抗新生物製剤、及び抗新生物製剤の使用
【課題】新生物細胞に特異的に作用し、同時に正常細胞に対して保護的に作用する新薬の提供。
【解決手段】、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤。
【解決手段】、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の対象は、抗新生物製剤、及び抗新生物製剤の使用である。
【０００２】
ここ数年の化学療法、放射線療法及び免疫療法における著しい進歩にもかかわらず、有効な抗新生物療法の問題は、依然として、現在の医学における重大な課題である。疫学的調査により、先進国では、３人のうちの１人が、様々な新生物疾患に罹患していることが示されている。そのグループでは、４分の１の症例が致死的な症例である。治療で実際に使用されている細胞増殖抑制剤には、有効性を制限し、患者の生活の質を低下させる副作用発現の危険性がある。
【０００３】
従って、新生物細胞に特異的に作用し、同時に正常細胞に対して保護的に作用する新薬の開発は、特に緊急な課題である。
【０００４】
本発明の抗新生物製剤は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有することを特徴とする。
【０００５】
本発明の抗新生物製剤の使用は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤の、新生物疾患の予防における使用である。
【０００６】
また、本発明の抗新生物製剤の使用は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤の、転移抑制のための使用である。
【０００７】
本発明の製剤、及び製剤の使用は、新生物細胞の遊走の抑制を可能にするが、これは、転移抑制におけるＡＫＧの潜在的な役割を反映している。食事に添加された本発明の製剤は、新生物治療で使用される既存の方法を支援するネオアジュバントとしての役割を果たす。本発明の製剤は、抗新生物薬との相乗作用、及び正常細胞に対する同時保護作用を通じて、患者の生活の質を改善すると考えられる。
【０００８】
本発明の一実施方法として、本発明の製剤の作用及びその使用の例を示す。
【０００９】
新生物細胞の培養：
Ａ５４９：肺癌のヒト新生物細胞；Ｗｒｏｃｌａｗのポーランド科学アカデミー経験療法免疫学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から入手した連続継代性細胞系
ＨＴ−２９：大腸癌のヒト新生物細胞；Ｗｒｏｃｌａｗのポーランド科学アカデミー経験療法免疫学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から入手した連続継代性細胞系
Ｃ６：脳腫瘍（グリオーマ）のラット新生物細胞；フンボルト大学新生児科（ベルリン、ドイツ）から入手した連続継代性細胞系
【００１０】
培養の培地：
Ａ５４９系の細胞はＤＭＥＭ：Ｆ−１２ＨＡＭ（２：１）培地上で培養し、ＨＴ−２９及びＣ６細胞はＤＭＥＭ培地上で培養した。培養培地に、１０％動物胎児血清（ｆｏｅｔａｌ ｂｅａｓｔ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｉ．ｕ．／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加した。ＤＭＥＭ：Ｆ−１２ＨＡＭ培地及びＤＭＥＭ培地は、シグマ社（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）製であった。動物胎児血清（ＦＢＳ）は、ライフテクノロジーズ社（ライフテクノロジーズ、カールスルーエ、ドイツ）製であった。残りの試薬はシグマ社製であった。
【００１１】
細胞培養物の調製：
組織バンクにおいて液体窒素中に保存されていた細胞を３７℃で解凍し、次いで、然るべき培地の入ったプラスチックボトルに注ぎ入れた。それらを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。細胞増殖液を注ぎ出した後、細胞を、ＰＢＳ（カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含有しない。）で洗浄し、０．２５％トリプシン溶液＋ＥＤＴＡで処理して、実験に必要な細胞の懸濁液を得た。
【００１２】
細胞培養物におけるＡＫＧの抗増殖活性の評価：
