抗炎症剤及び抗炎症性医療材料
本発明は、優れた抗炎症効果があり、かつ安全性の高い抗炎症剤及び抗炎症性医療材料を提供することを目的とする。 本発明は、ポリリン酸、特に一般式Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物を有効成分として含有する抗炎症剤及び抗炎症性医療材料に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤及び抗炎症性医療材料に関する。
【背景技術】
ポリリン酸はもともと多くの生物種の組織内及び細胞内に含有されており、生体内で常に合成されている物質である（Ｈ．Ｃ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，４５−８１，１９９９参照）。また、ポリリン酸の生体に対する安全性は古くから確かめられており、生体内で無毒なリン酸に分解される生分解性物質であることがわかっている。ポリリン酸の生理機能は未知の部分が多いが、本発明者らのポリリン酸に関する一連の研究によって、ポリリン酸にはＦＧＦ等の細胞増殖因子のような生理活性タンパク質を安定化し、細胞の生理活動をコントロールする機能があることが見出された。具体的には培養細胞増殖促進作用、組織再生促進作用（特開２０００−０６９９６１号公報；Ｔ．Ｓｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．２６７８８−２６７９２，２００３参照）や、石灰化促進作用、骨分化誘導促進作用（特開２０００−７９１６１号公報参照）が確認されている。また、さらなる研究の結果、ポリリン酸の組織再生促進作用を有効に発揮させるために、コラーゲンとの複合体にすることが提案されている（特開２００４−０００５４３号公報参照）。また、ポリリン酸には防カビ、変色防止、ビタミンＣ分解防止、缶の腐食・黒変防止、食味向上、濁り防止などの多岐にわたる効果が知られており、醤油、ジュース類、缶詰類などに食品添加物としても利用されている。
一方、サイトカインは、感染や組織障害などの外からの刺激に反応して白血球やマクロファージなどから放出され、細胞膜表面の特異的な受容体（サイトカイン受容体）に結合し、細胞の増殖分化や免疫応答の制御、細胞間の情報伝達、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用などといった生体の恒常性維持に重要な役割を担っているタンパク質の総称である。サイトカインにはインターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）等多くの種類が存在し、その働きの点からＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５など免疫反応を調整するもの（免疫調節性サイトカイン）、ＩＬ−６，ＴＮＦ−αなど炎症反応を誘導するもの（炎症性サイトカイン）に大別される。サイトカインは互いにその産生を調節し合い、それぞれのサイカインの機能を増幅するためのネットワークを構成している。例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−６及びＴＮＦ−αは互いにその産生を増強し、逆にＩＬ−４やＩＬ−１０は単核球からのこれらの炎症性サイトカインの分泌を抑制する。
炎症とはさまざまな侵襲に対する生体の反応である。また、多岐にわたる疾患の病因あるいは症状の亢進には炎症反応が関与しており、従来炎症性疾患としては分類されていなかった疾患、例えば動脈硬化やアルツハイマー病なども、最近の分子生物学的研究により、その発症過程において炎症反応が重要な役割を担うことが明らかとなってきている。炎症反応には数多くのメディエーターが関与しており、これまでヒスタミン、セロトニンなどのアミン類、プラジキニンなどのキニン類、補体成分、ロイコトリエン、プロスタグランジン等のメディエーターが知られているが、近年サイトカインやケモカインなどの蛋白液性因子の炎症反応惹起及び制御における重要性が明らかになってきている。例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−α、ＩＬ−βなどの炎症性サイトカイン、ＭＣＰ−１などの白血球走化性サイトカインなど様々なサイトカインが炎症の病態の成立に関与するとされている。また、自己免疫疾患は、自己抗原に対する過剰な免疫応答の結果生ずる病態であり、このような病態形成にもサイトカインが深く関与している。
しかしながら、これまでポリリン酸によるサイトカイン産生抑制、抗炎症効果については報告がない。
本発明の課題は、優れた抗炎症効果があり、かつ安全性の高い抗炎症剤及び抗炎症性医療材料を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、生体適合性があり、安全性の高いポリリン酸が炎症性サイトカインの産生を有意に抑制し、抗炎症効果を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤。
（２）ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、上記（１）の抗炎症剤。
（３）式中のｎが５０〜１５０の整数である、上記（２）の抗炎症剤。
（４）ポリリン酸がポリリン酸塩である、上記（１）から（３）のいずれかの抗炎症剤。
（５）皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤。
（６）皮膚、粘膜の炎症が、病原性細菌、免疫反応、又は外傷に起因する上記（５）の抗炎症剤。
（７）病原性細菌が口腔内有害細菌であって、該菌の増殖防止によって炎症を抑制する上記（６）の抗炎症剤。
（８）炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤。
（９）炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患から成る群から選択される疾患である上記（８）の抗炎症剤。
（１０）上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤を含有する抗炎症性医療材料。
（１１）ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、上記（１０）の抗炎症性医療材料。
（１２）式中のｎが５０〜１５０の整数である、上記（１１）の抗炎症性医療材料。
（１３）ポリリン酸がポリリン酸塩である、上記（１０）から（１２）のいずれかの抗炎症性医療材料。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト好中球をＧＭＤＰ及び各濃度のポリリン酸で処理した場合の各時間におけるＩＬ−１β産生量を示す。図中、ポリリン酸濃度はリン酸残基単位で換算したものであり、その分子量は１モルあたり約１０２ｇである。
図２は、処理群（ポリリン酸処理）及び比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す。Ｅは上皮組織、Ｏｄは象牙質を示す。円で囲った部分は処置部位及びその周辺を示す。
図３（Ａ）は、ポリリン酸のＳ．ｍｕｔａｎｓ対する増殖抑制効果を示す。
図３（Ｂ）は、ポリリン酸のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する増殖抑制効果を示す。
図４は、創傷モデルを示す。
