抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法
【課題】 高い安全性を有し、かつ経口投与した場合でも全身において有効である上、その抗炎症効果は市販の抗炎症薬に匹敵するほど高い抗炎症剤およびその製造方法を提供する。
【解決手段】 タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤。
【解決手段】 タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法に関し、より詳細には、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、生体が何らかの有害な刺激を受けたときに誘起される生体防御反応であり、血管拡張、血管透過性亢進、白血球遊走、結合組織増殖などの組織反応が誘起され、発赤、発熱、腫脹、疼痛などの炎症症状が発現する。慢性的な炎症は、腰痛、肩こり、関節痛を始めとする種々の疾病の原因となり、発癌の一因にもなり得る。
【０００３】
従って、炎症の予防や治療、症状緩和は大きな課題であり、抗炎症剤の開発が多数行われている。抗炎症剤としては、例えば、ステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤などが知られているが、これらの薬剤は副作用を示す場合があるため、より安全で有効な抗炎症剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、本発明者らは、従来、魚肉などの筋肉タンパク質の利用に関して研究開発を行っており、本発明者らの特許文献１には水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質が開示されている。また、非特許文献１には、鶏卵アルブミンのグルコース付加物が炎症性物質である一酸化窒素（ＮＯ）や炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）の産生を誘導することが、非特許文献２には、ラクトグロブリンや血清アルブミンの糖化物が炎症シグナルのカスケードを活性化させないことが、非特許文献３には、ラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物が炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）の産生を抑制することがそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１６９６３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｌａｄｊａｎａ Ｄ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第４４−５５頁、２００３年
【非特許文献２】Ｔｉｍｏ Ｍ．Ｂｕｅｔｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｎａｔｕｌ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．、第５２巻、第３７０−３７８頁、２００８年
【非特許文献３】Ｅｎｏｍｏｔｏら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、第９２巻、第３０５７−３０６８頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示された水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質、非特許文献１に開示された鶏卵アルブミンのグルコース付加物、非特許文献２に開示されたラクトグロブリンや血清アルブミンの糖化物および非特許文献３に開示されたラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物は、いずれもタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸ではない。また、特許文献１に開示された水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質が抗炎症効果を有するか否かについて、特許文献１にはなんら記載も示唆もない。また、非特許文献１に開示された鶏卵アルブミンのグルコース付加物は炎症性物質の産生を誘導するものであり、抗炎症効果とは逆の作用効果を有している。さらに、非特許文献３に開示されたラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物が有する炎症性サイトカイン産生抑制効果は、極めて僅かである。
【０００８】
本発明は、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、ないしタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸が、ＮＯ産生抑制効果、炎症性サイトカイン産生抑制効果および浮腫増大抑制効果を有することを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする抗炎症剤；（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【００１１】
（２）タンパク質が、軟体動物または甲殻類の筋肉、魚肉、畜肉もしくは獣肉の少なくともいずれか由来の筋肉タンパク質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【００１２】
（３）炎症性疾患予防および／または治療剤である、請求項１または請求項２に記載の抗炎症剤。
【００１３】
（４）下記（１）または（２）の工程を有する抗炎症剤の製造方法；（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る抗炎症剤は、動物の筋肉タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、または動物の筋肉タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分としており、高い安全性を有している。また、本発明に係る抗炎症剤は、経口投与した場合でも全身において有効である上、その抗炎症効果は市販の抗炎症薬に匹敵するほど高い。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１における、還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）の調製工程を説明したフロー図である。
【図２】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（Ａ）、ならびに保持時間をそれぞれ１時間（Ｂ）、２時間（Ｃ）、３時間（Ｄ）および４時間（Ｅ）として調製したＰＡＲＰについて、反応性リジン残基含量および還元糖付加量を測定した結果を示す図である。図中、反応性リジン残基含量のシンボルを○で示し、還元糖付加量のシンボルを△で示す。
【図３】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチドを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ａ）、保持時間を１，２，３および４時間として調製したＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）、ならびにＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞をそれぞれ培養し、培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＮＯ産生量を１００％とした場合のＮＯ産生率を算出した結果を示す図である。
【図４】ＰＡＲＰおよび還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）のいずれも添加しないＲＡＷ２６４．７細胞（ｇ）、終濃度１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）、ならびに終濃度５００μｇ／ｍＬのＰＡＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｍ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＮＯ量を測定した結果を示す図である。
【図５】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチドを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｎ）、保持時間を１、２、３および４時間として調製したＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）および（ｒ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＴＮＦ−α量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＴＮＦ−α量を１００％とした場合のＴＮＦ−α産生率を算出した結果を示す図（左図）、ならびに同細胞の培養上清中のＩＬ−６量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＩＬ−６量を１００％とした場合のＩＬ−６産生率を算出した結果を示す図（右図）である。
【図６】ＰＡＲＰおよびＰＡＰのいずれも添加しないＲＡＷ２６４．７細胞（ｔ）、終濃度１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）および（ｙ）、ならびに終濃度５００μｇ／ｍＬのＰＡＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｚ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＴＮＦ−α量を測定した結果を示す図（左図）およびＩＬ−６量を測定した結果を示す図（右図）である。
【図７】生理食塩水を経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（コントロール群）、保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（０時間群）、ならびに保持時間を２および４時間として調製したＰＡＲＰをそれぞれ経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（２時間群および４時間群）について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間後に足蹠容積を測定して浮腫増大率を算出した結果を示す図（上図）、ならびに浮腫増大率のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を算出した結果を示す図（下図）である。
【図８】生理食塩水を経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（コントロール群）、保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰを経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（４時間群）、およびインドメタシンを経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（インドメタシン群）について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間後に足蹠容積を測定して浮腫増大率を算出した結果を示す図（上図）、ならびに浮腫増大率のＡＵＣを算出した結果を示す図（下図）である。
【図９】ＰＡＲＰおよびＰＡＰを等電点電気泳動装置に供して得られた計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）の等電点を示す図である。
【図１０】ＰＡＲＰおよびＰＡＰを等電点電気泳動装置に供して得られた計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加して培養し、培養上清中のＮＯ量を測定した結果を示す図（上段図）、ＴＮＦ−α量を測定した結果を示す図（中段図）およびＩＬ−６量を測定した結果を示す図（下段図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法について詳細に説明する。本発明に係る抗炎症剤は下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする；
（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、
（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【００１７】
本発明における「タンパク質」としては、例えば、コラーゲンやケラチンなどの生体構造を形成するタンパク質や、アクチンやミオシンなどの筋肉を構成するタンパク質、カゼインなどの乳タンパク質、ビテリン、３０ｋＤａタンパク質、卵特異タンパク質などの卵黄タンパク質、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、卵白ムチンなどの卵白タンパク質、血清アルブミン、グロブリンなどの血清タンパク質などを挙げることができる。なお、本実施例においては、筋肉タンパク質を好適なタンパク質として用いている。
【００１８】
筋肉タンパク質は原生動物、中生動物および海綿動物を除くすべての動物が有しており、本発明におおける「筋肉タンパク質」は、そのうちのいずれの動物に由来するものでもよい。本発明において、筋肉タンパク質の由来としては、例えば、軟体動物や甲殻類、爬虫類や両生類の筋肉、魚肉、ウシやウマ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ヤギ、イヌ、ネコなどの家畜の畜肉、ウサギやシカ、イノシシ、クマなどの野生動物の獣肉などを挙げることができる。また、筋肉タンパク質は、骨格筋、内臓筋、横紋筋、平滑筋、随意筋、不随意筋または心筋の別を問わない。
【００１９】
