によるインターフェロン−ガンマ放出を測定することによって評価された。ＤＣをともなわずにインキュベーションされたＴ細胞は、サイトカインのバックグラウンドレベルのみを放出した。この実験において、ＨＬＡ−Ａ２−陽性ＤＣは、４８μｇのチロシナーゼが供給され、一方、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ＤＣは、２４μｇのチロシナーゼが供給された。
【００６９】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーに由来するＤＣ中へのＲＮＡ転移によって供給されたトランスジェニックＨＬＡ−Ａ２分子が、特異的ＨＬＡ−Ａ２抗体で細胞表面において染色することができ、ＨＬＡ−アロ特異的Ｔ細胞クローン（ＪＢ４）によって認識することができることを実証した。チロシナーゼＲＮＡの転移は、両方のＤＣ集団における細胞内タンパク質発現に導いた。ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼＲＮＡの共転移は、内因的にエンコードされたＨＬＡ−Ａ２分子を発現するＤＣ中へのチロシナーゼＲＮＡの転移のように、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ特異的Ｔ細胞クローン（ＴｙｒＦ８）が活性化されることを可能にした。
【００７０】
図１３．ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからの初回抗原刺激されたＴ細胞のテトラマー染色
初回抗原刺激されたＴ細胞培養物の中に存在するＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドリガンドについて特異的なＴ細胞受容体を担っているＴ細胞を選択するために、これらのＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３６９−３７７／Ｈβ２ｍテトラマーで染色
され、フローサイトメトリーによって分析された。テトラマー結合を示した２つの異なる初回抗原刺激培養物の各々からの細胞がゲートされ（黒い四角、□）、ＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ショーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ（Ｄａｋｏ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ））において単離された。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーのＣＤ８+テトラマー+Ｔ細胞集団は、低い強度においてのみテトラマー結合を示したが、一方で、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからのＣＤ８+テトラマー+細胞は、より高い強度において染色された。これらのソートされたテトラマー+Ｔ細胞は、単一細胞として培養され、残りの細胞は、非クローンバルク培養物として培養中に保持された。
【００７１】
これらの結果は、初回抗原刺激プロトコルが、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ特異的テトラマーを結合することができるＴＣＲを保有するＴ細胞を生じたことを実証した。より多くのＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２−陰性ドナーに由来するＤＣを用いて初回抗原刺激された培養物においてより高い強度でテトラマーを結合させ、ＨＬＡ−Ａ２同種異系ペプチドリガンドによるより良い刺激を示している。
【００７２】
図１４．特異性およびＴ細胞受容体結合活性についての、テトラマーソートされたバルクＴ細胞培養物の評価
バルク培養物として保持された、ソートされた細胞は、８日後テトラマー染色について再分析された。予想されたように、ソートされた細胞の大部分は、初回抗原刺激培養物の両方に由来する、ソートされたバルク培養物中のＣＤ８+であった。テトラマー+Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２陽性ＤＣを用いて初回抗原刺激された培養物中に約８％の頻度で存在した。これらの細胞は、テトラマー結合の中間的強度（ＭＦＩ＝１２７．４９）を有したが、一方で、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーからのバルク培養Ｔ細胞の８０％が、はるかに高い強度（ＭＦＩ＝３２４８．７７）を有するテトラマーを結合させた。テトラマー結合の強度は、特定のＭＨＣ−ペプチドリガンドについてのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合活性を評価するために用いられる１つのパラメーターである（Ｙｅｅら、１９９９年）。テトラマー結合のより高い強度は、このリガンドとＴＣＲとのより良い相互作用を示している。ＴＣＲ結合活性の第二パラメーターは、テトラマーオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）である（Ｐａｌｅｒｍｏら、２００５年）。Ｔ細胞は、テトラマーでインキュベーションされ、次いで洗浄され、テトラマーの不存在下、およびＨＬＡ−Ａ２分子について特異的な抗体の存在下にインキュベーションされる。この抗体の存在は、これらのＴ細胞の表面から落ちたテトラマーが、細胞表面へ再結合するのを防ぐ。これらのＴ細胞上のテトラマー染色の強度は、洗浄後の様々な時点：０時間、１時間、２時間の時点で決定される。テトラマー染色が急速に失われるならば、このことは、ＴＣＲが、テトラマーのＭＨＣ−ペプチドリガンドに対して低い結合活性しか有していないことを示している。テトラマー結合が経時的により安定であるならば、このことは、ＭＨＣ−ペプチドリガンドに対してのより高いＴＣＲ結合活性を示す。これら２つのバルク培養物の比較において、もとのテトラマー−結合細胞（１．７％対８．３％）の２０％のみが、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来する細胞において２時間後に依然としてテトラマー＋であることが発見された。これに対して、これらの細胞の７５％が、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＴ細胞において２時間後に依然としてテトラマー＋であった（６０．５％対８０．６％）。
【００７３】
テトラマー結合の特異性が、サイトメガロウイルスに由来するペプチドを提示するＨＬＡ−Ｂ７分子からなるテトラマー（Ｐｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって提供されたＢ７−ＣＭＶテトラマー）を用いて決定された。バルクＴ細胞培養物はどちらも、低レベルの染色（０．３〜０．４％）しか示さなかった。