図５は、術後３日目の（Ａ）処理群（ポリリン酸処理）及び（Ｂ）比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す（図中、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌはａの拡大写真、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像）；ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌはｂの拡大写真、ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像））。
図６は、術後７日目の（Ａ）処理群（ポリリン酸処理）及び（Ｂ）比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す（図中、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌはａの拡大写真、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像）；ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌはｂの拡大写真、ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像））。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年２月２６日に出願された日本国特許出願２００３−０４８４６０号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明において使用されるポリリン酸は、代表的にはオルトリン酸の脱水縮合によって２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造を有する直鎖状ポリリン酸であるが、側鎖に有機基が導入された側鎖状ポリリン酸、環状ポリリン酸、枝分かれ状のリン酸重合体であるポリリン酸（ウルトラポリリン酸）であってもよい。
本発明において特に好適に使用されるポリリン酸は、一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸から選ばれる１種又は２種以上の混合物が挙げられる。
上記一般式中のｎは３〜８００、好ましくは３０〜５００、より好ましくは５０〜１５０の整数である。
なお、鎖長が１０００以上のポリリン酸は水溶液の形で存在することが確認できておらず、水に難溶性であると考えられるので好ましくない。また、生体内でポリリン酸の鎖長は約８００であるから、鎖長が８００以下のポリリン酸が、生体内で種々の生理機能に関する高い有効性を持つと考えられる（Ｋ．Ｄ．Ｋｕｍｂｌｅ ａｎｄ Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．５８１８−５８２２，１９９５）。
また、本発明においては、上記のポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造を有するポリリン酸塩を使用してもよく、金属としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。
本発明に使用するポリリン酸又はその塩は、１種類であってもよいが、複数種の混合物であってもよい。複数種のポリリン酸又はその塩には、重合度の異なるポリリン酸又はその塩、分子構造の異なるポリリン酸又はその塩、及び金属イオンの異なるポリリン酸塩を包含する。またポリリン酸とその塩とを両方包含してもよい。
上記のポリリン酸は、リン酸を加熱する方法、リン酸に五酸化リンを添加溶解する方法など、通常用いられる製法により製造することができる。
また、特に鎖長が２０以上の中長鎖ポリリン酸は、本発明者らにより開発された以下の方法により製造することができる。まず、ヘキサメタリン酸塩を０．１〜１０重量％、好ましくは１０重量％となるように水に溶解する。このヘキサメタリン酸水溶液に、８７〜１００％エタノール、好ましくは９６％エタノールを、ヘキサメタリン酸溶液とエタノールとの混合後の全体液量の１／１０〜１／３量で、すなわちヘキサメタリン酸水溶液：エタノールが２：１〜９：１の体積比となる量で添加する。この混合溶液を十分に攪拌し、その結果析出する沈殿物を、限定するものではないが、遠心分離またはフィルター濾過等の分離方法を用いて水溶液成分と分離する。このようにして分離した沈殿物が中長鎖ポリリン酸である。このポリリン酸を続いて７０％エタノールにより洗浄し、その後乾燥させる。このような分離操作で得られるポリリン酸の平均鎖長は６０から７０であり、１０以下の短鎖ポリリン酸はほとんど含まれていない。従って、その分子量分布はリン酸残基数で１０から１５０程度である。
本発明の抗炎症剤におけるポリリン酸の含有量は、特に限定はされないが、例えば０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましく０．１〜５重量％、最も好ましくは０．２〜２重量％とすればよい。
ポリリン酸又はその塩は、それ単体で、あるいは薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、内用液剤（懸濁剤、シロップ剤、乳剤など）、外用液剤（注入剤、含嗽・洗口剤、噴霧・エアゾール剤、吸入剤、塗布剤など）、軟膏剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の各種剤型の経口・非経口用製剤にすることができる。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
経口投与用製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤など用いることができる。
非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができる。
また、本発明の抗炎症剤は、さらに強い抗炎症作用を得る目的で、ポリリン酸を既存の抗生物質や抗炎症剤と混合して使用することもできる。この場合、混合する薬剤としては、テトラサイクリン、キノロン系抗炎症剤、クロラムフェニコール、ペニシリン系抗生物質等が挙げられる。
本発明の抗炎症剤は、有効成分であるポリリン酸が炎症性サイトカインの産生を抑制する作用、口腔内有害細菌の増殖抑制作用を有するので、皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための、あるいは炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有効である。
本発明において、「皮膚、粘膜の炎症」とは、病原性細菌、免疫反応、又は外傷等に起因する皮膚、粘膜、特には口腔粘膜の炎症をいい、具体的には、口腔内有害細菌（例えばう蝕菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等）、歯周病菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）など）、アクネ桿菌、ブドウ球菌などの病原性細菌による炎症、創傷や火傷等による炎症、アトピー性皮膚炎や花粉症による狭範囲の炎症、臓器移植時の拒絶反応による広範囲の炎症などが挙げられるがこれらに限定はされない。