本発明において、「ペプチド」は、タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるものであり、そのアミノ酸残基数は特に限定されず、例えば、２〜４残基、５〜７残基、８〜１０残基、１１〜１５残基、１６〜２０残基、２１〜３０残基、３１〜４０残基、４１〜５５残基、５６〜７５残基、７６〜１００残基、１０１残基以上のアミノ酸残基数を挙げることができるが、それらのうちのいずれでもよい。
【００２０】
本発明において、「還元糖」は、すべての単糖や還元末端を有するオリゴ糖を挙げることができる。具体的には、単糖としては、例えば、ソルビトール、グリセルアルデヒド、グルコース、フルクトース、エリトルロース、リブロース、リボース、デオキシリボース、フコース、ヘプトースなどを挙げることができる。還元末端を有するオリゴ糖としては、例えば、ラクツロース、ラクトース、アラビノース、マルトース、コージビオース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ツラノースなどの還元性二糖類や、セロトリオース、ソラトリオースなどの還元性三糖類、セロテトラオースなどの還元性四糖類、セロペンタオースなどの還元性五糖類のほか、アルギン酸オリゴ糖やキトサンオリゴ糖などを挙げることができる。なお、オリゴ糖は一般に単糖が２〜１０分子重合したものをいうが、本発明においてオリゴ糖は還元末端を有するものである限り、その重合数はいずれでもよい。
【００２１】
本発明において、タンパク質やペプチド、アミノ酸に還元糖を付加させる方法は、常法に従い行うことができ、特に限定されないが、そのような方法としては、例えば、メイラード反応により行う方法などを挙げることができる。
【００２２】
一般にメイラード反応とは、還元糖とアミノ化合物（タンパク質やペプチド、アミノ酸など）のαアミノ基またはεアミノ基との間でおこる反応として知られており、シッフ塩基形成および転移反応を経て比較的無色なアマリド化合物を生成するまでの初期反応と、更に複雑な重合反応を経て褐色の高分子（メライノジン）を生成する中期・終期反応からなる。メイラード反応は、温度や時間、水分含量（湿度）、触媒の有無に依存してその反応速度が変化し、例えば、初期反応については、相対湿度６５−７０％の条件下で反応が促進される（化学総説Ｎｏ．４３ 食糧と化学 社団法人日本化学会編、学会出版センター 昭和５９年２月２８日発行 第１０７−１０９頁）。また、メイラード反応は概して加熱条件下で促進されるが、常温でも進行する。
【００２３】
すなわち、本発明においては、タンパク質やペプチド、アミノ酸の反応性リジン残基と還元糖の還元末端との間でメイラード反応をさせることにより、タンパク質に還元糖を付加することができる。温度や時間、水分含量（湿度）などのメイラード反応の条件は、タンパク質や還元糖の種類や量、触媒添加の有無や種類、達成すべき品質基準などに応じて、適宜設定することができる。なお、本実施例においては、タンパク質と還元糖とを、触媒を添加せずに６０℃、相対湿度３５％の環境下で保持することによりメイラード反応をさせている。
【００２４】
本発明において、タンパク質やペプチド、アミノ酸に還元糖が付加されたか否かや、還元糖が付加された量（還元糖付加量）は、常法に従い確認することができ、そのような方法としては、例えば、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）法やフェノール硫酸法を挙げることができる。すなわち、還元糖を付加させる反応を行ったタンパク質やペプチド、アミノ酸について、ＯＰＡ法により反応性リジン残基含量を、フェノール硫酸法により還元糖量を測定し、測定した反応性リジン残基含量の値が大きい場合は、還元糖付加量が少ないと評価することができ、測定した還元糖量の値が大きい場合は、還元糖付加量が多いと評価することができる。
【００２５】
本発明において、「タンパク質分解酵素」は、エキソ型、エンド型のいずれでもよく、比較的分子量の大きなタンパク質を基質とするプロテナーゼでも、比較的分子量の小さなタンパク質を基質とするペプチダーゼでもよい。また、基質特異性の比較的高いものでもよく、比較的低いものでもよい。タンパク質分解酵素として、具体的には、例えば、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、ペプシン、カテプシンＤ、ＨＩＶプロテアーゼ、サーモリシン、パパイン、カスパーゼ、Ｎ末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、ブロメライン、ショウガプロテアーゼ、フィシン、アクチニジン、マイタケプロテアーゼ、ナットウキナーゼなどを挙げることができる。
【００２６】
本発明において、タンパク質をタンパク質分解酵素で処理する方法は、常法に従い行うことができ、例えば、タンパク質分解酵素を溶媒に希釈して、タンパク質と混合し、インキュベートすることにより行うことができる。溶媒の種類やｐＨ、タンパク質分解酵素の濃度、インキュベートする温度や時間などは、用いるタンパク質分解酵素の種類、タンパク質における還元糖付加の有無、タンパク質に付加させた還元糖の量や種類、タンパク質の量や種類などに応じて、適宜設定することができる。
【００２７】
本発明において、抗炎症剤の抗炎症効果は、常法に従い確認することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認する方法としては、例えば、細胞に抗炎症剤を添加して培養し、培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）の量をＧｒｉｅｓｓ法により測定する方法や、培養上清中のＴＮＦ−αやＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインの量をＥＬＩＳＡ法により測定する方法を挙げることができる。また、本発明に係る抗炎症剤を添加して培養した細胞における、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＮＯ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子やＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２遺伝子、種々の炎症性サイトカイン遺伝子などのＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲ法やｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により確認してもよい。これら炎症に伴いＲＮＡ発現が上昇する遺伝子の発現量が、抗炎症剤を添加した場合に、それを添加しない場合と比較して、減少した場合は抗炎症効果を有すると評価することができる。
【００２８】
また、本発明に係る抗炎症剤の抗炎症効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認する方法としては、マウスやラットなどの実験動物にカラギーナンを皮下注射して浮腫を誘発し、本発明に係る抗炎症剤を投与した場合と投与しない場合とで、浮腫の大きさを比較する方法を挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る抗炎症剤は、長期間にわたって摂取を続けても、また大量に投与しても、副作用がほとんど生じない。したがって、本発明の抗炎症剤は、安全であるので、抗炎症作用により、炎症性疾患の予防や治療剤として用いることができ、ヒトの健康維持に大きな効果を奏するものである。また、長期間摂取や投与をしても安全であるので、健康食品や機能性食品、化粧品や石鹸、シャンプーなどのボディークレンジング製品、ロ−ション類、乳液類、クリ−ム類、パック類、サンスクリーン類、浴用剤などに配合して用いることもできる。
【００３０】
炎症性疾患としては、肩関節周囲炎（いわゆる肩凝り）、炎症性角化症（乾癬など）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーテス（ＳＬＥ）、ベーチェット病などの慢性炎症性疾患である自己免疫疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、薬物アレルギー性肝炎などの炎症性肝疾患、腎炎、糸球体腎炎などの炎症性腎疾患、気管支炎などの炎症性呼吸器疾患、口内炎、喉頭炎、声帯炎、音声障害、人工臓器・人工血管使用時に起こる炎症、非ステロイド性消炎剤による消化管粘膜障害、癌、動脈硬化症、腸粘膜障害などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記腸粘膜障害としては、単純性原発性小腸潰瘍、非特異性結腸潰瘍、非特異性炎症による潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病などの原因不明のものなどがあり、さらに感染、循環障害、膠原病、放射線、薬剤などが原因で起こる障害などを挙げることができる。
【００３１】
次に、本発明は、抗炎症剤の製造方法を提供する。本発明に係る抗炎症剤の製造方法は、下記（１）または（２）の工程を有する；
（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、
（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。なお、本発明に係る抗炎症剤の製造方法法において、上述した本発明に係る抗炎症剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００３２】
本発明に係る抗炎症剤の製造方法においては、必要とする抗炎症剤の純度や態様などに応じて、上述の（１）または（２）の工程の他に、原料タンパク質の洗浄工程、粉砕工程、凍結乾燥工程、未反応還元糖の洗浄工程、還元糖付加の確認工程などを１または２回以上行ってもよい。
【００３３】
以下、本発明に係る抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３４】
＜実施例１＞還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）の調製
（１）タンパク質への還元糖の付加
産卵回帰シロザケから筋肉タンパク質を採取して洗浄し、これを魚肉とした。魚肉タンパク質：アルギン酸オリゴ糖（平均重合度が約６）＝１：１（ｗ／ｗ）となるよう混合したものを計５サンプル用意し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとした。Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを凍結乾燥に供した後、「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で、Ｂは１時間、Ｃは２時間、Ｄは３時間、Ｅは４時間それぞれ保持することにより、魚肉タンパク質にアルギン酸オリゴ糖を付加させて、還元糖付加タンパク質を得た（以下、「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で保持した時間を「保持時間」という）。なお、Ａは「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で保持しなかった。
【００３５】
（２）未反応の還元糖の洗浄除去
本実施例（１）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液で洗浄することにより、タンパク質に付加していない還元糖を除去した。なお、糖付加によって筋肉タンパク質の一部が水溶化するが、これは加熱変性させて不溶化してから洗浄し除去すればよい。
【００３６】
（３）タンパク質分解酵素処理および凍結乾燥
本実施例（２）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについて、１％（ｗ／ｗ：タンパク質濃度比）ペプシンをｐＨ２．０、３７℃で３時間反応させることにより、ペプシン処理を行った。続いて、１％（ｗ／ｗ）トリプシンをｐＨ８．０、３７℃で３時間反応させることによりトリプシン処理を行った後、凍結乾燥を行うことにより、還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）を得た。すなわち、Ａにおいては保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド、Ｂにおいては保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ、Ｃにおいては保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ、Ｄにおいては保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ、およびＥにおいては保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰを得た。本実施例（１）〜（３）における、ＰＡＲＰの調製工程を図１に示す。
【００３７】
（４）還元糖付加の確認
本実施例（３）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについて、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）法により反応性リジン残基含量を、フェノール硫酸法によりアルギン酸オリゴ糖の量（還元糖付加量）を、それぞれ測定し、反応性リジン残基含量はＡを１００％とした。その結果を図２に示す。
【００３８】
図２に示すように、反応性リジン残基含量（シンボルが○）は、Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅであり、還元糖付加量（シンボルが△）はＡ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄ＜Ｅであった。すなわち、保持時間が長くなるほど、反応性リジン残基が減少し、還元糖付加量が増加することが確認された。これらの結果から、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長くなるほど、タンパク質中のリジン残基への還元糖の付加が進行することが明らかになった。なお、Ａの還元糖付加量が約２５μｇ／ｍｇとなっているのは、凍結乾燥過程によっても還元糖が付加されたことを示す。
【００３９】
＜実施例２＞ＰＡＲＰの抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討）
（１）ＮＯ産生抑制効果の検討