【００７４】
これに加えて、ＨＬＡ−Ａ２−ＣＭＶペプチドテトラマーも用いられた。ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＴ細胞の０．４％のみが、このテトラマーを結合させたが、一方で、第二ドナーからのバルクＴ細胞の１２．７％が陽性であった。これらのＴ細胞は、これらが提示するペプチドとは関わりなく、アロ抗原としてＨＬＡ−Ａ２分子を認識するＴＣＲを有するＴ細胞を表わす可能性がある。テトラマー結合の強度は、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼ−テトラマー結合の強度（ＭＦＩ＝３２４８．７７）と比較して低かった（ＭＦＩ＝１６６．９８）。
【００７５】
これらの結果は、テトラマー染色の強度として規定されるようなより高い結合活性およびより遅いテトラマーオフレートを有するＴＣＲを担っているＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＤＣを用いて、これらの培養物に由来することを実証しており、同種異系−ペプチドリガンドを用いて、非負選択されたＴ細胞レパートリーにおいて応答を誘発する優位性を実証している。
【００７６】
図１５．特異性、Ｔ細胞受容体結合活性、および機能についてのＴ細胞クローンの評価
単一細胞培養実験から、２つのクローンがさらなる特徴決定のために選択された。１つのクローン（ＰＳ Ｐ４Ｄ１１）がＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーに由来し、１つのクローン（ＳＷ Ｐ１２Ｂ１０）がＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来した。
【００７７】
ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＰＳ Ｐ４Ｄ１１クローンは、１時間および２時間の時点で測定された時の急速なテトラマー放出をともなって、テトラマー染色の中間的強度（ＭＦＩ＝１６６．９８）を示した。このＴ細胞クローンは、特異的ペプチドが負荷されたＴ２細胞（コネチカット州ニューヘブン、イエール大学のＰｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌによって提供されたＴ２細胞）でのインキュベーション後も、ＨＬＡ−Ａ２およびチロシナーゼを発現する腫瘍細胞（Ｍｅｌ ６２４．３８およびＭｅｌ ＩＬ−２）での刺激後も、インターフェロン−ガンマを分泌するよう刺激することはできなかった。しかしながらこれは、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋黒色腫腫瘍細胞を殺すことはできるが、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ−腫瘍細胞を殺すことはできず、ＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼリガンドについてのその特異性を実証した。
【００７８】
ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーに由来するＳＷ Ｐ１２Ｂ１０クローンは、テトラマー結合のより高い強度（ＭＦＩ＝１００９．０４）を示し、テトラマー結合の安定性は、２時間後にテトラマー対して依然として陽性である細胞のすべての場合により高かった。このクローンは、チロシナーゼ由来ペプチドが負荷されたＴ２細胞での刺激後に特異的インターフェロン−ガンマ放出を示したが、ペプチドをともなわないＴ２細胞に対しては可能ではなく、ペプチド特異性を実証した。これはまた、ＨＬＡ−Ａ２＋チロシナーゼ＋黒色腫腫瘍細胞での刺激後インターフェロン−ガンマを放出するように刺激することもできたが、ＨＬＡ−Ａ２陰性、チロシナーゼ陽性黒色腫細胞（ＳＫ Ｍｅｌ ２８）に対して、またはＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陰性黒色腫腫瘍細胞（Ｍｅｌ Ａ３７５）に対しては可能ではなかった。このパターンは、このクローンがＨＬＡ−Ａ２−チロシナーゼペプチドに特異的であることを実証した。このクローンはまた、ＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陽性黒色腫腫瘍細胞を殺すこともできたが、ＨＬＡ−Ａ２陽性、チロシナーゼ陰性腫瘍細胞を殺すことができなかった。
【００７９】
これらの結果は、これら２つの異なる初回抗原刺激培養物に由来するＴ細胞クローンが、テトラマー結合の強度およびテトラマーオフレートによって検出された場合、ＴＣＲ結合活性に関して差を示し、アロ制限ペプチド−特異的Ｔ細胞クローンが、この定義によってより高い結合活性のＴＣＲを有することを示している。さらにはこのＴ細胞クローンが機能的優位性を示したが、それは、これが黒色腫細胞を特異的に殺すことができるだけでなく、ペプチド刺激後、および腫瘍細胞での刺激後、ＨＬＡ−Ａ２、チロシナーゼ特異的にインターフェロン−ガンマを分泌するように活性化することもできたからである。
【００８０】
材料および方法
接着性腫瘍細胞株、Ｍｅｌ Ａ３７５、Ｍｅｌ ＩＬ−２、Ｍｅｌ ６２４．３８、およびＳＫ Ｍｅｌ ２８
これらのヒト黒色腫細胞株が、１２％ウシ胎児血清、１×非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭナトリウムピルベートが補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコ中の培地の容積は、１０ｍＬであった。ほぼ３〜４日毎に、細胞は密集成長した。個々の細胞株の成長率に応じて、これらは１：２〜１：１０に分けられた。培地が除去され、細胞はＰＢＳで一回洗浄され、ついで２ｍＬトリプシン／ＥＤＴＡ２×で３分間、室温でインキュベーションされた。脱離細胞が、新鮮なＲＰＭＩ １６４０培地＋補足物中に再縣濁された。
【００８１】
Ｔ細胞クローン、ＪＢ４、およびＴｙｒ−Ｆ８
Ｔ細胞クローンがまず、標準的再刺激培養物中で拡張された。大きい保存材料（ｓｔｏｃｋ）がアリコートされて冷凍された。実験に必要とされる度に、Ｔ細胞は保存材料から取られて解凍され、２４−ウエルプレートのウエル中に入れられ、標準化されたプロトコルにしたがって再刺激された。
【００８２】
縣濁腫瘍細胞株、Ｔ２、Ｋ５６２、およびＫ５６２−Ａ２細胞
Ｔ２、Ｋ５６２、およびＫ５６２−Ａ２が、１２％ＦＢＳ、１×ＭＥＭ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭナトリウムピルベートが補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。中程度のサイズの培養フラスコにおいてこの培地の容積は１０ｍＬであった。ほぼ４日毎に、この細胞縣濁液の３／４が除去され、同じ容積の新鮮な培地が添加された。Ｋ５６２−Ａ２細胞について、この培地は、１ｍｇ／ｍＬの選択抗生物質Ｇ４１８が補足された。
