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抗生物質を伴うポリアミンの使用
説明

抗生物質を伴うポリアミンの使用

細菌及び耐性菌株を親水性抗生物質に感作させ、かつ前記抗生物質に対する細菌の耐性を減少させるためのポリアミンの使用を含む、抗生物質の全体の有効性を改善し、かつ細菌を死滅させるために抗生物質耐性に影響を与えるための組成及び方法が本発明に含まれる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(発明の背景)
本発明は、一般に細菌感染のための薬剤による治療の分野及び殺菌剤の分野に関する。特に、本発明は、抗生物質の総体的な効果を改善し、細菌を死滅させ、抗生物質耐性に影響を与えるための組成及び方法に向けられている。
【背景技術】
【0002】
(先行技術)
抗生物質及び他の抗菌薬は、無数の生命を救い、多くの病気及び伝染病の深刻な混乱を鈍らせるために幅広く使用されていた。50年以上の広範囲に及ぶ使用の後、多くの抗菌薬は、部分的には菌耐性という理由により、細菌に対して効果が少なくなっている。耐性菌は、抗生物質の効果を回避するための方法を開発した。特に、抗生物質の過剰使用及び広範囲に及ぶ使用は、細菌が最も効果的な薬剤から生き残ることができるように進化的適応を促進したと考えられる。抗菌薬耐性は、病原菌に延命効果を与え、伝染病を撲滅することを難しくさせている。
【0003】
菌耐性の増加する発生は、病院又は他の周囲の環境において、より深刻な感染をもたらすことの危険性を増加させた。例えば、結核、淋病、マラリアのような病気及び幼少期の耳の感染は、前記病気を引き起こす病原体が従来の抗生物質に対してより大きい耐性を有するようになったため、現在治療することがより難しい。薬剤耐性は、より良く効く又はより有毒な抗生物質の助けなしに、感染を撃退することができなくなる危篤状態の患者をかくまっている病院にとって特に難しい問題である。不運にも、これは既知の最も強い抗生物質の存在下においてすら、生き残るためのより卓越した能力を備えた細菌を生成することによって問題を悪化させる。これらのなおさら強い薬物抵抗性の細菌は、病院の弱い患者を犠牲にし続ける。前記感染、抗生物質耐性は、結果としてより長い病院の滞在、より高い死亡率及び増加された医療費をもたらし得る。
【0004】
従って、抗生物質の生物学的活性を改良するための方法及び組成の必要性が常に存在する。抗生物質に対する菌耐性をより効果的に処置するための前記方法及び組成の必要性もまた存在する。本発明が向けられているのは、とりわけ前記の必要性である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0005】
(発明の簡単な説明)
簡潔には、本発明は、抗菌薬及び殺菌剤の有効性を改良するための方法及び組成を提供する。細菌及びその耐性菌に対する抗生物質の有効性を改良するための例示的な方法及び組成は、細菌又は細菌の耐性菌を抗生物質に感作させるためのポリアミンの投与、及び細菌を死滅させ又は抑制するための抗生物質の投与を含む。本発明の一般的原理は、抗生物質及び殺菌剤の抗菌効果を大幅に改善し得る方法を提供する。
【0006】
本発明は、一般にポリアミン単独又は抗生物質を組み合わせての効果的な量を投与することによる被験者における細菌感染の治療を含む。一つの実例となる治療において、ポリアミン及び抗生物質は、ポリアミンが細菌を抗生物質に感作させ、抗生物質がより良く細菌を死滅させ又は抑制し得るように、外因性投与によってそれぞれの適切なレベルに誘導するために被験者に対して同時に投与され得る。別の実例となる治療において、ポリアミンは、細菌の耐性菌を抗生物質に感作させるために、抗生物質による治療のコースの先又は後に被験者へ投与され得る。さらに別の例示的治療において、被験者は、ポリアミンの投与より前の期間に抗生物質による治療をされ得る。次に、ポリアミンは細菌又は細菌の耐性株を抗生物質に感作させるために投与され得る。従って、ポリアミンは、抗生物質と同時に、抗生物質の前に、及び/又は抗生物質の後に、被験者へ投与され得る。
【0007】
本発明の全体の構成は、治療的に有効なポリアミン及び抗生物質の量を含む。ポリアミン及び/又は抗生物質の特定の量は、使用された抗生物質、使用されたポリアミン、治療されるための病気又は感染症、及び治療の継続期間に依存され得る。一般に、投薬量は前記要因により変化し得る。好適な投薬量は、抗生物質及び/又はポリアミンの治療に効果的である最低投与量である。投薬量は、適切な医学的判断の事情内で主治医又は獣医によって決定され得る。効果的な投薬量の形式、ポリアミン及び抗生物質の投薬量及び投与の態様は、経験的に決定され得て、前記決定を行うことは技術の熟練の範囲内である。
【0008】
本発明の一つの利点は、治療的な有効性を達成するためにいくつかの抗生物質の濃度を低下させることを可能にし得ることである。本発明は、例えば、治療の継続期間が減少され、集中治療室における又は病院又は診療所における全体の滞在を縮め、かつ付随して深刻な院内で起こる(院内)感染の危険を減少させる結果、生活の利益の質をも提供し得る。
【0009】
本発明は、以下の好適な実施形態の詳細な説明が添付の図面と関係して読まれるときに、当業者にとって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【0010】