［１−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰにおける一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制効果
〈１−１−１〉細胞へのＰＡＲＰの添加
マウスのマクロファージ様細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を６枚用意し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆとした。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを２時間培養した後、培養上清を除去した。続いて、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を添加した。次に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆに、下記のとおりＰＡＲＰを添加した。
【００４０】
ａ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｂ；保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＢ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｃ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｄ；保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＤ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｅ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｆ；（添加しない）
【００４１】
続いて、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆにＩＦＮ−γを終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに細菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）を終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるよう添加した後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを２４時間培養し、上清を回収した。
【００４２】
〈１−１−２〉ＮＯ産生量の測定
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆについて、回収した培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）量をＧｒｉｅｓｓ法により測定し、これをＮＯ産生量とした。続いて、ｆにおけるＮＯ産生量を１００％とした場合の、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおけるＮＯ産生量の割合（ＮＯ産生率）を算出した。その結果を図３に示す。
【００４３】
図３に示すように、ＮＯ産生率は、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅのいずれも１００％より小さい値であった。また、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの間でＮＯ産生率を比較すると、ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ＞ｅであった。これらの結果から、ＰＡＲＰはＮＯの産生を抑制すること、およびＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長い、すなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほどＮＯ産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００４４】
［１−２］添加量が異なるＰＡＲＰのＮＯ産生抑制効果
〈１−２−１〉ＰＡＲＰの調製
実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従って、保持時間を３時間としたＰＡＲＰを調製した。
【００４５】
〈１−２−２〉還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）の調製
産卵回帰シロザケから筋肉タンパク質を採取して洗浄し、これを魚肉とした。実施例１（３）に記載の方法に従ってペプシン処理、トリプシン処理および凍結乾燥を行い、還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）を調製した。
【００４６】
〈１−２−３〉細胞へのＰＡＲＰの添加およびＮＯ産生量の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を７枚用意し、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍとした。次に、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従って、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍの細胞へＰＡＲＰまたはＰＡＰを添加した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍに添加したＰＡＲＰまたはＰＡＰ、ならびにその終濃度は下記のとおりとした。
【００４７】
ｇ；添加しない
ｈ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度１００μｇ／ｍＬ
ｉ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度２００μｇ／ｍＬ
ｊ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度３００μｇ／ｍＬ
ｋ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度４００μｇ／ｍＬ
ｌ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｍ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉のＰＡＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
【００４８】
続いて、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生量を測定した。その結果を図４に示す。
【００４９】
図４に示すように、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌのＮＯ産生量はｇと比較していずれも少なかった。一方で、ｍのＮＯ産生量はｇと比較して多かった。また、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌの間でＮＯ産生量を比較すると、ｇ＞ｈ＞ｉ＞ｊ＞ｋ＞ｌであった。これらの結果から、ＰＡＰはＮＯの産生を抑制しないのに対し、ＰＡＲＰはＮＯの産生を抑制することが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＮＯ産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００５０】
（２）炎症性サイトカイン産生抑制効果の検討
［２−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰの炎症性サイトカイン産生抑制効果
〈２−１−１〉細胞へのＰＡＲＰの添加
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を６枚用意し、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓとした。次に、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従ってｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの細胞へＰＡＲＰを添加した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍに添加したＰＡＲＰおよびその終濃度は下記のとおりとした。なお、すべてのサンプルについてＩＦＮ−γは添加しなかった。
【００５１】
ｎ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｏ；保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＢ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｐ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｑ；保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＤ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｒ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｓ；（添加しない）
【００５２】
〈２−１−２〉炎症性サイトカイン産生量の測定
本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉のｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓについて、ＥＬＩＳＡ法を用いて培養上清中のＴＮＦ−αの量およびＩＬ−６の量を測定し、それぞれＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量とした。続いて、ｓにおけるＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をそれぞれ１００％とした場合のｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒにおけるＴＮＦ−α産生量の割合（ＴＮＦ−α産生率）およびＩＬ−６産生量の割合（ＩＬ−６産生率）を算出した。その結果を図５に示す。
【００５３】
図５左図に示すように、ＴＮＦ−α産生率は、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒのいずれも１００％より小さい値であった。また、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒの間でＴＮＦ−α産生率を比較すると、ｎ＞ｏ＞ｐ＞ｑ＞ｒであった。このことから、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長いすなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、ＴＮＦ−α産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。また、図５右図に示すように、ＩＬ−６産生率は、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒのいずれも１００％より小さい値であった。また、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒの間でＩＬ−６産生率を比較すると、ｎ＞ｏ＞ｐ＞ｑ＞ｒであった。このことから、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長いすなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、ＩＬ−６産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００５４】
これらの結果から、ＰＡＲＰは炎症性サイトカインの産生を抑制すること、およびＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど炎症性サイトカインの産生抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００５５】
［２−２］添加量が異なるＰＡＲＰの炎症性サイトカイン産生抑制効果
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を７枚用意し、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚとした。次に、本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉に記載の方法に従ってｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚ細胞へＰＡＲＰを添加した。ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚに添加したＰＡＲＰおよびその終濃度は下記のとおりとした。
【００５６】
ｔ；（添加しない）
ｕ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度１００μｇ／ｍＬ
ｖ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度２００μｇ／ｍＬ
ｗ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度３００μｇ／ｍＬ
ｘ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度４００μｇ／ｍＬ
ｙ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｚ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉のＰＡＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
【００５７】