また、「炎症性サイトカイン産生亢進に起因する疾患」としては、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種、骨髄腫瘍等の癌；慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性筋炎、強皮症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、バセドー病等の自己免疫疾患；気管支喘息発作、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、蕁麻疹等のアレルギー疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、関節炎、ブドウ膜炎、角膜炎、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）等の炎症性疾患等が挙げられるがこれらに限定はされない。
また、炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＰＡＮＴＥＳから選ばれる少なくとも１種以上をいう。
本発明の抗炎症剤の投与方法としては、経口的又は非経口的方法のいずれでもよい。例えば、塗布剤・軟膏剤等であれば、歯周病組織、口内炎、皮膚炎、痔の患部に直接塗布したり、また噴霧剤等であれば、鼻腔内、口腔内、気管内に噴射することにより投与できる。あるいは、点眼剤として眼に適用することもできる。
本発明の抗炎症剤の投与量は特に限定はされず、患者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整されるが、例えば成人に経口投与する場合、１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日を、１日１回から数回に分けて投与すればよい。
また、本発明の抗炎症剤は、医薬のみならず、抗炎症効果を付与することを目的とする医薬部外品や化粧品等の組成物にも配合できる。例えば医薬部外品や化粧品等としては、化粧水、乳液、クリーム、洗顔料、練歯磨剤、口内洗浄液、含嗽剤などを挙げることができ、これらの組成物には界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐剤等の当分野で通常使用される薬剤を適宜配合してもよい。
また、前述のようにポリリン酸はそれ自体組織再生促進作用（特開２０００−６９９６１号公報）、骨再生促進作用（特開２０００−７９１６１号公報）をもつが、ポリリン酸以外の生体適合材料や再生医療足場材料などの医療材料に混合もしくはコーティングすることによってそれらの材料に抗炎症性を付与することができる。かかる材料としては、例えば、バイオセラミックス（アルミナ、酸化チタン、ジルコニア、カーボン、アパタイト、Ａ−Ｗ結晶化ガラス、リン酸カルシウム系結晶化ガラス、第三リン酸カルシウム（ＴＣＰ）など）、天然高分子材料（コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、セルロース、ヒアルロン酸など）、医療用金属材料（チタン及びチタン合金など）、合成高分子材料（グリコール・ジカルボン酸系、ポリエステルカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）が挙げられる。得られた抗炎症性医療材料は、人工臓器、人工皮膚、人工関節、人工義歯、人工歯根、人工血管、人工骨、手術用縫合糸などの医療器具として生体内で炎症を誘発することなく安全に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（製造例）ポリリン酸（中長鎖ポリリン酸）の製造
食品添加物規格のヘキサメタリン酸ナトリウム２０ｇを精製水２００ｍｌに溶解し、これに９６％のエタノール３２ｍｌを徐々に加えた。これをよく攪拌し室温で３０分ほど放置した後，遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分、２５℃）を行い、水溶液成分と沈殿物とを分離した。水溶液成分を廃棄し、回収した沈殿物に７０％エタノールを加えて洗浄し、真空乾燥した。このようにして、９．２ｇの中長鎖（平均鎖長６０以上）ポリリン酸塩を沈殿物として得た（収量４６．０％）。
（実施例１）ポリリン酸による炎症性サイトカインの産生抑制
上記製造例に従って取得したポリリン酸による炎症性サイトカインの産生抑制効果を確認する目的で、ヒト好中球を用いてＩＬ−１βの産生を観察する実験を行った。ヒト血液２５ｍｌより好中球を分離し、ダルベッコ変法イーグル培地に懸濁した。分離した好中球に３０μｇのグリコペプチドアジュバンドであるＧＭＤＰ［Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−β（１−４）−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ］または各濃度（０．２ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）のポリリン酸、及びその両者を添加して３７℃にて最大５時間処理を行った。比較群として何も添加しなかったもの、各濃度のポリリン酸のみを添加したものについても同様に処理を行った。各時間におけるＩＬ−１β産生量をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。
図１にヒト好中球をＧＭＤＰ及び各濃度のポリリン酸で処理した場合の各時間におけるＩＬ−１β産生量を示す。ＧＭＤＰ単独で処理した場合、ＩＬ−１β産生量は経時的に増加するが、ＧＭＤＰとポリリン酸の両者で処理した場合にはＧＭＤＰ単独処理の場合と比較してＩＬ−１β産生量は処理後３時間までは比較群（無処理好中球）と同様まで抑制されており、処理後５時間においてもポリリン酸の濃度に依存してＩＬ−１β産生量が減少した。またポリリン酸単独で処理した場合、いずれの濃度においてもＩＬ−１β産生量は比較群（無処理好中球）の場合とほとんど変わらなかった。このことは、ＧＭＤＰによって惹起された好中球によるＩＬ−１β産生亢進がポリリン酸により有意に抑制されることを示す。
（実施例２） ポリリン酸による歯周組織の炎症抑制
上記製造例に従って取得したポリリン酸の抗炎症効果を確認する目的で、ラットを用いて、組織の炎症状態を観察する実験を行った。Ｗｉｓｔｅｒ系雄ラット（８週齢、計１０匹）を麻酔し、上顎第一臼歯歯槽部の骨膜を剥離し、１／２ラウンドバーを使用して、上顎第一、第二臼歯の頬側歯槽骨頂より約２ｍｍを削除し、人工的な歯周ポケット（歯肉溝）を形成した。処理群（５匹）においては、歯肉溝にシリンジを用いて１％ポリリン酸溶液を約０．１ｍｌ注入した。また、比較群（５匹）には、１％リン酸緩衝液のみを注入した。この注入操作は歯肉溝作製のための手術翌日から毎日行い、１０日間続行した。
一定期間処理したラットを吸入麻酔法（エーテル）にて安楽死させ、上顎骨を切断し、１０％中性緩衝ホルマリン液（ｐＨ７．４）を用いた浸漬固定により１日間組織の固定を行った。その後、室温で約２日間酸脱灰した。脱灰終了後、第二臼歯で切除することによって標本のトリミングを行い、割面を下にしてパラフィン包埋した。組織切片を作製し、ＨＥ染色して観察した。
図２にポリリン酸処理群とリン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した（図中、Ｅは上皮組織、Ｏｄは象牙質を示す。円で囲った部分は処置部位及びその周辺を示す）。ポリリン酸処理群の処置部位周辺では炎症性細胞はほとんど見られないのに対し、比較群（リン酸処理群）の処置部位周辺では炎症細胞が多数見られ、細菌の繁殖も確認された。このことは、ポリリン酸が歯周病菌増殖を抑制し、顕著に炎症を抑制することを示す。
