抗生物質産生微生物及びそれが産生した抗生物質
【課題】抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにあり、また、抗生物質の製造方法に用いられる新規な微生物を提供することにあり、特に、少なくともＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す多剤耐性菌に有効な新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにある。
【解決手段】リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物であり、また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物。
【解決手段】リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物であり、また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗生物質を産生する微生物、その微生物の培養による新規抗生物質の製造方法及びその新規抗生物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記することがある）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記することがある）等の多くの抗生物質に対して耐性を有する多剤耐性細菌が臨床の現場から分離される例が多くなり、深刻な問題となっている。特に、ＭＲＳＡに有効なバンコマイシンに対して耐性を示すＶＲＥの出現は、より深刻に受け止められている。なぜならば、腸球菌自体が腸管内に常在している菌であるため潜在的な保菌者を発生させ易く、長期間、患者の体内に存在することによって他の菌に耐性遺伝子が伝播して、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等を発生させる危険性が高まると予想されるからである。
【０００３】
また、耐性菌出現の問題とは別に、バンコマイシン等に比べて安全性の点でも優れ、実質的に治療効果の高い抗生物質を求める声も大きく、そのため、ＭＲＳＡやＶＲＥに有効であると共に既存薬に比べて副作用等が少なく安全性も高い新規抗生物質を得るための検討が進められている。
【０００４】
先の目的の為に、新規な化学構造を有する抗生物質の創出や既存の抗生物質の改良等の合成による探索と共に、これまで報告されていない新規で有用な抗生物質を産生する能力を有する新規微生物の探索も幅広く行われている。微生物の産生する抗生物質は生体内で産生される天然物であるため、化学合成品に比べて生体に対する安全性の高いものが多いと考えられるからである。
【０００５】
例えば、特許文献１と特許文献２にはリソバクター（ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属、特許文献３にはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特許文献４にはストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する新規微生物とその微生物から産生され、製造される新規抗生物質が記載されている。
【０００６】
一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコを実験動物とするカイコ感染モデル（特許文献５）を構築し、その検討を進めてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３３３９２３５号公報
【特許文献２】特許第４０５４５７６号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３１９２号公報
【特許文献４】特開２００７−１３１５５２号公報
【特許文献５】特開２００７−３２７９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先の特許文献に記載されている抗生物質は、共に多剤耐性菌がそのターゲットとなっており、主にＭＲＳＡに対する有効性が謳われている。そのうち特許文献１と特許文献３に記載の抗生物質は、バンコマイシンに比べて低毒性で作用時間が早いということを特徴とし、特許文献４に記載の抗生物質は、既存の抗菌薬とは異なる化学構造を有することから、耐性菌の出現が少ないことが期待できることを特徴としている。また、特許文献２に記載の抗生物質の中には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌性を示す抗生物質も含まれている。しかしながら、この抗生物質は、主にインビトロにおける抗菌性が評価されたものである。以下、特に付記がない場合、「抗菌活性」はインビトロの評価系で評価されたものを示し、「治療効果」は実験動物を用いたインビボの評価系で評価されたものを示す。
【０００９】
ＭＲＳＡとＶＲＥに対して治療効果を示し、既に実用化されている抗生物質は、オキサゾリジノン系抗生物質であるリネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）がよく知られているが、これは完全化学合成によって創出されたものである。
【００１０】
一方、微生物の産生する物質から得られる抗生物質は生体に対する安全性に関し合成品より優れている可能性が高いと予想され、そのような抗生物質は医薬品とするための開発ステップを軽減できると考えられる。例えば、製造方法においても化学合成の場合よりも生体に優しい原材料を用いることができ、工程や設備も、製造条件が常温常圧に近いので、より簡便で安全な工程・設備により行うことができるというメリットを有する。そのため、化学合成により創出された抗生物質より医薬品開発ステップを軽減できる可能性が高い。
【００１１】
しかし、ＭＲＳＡに対して有効性を示すだけでなく、ＶＲＥに対しても抗菌性を示す抗生物質を産生する微生物については、特許文献２のような例はあるものの、実際の治療における治療効果や耐性菌の出現等を考慮すると、更に検討を進める必要があった。つまりＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても抗菌活性を有し、実際に治療効果を示す抗生物質を産生するという特徴を有する微生物を新たに見出すと共に、その微生物を用いたＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す新たな抗生物質とその製造方法の提供が望まれていた。
【００１２】
また、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等に対する抗菌活性の有無にかかわらず、広く新規な抗生物質を得るためには、新規な微生物の提供が望まれていた。
【００１３】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、その課題は、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにあり、また、抗生物質の製造方法に用いられる新規な微生物を提供することにある。特に、少なくともＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す多剤耐性菌に有効な新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の事情に鑑み、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することを課題として微生物の探索を行った。特に、多剤耐性菌に対しても有効性を示す抗生物質である新規な微生物を提供することを更なる課題として微生物の探索を開始した。そしてその探索方法として、カイコの幼虫を実験動物として用いたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（特許文献５参照）を用い、抗菌活性を確認した各種微生物の産生物に対して、この感染モデルを用いて、その治療効果を指標とするスクリーニングを行うことで、上記の課題を解決することのできる微生物の探索を進めた。
【００１５】
その結果、土壌細菌１４３４６株の内、その培養液に抗菌活性を認めた菌株が３４８７株あり、それらの菌の培養液の示す「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果」を検討したところ、その内４５株について治療効果が認められた。その後、抗菌活性を有し、更に上記感染モデルで治療効果を認めた４５株の微生物の中に、リソバクター属に属する微生物が含まれていることを確認した。
【００１６】
そして、そのリソバクター属に属する微生物の培養液中から精製した抗生物質の抗菌スペクトルを詳細に検討したところ、この抗生物質は、ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示し、また、先のカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対しても、既存薬のバンコマイシンと比較して高い治療効果を有することを確認した。更に、この抗生物質は構造的に新規であることも見出したこと等から、本発明の「抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物」は、課題の解決を可能とする有用性の高い新規な微生物であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下に存する。
（１）リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物。
（２）上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである（１）に記載の微生物。
（３）配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する（１）又は（２）に記載の微生物。
【００１８】
（４）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
（５）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
（６）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質。
（７）下記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である（６）の抗生物質。
【化１】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、抗菌活性を有する抗生物質を産生することのできる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明の微生物が産生した抗生物質には、ＭＲＳＡやＶＲＥに抗菌活性を有し、治療効果も高いことが確認されているものが存在するので、多剤耐性菌に対して有効性の高い新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することができるという効果を有している。
【００２０】
また、本発明の抗生物質の製造方法は、特に新規な抗生物質を製造することができ、更には、抗菌活性を有するのみならず治療効果も高い抗生物質を製造することができる。また、本発明の抗生物質の製造方法は、化学合成法に比べてより簡単である微生物の培養という製造方法であるため、有機溶媒、金属触媒、試薬類、多くの化学合成ステップ、高温、高圧等を必要としないので、コストが安く環境にもやさしいという効果を有している。
【００２１】
また、本発明の抗生物質は、新規な抗生物質であり、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有し高い治療効果も確認されているので、多剤耐性菌による疾患の治療に有効となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＲＨ２１８０−５の培養物から得られた治療効果を示す抗生物質含有画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また、別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。
【図２】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成解析結果を示す図である。
【図３】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【図４】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ解析結果を示す図である。
【図５】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。
【図６】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。
【図７】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。リソバクター属に属する新規な微生物であることは、後述する本菌株の性質と１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の配列から同定された。
【００２４】
本発明の微生物は、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物であるが、具体的には、沖縄で採取された土壌中から本発明者らによって分離された受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−８７０」として、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され（寄託日：２０１０年１月２５日）、識別表示「ＲＨ２１８０−５」と命名した微生物である（以下、本菌株を「ＲＨ２１８０−５」と表記する）。