続いて、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚについて、本実施例（２）［２−１］〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量を測定した。その結果を図６に示す。
【００５８】
図６左図に示すように、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚのＴＮＦ−α産生量はｔと比較していずれも少なかった。また、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの間でＴＮＦ−α産生量を比較すると、ｕ≒ｚ＞ｖ＞ｗ＞ｘ＞ｙであった。これらの結果から、ＰＡＰおよびＰＡＲＰはいずれもＴＮＦ−αの産生を抑制するが、その効果はＰＡＲＰの方が大きいことが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＴＮＦ−α産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００５９】
また、図６右図に示すように、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚのＩＬ−６産生量は、いずれもｔと比較して少なかった。また、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの間でＩＬ−６産生量を比較すると、ｕ＞ｚ＞ｖ＞ｗ＞ｘ＞ｙであった。これらの結果から、ＰＡＰおよびＰＡＲＰはいずれもＩＬ−６の産生を抑制するが、その効果はＰＡＲＰの方が大きいことが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＩＬ−６産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００６０】
これらの結果から、ＰＡＲＰは炎症性サイトカインの産生を強く抑制すること、およびＰＡＲＰの添加量が多いほど炎症性サイトカイン産生抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００６１】
（３）還元糖としてマルトオリゴ糖を用いたＰＡＲＰの抗炎症効果
アルギン酸オリゴ糖をマルトオリゴ糖に代えて、実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製し、これをマルトオリゴ糖ＰＡＲＰとした。マルトオリゴ糖ＰＡＲＰについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉および〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生率を求めたところ、ＮＯ産生率は６２％と顕著に低い値であった。また、マルトオリゴ糖ＰＡＲＰについて、本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉および〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生率を求めたところ、ＴＮＦ−α産生率は１６％と極めて低い値であった。
【００６２】
すなわち、アルギン酸オリゴ糖に代えてマルトオリゴ糖を用いたＰＡＲＰは、アルギン酸オリゴ糖を用いたＰＡＲＰと同様、ＮＯ産生抑制効果およびＴＮＦ−α産生抑制効果を有することが明らかになった。これらの結果から、ＰＡＲＰは、構成する還元糖の種類に関わらず、抗炎症効果を有することが明らかになった。
【００６３】
＜実施例３＞ＰＡＲＰの抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｖｏでの検討）
（１）ＰＡＲＰの浮腫増大抑制効果の検討
［１−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰの浮腫増大抑制効果
〈１−１−１〉ＰＡＲＰの経口投与およびカラギーナンの皮下注射
８週齢の雄のＩＣＲマウスを８匹ずつ４群にわけて、コントロール群、０時間群、２時間群および４時間群とした。各群のマウスを１６時間絶食させた後、下記のとおりＰＡＲＰを生理食塩水に溶解して経口投与した。
【００６４】
コントロール群；生理食塩水
０時間群 ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
２時間群 ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
４時間群 ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
【００６５】
ＰＡＲＰの経口投与から１時間後に、各群のマウスの足の裏（足蹠）に１％カラギーナン溶液を０．０４ｍＬずつ皮下注射した。なお、カラギーナンをげっ歯類に皮下注射すると浮腫などの炎症を惹起することが知られている（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第１１１巻、第５４４−５４７頁、１９６２年）。
【００６６】
〈１−１−２〉足蹠の容積の測定
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のコントロール群、０時間群、２時間群および４時間群について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間経過後に、Ｐｌｅｔｈｙｍｏｍｅｔｅｒを用いて足蹠の容積を測定し、その測定結果に基づいて、下記の式を用いて浮腫増大率を算出した。また、浮腫増大率について、Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を求めた。
【００６７】
式；浮腫増大率（％）＝｛（１、２、３、４または５時間経過時の容積−０時間経過時の容積）／０時間経過時の容積｝×１００
【００６８】
また、浮腫増大率および浮腫増大率のＡＵＣについて、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により各群間の有意差検定を行った。その結果を図７に示す。なお、図７において、各群間の有意差はアルファベット（ａ、ｂ、ｂｃ、またはｃ）で示す。各群間でアルファベットが異なる場合は有意差あり（ｐ＜０．０５）を意味し、アルファベットが同じである場合は有意差なし（ｐ≧０．０５）を意味するものとする。例えば、ａの場合はｂ、ｃおよびｂｃとは有意差があるがａとは有意差がないことを意味し、ｂｃの場合はａとは有意差があるがｂ、ｃおよびｂｃとは有意差がないことを意味する。
【００６９】
図７上図に示すように、浮腫増大率については、コントロール群と比較して０時間群は、１、２、３および４時間経過時点において有意に小さく、５時間経過時点において小さい傾向であった。２時間群および４時間群は、１、２、３、４および５時間経過時点のいずれにおいても有意に小さかった。浮腫増大率について０時間群、２時間群および４時間群の間で比較すると、０時間群＞２時間群＞４時間群の傾向であった。また、図７下図に示すように、浮腫増大率のＡＵＣについては、コントロール群と比較して０時間群、２時間群および４時間群はいずれも有意に小さかった。浮腫増大率のＡＵＣについて０時間群、２時間群および４時間群の間で比較すると、０時間群＞２時間群＞４時間群の傾向であった。
【００７０】
これらの結果から、ＰＡＲＰは生体に投与した場合に抗炎症効果を有すること、および生体に投与するＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、抗炎症効果が大きいことが明らかになった。
【００７１】
［１−２］市販の抗炎症薬とＰＡＲＰとの比較
８週齢の雄のＩＣＲマウスを８匹ずつ３群にわけて、コントロール群、４時間群およびインドメタシン群とした。各群のマウスに、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従って、生理食塩水に溶解したＰＡＲＰの経口投与およびカラギーナンの皮下注射を行った。ただし、インドメタシン群にはＰＡＲＰに代えて市販の抗炎症薬であるインドメタシンを生理食塩水に溶解して経口投与した。すなわち、コントロール群、４時間群およびインドメタシン群に経口投与したものは、下記のとおりとした。
【００７２】
コントロール群 ；生理食塩水
４時間群 ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
インドメタシン群；インドメタシン
１０ｍｇ×／ｋｇマウス個体の体重（ｋｇ）量
【００７３】
続いて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉に記載の方法に従って浮腫増大率および浮腫増大率のＡＵＣの算出を行った。その結果を図８に示す。
【００７４】
図８上図に示すように、浮腫増大率については、コントロール群と比較して４時間群は１、２、３および４時間経過時点において有意に小さく、５時間経過時点において小さい傾向であった。また、インドメタシン群は１、２、３、４および５時間経過時点のいずれにおいても有意に小さかった。浮腫増大率について４時間群およびインドメタシン群の間で比較すると、５時間経過時点においては４時間群＞インドメタシン群であったが、１、２、３および４時間経過時点においてはほぼ同じであった。また、図８下図に示すように、浮腫増大率のＡＵＣについては、コントロール群と比較して４時間群およびインドメタシン群はいずれも有意に小さかった。浮腫増大率のＡＵＣについて４時間群およびインドメタシン群の間で比較すると、ほぼ同じであった。
【００７５】
これらの結果から、生体に投与した場合のＰＡＲＰの抗炎症効果は、市販の抗炎症薬に匹敵するほど強力であることが明らかになった。
【００７６】
（２）タンパク質として鶏肉由来の筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰの抗炎症効果
産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を鶏肉の筋肉タンパク質に代えて、実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製し、これを鶏肉ＰＡＲＰとした。また、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を鶏肉の筋肉タンパク質に代えて、実施例２（１）［１−２］〈１−２−２〉に記載の方法に従ってＰＡＰを調製し、これを鶏肉ＰＡＰとした。鶏肉ＰＡＲＰおよび鶏肉ＰＡＰについて、本実施例（１）［１−１］に記載の方法に従って浮腫増大抑制効果を確認したところ、鶏肉ＰＡＰは浮腫増大抑制効果を有さなかったのに対し、鶏肉ＰＡＲＰは浮腫増大抑制効果を有した。
【００７７】
すなわち、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質に代えて鶏肉の筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰは、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰと同様に、抗炎症効果を有することが明らかになった。これらの結果から、ＰＡＲＰは、構成するタンパク質の種類に関わらず、抗炎症効果を有することが明らかになった。
【００７８】
＜実施例４＞等電点電気泳動画分の抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討）
（１）等電点電気泳動画分の調製
実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製した。また、実施例２（１）［１−２］〈１−２−２〉に記載の方法に従ってＰＡＰを調製した。続いて、ＰＡＲＰおよびＰＡＰを、等電点電気泳動装置（ロトフォア；バイオラド社）に供して、それぞれ計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）を得た。各画分の等電点を図９に示す。
【００７９】
（２）等電点電気泳動画分のＮＯ産生抑制効果および炎症性サイトカイン抑制効果
本実施例（１）の各画分について、実施例２（１）［１−１］〈１−１−１〉および〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生量を、実施例２（２）［２−１］〈２−１−１〉および〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をそれぞれ測定した。また、ＰＡＲＰまたはＰＡＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルについてのＮＯ産生量、ＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をコントロールとした。その結果を図１０に示す。
【００８０】
図１０上段に示すように、ＮＯ産生量は、ＰＡＲＰの画分番号５（等電点１．２１）および画分番号６（等電点１．５９）を用いた場合に、顕著に減少した。また、図１０中段に示すように、ＴＮＦ−α産生量は、ＰＡＲＰの画分番号１２（等電点１２．０）および１３（等電点１２．５）を用いた場合に、顕著に減少した。また、図１０下段に示すように、ＩＬ−６産生量は、ＰＡＲＰの画分番号５（等電点１．２１）、６（等電点１．５９）、１２（等電点１２．０）および１３（等電点１２．５）を用いた場合に、顕著に減少した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法に関し、より詳細には、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、生体が何らかの有害な刺激を受けたときに誘起される生体防御反応であり、血管拡張、血管透過性亢進、白血球遊走、結合組織増殖などの組織反応が誘起され、発赤、発熱、腫脹、疼痛などの炎症症状が発現する。慢性的な炎症は、腰痛、肩こり、関節痛を始めとする種々の疾病の原因となり、発癌の一因にもなり得る。
【０００３】
従って、炎症の予防や治療、症状緩和は大きな課題であり、抗炎症剤の開発が多数行われている。抗炎症剤としては、例えば、ステロイド系抗炎症剤や非ステロイド系抗炎症剤などが知られているが、これらの薬剤は副作用を示す場合があるため、より安全で有効な抗炎症剤の開発が求められている。
【０００４】