【００８３】
ＤＣ生成および培養
ドナーからのＰＢＭＣが、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。ＰＢＭＣは、Ｔ７５培養フラスコ１あたり７．５×１０６細胞で１％自家血漿が補足されたＲＰＭＩ １６４０培地中に再縣濁された。これらのフラスコは３７℃および５％ＣＯ２で１時間インキュベーションされた。非接着性細胞が注意深く洗い流された。接着性単球が、１％自家血漿、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、および８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地の１フラスコあたり１０ｍＬ中に培養された。３日間の培養後、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が再び添加された。培養の６日目に、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１β、９ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−６、９ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α、および１ｍＬあたり２μＭ ＰＧＥ２が、成熟を誘発するために未成熟ＤＣへ添加された。成熟ＤＣが、培養の８日目に収穫された。
【００８４】
フローサイトメトリー
選択された分子の細胞発現を測定するために、フローサイトメトリーが用いられた。これらの分子は、蛍光染料へ付着されたモノクローナル抗体で特異的に染色される。フローサイトメトリー分析は、蛍光−活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ（商標））において実施された。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）において、染色された細胞の縣濁液がノズルを強制的に通され、１つずつ間隔をあけて配置された細胞を含有する液体の細い流れを生じた。各細胞がレーザービームを通過する時、これはレーザー光を散乱させ、この細胞と関連した蛍光分子が励起された。感受性光電倍増管が、細胞のサイズおよび粒度についての情報を与える両方の散乱光、および標識されたモノクローナル抗体の結合、および従って各細胞による標的分子の発現についての情報を与える蛍光発光を検出した。該細胞のソートのために、ＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）が、２５，０００事象（ｅｖｅｎｔｓ）／ｓおよび最大１ｐｓｉで用いられた。
【００８５】
細胞表面分子の直接染色
表面上のＨＬＡ−Ａ２分子の発現を測定するために、ハイブリドーマ上澄み液ＨＢ８２（メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）のＡＴＣＣ）、およびＰＥ（フィコエリトリン）と共役された二次ヤギ抗マウス抗体が、細胞表面上の直接染色のために用いられた。約１×１０５ＤＣ、Ｋ５６２、またはＫ５６２−Ａ２細胞が、１回洗浄された。各洗浄工程は、６００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の細胞の再縣濁、３００×ｇで４分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、５０μＬのＨＢ８２がこれらのペレットへ別々に添加された。氷上の３０分のインキュベーション時間後、細胞は１回洗浄された。ついで０．５μＬの二次抗体（１／１００希釈；５０μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．５μＬ抗体）が、これらのペレットへ別々に添加された。氷上および暗室での３０分のインキュベーション時間後、細胞は１回洗浄された。最後に、細胞は２００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
【００８６】
細胞内分子の間接染色
ＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＣの内部のチロシナーゼの発現を測定するために、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞がまず固定された。固定後、これらの細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％および０．２５％サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）を用いて透過性化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓｅ）された。簡単に言えば、約３×１０５細胞が１回洗浄された。各洗浄工程は、５００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中、またはＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％サポニン中の細胞の再縣濁、３００×ｇで４分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。洗浄後、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液（固定培地）中の５００μＬの１％パラホルムアルデヒドがこれらのペレットへ添加され、静かに混合された。氷上の３０分のインキュベーション時間後、細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液で２回洗浄された。これらの細胞を５００μＬのＦＡＣＳ（商標）緩衝液中に４℃で７日まで保存することが可能であった。これらのペレットは、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中５００μＬの０．１％サポニンで１回洗浄された。その後、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液（透過性化培地）中の５０μＬの０．２５％サポニン、および５μＬのチロシナーゼ特異的一次抗体が、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温で１時間のインキュベーション後、細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の０．１％サポニンで1回洗浄され、ついでＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の５０μＬの０．２５％サポニン中一