【００２５】
「ＲＨ２１８０−５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０」を受けているものである。
【００２６】
ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）の菌株としての性質は次の通りである。
【００２７】
形態：本ＲＨ２１８０−５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また抗酸性を示さない。
【００２８】
培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。
【００２９】
生理学的性質：本ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５〜９（６〜８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０〜４０℃（２５〜３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｄ ｔｅｓｔ）：−
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：−
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：−
（１８）硫化水素生成（Ｈ２Ｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ−ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：−
Ｄ−キシロース（Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ）：−
Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ−マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ−フラクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：−
Ｄ−マルトース（Ｄ−ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−スクロース（Ｄ−ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ−ラクトース（Ｄ−ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−トレハロース（Ｄ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ−ソルビトール（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：−
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：−
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：−
【００３０】
分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ ｒＲＮＡの、ＲＨ２１８０−５の解析結果は以下の通りである。
（１２）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の解析結果
ＲＨ２１８０−５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、配列表の配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列が見出された。この配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ全長ではないため、１６Ｓ ｒＲＮＡ「領域」とした。この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、本発明のＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列は、リソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＮ２０４３Ｔ株と相同率９９％を示した。従って、本発明のＲＨ２１８０−５は、リソバクター属に属する微生物である。
【００３１】
上記Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、本発明のＲＨ２１８０−５とは異なるものである。
【００３２】
以上の本菌株の性質をバージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３ １９８９）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、本菌株はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。
【００３３】
本発明のＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、本菌株の産生する抗生物質の示す、ＶＲＥを含む多剤耐性菌にも有効という新規な抗菌スペクトルの傾向と、これまでに報告されていない有用性の高い新規な抗生物質を産生するという性質から、本菌株は新規微生物株であると判断した。
【００３４】
以上の結果から、今回見出された本菌株は、従来報告されていない新規で有用なリソバクター属の菌株と判断し、リソバクター属、「ＲＨ２１８０−５」と命名した。ＲＨ２１８０−５は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０（寄託日：２０１０年１月２５日）として、国内寄託されている。なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易く、上記で示した範囲内に留まらない可能性も有している。しかしながら、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）から変異した微生物であっても、抗生物質を産生する能力を有している限り、本発明の微生物に含まれるものである。
【００３５】
すなわち、本発明は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する上記の微生物である。
【００３６】
更に好ましくは、本発明は、産生される抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである上記の微生物である。すなわち、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有しているＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物や、ＮＩＴＥ Ｐ−８７０から変異した微生物は、更に好ましい本発明の微生物に含まれるものである。また言うまでもなく、その変異には自然的な変異と人工的な変異を含むものである。
【００３７】
（本発明微生物の培養方法）
本発明のＲＨ２１８０−５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油や界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。
【００３８】
培養条件は、先に記したように好気的条件下で培養するのが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃〜４０℃で可能であるが、２５℃〜３５℃間に保つことが好ましく、２７℃〜３２℃で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６〜８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０−５の場合、通常は１〜２０日間程度、好ましくは４〜７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。
【００３９】
（抗菌活性成分の精製方法）
ＲＨ２１８０−５の培養物からの抗菌活性成分の回収は、通常の微生物培養物から生理活性物質を回収し精製する方法で行えばよい。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。
【００４０】
通常単離精製に用いられる溶媒や分離手法は、最小生育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記する）で判定された抗菌活性を指標として、その取捨選択が行われる。単なる抗菌活性の分離、濃縮であれば基本的にそのような手法でも問題はない。しかしながら、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質の単離精製に当たっては、ＭＩＣの結果だけでなく、特許文献５で示したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果を指標とした選択を行っている。その結果、ＭＩＣの結果だけでは濃縮・単離することが困難であったと考えられる「本発明のＲＨ２１８０−５」の産生する新規な抗生物質の濃縮・精製が成し遂げられたのである。そこで、その点に関し次に記載する。
【００４１】
（カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした抗生物質の単離精製）
多くの菌株から有用菌株の絞込みを行う一次スクリーニングは、抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法でも行うことができるが、例えば、ＭＩＣを指標として各種菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた検体をピックアップすることができる。その後、各精製工程で得られた検体は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに供することで、その検体の治療効果を検討することができる。
【００４２】
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対して治療効果の認められた検体については、更に単離精製操作を行い、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに、各精製段階の検体を投与して、行った単離精製操作の種類や手法による治療効果の濃縮度を確認する。このような「治療効果を指標にした検体や精製操作方法の取捨選択方法」は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用することによって始めて成し遂げられたものである。
【００４３】
表１の結果は、ＲＨ２１８０−５の培養液から精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ感染モデルの治療効果ＥＤ５０をまとめたものである。表１中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。
【００４４】
表１に示すように、極めて興味深いことに、行った単離精製操作によって、抗菌活性の濃縮度と、治療効果の濃縮度は、必ずしも一致しないことが明らかとなった。表１の結果は、ＥＤ５０が３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。
【００４５】
【表１】
【００４６】
つまり、本発明のＲＨ２１８０−５は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標とした単離精製方法を用いることによって効果的に見出されたものと考えることができる。なぜならば、従来から行われている抗菌活性のみを指標として目的物の単離精製を行った場合には、治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃してしまう可能性が高かったと、表１の結果から考えられるからである。そしてその場合には、本発明のＲＨ２１８０−５の有用性を確認することはできずに、ＲＨ２１８０−５の存在自体を見逃してしまった可能性が高いのである。従って、本発明の新規微生物（ＲＨ２１８０−５）を世の中に提供するにあたり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いる治療効果を指標とした取捨選択が行われ、新規な抗生物質が得られたことは非常に重要と考えられる。
【００４７】
以下に、本発明の上記微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法と、本発明の上記微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法の具体的な内容について記載する。
【００４８】
（抗生物質の単離精製方法）
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択される単離精製方法としては特に限定はないが、培養物の溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等が挙げられる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい。表１参照。
【００４９】
なお、上記した単離精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする抗生物質が得られる方法であれば、如何なる単離精製方法であってもよい。
【００５０】
（単離精製された抗生物質の構造解析）