培養培地中で予め調製した密度１×１０４細胞／ｍｌ（Ａ５４９）、４×１０４細胞／ｍｌ（ＨＴ−２９）及び０．５×１０４細胞／ｍｌ（Ｃ６）の細胞懸濁液を、平底の９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）に１穴当たり１００μｌ注ぎ入れた。細胞の固着後（２４時間後）、液体を注意深く除去し、次いで、様々な濃度のＡＫＧ及び試験対象の細胞増殖抑制剤（シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ）の溶液（１０％ＦＢＳを含有する。）（１００μｌ／穴）を添加した。プレート上の培養物を、９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベートした。被検物質の抗増殖活性は、ＭＴＴ法で評価した。
【００１３】
ＭＴＴ法（「細胞増殖キットＩＩＩ」（ベーリンガー・マンハイム）による）：
この方法は、細胞毒性物質及び抗増殖性物質の研究において細胞の増殖能力及び生存能力を判定するために実施した。代謝的に活性な細胞において、黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴは、ミトコンドリアの脱水酵素で青色のホルマザンに還元される。水に不溶のホルマザン結晶は細胞内に蓄積し、それらを溶解するためには、有機界面活性剤を使用して、膜を破壊し、同時に色素を溶解する必要がある。この目的のために、ｐＨ７．４のＳＤＳ−ＨＣｌバッファーが使用される。放出色素の濃度は、波長５７０ｎｍで、９６穴プレート用リーダーで定量的に評価される。色の強度は、生存細胞の量に正比例する。濃度５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ条件のＭＴＴ溶液を、プラスチックプレート上の各穴に１穴当たり１５μｌ添加した。プレートを、３７℃で３時間インキュベートした。その後、１００μｌ／穴のＳＤＳ−ＨＣｌバッファーを添加し、プレートを、３７℃で一晩放置した。結果は、翌日、Ｅ−ｍａｘ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア、米国）を用いて評価した。
【００１４】
「創傷（ｗｏｕｎｄ）アッセイ」法による細胞遊走度の評価：
この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の移動性に影響を及ぼす物質の活性を評価するためのものである。この方法は、創傷治癒、血管新生及び新生物転移の研究で使用される。
【００１５】
１０％血清（ＦＢＳ）を添加した培養培地に懸濁されたＣ６細胞（１×１０６）を、直径４ｃｍの培養プレート（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上に注ぎ入れた。翌日、細胞の均等な層に、自動ピペットの末端で傷（創傷）を作り、剥がれた細胞を、ＰＢＳ溶液でプレートを２回洗浄することにより除去した。次いで、培養培地に溶解したＡＫＧ（１０ｍＭ及び２０ｍＭ）を、調製した培養物に添加した。プレートを、９５％空気／５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培養物を、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｚａ法で着色させた。次いで、顕微鏡分析を、ソフトウェアａｎａｌｙＳＩＳ（登録商標）（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ、ミュンスター、ドイツ）を用いて、顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１（オリンパス光学工業株式会社、東京、日本）で行った。細胞遊走度は、細胞の層に先に作られた創傷に存在する細胞数として、サイトメトリーで評価した。８枚の写真上の少なくとも５０個の選択フィールドを評価した。
【００１６】
（結果）
ＡＫＧの抗増殖活性の評価：
培養物におけるＡＫＧの抗増殖活性を、様々な種類の新生物細胞、すなわち、肺癌細胞（Ａ５４９）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）及びグリオーマ細胞（Ｃ６）に関して評価した。細胞を、濃度０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭのＡＫＧで９６時間処理した。
【００１７】