一方、本発明者らは、従来、魚肉などの筋肉タンパク質の利用に関して研究開発を行っており、本発明者らの特許文献１には水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質が開示されている。また、非特許文献１には、鶏卵アルブミンのグルコース付加物が炎症性物質である一酸化窒素（ＮＯ）や炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）の産生を誘導することが、非特許文献２には、ラクトグロブリンや血清アルブミンの糖化物が炎症シグナルのカスケードを活性化させないことが、非特許文献３には、ラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物が炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６）の産生を抑制することがそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１６９６３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｌａｄｊａｎａ Ｄ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第８７巻、第４４−５５頁、２００３年
【非特許文献２】Ｔｉｍｏ Ｍ．Ｂｕｅｔｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｎａｔｕｌ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．、第５２巻、第３７０−３７８頁、２００８年
【非特許文献３】Ｅｎｏｍｏｔｏら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、第９２巻、第３０５７−３０６８頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示された水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質、非特許文献１に開示された鶏卵アルブミンのグルコース付加物、非特許文献２に開示されたラクトグロブリンや血清アルブミンの糖化物および非特許文献３に開示されたラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物は、いずれもタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸ではない。また、特許文献１に開示された水溶性の還元糖付加筋肉タンパク質が抗炎症効果を有するか否かについて、特許文献１にはなんら記載も示唆もない。また、非特許文献１に開示された鶏卵アルブミンのグルコース付加物は炎症性物質の産生を誘導するものであり、抗炎症効果とは逆の作用効果を有している。さらに、非特許文献３に開示されたラクトグロブリンのマルトペンタオース付加物が有する炎症性サイトカイン産生抑制効果は、極めて僅かである。
【０００８】
本発明は、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、またはタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分とする抗炎症剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、ないしタンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸が、ＮＯ産生抑制効果、炎症性サイトカイン産生抑制効果および浮腫増大抑制効果を有することを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする抗炎症剤；（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【００１１】
（２）タンパク質が、軟体動物または甲殻類の筋肉、魚肉、畜肉もしくは獣肉の少なくともいずれか由来の筋肉タンパク質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【００１２】
（３）炎症性疾患予防および／または治療剤である、請求項１または請求項２に記載の抗炎症剤。
【００１３】
（４）下記（１）または（２）の工程を有する抗炎症剤の製造方法；（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る抗炎症剤は、動物の筋肉タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸、または動物の筋肉タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドやアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドや還元糖が付加されたアミノ酸を有効成分としており、高い安全性を有している。また、本発明に係る抗炎症剤は、経口投与した場合でも全身において有効である上、その抗炎症効果は市販の抗炎症薬に匹敵するほど高い。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１における、還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）の調製工程を説明したフロー図である。
【図２】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（Ａ）、ならびに保持時間をそれぞれ１時間（Ｂ）、２時間（Ｃ）、３時間（Ｄ）および４時間（Ｅ）として調製したＰＡＲＰについて、反応性リジン残基含量および還元糖付加量を測定した結果を示す図である。図中、反応性リジン残基含量のシンボルを○で示し、還元糖付加量のシンボルを△で示す。
【図３】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチドを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ａ）、保持時間を１，２，３および４時間として調製したＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）、ならびにＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞をそれぞれ培養し、培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＮＯ産生量を１００％とした場合のＮＯ産生率を算出した結果を示す図である。
【図４】ＰＡＲＰおよび還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）のいずれも添加しないＲＡＷ２６４．７細胞（ｇ）、終濃度１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）、ならびに終濃度５００μｇ／ｍＬのＰＡＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｍ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＮＯ量を測定した結果を示す図である。
【図５】保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチドを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｎ）、保持時間を１、２、３および４時間として調製したＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）および（ｒ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＴＮＦ−α量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＴＮＦ−α量を１００％とした場合のＴＮＦ−α産生率を算出した結果を示す図（左図）、ならびに同細胞の培養上清中のＩＬ−６量を測定して、ＰＡＲＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞における培養上清中のＩＬ−６量を１００％とした場合のＩＬ−６産生率を算出した結果を示す図（右図）である。
【図６】ＰＡＲＰおよびＰＡＰのいずれも添加しないＲＡＷ２６４．７細胞（ｔ）、終濃度１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび５００μｇ／ｍＬのＰＡＲＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、（ｘ）および（ｙ）、ならびに終濃度５００μｇ／ｍＬのＰＡＰを添加したＲＡＷ２６４．７細胞（ｚ）をそれぞれ培養し、培養上清中のＴＮＦ−α量を測定した結果を示す図（左図）およびＩＬ−６量を測定した結果を示す図（右図）である。
【図７】生理食塩水を経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（コントロール群）、保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（０時間群）、ならびに保持時間を２および４時間として調製したＰＡＲＰをそれぞれ経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（２時間群および４時間群）について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間後に足蹠容積を測定して浮腫増大率を算出した結果を示す図（上図）、ならびに浮腫増大率のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を算出した結果を示す図（下図）である。
【図８】生理食塩水を経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（コントロール群）、保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰを経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（４時間群）、およびインドメタシンを経口投与した後にカラギーナンを皮下注射したマウス（インドメタシン群）について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間後に足蹠容積を測定して浮腫増大率を算出した結果を示す図（上図）、ならびに浮腫増大率のＡＵＣを算出した結果を示す図（下図）である。
【図９】ＰＡＲＰおよびＰＡＰを等電点電気泳動装置に供して得られた計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）の等電点を示す図である。
【図１０】ＰＡＲＰおよびＰＡＰを等電点電気泳動装置に供して得られた計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加して培養し、培養上清中のＮＯ量を測定した結果を示す図（上段図）、ＴＮＦ−α量を測定した結果を示す図（中段図）およびＩＬ−６量を測定した結果を示す図（下段図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明に係る抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法について詳細に説明する。本発明に係る抗炎症剤は下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする；
（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、
（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【００１７】
本発明における「タンパク質」としては、例えば、コラーゲンやケラチンなどの生体構造を形成するタンパク質や、アクチンやミオシンなどの筋肉を構成するタンパク質、カゼインなどの乳タンパク質、ビテリン、３０ｋＤａタンパク質、卵特異タンパク質などの卵黄タンパク質、オボアルブミン、オボトランスフェリン、オボムコイド、卵白ムチンなどの卵白タンパク質、血清アルブミン、グロブリンなどの血清タンパク質などを挙げることができる。なお、本実施例においては、筋肉タンパク質を好適なタンパク質として用いている。
【００１８】
筋肉タンパク質は原生動物、中生動物および海綿動物を除くすべての動物が有しており、本発明におおける「筋肉タンパク質」は、そのうちのいずれの動物に由来するものでもよい。本発明において、筋肉タンパク質の由来としては、例えば、軟体動物や甲殻類、爬虫類や両生類の筋肉、魚肉、ウシやウマ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ヤギ、イヌ、ネコなどの家畜の畜肉、ウサギやシカ、イノシシ、クマなどの野生動物の獣肉などを挙げることができる。また、筋肉タンパク質は、骨格筋、内臓筋、横紋筋、平滑筋、随意筋、不随意筋または心筋の別を問わない。
【００１９】
本発明において、「ペプチド」は、タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるものであり、そのアミノ酸残基数は特に限定されず、例えば、２〜４残基、５〜７残基、８〜１０残基、１１〜１５残基、１６〜２０残基、２１〜３０残基、３１〜４０残基、４１〜５５残基、５６〜７５残基、７６〜１００残基、１０１残基以上のアミノ酸残基数を挙げることができるが、それらのうちのいずれでもよい。
【００２０】
本発明において、「還元糖」は、すべての単糖や還元末端を有するオリゴ糖を挙げることができる。具体的には、単糖としては、例えば、ソルビトール、グリセルアルデヒド、グルコース、フルクトース、エリトルロース、リブロース、リボース、デオキシリボース、フコース、ヘプトースなどを挙げることができる。還元末端を有するオリゴ糖としては、例えば、ラクツロース、ラクトース、アラビノース、マルトース、コージビオース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ツラノースなどの還元性二糖類や、セロトリオース、ソラトリオースなどの還元性三糖類、セロテトラオースなどの還元性四糖類、セロペンタオースなどの還元性五糖類のほか、アルギン酸オリゴ糖やキトサンオリゴ糖などを挙げることができる。なお、オリゴ糖は一般に単糖が２〜１０分子重合したものをいうが、本発明においてオリゴ糖は還元末端を有するものである限り、その重合数はいずれでもよい。
【００２１】
本発明において、タンパク質やペプチド、アミノ酸に還元糖を付加させる方法は、常法に従い行うことができ、特に限定されないが、そのような方法としては、例えば、メイラード反応により行う方法などを挙げることができる。
