抗老化剤及び老化防止用皮膚外用剤
【課題】優れた線維芽細胞増殖促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有する物質を見出し、それを有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤を提供する。
【解決手段】線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の有効成分として、ダビジゲニンを含有させる。また、老化防止用皮膚外用剤に、ダビジゲニンを配合する。
【解決手段】線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の有効成分として、ダビジゲニンを含有させる。また、老化防止用皮膚外用剤に、ダビジゲニンを配合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては線維芽細胞の増殖は活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖が遅くなり皮膚の保湿機能や弾力性が低下する。そして、皮膚は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚の老化を予防又は改善することができると考えられる。
【０００４】
また、線維芽細胞は、外傷や火傷等の創傷の治癒過程において重要な役割を果たしているほか、皮膚疾患（例えば，褥瘡，熱傷潰瘍，糖尿病性潰瘍等の皮膚潰瘍）の治癒過程にも重要である。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより創傷や皮膚疾患を治療することができると考えられる。さらに、再生医療の分野において、自己治癒が困難な創傷（重度の熱傷等）を負った患者の治療法として、患者自身の皮膚断片から皮膚細胞を培養・増殖させ、これを患者に移植する方法が知られているが、細胞増殖促進剤の使用により皮膚細胞の培養期間短縮が期待される。
【０００５】
従来、線維芽細胞増殖促進作用を有するものとして、クスノハガシワ抽出物（特許文献１参照）等が提案されている。
【０００６】
また、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチンが分解・変質し、また、コラーゲンの産生量が減少するとともに架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が生じるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン、エラスチン等の真皮マトリックス成分の減少・変性等が関与している。
【０００７】
近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１の活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。
【０００８】
また、ＭＭＰ−１の活性が亢進すると、細胞外マトリックスが破壊される。細胞外マトリックスの破壊は、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等、様々な疾患と関連することが知られている。そのため、ＭＭＰ−１の活性を阻害することにより、細胞外マトリックスの破壊と関連する疾患等を治療・予防することができると考えられる。
【０００９】
このようなＭＭＰ−１活性阻害作用を有するものとしては、例えば、ヒマラヤザクラからの抽出物（特許文献２参照）、ショウガ科ジンギバーカッサムナー又はクワ科フィカスネリフォリアからの抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【００１０】
また、上述の細胞外マトリックス成分のうち、エラスチンは、皮膚組織に弾力性を与える線維であり、加齢等に伴ってエラスチンが分解されると皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。エラスチンを分解する酵素であるエラスターゼは、紫外線の照射により活性化され、これによりエラスチンの分解が加速する。そのため、エラスターゼの活性を阻害することによりエラスチンの分解が抑制され、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善できると考えられる。
【００１１】
また、喫煙等によって生体内でのエラスターゼの活性が亢進することが知られている。そして、肺の基質は、コラーゲンとエラスチンとから構成されているため、喫煙等によってエラスターゼの活性が亢進すると、肺胞壁を破壊して肺気腫等を招くおそれがあると考えられる。さらに、エラスターゼの活性の亢進により肺毛細血管が破壊され、肺水腫等の急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を招くおそれがあると考えられる。そのため、生体内でのエラスターゼの活性を阻害することができれば、肺気腫、肺水腫等の呼吸器系疾患を予防・治療することができるものと考えられる。
【００１２】
従来、エラスターゼ活性阻害作用を有するものとして、例えば、スターフルーツ果実抽出物等が知られている（特許文献４参照）。
【００１３】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【００１４】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。
【００１５】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
【００１６】
このようなプロフィラグリン産生促進剤又はフィラグリン産生促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１７】
しかしながら、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有し、安価である線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤に対する消費者の要望は強く、さらなる新しい線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の開発及び提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００３−１４６８３７号公報
【特許文献２】特開２００３−１７６２３２号公報
【特許文献３】特開２００３−１７６２３０号公報
【特許文献４】特開２００３−３００８９３号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】「Arch. Dermatol. Res.」，1996，Vol.288，p.442-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有する化合物を見出し、それを有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤若しくは抗老化剤、又は当該化合物を配合した老化防止用皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする。また、本発明の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンを配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、線維芽細胞増殖促進作用に優れた線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害作用に優れたＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害作用に優れたエラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進作用に優れたプロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進作用に優れたフィラグリン産生促進剤、及び抗老化作用に優れた抗老化剤を提供することができる。また、本発明によれば、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用に優れた老化防止用皮膚外用剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、下記式で表されるダビジゲニンを有効成分として含有するものである。また、本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンが配合されるものである。
【００２４】
【化１】
【００２５】
ダビジゲニンは、合成により製造することもできるし、ダビジゲニンを含有する植物の抽出物から単離・精製することにより製造することもできる。さらに、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン（イソリクイリチゲニン）を含有する植物の抽出物を還元処理し、当該抽出物に含まれる２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンをダビジゲニンに還元した後、単離・精製することにより製造することも可能である。
【００２６】
ダビジゲニンを合成により製造する場合、公知の方法により合成することができる。例えば、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドと２，４−ジヒドロキシアセトフェノンとを塩基の存在化でアルドール縮合させ、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを得る。得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンにさらに水素を添加することによりダビジゲニンを得ることができる。
【００２７】
アルドール縮合反応において使用し得る溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；ｎ−ヘキサン、ベンゼン等の炭化水素系有機溶媒；ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらを１種又は２種以上の混合溶媒として使用することができる。また、アルドール縮合において触媒として使用し得る塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等が挙げられる。これらの塩基は、適宜溶媒に溶解して加えても良い。アルドール縮合における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。反応後、再結晶などの一般的な精製手法により、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを得ることができる。
