抗癌剤
【課題】安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供すること。
【解決手段】本発明の抗癌剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する。
【解決手段】本発明の抗癌剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤に関し、より詳細には、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の一酸化窒素（ＮＯ）はアポトーシスを誘導することが知られている。この現象を利用し、化学修飾によりＮＯを多量にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付加して得られたＳ−ニトロソ基含有ＨＳＡ（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を癌細胞に投与することにより、癌を治療する試みが報告されている（特許文献１）。ＨＳＡは内因性の物質であるため、ＳＮＯ−ＨＳＡを体内に投与しても、副作用が少なく、ニトロソ基も安定して存在することから、ＳＮＯ−ＨＳＡは有効な抗癌剤として期待されている。しかし、癌を効果的に治療するには１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＳＮＯ−ＨＳＡが必要とされる（特許文献１）。
【０００３】
ところで、特許文献２および３ならびに非特許文献１には、少なくとも２つのＨＳＡ分子を遺伝子組換え法により結合したＨＳＡ多量体およびその製造方法が記載されている。また、ＨＳＡ多量体を薬物投与担体として用いた場合、ＨＳＡ単量体と比較して薬物の血中半減期が長くなることが記載されている。
【０００４】
一方、癌細胞を含む腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため高分子などが血管から流出しやすい反面、リンパ系が発達していないため腫瘍組織に到達した物質は蓄積するというＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果が知られており、癌細胞に対する受動的ターゲティングを行う上で重要な因子となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−５７３１８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２６９号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８７８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. Matsushitaら、「Recombinant human serum albumin dimer has high blood circulation activity and low vascular permeability in comparison with native human serum albumin」、Pharm Res、2006年、第23巻、p. 882-891
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することを目的とする。また、他の抗癌剤の癌細胞ターゲティングを増強するＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が優れた抗癌作用および他の抗癌剤に対するＥＰＲ効果促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
【００１１】
１つの実施態様では、上記アルブミン２量体は、遺伝子組換え法により製造される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記アルブミン２量体をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で示される。
【００１３】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される。
【００１４】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、ヒトに対して５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＳＡ２量体、ＨＳＡ単量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真（Ａ）、キャピラリーゾーン電気泳動の結果を示すグラフ（Ｂ）、ＣＤスペクトル解析の結果を示すグラフ（ＣおよびＤ）である。
【図２】ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体、ＨＳＡ単量体をＣ２６癌モデルマウスに静脈投与後、投与量に対する腫瘍組織への移行量（％）の経時変化を示すグラフである。
【図３】ＨＳＡ２量体（Ａ）、ＨＳＡ単量体（Ａ）、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（Ｂ）、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体（Ｂ）で処理したＣ２６細胞の細胞死の割合（％）を示すグラフである。
【図４】ＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＧＳＮＯをＣ２６癌モデルマウスに静脈投与して６時間後の腫瘍（Ａ）、肝臓（Ｂ）、腎臓（Ｃ）、血漿（Ｄ）のＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度を示すグラフである。
【図５】ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体をＣ２６癌モデルマウスに静脈投与し、６時間後にエバンスブルーを静脈投与し、２４時間後の腫瘍、筋肉のエバンスブルーのＴ／Ｂ比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の抗癌剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する。
【００１８】
本発明のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体とは、アルブミンの２量体であって、各アルブミンに対して少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上のＳ−ニトロソ基が導入されているアルブミン２量体をいう。
【００１９】
本発明におけるアルブミン２量体は、天然のアルブミンを化学架橋剤によって２量体化したものであってもよいし、遺伝子組換え法によって２量体化したものであってもよい。
【００２０】
天然のアルブミンとは、ヒトや哺乳動物などの体内に存在するアルブミンのほか、卵白アルブミンや筋アルブミン（ミオゲン）も含み、これらと同一のアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。ヒト体内に存在するアルブミンとしては、例えば、ヒト血清中に存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられる。
【００２１】
化学架橋剤としては、特に限定されず、例えば、ＢＭＨ（1, 6-Bismaleimidohexane）、ＤＭＳ（Dimethyl Suberimidate, Dihydrochloride）、ＥＭＣＡ（N-ε-Maleimidocaproic Acid）、ＥＭＣＳ（N-[ε-Maleimidocaproyloxy]Succinimide Ester）、ＳＩＡ（N-Succinimidyl Iodoacetate）、ＳＭＣＣ（Succinimidyl trans-4-(N-Maleimidylmethyl)-Cyclohexane-1-Carboxylate）、ＳＰＤＰ（N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio) Propionate）が挙げられる。
【００２２】
遺伝子組換え法によって２量体化する方法では、一方のアルブミンポリペプチドのＣ末端に他方のアルブミンポリペプチドのＮ末端を結合する。Ｎ末端、Ｃ末端のアミノ酸残基は、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、１もしくは複数個の残基が置換、欠失および／または付加されてもよい。一方のＣ末端と他方のＮ末端とは直接結合してもよいし、リンカーポリペプチドを介して結合してもよい。リンカーポリペプチドの長さは、特に限定されないが、好ましくは５〜２０残基である。リンカーポリペプチドとしては、特に限定されず、例えば、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｃ末端、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−Ｃ末端、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４−Ｃ末端）、Ｎ末端−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｃ末端が挙げられる。