【００２２】
一般にメイラード反応とは、還元糖とアミノ化合物（タンパク質やペプチド、アミノ酸など）のαアミノ基またはεアミノ基との間でおこる反応として知られており、シッフ塩基形成および転移反応を経て比較的無色なアマリド化合物を生成するまでの初期反応と、更に複雑な重合反応を経て褐色の高分子（メライノジン）を生成する中期・終期反応からなる。メイラード反応は、温度や時間、水分含量（湿度）、触媒の有無に依存してその反応速度が変化し、例えば、初期反応については、相対湿度６５−７０％の条件下で反応が促進される（化学総説Ｎｏ．４３ 食糧と化学 社団法人日本化学会編、学会出版センター 昭和５９年２月２８日発行 第１０７−１０９頁）。また、メイラード反応は概して加熱条件下で促進されるが、常温でも進行する。
【００２３】
すなわち、本発明においては、タンパク質やペプチド、アミノ酸の反応性リジン残基と還元糖の還元末端との間でメイラード反応をさせることにより、タンパク質に還元糖を付加することができる。温度や時間、水分含量（湿度）などのメイラード反応の条件は、タンパク質や還元糖の種類や量、触媒添加の有無や種類、達成すべき品質基準などに応じて、適宜設定することができる。なお、本実施例においては、タンパク質と還元糖とを、触媒を添加せずに６０℃、相対湿度３５％の環境下で保持することによりメイラード反応をさせている。
【００２４】
本発明において、タンパク質やペプチド、アミノ酸に還元糖が付加されたか否かや、還元糖が付加された量（還元糖付加量）は、常法に従い確認することができ、そのような方法としては、例えば、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）法やフェノール硫酸法を挙げることができる。すなわち、還元糖を付加させる反応を行ったタンパク質やペプチド、アミノ酸について、ＯＰＡ法により反応性リジン残基含量を、フェノール硫酸法により還元糖量を測定し、測定した反応性リジン残基含量の値が大きい場合は、還元糖付加量が少ないと評価することができ、測定した還元糖量の値が大きい場合は、還元糖付加量が多いと評価することができる。
【００２５】
本発明において、「タンパク質分解酵素」は、エキソ型、エンド型のいずれでもよく、比較的分子量の大きなタンパク質を基質とするプロテナーゼでも、比較的分子量の小さなタンパク質を基質とするペプチダーゼでもよい。また、基質特異性の比較的高いものでもよく、比較的低いものでもよい。タンパク質分解酵素として、具体的には、例えば、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン、ペプシン、カテプシンＤ、ＨＩＶプロテアーゼ、サーモリシン、パパイン、カスパーゼ、Ｎ末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、ブロメライン、ショウガプロテアーゼ、フィシン、アクチニジン、マイタケプロテアーゼ、ナットウキナーゼなどを挙げることができる。
【００２６】
本発明において、タンパク質をタンパク質分解酵素で処理する方法は、常法に従い行うことができ、例えば、タンパク質分解酵素を溶媒に希釈して、タンパク質と混合し、インキュベートすることにより行うことができる。溶媒の種類やｐＨ、タンパク質分解酵素の濃度、インキュベートする温度や時間などは、用いるタンパク質分解酵素の種類、タンパク質における還元糖付加の有無、タンパク質に付加させた還元糖の量や種類、タンパク質の量や種類などに応じて、適宜設定することができる。
【００２７】
本発明において、抗炎症剤の抗炎症効果は、常法に従い確認することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認する方法としては、例えば、細胞に抗炎症剤を添加して培養し、培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）の量をＧｒｉｅｓｓ法により測定する方法や、培養上清中のＴＮＦ−αやＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインの量をＥＬＩＳＡ法により測定する方法を挙げることができる。また、本発明に係る抗炎症剤を添加して培養した細胞における、Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＮＯ ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子やＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２遺伝子、種々の炎症性サイトカイン遺伝子などのＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲ法やｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により確認してもよい。これら炎症に伴いＲＮＡ発現が上昇する遺伝子の発現量が、抗炎症剤を添加した場合に、それを添加しない場合と比較して、減少した場合は抗炎症効果を有すると評価することができる。
【００２８】
また、本発明に係る抗炎症剤の抗炎症効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認する方法としては、マウスやラットなどの実験動物にカラギーナンを皮下注射して浮腫を誘発し、本発明に係る抗炎症剤を投与した場合と投与しない場合とで、浮腫の大きさを比較する方法を挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る抗炎症剤は、長期間にわたって摂取を続けても、また大量に投与しても、副作用がほとんど生じない。したがって、本発明の抗炎症剤は、安全であるので、抗炎症作用により、炎症性疾患の予防や治療剤として用いることができ、ヒトの健康維持に大きな効果を奏するものである。また、長期間摂取や投与をしても安全であるので、健康食品や機能性食品、化粧品や石鹸、シャンプーなどのボディークレンジング製品、ロ−ション類、乳液類、クリ−ム類、パック類、サンスクリーン類、浴用剤などに配合して用いることもできる。
【００３０】
炎症性疾患としては、肩関節周囲炎（いわゆる肩凝り）、炎症性角化症（乾癬など）、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患、慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーテス（ＳＬＥ）、ベーチェット病などの慢性炎症性疾患である自己免疫疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、薬物アレルギー性肝炎などの炎症性肝疾患、腎炎、糸球体腎炎などの炎症性腎疾患、気管支炎などの炎症性呼吸器疾患、口内炎、喉頭炎、声帯炎、音声障害、人工臓器・人工血管使用時に起こる炎症、非ステロイド性消炎剤による消化管粘膜障害、癌、動脈硬化症、腸粘膜障害などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記腸粘膜障害としては、単純性原発性小腸潰瘍、非特異性結腸潰瘍、非特異性炎症による潰瘍性大腸炎、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病などの原因不明のものなどがあり、さらに感染、循環障害、膠原病、放射線、薬剤などが原因で起こる障害などを挙げることができる。
【００３１】
次に、本発明は、抗炎症剤の製造方法を提供する。本発明に係る抗炎症剤の製造方法は、下記（１）または（２）の工程を有する；
（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、
（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。なお、本発明に係る抗炎症剤の製造方法法において、上述した本発明に係る抗炎症剤の構成と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００３２】
本発明に係る抗炎症剤の製造方法においては、必要とする抗炎症剤の純度や態様などに応じて、上述の（１）または（２）の工程の他に、原料タンパク質の洗浄工程、粉砕工程、凍結乾燥工程、未反応還元糖の洗浄工程、還元糖付加の確認工程などを１または２回以上行ってもよい。
【００３３】
以下、本発明に係る抗炎症剤および抗炎症剤の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３４】
＜実施例１＞還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）の調製
（１）タンパク質への還元糖の付加
産卵回帰シロザケから筋肉タンパク質を採取して洗浄し、これを魚肉とした。魚肉タンパク質：アルギン酸オリゴ糖（平均重合度が約６）＝１：１（ｗ／ｗ）となるよう混合したものを計５サンプル用意し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとした。Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを凍結乾燥に供した後、「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で、Ｂは１時間、Ｃは２時間、Ｄは３時間、Ｅは４時間それぞれ保持することにより、魚肉タンパク質にアルギン酸オリゴ糖を付加させて、還元糖付加タンパク質を得た（以下、「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で保持した時間を「保持時間」という）。なお、Ａは「６０℃、相対湿度３５％」の環境下で保持しなかった。
【００３５】
（２）未反応の還元糖の洗浄除去
本実施例（１）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液で洗浄することにより、タンパク質に付加していない還元糖を除去した。なお、糖付加によって筋肉タンパク質の一部が水溶化するが、これは加熱変性させて不溶化してから洗浄し除去すればよい。
【００３６】
（３）タンパク質分解酵素処理および凍結乾燥
本実施例（２）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについて、１％（ｗ／ｗ：タンパク質濃度比）ペプシンをｐＨ２．０、３７℃で３時間反応させることにより、ペプシン処理を行った。続いて、１％（ｗ／ｗ）トリプシンをｐＨ８．０、３７℃で３時間反応させることによりトリプシン処理を行った後、凍結乾燥を行うことにより、還元糖が付加されたペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ−ａｄｄｅｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＲＰ）を得た。すなわち、Ａにおいては保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド、Ｂにおいては保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ、Ｃにおいては保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ、Ｄにおいては保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ、およびＥにおいては保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰを得た。本実施例（１）〜（３）における、ＰＡＲＰの調製工程を図１に示す。
【００３７】
（４）還元糖付加の確認
本実施例（３）のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥについて、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）法により反応性リジン残基含量を、フェノール硫酸法によりアルギン酸オリゴ糖の量（還元糖付加量）を、それぞれ測定し、反応性リジン残基含量はＡを１００％とした。その結果を図２に示す。
【００３８】
図２に示すように、反応性リジン残基含量（シンボルが○）は、Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｅであり、還元糖付加量（シンボルが△）はＡ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄ＜Ｅであった。すなわち、保持時間が長くなるほど、反応性リジン残基が減少し、還元糖付加量が増加することが確認された。これらの結果から、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長くなるほど、タンパク質中のリジン残基への還元糖の付加が進行することが明らかになった。なお、Ａの還元糖付加量が約２５μｇ／ｍｇとなっているのは、凍結乾燥過程によっても還元糖が付加されたことを示す。
【００３９】
＜実施例２＞ＰＡＲＰの抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討）
（１）ＮＯ産生抑制効果の検討
［１−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰにおける一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制効果
〈１−１−１〉細胞へのＰＡＲＰの添加
マウスのマクロファージ様細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を６枚用意し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆとした。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを２時間培養した後、培養上清を除去した。続いて、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地を添加した。次に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆに、下記のとおりＰＡＲＰを添加した。
【００４０】