【００２８】
このようにして得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンに水素を添加する方法としては、接触還元を用いることができる。接触還元において使用する溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジオキサン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上の混合溶媒として使用することができる。接触還元において使用し得る触媒としては、パラジウム、パラジウムカーボン、白金、酸化白金などが挙げられる。接触還元における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。反応後、再結晶などの一般的な精製手法により、ダビジゲニンを得ることができる。
【００２９】
なお、上記の方法において、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドと２，４−ジヒドロキシアセトフェノンとに代えて、これらの化合物に存在する１又は２以上のヒドロキシル基を保護基によりあらかじめ保護した化合物を用いてアルドール縮合を行い、得られた縮合物を還元する前又は還元した後に脱保護を行うことにより、ダビジゲニンを得ることとしても良い。
【００３０】
また、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物の抽出物を還元処理し、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンをダビジゲニンに還元した後、単離・精製することにより製造する場合、以下の方法により製造することができる。この方法により、後述する好ましい生理作用を有するダビジゲニンを、天然物から安価にかつ大量に製造することが可能となる。
【００３１】
２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物としては、例えば、甘草（Glychyrrhiza属）の植物が挙げられる。２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。例えば、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００３２】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出溶媒に抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができ、得られた抽出液から溶媒を留去すると濃縮物が、さらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００３３】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物に還元処理を行う方法としては、接触還元を用いることができる。接触還元において使用する溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジオキサン等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。接触還元において使用し得る触媒としては、パラジウム、パラジウムカーボン、白金、酸化白金などが挙げられ、中でもパラジウムカーボンが好ましい。また、接触還元における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。
【００３４】
以上のようにして還元処理を行った抽出物は、そのままダビジゲニンの単離・精製を行えば良い。なお、還元処理の前後に、酸又は塩基等を用いた加水分解処理を行うことで、ダビジゲニンの収量を高めてもよい。ダビジゲニンを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を、多孔質物質や多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付すことにより、ダビジゲニンを含有する画分として得ることができる。さらに、得られた画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００３５】
［線維芽細胞増殖促進剤，ＭＭＰ−１活性阻害剤，エラスターゼ活性阻害剤，プロフィラグリン産生促進剤，フィラグリン産生促進剤，抗老化剤］
以上のようにして得られるダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用を有しているため、線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及び抗老化剤の有効成分として用いることができる。
【００３６】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、ダビジゲニンのみからなるものでもよいし、ダビジゲニンを製剤化したものでもよい。
【００３７】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、他の組成物（例えば，皮膚外用剤，美容用飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３８】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤を製剤化した場合、ダビジゲニンの含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３９】
なお、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、必要に応じて、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有する他の天然抽出物等を、ダビジゲニンとともに配合して有効成分として用いることができる。
【００４０】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００４１】
また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００４２】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、有効成分であるダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、皮膚のシワ形成、弾力性の低下等の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、創傷治療や皮膚疾患の治療、さらには再生医療分野への応用等の用途にも使用することができる。ただし、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４３】
本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、有効成分であるダビジゲニンが有するＭＭＰ−１活性阻害作用を通じて、コラーゲンの減少・変性を抑制し、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、細胞外マトリックスの破壊が病態と関連していることが知られている疾患等の治療・予防の用途にも使用することが可能である。このような疾患として、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等が挙げられる。ただし、本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、これらの用途以外にも、ＭＭＰ−１活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４４】
本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、有効成分であるダビジゲニンが有するエラスターゼ活性阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の張りの消失、弾力性の低下等の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、エラスターゼの活性亢進に起因する疾患の予防・治療用医薬品又は医薬部外品の有効成分として用いることができる。このような疾患としては、例えば、肺気腫、肺水腫等の呼吸器疾患等が挙げられる。ただし、本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ活性阻害作用を発揮することに意義あるすべての用途に用いることができる。
【００４５】
本実施形態のプロフィラグリン産生促進剤は、ダビジゲニンが有するプロフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのプロフィラグリンの産生を促進し、プロフィラグリンの加水分解により得られるフィラグリン量を増加させ、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態のプロフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４６】
本実施形態のフィラグリン産生促進剤は、ダビジゲニンが有するフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのフィラグリンの産生を促進し、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４７】
本実施形態の抗老化剤は、ダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、皮膚のシワの形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、ダビジゲニンが有する抗老化作用は、上記作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。