以上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から９つのピークに分けられる化合物を分取することができた（図１）。これらはＵＶ吸収パターンが類似していることから互いに類似する化合物であり、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の単離精製方法によっては単一の成分となっている。
【００５１】
これらの９つのピークのうち主要なピークであるピーク５のＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品の構造解析は次の解析手段により行われた。すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ−ＮＭＲ解析や１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４）等を実施した結果、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出され（図２）、図５に示す新規骨格構造を有する新規抗生物質（以下、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」と表記する）であることが判明した。
【００５２】
（抗菌スペクトル）
上記各ピークの抗生物質の示す抗菌スペクトルは、微量液体希釈法等で得られたＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、表２に示すように、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことを確認することができた。更に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても通常の細菌と同様の抗菌活性を有し、多剤耐性細菌にも有効であることを確認することができた。表２、後述の表６参照。
【００５３】
以上から、本発明の抗生物質は、前記の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくとも、ＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質である。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果）
ＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質は、各精製工程においてカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてその治療効果を有することが確認されている。前記特許文献５において、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに治療効果を示す物質は、マウス感染モデルに対しても治療効果を示すことが確認されている。そこで、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質に対しても同様の確認を行ったところ、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウス感染モデルにおいても治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなりバンコマイシンの１．６ｍｇ／ｋｇよりも明確に低く治療効果の高いことが確認された。表３参照。
【００５６】
また、マウスに対する急性毒性試験の結果は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量ではマウスは殺傷されなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが期待できる。
【００５７】
【表３】
【００５８】
以上の結果から、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、ＭＲＳＡに対してバンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し高い治療効果を示すと共に、臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。また、治療効果を示す他の画分中の物質も、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様のＵＶスペクトルを示すことから類似する化合物と考えられ、従って、抗菌スペクトルも同様の傾向を示すと予想される。以上の結果は、発明者が見出したＲＨ２１８０−５が有用性の高い新規微生物であることを示すものである。
【００５９】
ＲＨ２１８０−５の産生する化合物が、上記したように、新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする新規な化合物であること、また、その化合物がＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示し、ＭＲＳＡによる感染症に対しマウスにおいて治療効果が確認され、このような抗菌スペクトルは知られていなかったこと等を含め総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、新規な微生物株であると判断した。
【００６０】
９つのピークのうちの主要なピークであるピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品と同様に、その他のピークも、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲによる解析、ＴＯＦ型ＭＳ解析、ＵＶスペクトル、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で構造解析した結果、９つのピークを与える化合物は、下記式（１）と表４で示される化合物であった。
【００６１】
【化２】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【００６２】
【表４】
表４中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋
【００６３】
本発明は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する上記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である抗生物質でもある。
【００６４】
検討例２に示すように、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は、従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌との比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例、検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６６】
実施例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の単離精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。
【００６７】
（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
先の抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、カイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。
【００６８】
（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療活性物質の精製
上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０−５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０−５は、後述する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の解析、酸性物質の傾向等から、新規リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物と判定された。
【００６９】
ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０％アセトン抽出物からカイコモデルにおける治療効果を指標に治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。
【００７０】
表１に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料である培養上清のアセトン抽出物の示す抗菌活性には最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質も関与し、今回選択された精製工程によりそれらの物質が除去されたためと推定される。
【００７１】
また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０−５は少なくとも９つの関連化合物を産生していると考えられた。
【００７２】
実施例２
＜ＲＨ２１８０−５の培養とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
ＲＨ２１８０−５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、先の液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。
【００７３】
このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は先の試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。
【００７４】
ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ−ｐａＫ（登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％−１００％メタノールで１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％−８０％メタノール画分で治療効果を示す抗生物質含有画分が溶出された。
【００７５】
先の治療効果を示す抗生物質含有画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ ＰａＫ ＳＰ−１００ ＯＤＳカラム（直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％−９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＰＲ−ＨＰＬＣにより治療効果を示す抗生物質含有画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。
【００７６】
以上のＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す抗生物質含有画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６ ｐｈｏｔｏ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された。図１参照。以上の操作により、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。
【００７７】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ−Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］であることが分かった。また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。更に、日本電子ＥＣＡ−５００ＮＭＲによる１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ−ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、図５に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。
【００７８】
更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ−ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）
脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
その結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図６に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。
【００７９】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトル＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の各種細菌に対する抗菌スペクトルを微量液体希釈法によるＭＩＣにより検討した。その結果を表２に示す。ＭＩＣの結果から、本物質は黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。またメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても抗菌活性を示したことから、多剤耐性菌に対しても有効であると考えられた。今回の結果で示されたＭＩＣの値は、従来報告のある抗生物質と比べて低い値でなく、特に高い抗菌活性を示したものではないが、治療効果については、後述する治療効果の検討により、バンコマイシンと比べた場合、バンコマイシン以上の治療効果を有することが確認された。