【００２３】
遺伝子組換え法によって生産されたアルブミン２量体の各アルブミンは、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、天然のアルブミンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。例えば、天然のアルブミンのアミノ酸配列中の４１０番目のアルギニンをシステインに置換したアルブミンを含み得る。２量体の一方と他方とは、同一のアミノ酸配列からなるものであってもよいし、異なるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２４】
本発明のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、天然のＳ−ニトロソ基含有アルブミンを化学架橋剤によって２量体化したものであってもよいし、天然のアルブミンを化学架橋剤によって２量体化したもの、または遺伝子組換え法によって２量体化したものに人為的にＳ−ニトロソ基を導入して得られたものであってもよい。
【００２５】
Ｓ−ニトロソ基は、アルブミンを構成するアミノ酸配列のアミノ酸中に存在する硫黄原子、例えば、チオール基における硫黄原子がニトロソ基で置換されることにより、アルブミンに導入される。チオール基を含有するアミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、メチオニンが挙げられる。
【００２６】
通常、天然のアルブミンは３５個のシステインを含有し、そのうち３４個はアルブミンの二次構造の形成のためにジスルフィド結合を形成している。このため、例えば、天然のアルブミンにシステインのチオール基を介してＳ−ニトロソ基を導入する場合には、ジスルフィド結合に関与しない１個のシステインにＳ−ニトロソ基を導入することができる。
【００２７】
アルブミンのチオール基に人為的にＳ−ニトロソ基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、ニトロソ化試薬（亜硝酸イオン、イソアミルナイトライト、ｎ−ブチルナイトライトなど）を用いる方法が挙げられる。
【００２８】
アルブミンに人為的にチオール基を導入して、このチオール基にＳ−ニトロソ基を導入することもできる。アルブミンに人為的にチオール基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、チオール化試薬（２−イミノチオランまたはその塩など）を用いて、リジンのε−アミノ基にチオール基を導入する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗癌剤の投与経路としては、特に限定されないが、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入が挙げられ、好ましくは非経口投与経路、より好ましくは注射による投与経路である。
【００３０】
本発明の抗癌剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤が挙げられる。
【００３１】
特に、注射剤とする場合には、ＳＮＯ−ＨＳＡを含有する溶液または懸濁液とすればよく、さらに、例えば、ｐＨ調整剤、電解質、糖類、ビタミン類、薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸および／またはアミノ酸などの当該分野で通常用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
【００３２】
溶液または懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される水（注射用水）、生理食塩水、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などを用いることができる。
【００３３】
ｐＨ調節剤としては、一般に注射剤のｐＨ調節剤として用いられるものであればよい。例えば、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸などの有機酸、例えば、塩酸、リン酸などなどの無機酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの無機塩基が挙げられる。
【００３４】
電解質としては、従来より輸液に用いられている各種水溶性塩を用いることができる。例えば、生体の機能や体液の電解質バランスを維持するうえで必要とされる各種無機成分（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン）の水溶性塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）が挙げられる。
【００３５】
糖類としては、従来より各種の輸液に用いられているものを用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトースなどの二糖類、グリセロールなどの多価アルコール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、デキストラン４０またはデキストラン８０などのデキストラン類、蔗糖が挙げられる。
【００３６】
ビタミン類としては、水溶性／脂溶性の各種ビタミンを用いることができる。例えば、ビタミンＡ、プロビタミンＡ、ビタミンＤ、プロビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６群、パントテン酸、ビオチン、ミオ−イノシトール、コリン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＰまたはビタミンＵが挙げられる。
【００３７】
薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、カプリル酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシククロヘキシルアミンなどの有機塩基が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。また、Ｎ−アセチルメチオニンなどのアミノ酸誘導体を添加してもよい。
【００３９】
本発明の抗癌剤は、通常の製剤学的方法に従って製造することができる。すなわち、水、各種緩衝液、一般に市販されている輸液（例えば、総合アミノ酸輸液、電解質輸液）またはそれらと同様の成分を含む水溶液などに、ｐＨが４．５〜８．７程度となるように、ＳＮＯ−ＨＳＡを希釈および／または溶解することによって製造することができる。
【００４０】
本発明の抗癌剤に含有されるＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体の濃度は、通常１〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００４１】
本発明の抗癌剤が適用される癌としては、特に限定されないが、例えば、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌が挙げられる。
【００４２】
本発明の抗癌剤は、有効成分のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体がヒトに対して通常５〜２００ｍｇ／ｋｇ・回、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４４】
（調製例１：遺伝子組換えヒト血清アルブミン２量体および単量体の調製）
遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２量体（配列番号１：塩基配列；配列番号２：アミノ酸配列）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を非特許文献１に記載の方法により調製した。同様にして、ＨＳＡ単量体（配列番号３：塩基配列；配列番号４：アミノ酸配列）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。
【００４５】
（調製例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体および単量体の調製）