ａ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｂ；保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＢ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｃ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｄ；保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＤ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｅ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｆ；（添加しない）
【００４１】
続いて、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆにＩＦＮ−γを終濃度１ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに細菌由来リポ多糖（ＬＰＳ）を終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるよう添加した後、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを２４時間培養し、上清を回収した。
【００４２】
〈１−１−２〉ＮＯ産生量の測定
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆについて、回収した培養上清中の一酸化窒素（ＮＯ）量をＧｒｉｅｓｓ法により測定し、これをＮＯ産生量とした。続いて、ｆにおけるＮＯ産生量を１００％とした場合の、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおけるＮＯ産生量の割合（ＮＯ産生率）を算出した。その結果を図３に示す。
【００４３】
図３に示すように、ＮＯ産生率は、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅのいずれも１００％より小さい値であった。また、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅの間でＮＯ産生率を比較すると、ａ＞ｂ＞ｃ＞ｄ＞ｅであった。これらの結果から、ＰＡＲＰはＮＯの産生を抑制すること、およびＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長い、すなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほどＮＯ産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００４４】
［１−２］添加量が異なるＰＡＲＰのＮＯ産生抑制効果
〈１−２−１〉ＰＡＲＰの調製
実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従って、保持時間を３時間としたＰＡＲＰを調製した。
【００４５】
〈１−２−２〉還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）の調製
産卵回帰シロザケから筋肉タンパク質を採取して洗浄し、これを魚肉とした。実施例１（３）に記載の方法に従ってペプシン処理、トリプシン処理および凍結乾燥を行い、還元糖を意図的に付加していないペプチド／アミノ酸（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＰ）を調製した。
【００４６】
〈１−２−３〉細胞へのＰＡＲＰの添加およびＮＯ産生量の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を７枚用意し、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍとした。次に、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従って、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍの細胞へＰＡＲＰまたはＰＡＰを添加した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍに添加したＰＡＲＰまたはＰＡＰ、ならびにその終濃度は下記のとおりとした。
【００４７】
ｇ；添加しない
ｈ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度１００μｇ／ｍＬ
ｉ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度２００μｇ／ｍＬ
ｊ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度３００μｇ／ｍＬ
ｋ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度４００μｇ／ｍＬ
ｌ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｍ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉のＰＡＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
【００４８】
続いて、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生量を測定した。その結果を図４に示す。
【００４９】
図４に示すように、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌのＮＯ産生量はｇと比較していずれも少なかった。一方で、ｍのＮＯ産生量はｇと比較して多かった。また、ｈ、ｉ、ｊ、ｋおよびｌの間でＮＯ産生量を比較すると、ｇ＞ｈ＞ｉ＞ｊ＞ｋ＞ｌであった。これらの結果から、ＰＡＰはＮＯの産生を抑制しないのに対し、ＰＡＲＰはＮＯの産生を抑制することが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＮＯ産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００５０】
（２）炎症性サイトカイン産生抑制効果の検討
［２−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰの炎症性サイトカイン産生抑制効果
〈２−１−１〉細胞へのＰＡＲＰの添加
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を６枚用意し、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓとした。次に、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従ってｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓの細胞へＰＡＲＰを添加した。ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍに添加したＰＡＲＰおよびその終濃度は下記のとおりとした。なお、すべてのサンプルについてＩＦＮ−γは添加しなかった。
【００５１】
ｎ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｏ；保持時間を１時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＢ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｐ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｑ；保持時間を３時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＤ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｒ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｓ；（添加しない）
【００５２】
〈２−１−２〉炎症性サイトカイン産生量の測定
本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉のｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒおよびｓについて、ＥＬＩＳＡ法を用いて培養上清中のＴＮＦ−αの量およびＩＬ−６の量を測定し、それぞれＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量とした。続いて、ｓにおけるＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をそれぞれ１００％とした場合のｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒにおけるＴＮＦ−α産生量の割合（ＴＮＦ−α産生率）およびＩＬ−６産生量の割合（ＩＬ−６産生率）を算出した。その結果を図５に示す。
【００５３】
図５左図に示すように、ＴＮＦ−α産生率は、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒのいずれも１００％より小さい値であった。また、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒの間でＴＮＦ−α産生率を比較すると、ｎ＞ｏ＞ｐ＞ｑ＞ｒであった。このことから、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長いすなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、ＴＮＦ−α産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。また、図５右図に示すように、ＩＬ−６産生率は、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒのいずれも１００％より小さい値であった。また、ｎ、ｏ、ｐ、ｑおよびｒの間でＩＬ−６産生率を比較すると、ｎ＞ｏ＞ｐ＞ｑ＞ｒであった。このことから、ＰＡＲＰの調製工程における保持時間が長いすなわちＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、ＩＬ−６産生の抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００５４】
これらの結果から、ＰＡＲＰは炎症性サイトカインの産生を抑制すること、およびＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど炎症性サイトカインの産生抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００５５】
［２−２］添加量が異なるＰＡＲＰの炎症性サイトカイン産生抑制効果
ＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルとなるよう播いた培養皿を７枚用意し、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚとした。次に、本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉に記載の方法に従ってｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚ細胞へＰＡＲＰを添加した。ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚに添加したＰＡＲＰおよびその終濃度は下記のとおりとした。
【００５６】
ｔ；（添加しない）
ｕ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度１００μｇ／ｍＬ
ｖ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度２００μｇ／ｍＬ
ｗ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度３００μｇ／ｍＬ
ｘ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度４００μｇ／ｍＬ
ｙ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−１〉のＰＡＲＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
ｚ；本実施例（１）［１−２］〈１−２−２〉のＰＡＰ 終濃度５００μｇ／ｍＬ
【００５７】
続いて、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚについて、本実施例（２）［２−１］〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量を測定した。その結果を図６に示す。
【００５８】
図６左図に示すように、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚのＴＮＦ−α産生量はｔと比較していずれも少なかった。また、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの間でＴＮＦ−α産生量を比較すると、ｕ≒ｚ＞ｖ＞ｗ＞ｘ＞ｙであった。これらの結果から、ＰＡＰおよびＰＡＲＰはいずれもＴＮＦ−αの産生を抑制するが、その効果はＰＡＲＰの方が大きいことが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＴＮＦ−α産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００５９】
また、図６右図に示すように、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚのＩＬ−６産生量は、いずれもｔと比較して少なかった。また、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの間でＩＬ−６産生量を比較すると、ｕ＞ｚ＞ｖ＞ｗ＞ｘ＞ｙであった。これらの結果から、ＰＡＰおよびＰＡＲＰはいずれもＩＬ−６の産生を抑制するが、その効果はＰＡＲＰの方が大きいことが明らかになった。また、ＰＡＲＰの添加量が多いほど、ＩＬ−６産生抑制効果が大きくなることが明らかになった。