【００８０】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（マウスモデル）における治療効果と毒性の検討＞
７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で先の菌株投与２時間後に皮下注射した。
【００８１】
上記マウスモデルに対してＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後、翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ５０値）を検討した（１群５匹）。同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ５０値を検討した。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしの条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ５０値はプロビット法により求めた。
【００８２】
得られた結果を表３に示す。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ５０値１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質であることが確認された。
【００８３】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後翌日の観察によりマウスに対するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。急性毒性は、ＥＤ５０値の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇの投与量では毒性を認めなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された。
【００８４】
検討例１
＜１６Ｓ ｒＲＮＡ解析＞
ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、配列表の配列番号１に示すほぼ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。この塩基配列を元にＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存菌株との相同性検索を行った。その結果ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物であると考えられた。
【００８５】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性について＞
ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と化学的性質について相似する点が多いが、産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、これまで報告されていない新規で有用なＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を産生していることが確認されている点が異なっている。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な菌株であると判定した。
【００８６】
検討例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの本発明の新規な環状ペプチド化合物について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。
【００８７】
試験対象菌には、黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表５に示す。
【００８８】
【表５】
ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）
【００８９】
ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
ＥＦ１ ：腸球菌
ＶＲＥ ：バンコマイシン耐性腸球菌
【００９０】
ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン
【００９１】
その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３，ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
【００９２】
なお、抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣ値が表５の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表２の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ５０値）の検討結果ではバンコマイシンの１／３程度のＥＤ５０値を示しており、高い治療効果を示すことが確認されている。
【００９３】
ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣ値とされている水準であるにもかかわらず、前記式（１）で示される化合物が充分な治療効果を示す理由の一つとして本化合物が既存薬とは異なった作用機序で抗菌活性を示し、それが治療効果に反映している可能性が考えられる。既存薬と異なった作用機序で抗菌活性を示している場合は、少なくとも現時点での耐性菌の分離頻度が低いことが予測され、前記式（１）で示される化合物の有利な点と考えられる。
【００９４】
検討例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
表６の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。
【００９７】
検討例４
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。
【００９８】
【表７】
【００９９】
表７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。
【０１００】
検討例５
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を経時的に測定した。結果を図７に示す。
【０１０１】
図７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の新規微生物株ＲＨ２１８０−５は、新たな抗生物質の製造方法とその抗生物質を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。
【受託番号】
【０１０３】
国内寄託：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０
ブダペスト条約に基づく寄託：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列表の配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗生物質を産生する微生物、その微生物の培養による新規抗生物質の製造方法及びその新規抗生物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、「ＭＲＳＡ」と略記することがある）、バンコマイシン耐性腸球菌（以下、「ＶＲＥ」と略記することがある）等の多くの抗生物質に対して耐性を有する多剤耐性細菌が臨床の現場から分離される例が多くなり、深刻な問題となっている。特に、ＭＲＳＡに有効なバンコマイシンに対して耐性を示すＶＲＥの出現は、より深刻に受け止められている。なぜならば、腸球菌自体が腸管内に常在している菌であるため潜在的な保菌者を発生させ易く、長期間、患者の体内に存在することによって他の菌に耐性遺伝子が伝播して、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）等を発生させる危険性が高まると予想されるからである。
【０００３】
また、耐性菌出現の問題とは別に、バンコマイシン等に比べて安全性の点でも優れ、実質的に治療効果の高い抗生物質を求める声も大きく、そのため、ＭＲＳＡやＶＲＥに有効であると共に既存薬に比べて副作用等が少なく安全性も高い新規抗生物質を得るための検討が進められている。
【０００４】
先の目的の為に、新規な化学構造を有する抗生物質の創出や既存の抗生物質の改良等の合成による探索と共に、これまで報告されていない新規で有用な抗生物質を産生する能力を有する新規微生物の探索も幅広く行われている。微生物の産生する抗生物質は生体内で産生される天然物であるため、化学合成品に比べて生体に対する安全性の高いものが多いと考えられるからである。
【０００５】
例えば、特許文献１と特許文献２にはリソバクター（ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属、特許文献３にはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特許文献４にはストレプトマイセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する新規微生物とその微生物から産生され、製造される新規抗生物質が記載されている。
【０００６】
一方、本発明者は、抗生物質の探索に有用に用いられる、カイコを実験動物とするカイコ感染モデル（特許文献５）を構築し、その検討を進めてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３３３９２３５号公報
【特許文献２】特許第４０５４５７６号公報
【特許文献３】特開２００３−１１３１９２号公報
【特許文献４】特開２００７−１３１５５２号公報
【特許文献５】特開２００７−３２７９６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先の特許文献に記載されている抗生物質は、共に多剤耐性菌がそのターゲットとなっており、主にＭＲＳＡに対する有効性が謳われている。そのうち特許文献１と特許文献３に記載の抗生物質は、バンコマイシンに比べて低毒性で作用時間が早いということを特徴とし、特許文献４に記載の抗生物質は、既存の抗菌薬とは異なる化学構造を有することから、耐性菌の出現が少ないことが期待できることを特徴としている。また、特許文献２に記載の抗生物質の中には、ＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌性を示す抗生物質も含まれている。しかしながら、この抗生物質は、主にインビトロにおける抗菌性が評価されたものである。以下、特に付記がない場合、「抗菌活性」はインビトロの評価系で評価されたものを示し、「治療効果」は実験動物を用いたインビボの評価系で評価されたものを示す。
【０００９】
ＭＲＳＡとＶＲＥに対して治療効果を示し、既に実用化されている抗生物質は、オキサゾリジノン系抗生物質であるリネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）がよく知られているが、これは完全化学合成によって創出されたものである。
【００１０】
一方、微生物の産生する物質から得られる抗生物質は生体に対する安全性に関し合成品より優れている可能性が高いと予想され、そのような抗生物質は医薬品とするための開発ステップを軽減できると考えられる。例えば、製造方法においても化学合成の場合よりも生体に優しい原材料を用いることができ、工程や設備も、製造条件が常温常圧に近いので、より簡便で安全な工程・設備により行うことができるというメリットを有する。そのため、化学合成により創出された抗生物質より医薬品開発ステップを軽減できる可能性が高い。
【００１１】
しかし、ＭＲＳＡに対して有効性を示すだけでなく、ＶＲＥに対しても抗菌性を示す抗生物質を産生する微生物については、特許文献２のような例はあるものの、実際の治療における治療効果や耐性菌の出現等を考慮すると、更に検討を進める必要があった。つまりＭＲＳＡだけでなくＶＲＥに対しても抗菌活性を有し、実際に治療効果を示す抗生物質を産生するという特徴を有する微生物を新たに見出すと共に、その微生物を用いたＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す新たな抗生物質とその製造方法の提供が望まれていた。
【００１２】
また、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ等に対する抗菌活性の有無にかかわらず、広く新規な抗生物質を得るためには、新規な微生物の提供が望まれていた。
【００１３】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、その課題は、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにあり、また、抗生物質の製造方法に用いられる新規な微生物を提供することにある。特に、少なくともＭＲＳＡとＶＲＥの両者に有効性を示す多剤耐性菌に有効な新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記の事情に鑑み、抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することを課題として微生物の探索を行った。特に、多剤耐性菌に対しても有効性を示す抗生物質である新規な微生物を提供することを更なる課題として微生物の探索を開始した。そしてその探索方法として、カイコの幼虫を実験動物として用いたカイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（特許文献５参照）を用い、抗菌活性を確認した各種微生物の産生物に対して、この感染モデルを用いて、その治療効果を指標とするスクリーニングを行うことで、上記の課題を解決することのできる微生物の探索を進めた。