(好適な実施形態の詳細な説明)
本発明の好適な実施形態は、抗生物質及び他の抗菌剤の効果を増加させるための組成及び方法を含む。細菌及びその耐性菌に対する抗生物質の有効性を改良するための本発明の例示的な方法及び組成は、細菌又は細菌の耐性菌を抗生物質に感作させるために、ポリアミンの投与及び細菌を抑制し又は死滅させるための抗生物質の投与を含む。本発明の一般的原理は本明細書において定義され、抗生物質及び殺菌剤の抗菌効果を大幅に改良し得る方法を提供する。
【0011】
より具体的には、抗生物質、特に親水性の抗生物質を伴う種々のポリアミンの投与又は同時投与は、そのような抗生物質に対する菌耐性を減少させ、細菌の耐性株を死滅させ、かつ前記抗生物質の有効性を改善することが突然に発見された。以前の研究は、天然のポリアミン(例えばカダベリン、スペルミジン、スペルミン)が腸内細菌を親水性の抗生物質に感作させ得ないこと、及び天然のポリアミンが殺菌又は感作活性のいずれを有しないことを示した。先行技術は、細菌を抗生物質に感作させるためのポリアミンの使用、特に天然のポリアミンの使用に焦点を合わせていなかった。種々の抗生物質(親水性の抗生物質を含む)及びポリアミンによる実験の後、ポリアミンが緑膿菌、大腸菌、枯草菌及び黄色ブドウ球菌のような細菌を抗生物質及び殺菌剤に感作させ得ることが発見された。
【0012】
本発明の一つの例示的実施形態は、単独又は抗生物質と組み合わせたポリアミンの効果的な量を投与することによる、被験者における細菌感染の治療を含む。一つの例示的治療において、ポリアミン及び抗生物質は、ポリアミンが細菌を抗生物質に感作させ、抗生物質がより良く細菌を死滅させ又は抑制し得るように、外因性投与によってそれぞれの適切なレベルに誘導するために被験者に対して同時投与され得る。別の例示的治療において、ポリアミンは、細菌の耐性菌を抗生物質に感作させるために、抗生物質による治療のコースの先又は後に被験者へ投与され得る。さらに別の例示的治療において、被験者は、ポリアミンの投与より前の期間に抗生物質による治療をされ得る。次に、ポリアミンは細菌又は耐性菌を抗生物質に感作させるために投与され得る。従って、ポリアミンは、抗生物質と同時に、抗生物質の前に、及び/又は抗生物質の後に、被験者へ投与され得る。
【0013】
例えば、抗生物質のコースが十分な有効性を提供しない場合、次にポリアミンのコースが細菌を感作させ、抗生物質の有効性を増加させるために投与され得る。同様に、ポリアミンのコースが単に抗生物質の有効性を増加させるために、抗生物質のコースの後で投与され得る。別の例としては、ポリアミンのコースが、抗生物質の有効性を増加させるために抗生物質のコースと同時に投与され得る。同様に、被験者がアレルギーを有し又は他の医学的に好適な抗生物質に過敏であり得る場合においては、ポリアミンのコースは、抗生物質の有効性を増加させるために、一般に有効性がより少ないと考えられる抗生物質のコースと同時に投与され得る。さらに別の例としては、ポリアミンのコースは、抗生物質に対して細菌を予め過敏にするために、抗生物質のコースの投与より前に投与され得る。
【0014】
本発明の一般的な全体構成は、選択されたポリアミン及び抗生物質の治療的に効果的な量を含む。ポリアミン及び/又は抗生物質の特定の量は、使用された抗生物質、使用されたポリアミン、治療されるための病気又は感染症(細菌感染の重症度又はその抵抗力を含む)、患者の集団及び状況、組成の排泄率、並びに治療の継続期間に依存され得る。一般に、投薬量は前記要因により変化し得る。好適な投薬量は、抗生物質及び/又はポリアミンの治療に効果的である最低投与量である。投薬量は、適切な医学的判断の事情内で主治医又は獣医によって決定され得る。効果的な投薬量の形式、ポリアミン並びに抗生物質の投薬量及び投与の態様は経験的に決定され得て、前記決定を行うことは技術の熟練の範囲内である。
【0015】
いくつかの抗生物質の使用が全身毒性又は非常に高い費用によって制限されるので、治療有効性に必要とされる抗生物質の濃度の低下は、治療の費用及び/又は毒性を減少させ、これにより抗生物質の幅広い使用及び/又は代替的な抗生物質の使用を可能にする。例えば、抗生物質を伴うポリアミンの投与は、抗生物質及び/又は抗菌薬を含む治療薬の投薬量を本質的に減少させることによって、特定の抗生物質及び/又は抗菌薬の副作用を回避し得る。本発明は、例えば、治療の継続期間が減少され、集中治療室又は病院における全般的な滞在を縮め、かつ付随して深刻な院内で起こる(院内)感染の危険を減少させる結果、生活の利益の質をも提供し得る。
【0016】
本発明による使用に適したポリアミンは、天然のポリアミン、好適には無毒な天然の化合物でありかつ/又は普通の動物及び/又は人体において高水準にて存在するポリアミンを含む。本発明の好適な実施例による使用のために選択されたポリアミンは、天然のポリアミンである。前記天然のポリアミンは、例えばカダベリン、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン、ノルスペルミジン及びノルスペルミンを含む。スペルミン及びスペルミジンのポリアミンがプトレッシン及びカダベリンより細菌に感作させることが発見されたため、より好適なポリアミンはスペルミン及びスペルミジンを含む。人工の類似体及び他のポリアミンは、本発明に適切であり、かつ過度の実験なしに利用可能である。