【００４８】
また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有するため、例えば、老化防止用皮膚外用剤又は美容用飲食品に配合するのに好適である。ここで、老化防止用皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。また、美容用飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００４９】
さらに、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有するので、線維芽細胞や細胞外マトリックス等に関連する疾患の研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【００５０】
［老化防止用皮膚外用剤］
ダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用を有しているため、老化防止用皮膚外用剤に配合するのに好適である。
【００５１】
この場合において、老化防止用皮膚外用剤には、ダビジゲニンをそのまま配合してもよいし、ダビジゲニンから製剤化した線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤を配合してもよい。
【００５２】
ダビジゲニン、又は当該ダビジゲニンから製剤化した線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤若しくは抗老化剤を配合することにより、老化防止用皮膚外用剤に線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を付与することができる。
【００５３】
ダビジゲニンを配合し得る老化防止用皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【００５４】
ダビジゲニンを老化防止用皮膚外用剤に配合する場合、その配合量は、老化防止用皮膚外用剤の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．００１〜１質量％である。
【００５５】
本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を妨げない限り、通常の老化防止用皮膚外用剤の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された上記成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００５６】
本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、皮膚のシワ形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の老化症状；創傷、皮膚疾患等の線維芽細胞の増殖に関連するする各種疾患；肺気腫、肺水腫等の呼吸器疾患等のエラスターゼの活性亢進に起因する各種疾患；癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等の細胞外マトリックスの破壊に起因する各種疾患等を予防、治療又は改善することができる。
【００５７】
なお、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ、ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００５９】
〔製造例１〕ダビジゲニンの製造−１
甘草の一種であるグリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の根茎部を粉砕し、チップ状にした。この甘草チップ１．０ｋｇをフラスコに取り、１０Ｌの５０容量％エタノール水溶液を加え、８０℃で２時間抽出した後、ろ過した。得られたろ液を４０℃以下の温度で減圧下濃縮した後、４０℃で減圧乾燥を行い、黄褐色粉末である甘草根茎部５０％エタノール抽出物（１５０ｇ）を得た。
【００６０】
このようにして得られた甘草根茎部５０％エタノール抽出物１０ｇに水２５ｍＬを加えて懸濁させ、次いでエタノール２５ｍＬおよび５質量％パラジウムカーボンを加えて撹拌し、室温にて懸濁液中に水素ガスを１６時間吹き込んだ。次いで、ろ過により触媒を除去し、ろ液として甘草抽出物の還元処理物（１０ｇ）を得た。
【００６１】
このようにして得られた甘草抽出物の還元処理物１０ｇに９５質量％硫酸５．０ｍＬを加え、８０℃で２時間反応させた。得られた反応液を多孔性樹脂（三菱化学社製，Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０，５００ｍＬ）上に付し、水２Ｌ、エタノール２Ｌの順で溶出させた。エタノール２Ｌで溶出させた画分からエタノールを留去し、エタノール溶出画分２．５ｇを得た。このエタノール溶出画分２．５ｇをメタノール：水＝６０：４０（容量比）の混合液に溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学社製，クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ）を充填したガラス製のカラム上部より流入して、ＯＤＳに吸着させた。移動相としてメタノール：水＝６０：４０（容量比）を流し、その溶出液を集め、溶媒を留去し、ダビジゲニン濃縮液３００ｍｇを得た。得られたダビジゲニン濃縮液を、下記の条件で液体クロマトグラフィーを用いて分画した。
【００６２】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００６３】
ここで、保持時間４０分〜５０分に溶出する画分をリサイクルＨＰＬＣにより精製を行い、精製物を得た（２２０ｍｇ）。得られた精製物について、１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を以下に示す。
【００６４】
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）＞
２０５．６（Ｃ＝Ｏ），１６６．４（４’−Ｃ），１６６．３（２’−Ｃ），１５６．７（４−Ｃ），１３３．７（６’−Ｃ），１３３．２（１−Ｃ），１３０．４（２，５−Ｃ），１１６．２（３，５−Ｃ），１１４．１（１’−Ｃ），１０９．１（５’−Ｃ），１０３．７（３’−Ｃ），４０．９（α−Ｃ），３１．０（β−Ｃ）
【００６５】
以上の結果から、甘草抽出物の還元処理物を多孔性樹脂により分画し、ＯＤＳにより分離し、さらに液体クロマトグラフィーにより精製して得られた精製物が、下記式で表されるダビジゲニン（試料１）であることが確認された。
【００６６】
【化２】
【００６７】
〔製造例２〕ダビジゲニンの製造−２
４８％質量水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬにイオン交換水１０ｍＬを加えて希釈した。これを６０℃に加熱し、撹拌しながらｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１．２ｇを加えて溶解し、次いで２’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン１．５ｇを加えて溶解した。この反応液を６０℃に加熱したまま２４時間撹拌し、さらに加熱を止めて室温で４８時間撹拌した。得られた反応液を氷浴上で冷却しながら、水８０ｍＬを用いて希釈した後、あらかじめ調製した１０％硫酸水溶液４０ｍＬを加えて黄色結晶を析出させた。この懸濁液からろ紙を用いたろ過によって沈殿部をろ取した。ろ取した沈殿を４０℃にて減圧乾燥し、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン５００ｍｇを黄色結晶として得た。
【００６８】
上記の反応を繰り返すことで得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン１０ｇを、密封可能な反応容器内でエタノール５０ｍＬに溶解し、５質量％パラジウムカーボン１．０ｇを加えた。この懸濁液を激しく撹拌しながら、容器内を減圧しては水素ガスを吹き込む操作を数回繰り返し、容器内を水素ガスで充満させた。反応液を４時間激しく撹拌した後に、ろ過によって触媒を除去した。得られたろ液に水１００ｍＬを加えた。析出した白色結晶をろ紙ろ過によってろ取し、これを４０℃にて減圧乾燥することで白色結晶を得た（９．５ｇ）。
【００６９】
得られた白色結晶を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析したところ、試料１の結果と一致し、得られた白色結晶がダビジゲニンであることが確認された。
【００７０】
〔試験例１〕皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
【００７１】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７２】
培養終了後、５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。
【００７３】
培養終了後、各ウェルから１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ緩衝液に溶解したＭＴＴを各ウェルに２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後に、１０％ＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、下記の式により線維芽細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７４】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
式中、Ｓｔは「試料を添加した細胞での吸光度」を表し、Ｓｂは「試料を添加した空試験の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料を添加しない細胞での吸光度」を表し、Ｃｂは「試料を添加しない空試験の吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１に示すように、ダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７７】