（実施例３） ポリリン酸による口腔内細菌の増殖抑制試験
口腔内細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｐｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を用いて上記製造例に従って取得したポリリン酸による細菌増殖抑制試験を行った。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＪＣ２株はハートインフュージョン培地を用いて３７℃で嫌気培養を行った。処理群には培養液に各濃度（０，０．０６，０．５％）のポリリン酸、比較群には培養液に各濃度（０，０．０６，０．５％）のリン酸緩衝液を添加して最大で２日間培養し、菌体の増殖を５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより経時的に観察した。一方、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ３３２７７株はブレインハートインフュージョン培地を用いて培養液に各濃度（０，０．０１５，０．０３，０．０６，０．１２，０．２５，０．５％）のポリリン酸を添加し、上記と同期間３７℃で嫌気培養を行い、菌体の増殖を５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより経時的に観察した。
図３（Ａ）は２４時間後の処理群及び比較群におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖、図３（Ｂ）は４８時間後の処理群及び比較群におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体増殖の結果を示す。Ｓ．ｍｕｔａｎｓはリン酸濃度０．５％でも菌体増殖に大きな変化はみられなかったが、ポリリン酸濃度０．０６％で顕著な菌体増殖抑制がみられた。またＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにおいてもポリリン酸濃度０．０１％で顕著な菌体増殖抑制がみられた。このことは、ポリリン酸が口腔内細菌の増殖を抑制したことを示す。
（実施例４） ポリリン酸による創傷部位における炎症抑制試験
上記製造例に従って取得したポリリン酸を用いてラット創傷部位の抗炎症試験を行った。
生後６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に背部を剃毛し、体の長軸に沿って筋膜に達する深さで２０ｍｍ切開を行った後、創中央の両端を５ｍｍの幅になるように筋膜と１糸ずつ縫合して紡錘形の創傷モデルを作成した（図４）。処理群には創部に１％ポリリン酸溶液を、比較群には１％リン酸緩衝液を週５日間局所注入した。３日目、７日目に安楽死させ、創の中央から５ｍｍの距離の組織を図４の如く筋膜上で皮膚を切除し、ＨＥ染色して病理組織学的観察を行った。
図５に術後３日目の（Ａ）ポリリン酸処理群と（Ｂ）リン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した。比較群の創面は依然として好中球を中心とした炎症性細胞浸潤が認められたが（ａ；ａ−１−Ｌはａの拡大写真）、ポリリン酸処理群では好中球の割合が減少し、リンパ球やマクロファージが出現した。全体的には炎症性細胞浸潤が減少し、比較的細胞質に富む紡錘形の線維芽細胞が多数認められた（ｂ；ｂ−１−Ｌはｂの拡大写真）。また、比較群では、上皮の伸長（矢印）はわずかしか認められないが（ａ−２−Ｌ）、ポリリン酸処理群では、創の中心に向かって顕著な上皮の伸長（矢印）が認められた（ｂ−２−Ｌ）。
図６に術後７日目の（Ａ）ポリリン酸処理群と（Ｂ）リン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した。ポリリン酸処理群、比較群ともに中央の創部の上皮は欠如していた。創の断端においては，比較群に比べ（ａ；ａ−１−Ｌはａの拡大写真）、ポリリン酸処理群で上皮の伸長（矢印）が促進されていた（ｂ；ｂ−１−Ｌはｂの拡大写真）。創の中央においては比較群では依然として深部に炎症性細胞が浸潤していたが（ａ−２−Ｌ）、ポリリン酸処理群では、炎症は上部に一部残存するのみで深部では線維性結合組織による修復が生じ、器質化が進んでいた（ｂ−２−Ｌ）。
上記結果より、ポリリン酸処理群では比較群に比べ術後３日目から炎症性細胞浸潤が消退し、皮下組織の基質化が促進され、上皮は早期に伸長し、術後７日目には創面はほぼ完全に上皮化していた。このようにポリリン酸が皮膚組織においても顕著に炎症を抑制し、修復・再生を促進することがわかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、炎症性サイトカインの産生抑制作用を有する抗炎症剤が提供される。本発明の抗炎症剤は、例えば皮膚、粘膜等の炎症部位に直接塗布することにより適用でき、特にう蝕菌や歯周病などの口腔有害細菌の増殖を抑えて抗炎症効果を示すとともに、癌、自己免疫疾患などの炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防に有効である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
本発明はポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤及び抗炎症性医療材料に関する。
【背景技術】
ポリリン酸はもともと多くの生物種の組織内及び細胞内に含有されており、生体内で常に合成されている物質である（Ｈ．Ｃ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ：Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，４５−８１，１９９９参照）。また、ポリリン酸の生体に対する安全性は古くから確かめられており、生体内で無毒なリン酸に分解される生分解性物質であることがわかっている。ポリリン酸の生理機能は未知の部分が多いが、本発明者らのポリリン酸に関する一連の研究によって、ポリリン酸にはＦＧＦ等の細胞増殖因子のような生理活性タンパク質を安定化し、細胞の生理活動をコントロールする機能があることが見出された。具体的には培養細胞増殖促進作用、組織再生促進作用（特開２０００−０６９９６１号公報；Ｔ．Ｓｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．２６７８８−２６７９２，２００３参照）や、石灰化促進作用、骨分化誘導促進作用（特開２０００−７９１６１号公報参照）が確認されている。また、さらなる研究の結果、ポリリン酸の組織再生促進作用を有効に発揮させるために、コラーゲンとの複合体にすることが提案されている（特開２００４−０００５４３号公報参照）。また、ポリリン酸には防カビ、変色防止、ビタミンＣ分解防止、缶の腐食・黒変防止、食味向上、濁り防止などの多岐にわたる効果が知られており、醤油、ジュース類、缶詰類などに食品添加物としても利用されている。