【００１５】
その結果、土壌細菌１４３４６株の内、その培養液に抗菌活性を認めた菌株が３４８７株あり、それらの菌の培養液の示す「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果」を検討したところ、その内４５株について治療効果が認められた。その後、抗菌活性を有し、更に上記感染モデルで治療効果を認めた４５株の微生物の中に、リソバクター属に属する微生物が含まれていることを確認した。
【００１６】
そして、そのリソバクター属に属する微生物の培養液中から精製した抗生物質の抗菌スペクトルを詳細に検討したところ、この抗生物質は、ＭＲＳＡとＶＲＥの両者に抗菌活性を示し、また、先のカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルだけでなく、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対しても、既存薬のバンコマイシンと比較して高い治療効果を有することを確認した。更に、この抗生物質は構造的に新規であることも見出したこと等から、本発明の「抗生物質を産生するリソバクター属に属する微生物」は、課題の解決を可能とする有用性の高い新規な微生物であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、以下に存する。
（１）リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物。
（２）上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである（１）に記載の微生物。
（３）配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する（１）又は（２）に記載の微生物。
【００１８】
（４）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
（５）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
（６）（１）ないし（３）の何れかに記載の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質。
（７）下記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である（６）の抗生物質。
【化１】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、抗菌活性を有する抗生物質を産生することのできる新規な微生物を提供することができる。特に、本発明の微生物が産生した抗生物質には、ＭＲＳＡやＶＲＥに抗菌活性を有し、治療効果も高いことが確認されているものが存在するので、多剤耐性菌に対して有効性の高い新規な抗生物質を産生することができる新規な微生物を提供することができるという効果を有している。
【００２０】
また、本発明の抗生物質の製造方法は、特に新規な抗生物質を製造することができ、更には、抗菌活性を有するのみならず治療効果も高い抗生物質を製造することができる。また、本発明の抗生物質の製造方法は、化学合成法に比べてより簡単である微生物の培養という製造方法であるため、有機溶媒、金属触媒、試薬類、多くの化学合成ステップ、高温、高圧等を必要としないので、コストが安く環境にもやさしいという効果を有している。
【００２１】
また、本発明の抗生物質は、新規な抗生物質であり、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有し高い治療効果も確認されているので、多剤耐性菌による疾患の治療に有効となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＲＨ２１８０−５の培養物から得られた治療効果を示す抗生物質含有画分のＯＤＳカラムによる分画結果を示す図である。縦軸は吸収強度、横軸は溶出時間（分）を示す。また、別枠で表示した各ピークの欄上の数字は各ピーク物質の分子量を示す。
【図２】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸組成解析結果を示す図である。
【図３】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析結果を示す図である。縦軸はシグナル強度、横軸は化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。
【図４】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳのＭＳ−ＭＳ解析結果を示す図である。
【図５】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の化学構造を示す図である。
【図６】各解析結果から導き出されたＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のアミノ酸の立体構造も明らかにした化学構造を示す図である。
【図７】ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の微生物は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。リソバクター属に属する新規な微生物であることは、後述する本菌株の性質と１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の配列から同定された。
【００２４】
本発明の微生物は、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物であるが、具体的には、沖縄で採取された土壌中から本発明者らによって分離された受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ−８７０」として、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託され（寄託日：２０１０年１月２５日）、識別表示「ＲＨ２１８０−５」と命名した微生物である（以下、本菌株を「ＲＨ２１８０−５」と表記する）。
【００２５】
「ＲＨ２１８０−５」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１０年１月２５日）から、ブダペスト条約に基づく寄託への移管申請を行ない（移管日（国際寄託日）：２０１１年５月２０日）、生存が証明され、ブダペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０」を受けているものである。
【００２６】
ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）の菌株としての性質は次の通りである。
【００２７】
形態：本ＲＨ２１８０−５は、グラム陰性の桿菌であり、鞭毛は認められないが滑走性が認められる。子実体の形成は認められない。また抗酸性を示さない。
【００２８】
培地における生育状況：
（１）肉汁寒天平板上では薄黄色のコロニーを形成する。拡散性の色素は認められない。
（２）肉汁ゼラチン穿刺培養では内部に渡ってゼラチンを液化しながら生育する。
【００２９】
生理学的性質：本ＲＨ２１８０−５の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである
（１）生育ｐＨ（最適生育ｐＨ）：５〜９（６〜８）
（２）生育温度（至適生育温度）：１０〜４０℃（２５〜３０℃）
（３）酸素に対する態度：好気的
（４）ＭＲテスト（Ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｄ ｔｅｓｔ）：−
（５）ＶＰテスト（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｃａｕｅｒ ｔｅｓｔ）：＋
（６）色素の生成（Ｐｉｇｍｅｎｔ）：＋
（７）オキシダーゼ（Ｏｘｉｄａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（８）カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（９）ウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：−
（１０）フォスファターゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１１）カゼイン加水分解（Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１２）セルロース加水分解（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１３）ゼラチン加水分解（Ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：＋
（１４）でんぷん加水分解（Ｓｔａｒｃｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）：−
（１５）デオキシリボヌクレアーゼ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｅｓｔ）：＋
（１６）硝酸塩還元（Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１７）脱窒（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：−
（１８）硫化水素生成（Ｈ２Ｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（１９）インドール生成（Ｉｎｄｏｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）：−
（２０）クエン酸塩の利用（Ｃｉｔｒａｔｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）：＋
（２１）ＯＦ−ｔｅｓｔ：ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
（２２）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
Ｌ−アラビノース（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ）：−
Ｄ−キシロース（Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ）：−
Ｄ−グルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）：＋
Ｄ−マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）：＋
Ｄ−フラクトース（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−ガラクトース（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ）：−
Ｄ−マルトース（Ｄ−ｍａｌｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−スクロース（Ｄ−ｓｕｃｒｏｓｅ）：＋
Ｄ−ラクトース（Ｄ−ｌａｃｔｏｓｅ）：＋
Ｄ−トレハロース（Ｄ−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：＋
Ｄ−ソルビトール（Ｄ−ｓｏｒｂｉｔｏｌ）：−
グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：−
スターチ（ｓｔａｒｃｈ）：−
【００３０】
分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６Ｓ ｒＲＮＡの、ＲＨ２１８０−５の解析結果は以下の通りである。
（１２）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の解析結果
ＲＨ２１８０−５のコロニーから、コロニーＰＣＲにより、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、配列表の配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列が見出された。この配列表の配列番号１の塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ全長ではないため、１６Ｓ ｒＲＮＡ「領域」とした。この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴで相同性検索を行ったところ、本発明のＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列は、リソバクター属であるＬｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＮ２０４３Ｔ株と相同率９９％を示した。従って、本発明のＲＨ２１８０−５は、リソバクター属に属する微生物である。
【００３１】
上記Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓには、抗生物質産生の報告はないので、本発明のＲＨ２１８０−５とは異なるものである。
【００３２】