次抗体（１／１００希釈）について特異的なＣｙ５−共役二次抗体０．５μＬが、ペレットへ添加され、静かに混合された。室温および暗室での３０分のインキュベーション後、これらの細胞は、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の５００μＬの０．１％サポニンで洗浄された。最後に、ペレット化された細胞が、ＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の２００μＬの０．１％サポニン中に再縣濁され、フローサイトメトリー分析が実施された。
【００８７】
テトラマー染色およびテトラマーオフレート
ＨＬＡ−Ａ２−制限チロシナーゼ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の結合活性を評価するため、およびＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）でのソートを実施するために、これらのＴ細胞が、ＰＥ−標識Ａ*０２０１／ｈｔｙｒ３
６９−３７７／Ｈβ２ｍテトラマー（Ｐｒｏｆ．Ｄ．Ｂｕｓｃｈによって供給された）で染色された。これらの細胞は２回洗浄された。各洗浄工程は、冷ＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の細胞の再縣濁、３００×ｇで５分間の遠心分離、および上澄み液の廃棄を包含していた。インキュベーション容積は細胞数に依存している。１０６までの細胞が、５０μＬ中２５分、ＰＥ−標識テトラマーで、氷上で暗室においてインキュベーションされた（１／２５希釈、５０μＬＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の２μＬテトラマー）。ＨＬＡ−Ａ２−制限チロシナーゼ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のソートのために、５×１０６細胞までが、１００μＬＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中の６μＬ Ａ２／ペプチドテトラマーでインキュベーションされた。次いで、さらに２５分間、１／５０の比においてＣＤ８−ＡＰＣ抗体（米国フランクリンレイクスのＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ））が添加された。染色後、これらの細胞は２回洗浄され、最後にＦＡＣＳ（商標）緩衝液中の１％パラホルムアルデヒドで固定され、フローサイトメトリーＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（カリフォルニア州マウンテンビューのベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））によって分析されるか、またはＭｏＦｌｏ（商標）高性能細胞ソーター（米国コロラド州フォートコリンズのダコ）においてテトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のソートのためにＰＢＳ＋０．５％ヒト血清中に希釈された。
【００８８】
テトラマーオフレートアッセイのために、洗浄後、脱離テトラマーの再結合は、飽和量のハイブリドーマ上澄み液ＨＢ８２（メリーランド州ベセスダのＡＴＣＣ）でのインキュベーションによって防がれた。これは、複合ペプチドとは独立してＨＬＡ−Ａ２を結合する。時間間隔を増加した後、サンプルが採取されて固定され、テトラマー染色の強度についてフローサイトメトリーによって分析された。
【００８９】
単一種ｃＲＮＡの生産
ここではｃＲＮＡと呼ばれる、単一種試験管内転写ＲＮＡの生産は、４つの工程を含んでいた。すなわち、ｃＤＮＡ挿入断片を含有するプラスミドの線形化、プロモーター配列および線形化されたプラスミド中のｃＤＮＡテンプレートに基づく試験管内転写、合成ｃＲＮＡのポリアデニル化、およびｃＲＮＡ精製である。実質量のｃＤＮＡテンプレート、すなわちプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）が試験管内転写反応に必要とされるので、このプラスミドは、コンピテント細菌中で増幅されなければならなかった。
【００９０】
プラスミドＤＮＡでのコンピテント細菌の形質転換
他の基から親切な贈り物（ｋｉｎｄ ｇｉｆｔ）として受け取られる、より多量のｐＤＮＡを得るために、コンピテント細菌は該ｐＤＮＡで形質転換されて拡張されなければならなかった。一回大量トップ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ）１０Ｆ’コンピテント細胞の５０μＬガラス瓶が、融解しつつある氷上でゆっくりと霜取りされ、小さい容積のｐＤＮＡが添加され、静かに栓を抜く（ｔａｐ）ことによって細菌と混合された。これらの細胞は、氷上で３０分間インキュベーションされ、次いで４２℃で正確に３０秒間加熱され、最後に氷上に載せられて２分間冷却された。コンピテント細胞とともに供給されたリッチなＳＯＣ培地が添加され、形質転換された細菌が、適切な選択抗生物質とともにＬＢ培地寒天プレート上に培養された。プレートが細菌インキュベーター中に３７℃で一晩入れられた。抗生物質ゼオシンが光感受性であり、その活性は高い塩濃度によって阻害されるので、ｐＺｅｏＳＶ２＋／ｈｕＴｙｒで形質転換された細菌用のプレートは低塩ＬＢ寒天培地を含有し、暗室に保存された。
【００９１】
形質転換細菌の選択および拡張
抗生物質への耐性をエンコードする、ｐＤＮＡで形質転換された細菌のみが、寒天培地中の対応抗生物質の存在にもかかわらず、選択プレート上で成長してコロニーを形成することができた。一晩の成長後、コロニーは、滅菌つま楊枝を用いてこれらのプレートから引き出された。各々の個々のコロニーは、１５ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管において、適切な抗生物質を含有する５ｍＬのＬＢ培地中に接種された。予め選択され、凍結された形質転換細菌が拡張されることになるならば、凍結ガラス瓶が、−８０℃フリーザーから、融解しつつある氷上へ移された。約５μＬの一部解凍された細菌縣濁液が、次いで、適切な抗生物質とともに５ｍＬのＬＢ培地を収容している１５ｍＬファルコン管に移された。これらの管は、一晩（約１２時間）３７℃で激しい振とうをともなって、１５０ｒｐｍで、形質転換された細菌の効率的な成長のためにインキュベーションされた。
【００９２】
形質転換細菌の凍結
細菌は、凍結培地が１５％のグリセリンを含有するならば、凍結プロセスによって害されることが最も少ない。したがって４００μＬの一晩細菌縣濁液が、８４μＬのオートクレーブされた８７％グリセリンへ添加され、渦巻き撹拌され、液体窒素中に急速凍結され、−８０℃へ移された。
【００９３】
形質転換細菌からのプラスミドＤＮＡ抽出