〔試験例２〕ＭＭＰ−１活性阻害作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−１活性阻害作用を試験した。
【００７８】
蓋付試験管にて２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表２を参照）５０μＬ、ＭＭＰ−１溶液（Sigma社製，COLLAGENASE Type IV from Clostridium histolyticum）５０μＬ、及びＰｚペプチド溶液（BACHEM Feinchemikalien AG社製，Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ）４００μＬを混合し、３７℃にて３０分反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止した。
【００７９】
その後、酢酸エチル５ｍＬを加え、激しく振とうした。これを遠心（１６００×ｇ，１０分）し、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様にして空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−１活性阻害率（％）を算出するとともに、ＭＭＰ−１の活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
【００８０】
ＭＭＰ−１活性阻害率(％)={１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは、「試料添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
表２に示すように、ダビジゲニンは、優れたＭＭＰ−１活性阻害作用を有することが確認された。また、ＭＭＰ−１活性阻害作用の程度は、ダビジゲニンの濃度によって調節できることが確認された。
【００８３】
〔試験例３〕エラスターゼ活性阻害作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
【００８４】
０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表３を参照）５０μＬと、エラスターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）５０μＬとを９６ウェルプレートにて混合した。その後、０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に０．４５１４ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した基質溶液（SIGMA社製，Ｎ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド）１００μＬを添加し、２５℃にて１５分間反応させた。反応終了後、分光光度計（BIO-TEK INSTRUMENTS, INC社製）を用いて波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様にして空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりエラスターゼ活性阻害率（％）を算出した。
【００８５】
エラスターゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ａ−Ｂ)／(Ｃ−Ｄ)}×１００
式中、Ａは「試料添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料無添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３に示すように、ダビジゲニンは、優れたエラスターゼ活性阻害作用を有することが確認された。
【００８８】
〔試験例４〕プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用を試験した。
【００８９】
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で３日間培養した。培養後、培地を０．２５％ＤＭＳＯに溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を含むＫＧＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパク質の調製を行った。
【００９０】
１０μｇ／列に調整したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ緩衝液でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Amersham Biosciences社製，Whole Ab）及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ緩衝液で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Western blotting detection reagents（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを画像撮影装置（Bio-Rad Laboratories社製，ChemiDoc XRS Plus）を用いて検出した。検出したバンドをImage Lab Software version2.0（Bio-Rad Laboratories社製）にて定量的に測定した。
【００９１】
結果は、試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク質１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのNet intensity（バンド強度）を合算した値を用いて、試料のプロフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。
【００９２】
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時のNet intensity（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を表し、Ｂは「試料無添加時（コントロール）のNet intensity」を表す。
結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
表４に示すように、ダビジゲニンは、１０μｇ／ｍＬにおいて優れたプロフィラグリン産生促進作用を有することが確認された。なお、フィラグリンは、生体内でプロフィラグリンの加水分解により産生されるものであることから、プロフィラグリン産生促進作用を有するダビジゲニンは、プロフィラグリンの産生を促進し、細胞内におけるプロフィラグリン量を増加させることで、フィラグリン量をも増加させることができ、結果としてフィラグリン産生促進作用を有するものと考えられる。
【００９５】
〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００９６】
〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００９７】
〔配合例３〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤は、皮膚の老化の予防又は改善に大きく貢献できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては線維芽細胞の増殖は活発であり、線維芽細胞、コラーゲン等の皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、線維芽細胞の増殖が遅くなり皮膚の保湿機能や弾力性が低下する。そして、皮膚は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚の老化を予防又は改善することができると考えられる。
【０００４】
また、線維芽細胞は、外傷や火傷等の創傷の治癒過程において重要な役割を果たしているほか、皮膚疾患（例えば，褥瘡，熱傷潰瘍，糖尿病性潰瘍等の皮膚潰瘍）の治癒過程にも重要である。そのため、線維芽細胞の増殖を促進することにより創傷や皮膚疾患を治療することができると考えられる。さらに、再生医療の分野において、自己治癒が困難な創傷（重度の熱傷等）を負った患者の治療法として、患者自身の皮膚断片から皮膚細胞を培養・増殖させ、これを患者に移植する方法が知られているが、細胞増殖促進剤の使用により皮膚細胞の培養期間短縮が期待される。
【０００５】
従来、線維芽細胞増殖促進作用を有するものとして、クスノハガシワ抽出物（特許文献１参照）等が提案されている。
【０００６】
また、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるエラスチンが分解・変質し、また、コラーゲンの産生量が減少するとともに架橋による弾力性低下を引き起こす。その結果、皮膚の保湿機能や弾力性が低下し、角質の異常剥離が生じるため、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン、エラスチン等の真皮マトリックス成分の減少・変性等が関与している。
【０００７】
近年、皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰｓ；Matrix metalloproteinases）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１の活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。
【０００８】
また、ＭＭＰ−１の活性が亢進すると、細胞外マトリックスが破壊される。細胞外マトリックスの破壊は、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等、様々な疾患と関連することが知られている。そのため、ＭＭＰ−１の活性を阻害することにより、細胞外マトリックスの破壊と関連する疾患等を治療・予防することができると考えられる。
【０００９】
このようなＭＭＰ−１活性阻害作用を有するものとしては、例えば、ヒマラヤザクラからの抽出物（特許文献２参照）、ショウガ科ジンギバーカッサムナー又はクワ科フィカスネリフォリアからの抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【００１０】