以上の本菌株の性質をバージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３ １９８９）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、１６Ｓ ｒＲＮＡ解析の結果を考慮して総合的に判断した結果、本菌株はリソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であると判断した。
【００３３】
本発明のＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、本菌株の産生する抗生物質の示す、ＶＲＥを含む多剤耐性菌にも有効という新規な抗菌スペクトルの傾向と、これまでに報告されていない有用性の高い新規な抗生物質を産生するという性質から、本菌株は新規微生物株であると判断した。
【００３４】
以上の結果から、今回見出された本菌株は、従来報告されていない新規で有用なリソバクター属の菌株と判断し、リソバクター属、「ＲＨ２１８０−５」と命名した。ＲＨ２１８０−５は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０（寄託日：２０１０年１月２５日）として、国内寄託されている。なお、バクテリアの一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易く、上記で示した範囲内に留まらない可能性も有している。しかしながら、ＲＨ２１８０−５（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０）から変異した微生物であっても、抗生物質を産生する能力を有している限り、本発明の微生物に含まれるものである。
【００３５】
すなわち、本発明は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物である。また、配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する上記の微生物である。
【００３６】
更に好ましくは、本発明は、産生される抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである上記の微生物である。すなわち、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有しているＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物や、ＮＩＴＥ Ｐ−８７０から変異した微生物は、更に好ましい本発明の微生物に含まれるものである。また言うまでもなく、その変異には自然的な変異と人工的な変異を含むものである。
【００３７】
（本発明微生物の培養方法）
本発明のＲＨ２１８０−５の培養方法は、リソバクター属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。具体的には、ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地、ＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地等の栄養源含有培地に接種し、好気的条件下で培養を行う。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、シュクロース、デンプン、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。また、シリコン油や界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。
【００３８】
培養条件は、先に記したように好気的条件下で培養するのが好ましく、液体培養法であれば通気攪拌培養が望ましい。小規模であればフラスコによる振とう培養法を用いてもよい。培養温度は２０℃〜４０℃で可能であるが、２５℃〜３５℃間に保つことが好ましく、２７℃〜３２℃で行うことがより好ましい。培養ｐＨは、６〜８が好ましく、７付近で行うことが特に好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、ＲＨ２１８０−５の場合、通常は１〜２０日間程度、好ましくは４〜７日間程度の短期間に充分な量の目的物を確保することができる。
【００３９】
（抗菌活性成分の精製方法）
ＲＨ２１８０−５の培養物からの抗菌活性成分の回収は、通常の微生物培養物から生理活性物質を回収し精製する方法で行えばよい。ここで培養物とは、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物を含むものである。例えば、培養物に抽出処理としてアセトン等の適当な有機溶媒を加えて懸濁した後に、遠心分離やろ過膜分離等を行って菌体と分離した抽出上清に対して、通常用いられる単離精製処理を加えればよい。また必要に応じて残った菌体残渣を摩砕処理等してから再度抽出処理を行ってもよい。
【００４０】
通常単離精製に用いられる溶媒や分離手法は、最小生育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」と略記する）で判定された抗菌活性を指標として、その取捨選択が行われる。単なる抗菌活性の分離、濃縮であれば基本的にそのような手法でも問題はない。しかしながら、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質の単離精製に当たっては、ＭＩＣの結果だけでなく、特許文献５で示したカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果を指標とした選択を行っている。その結果、ＭＩＣの結果だけでは濃縮・単離することが困難であったと考えられる「本発明のＲＨ２１８０−５」の産生する新規な抗生物質の濃縮・精製が成し遂げられたのである。そこで、その点に関し次に記載する。
【００４１】
（カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした抗生物質の単離精製）
多くの菌株から有用菌株の絞込みを行う一次スクリーニングは、抗菌活性を評価する方法であれば何れの方法でも行うことができるが、例えば、ＭＩＣを指標として各種菌株の培養上清中に黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性の認められた検体をピックアップすることができる。その後、各精製工程で得られた検体は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに供することで、その検体の治療効果を検討することができる。
【００４２】
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに対して治療効果の認められた検体については、更に単離精製操作を行い、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに、各精製段階の検体を投与して、行った単離精製操作の種類や手法による治療効果の濃縮度を確認する。このような「治療効果を指標にした検体や精製操作方法の取捨選択方法」は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを利用することによって始めて成し遂げられたものである。
【００４３】
表１の結果は、ＲＨ２１８０−５の培養液から精製される各精製段階の検体の抗菌活性ＭＩＣと、カイコ感染モデルの治療効果ＥＤ５０をまとめたものである。表１中、全活性「ｕｎｉｔ」とは、体重１ｇの黄色ブドウ球菌に感染したカイコの、５０％の確率で生存に必要な活性量と定義される。
【００４４】
表１に示すように、極めて興味深いことに、行った単離精製操作によって、抗菌活性の濃縮度と、治療効果の濃縮度は、必ずしも一致しないことが明らかとなった。表１の結果は、ＥＤ５０が３００倍に濃縮されているのに対し、ＭＩＣは、この場合に行った単離精製方法では、５倍に濃縮されているに過ぎないことを示している。
【００４５】
【表１】
【００４６】
つまり、本発明のＲＨ２１８０−５は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いた治療効果を指標とした単離精製方法を用いることによって効果的に見出されたものと考えることができる。なぜならば、従来から行われている抗菌活性のみを指標として目的物の単離精製を行った場合には、治療効果の点では有効でない抗菌活性成分が濃縮されてしまい、生体内で治療効果の高い抗生物質を見逃してしまう可能性が高かったと、表１の結果から考えられるからである。そしてその場合には、本発明のＲＨ２１８０−５の有用性を確認することはできずに、ＲＨ２１８０−５の存在自体を見逃してしまった可能性が高いのである。従って、本発明の新規微生物（ＲＨ２１８０−５）を世の中に提供するにあたり、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルを用いる治療効果を指標とした取捨選択が行われ、新規な抗生物質が得られたことは非常に重要と考えられる。
【００４７】
以下に、本発明の上記微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法と、本発明の上記微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法の具体的な内容について記載する。
【００４８】
（抗生物質の単離精製方法）
カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標として選択される単離精製方法としては特に限定はないが、培養物の溶媒抽出、転溶、水沈殿、ＯＤＳカラム等によるクロマトグラフィー、ＯＤＳカラム等を用いたＲＰ−ＨＰＬＣによる分取等が挙げられる。上記溶媒抽出の溶媒や転溶の溶媒としては特に限定はないが、アセトン等の水溶性溶媒；ブタノール等の親水性溶媒；それらの混合溶媒；水と親水性溶媒との混合溶媒；水と水溶性溶媒との混合溶媒；等が好ましい。また、ＯＤＳカラムの代わりに、オクチル基やブチル基で修飾した担体、ポリスチレン系のポリマー担体等を充填したカラムを用いてもよい。表１参照。
【００４９】
なお、上記した単離精製方法は一例に過ぎず、最終的に目的とする抗生物質が得られる方法であれば、如何なる単離精製方法であってもよい。
【００５０】
（単離精製された抗生物質の構造解析）
以上のＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＲＨ２１８０−５の培養物から９つのピークに分けられる化合物を分取することができた（図１）。これらはＵＶ吸収パターンが類似していることから互いに類似する化合物であり、ＲＰ−ＨＰＬＣより前段階の単離精製方法によっては単一の成分となっている。
【００５１】
これらの９つのピークのうち主要なピークであるピーク５のＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品の構造解析は次の解析手段により行われた。すなわち、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析（図２）、１Ｈ−ＮＭＲ解析や１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ：飛行時間型）ＭＳ解析（図４）等を実施した結果、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｒｇがそれぞれ２分子、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅがそれぞれ１分子検出され（図２）、図５に示す新規骨格構造を有する新規抗生物質（以下、「ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質」と表記する）であることが判明した。
【００５２】
（抗菌スペクトル）
上記各ピークの抗生物質の示す抗菌スペクトルは、微量液体希釈法等で得られたＭＩＣによって検討することができる。それによって、例えば、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、表２に示すように、黄色ブドウ球菌、腸球菌等のグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことを確認することができた。更に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても通常の細菌と同様の抗菌活性を有し、多剤耐性細菌にも有効であることを確認することができた。表２、後述の表６参照。
【００５３】
以上から、本発明の抗生物質は、前記の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくとも、ＭＲＳＡ及びＶＲＥに対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質である。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（マウス黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果）
ＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質は、各精製工程においてカイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおいてその治療効果を有することが確認されている。前記特許文献５において、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルに治療効果を示す物質は、マウス感染モデルに対しても治療効果を示すことが確認されている。そこで、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質に対しても同様の確認を行ったところ、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウス感染モデルにおいても治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなりバンコマイシンの１．６ｍｇ／ｋｇよりも明確に低く治療効果の高いことが確認された。表３参照。