【0017】
本発明により使用され得る実例となるポリアミンは、このポリアミンが抗生物質に対する菌耐性を減少すること及び抗生物質の有効性を改良することにおいて、最高の有効性を示すようなスペルミンである。本明細書に記述された実施例において示されるように、このポリアミンは耐性菌を感作させ得るとともに、種々の抗生物質が細菌感染の治療に有効であり得る。前記ポリアミンはまた人間にとって無毒であり、かつ人体において自然に発見されるので、前記ポリアミンは人間の患者に対して安全に投与され得る。実施例において開示された結果は、他のポリアミンに対して推定され得る。
【0018】
本発明に適切である抗生物質は、合成又は自然に生成された物質を含み、それは微生物を殺し、又は成長を抑制し得る。前記抗生物質は、β‐ラクタム抗生物質、マクロライド剤、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、カプレオマイシン、コリスチメテート(colistimethate)、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バシトラシン、エリスロマイシン、ナリジクス酸、バンコマイシン、及びトリメトプリムを含み得る。 典型的なβ‐ラクタム抗生物質は、アンピシリン、アゾシリン(azlocillin)、アズトレオナム、カルベニシリン、セフォペラゾン、セフトリアキソン、セファロリジン、セファロチン、クロキサシリン、モキサラクタム、ペニシリンG、ピペラシリン、及びチカルシリンを含む。カチオンペプチド(cation peptide)を含む他の抗生物質もまた、本発明に適切である。
【0019】
本発明の使用のための抗生物質は、一以上の抗菌薬又は抗生物質を含む治療又は組成をさらに含む。例えば、一連の(次々に)又は平行して(同時に又は組み合わせとして)投与される第一及び第二の抗生物質は、本発明に使用され得て、抗生物質という用語に含まれる。一つの実施例において、第一及び第二の抗生物質の組み合わせは、例えばゲンタマイシン又はバンコマイシンのようなペニシリン及びアミノグリコシド抗生物質になり得る。好適な実施例において、抗生物質の組み合わせは、互いに異なる少なくとも二つの抗生物質を含み、各抗生物質が好適には抗生物質の異なるクラスからのものである。
【0020】
通常の当業者にとって明白であるように、ポリアミン及び/又は抗生物質の組成は、既知及び将来開発される医療的方法を使用して投与され得る。前記組成は、種々の投与手段により投与を考案され得る。好適な実施例において、抗生物質製品は経口投与に適切な方法により考案される。経口投与は、丸薬又は粒子としての各投薬形態と共に、その後経口投与のために例えばカプセルに、又は錠剤に組み込まれ、又は液体に懸濁される、単位薬剤製品に形成される丸薬又は粒子を含み得る。
【0021】
さらに、経口伝達系を考案することにおいて、抗生物質及びポリアミン製品のそれぞれの投薬形態は、単位抗生物質製品を生産するためにカプセルの中に入れられるそれぞれの錠剤を備えた錠剤として考案され得る。従って、例えば、抗生物質製品は即効性錠剤である錠剤の形態において第一の投薬形態を含み得て、さらに抗生物質の遅延放出を提供する少なくとも一つの追加の錠剤を含み得る。それによって錠剤のそれぞれから放出される抗生物質又はポリアミンは、所望された時間帯において達成される抗生物質製品から放出された全体の抗生物質と共に異なる時間に放出される。遅延放出に関して技術的に知られるように、放出時間は被覆剤の厚さ及び/又は被覆剤において、抗生物質の濃度によって制御され得る。
【0022】
このようにして、抗生物質の一部及びポリアミンの一部は、同時に又は異なる時間において放出され得る。例えば、素早い放出の(最初に放出する)錠剤は、抗生物質又はポリアミンのいずれにもなり得るし、遅い放出の(二番目に放出する)錠剤は、ポリアミン又は抗生物質それぞれになり得る。さらに遅い(三番目及び以上に放出する)錠剤は所望されたような抗生物質及び/又はポリアミンを含むことをも含まれ得る。放出系のタイプは、臨床医が最初に抗生物質又はポリアミンを放出するか否かを決定することを可能にする。代替的に、抗生物質とポリアミンは単一の錠剤において結合され得て、又は分離され得るが同様の時間に放出する錠剤である。
【0023】
さらに、抗生物質とポリアミンの組み合わせ又はポリアミンは、軟膏及び他の殺菌剤の局所使用における使用のためにさらに設計され得る。例えば、抗生物質を備えたポリアミンの組み合わせは、抗菌性の洗浄液として特に有効性があり得る。一つの実施例において、局所性投与は、抗生物質又はポリアミンを含むそれぞれの少なくとも二つの異なる投薬形態において使用され、前記投与形態を水中油型乳剤又は油中水乳剤に含めることにより局所投与用に考案され得る。前記考案において、即効型投薬形態は連続的な段階に存在し、遅延放出性の投薬形態は不連続の段階に存在する。前記考案は、複数の投薬形態の伝達のための方法においても生成され得る。例えば、そこに即効型成分を含む連続的な段階になる油及び第一の遅延放出性の投薬形態を含む油に分散される水を備えた水中油型油中水(oil-in-water-in-oil)乳剤が提供され得る。軟膏は、クリーム又は乳液、又は局所性投与のために用いられるものに類似する他の溶ける投薬形態の形態であり得る。合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロース又は変性無機物質のような増粘剤は、使用者の肌への直接的塗布のために、広げることが可能なペースト、ゲル、軟膏、せっけん等を形成するために液体担体と共にも使用され得る。