調製例１で得られたＨＳＡ２量体を含有する水溶液にＤＴＴを添加し（最終濃度３ｍＭ）、３７℃にて５分間インキュベートした。この水溶液をセファデックスＧ−２５（φ１．６×２．５ｃｍ；ＧＥヘルスケア社）のゲル濾過に供してＤＴＴを除去し、０．５ｍＭのＤＴＰＡ（Diethylenetriaminepentaacetic Acid：ジエチレントリアミン五酢酸；ナカライテスク株式会社）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＨＳＡ２量体を溶出した。ＨＳＡ２量体の濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整し、この水溶液にＩＡＮ（Isoamyl nitrite：亜硝酸イソアミル；和光純薬工業株式会社）を添加し（最終濃度３ｍＭ）、遮光下３７℃にて１時間インキュベートした。この水溶液をセファデックスＧ−２５のゲル濾過に供し、０．５ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）でＳ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）２量体を溶出した。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の濃度を調整し、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。同様にして、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。これらの水溶液は使用するまで−８０℃にて保存した。
【００４６】
（参考例：Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体の物理化学的特性の評価）
調製例１で得られたＨＳＡ２量体の分子量を評価するために、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）を行った。調製例１で得られたＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を図１Ａに示す。
【００４７】
図１Ａから明らかなように、ＨＳＡ２量体は、ＨＳＡ単量体の分子量６６．５ｋＤａの約２倍に相当する分子量１３０ｋＤａの１本のバンドを示した。これは、ＨＳＡ２量体が分子構造から予想される分子として均一に調製されたことを示す。
【００４８】
次いで、ＨＳＡ２量体の全電荷を評価するために、キャピラリーゾーン電気泳動を行った。ＨＳＡ単量体を比較に用いた。キャピラリーゾーン電気泳動の条件は次のとおりである。結果を図１Ｂに示す。
【００４９】
Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム（ベックマン社製）
検出器：フォトダイオードアレイ検出器（２１４ｎｍ）
キャピラリー：６０ｃｍ（検出器まで５０ｃｍ）
注入圧：０．５ｐｓｉ（５分間）
電気泳動用緩衝液：リン酸ナトリウム系
【００５０】
図１Ｂから明らかなように、ＨＳＡ２量体はＨＳＡ単量体と同様の全電荷を示した。
【００５１】
次いで、ＨＳＡ２量体の立体構造を評価するために、円二色性分散計（日本分光株式会社製Ｊ−７２０型）を用いてＣＤスペクトル解析を行った。ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を図１ＣおよびＤに示す。
【００５２】
図１ＣおよびＤから明らかなように、ＨＳＡ２量体はＨＳＡ単量体と同様のＣＤスペクトルを示した。
【００５３】
次いで、調製例２で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ２量体が含有するＳ−ニトロソ基の数を評価するために、T. Akaikeら、「Mechanism of biological S-nitrosation and its measurement」、Free Radic Res、2000年、第33巻、p. 461-469に記載の方法に従い、ＨＰＬＣフローリアクターシステムを用いてＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基を定量した。調製例２で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は１分子あたり平均１．４８分子のＳ−ニトロソ基を含有していた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の１分子あたり平均０．５２分子のＳ−ニトロソ基の２倍以上であり、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体と比較してＨＳＡ１分子あたり多くのＳ−ニトロソ基を含有することを示す。
【００５６】
次いで、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体が含有するＳ−ニトロソ基の安定性を評価するために、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ溶液を遮光下２５℃にて保持し、上記と同様にして経時的にＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基を定量した。ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を表１に示す。
【００５７】
表１から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基の半減期は約３９日であり、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体のＳ−ニトロソ基の半減期の約２１日よりも長かった。
【００５８】
（実施例１：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体の薬物動態）
２官能性キレート剤としてＤＴＰＡ無水物を用い、放射性インジウム同位体（１１１Ｉｎ）の化合物として１１１ＩｎＣｌ３（日本メジフィジックス株式会社より提供を受けた）を用いて、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を１１１Ｉｎで標識した（１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の調製）。得られた１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を生理食塩水に溶解し、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。
【００５９】
得られた１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体をＣ２６癌モデルマウス（特許文献１の実施例１に記載の方法により作製した）７２匹に１ｍｇ／ｋｇの投与量で経尾静脈投与し、投与後一定時間経過ごとに１匹ずつマウスを屠殺し、背部皮下より腫瘍組織を回収した。回収した腫瘍組織について、ウェル形ＮａＩシンチレーションカウンター（アロカ株式会社製ＡＲＣ−２０００）を用いて放射活性を計測した。投与後の経過時間と投与量に対する腫瘍組織への移行量の結果を図２に示す。
【００６０】
（比較例１：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などの薬物動態）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体またはＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、放射活性を計測した。結果を図２に示す。
【００６１】
図２から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は、ＨＳＡ単量体の２．９倍、ＨＳＡ２量体の１．６倍腫瘍組織に蓄積した。これは、ニトロソ化および２量体化することによって相乗的にＨＳＡが腫瘍組織に蓄積しやくなったことを示す。
【００６２】
（実施例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体の細胞毒性）
マウス結腸癌由来細胞株Ｃ２６（東北大学加齢医学研究所より提供を受けた）をＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の存在下で培養し、細胞死の際に細胞から培養上清に放出されるＬＤＨ（Lactate Dehydrogenase：乳酸脱水素酵素）の活性を定量することによりＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の細胞毒性を評価した。
【００６３】