【００５６】
また、マウスに対する急性毒性試験の結果は、５０ｍｇ／ｋｇの投与量ではマウスは殺傷されなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが期待できる。
【００５７】
【表３】
【００５８】
以上の結果から、本発明のＲＨ２１８０−５の産生する抗生物質ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、ＭＲＳＡに対してバンコマイシンに比べて優れたＥＤ５０値を示し高い治療効果を示すと共に、臨床上非常に問題となっているＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも有効性を示すという優れた特徴を有していることが確認できた。また、治療効果を示す他の画分中の物質も、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質と同様のＵＶスペクトルを示すことから類似する化合物と考えられ、従って、抗菌スペクトルも同様の傾向を示すと予想される。以上の結果は、発明者が見出したＲＨ２１８０−５が有用性の高い新規微生物であることを示すものである。
【００５９】
ＲＨ２１８０−５の産生する化合物が、上記したように、新規な環状ペプチド構造を基本骨格とする新規な化合物であること、また、その化合物がＭＲＳＡだけでなくＶＲＥにも抗菌活性を示し、ＭＲＳＡによる感染症に対しマウスにおいて治療効果が確認され、このような抗菌スペクトルは知られていなかったこと等を含め総合的に判断した結果、ＲＨ２１８０−５は、新規な微生物株であると判断した。
【００６０】
９つのピークのうちの主要なピークであるピーク５からのＲＰ−ＨＰＬＣ精製標品と同様に、その他のピークも、精密質量分析による分子量測定、酸加水分解処理後のアミノ酸分析、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲによる解析、ＴＯＦ型ＭＳ解析、ＵＶスペクトル、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）で構造解析した結果、９つのピークを与える化合物は、下記式（１）と表４で示される化合物であった。
【００６１】
【化２】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【００６２】
【表４】
表４中、「高分解能質量分析」は、ＨＲ ＴＯＦ ＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋
【００６３】
本発明は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する上記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である抗生物質でもある。
【００６４】
検討例２に示すように、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は、従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌との比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例、検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６６】
実施例１
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の単離精製＞
（１）抗菌活性を有する微生物のＭＩＣによる探索
各地から採取した土壌を生理食塩水に懸濁し、その上清をＧＡ培地及びＨＶ培地に塗布し、３０℃でインキュベート後に生育した菌を分離し、ＹＭＥ培地又はＳＧＭ培地、ＣＤＹ培地にて３０℃で５日間培養した。アセトンを等量加え、懸濁後に遠心分離しその上清をエバポレーションした。得られた残存物を生理食塩水で希釈後に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を微量液体希釈法によるＭＩＣにて評価した。その結果、１４３４６株中、３４８７株の培養上清に抗菌活性が認められた。
【００６７】
（２）カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル（以下、「カイコモデル」と略記する）を用いた治療活性物質を産生する微生物株の検討
先の抗菌活性が認められた３４８７株の検体を、カイコモデルに供してその治療効果を検討したところ、４５株の培養上清に治療効果が認められた。
【００６８】
（３）カイコモデルを用いた治療効果を指標とした治療活性物質の精製
上記４５株中、沖縄で採取された土壌から分離されたＲＨ２１８０−５について、培養上清からの治療活性物質の精製を実施した。ＲＨ２１８０−５は、後述する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の解析、酸性物質の傾向等から、新規リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物と判定された。
【００６９】
ＲＨ２１８０−５を、ＹＭＥ培地１２００ｍＬに接種して培養し、培養物の５０％アセトン抽出物からカイコモデルにおける治療効果を指標に治療効果を示す抗生物質の精製方法を検討した。その結果、ブタノール転溶、水沈殿、ＯＤＳカラムによるクロマトグラフィー、更にＯＤＳカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣ）により、治療効果を示す抗生物質が精製された。
【００７０】
表１に示したように、以上の精製工程により、治療効果（ＥＤ５０値）の比活性は、アセトン抽出物の３００倍に上昇した。一方、抗菌活性（ＭＩＣ）の上昇は５倍に留まった。これは、精製の出発材料である培養上清のアセトン抽出物の示す抗菌活性には最終精製物の治療効果を示す抗生物質以外の物質も関与し、今回選択された精製工程によりそれらの物質が除去されたためと推定される。
【００７１】
また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、ＵＶ吸収パターンの類似した９つの化合物が検出されていることから、ＲＨ２１８０−５は少なくとも９つの関連化合物を産生していると考えられた。
【００７２】
実施例２
＜ＲＨ２１８０−５の培養とＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の製造＞
ＲＨ２１８０−５の斜面培養から白金耳で菌を掻き取り、１００ｍＬのＹＭＥ培地を入れた５００ｍＬ容の三角フラスコに接種し、３０℃で３日間振とう培養を行い種培養液とした。次いで、この種培養液１．０ｍＬを、先の液体培地１００ｍＬを入れた５００ｍＬ容の三角フラスコ１２本に接種し、３０℃で５日間振とう培養を行った。
【００７３】
このようにして得た培養液にアセトンを等量混合し、この混合液を充分に攪拌した後に遠心分離を行い、遠心上清をエバポレーションしてアセトンを除去した。次いで、この試料をブタノール転溶に供した。ブタノール転溶はアセトン抽出物を８０ｍＬの水に懸濁し、等量のブタノールを添加して充分に振とうした後、静置、分液ロートにてブタノール層を分取し、減圧乾固後水沈殿に供した。水沈殿は先の試料を８０ｍＬの水に懸濁し、遠心後に水を取り除き、沈殿物を分取した。
【００７４】
ブタノール抽出物残渣７５ｍｇのサンプルを６０％メタノールに溶解し、Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｅｐ−ｐａＫ（登録商標）Ｃ１８、２５ｍＬを用いて、０．１％ＴＦＡを含む６０％−１００％メタノールで１０％ごとに２０ｍＬの液で溶出させた。その結果、７０％−８０％メタノール画分で治療効果を示す抗生物質含有画分が溶出された。
【００７５】
先の治療効果を示す抗生物質含有画分をプールして乾固させ、内２２ｍｇを５０％メタノールに溶解し、Ｓｅｎｓｈｕ ＰａＫ ＳＰ−１００ ＯＤＳカラム（直径２０ｍｍＸ長さ２５０ｍｍ）を用いて、７５％−９５％メタノール＋０．１％ＴＦＡにて溶出させた。この条件のＰＲ−ＨＰＬＣにより治療効果を示す抗生物質含有画分は、それぞれ単一物質からなる９つのピークを示す物質に分画された。
【００７６】
以上のＲＰ−ＨＰＬＣにおいて、治療効果を示す抗生物質含有画分は、ピーク５を主要成分とする９つの類似したＵＶ吸収パターン（ＵＶ装置Ｗａｔｅｒｓ２９９６ ｐｈｏｔｏ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）を有する化合物群からなっていることが確認された。図１参照。以上の操作により、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を５．３ｍｇ得た。
【００７７】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の構造解析＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を、ブルカー・ダルトニクス社（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ）ＢｉｏＴＯＦ−Ｑ質量分析器による精密質量分析に供した結果、分子量は１６１６．９［ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで、（Ｍ＋Ｈ）＋が、ｍ／ｚ＝１６１７．８７５５］であることが分かった。また、６Ｎ塩酸下、１０５℃で一晩加水分解処理をした後に、日立アミノ酸分析機によりアミノ酸分析を行ったところ、各々２分子のＴｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇと、各々１分子のＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅが検出された（図２）。更に、日本電子ＥＣＡ−５００ＮＭＲによる１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲ解析（図３）、ＴＯＦ−ＭＳ解析（図４）の結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、図５に示す新規骨格を有する化合物であることが明らかとなった。
【００７８】
更に、酸加水分解を行ったＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質について、キラルカラムによるＤ，Ｌ体の決定を行ったところ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，２個のＴｈｒはＬ体で、Ｎ−ＭｅＰｈｅ，２個のＡｒｇ，ＴｒｐはＤ体であることが明らかになった。
ＧｌｎとＧｌｕについては、酸加水分解の結果では両方ともＧｌｕとなり、Ｄ，Ｌ体が１：１で検出されたため、グルタミンおよびグルタミン酸を含むペプチドに対して、ビス（１，１―トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを反応させることにより、グルタミンをジアミノ酪酸に変換し、加水分解後、反応しなかったグルタミン酸について、キラルカラムによる絶対配置の決定を行ったところ、ＧｌｎがＤ体、ＧｌｕがＬ体であることが明らかになった。（この分解法によるペプチドのＤ，Ｌ体の決定法は本願において初めて行われた新規の方法である。）
脂肪酸鎖の水酸基については、改良モッシャー法により絶対配置Ｒを決定した。
その結果、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、各アミノ酸が図６に示す立体構造を有する新規な環状ペプチド化合物であることが分かった。
【００７９】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトル＞
ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の各種細菌に対する抗菌スペクトルを微量液体希釈法によるＭＩＣにより検討した。その結果を表２に示す。ＭＩＣの結果から、本物質は黄色ブドウ球菌、腸球菌に抗菌活性を示すことからグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことが明らかとなった。またメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）だけでなくバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対しても抗菌活性を示したことから、多剤耐性菌に対しても有効であると考えられた。今回の結果で示されたＭＩＣの値は、従来報告のある抗生物質と比べて低い値でなく、特に高い抗菌活性を示したものではないが、治療効果については、後述する治療効果の検討により、バンコマイシンと比べた場合、バンコマイシン以上の治療効果を有することが確認された。
【００８０】
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質のマウス黄色ブドウ球菌感染モデル（マウスモデル）における治療効果と毒性の検討＞
７％ムチン＋０．２ｍＭクエン酸鉄（III）アンモニウム（Ｆｅｒｒｉｃ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）に、黄色ブドウ球菌Ｓｍｉｔｈ株を懸濁し、６．２×１０６個（２０×ＬＤ５０）を一群５匹のマウス（ＩＣＲ雌４週齢）の腹腔に投与した。各薬剤は、以下に示す方法で先の菌株投与２時間後に皮下注射した。
【００８１】