【0024】
消毒した注射剤は、上記に列挙された種々の他の材料を有する適切な溶剤中に必要な量の活性化合物を組み込むことによっても準備され得て、必要に応じて濾過滅菌がこれに続く。消毒した注射剤の準備のために消毒した粉末の場合において、好適な準備の方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。凍結乾燥技術は、前もって消毒しフィルター処理した(sterile-filtered)溶剤において、任意の付加的な所望された原料の存在を加える活性成分の粉末を生成する。溶剤は、抗生物質とポリアミンの組み合わせになり得る。あるいは、抗生物質及びポリアミンの別個の注射が所望された順序により投与され得る。前記溶剤は、代わりに抗生物質及びポリアミンのミクロスフェア又はナノスフィアを含み得る。溶解した前記ミクロスフェア又はナノスフィアは、所定の率において体内において活性化する。
【0025】
体内における使用に加えて、適切なポリアミンが体外の条件下において抗生物質と共に使用され得ることがさらに検討され得る。例えば、ポリアミンは、食品をより新鮮により長く保つために、食品産業において抗生物質と共に使用され得る。前記使用において、ポリアミンは、食品の腐敗を引き起こす細菌を抑制する抗生物質を助け、これにより在庫期間を増加させるであろう。別の例としては、ポリアミンは、血液、細胞又は組織と共に、前記物体を低細菌又は無細菌に保つために使用され得る。前記使用において、ポリアミンは、血液、細胞又は組織を傷つけることを引き起こす細菌を抑制する抗生物質を助けるであろう。従って、ポリアミンは血液、細胞、又は組織の効果的な耐用年数を増加させる。
【0026】
抗生物質を伴うポリアミンの活動又は抵抗力を与える作用は、まだ完全に理解されておらず、その効果は全てのポリアミンにまで及び得ない。ポリアミンは、イー・フラックス(e.flux)ポンプに影響することによって活動し得ると考えられる。さらには、ポリアミンは、蛋白質と結合しているペニシリンに影響することによって活動し得ると考えられる。好適な抗生物質は、前記作用の一つを通じて働くものである。しかしながら、ポリアミンが薬剤耐性の感染症の治療をもたらし、抗生物質の有効性を改善し得る正確な作用は重大ではない。
【0027】
(実施例)
本部分におけるデータ及び実施例は、抗生物質の有効性がポリアミンの投与又はポリアミンとの組み合わせによって向上され得ることを確立するために含まれた。より具体的には、本発明は以下の非制限的実施例の参照によりさらに説明される。
【0028】
(一般的物質及び方法)
(実験的培養条件)
緑膿菌及び大腸菌を含む細菌の種々の株は、ルリア‐ベルターニ(LB)寒天/培地又はミューラー‐ヒントン(MH)寒天/培地上において培養された。生育曲線は、種々の化学物質、ポリアミン及び/又は抗生物質の存在下における細菌の生育により決定された。植菌された細胞は、次に空気・温度を調整された培養器において培養された。アリコートは毎時間引き出され、光学密度は600nmにおいて測定された。抗生物質、化学物質及び/又はポリアミンは再蒸留水又は溶媒に溶解され、その後0.4μm使い捨て膜を通じて濾過された。
【0029】
(タイムキリング(Time Killing)分析)
タイムキリング分析は、種々の細菌試料について実行された。簡潔には、試験された細菌は、ミューラー‐ヒントン培地において中期対数増殖期まで培養された。当該細胞は、室温において、ポリアミン(例えばスペルミン)を含むリン酸ナトリウム緩衝液に徐々に希釈された。対照群として、いかなる追加の化合物も有しないリン酸ナトリウムに細胞が希釈された。アリコートは特定の時間間隔にて引き出され、LB寒天プレート上に拡散されて、37°Cにて一晩培養された。生き残ったコロニーの百分率は、対照に対して相対的に決定された。
【0030】
(最小抑制濃度(MIC)値)
ポリアミンと抗生物質の種々の組み合わせに関連した株のMIC値は、ミューラー‐ヒントン培地における培地希釈技術及び標準倍数寒天希釈技術を使用して決定された。可視の濁りを有しない薬剤の最低濃度が、MICと考えられた。抗生物質拡散分析もまた、寒天希釈及び培地希釈技術からの結果を検証するために実行された。
【0031】
(β‐ラクタマーゼ分析)
β‐ラクタマーゼ活性は、ニトロセフィンを基質として使用する分光光度法により決定された。β‐ラクタマーゼが細胞から抽出された後、β‐ラクタマーゼ活性は、分子消滅係数20500を有する486nmの波長における吸光度変化により観察された。加水分解の範囲は、抑制されていないままの酵素の量の反射であった。
【0032】
(lacZ::ampCプロモータ融合の構築及びβ‐ガラクトシダーゼ分析)
ゲノムDNAは、種々の細菌、例えば緑膿菌PAO1から抽出され、PCRプライマー対5´‐ggaagtcctccagccgcggcag‐3/5´‐ggcgtcctttgtcgttggctgcatgagaaa‐3´(500‐bps断片)を有するampC(PA4110)プロモータ領域の増幅に使用された。500‐bpsPCR断片は、回転カラムを使用して精製され、プラスミドpAU16Rをもたらす広宿主域転写融合ベクターpQF50に挿入された。挿入のDNA配列及び配向は、ヌクレオチドシークエンシングにより確認された。