また、上述の細胞外マトリックス成分のうち、エラスチンは、皮膚組織に弾力性を与える線維であり、加齢等に伴ってエラスチンが分解されると皮膚の張りが失われるとともに、弾力性が低下する。エラスチンを分解する酵素であるエラスターゼは、紫外線の照射により活性化され、これによりエラスチンの分解が加速する。そのため、エラスターゼの活性を阻害することによりエラスチンの分解が抑制され、張りの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防・改善できると考えられる。
【００１１】
また、喫煙等によって生体内でのエラスターゼの活性が亢進することが知られている。そして、肺の基質は、コラーゲンとエラスチンとから構成されているため、喫煙等によってエラスターゼの活性が亢進すると、肺胞壁を破壊して肺気腫等を招くおそれがあると考えられる。さらに、エラスターゼの活性の亢進により肺毛細血管が破壊され、肺水腫等の急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を招くおそれがあると考えられる。そのため、生体内でのエラスターゼの活性を阻害することができれば、肺気腫、肺水腫等の呼吸器系疾患を予防・治療することができるものと考えられる。
【００１２】
従来、エラスターゼ活性阻害作用を有するものとして、例えば、スターフルーツ果実抽出物等が知られている（特許文献４参照）。
【００１３】
天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒に由来するフィラグリンが角質層内で分解されて産生される。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮ケラチノサイトでプロフィラグリンとして発現する。その後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、脱リン酸，加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、ケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献１参照）。
【００１４】
近年、このフィラグリンが、皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥等の条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが知られている（非特許文献２参照）。
【００１５】
したがって、表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンｍＲＮＡの発現促進を通じて、フィラグリンの産生を促進し、それにより角質層内のアミノ酸量を増大させることで、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
【００１６】
このようなプロフィラグリン産生促進剤又はフィラグリン産生促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物（特許文献５参照）、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン（特許文献６参照）、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス（特許文献７参照）等が知られている。
【００１７】
しかしながら、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有し、安価である線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤に対する消費者の要望は強く、さらなる新しい線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の開発及び提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００３−１４６８３７号公報
【特許文献２】特開２００３−１７６２３２号公報
【特許文献３】特開２００３−１７６２３０号公報
【特許文献４】特開２００３−３００８９３号公報
【特許文献５】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献６】特開２００３−１４６８８６号公報
【特許文献７】特開２００１−２６１５６８号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】「フレグランスジャーナル臨時増刊」，2000年，Vol.17，p.14-19
【非特許文献２】「Arch. Dermatol. Res.」，1996，Vol.288，p.442-446
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有する化合物を見出し、それを有効成分とする線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤若しくは抗老化剤、又は当該化合物を配合した老化防止用皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする。また、本発明の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンを配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、線維芽細胞増殖促進作用に優れた線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害作用に優れたＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害作用に優れたエラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進作用に優れたプロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進作用に優れたフィラグリン産生促進剤、及び抗老化作用に優れた抗老化剤を提供することができる。また、本発明によれば、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用に優れた老化防止用皮膚外用剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、下記式で表されるダビジゲニンを有効成分として含有するものである。また、本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンが配合されるものである。
【００２４】
【化１】
【００２５】
ダビジゲニンは、合成により製造することもできるし、ダビジゲニンを含有する植物の抽出物から単離・精製することにより製造することもできる。さらに、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン（イソリクイリチゲニン）を含有する植物の抽出物を還元処理し、当該抽出物に含まれる２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンをダビジゲニンに還元した後、単離・精製することにより製造することも可能である。
【００２６】
ダビジゲニンを合成により製造する場合、公知の方法により合成することができる。例えば、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドと２，４−ジヒドロキシアセトフェノンとを塩基の存在化でアルドール縮合させ、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを得る。得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンにさらに水素を添加することによりダビジゲニンを得ることができる。
【００２７】
アルドール縮合反応において使用し得る溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；ｎ−ヘキサン、ベンゼン等の炭化水素系有機溶媒；ジメチルスルホキシド等が挙げられ、これらを１種又は２種以上の混合溶媒として使用することができる。また、アルドール縮合において触媒として使用し得る塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等が挙げられる。これらの塩基は、適宜溶媒に溶解して加えても良い。アルドール縮合における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。反応後、再結晶などの一般的な精製手法により、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを得ることができる。
【００２８】
このようにして得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンに水素を添加する方法としては、接触還元を用いることができる。接触還元において使用する溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジオキサン等が挙げられ、これらを１種又は２種以上の混合溶媒として使用することができる。接触還元において使用し得る触媒としては、パラジウム、パラジウムカーボン、白金、酸化白金などが挙げられる。接触還元における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。反応後、再結晶などの一般的な精製手法により、ダビジゲニンを得ることができる。
【００２９】
なお、上記の方法において、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドと２，４−ジヒドロキシアセトフェノンとに代えて、これらの化合物に存在する１又は２以上のヒドロキシル基を保護基によりあらかじめ保護した化合物を用いてアルドール縮合を行い、得られた縮合物を還元する前又は還元した後に脱保護を行うことにより、ダビジゲニンを得ることとしても良い。
【００３０】