【００６０】
これらの結果から、ＰＡＲＰは炎症性サイトカインの産生を強く抑制すること、およびＰＡＲＰの添加量が多いほど炎症性サイトカイン産生抑制効果が大きいことが明らかになった。
【００６１】
（３）還元糖としてマルトオリゴ糖を用いたＰＡＲＰの抗炎症効果
アルギン酸オリゴ糖をマルトオリゴ糖に代えて、実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製し、これをマルトオリゴ糖ＰＡＲＰとした。マルトオリゴ糖ＰＡＲＰについて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉および〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生率を求めたところ、ＮＯ産生率は６２％と顕著に低い値であった。また、マルトオリゴ糖ＰＡＲＰについて、本実施例（２）［２−１］〈２−１−１〉および〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生率を求めたところ、ＴＮＦ−α産生率は１６％と極めて低い値であった。
【００６２】
すなわち、アルギン酸オリゴ糖に代えてマルトオリゴ糖を用いたＰＡＲＰは、アルギン酸オリゴ糖を用いたＰＡＲＰと同様、ＮＯ産生抑制効果およびＴＮＦ−α産生抑制効果を有することが明らかになった。これらの結果から、ＰＡＲＰは、構成する還元糖の種類に関わらず、抗炎症効果を有することが明らかになった。
【００６３】
＜実施例３＞ＰＡＲＰの抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｖｏでの検討）
（１）ＰＡＲＰの浮腫増大抑制効果の検討
［１−１］還元糖付加量が異なるＰＡＲＰの浮腫増大抑制効果
〈１−１−１〉ＰＡＲＰの経口投与およびカラギーナンの皮下注射
８週齢の雄のＩＣＲマウスを８匹ずつ４群にわけて、コントロール群、０時間群、２時間群および４時間群とした。各群のマウスを１６時間絶食させた後、下記のとおりＰＡＲＰを生理食塩水に溶解して経口投与した。
【００６４】
コントロール群；生理食塩水
０時間群 ；保持時間を０時間として調製した還元糖を意図的に付加していないペプチド（実施例１（３）のＡ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
２時間群 ；保持時間を２時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＣ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
４時間群 ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
【００６５】
ＰＡＲＰの経口投与から１時間後に、各群のマウスの足の裏（足蹠）に１％カラギーナン溶液を０．０４ｍＬずつ皮下注射した。なお、カラギーナンをげっ歯類に皮下注射すると浮腫などの炎症を惹起することが知られている（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第１１１巻、第５４４−５４７頁、１９６２年）。
【００６６】
〈１−１−２〉足蹠の容積の測定
本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉のコントロール群、０時間群、２時間群および４時間群について、カラギーナンの皮下注射から０、１、２、３、４および５時間経過後に、Ｐｌｅｔｈｙｍｏｍｅｔｅｒを用いて足蹠の容積を測定し、その測定結果に基づいて、下記の式を用いて浮腫増大率を算出した。また、浮腫増大率について、Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）を求めた。
【００６７】
式；浮腫増大率（％）＝｛（１、２、３、４または５時間経過時の容積−０時間経過時の容積）／０時間経過時の容積｝×１００
【００６８】
また、浮腫増大率および浮腫増大率のＡＵＣについて、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により各群間の有意差検定を行った。その結果を図７に示す。なお、図７において、各群間の有意差はアルファベット（ａ、ｂ、ｂｃ、またはｃ）で示す。各群間でアルファベットが異なる場合は有意差あり（ｐ＜０．０５）を意味し、アルファベットが同じである場合は有意差なし（ｐ≧０．０５）を意味するものとする。例えば、ａの場合はｂ、ｃおよびｂｃとは有意差があるがａとは有意差がないことを意味し、ｂｃの場合はａとは有意差があるがｂ、ｃおよびｂｃとは有意差がないことを意味する。
【００６９】
図７上図に示すように、浮腫増大率については、コントロール群と比較して０時間群は、１、２、３および４時間経過時点において有意に小さく、５時間経過時点において小さい傾向であった。２時間群および４時間群は、１、２、３、４および５時間経過時点のいずれにおいても有意に小さかった。浮腫増大率について０時間群、２時間群および４時間群の間で比較すると、０時間群＞２時間群＞４時間群の傾向であった。また、図７下図に示すように、浮腫増大率のＡＵＣについては、コントロール群と比較して０時間群、２時間群および４時間群はいずれも有意に小さかった。浮腫増大率のＡＵＣについて０時間群、２時間群および４時間群の間で比較すると、０時間群＞２時間群＞４時間群の傾向であった。
【００７０】
これらの結果から、ＰＡＲＰは生体に投与した場合に抗炎症効果を有すること、および生体に投与するＰＡＲＰにおける還元糖付加量が多いほど、抗炎症効果が大きいことが明らかになった。
【００７１】
［１−２］市販の抗炎症薬とＰＡＲＰとの比較
８週齢の雄のＩＣＲマウスを８匹ずつ３群にわけて、コントロール群、４時間群およびインドメタシン群とした。各群のマウスに、本実施例（１）［１−１］〈１−１−１〉に記載の方法に従って、生理食塩水に溶解したＰＡＲＰの経口投与およびカラギーナンの皮下注射を行った。ただし、インドメタシン群にはＰＡＲＰに代えて市販の抗炎症薬であるインドメタシンを生理食塩水に溶解して経口投与した。すなわち、コントロール群、４時間群およびインドメタシン群に経口投与したものは、下記のとおりとした。
【００７２】
コントロール群 ；生理食塩水
４時間群 ；保持時間を４時間として調製したＰＡＲＰ（実施例１（３）のＥ）
３００ｍｇ／ｋｇ×マウス個体の体重（ｋｇ）量
インドメタシン群；インドメタシン
１０ｍｇ×／ｋｇマウス個体の体重（ｋｇ）量
【００７３】
続いて、本実施例（１）［１−１］〈１−１−２〉に記載の方法に従って浮腫増大率および浮腫増大率のＡＵＣの算出を行った。その結果を図８に示す。
【００７４】
図８上図に示すように、浮腫増大率については、コントロール群と比較して４時間群は１、２、３および４時間経過時点において有意に小さく、５時間経過時点において小さい傾向であった。また、インドメタシン群は１、２、３、４および５時間経過時点のいずれにおいても有意に小さかった。浮腫増大率について４時間群およびインドメタシン群の間で比較すると、５時間経過時点においては４時間群＞インドメタシン群であったが、１、２、３および４時間経過時点においてはほぼ同じであった。また、図８下図に示すように、浮腫増大率のＡＵＣについては、コントロール群と比較して４時間群およびインドメタシン群はいずれも有意に小さかった。浮腫増大率のＡＵＣについて４時間群およびインドメタシン群の間で比較すると、ほぼ同じであった。
【００７５】
これらの結果から、生体に投与した場合のＰＡＲＰの抗炎症効果は、市販の抗炎症薬に匹敵するほど強力であることが明らかになった。
【００７６】
（２）タンパク質として鶏肉由来の筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰの抗炎症効果
産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を鶏肉の筋肉タンパク質に代えて、実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製し、これを鶏肉ＰＡＲＰとした。また、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を鶏肉の筋肉タンパク質に代えて、実施例２（１）［１−２］〈１−２−２〉に記載の方法に従ってＰＡＰを調製し、これを鶏肉ＰＡＰとした。鶏肉ＰＡＲＰおよび鶏肉ＰＡＰについて、本実施例（１）［１−１］に記載の方法に従って浮腫増大抑制効果を確認したところ、鶏肉ＰＡＰは浮腫増大抑制効果を有さなかったのに対し、鶏肉ＰＡＲＰは浮腫増大抑制効果を有した。
【００７７】
すなわち、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質に代えて鶏肉の筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰは、産卵回帰シロザケの筋肉タンパク質を用いたＰＡＲＰと同様に、抗炎症効果を有することが明らかになった。これらの結果から、ＰＡＲＰは、構成するタンパク質の種類に関わらず、抗炎症効果を有することが明らかになった。
【００７８】
＜実施例４＞等電点電気泳動画分の抗炎症効果の検討（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討）
（１）等電点電気泳動画分の調製
実施例１（１）〜（３）に記載の方法に従ってＰＡＲＰを調製した。また、実施例２（１）［１−２］〈１−２−２〉に記載の方法に従ってＰＡＰを調製した。続いて、ＰＡＲＰおよびＰＡＰを、等電点電気泳動装置（ロトフォア；バイオラド社）に供して、それぞれ計２０の画分（画分番号１、２、３、・・・２０とする）を得た。各画分の等電点を図９に示す。
【００７９】
（２）等電点電気泳動画分のＮＯ産生抑制効果および炎症性サイトカイン抑制効果
本実施例（１）の各画分について、実施例２（１）［１−１］〈１−１−１〉および〈１−１−２〉に記載の方法に従ってＮＯ産生量を、実施例２（２）［２−１］〈２−１−１〉および〈２−１−２〉に記載の方法に従ってＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をそれぞれ測定した。また、ＰＡＲＰまたはＰＡＰを添加しないＲＡＷ２６４．７細胞を２．０×１０５個／ウェルについてのＮＯ産生量、ＴＮＦ−α産生量およびＩＬ−６産生量をコントロールとした。その結果を図１０に示す。
【００８０】
図１０上段に示すように、ＮＯ産生量は、ＰＡＲＰの画分番号５（等電点１．２１）および画分番号６（等電点１．５９）を用いた場合に、顕著に減少した。また、図１０中段に示すように、ＴＮＦ−α産生量は、ＰＡＲＰの画分番号１２（等電点１２．０）および１３（等電点１２．５）を用いた場合に、顕著に減少した。また、図１０下段に示すように、ＩＬ−６産生量は、ＰＡＲＰの画分番号５（等電点１．２１）、６（等電点１．５９）、１２（等電点１２．０）および１３（等電点１２．５）を用いた場合に、顕著に減少した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする抗炎症剤；
（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、
（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【請求項２】
タンパク質が、軟体動物または甲殻類の筋肉、魚肉、畜肉もしくは獣肉の少なくともいずれか由来の筋肉タンパク質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
炎症性疾患予防および／または治療剤である、請求項１または請求項２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
下記（１）または（２）の工程を有する抗炎症剤の製造方法；
（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、
（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、
または、
（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、
（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。
【請求項１】
下記の（ａ）または（ｂ）を有効成分とする抗炎症剤；
（ａ）タンパク質に還元糖を付加させてタンパク質分解酵素で処理して得られる還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸、
（ｂ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して得られるペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加させた還元糖が付加されたペプチドおよび／または還元糖が付加されたアミノ酸。
【請求項２】
タンパク質が、軟体動物または甲殻類の筋肉、魚肉、畜肉もしくは獣肉の少なくともいずれか由来の筋肉タンパク質である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
炎症性疾患予防および／または治療剤である、請求項１または請求項２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
下記（１）または（２）の工程を有する抗炎症剤の製造方法；
（１）（ｉ）タンパク質に還元糖を付加させる工程、
（ｉｉ）前記還元糖を付加させたタンパク質をタンパク質分解酵素で処理する工程、
または、
（２）（ｉｉｉ）タンパク質をタンパク質分解酵素で処理してペプチドおよび／またはアミノ酸を得る工程、
（ｉｖ）前記ペプチドおよび／またはアミノ酸に還元糖を付加する工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１２−２２９１６５（Ｐ２０１２−２２９１６５Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９６６５６（Ｐ２０１１−９６６５６）
【出願日】平成２３年４月２４日（２０１１．４．２４）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２４日（２０１１．４．２４）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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