Ｃ２６細胞を培地（ＲＰＭＩ−１６４０，１０％ＦＢＳ，１００単位／ｍＬペニシリン，１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に懸濁し、１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２１時間培養した。次いで、各穴の培養上清を新鮮な培地に交換し、各穴に種々の濃度でＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を添加し、さらに細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。ＬＤＨ−細胞毒性テストワコーキット（和光純薬工業株式会社２９９−５０６０１）を用いて各穴の培養上清のＬＤＨ活性を定量した（処理群）。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を添加しなかったこと以外は、同様にして培養上清のＬＤＨ活性を定量した（コントロール群）。細胞死の割合は、（Ｔ−Ｌ）／（Ｈ−Ｌ）×１００（％）（ここで、Ｔ：処理群の吸光度；Ｌ：コントロール群の吸光度；Ｈ：細胞をＴｒｉｔｏｎで溶解した場合の培養上清の吸光度（ＬＤＨ活性１００％）；吸光度は４９０ｎｍ（参照：６３０ｎｍ）にて測定）により求めた。結果を図３Ｂに示す。
【００６４】
（比較例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などの細胞毒性）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体またはＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、細胞毒性を評価した。結果を図３に示す。
【００６５】
図３Ａから明らかなように、Ｓ−ニトロソ基を含有しないＨＳＡ２単量体およびＨＳＡ単量体で処理した細胞は、２０ｍｇ／ｍＬの高濃度でも有意なＬＤＨ放出を示さなかった。また、図３Ｂから明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の１／３〜１／２のモル濃度で細胞を処理しても同等のＬＤＨ放出を示した。これは、１分子あたりの一酸化窒素（ＮＯ）の量が、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体では理論上ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の２倍であるためと考えられ、ＨＳＡではなくＮＯが細胞毒性を有することを示す。
【００６６】
（実施例３：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体による一酸化窒素の腫瘍組織への送達）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（２０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬをＣ２６癌モデルマウス４０匹に経尾静脈投与し（１．３μｍｏｌＮＯ／ｋｇ）、６時間後にマウスを屠殺し、下大静脈より血液を回収し、肝臓および腎臓を回収し、背部皮下より腫瘍組織を回収した。回収した血液を遠心分離し、上清の血漿１００μＬをＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量に用いた。肝臓、腎臓および腫瘍組織は、ＢｉｏＭａｓｈａｅｒ（登録商標）を用いてホモジナイズし、１０ｍｇをＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量に用いた。ＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量にはＧｒｉｅｓｓ法に基づく酸化窒素分析システム（株式会社エイコム製ＥＮＯ−２０）を用いた。結果を図４に示す。
【００６７】
（比較例３：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などによる一酸化窒素の腫瘍組織への送達）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、または従来のＮＯ供与体であるＧＳＮＯ（S-Nitrosoglutathione：Ｓ−ニトロソグルタチオン；株式会社同仁化学研究所Ｎ４１５）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、ＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度を定量した。結果を図４に示す。
【００６８】
図４から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の静脈投与によりＮＯＸレベルは腫瘍組織では顕著に上昇したが、肝臓および腎臓では上昇しなかった。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体およびＧＳＮＯと比較して腫瘍組織のＮＯＸレベルを大きく上昇させた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は、ＮＯを腫瘍に送達する上で、従来のＮＯ供与体であるＧＳＮＯやＳＮＯ−ＨＳＡ単量体よりも効率的であることを示す。
【００６９】
（実施例４：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体のＥＰＲ効果）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体がＮＯを腫瘍組織へ送達することにより、ＮＯがＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果を促進するかどうかを評価するために、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を投与した腫瘍組織でのエバンスブルーの取り込みを定量した。
【００７０】
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（２０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬをＣ２６癌モデルマウス２４匹に経尾静脈投与し（１．３μｍｏｌＮＯ／ｋｇ）、６時間後にエバンスブルー（東京化成工業株式会社Ｅ０１９７）を静脈投与し（１０ｍｇ／ｋｇ）、２４時間後にマウスを屠殺し、背部皮下より１００〜２００ｍｇおよび２００〜５００ｍｇの固形腫瘍を回収した。回収した固形腫瘍をホルムアルデヒドに浸漬し、腫瘍から滲出したエバンスブルーを紫外吸収（６２０ｎｍ）の測定により定量した。Ｔ／Ｂ比（tissue/blood ratio：血中の値に対する組織中の値の比）の結果を図５に示す。
【００７１】
（比較例４：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体のＥＰＲ効果）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例４と同様にして、エバンスブルーを定量した。結果を図５に示す。
【００７２】
図５から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体およびＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の静脈投与によりエバンスブルーの取り込みは腫瘍組織では上昇したが、筋肉では上昇しなかった。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体と比較してエバンスブルーの取り込みを大きく上昇させた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体がＳＮＯ−ＨＳＡ単量体よりも顕著にＥＰＲ効果を促進するためであり、おそらくＳＮＯ−ＨＳＡ２量体によるＮＯの腫瘍組織への送達の上昇のためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤に関し、より詳細には、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の一酸化窒素（ＮＯ）はアポトーシスを誘導することが知られている。この現象を利用し、化学修飾によりＮＯを多量にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に付加して得られたＳ−ニトロソ基含有ＨＳＡ（ＳＮＯ−ＨＳＡ）を癌細胞に投与することにより、癌を治療する試みが報告されている（特許文献１）。ＨＳＡは内因性の物質であるため、ＳＮＯ−ＨＳＡを体内に投与しても、副作用が少なく、ニトロソ基も安定して存在することから、ＳＮＯ−ＨＳＡは有効な抗癌剤として期待されている。しかし、癌を効果的に治療するには１０〜１５０ｍｇ／ｍＬのＳＮＯ−ＨＳＡが必要とされる（特許文献１）。
【０００３】
ところで、特許文献２および３ならびに非特許文献１には、少なくとも２つのＨＳＡ分子を遺伝子組換え法により結合したＨＳＡ多量体およびその製造方法が記載されている。また、ＨＳＡ多量体を薬物投与担体として用いた場合、ＨＳＡ単量体と比較して薬物の血中半減期が長くなることが記載されている。
【０００４】