被検物質は、すべての新生物細胞タイプに関して抗増殖活性を有していた（図１、図２、図３）。細胞増殖の統計的に有意な（４．５％）抑制は、Ａ５４９細胞系においてＡＫＧ濃度２．５ｍＭで観察された（対照群と比較）。その効果は、ＡＫＧの用量と相関していて、用量５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭで、それぞれ７．８％、１２．４％及び１７．５％であった（図１）。グリオーマ細胞（Ｃ６）における増殖抑制は、ＡＫＧ用量２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭで、それぞれ１２．６％、７．９％、１６％及び１９．８％であった。大腸癌細胞（ＨＴ−２９）の増殖抑制は、１〜１０ｍＭのＡＫＧ濃度で線形性を有していなかった。用量１ｍＭでは、細胞増殖が１１．８％抑制された。ほぼ同様の効果が、用量５ｍＭ（１１．８％）及び１０ｍＭ（１１．５％）で得られた。用量２０ｍＭにおいてのみ、これらの細胞の増殖の有意な（２５％）抑制が生じた（図３）。
【００１８】
ＡＫＧと抗新生物薬との相互作用の評価：
ＡＫＧと、癌化学療法で使用される周知の細胞増殖抑制剤と、の相互作用に関する検討を、肺癌細胞（Ａ５４９）の培養物で行った。その目的のために、３種の細胞増殖抑制剤、すなわち、シクロホスファミド（１．５ｍＭ）、イホスファミド（１．５ｍＭ）及びチオテパ（５μＭ）を単独で、又はＡＫＧ（５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭ）と組み合わせて用いて、細胞を処理した。使用した化学療法剤の細胞増殖抑制活性に対するＡＫＧの相加的効果が観察された（結果を図４、図５及び図６に示す）。濃度１．５ｍＭのシクロホスファミドは、Ａ５４９細胞の増殖を２１．４％抑制した。ＡＫＧの添加は、細胞増殖抑制活性を、それぞれ６．４％、９．８％及び１４．４％増加させた（図４）。イホスファミド（１．５ｍＭ）は、細胞増殖を７．３％抑制した。ＡＫＧ（５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭ）添加後、効果は、それぞれ５％、５．３％及び８．８％増加した（図５）。また、ＡＫＧは、チオテパ（５μＭ−２５．９％）の細胞増殖抑制活性を４．２％（５ｍＭ）、８％（１０ｍＭ）及び１１．２％（２０ｍＭ）増強した（結果を図６に示す）。
【００１９】
新生物細胞の遊走に対するＡＫＧの影響：
新生物細胞の移動性に関する検討を「創傷アッセイ」モデルで行った。写真１には、Ｃ６細胞の層の創傷（Ａ）、ＡＫＧ非存在下の２４時間のインキュベーション後の創傷への細胞の密集（Ｂ）、及びＡＫＧ２０ｍＭ存在下の細胞遊走の有意な抑制（Ｃ）が示されている。図７には、細胞の均一層に作られた傷の１フィールドへ遊走した細胞の平均数が示されている。１０ｍＭ及び２０ｍＭのＡＫＧ存在下の、細胞遊走の統計的に有意な抑制が示された。
【００２０】
統計解析：
統計解析は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＡＫＧで刺激した場合のＡ５４９細胞の増殖を示す。
【図２】ＡＫＧ存在下のＣ６細胞の増殖を示す。
【図３】ＡＫＧで刺激した場合のＨＴ−２９細胞の増殖を示す。
【図４】シクロホスファミド及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図５】イホスファミド及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図６】チオテパ及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図７】ＡＫＧによるＣ６細胞遊走の抑制を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の対象は、抗新生物製剤、及び抗新生物製剤の使用である。
【０００２】
ここ数年の化学療法、放射線療法及び免疫療法における著しい進歩にもかかわらず、有効な抗新生物療法の問題は、依然として、現在の医学における重大な課題である。疫学的調査により、先進国では、３人のうちの１人が、様々な新生物疾患に罹患していることが示されている。そのグループでは、４分の１の症例が致死的な症例である。治療で実際に使用されている細胞増殖抑制剤には、有効性を制限し、患者の生活の質を低下させる副作用発現の危険性がある。
【０００３】
従って、新生物細胞に特異的に作用し、同時に正常細胞に対して保護的に作用する新薬の開発は、特に緊急な課題である。
【０００４】
本発明の抗新生物製剤は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有することを特徴とする。
【０００５】
本発明の抗新生物製剤の使用は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤の、新生物疾患の予防における使用である。
【０００６】