上記マウスモデルに対してＰＢＳに溶解したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇとなるよう皮下注射し、投与後、翌日の生存数を測定することでその治療効果（ＥＤ５０値）を検討した（１群５匹）。同様にしてバンコマイシンについても、今回用いたマウスモデルに対するＥＤ５０値を検討した。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の場合、ＰＢＳ投与で生存なしの条件で、２５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウス全匹の生存が確認された。また、ＥＤ５０値はプロビット法により求めた。
【００８２】
得られた結果を表３に示す。ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質はマウスモデルに対して治療効果を示し、そのＥＤ５０値は０．６ｍｇ／ｋｇとなり、同時に検討したバンコマイシンのＥＤ５０値１．６ｍｇ／ｋｇより明確に低く、黄色ブドウ球菌に対して治療効果の高い抗生物質であることが確認された。
【００８３】
また、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質をマウスに皮下投与し、投与後翌日の観察によりマウスに対するＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の急性毒性についても検討した。急性毒性は、ＥＤ５０値の８０倍量に相当する５０ｍｇ／ｋｇの投与量では毒性を認めなかったことから、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は低毒性であることが示唆された。
【００８４】
検討例１
＜１６Ｓ ｒＲＮＡ解析＞
ＲＨ２１８０−５の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基をコロニーＰＣＲ法によって増幅し、増幅できたＲＮＡ断片についてシーケンサーによって解析した。その結果、５’末端側、３’末端側のいくつかの塩基を除く、配列表の配列番号１に示すほぼ１６Ｓ ｒＲＮＡ領域全長に相当する塩基配列を決定した。この塩基配列を元にＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて既存菌株との相同性検索を行った。その結果ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と９９％の相同性を示したことから、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物であると考えられた。
【００８５】
＜ＲＨ２１８０−５の新規性について＞
ＲＨ２１８０−５は、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ２０４３Ｔ株と化学的性質について相似する点が多いが、産生する生理活性物質の抗菌スペクトルが異なること、これまで報告されていない新規で有用なＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を産生していることが確認されている点が異なっている。よって、以上の結果から、ＲＨ２１８０−５は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な菌株であると判定した。
【００８６】
検討例２
＜各ピーク物質の多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討＞
試料量の少ないピーク１物質を除くピーク２物質からピーク９物質の８つの本発明の新規な環状ペプチド化合物について、多剤耐性菌と薬剤耐性を有さない菌に対する抗菌活性の比較検討を行った。
【００８７】
試験対象菌には、黄色ブドウ球菌と腸球菌を選択し、微生物も同じＭＳＳＡ１とＥＦ１、ＭＲＳＡ３とＭＲＳＡ４及びＶＲＥについて各ピーク物質の示すＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。その結果を表５に示す。
【００８８】
【表５】
ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）
【００８９】
ＭＳＳＡ１：黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ３：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＴＣ，ＥＭ耐性黄色ブドウ球菌
ＭＲＳＡ４：ＯＸ，ＦＬ，ＫＭ，ＣＰ，ＣＰＬＸ耐性黄色ブドウ球菌
ＥＦ１ ：腸球菌
ＶＲＥ ：バンコマイシン耐性腸球菌
【００９０】
ＯＸ：オキサシリン、ＦＬ：フロモキエフ、ＫＭ：カナマイシン、
ＴＣ：テトラサイクリン、ＣＰ：クロラムフェニコール、ＥＭ：エリスロマイシン
ＣＰＬＸ：シプロフロキサシン
【００９１】
その結果、各ピーク物質の示すＭＩＣ値自体は従来報告されている抗菌剤に比べると大きい値となっているものの、通常の菌とその多剤耐性菌（ＭＳＳＡ１とＭＲＳＡ３，ＭＲＳＡ４との間、ＥＦ１とＶＲＥ間）の比較においては、ＭＩＣ値はほとんど同等の値を示し、各ピーク物質の抗菌活性は多剤耐性の影響を受けていないことが確認された。
【００９２】
なお、抗菌活性と治療効果は必ずしも一致していないことが確認されている。例えば、ＭＳＳＡに対するＭＩＣ値が表５の場合で６．３μｇ／ｍＬ、表２の場合で５μｇ／ｍＬを示したＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、マウス黄色ブドウ球菌感染モデルに対する治療効果（ＥＤ５０値）の検討結果ではバンコマイシンの１／３程度のＥＤ５０値を示しており、高い治療効果を示すことが確認されている。
【００９３】
ＭＩＣ値５μｇ／ｍＬや６μｇ／ｍＬは、バンコマイシンでは耐性菌の示すＭＩＣ値とされている水準であるにもかかわらず、前記式（１）で示される化合物が充分な治療効果を示す理由の一つとして本化合物が既存薬とは異なった作用機序で抗菌活性を示し、それが治療効果に反映している可能性が考えられる。既存薬と異なった作用機序で抗菌活性を示している場合は、少なくとも現時点での耐性菌の分離頻度が低いことが予測され、前記式（１）で示される化合物の有利な点と考えられる。
【００９４】
検討例３
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の抗菌スペクトルの検討＞
先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の、ＭＲＳＡ、ＶＲＥを含む各種の微生物に対する抗菌スペクトルの検討を行った。１０％血清を添加した場合と血清を添加しなかった場合それぞれのＭＩＣ値をＣＬＳＩ（旧ＮＣＣＬＳ米国臨床検査標準委員会）に基づく微量検体希釈法によって測定した。測定結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】
【００９６】
表６の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質は、グラム陽性菌に対し有効であり、血清の添加によって活性が上昇することが確認できた。
【００９７】
検討例４
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の殺菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に１．８ｘ１０８個の黄色ブドウ球菌を摂取し、先のＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質（２５μｇ／ｍＬ）、バンコマイシン（ＶＭ、５μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（ＧＭ、２．５μｇ／ｍＬ）を添加し、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後の生存細胞数をＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ／ｍＬ）として求めた。結果を表７に示す。
【００９８】
【表７】
【００９９】
表７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質を添加すると、バンコマイシン、ゲンタマイシンを添加した場合と比較して直ちに黄色ブドウ球菌が減少することが確認できた。
【０１００】
検討例５
＜ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質の溶菌活性の検討＞
ＣＡ−Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ培地に黄色ブドウ球菌液を希釈し、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質、バンコマイシン、ダプトマイシンを試験例１で用いたときの５倍の濃度で添加し、３７℃で培養した。吸光度計（島津製作所社製）を用いて、添加後の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を経時的に測定した。結果を図７に示す。
【０１０１】
図７の結果より、ＲＨ２１８０−５Ｐｅａｋ５物質が、バンコマイシン、ダプトマイシンと比較して吸光度（ＯＤ６００）の減少が大きかったことから、溶菌活性を示すことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の新規微生物株ＲＨ２１８０−５は、新たな抗生物質の製造方法とその抗生物質を提供することができるという産業上の利用可能性を有している。
【受託番号】
【０１０３】
国内寄託：ＮＩＴＥ Ｐ−８７０
ブダペスト条約に基づく寄託：ＮＩＴＥ ＢＰ−８７０
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列表の配列番号１は、リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ ｒＲＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物。
【請求項２】
上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する請求項１又は請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質。
【請求項７】
下記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である請求項６記載の抗生物質。
【化１】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【請求項１】
リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）属に属する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−８７０の微生物又はその自然的若しくは人工的に変異した微生物であって、抗菌活性を有する抗生物質を産生する能力を有する微生物。
【請求項２】
上記抗生物質が、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有するものである請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
配列表の配列番号１で示される１６Ｓ ｒＲＮＡ領域の塩基配列を有する請求項１又は請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から、該微生物の産生した、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有する抗生物質を得ることを特徴とする抗生物質の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項３の何れかの請求項に記載の微生物の培養液から得られる、該微生物の産生した抗生物質であって、少なくともメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）及びバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）に対して抗菌活性を有することを特徴とする抗生物質。
【請求項７】
下記式（１）で示される化合物又はその製薬学的に許容される塩である請求項６記載の抗生物質。
【化１】
［式（１）中、Ｒ１は水酸基を１つ有する炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ２はメチル基又は水素原子を示し、Ｒ３はエチル基又はメチル基を示す。］
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−５４８０（Ｐ２０１２−５４８０Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１６４８６（Ｐ２０１１−１１６４８６）
【出願日】平成２３年５月２５日（２０１１．５．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人医薬基盤研究所、基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１４８１４９２）株式会社ゲノム創薬研究所 (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２５日（２０１１．５．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人医薬基盤研究所、基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１４８１４９２）株式会社ゲノム創薬研究所 (25)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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