一方、癌細胞を含む腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため高分子などが血管から流出しやすい反面、リンパ系が発達していないため腫瘍組織に到達した物質は蓄積するというＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果が知られており、癌細胞に対する受動的ターゲティングを行う上で重要な因子となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−５７３１８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２６９号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８７８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. Matsushitaら、「Recombinant human serum albumin dimer has high blood circulation activity and low vascular permeability in comparison with native human serum albumin」、Pharm Res、2006年、第23巻、p. 882-891
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することを目的とする。また、他の抗癌剤の癌細胞ターゲティングを増強するＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が優れた抗癌作用および他の抗癌剤に対するＥＰＲ効果促進作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤を提供する。
【００１０】
１つの実施態様では、上記アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
【００１１】
１つの実施態様では、上記アルブミン２量体は、遺伝子組換え法により製造される。
【００１２】
１つの実施態様では、上記アルブミン２量体をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で示される。
【００１３】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される。
【００１４】
１つの実施態様では、上記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、ヒトに対して５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＨＳＡ２量体、ＨＳＡ単量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真（Ａ）、キャピラリーゾーン電気泳動の結果を示すグラフ（Ｂ）、ＣＤスペクトル解析の結果を示すグラフ（ＣおよびＤ）である。
【図２】ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体、ＨＳＡ単量体をＣ２６癌モデルマウスに静脈投与後、投与量に対する腫瘍組織への移行量（％）の経時変化を示すグラフである。
【図３】ＨＳＡ２量体（Ａ）、ＨＳＡ単量体（Ａ）、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（Ｂ）、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体（Ｂ）で処理したＣ２６細胞の細胞死の割合（％）を示すグラフである。
【図４】ＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＧＳＮＯをＣ２６癌モデルマウスに静脈投与して６時間後の腫瘍（Ａ）、肝臓（Ｂ）、腎臓（Ｃ）、血漿（Ｄ）のＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度を示すグラフである。
【図５】ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体をＣ２６癌モデルマウスに静脈投与し、６時間後にエバンスブルーを静脈投与し、２４時間後の腫瘍、筋肉のエバンスブルーのＴ／Ｂ比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の抗癌剤は、Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する。
【００１８】
本発明のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体とは、アルブミンの２量体であって、各アルブミンに対して少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上のＳ−ニトロソ基が導入されているアルブミン２量体をいう。
【００１９】
本発明におけるアルブミン２量体は、天然のアルブミンを化学架橋剤によって２量体化したものであってもよいし、遺伝子組換え法によって２量体化したものであってもよい。
【００２０】
天然のアルブミンとは、ヒトや哺乳動物などの体内に存在するアルブミンのほか、卵白アルブミンや筋アルブミン（ミオゲン）も含み、これらと同一のアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。ヒト体内に存在するアルブミンとしては、例えば、ヒト血清中に存在するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が挙げられる。
【００２１】
化学架橋剤としては、特に限定されず、例えば、ＢＭＨ（1, 6-Bismaleimidohexane）、ＤＭＳ（Dimethyl Suberimidate, Dihydrochloride）、ＥＭＣＡ（N-ε-Maleimidocaproic Acid）、ＥＭＣＳ（N-[ε-Maleimidocaproyloxy]Succinimide Ester）、ＳＩＡ（N-Succinimidyl Iodoacetate）、ＳＭＣＣ（Succinimidyl trans-4-(N-Maleimidylmethyl)-Cyclohexane-1-Carboxylate）、ＳＰＤＰ（N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio) Propionate）が挙げられる。
【００２２】
遺伝子組換え法によって２量体化する方法では、一方のアルブミンポリペプチドのＣ末端に他方のアルブミンポリペプチドのＮ末端を結合する。Ｎ末端、Ｃ末端のアミノ酸残基は、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、１もしくは複数個の残基が置換、欠失および／または付加されてもよい。一方のＣ末端と他方のＮ末端とは直接結合してもよいし、リンカーポリペプチドを介して結合してもよい。リンカーポリペプチドの長さは、特に限定されないが、好ましくは５〜２０残基である。リンカーポリペプチドとしては、特に限定されず、例えば、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２−Ｃ末端、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−Ｃ末端、Ｎ末端−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４−Ｃ末端）、Ｎ末端−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｃ末端が挙げられる。
【００２３】
遺伝子組換え法によって生産されたアルブミン２量体の各アルブミンは、天然のアルブミンと同等の機能を有する限り、天然のアルブミンのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるアルブミンも含む。例えば、天然のアルブミンのアミノ酸配列中の４１０番目のアルギニンをシステインに置換したアルブミンを含み得る。２量体の一方と他方とは、同一のアミノ酸配列からなるものであってもよいし、異なるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２４】
本発明のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体は、天然のＳ−ニトロソ基含有アルブミンを化学架橋剤によって２量体化したものであってもよいし、天然のアルブミンを化学架橋剤によって２量体化したもの、または遺伝子組換え法によって２量体化したものに人為的にＳ−ニトロソ基を導入して得られたものであってもよい。
【００２５】
Ｓ−ニトロソ基は、アルブミンを構成するアミノ酸配列のアミノ酸中に存在する硫黄原子、例えば、チオール基における硫黄原子がニトロソ基で置換されることにより、アルブミンに導入される。チオール基を含有するアミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、メチオニンが挙げられる。
【００２６】