一方、サイトカインは、感染や組織障害などの外からの刺激に反応して白血球やマクロファージなどから放出され、細胞膜表面の特異的な受容体（サイトカイン受容体）に結合し、細胞の増殖分化や免疫応答の制御、細胞間の情報伝達、炎症反応の惹起、抗腫瘍作用などといった生体の恒常性維持に重要な役割を担っているタンパク質の総称である。サイトカインにはインターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）等多くの種類が存在し、その働きの点からＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５など免疫反応を調整するもの（免疫調節性サイトカイン）、ＩＬ−６，ＴＮＦ−αなど炎症反応を誘導するもの（炎症性サイトカイン）に大別される。サイトカインは互いにその産生を調節し合い、それぞれのサイカインの機能を増幅するためのネットワークを構成している。例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−６及びＴＮＦ−αは互いにその産生を増強し、逆にＩＬ−４やＩＬ−１０は単核球からのこれらの炎症性サイトカインの分泌を抑制する。
炎症とはさまざまな侵襲に対する生体の反応である。また、多岐にわたる疾患の病因あるいは症状の亢進には炎症反応が関与しており、従来炎症性疾患としては分類されていなかった疾患、例えば動脈硬化やアルツハイマー病なども、最近の分子生物学的研究により、その発症過程において炎症反応が重要な役割を担うことが明らかとなってきている。炎症反応には数多くのメディエーターが関与しており、これまでヒスタミン、セロトニンなどのアミン類、プラジキニンなどのキニン類、補体成分、ロイコトリエン、プロスタグランジン等のメディエーターが知られているが、近年サイトカインやケモカインなどの蛋白液性因子の炎症反応惹起及び制御における重要性が明らかになってきている。例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−α、ＩＬ−βなどの炎症性サイトカイン、ＭＣＰ−１などの白血球走化性サイトカインなど様々なサイトカインが炎症の病態の成立に関与するとされている。また、自己免疫疾患は、自己抗原に対する過剰な免疫応答の結果生ずる病態であり、このような病態形成にもサイトカインが深く関与している。
しかしながら、これまでポリリン酸によるサイトカイン産生抑制、抗炎症効果については報告がない。
本発明の課題は、優れた抗炎症効果があり、かつ安全性の高い抗炎症剤及び抗炎症性医療材料を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、生体適合性があり、安全性の高いポリリン酸が炎症性サイトカインの産生を有意に抑制し、抗炎症効果を発揮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤。
（２）ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、上記（１）の抗炎症剤。
（３）式中のｎが５０〜１５０の整数である、上記（２）の抗炎症剤。
（４）ポリリン酸がポリリン酸塩である、上記（１）から（３）のいずれかの抗炎症剤。
（５）皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤。
（６）皮膚、粘膜の炎症が、病原性細菌、免疫反応、又は外傷に起因する上記（５）の抗炎症剤。
（７）病原性細菌が口腔内有害細菌であって、該菌の増殖防止によって炎症を抑制する上記（６）の抗炎症剤。
（８）炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤。
（９）炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患から成る群から選択される疾患である上記（８）の抗炎症剤。
（１０）上記（１）から（４）のいずれかの抗炎症剤を含有する抗炎症性医療材料。
（１１）ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、上記（１０）の抗炎症性医療材料。
（１２）式中のｎが５０〜１５０の整数である、上記（１１）の抗炎症性医療材料。
（１３）ポリリン酸がポリリン酸塩である、上記（１０）から（１２）のいずれかの抗炎症性医療材料。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト好中球をＧＭＤＰ及び各濃度のポリリン酸で処理した場合の各時間におけるＩＬ−１β産生量を示す。図中、ポリリン酸濃度はリン酸残基単位で換算したものであり、その分子量は１モルあたり約１０２ｇである。
図２は、処理群（ポリリン酸処理）及び比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す。Ｅは上皮組織、Ｏｄは象牙質を示す。円で囲った部分は処置部位及びその周辺を示す。
図３（Ａ）は、ポリリン酸のＳ．ｍｕｔａｎｓ対する増殖抑制効果を示す。
図３（Ｂ）は、ポリリン酸のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する増殖抑制効果を示す。
図４は、創傷モデルを示す。
図５は、術後３日目の（Ａ）処理群（ポリリン酸処理）及び（Ｂ）比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す（図中、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌはａの拡大写真、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像）；ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌはｂの拡大写真、ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像））。
図６は、術後７日目の（Ａ）処理群（ポリリン酸処理）及び（Ｂ）比較群（リン酸処理）の組織染色写真を示す（図中、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌはａの拡大写真、ａ−１−Ｌ及びａ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像）；ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌはｂの拡大写真、ｂ−１−Ｌ及びｂ−２−Ｌは異なる視野からの染色像（強拡大像））。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年２月２６日に出願された日本国特許出願２００３−０４８４６０号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明において使用されるポリリン酸は、代表的にはオルトリン酸の脱水縮合によって２個以上のＰＯ４四面体が頂点の酸素原子を共有して直鎖状に連なった構造を有する直鎖状ポリリン酸であるが、側鎖に有機基が導入された側鎖状ポリリン酸、環状ポリリン酸、枝分かれ状のリン酸重合体であるポリリン酸（ウルトラポリリン酸）であってもよい。
本発明において特に好適に使用されるポリリン酸は、一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸から選ばれる１種又は２種以上の混合物が挙げられる。
上記一般式中のｎは３〜８００、好ましくは３０〜５００、より好ましくは５０〜１５０の整数である。
なお、鎖長が１０００以上のポリリン酸は水溶液の形で存在することが確認できておらず、水に難溶性であると考えられるので好ましくない。また、生体内でポリリン酸の鎖長は約８００であるから、鎖長が８００以下のポリリン酸が、生体内で種々の生理機能に関する高い有効性を持つと考えられる（Ｋ．Ｄ．Ｋｕｍｂｌｅ ａｎｄ Ａ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．５８１８−５８２２，１９９５）。