一晩の培養後、細菌縣濁液が、５３００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離された。細菌細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出が、ＱＩＡｗｅｌｌ（登録商標）８ウルトラプラスミドキットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ペレット化された細胞が溶解された。溶解物中の塩およびｐＨ条件が、ＤＮＡのこの膜への独占的結合を保証したが、一方、分解されたＲＮＡおよび細胞タンパク質は保持されなかった。この膜はついで、あらゆる核酸結合タンパク質およびｐＤＮＡからの他の残留汚染物質の除去を可能にする、あらゆるＤＮＡ−タンパク質相互作用を乱す緩衝液で洗浄された。追加の洗浄工程は、塩および他の非−ＤＮＡ成分を除去した。精製ｐＤＮＡは最終的にトリス緩衝液中に溶出された。抽出ｐＤＮＡの収率は、プラスミドに応じて、５ｍＬの一晩細菌培養あたり４〜８μｇであった。
【００９４】
ｃＲＮＡ中への単一種ｃＤＮＡの試験管内転写
各プラスミドが、試験管内転写に適したテンプレートを生産するために、適切な制限酵素で線形化された。すべてのプラスミドが、所望のタンパク質をエンコードするｃＤＮＡの５’末端においてＴ７プロモーターを含有するので、転写は、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（商標）Ｔ７キットからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて製造業者の指示に従って実施された。ＲＮＡ分子の安定性、およびタンパク質中への翻訳用テンプレートとしてのその効率的な使用は、その５’末端におけるキャップおよび３’末端におけるポリ（Ａ）テイルの存在に依存している。ポリ（Ａ）テイルは常に、細胞によって合成されたｍＲＮＡ分子の一部である。従って、上述された全細胞ｍＲＮＡ増幅手順は、試験管内転写反応においてキャップ類似体の添加のみを含んでいた。しかしながら、プラスミド中のｃＤＮＡを用いて生産された単一種ｃＲＮＡは、テイルが構成体においてエンコードされるか否かに応じて、ポリ（Ａ）テイルを含有してもよいし含有しなくてもよい。試験管内転写反応における５’末端でのキャップ類似体の統合に加えて、チロシナーゼ、ＨＬＡ−Ａ２ ｃＲＮＡは、ポリ（Ａ）テイリングキットを用いて３’末端においてポリアデニル化された。両方の反応は、製造業者によって提案された条件下で実施された。試験管内転写およびｃＲＮＡ精製後、ｃＲＮＡの測定された収率は、１００μＬのポリアデニル化反応混合物あたり６０〜７０μｇであった。
【００９５】
ｃＲＮＡの精製
増幅された全細胞ｃＤＮＡまたはプラスミド中の単一種ｃＤＮＡのどちらかをテンプレートとして用いて、試験管内転写反応において得られたｃＲＮＡの精製は、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて、製造業者の指示にしたがって実施された。精製のために、この手順は、試験管内転写反応混合物のＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム上への転移から開始された。ＲＮＡはＤＥＰＣ水中に溶出され、アリコートが−８０℃で保存された。
【００９６】
ＤＣ中へのＲＮＡトランスフェクション
細胞血漿膜は、細胞の分子内容物をその外部環境から分離するという生命維持機能を果たしている。これらの膜は、高度に絶縁性の二層中に自己集合する両親媒性脂質から大部分なっている。可能な限り多くの抗原を捕獲しようとして、未成熟ＤＣは、ＲＮＡを包含する、これらの周囲からの様々な構造（サイズが小さい分子から、アポトーシス体までの範囲のもの）を取り上げることが周知である。これらは、マクロ飲作用およびエンドサイトーシスを通して可能である。ＲＮＡとの単純ＤＣコインキュベーションは、Ｔ細胞初回抗原刺激を達成することが証明されてはいるが、より攻撃的な方法、例えばリポフェクションおよびエレクトロポレーションは、より良好なトランスフェクション方法であることが証明された。
【００９７】
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションは、細胞が、強い外部電場の短いパルスへ暴露された時、血漿膜の可逆性透過性を誘発する。親水性細孔の形成は、二層膜中の脂質の再配向の結果である。この現象の分子メカニズムは依然としてよく理解されていない。細孔数およびこれらの直径は、パルス振幅およびパルス持続時間の積とともに増加する。小さい分子が、これらの細孔を通って細胞質中に単純に拡散するが、より大きい分子、例えば核酸は、電気泳動力によって細胞中に駆動される。核酸の存在が細孔形成を促進することも証明されている。細孔は、電場への暴露の１マイクロ秒以内に現われるが、これらが再閉するには数分かかる。
【００９８】
最初に、２〜３×１０６ＤＣまたはＫ５６２細胞が、少なくとも１７０μＬ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ培地中に再縣濁され、０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベット中に入れられ、氷上で約３分間インキュベーションされた。エレクトロポレーション前の縣濁液の冷却は有利であるが、その理由は、これが細胞代謝を遅くしたからである。これによって電気による過熱が避けられた。さらには電気ショックによって、および死んだ細胞から放出された分子によって引起こされた損傷が最小限にされた。その後、１００μＬ以下のＤＥＰＣ水中に再縣濁されたＲＮＡが添加され、２７０μＬの総エレクトロポレーション縣濁液容積を生じた。この縣濁液は、ピペットによって短時間混合され、ついで急速にエレクトロポレーションされた。エレクトロポレーションは、２５０Ｖおよび１５０μＦで実施された。エレクトロポレーションの直後に、細胞が、２％自家血漿、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦ、および８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中に移された。これらの細胞が計数され、縣濁液が、ＦＡＣＳ（商標）分析、ＲＮＡ単離、または機能的アッセイのために迅速にアリコートされ、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター中に入れられた。
【００９９】
機能的アッセイ
機能的アッセイにおいて、ＲＮＡ−トランスフェクションされたＤＣまたはＫ５６２細胞、ペプチド−パルスされたＤＣまたは腫瘍細胞が、促進剤として役立った。抗原特異的ＣＴＬクローンが、エフェクターとして役立った。促進剤の刺激能力を測定するために、ＤＣまたは他の細胞がまず、Ｔ細胞とともにコインキュベーションされ、これらは収穫され、解凍および再刺激の８〜１４日後にコインキュベーション培養において用いられた。活性化されたＴ細胞によって分泌されたＩＦＮ−γの量が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において測定された。