通常、天然のアルブミンは３５個のシステインを含有し、そのうち３４個はアルブミンの二次構造の形成のためにジスルフィド結合を形成している。このため、例えば、天然のアルブミンにシステインのチオール基を介してＳ−ニトロソ基を導入する場合には、ジスルフィド結合に関与しない１個のシステインにＳ−ニトロソ基を導入することができる。
【００２７】
アルブミンのチオール基に人為的にＳ−ニトロソ基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、ニトロソ化試薬（亜硝酸イオン、イソアミルナイトライト、ｎ−ブチルナイトライトなど）を用いる方法が挙げられる。
【００２８】
アルブミンに人為的にチオール基を導入して、このチオール基にＳ−ニトロソ基を導入することもできる。アルブミンに人為的にチオール基を導入する方法としては、特に限定されず、当該分野で公知の方法が挙げられる。例えば、チオール化試薬（２−イミノチオランまたはその塩など）を用いて、リジンのε−アミノ基にチオール基を導入する方法が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗癌剤の投与経路としては、特に限定されないが、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜、経口、吸入が挙げられ、好ましくは非経口投与経路、より好ましくは注射による投与経路である。
【００３０】
本発明の抗癌剤の剤形としては、特に限定されないが、例えば、注射剤、パッチ剤、パップ剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、クリーム剤、ローション剤、粉剤が挙げられる。
【００３１】
特に、注射剤とする場合には、ＳＮＯ−ＨＳＡを含有する溶液または懸濁液とすればよく、さらに、例えば、ｐＨ調整剤、電解質、糖類、ビタミン類、薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸および／またはアミノ酸などの当該分野で通常用いられる添加剤を適宜添加してもよい。
【００３２】
溶液または懸濁液とする場合には、例えば、日本薬局方で規定される水（注射用水）、生理食塩水、各種緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）などを用いることができる。
【００３３】
ｐＨ調節剤としては、一般に注射剤のｐＨ調節剤として用いられるものであればよい。例えば、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸などの有機酸、例えば、塩酸、リン酸などなどの無機酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの無機塩基が挙げられる。
【００３４】
電解質としては、従来より輸液に用いられている各種水溶性塩を用いることができる。例えば、生体の機能や体液の電解質バランスを維持するうえで必要とされる各種無機成分（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン）の水溶性塩（例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）が挙げられる。
【００３５】
糖類としては、従来より各種の輸液に用いられているものを用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトースなどの二糖類、グリセロールなどの多価アルコール、キシリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、デキストラン４０またはデキストラン８０などのデキストラン類、蔗糖が挙げられる。
【００３６】
ビタミン類としては、水溶性／脂溶性の各種ビタミンを用いることができる。例えば、ビタミンＡ、プロビタミンＡ、ビタミンＤ、プロビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６群、パントテン酸、ビオチン、ミオ−イノシトール、コリン、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＰまたはビタミンＵが挙げられる。
【００３７】
薬理学的に許容される塩もしくは脂肪酸としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属、ギ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、カプリル酸、コハク酸、リンゴ酸などの有機酸、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシククロヘキシルアミンなどの有機塩基が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンが挙げられる。また、Ｎ−アセチルメチオニンなどのアミノ酸誘導体を添加してもよい。
【００３９】
本発明の抗癌剤は、通常の製剤学的方法に従って製造することができる。すなわち、水、各種緩衝液、一般に市販されている輸液（例えば、総合アミノ酸輸液、電解質輸液）またはそれらと同様の成分を含む水溶液などに、ｐＨが４．５〜８．７程度となるように、ＳＮＯ−ＨＳＡを希釈および／または溶解することによって製造することができる。
【００４０】
本発明の抗癌剤に含有されるＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体の濃度は、通常１〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬである。
【００４１】
本発明の抗癌剤が適用される癌としては、特に限定されないが、例えば、悪性リンパ腫、肺癌、消化器癌、乳癌、膀胱腫瘍、骨肉腫、脳腫瘍、皮膚癌が挙げられる。
【００４２】
本発明の抗癌剤は、有効成分のＳ−ニトロソ基含有アルブミン２量体がヒトに対して通常５〜２００ｍｇ／ｋｇ・回、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量となるように投与される。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４４】
（調製例１：遺伝子組換えヒト血清アルブミン２量体および単量体の調製）
遺伝子組換えヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２量体（配列番号１：塩基配列；配列番号２：アミノ酸配列）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を非特許文献１に記載の方法により調製した。同様にして、ＨＳＡ単量体（配列番号３：塩基配列；配列番号４：アミノ酸配列）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。
【００４５】
（調製例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体および単量体の調製）
調製例１で得られたＨＳＡ２量体を含有する水溶液にＤＴＴを添加し（最終濃度３ｍＭ）、３７℃にて５分間インキュベートした。この水溶液をセファデックスＧ−２５（φ１．６×２．５ｃｍ；ＧＥヘルスケア社）のゲル濾過に供してＤＴＴを除去し、０．５ｍＭのＤＴＰＡ（Diethylenetriaminepentaacetic Acid：ジエチレントリアミン五酢酸；ナカライテスク株式会社）を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＨＳＡ２量体を溶出した。ＨＳＡ２量体の濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整し、この水溶液にＩＡＮ（Isoamyl nitrite：亜硝酸イソアミル；和光純薬工業株式会社）を添加し（最終濃度３ｍＭ）、遮光下３７℃にて１時間インキュベートした。この水溶液をセファデックスＧ−２５のゲル濾過に供し、０．５ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）でＳ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン（ＳＮＯ−ＨＳＡ）２量体を溶出した。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の濃度を調整し、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。同様にして、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。これらの水溶液は使用するまで−８０℃にて保存した。
【００４６】
（参考例：Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体の物理化学的特性の評価）
調製例１で得られたＨＳＡ２量体の分子量を評価するために、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８％）を行った。調製例１で得られたＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を図１Ａに示す。