また、本発明においては、上記のポリリン酸の水酸基の水素が金属と置換した分子構造を有するポリリン酸塩を使用してもよく、金属としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。
本発明に使用するポリリン酸又はその塩は、１種類であってもよいが、複数種の混合物であってもよい。複数種のポリリン酸又はその塩には、重合度の異なるポリリン酸又はその塩、分子構造の異なるポリリン酸又はその塩、及び金属イオンの異なるポリリン酸塩を包含する。またポリリン酸とその塩とを両方包含してもよい。
上記のポリリン酸は、リン酸を加熱する方法、リン酸に五酸化リンを添加溶解する方法など、通常用いられる製法により製造することができる。
また、特に鎖長が２０以上の中長鎖ポリリン酸は、本発明者らにより開発された以下の方法により製造することができる。まず、ヘキサメタリン酸塩を０．１〜１０重量％、好ましくは１０重量％となるように水に溶解する。このヘキサメタリン酸水溶液に、８７〜１００％エタノール、好ましくは９６％エタノールを、ヘキサメタリン酸溶液とエタノールとの混合後の全体液量の１／１０〜１／３量で、すなわちヘキサメタリン酸水溶液：エタノールが２：１〜９：１の体積比となる量で添加する。この混合溶液を十分に攪拌し、その結果析出する沈殿物を、限定するものではないが、遠心分離またはフィルター濾過等の分離方法を用いて水溶液成分と分離する。このようにして分離した沈殿物が中長鎖ポリリン酸である。このポリリン酸を続いて７０％エタノールにより洗浄し、その後乾燥させる。このような分離操作で得られるポリリン酸の平均鎖長は６０から７０であり、１０以下の短鎖ポリリン酸はほとんど含まれていない。従って、その分子量分布はリン酸残基数で１０から１５０程度である。
本発明の抗炎症剤におけるポリリン酸の含有量は、特に限定はされないが、例えば０．００１〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましく０．１〜５重量％、最も好ましくは０．２〜２重量％とすればよい。
ポリリン酸又はその塩は、それ単体で、あるいは薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、内用液剤（懸濁剤、シロップ剤、乳剤など）、外用液剤（注入剤、含嗽・洗口剤、噴霧・エアゾール剤、吸入剤、塗布剤など）、軟膏剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の各種剤型の経口・非経口用製剤にすることができる。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
経口投与用製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤など用いることができる。
非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができる。
また、本発明の抗炎症剤は、さらに強い抗炎症作用を得る目的で、ポリリン酸を既存の抗生物質や抗炎症剤と混合して使用することもできる。この場合、混合する薬剤としては、テトラサイクリン、キノロン系抗炎症剤、クロラムフェニコール、ペニシリン系抗生物質等が挙げられる。
本発明の抗炎症剤は、有効成分であるポリリン酸が炎症性サイトカインの産生を抑制する作用、口腔内有害細菌の増殖抑制作用を有するので、皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための、あるいは炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有効である。
本発明において、「皮膚、粘膜の炎症」とは、病原性細菌、免疫反応、又は外傷等に起因する皮膚、粘膜、特には口腔粘膜の炎症をいい、具体的には、口腔内有害細菌（例えばう蝕菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ等）、歯周病菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ等）など）、アクネ桿菌、ブドウ球菌などの病原性細菌による炎症、創傷や火傷等による炎症、アトピー性皮膚炎や花粉症による狭範囲の炎症、臓器移植時の拒絶反応による広範囲の炎症などが挙げられるがこれらに限定はされない。
また、「炎症性サイトカイン産生亢進に起因する疾患」としては、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種、骨髄腫瘍等の癌；慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、多発性筋炎、強皮症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、バセドー病等の自己免疫疾患；気管支喘息発作、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症、蕁麻疹等のアレルギー疾患；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、敗血症、関節炎、ブドウ膜炎、角膜炎、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）等の炎症性疾患等が挙げられるがこれらに限定はされない。
また、炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８／ＩＧＩＦ、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＩＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１、ＰＡＮＴＥＳから選ばれる少なくとも１種以上をいう。
本発明の抗炎症剤の投与方法としては、経口的又は非経口的方法のいずれでもよい。例えば、塗布剤・軟膏剤等であれば、歯周病組織、口内炎、皮膚炎、痔の患部に直接塗布したり、また噴霧剤等であれば、鼻腔内、口腔内、気管内に噴射することにより投与できる。あるいは、点眼剤として眼に適用することもできる。
本発明の抗炎症剤の投与量は特に限定はされず、患者の年齢、性別、症状、体重等により適宜調整されるが、例えば成人に経口投与する場合、１０〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日を、１日１回から数回に分けて投与すればよい。
また、本発明の抗炎症剤は、医薬のみならず、抗炎症効果を付与することを目的とする医薬部外品や化粧品等の組成物にも配合できる。例えば医薬部外品や化粧品等としては、化粧水、乳液、クリーム、洗顔料、練歯磨剤、口内洗浄液、含嗽剤などを挙げることができ、これらの組成物には界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、香料、防腐剤等の当分野で通常使用される薬剤を適宜配合してもよい。