また、本発明の抗新生物製剤の使用は、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する製剤の、転移抑制のための使用である。
【０００７】
本発明の製剤、及び製剤の使用は、新生物細胞の遊走の抑制を可能にするが、これは、転移抑制におけるＡＫＧの潜在的な役割を反映している。食事に添加された本発明の製剤は、新生物治療で使用される既存の方法を支援するネオアジュバントとしての役割を果たす。本発明の製剤は、抗新生物薬との相乗作用、及び正常細胞に対する同時保護作用を通じて、患者の生活の質を改善すると考えられる。
【０００８】
本発明の一実施方法として、本発明の製剤の作用及びその使用の例を示す。
【０００９】
新生物細胞の培養：
Ａ５４９：肺癌のヒト新生物細胞；Ｗｒｏｃｌａｗのポーランド科学アカデミー経験療法免疫学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から入手した連続継代性細胞系
ＨＴ−２９：大腸癌のヒト新生物細胞；Ｗｒｏｃｌａｗのポーランド科学アカデミー経験療法免疫学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐｏｌｉｓｈ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から入手した連続継代性細胞系
Ｃ６：脳腫瘍（グリオーマ）のラット新生物細胞；フンボルト大学新生児科（ベルリン、ドイツ）から入手した連続継代性細胞系
【００１０】
培養の培地：
Ａ５４９系の細胞はＤＭＥＭ：Ｆ−１２ＨＡＭ（２：１）培地上で培養し、ＨＴ−２９及びＣ６細胞はＤＭＥＭ培地上で培養した。培養培地に、１０％動物胎児血清（ｆｏｅｔａｌ ｂｅａｓｔ ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）、ペニシリン１００ｉ．ｕ．／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加した。ＤＭＥＭ：Ｆ−１２ＨＡＭ培地及びＤＭＥＭ培地は、シグマ社（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）製であった。動物胎児血清（ＦＢＳ）は、ライフテクノロジーズ社（ライフテクノロジーズ、カールスルーエ、ドイツ）製であった。残りの試薬はシグマ社製であった。
【００１１】
細胞培養物の調製：
組織バンクにおいて液体窒素中に保存されていた細胞を３７℃で解凍し、次いで、然るべき培地の入ったプラスチックボトルに注ぎ入れた。それらを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。細胞増殖液を注ぎ出した後、細胞を、ＰＢＳ（カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含有しない。）で洗浄し、０．２５％トリプシン溶液＋ＥＤＴＡで処理して、実験に必要な細胞の懸濁液を得た。
【００１２】
細胞培養物におけるＡＫＧの抗増殖活性の評価：
培養培地中で予め調製した密度１×１０４細胞／ｍｌ（Ａ５４９）、４×１０４細胞／ｍｌ（ＨＴ−２９）及び０．５×１０４細胞／ｍｌ（Ｃ６）の細胞懸濁液を、平底の９６穴マイクロプレート（ＮＵＮＣ社、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）に１穴当たり１００μｌ注ぎ入れた。細胞の固着後（２４時間後）、液体を注意深く除去し、次いで、様々な濃度のＡＫＧ及び試験対象の細胞増殖抑制剤（シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ）の溶液（１０％ＦＢＳを含有する。）（１００μｌ／穴）を添加した。プレート上の培養物を、９５％空気／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で９６時間インキュベートした。被検物質の抗増殖活性は、ＭＴＴ法で評価した。
【００１３】
ＭＴＴ法（「細胞増殖キットＩＩＩ」（ベーリンガー・マンハイム）による）：