また、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物の抽出物を還元処理し、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンをダビジゲニンに還元した後、単離・精製することにより製造する場合、以下の方法により製造することができる。この方法により、後述する好ましい生理作用を有するダビジゲニンを、天然物から安価にかつ大量に製造することが可能となる。
【００３１】
２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物としては、例えば、甘草（Glychyrrhiza属）の植物が挙げられる。２’，４，４’−トリヒドロキシカルコンを含有する植物抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法によって得ることができる。例えば、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより得ることができる。抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。
【００３２】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出溶媒に抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができ、得られた抽出液から溶媒を留去すると濃縮物が、さらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００３３】
以上のようにして得られた抽出液、当該抽出液の濃縮物又は当該抽出液の乾燥物に還元処理を行う方法としては、接触還元を用いることができる。接触還元において使用する溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジオキサン等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。接触還元において使用し得る触媒としては、パラジウム、パラジウムカーボン、白金、酸化白金などが挙げられ、中でもパラジウムカーボンが好ましい。また、接触還元における反応温度は−１０〜８０℃であることが好ましい。
【００３４】
以上のようにして還元処理を行った抽出物は、そのままダビジゲニンの単離・精製を行えば良い。なお、還元処理の前後に、酸又は塩基等を用いた加水分解処理を行うことで、ダビジゲニンの収量を高めてもよい。ダビジゲニンを単離・精製する方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、抽出物を、多孔質物質や多孔性樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーに付すことにより、ダビジゲニンを含有する画分として得ることができる。さらに、得られた画分を、ＯＤＳを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィー、再結晶、液−液向流抽出、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等の任意の有機化合物精製手段を用いて精製してもよい。
【００３５】
［線維芽細胞増殖促進剤，ＭＭＰ−１活性阻害剤，エラスターゼ活性阻害剤，プロフィラグリン産生促進剤，フィラグリン産生促進剤，抗老化剤］
以上のようにして得られるダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用を有しているため、線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤及び抗老化剤の有効成分として用いることができる。
【００３６】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、ダビジゲニンのみからなるものでもよいし、ダビジゲニンを製剤化したものでもよい。
【００３７】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味・矯臭剤等を用いることができる。線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、他の組成物（例えば，皮膚外用剤，美容用飲食品等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。
【００３８】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤を製剤化した場合、ダビジゲニンの含有量は、特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定することができる。
【００３９】
なお、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、必要に応じて、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有する他の天然抽出物等を、ダビジゲニンとともに配合して有効成分として用いることができる。
【００４０】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の患者に対する投与方法としては、経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。
【００４１】
また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。
【００４２】
本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、有効成分であるダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用を通じて、皮膚のシワ形成、弾力性の低下等の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、創傷治療や皮膚疾患の治療、さらには再生医療分野への応用等の用途にも使用することができる。ただし、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤は、これらの用途以外にも、線維芽細胞増殖促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４３】
本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、有効成分であるダビジゲニンが有するＭＭＰ−１活性阻害作用を通じて、コラーゲンの減少・変性を抑制し、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、細胞外マトリックスの破壊が病態と関連していることが知られている疾患等の治療・予防の用途にも使用することが可能である。このような疾患として、癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等が挙げられる。ただし、本実施形態のＭＭＰ−１活性阻害剤は、これらの用途以外にも、ＭＭＰ−１活性阻害作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４４】
本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、有効成分であるダビジゲニンが有するエラスターゼ活性阻害作用を通じて、エラスチンの分解を抑制し、皮膚の張りの消失、弾力性の低下等の老化症状を予防、治療又は改善することができる。また、本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、エラスターゼの活性亢進に起因する疾患の予防・治療用医薬品又は医薬部外品の有効成分として用いることができる。このような疾患としては、例えば、肺気腫、肺水腫等の呼吸器疾患等が挙げられる。ただし、本実施形態のエラスターゼ活性阻害剤は、これらの用途以外にも、エラスターゼ活性阻害作用を発揮することに意義あるすべての用途に用いることができる。
【００４５】
本実施形態のプロフィラグリン産生促進剤は、ダビジゲニンが有するプロフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのプロフィラグリンの産生を促進し、プロフィラグリンの加水分解により得られるフィラグリン量を増加させ、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態のプロフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもプロフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４６】
本実施形態のフィラグリン産生促進剤は、ダビジゲニンが有するフィラグリン産生促進作用を通じて、細胞内でのフィラグリンの産生を促進し、皮膚の保湿能力を改善することができ、これにより、皮膚の弾力性を維持し、皮膚の老化、肌荒れ等を予防、治療又は改善することができる。ただし、本実施形態のフィラグリン産生促進剤は、これらの用途以外にもフィラグリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００４７】
本実施形態の抗老化剤は、ダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用及びフィラグリン産生促進作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、皮膚のシワの形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の皮膚の老化症状を予防、治療又は改善することができる。ただし、ダビジゲニンが有する抗老化作用は、上記作用に基づいて発揮される抗老化作用に限定されるものではない。
【００４８】
また、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有するため、例えば、老化防止用皮膚外用剤又は美容用飲食品に配合するのに好適である。ここで、老化防止用皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、経皮的に使用される皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。また、美容用飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものである。
【００４９】