【0033】
pAU16Rを保持する培養物は、スペルミジン(10mM及び20mM)を有し又は有しない20mlのMH培地において100倍に希釈された。前記培養物は、350rpmにおいて37°Cにて3時間培養された。ampC遺伝子を誘導するために抗生物質が各培養物に追加された後、培養物は同一の条件にて追加の時間培養された。細胞は遠心分離により採取され、一回洗浄され、リン酸緩衝液(pH7.0)中において再懸濁された。細胞を破砕するためにフレンチプレッシャーセル(French pressure cell)が8,000lb/inにて使用され、可溶性細胞抽出物がμ‐ガラクトシダーゼ活性の測定のために準備された。蛋白質濃度は、ウシ血清アルブミンを基準として使用するブラッドフォード法により決定された。
【0034】
(外膜透過化分析)
染色体にエンコードされたβ‐ラクタマーゼの放出を検査することにより、外膜透過化分析が実行された。簡潔には、定常期細胞が1:59にて20mlの予熱されたMMP培地に希釈され、350rpmにおいて37°Cにて5時間培養された。β‐ラクタマーゼ活性を誘導するためにカルベニシリン(200μg/ml)が加えられた後、培養物は追加の5時間培養された。細胞は、5,000xgにて10分間の遠心分離により採取され、pH7.2における0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液により一回洗浄された。細胞ペレットは、5mlの同一の緩衝液中において再懸濁され、1mlのアリコートに分割された。外膜透過化分析は、各アリコートへの1,5,10,20mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スペルミジン、スペルミン及びアルギニン(対照として)の追加により開始された。前記分析は、各アリコートへの1,5,10,20μg/mlのポリミキシンB非ペプチド(PMBN)の追加によっても開始された。反応混合物は室温において5分間培養され、直ちに全速(15000xg)にて20分間遠心分離され、上清がβ‐ラクタマーゼのソースのために使用された。β‐ラクタマーゼ活性は、上述のように300μlの上清を使用して決定された。
【実施例1】
【0035】
ポリアミンと種々の抗生物質の組み合わせは、抗生物質単独より緑膿菌の細菌感染に対してより有効であった。前記結果は、ポリアミンを特定の抗生物質に組み合わせることが細菌の成長を抑制し、ポリアミンを特定の抗生物質に組み合わせることが抗生物質の有効性を改善する点において相乗効果を有し得ることを示す。さらに、前記結果は、耐性菌を完全に抑制するために特定のポリアミンの濃度が選択され得ることを示す。
【0036】
図1は、ポリアミンが緑膿菌の耐性株(緑膿菌PAO1)に感作することが可能であったことを示す。要約すると、20mMのスペルミジン、プトレッシン、カダベリンと1mMのスペルミンは、緑膿菌を14β‐ラクタム、クロラムフェニコール、ナリジクス酸及びトリメトプリムに感作させることができた。全てのβ‐ラクタム抗生物質、クロラムフェニコール、ナリジクス酸及びトリメトプリムについてのMIC値は、全てのポリアミン(スペルミジン、スペルミン、プトレッシン及びカダベリン)の存在下において著しく(2倍から64倍に)減少させられた。スペルミン及びスペルミジンは、本実施例において使用された濃度において、プトレッシン及びカダベリンの感作効果より良好な感作効果を有すると思われた。疎水性の抗生物質(エリスロマイシン、ノボビオシン及びフシジン酸)に対するMIC値は、ポリアミンの存在と不存在の間において同一であった。さらに、ポリアミンはシプロフロキサシン耐性株をもカルベニシリン、クロラムフェニコール及びナリジクス酸に感作させた。
【0037】
非常に高いMIC値を有する突然変異株は、ポリアミンの存在下において抗生物質に対して感受性が高くなったため、本実施例は、シプロフロキサシン、β‐ラクタム、クロラムフェニコール、ナリジクス酸及びトリメトプリムのような抗生物質をポリアミンと組み合わせることにより、緑膿菌がより効果的に治療され得ることを示す。
【実施例2】
【0038】
より高い濃度のポリアミンの追加は、細菌の感作及び抗生物質の有効性をさらに改善し得る。抗生物質のMIC値についてのポリアミンの効果をさらに調べるために、異なる濃度のポリアミンが使用されることによりカルベニシリンに対するMIC値が決定された。表1は、より高い濃度のポリアミンがより高いレベルのMIC値を減少させたことを明らかにする。表1におけるMIC値は3回繰り返され、同一の値を生じた。減少し又は変化しなかった全てのMICの結果は、抗生物質抑制領域試験によって検証された。
【表1】

【実施例3】
【0039】
緑膿菌の耐性株(又は臨床分離株)は、抗生物質とポリアミンの種々の組み合わせによって感作された。基準株である緑膿菌PAO1のカルベニシリン、クロラムフェニコール及びナリジクス酸に対するMIC値は、以前のものと同一であると確認された。ポリアミンの不存在下において、カルベニシリン及びナリジクス酸に対する臨床分離株のMIC値は、カルベニシリンについての株T6268を除き、基準株PAO1のMIC値より大幅に高かった。