【００４７】
図１Ａから明らかなように、ＨＳＡ２量体は、ＨＳＡ単量体の分子量６６．５ｋＤａの約２倍に相当する分子量１３０ｋＤａの１本のバンドを示した。これは、ＨＳＡ２量体が分子構造から予想される分子として均一に調製されたことを示す。
【００４８】
次いで、ＨＳＡ２量体の全電荷を評価するために、キャピラリーゾーン電気泳動を行った。ＨＳＡ単量体を比較に用いた。キャピラリーゾーン電気泳動の条件は次のとおりである。結果を図１Ｂに示す。
【００４９】
Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱシステム（ベックマン社製）
検出器：フォトダイオードアレイ検出器（２１４ｎｍ）
キャピラリー：６０ｃｍ（検出器まで５０ｃｍ）
注入圧：０．５ｐｓｉ（５分間）
電気泳動用緩衝液：リン酸ナトリウム系
【００５０】
図１Ｂから明らかなように、ＨＳＡ２量体はＨＳＡ単量体と同様の全電荷を示した。
【００５１】
次いで、ＨＳＡ２量体の立体構造を評価するために、円二色性分散計（日本分光株式会社製Ｊ−７２０型）を用いてＣＤスペクトル解析を行った。ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を図１ＣおよびＤに示す。
【００５２】
図１ＣおよびＤから明らかなように、ＨＳＡ２量体はＨＳＡ単量体と同様のＣＤスペクトルを示した。
【００５３】
次いで、調製例２で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ２量体が含有するＳ−ニトロソ基の数を評価するために、T. Akaikeら、「Mechanism of biological S-nitrosation and its measurement」、Free Radic Res、2000年、第33巻、p. 461-469に記載の方法に従い、ＨＰＬＣフローリアクターシステムを用いてＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基を定量した。調製例２で得られたＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
表１から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は１分子あたり平均１．４８分子のＳ−ニトロソ基を含有していた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の１分子あたり平均０．５２分子のＳ−ニトロソ基の２倍以上であり、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体と比較してＨＳＡ１分子あたり多くのＳ−ニトロソ基を含有することを示す。
【００５６】
次いで、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体が含有するＳ−ニトロソ基の安定性を評価するために、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ溶液を遮光下２５℃にて保持し、上記と同様にして経時的にＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基を定量した。ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を比較に用いた。結果を表１に示す。
【００５７】
表１から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体のＳ−ニトロソ基の半減期は約３９日であり、ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体のＳ−ニトロソ基の半減期の約２１日よりも長かった。
【００５８】
（実施例１：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体の薬物動態）
２官能性キレート剤としてＤＴＰＡ無水物を用い、放射性インジウム同位体（１１１Ｉｎ）の化合物として１１１ＩｎＣｌ３（日本メジフィジックス株式会社より提供を受けた）を用いて、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を１１１Ｉｎで標識した（１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の調製）。得られた１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を生理食塩水に溶解し、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する水溶液を調製した。
【００５９】
得られた１１１ＩｎＳＮＯ−ＨＳＡ２量体をＣ２６癌モデルマウス（特許文献１の実施例１に記載の方法により作製した）７２匹に１ｍｇ／ｋｇの投与量で経尾静脈投与し、投与後一定時間経過ごとに１匹ずつマウスを屠殺し、背部皮下より腫瘍組織を回収した。回収した腫瘍組織について、ウェル形ＮａＩシンチレーションカウンター（アロカ株式会社製ＡＲＣ−２０００）を用いて放射活性を計測した。投与後の経過時間と投与量に対する腫瘍組織への移行量の結果を図２に示す。
【００６０】
（比較例１：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などの薬物動態）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体またはＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、放射活性を計測した。結果を図２に示す。
【００６１】
図２から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は、ＨＳＡ単量体の２．９倍、ＨＳＡ２量体の１．６倍腫瘍組織に蓄積した。これは、ニトロソ化および２量体化することによって相乗的にＨＳＡが腫瘍組織に蓄積しやくなったことを示す。
【００６２】
（実施例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体の細胞毒性）
マウス結腸癌由来細胞株Ｃ２６（東北大学加齢医学研究所より提供を受けた）をＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の存在下で培養し、細胞死の際に細胞から培養上清に放出されるＬＤＨ（Lactate Dehydrogenase：乳酸脱水素酵素）の活性を定量することによりＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の細胞毒性を評価した。
【００６３】
Ｃ２６細胞を培地（ＲＰＭＩ−１６４０，１０％ＦＢＳ，１００単位／ｍＬペニシリン，１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に懸濁し、１×１０４細胞を９６穴プレートの各穴に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２１時間培養した。次いで、各穴の培養上清を新鮮な培地に交換し、各穴に種々の濃度でＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を添加し、さらに細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて２４時間培養した。ＬＤＨ−細胞毒性テストワコーキット（和光純薬工業株式会社２９９−５０６０１）を用いて各穴の培養上清のＬＤＨ活性を定量した（処理群）。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を添加しなかったこと以外は、同様にして培養上清のＬＤＨ活性を定量した（コントロール群）。細胞死の割合は、（Ｔ−Ｌ）／（Ｈ−Ｌ）×１００（％）（ここで、Ｔ：処理群の吸光度；Ｌ：コントロール群の吸光度；Ｈ：細胞をＴｒｉｔｏｎで溶解した場合の培養上清の吸光度（ＬＤＨ活性１００％）；吸光度は４９０ｎｍ（参照：６３０ｎｍ）にて測定）により求めた。結果を図３Ｂに示す。
【００６４】
（比較例２：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などの細胞毒性）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、ＨＳＡ２量体またはＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例２と同様にして、細胞毒性を評価した。結果を図３に示す。
【００６５】