さらに、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を有するので、線維芽細胞や細胞外マトリックス等に関連する疾患の研究のための試薬としても好適に利用することができる。
【００５０】
［老化防止用皮膚外用剤］
ダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用を有しているため、老化防止用皮膚外用剤に配合するのに好適である。
【００５１】
この場合において、老化防止用皮膚外用剤には、ダビジゲニンをそのまま配合してもよいし、ダビジゲニンから製剤化した線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤又は抗老化剤を配合してもよい。
【００５２】
ダビジゲニン、又は当該ダビジゲニンから製剤化した線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤若しくは抗老化剤を配合することにより、老化防止用皮膚外用剤に線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を付与することができる。
【００５３】
ダビジゲニンを配合し得る老化防止用皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品等を幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプー等が挙げられる。
【００５４】
ダビジゲニンを老化防止用皮膚外用剤に配合する場合、その配合量は、老化防止用皮膚外用剤の種類に応じて適宜調整することができるが、好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．０００１〜１０質量％であり、特に好適な配合率は、標準的な抽出物に換算して約０．００１〜１質量％である。
【００５５】
本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、ダビジゲニンが有する線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用又は抗老化作用を妨げない限り、通常の老化防止用皮膚外用剤の製造に用いられる主剤、助剤又はその他の成分、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素除去剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料等を併用することができる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、併用された上記成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００５６】
本実施形態の老化防止用皮膚外用剤は、線維芽細胞増殖促進作用、ＭＭＰ−１活性阻害作用、エラスターゼ活性阻害作用、プロフィラグリン産生促進作用、フィラグリン産生促進作用及び抗老化作用からなる群より選ばれる１種又は２種以上の作用を通じて、皮膚のシワ形成、弾力性の低下、保湿機能の低下等の老化症状；創傷、皮膚疾患等の線維芽細胞の増殖に関連するする各種疾患；肺気腫、肺水腫等の呼吸器疾患等のエラスターゼの活性亢進に起因する各種疾患；癌の浸潤・転移、関節リュウマチ、変形性膝関節症、歯周病、加齢黄斑変性症等の細胞外マトリックスの破壊に起因する各種疾患等を予防、治療又は改善することができる。
【００５７】
なお、本実施形態の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば，マウス，ラット，ハムスター，イヌ、ネコ，ウシ，ブタ，サル等）に対して適用することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００５９】
〔製造例１〕ダビジゲニンの製造−１
甘草の一種であるグリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の根茎部を粉砕し、チップ状にした。この甘草チップ１．０ｋｇをフラスコに取り、１０Ｌの５０容量％エタノール水溶液を加え、８０℃で２時間抽出した後、ろ過した。得られたろ液を４０℃以下の温度で減圧下濃縮した後、４０℃で減圧乾燥を行い、黄褐色粉末である甘草根茎部５０％エタノール抽出物（１５０ｇ）を得た。
【００６０】
このようにして得られた甘草根茎部５０％エタノール抽出物１０ｇに水２５ｍＬを加えて懸濁させ、次いでエタノール２５ｍＬおよび５質量％パラジウムカーボンを加えて撹拌し、室温にて懸濁液中に水素ガスを１６時間吹き込んだ。次いで、ろ過により触媒を除去し、ろ液として甘草抽出物の還元処理物（１０ｇ）を得た。
【００６１】
このようにして得られた甘草抽出物の還元処理物１０ｇに９５質量％硫酸５．０ｍＬを加え、８０℃で２時間反応させた。得られた反応液を多孔性樹脂（三菱化学社製，Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ−２０，５００ｍＬ）上に付し、水２Ｌ、エタノール２Ｌの順で溶出させた。エタノール２Ｌで溶出させた画分からエタノールを留去し、エタノール溶出画分２．５ｇを得た。このエタノール溶出画分２．５ｇをメタノール：水＝６０：４０（容量比）の混合液に溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学社製，クロマトレックスＯＤＳ ＤＭ１０２０Ｔ）を充填したガラス製のカラム上部より流入して、ＯＤＳに吸着させた。移動相としてメタノール：水＝６０：４０（容量比）を流し、その溶出液を集め、溶媒を留去し、ダビジゲニン濃縮液３００ｍｇを得た。得られたダビジゲニン濃縮液を、下記の条件で液体クロマトグラフィーを用いて分画した。
【００６２】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ ＧＳ−３１０（日本分析工業社製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相流量：５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００６３】
ここで、保持時間４０分〜５０分に溶出する画分をリサイクルＨＰＬＣにより精製を行い、精製物を得た（２２０ｍｇ）。得られた精製物について、１３Ｃ−ＮＭＲにより分析した結果を以下に示す。
【００６４】
＜１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）＞
２０５．６（Ｃ＝Ｏ），１６６．４（４’−Ｃ），１６６．３（２’−Ｃ），１５６．７（４−Ｃ），１３３．７（６’−Ｃ），１３３．２（１−Ｃ），１３０．４（２，５−Ｃ），１１６．２（３，５−Ｃ），１１４．１（１’−Ｃ），１０９．１（５’−Ｃ），１０３．７（３’−Ｃ），４０．９（α−Ｃ），３１．０（β−Ｃ）
【００６５】
以上の結果から、甘草抽出物の還元処理物を多孔性樹脂により分画し、ＯＤＳにより分離し、さらに液体クロマトグラフィーにより精製して得られた精製物が、下記式で表されるダビジゲニン（試料１）であることが確認された。
【００６６】
【化２】
【００６７】
〔製造例２〕ダビジゲニンの製造−２
４８％質量水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬにイオン交換水１０ｍＬを加えて希釈した。これを６０℃に加熱し、撹拌しながらｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド１．２ｇを加えて溶解し、次いで２’，４’−ジヒドロキシアセトフェノン１．５ｇを加えて溶解した。この反応液を６０℃に加熱したまま２４時間撹拌し、さらに加熱を止めて室温で４８時間撹拌した。得られた反応液を氷浴上で冷却しながら、水８０ｍＬを用いて希釈した後、あらかじめ調製した１０％硫酸水溶液４０ｍＬを加えて黄色結晶を析出させた。この懸濁液からろ紙を用いたろ過によって沈殿部をろ取した。ろ取した沈殿を４０℃にて減圧乾燥し、２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン５００ｍｇを黄色結晶として得た。
【００６８】
上記の反応を繰り返すことで得られた２’，４，４’−トリヒドロキシカルコン１０ｇを、密封可能な反応容器内でエタノール５０ｍＬに溶解し、５質量％パラジウムカーボン１．０ｇを加えた。この懸濁液を激しく撹拌しながら、容器内を減圧しては水素ガスを吹き込む操作を数回繰り返し、容器内を水素ガスで充満させた。反応液を４時間激しく撹拌した後に、ろ過によって触媒を除去した。得られたろ液に水１００ｍＬを加えた。析出した白色結晶をろ紙ろ過によってろ取し、これを４０℃にて減圧乾燥することで白色結晶を得た（９．５ｇ）。
【００６９】
得られた白色結晶を１３Ｃ−ＮＭＲにより分析したところ、試料１の結果と一致し、得られた白色結晶がダビジゲニンであることが確認された。
【００７０】
〔試験例１〕皮膚線維芽細胞増殖促進作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにして皮膚線維芽細胞増殖促進作用を試験した。
【００７１】
ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を７．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度になるように５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。
【００７２】
培養終了後、５％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭで溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表１を参照）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３日間培養した。線維芽細胞増殖作用は、ＭＴＴアッセイ法を用いて測定した。
【００７３】
培養終了後、各ウェルから１００μＬずつ培地を抜き、終濃度５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ緩衝液に溶解したＭＴＴを各ウェルに２０μＬずつ添加した。４．５時間培養した後に、１０％ＳＤＳを溶解した０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、一晩培養した後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様の方法で空試験を行い補正した。得られた結果から、下記の式により線維芽細胞増殖促進率（％）を算出した。