また、前述のようにポリリン酸はそれ自体組織再生促進作用（特開２０００−６９９６１号公報）、骨再生促進作用（特開２０００−７９１６１号公報）をもつが、ポリリン酸以外の生体適合材料や再生医療足場材料などの医療材料に混合もしくはコーティングすることによってそれらの材料に抗炎症性を付与することができる。かかる材料としては、例えば、バイオセラミックス（アルミナ、酸化チタン、ジルコニア、カーボン、アパタイト、Ａ−Ｗ結晶化ガラス、リン酸カルシウム系結晶化ガラス、第三リン酸カルシウム（ＴＣＰ）など）、天然高分子材料（コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、セルロース、ヒアルロン酸など）、医療用金属材料（チタン及びチタン合金など）、合成高分子材料（グリコール・ジカルボン酸系、ポリエステルカーボネート、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）が挙げられる。得られた抗炎症性医療材料は、人工臓器、人工皮膚、人工関節、人工義歯、人工歯根、人工血管、人工骨、手術用縫合糸などの医療器具として生体内で炎症を誘発することなく安全に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（製造例）ポリリン酸（中長鎖ポリリン酸）の製造
食品添加物規格のヘキサメタリン酸ナトリウム２０ｇを精製水２００ｍｌに溶解し、これに９６％のエタノール３２ｍｌを徐々に加えた。これをよく攪拌し室温で３０分ほど放置した後，遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分、２５℃）を行い、水溶液成分と沈殿物とを分離した。水溶液成分を廃棄し、回収した沈殿物に７０％エタノールを加えて洗浄し、真空乾燥した。このようにして、９．２ｇの中長鎖（平均鎖長６０以上）ポリリン酸塩を沈殿物として得た（収量４６．０％）。
（実施例１）ポリリン酸による炎症性サイトカインの産生抑制
上記製造例に従って取得したポリリン酸による炎症性サイトカインの産生抑制効果を確認する目的で、ヒト好中球を用いてＩＬ−１βの産生を観察する実験を行った。ヒト血液２５ｍｌより好中球を分離し、ダルベッコ変法イーグル培地に懸濁した。分離した好中球に３０μｇのグリコペプチドアジュバンドであるＧＭＤＰ［Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−β（１−４）−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ］または各濃度（０．２ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ）のポリリン酸、及びその両者を添加して３７℃にて最大５時間処理を行った。比較群として何も添加しなかったもの、各濃度のポリリン酸のみを添加したものについても同様に処理を行った。各時間におけるＩＬ−１β産生量をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。
図１にヒト好中球をＧＭＤＰ及び各濃度のポリリン酸で処理した場合の各時間におけるＩＬ−１β産生量を示す。ＧＭＤＰ単独で処理した場合、ＩＬ−１β産生量は経時的に増加するが、ＧＭＤＰとポリリン酸の両者で処理した場合にはＧＭＤＰ単独処理の場合と比較してＩＬ−１β産生量は処理後３時間までは比較群（無処理好中球）と同様まで抑制されており、処理後５時間においてもポリリン酸の濃度に依存してＩＬ−１β産生量が減少した。またポリリン酸単独で処理した場合、いずれの濃度においてもＩＬ−１β産生量は比較群（無処理好中球）の場合とほとんど変わらなかった。このことは、ＧＭＤＰによって惹起された好中球によるＩＬ−１β産生亢進がポリリン酸により有意に抑制されることを示す。
（実施例２） ポリリン酸による歯周組織の炎症抑制
上記製造例に従って取得したポリリン酸の抗炎症効果を確認する目的で、ラットを用いて、組織の炎症状態を観察する実験を行った。Ｗｉｓｔｅｒ系雄ラット（８週齢、計１０匹）を麻酔し、上顎第一臼歯歯槽部の骨膜を剥離し、１／２ラウンドバーを使用して、上顎第一、第二臼歯の頬側歯槽骨頂より約２ｍｍを削除し、人工的な歯周ポケット（歯肉溝）を形成した。処理群（５匹）においては、歯肉溝にシリンジを用いて１％ポリリン酸溶液を約０．１ｍｌ注入した。また、比較群（５匹）には、１％リン酸緩衝液のみを注入した。この注入操作は歯肉溝作製のための手術翌日から毎日行い、１０日間続行した。
一定期間処理したラットを吸入麻酔法（エーテル）にて安楽死させ、上顎骨を切断し、１０％中性緩衝ホルマリン液（ｐＨ７．４）を用いた浸漬固定により１日間組織の固定を行った。その後、室温で約２日間酸脱灰した。脱灰終了後、第二臼歯で切除することによって標本のトリミングを行い、割面を下にしてパラフィン包埋した。組織切片を作製し、ＨＥ染色して観察した。
図２にポリリン酸処理群とリン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した（図中、Ｅは上皮組織、Ｏｄは象牙質を示す。円で囲った部分は処置部位及びその周辺を示す）。ポリリン酸処理群の処置部位周辺では炎症性細胞はほとんど見られないのに対し、比較群（リン酸処理群）の処置部位周辺では炎症細胞が多数見られ、細菌の繁殖も確認された。このことは、ポリリン酸が歯周病菌増殖を抑制し、顕著に炎症を抑制することを示す。
（実施例３） ポリリン酸による口腔内細菌の増殖抑制試験
口腔内細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｐｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を用いて上記製造例に従って取得したポリリン酸による細菌増殖抑制試験を行った。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ ＪＣ２株はハートインフュージョン培地を用いて３７℃で嫌気培養を行った。処理群には培養液に各濃度（０，０．０６，０．５％）のポリリン酸、比較群には培養液に各濃度（０，０．０６，０．５％）のリン酸緩衝液を添加して最大で２日間培養し、菌体の増殖を５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより経時的に観察した。一方、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ３３２７７株はブレインハートインフュージョン培地を用いて培養液に各濃度（０，０．０１５，０．０３，０．０６，０．１２，０．２５，０．５％）のポリリン酸を添加し、上記と同期間３７℃で嫌気培養を行い、菌体の増殖を５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより経時的に観察した。
図３（Ａ）は２４時間後の処理群及び比較群におけるＳ．ｍｕｔａｎｓの増殖、図３（Ｂ）は４８時間後の処理群及び比較群におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体増殖の結果を示す。Ｓ．ｍｕｔａｎｓはリン酸濃度０．５％でも菌体増殖に大きな変化はみられなかったが、ポリリン酸濃度０．０６％で顕著な菌体増殖抑制がみられた。またＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにおいてもポリリン酸濃度０．０１％で顕著な菌体増殖抑制がみられた。このことは、ポリリン酸が口腔内細菌の増殖を抑制したことを示す。
（実施例４） ポリリン酸による創傷部位における炎症抑制試験
上記製造例に従って取得したポリリン酸を用いてラット創傷部位の抗炎症試験を行った。
生後６週齢のＷｉｓｔａｒ系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に背部を剃毛し、体の長軸に沿って筋膜に達する深さで２０ｍｍ切開を行った後、創中央の両端を５ｍｍの幅になるように筋膜と１糸ずつ縫合して紡錘形の創傷モデルを作成した（図４）。処理群には創部に１％ポリリン酸溶液を、比較群には１％リン酸緩衝液を週５日間局所注入した。３日目、７日目に安楽死させ、創の中央から５ｍｍの距離の組織を図４の如く筋膜上で皮膚を切除し、ＨＥ染色して病理組織学的観察を行った。