この方法は、細胞毒性物質及び抗増殖性物質の研究において細胞の増殖能力及び生存能力を判定するために実施した。代謝的に活性な細胞において、黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴは、ミトコンドリアの脱水酵素で青色のホルマザンに還元される。水に不溶のホルマザン結晶は細胞内に蓄積し、それらを溶解するためには、有機界面活性剤を使用して、膜を破壊し、同時に色素を溶解する必要がある。この目的のために、ｐＨ７．４のＳＤＳ−ＨＣｌバッファーが使用される。放出色素の濃度は、波長５７０ｎｍで、９６穴プレート用リーダーで定量的に評価される。色の強度は、生存細胞の量に正比例する。濃度５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ条件のＭＴＴ溶液を、プラスチックプレート上の各穴に１穴当たり１５μｌ添加した。プレートを、３７℃で３時間インキュベートした。その後、１００μｌ／穴のＳＤＳ−ＨＣｌバッファーを添加し、プレートを、３７℃で一晩放置した。結果は、翌日、Ｅ−ｍａｘ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア、米国）を用いて評価した。
【００１４】
「創傷（ｗｏｕｎｄ）アッセイ」法による細胞遊走度の評価：
この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の移動性に影響を及ぼす物質の活性を評価するためのものである。この方法は、創傷治癒、血管新生及び新生物転移の研究で使用される。
【００１５】
１０％血清（ＦＢＳ）を添加した培養培地に懸濁されたＣ６細胞（１×１０６）を、直径４ｃｍの培養プレート（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）上に注ぎ入れた。翌日、細胞の均等な層に、自動ピペットの末端で傷（創傷）を作り、剥がれた細胞を、ＰＢＳ溶液でプレートを２回洗浄することにより除去した。次いで、培養培地に溶解したＡＫＧ（１０ｍＭ及び２０ｍＭ）を、調製した培養物に添加した。プレートを、９５％空気／５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培養物を、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｚａ法で着色させた。次いで、顕微鏡分析を、ソフトウェアａｎａｌｙＳＩＳ（登録商標）（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ、ミュンスター、ドイツ）を用いて、顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１（オリンパス光学工業株式会社、東京、日本）で行った。細胞遊走度は、細胞の層に先に作られた創傷に存在する細胞数として、サイトメトリーで評価した。８枚の写真上の少なくとも５０個の選択フィールドを評価した。
【００１６】
（結果）
ＡＫＧの抗増殖活性の評価：
培養物におけるＡＫＧの抗増殖活性を、様々な種類の新生物細胞、すなわち、肺癌細胞（Ａ５４９）、大腸癌細胞（ＨＴ−２９）及びグリオーマ細胞（Ｃ６）に関して評価した。細胞を、濃度０．５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭのＡＫＧで９６時間処理した。
【００１７】
被検物質は、すべての新生物細胞タイプに関して抗増殖活性を有していた（図１、図２、図３）。細胞増殖の統計的に有意な（４．５％）抑制は、Ａ５４９細胞系においてＡＫＧ濃度２．５ｍＭで観察された（対照群と比較）。その効果は、ＡＫＧの用量と相関していて、用量５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭで、それぞれ７．８％、１２．４％及び１７．５％であった（図１）。グリオーマ細胞（Ｃ６）における増殖抑制は、ＡＫＧ用量２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭで、それぞれ１２．６％、７．９％、１６％及び１９．８％であった。大腸癌細胞（ＨＴ−２９）の増殖抑制は、１〜１０ｍＭのＡＫＧ濃度で線形性を有していなかった。用量１ｍＭでは、細胞増殖が１１．８％抑制された。ほぼ同様の効果が、用量５ｍＭ（１１．８％）及び１０ｍＭ（１１．５％）で得られた。用量２０ｍＭにおいてのみ、これらの細胞の増殖の有意な（２５％）抑制が生じた（図３）。
【００１８】
ＡＫＧと抗新生物薬との相互作用の評価：
ＡＫＧと、癌化学療法で使用される周知の細胞増殖抑制剤と、の相互作用に関する検討を、肺癌細胞（Ａ５４９）の培養物で行った。その目的のために、３種の細胞増殖抑制剤、すなわち、シクロホスファミド（１．５ｍＭ）、イホスファミド（１．５ｍＭ）及びチオテパ（５μＭ）を単独で、又はＡＫＧ（５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭ）と組み合わせて用いて、細胞を処理した。使用した化学療法剤の細胞増殖抑制活性に対するＡＫＧの相加的効果が観察された（結果を図４、図５及び図６に示す）。濃度１．５ｍＭのシクロホスファミドは、Ａ５４９細胞の増殖を２１．４％抑制した。ＡＫＧの添加は、細胞増殖抑制活性を、それぞれ６．４％、９．８％及び１４．４％増加させた（図４）。イホスファミド（１．５ｍＭ）は、細胞増殖を７．３％抑制した。ＡＫＧ（５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭ）添加後、効果は、それぞれ５％、５．３％及び８．８％増加した（図５）。また、ＡＫＧは、チオテパ（５μＭ−２５．９％）の細胞増殖抑制活性を４．２％（５ｍＭ）、８％（１０ｍＭ）及び１１．２％（２０ｍＭ）増強した（結果を図６に示す）。