【0040】
より具体的には、図2に示されるように、カルベニシリン、クロラムフェニコール及びナリジクス酸に対する臨床分離株のMIC値は、ポリアミンの不存在からのMIC値と比較して2倍から32倍に減少させられた。基準株PAO1は、クロラムフェニコールに対して、臨床分離株のMICより驚くほどに大幅に高いレベルのMICであり、4倍から16倍に変動した(図2)。シプロフロキサシン、ゲンタマイシン及びポリミキシンBに対する臨床分離株のMIC値は、ポリアミンの存在下において4倍にまで増加し、又は4倍に近かった。本実施例は、ポリアミンと抗生物質の組み合わせが、異なる菌株のMIC値を低下させることが可能であることを確認する。
【実施例4】
【0041】
ポリアミンと抗生物質の組み合わせは、大腸菌とネズミチフス菌の菌株を感作させることができた。大腸菌(例えばエウロパソジェニック(europathogenic)患者からのK10、K12及びC921−61分離株)及びネズミチフス菌LT2の種々の菌株は、β‐ラクタム(アンピシリン、アゾシリン、カルベニシリン、オキサシリン、ペニシリンG、ピペラシリン及びチカルシリン)及び7つの他の抗生物質(クロラムフェニコール、エリスロマイシン、フシジン酸、カナマイシン、ノボビオシン、スペクチノマイシン及びテトラサイクリン)に対して改善された感受性を示した。
【0042】
図3に示されるように、大腸菌株及びネズミチフス菌は、ポリアミンの存在下において、ポリアミンの不存在と比較してほとんどのβ‐ラクタム抗生物質に対して感受性が4倍を超えて高かった。同様に、大腸菌株(K10及びK12)も、ポリアミンの存在下において、ほとんどの他の抗生物質に対して感受性が4倍を超えて高かった。このように、本実施例はポリアミンと抗生物質の組み合わせが異なる細菌のMIC値を低下させることができることを示す。
【実施例5】
【0043】
ポリアミンと抗生物質の組み合わせは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)をβ‐ラクタムに感作させることが可能である。MRSAの臨床分離株である黄色ブドウ球菌Mu5は、β‐ラクタムに対する高いレベルの耐性と、バンコマイシンに対する中間レベルの耐性を示した。より具体的には、表2は外因性のスペルミン(1mM以下)が黄色ブドウ球菌Mu50をβ‐ラクタム(例えば100倍を超えて減少したオキサシリンのMIC)に対して再度感受性を有するようにすることを示す。黄色ブドウ球菌Mu50は、メチシリン耐性の分子機構としてmecAによりエンコードされた高いレベルのペニシリン結合蛋白質2Aを発現すると知られている。グリコペプチド抗生物質(例えばバンコマイシン)はMRSAについての最終防御線であると考えられ、バンコマイシンの臨床応用はバンコマイシン/メチシリン二重耐性株の出現をもたらすため、本実施例はポリアミンと種々の抗生物質の組み合わせが前記の超耐性菌に対する処置であり得ることを示す。
【表2】

【実施例6】
【0044】
ポリアミンは、ヒト血清中において細菌を抗生物質に感作させることが可能であった。図4は、ヒト血清中におけるポリアミンにより媒介されたβ‐ラクタム感受性試験の結果を示す。ヒト血清中のポリアミン単独は、24時間以内に任意の外因性の抗生物質なしに二つの大腸菌株(K10及びK12)の99%より多くを死滅させることができた。しかしながら、緑膿菌PAO1及びネズミチフス菌LT2は、同一の条件において依然良好に生育した(データ不図示)。
【0045】
図4に示されるように、ヒト血清中における緑膿菌PAO1の生育は、2mMのスペルミンの存在又は不存在により影響されなかった。さらに、血清中への16μg/mlのカルベニシリン単独の追加が初期抑制を引き起こした一方、前記抑制には生育の完全な回復が続いた。しかしながら、2mMのスペルミンが16μg/mlのカルベニシリンと共に加えられたとき、接種材料の99%より多くが24時間にて死滅した。同様の結果は、ネズミチフス菌LT2によっても得られた(データ不図示)。
【0046】
ヒト血清中における上記の肯定的結果は、ポリアミンと抗生物質の組み合わせがヒトにおいて有効であり得ることを強力に支持する。
【実施例7】
【0047】
本実施例は、細胞ポリアミンが外膜透過性を変化させず、又は細胞若しくは外膜を破壊しないことを示す。無細胞濾液又は細胞全体におけるβ‐ラクタマーゼ活性の測定は、外膜障壁上における変化が増加された抗生物質感受性に関連しているか否かを評価するために使用された。ポリミキシンBにより処理されたとき、陽イオンペプチド抗生物質が外膜透過性を増加させることが知られ、100μg/mlの前記抗生物質が細胞懸濁液に適用されたとき、β‐ラクタマーゼの顕著な活動が細胞全体において検出された。
【0048】
図5は、100μg/mlの前記抗生物質が前記細胞懸濁液に適用されたとき、ポリミキシンBにより処理された細胞がβ‐ラクタマーゼの顕著な活動を示すことを示す。図6は、外膜破壊の結果としてのペリプラズムβ‐ラクタマーゼの懸濁溶液中への放出が、0.5mMのEDTAの追加に続いて検出され、1mMのEDTAの追加により増加し、細胞全体から検出された活性により証明されたように、外膜透過性も増加されたことを示す。図7は、20mMのスペルミジン又はスペルミンの追加に続いて、非常に低いレベルのβ‐ラクタマーゼ活性のみが検出された(データ不図示)ことを示す。前記の結果は、ポリアミンが細胞外膜を破壊し又は細胞外膜の透過性を変化させることによってその効果を発揮する可能性が非常に低いことを示す。