【０１００】
Ｔ細胞とのペプチド−パルスされたＴ２細胞コインキュベーション
Ｔ２細胞のＣＴＬとのコインキュベーションのために、より低い細胞数が利用された。外因性ペプチドパルシングのために、１×１０６Ｔ２細胞が、１０μｇ／ｍＬ ＹＭＤチロシナーゼペプチド（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、ミュンヘンＬＭＵのジーンセンター）および１０μｇ／ｍＬヒトβ２−マイクログロブリン（米国サンディエゴのカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））でインキュベーションされた。２０分毎に細胞縣濁液が振とうされた。３７℃、５％ＣＯ２での２時間のインキュベーション後、細胞縣濁液が、非結合ペプチドを除去するために１回洗浄された。１００μＬのペプチド−パルスされたＴ２縣濁液（１２％ＦＣＳが補足されたＲＰＭＩ １６４０中の１×１０４細胞）が、１００μＬのＣＴＬ縣濁液（１５％ヒト血清が補足されたＣＴＬ培地中の２×１０３細胞）とコインキュベーションされ、５：１の促進剤対エフェクター比を生じた。
【０１０１】
エフェクターおよび促進剤の２４時間のコインキュベーション後、１５０μＬの各上澄み液が収穫され、−２０℃で保存された。上澄み液が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において分析された。
【０１０２】
Ｔ細胞とのＤＣもしくはＫ５６２コインキュベーション
エレクトロポレーションの１２時間もしくは2４時間後、１００μＬのＴ細胞縣濁液（コインキュベーション培地中２×１０４細胞）が、１００μＬのトランスフェクションされた細胞縣濁液（２％自家血漿および８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中の２×１０４または４×１０４細胞）へ添加され、９６ウエルプレートの１ウエルあたり全部で２００μＬ、および１：４、１：２、１：１、２：１、または４：１の促進剤対エフェクター比を生じた。
【０１０３】
非トランスフェクションＤＣが、１０μＬのペプチド溶液（１００μＬ／ｍＬ）を１００μＬのＤＣ縣濁液（２％自家血漿および８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ−ＣＳＦおよび８００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−４が補足された樹状細胞培地中の４×１０４細胞）へ添加することによって、ペプチドで外因的にパルスされた。３７℃および５％ＣＯ２での２時間のインキュベーション後、１００μＬのＣＴＬ縣濁液（ＣＴＬコインキュベーション培地中の２×１０４細胞）が添加され、２：１の促進剤対エフェクター比を生じた。エフェクターおよび促進剤の２４時間のコインキュベーション後、１５０μＬの各上澄み液が収穫され、−２０℃で保存された。
【０１０４】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＡ
共培養上澄み液中のＩＦＮ−γの測定が、ＥＬＩＳＡにおいてＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＩＦＮ−γセットを用いて、製造業者の指示に従って実施された。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートは、マウス抗−ＩＦＮ−γ捕獲抗体でコーティングされ、次いでＦＢＳ−含有溶液で遮断された。いくつかの事例では、上澄み液は、コインキュベーション培地中において１：２．５で希釈された。同じ培地が、ＩＦＮ−γ標準の連続希釈液を作るために用いられた。細胞培養上澄み液または標準溶液からのＩＦＮ−γが、これらのプレート中の捕獲抗体へ結合された後、ビオチチニル化マウス抗−ＩＦＮ−γ検出抗体が、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼへ共役されたアビジンとともに添加された。捕獲抗体からなる複合体を視覚化するために、ＩＦＮ−γ、検出抗体、ビオチン、アビジン、およびホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼのための基質）が、テトラメチルベンジジン（基質試薬ＡおよびＢミックス）とともに添加され、溶液の色彩を青色に変えた。酵素反応が、１Ｍオルト−リン酸で停止された。これによって、溶液の色彩が黄色に変わり、その強度は、処理された基質の量に正比例した。すなわち捕獲されたＩＦＮ−γの量に間接的に比例した。反応溶液中の光吸収が、４５０ｎｍで測定された。不明なＩＦＮ−γ濃度が、ＩＦＮ−γ標準の公知濃度および対応測定吸光度に基づいて描かれた標準曲線の助けを借りて計算された。
【０１０５】
細胞傷害性アッセイ
それぞれテトラマー＋ＣＤ８＋ソートされたバルク細胞株およびＴ細胞クローンの細胞溶解活性が、標準４時間クロム放出アッセイにおいて分析された。これら２つのＨＬＡ−マッチされた黒色腫細胞株Ｍｅｌ Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ２−陽性、チロシナーゼ−陰性）およびＭｅｌ ＩＬ−２（ＨＬＡ−Ａ２−陽性、チロシナーゼ−陽性）が用いられた。簡単に言えば、１０６標的黒色腫細胞が、２００μＣｉ５１Ｃｒで１〜１．５時間標識された。５１Ｃｒ−標識された標的細胞が、Ｖ底９６ウエル組織培養プレート（ドイツ国ゾリンゲンのグライナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｓｏｌｉｎｇｅｎ））において１００μＬ／ウエルの１２％のＦＣＳを有するＲＰＭＩ １６４０中でＴ細胞とともに培養された。ＣＴＬ−媒介溶解の有効性を評価するために、Ｔ細胞は連続的に希釈され、ついで段階的エフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を生じるために１０３標的細胞／ウエルと共培養された。３７℃で４時間の共培養後、５０μＬの上澄み液が収集され、放射能がガンマカウンターで測定された。特異的溶解のパーセンテージは、１００×（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）として計算された。自然放出は、エフェクター細胞の不存在下に標的細胞をインキュベーションすることによって評価され、一般に１４％未満であった。
【０１０６】
参照
Becker, C, Pohla, H., Frankenberger, B., Assenmacher, M., Schendel, D.J. and Th. Blankenstein. 2001. Adoptive tumor therapy with T lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162.
Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Robbins, P. F., Yang, J. C., Hwu, P., Schwartzentruber, D. J., Topalian, S. L., Sherry, R., Restifo, N. P., Hubicki, A. M., Robinson, M. R., Raffeld, M., Duray, P., Seipp, C. A., Rogers-Freezer, L., Morton, K. E., Mavroukakis, S. A., White, D. E., Rosenberg, S. A. (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonalrepopulation with antitumor lymphocytes. Science 298:850-854.
Dudley, M.E. and Rosenberg, S.A.(2003). Adoptive-cell-transfer therapy for the treatment of patients with cancer. Nature Reviews Cancer 3: 666-675.
Engels, B., Nossner, E., Frankenberger, B., Blankenstein, Th., Schendel, D. J., and W. Uckert. 2005. Redirecting human T lymphocytes towards renal cell carcinoma-specificity by retroviral transfer of T cell receptor genes. Human Gene Then, 16(7). -79.9-810
FaIk, C. S. and Schendel, D. J. (2002). Allogeneic MHC class I ligandsand their role in positive and negative regulation of human cytotoxiceffector cells. Human Immunol. 63:8-19.
Gao, L., Bellantuono, I., Elsasser, A., Marley, S. B., Gordon, M. Y., Goldmann, J. M., Stauss, H. J. (2000). Selective elimination of leukemic CD34+ progenitor cells by cytotoxicT lymphocytes specific for WTl . Blood 95: 2198-2203.
Gao, L., Yang, T. H., Tourdot, S., Sadovnikova, E., Hasserjian, R. and Stauss H. J. (1999). AlIo- major-histocompatibility complex restricted cytotoxic T lymphocytes engraft in bone marrow transplant recipients without causing graft- versus-host disease. Blood 94: 2999-3006.
Geiger, C, Regn, S., Noessner, E., Wilde, S., Frankenberger, B., Papier, B., Pohla, H., and D.J. Schendel. 2005. Development of a generic RNA-pulsed dendriticcell vaccine for renal cell carcinoma, J. Translational Medicine in press.
Gilboa-E and J. Viewig. 2004. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendriticcells. Immunol. Rev. 199:251-63.
KoIb, H. J., Schmid, C, Barrett, A. J. and Schendel, D. J. (2004). Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras. Blood 103:767-776.
KoIb, H.J., Schattenberg, A., Goldman, J.M., Hertenstein, B., Jacobsen, H., ArceseW., Ljungman, P., Ferrant, A., Verdonck, L. Niederwieser, B. et al. 1995. Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusions in marrow grafted patients. Blood 86:2041.
Levings, M.K. and M.G. Roncarolo. 2005. Phenotypic and functional differences between human CD4+CD25+ and type 1 regulatory T cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 293:303-326.
Liao, X., Yongging, L., Bonini, C, Nair, S., Gilboa, E., Greenberg, P. D., Yee, C. (2004). Transfection of RNA encoding tumor antigens following maturation of dendritic cells leads to prolonged presentation of antigen and the generation of high-affinity tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes. MoI. Ther. 9: 757-764.
Nair, S. K., Boczkowski, D., Morse, M., Cumming, R.I., Lyerly, H. K. and Gilboa, E. (1998). Induction of primary carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes in vitro using human dendritic cells transfectedwith RNA. Nat. Biotechnol. 16(4): 364-369.
Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Salllusto, F. and A. Lanzavecchia. 2005. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type-1 polarizing programme in dendritic cells. Nat. Immunol. 6(8): 769-76.
Regn, S., Chen, X., Schendel, D., KoIb, H.-J. and M.A. Roskrow. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T lymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64.
Schaft, N, Dorrie, J., Thuman, P., Beck, V. E., Muller, I., Schultz, E. S., Kampgen, E., Dieckmann, D. and Schuler, G. 2005. Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfectingdefined RNA after rather than before maturation. J. Immunol. 174(5): 3087-97.
Schendel, D. J., Wank, R. and B. Dupont. 1979. Standardization of the human in vitro cell-mediated lympholysis technique. Tissue Antigens 13: 112-120.
Schendel, D. J., Maget, B., FaIk, C. S. and R. Wank. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. In: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) pp 670-690, Academic Press Ltd., London.
Su, Z., Peluso, M. V., Raffegerst, S. H., Schendel, D. J., and M. A. Roskrow. 2001. LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes for the treatment of patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease. Eur. J. Immunol. 31: 947-958.