【００１９】
新生物細胞の遊走に対するＡＫＧの影響：
新生物細胞の移動性に関する検討を「創傷アッセイ」モデルで行った。写真１には、Ｃ６細胞の層の創傷（Ａ）、ＡＫＧ非存在下の２４時間のインキュベーション後の創傷への細胞の密集（Ｂ）、及びＡＫＧ２０ｍＭ存在下の細胞遊走の有意な抑制（Ｃ）が示されている。図７には、細胞の均一層に作られた傷の１フィールドへ遊走した細胞の平均数が示されている。１０ｍＭ及び２０ｍＭのＡＫＧ存在下の、細胞遊走の統計的に有意な抑制が示された。
【００２０】
統計解析：
統計解析は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＡＫＧで刺激した場合のＡ５４９細胞の増殖を示す。
【図２】ＡＫＧ存在下のＣ６細胞の増殖を示す。
【図３】ＡＫＧで刺激した場合のＨＴ−２９細胞の増殖を示す。
【図４】シクロホスファミド及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図５】イホスファミド及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図６】チオテパ及びＡＫＧの存在下のヒト新生物細胞Ａ５４９の増殖を示す。
【図７】ＡＫＧによるＣ６細胞遊走の抑制を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤。
【請求項２】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤の、新生物疾患の予防における使用。
【請求項３】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤の、癌転移抑制のための使用。
【請求項１】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤。
【請求項２】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤の、新生物疾患の予防における使用。
【請求項３】
α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びオルニチンのα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのジペプチド、又は／及びグルタミンと他のアミノ酸とのトリペプチド、又は／及びグルタミン酸と他のアミノ酸とのジ及びトリペプチド、或いは／並びにα−ケトグルタル酸、又は／及びグルタミン、又は／及びグルタミン酸、又は／及びα−ケトグルタル酸のオルニチン、の一価及び二価金属塩その他、を含有する抗新生物製剤の、癌転移抑制のための使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−３５８６４（Ｐ２０１３−３５８６４Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２１９７０１（Ｐ２０１２−２１９７０１）
【出願日】平成２４年１０月１日（２０１２．１０．１）
【分割の表示】特願２００７−５５０３２１（Ｐ２００７−５５０３２１）の分割
【原出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【出願人】（５０７１３０４１７）エスジーピー アンド ソンズ アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２１９７０１（Ｐ２０１２−２１９７０１）
【出願日】平成２４年１０月１日（２０１２．１０．１）
【分割の表示】特願２００７−５５０３２１（Ｐ２００７−５５０３２１）の分割
【原出願日】平成１８年１月１０日（２００６．１．１０）
【出願人】（５０７１３０４１７）エスジーピー アンド ソンズ アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
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