【実施例8】
【0049】
ポリアミンにより媒介される抗生物質感作は、二価イオン又は塩の存在により影響を受けない。以前の研究が、いくつかの抗生物質の抗生物質感受性について二価イオン又は塩の生理学的濃度が影響を有することを示したため、ポリアミンと抗生物質の組み合わせが種々の濃度の二価イオン又は塩の影響について試験された。
【0050】
表3に示されるように、二価イオン又は塩の増加した濃度は、ポリアミンによる細菌の感作において顕著な効果を有しなかった。例えば、本実施例においては、スペルミンとスペルミジンの組み合わせが、10mMのスペルミジンの存在下において有効であり続けたことが示される。二価イオン又は塩の増加した濃度は、10mMのスペルミジンの存在下におけるカルベニシリン感受性について顕著な効果を有しなかった。同様の結果は、緑膿菌、ネズミチフス菌及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌Mu50(MRSA)においても観察された。
【表3】

【実施例9】
【0051】
ポリアミン及び種々の抗生物質の組み合わせは、種々の耐性大腸菌の菌株に対する増加した有効性を提供した。図8に示されるように、ポリアミンは大腸菌の種々の耐性株の種々の抗生物質に対する抗生物質感受性を増加させた。図8に示されるように、外因性ポリアミンの追加によって、MIC値は因数4により低減された。
【実施例10】
【0052】
ポリアミンと種々の抗生物質の組み合わせは、ネズミチフス菌の耐性株に対する増加した有効性を提供した。本実施例においては、ポリアミンは種々の抗生物質に対するネズミチフス菌の抗生物質感受性を増加させた。表4に示されるように、MIC値は因数4により低減された。
【表4】

【実施例11】
【0053】
ポリアミンと種々の抗生物質の組み合わせは、黄色ブドウ球菌700699の耐性株に対する増加した有効性を提供した。本実施例においては、ポリアミンは種々の抗生物質に対する黄色ブドウ球菌700699の抗生物質感受性を増加させた。表5に示されるように、MIC値は因数4により低減された。
【表5】

【0054】
上記の好適な実施形態の詳細な説明及び添付の図面は、例示及び説明の目的のためにのみ提示され、網羅的であることを意図されず、かつ本発明の範囲及び精神を限定することを意図されない。前記実施形態は、本発明の原理及びその実用的な用途を最良に説明するために選択され記述された。当業者は、本発明の範囲及び精神から離れることなく、本明細書に開示された発明に対して多数の変形がなされ得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【図1】ポリアミン、化学薬品及び/又は抗生物質の種々の濃度の存在下における緑膿菌の最小抑制値を示す表である。
【図2】種々の抗生物質とポリアミンの組み合わせに対して、緑膿菌の臨床分離株の感受性を示す表である。
【図3】シプロフロキサシン及び種々のポリアミンの組み合わせに対して、大腸菌及びネズミチフス菌の株の感受性を示す表である。
【図4】ヒト血清における緑膿菌PAO1のタイム・キル・アッセイをグラフにより示す。
【図5】抗生物質とポリアミンの組み合わせにより治療されるとき、種々の細胞のβ‐ラクタマーゼ活性が減少することをグラフにより示す。
【図6】破壊剤により治療される細胞のβ‐ラクタマーゼ活性をグラフにより示す。
【図7】抗生物質と種々のポリアミンの組み合わせによる治療に続いて非常に低いレベルのβ‐ラクタマーゼ活性のみが検出され得ることをグラフにより示す。
【図8】シプロフロキサシンと種々のポリアミンの組み合わせに対して、大腸菌株の感受性を示す表である。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者における抗生物質の有効性を改善するための方法であって、
a)少なくとも一つのポリアミンを被験者に投与するステップと、
b)少なくとも一つの抗生物質を被験者に投与するステップ
を含む方法。
【請求項2】
前記少なくとも一つのポリアミンと組み合わせた前記少なくとも一つの抗生物質の有効性が、前記少なくとも一つの抗生物質単独の有効性より大きい、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記被験者における細菌感染を抑制するために必要とされる前記少なくとも一つの抗生物質の量が、前記被験者への前記少なくとも一つのポリアミンの投与により削減される、請求項1に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも一つの抗生物質が親水性である、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