図３Ａから明らかなように、Ｓ−ニトロソ基を含有しないＨＳＡ２単量体およびＨＳＡ単量体で処理した細胞は、２０ｍｇ／ｍＬの高濃度でも有意なＬＤＨ放出を示さなかった。また、図３Ｂから明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の１／３〜１／２のモル濃度で細胞を処理しても同等のＬＤＨ放出を示した。これは、１分子あたりの一酸化窒素（ＮＯ）の量が、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体では理論上ＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の２倍であるためと考えられ、ＨＳＡではなくＮＯが細胞毒性を有することを示す。
【００６６】
（実施例３：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体による一酸化窒素の腫瘍組織への送達）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（２０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬをＣ２６癌モデルマウス４０匹に経尾静脈投与し（１．３μｍｏｌＮＯ／ｋｇ）、６時間後にマウスを屠殺し、下大静脈より血液を回収し、肝臓および腎臓を回収し、背部皮下より腫瘍組織を回収した。回収した血液を遠心分離し、上清の血漿１００μＬをＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量に用いた。肝臓、腎臓および腫瘍組織は、ＢｉｏＭａｓｈａｅｒ（登録商標）を用いてホモジナイズし、１０ｍｇをＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量に用いた。ＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度の定量にはＧｒｉｅｓｓ法に基づく酸化窒素分析システム（株式会社エイコム製ＥＮＯ−２０）を用いた。結果を図４に示す。
【００６７】
（比較例３：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体などによる一酸化窒素の腫瘍組織への送達）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体、または従来のＮＯ供与体であるＧＳＮＯ（S-Nitrosoglutathione：Ｓ−ニトロソグルタチオン；株式会社同仁化学研究所Ｎ４１５）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、ＮＯＸ（ＮＯ２−＋ＮＯ３−）濃度を定量した。結果を図４に示す。
【００６８】
図４から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の静脈投与によりＮＯＸレベルは腫瘍組織では顕著に上昇したが、肝臓および腎臓では上昇しなかった。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体およびＧＳＮＯと比較して腫瘍組織のＮＯＸレベルを大きく上昇させた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体は、ＮＯを腫瘍に送達する上で、従来のＮＯ供与体であるＧＳＮＯやＳＮＯ−ＨＳＡ単量体よりも効率的であることを示す。
【００６９】
（実施例４：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン２量体のＥＰＲ効果）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体がＮＯを腫瘍組織へ送達することにより、ＮＯがＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention effect）効果を促進するかどうかを評価するために、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体を投与した腫瘍組織でのエバンスブルーの取り込みを定量した。
【００７０】
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体（２０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬをＣ２６癌モデルマウス２４匹に経尾静脈投与し（１．３μｍｏｌＮＯ／ｋｇ）、６時間後にエバンスブルー（東京化成工業株式会社Ｅ０１９７）を静脈投与し（１０ｍｇ／ｋｇ）、２４時間後にマウスを屠殺し、背部皮下より１００〜２００ｍｇおよび２００〜５００ｍｇの固形腫瘍を回収した。回収した固形腫瘍をホルムアルデヒドに浸漬し、腫瘍から滲出したエバンスブルーを紫外吸収（６２０ｎｍ）の測定により定量した。Ｔ／Ｂ比（tissue/blood ratio：血中の値に対する組織中の値の比）の結果を図５に示す。
【００７１】
（比較例４：Ｓ−ニトロソ基含有ヒト血清アルブミン単量体のＥＰＲ効果）
ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体の代わりにＳＮＯ−ＨＳＡ単量体を用いたこと以外は、実施例４と同様にして、エバンスブルーを定量した。結果を図５に示す。
【００７２】
図５から明らかなように、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体およびＳＮＯ−ＨＳＡ単量体の静脈投与によりエバンスブルーの取り込みは腫瘍組織では上昇したが、筋肉では上昇しなかった。ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体はＳＮＯ−ＨＳＡ単量体と比較してエバンスブルーの取り込みを大きく上昇させた。これは、ＳＮＯ−ＨＳＡ２量体がＳＮＯ−ＨＳＡ単量体よりも顕著にＥＰＲ効果を促進するためであり、おそらくＳＮＯ−ＨＳＡ２量体によるＮＯの腫瘍組織への送達の上昇のためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、安全性および安定性に優れ、低濃度で抗癌作用を有する抗癌剤を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記アルブミン２量体が、遺伝子組換え法により製造される、請求項１または２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
前記アルブミン２量体をコードする遺伝子が、配列番号１の塩基配列で示される、請求項１から３のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【請求項５】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される、請求項１から４のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【請求項６】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が、ヒトに対して５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される、請求項１から５のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【請求項１】
Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記アルブミン２量体が、遺伝子組換え法により製造される、請求項１または２に記載の抗癌剤。
【請求項４】
前記アルブミン２量体をコードする遺伝子が、配列番号１の塩基配列で示される、請求項１から３のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【請求項５】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が、５〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有される、請求項１から４のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【請求項６】
前記Ｓ−ニトロソ基含有アルブミン２量体が、ヒトに対して５０〜１００ｍｇ／ｋｇ・回の量で投与される、請求項１から５のいずれかの項に記載の抗癌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−６７５９１（Ｐ２０１３−６７５９１Ａ）
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０８０８５（Ｐ２０１１−２０８０８５）
【出願日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１８日（２０１３．４．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【出願人】（０００１３５０３６）ニプロ株式会社 (583)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]