Su, Z., Peluso, M. V., Raffergerst, S. H., Schendel, D. J. and Roskrow, M. 2002. Antigen presenting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specif[iota]c cytotoxic T lymphocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-62.
Toes, R. E., Schoenberger, S. P., van der Voort, E. I., Offringa, R. and Melief, C. J. 1998. CD40- CD40Ligand interactions and their role in cytotoxic T lymphocyte priming and anti-tumor immunity. Semin. Immunol. 10(6): 443-8.
Yee, C, Savage, P. A., Lee, P. P., Davis, M. M. and P. D. Greenberg. 1999. Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogenouspopulations using peptide-MHC-tetramers. J. Immunol. 162(4): 2227-34.
更なる参照
Belinda Palermo, Silvia Garbelli, StefaniaMantovani, Elisabetta Scoccia, Gian Antonio Da Prada, Paola Bernabei, M. Antonietta Avanzini, Valeria Brazzelli, Giovanni Borroni and Claudia Giachino(2005). Qualitative difference between the cytotoxicT lymphocyte responses to melanocyte antigens in melanoma and vitiligo. Eur. J. Immunol. 35: 3153-3162.
Cassian Yee, Peter A. Savage, Peter P. Lee, Mark M. Davis, and Philip D. Greenberg (1999). Isolation of High Avidity Melanoma-Reactive CTL from Heterogeneous Populations Using Peptide-MHC Tetramers. The Journal of Immunology: 2227-2234.
Matthias Wolfl, Stefan Schalk, Martin Hellmich, Katharina M. Huster, Dirk H. Busch, and Frank Berthold(2004). Quantitation of MHC Tetramer-Positive Cells From Whole Blood: Evaluation of a Single-Platform, Six-Parameter Flow Cytometric Method. Wiley-Liss, Inc. Cytometry Part A 57A: 120-130.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程
を含む方法によって得られる抗原特異的Ｔ細胞。
【請求項２】
エフェクター細胞特徴を有するＴ細胞、サイトカイン生産Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および調節Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
前記調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２に記載のＴ細胞。
【請求項４】
トランスジェニックＴＣＲをコードする核酸であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程、
ｅ）単離Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローン工程
を含む方法によって得られる核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
プラスミドまたはレトロウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載のベクターで形質転換されているＰＢＭＣ。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項２に記載の該Ｔ細胞、または請求項７に記載のＰＢＭＣ、および製薬的に許容可能な担体を含む製薬組成物。
【請求項９】
注入、注射、またはワクチンである、請求項８に記載の製薬組成物。
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程
を含む方法によって得られる抗原特異的Ｔ細胞。
【請求項２】
エフェクター細胞特徴を有するＴ細胞、サイトカイン生産Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および調節Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
前記調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２に記載のＴ細胞。
【請求項４】
トランスジェニックＴＣＲをコードする核酸であって、
ａ）患者由来ＭＨＣ分子をエンコードする核酸、および、抗原もしくは前記抗原をエンコードする核酸を準備する工程、
ｂ）工程ａ）において規定される両方の化合物を、健康なドナーに由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）中にコトランスフェクションするか、または導入する工程、
ｃ）健康なドナーに由来する末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、前記ＡＰＣで初回抗原刺激する工程、
ｄ）ＭＨＣ−抗原リガンドに特異的なＴ細胞を選択する工程、
ｅ）単離Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のクローン工程
を含む方法によって得られる核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
プラスミドまたはレトロウイルスベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載のベクターで形質転換されているＰＢＭＣ。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項２に記載の該Ｔ細胞、または請求項７に記載のＰＢＭＣ、および製薬的に許容可能な担体を含む製薬組成物。
【請求項９】
注入、注射、またはワクチンである、請求項８に記載の製薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２１３４０２（Ｐ２０１２−２１３４０２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５４４２０（Ｐ２０１２−１５４４２０）
【出願日】平成２４年７月１０日（２０１２．７．１０）
【分割の表示】特願２００８−５２４４５０（Ｐ２００８−５２４４５０）の分割
【原出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【出願人】（５９７１２１３８２）ヘルムホルツ ツェントラム ミュンヘン ドイチェス フォーシュングスツェントラム フュール ゲズントハイト ウント ウンヴェルト ゲーエムベーハー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＬＭＨＯＬＴＺ ＺＥＮＴＲＵＭ ＭＵＥＮＣＨＥＮ ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ ＦＵＥＲ ＧＥＳＵＮＤＨＥＩＴ ＵＮＤ ＵＭＷＥＬＴ ＧＭＢＨ
【出願人】（５０７３９３６６５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月１０日（２０１２．７．１０）
【分割の表示】特願２００８−５２４４５０（Ｐ２００８−５２４４５０）の分割
【原出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【出願人】（５９７１２１３８２）ヘルムホルツ ツェントラム ミュンヘン ドイチェス フォーシュングスツェントラム フュール ゲズントハイト ウント ウンヴェルト ゲーエムベーハー (4)
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＬＭＨＯＬＴＺ ＺＥＮＴＲＵＭ ＭＵＥＮＣＨＥＮ ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ ＦＵＥＲ ＧＥＳＵＮＤＨＥＩＴ ＵＮＤ ＵＭＷＥＬＴ ＧＭＢＨ
【出願人】（５０７３９３６６５）
【Ｆターム（参考）】
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