前記少なくとも一つの抗生物質がβ‐ラクタムである、請求項1に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも一つの抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン(cephalosphorin)、モノバクタム及びこれらの組み合わせから構成されるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも一つのポリアミンが天然に存在するポリアミンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項8】
前記少なくとも一つのポリアミンが、カダベリン、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン、ノルスペルミジン、及びノルスペルミン、並びにこれらの組み合わせから構成されるグループから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも一つのポリアミンが、化学的に変形された天然に存在するポリアミンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項10】
前記少なくとも一つのポリアミンが、プトレッシンに由来するポリアミンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも一つのポリアミンと組み合わせた前記少なくとも一つの抗生物質の有効性が、前記少なくとも一つの抗生物質単独より耐性菌に対するより大きな有効性を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
前記少なくとも一つのポリアミンが、前記少なくとも一つの抗生物質より前に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項13】
前記少なくとも一つのポリアミンが、前記少なくとも一つの抗生物質の後に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項14】
前記少なくとも一つのポリアミンと前記少なくとも一つの抗生物質が被験者に同時に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項15】
前記少なくとも一つの抗生物質が複数の抗生剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも一つのポリアミンが、天然に存在するポリアミンの人工の類似物質である、請求項1に記載の方法。
【請求項17】
前記少なくとも一つの抗生物質が経口投薬形態にて投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項18】
前記少なくとも一つのポリアミンが経口投薬形態にて投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項19】
a)少なくとも一つのポリアミンと、
b)少なくとも一つの抗生物質と、
c)薬学的に受容可能な担体
を含む、細菌の侵入(invention)を治療するための組成。
【請求項20】
前記少なくとも一つのポリアミンがプトレッシンに由来する、請求項19に記載の組成。
【請求項21】
前記少なくとも一つのポリアミンが、β‐ラクタム抗生物質、アミノグリコシド、マクロライド、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、ネオマイシン、ポリミキシン、カプレオマイシン、コリスチメテート(colistimethate)、コリスチン、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン(vanomycin)、バシトラシン、カナマイシン、ナリジキシン酸、及びトリメトプリムから構成されるグループから選択される、請求項19に記載の組成。
【請求項22】
前記少なくとも一つの抗生物質が親水性である、請求項19に記載の組成。
【請求項23】
前記少なくとも一つの抗生物質がβ‐ラクタムである、請求項19に記載の組成。
【請求項24】
前記少なくとも一つの抗生物質が異なる抗生物質の組み合わせを含む、請求項19に記載の組成。
【請求項25】
前記少なくとも一つの抗生物質が異種のクラスの抗生物質の組み合わせを含む、請求項19に記載の組成。
【請求項26】
前記少なくとも一つの抗生物質が、細菌内の排出ポンプに作用することにより細菌に作用する、請求項19に記載の組成。
【請求項27】
前記少なくとも一つの抗生物質がペニシリン結合蛋白質に作用する、請求項19に記載の組成。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【公表番号】特表2009−507762(P2009−507762A)
【公表日】平成21年2月26日(2009.2.26)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−513779(P2008−513779)
【出願日】平成18年5月26日(2006.5.26)
【国際出願番号】PCT/US2006/020583
【国際公開番号】WO2006/128045
【国際公開日】平成18年11月30日(2006.11.30)
【出願人】(506036530)ジョージア ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション、インコーポレイテッド (3)
【Fターム(参考)】