図５に術後３日目の（Ａ）ポリリン酸処理群と（Ｂ）リン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した。比較群の創面は依然として好中球を中心とした炎症性細胞浸潤が認められたが（ａ；ａ−１−Ｌはａの拡大写真）、ポリリン酸処理群では好中球の割合が減少し、リンパ球やマクロファージが出現した。全体的には炎症性細胞浸潤が減少し、比較的細胞質に富む紡錘形の線維芽細胞が多数認められた（ｂ；ｂ−１−Ｌはｂの拡大写真）。また、比較群では、上皮の伸長（矢印）はわずかしか認められないが（ａ−２−Ｌ）、ポリリン酸処理群では、創の中心に向かって顕著な上皮の伸長（矢印）が認められた（ｂ−２−Ｌ）。
図６に術後７日目の（Ａ）ポリリン酸処理群と（Ｂ）リン酸緩衝液で処理した比較群より抜粋した組織標本の染色像を示した。ポリリン酸処理群、比較群ともに中央の創部の上皮は欠如していた。創の断端においては，比較群に比べ（ａ；ａ−１−Ｌはａの拡大写真）、ポリリン酸処理群で上皮の伸長（矢印）が促進されていた（ｂ；ｂ−１−Ｌはｂの拡大写真）。創の中央においては比較群では依然として深部に炎症性細胞が浸潤していたが（ａ−２−Ｌ）、ポリリン酸処理群では、炎症は上部に一部残存するのみで深部では線維性結合組織による修復が生じ、器質化が進んでいた（ｂ−２−Ｌ）。
上記結果より、ポリリン酸処理群では比較群に比べ術後３日目から炎症性細胞浸潤が消退し、皮下組織の基質化が促進され、上皮は早期に伸長し、術後７日目には創面はほぼ完全に上皮化していた。このようにポリリン酸が皮膚組織においても顕著に炎症を抑制し、修復・再生を促進することがわかった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、炎症性サイトカインの産生抑制作用を有する抗炎症剤が提供される。本発明の抗炎症剤は、例えば皮膚、粘膜等の炎症部位に直接塗布することにより適用でき、特にう蝕菌や歯周病などの口腔有害細菌の増殖を抑えて抗炎症効果を示すとともに、癌、自己免疫疾患などの炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防に有効である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２】
ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
式中のｎが５０〜１５０の整数である、請求項２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
ポリリン酸がポリリン酸塩である、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための請求項１から４のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項６】
皮膚、粘膜の炎症が、病原性細菌、免疫反応、又は外傷に起因する請求項５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
病原性細菌が口腔内有害細菌であって、該菌の増殖防止によって炎症を抑制する請求項６に記載の抗炎症剤。
【請求項８】
炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項９】
炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患から成る群から選択される疾患である請求項８に記載の抗炎症剤。
【請求項１０】
ポリリン酸を含有する抗炎症性医療材料。
【請求項１１】
ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、請求項１０に記載の抗炎症性医療材料。
【請求項１２】
式中のｎが５０〜１５０の整数である、請求項１１に記載の抗炎症性医療材料。
【請求項１３】
ポリリン酸がポリリン酸塩である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の抗炎症性医療材料。
【請求項１】
ポリリン酸を有効成分として含有する抗炎症剤。
【請求項２】
ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
式中のｎが５０〜１５０の整数である、請求項２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
ポリリン酸がポリリン酸塩である、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
皮膚、粘膜の炎症の治療及び／予防のための請求項１から４のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項６】
皮膚、粘膜の炎症が、病原性細菌、免疫反応、又は外傷に起因する請求項５に記載の抗炎症剤。
【請求項７】
病原性細菌が口腔内有害細菌であって、該菌の増殖防止によって炎症を抑制する請求項６に記載の抗炎症剤。
【請求項８】
炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患の治療及び／又は予防のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗炎症剤。
【請求項９】
炎症性サイトカインの産生亢進に起因する疾患が、癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患から成る群から選択される疾患である請求項８に記載の抗炎症剤。
【請求項１０】
ポリリン酸を含有する抗炎症性医療材料。
【請求項１１】
ポリリン酸が、下記一般式：
Ｈｎ＋２（ＰｎＯ３ｎ＋１）
（式中、ｎは３〜８００の整数を表す）で表される直鎖状リン酸の１種又は２種以上の混合物である、請求項１０に記載の抗炎症性医療材料。
【請求項１２】
式中のｎが５０〜１５０の整数である、請求項１１に記載の抗炎症性医療材料。
【請求項１３】
ポリリン酸がポリリン酸塩である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の抗炎症性医療材料。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７５９０６
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２８８９（Ｐ２００５−５０２８８９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２１６２
【国際出願日】平成１６年２月２５日（２００４．２．２５）
【出願人】（５０２１２４２４８）リジェンティス株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月１０日（２００４．９．１０）
【発行日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２１６２
【国際出願日】平成１６年２月２５日（２００４．２．２５）
【出願人】（５０２１２４２４８）リジェンティス株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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