【００７４】
線維芽細胞増殖促進率(％)＝(Ｓｔ−Ｓｂ)／(Ｃｔ−Ｃｂ)×１００
式中、Ｓｔは「試料を添加した細胞での吸光度」を表し、Ｓｂは「試料を添加した空試験の吸光度」を表し、Ｃｔは「試料を添加しない細胞での吸光度」を表し、Ｃｂは「試料を添加しない空試験の吸光度」を表す。
結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
【００７６】
表１に示すように、ダビジゲニンは、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することが確認された。
【００７７】
〔試験例２〕ＭＭＰ−１活性阻害作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてＭＭＰ−１活性阻害作用を試験した。
【００７８】
蓋付試験管にて２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表２を参照）５０μＬ、ＭＭＰ−１溶液（Sigma社製，COLLAGENASE Type IV from Clostridium histolyticum）５０μＬ、及びＰｚペプチド溶液（BACHEM Feinchemikalien AG社製，Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ）４００μＬを混合し、３７℃にて３０分反応させた後、２５ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液１ｍＬを加え反応を停止した。
【００７９】
その後、酢酸エチル５ｍＬを加え、激しく振とうした。これを遠心（１６００×ｇ，１０分）し、酢酸エチル層の波長３２０ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様にして空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりＭＭＰ−１活性阻害率（％）を算出するとともに、ＭＭＰ−１の活性を５０％阻害する試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を内挿法により求めた。
【００８０】
ＭＭＰ−１活性阻害率(％)={１−(Ｃ−Ｄ)／(Ａ−Ｂ)}×１００
式中、Ａは「試料無添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料添加、酵素添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは、「試料添加、酵素無添加での波長３２０ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
【００８２】
表２に示すように、ダビジゲニンは、優れたＭＭＰ−１活性阻害作用を有することが確認された。また、ＭＭＰ−１活性阻害作用の程度は、ダビジゲニンの濃度によって調節できることが確認された。
【００８３】
〔試験例３〕エラスターゼ活性阻害作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
【００８４】
０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に溶解した試料溶液（試料１，試料濃度は下記表３を参照）５０μＬと、エラスターゼ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）５０μＬとを９６ウェルプレートにて混合した。その後、０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に０．４５１４ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解した基質溶液（SIGMA社製，Ｎ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド）１００μＬを添加し、２５℃にて１５分間反応させた。反応終了後、分光光度計（BIO-TEK INSTRUMENTS, INC社製）を用いて波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。また、同様にして空試験を行い補正した。得られた結果から、下記式によりエラスターゼ活性阻害率（％）を算出した。
【００８５】
エラスターゼ活性阻害率(％)＝{１−(Ａ−Ｂ)／(Ｃ−Ｄ)}×１００
式中、Ａは「試料添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｃは「試料無添加・酵素添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｄは「試料無添加・酵素無添加時の波長４１５ｎｍにおける吸光度」を表す。
結果を表３に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３に示すように、ダビジゲニンは、優れたエラスターゼ活性阻害作用を有することが確認された。
【００８８】
〔試験例４〕プロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用試験
製造例１で得られたダビジゲニン（試料１）について、以下のようにしてプロフィラグリン・フィラグリン産生促進作用を試験した。
【００８９】
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を７５ｃｍ２のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて１．５×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように調整し、２ｍＬずつ６穴コラーゲンコートプレートに播種して３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で３日間培養した。培養後、培地を０．２５％ＤＭＳＯに溶解した試料（試料１，試料濃度は下記表４を参照）を含むＫＧＭ２ｍＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で５日間培養した。培養終了後、常法により総タンパク質の調製を行った。
【００９０】
１０μｇ／列に調整したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＰＶＤＦ膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳ緩衝液でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）、ビオチン標識抗マウスＩｇ（Amersham Biosciences社製，Whole Ab）及びストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（CALBIOCHEM社製）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．３％スキムミルクを含むＰＢＳ緩衝液で１０００倍に希釈して順次反応させ、ECL Western blotting detection reagents（Amersham Biosciences社製）の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを画像撮影装置（Bio-Rad Laboratories社製，ChemiDoc XRS Plus）を用いて検出した。検出したバンドをImage Lab Software version2.0（Bio-Rad Laboratories社製）にて定量的に測定した。
【００９１】
結果は、試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク質１０μｇ中のプロフィラグリン及びフィラグリンのNet intensity（バンド強度）を合算した値を用いて、試料のプロフィラグリン産生促進作用を評価し、プロフィラグリン産生促進率（％）を下記式に基づいて算出した。
【００９２】
プロフィラグリン／フィラグリン産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時のNet intensity（プロフィラグリン及びフィラグリンの合計値）」を表し、Ｂは「試料無添加時（コントロール）のNet intensity」を表す。
結果を表４に示す。
【００９３】
【表４】
【００９４】
表４に示すように、ダビジゲニンは、１０μｇ／ｍＬにおいて優れたプロフィラグリン産生促進作用を有することが確認された。なお、フィラグリンは、生体内でプロフィラグリンの加水分解により産生されるものであることから、プロフィラグリン産生促進作用を有するダビジゲニンは、プロフィラグリンの産生を促進し、細胞内におけるプロフィラグリン量を増加させることで、フィラグリン量をも増加させることができ、結果としてフィラグリン産生促進作用を有するものと考えられる。
【００９５】
〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
黄杞エキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.O） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００９６】
〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０５ｇ
クジンエキス ０．１ｇ
オウゴンエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【００９７】
〔配合例３〕
下記組成の美容液を常法により製造した。
ダビジゲニン（製造例１） ０．０１ｇ
カミツレエキス ０．１ｇ
ニンジンエキス ０．１ｇ
キサンタンガム ０．３ｇ
ヒドロキシエチルセルロース ０．１ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ４．０ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
グリセリン ２．０ｇ
水酸化カリウム ０．２５ｇ
香料 ０．０１ｇ
防腐剤（パラオキシ安息香酸メチル） ０．１５ｇ
エタノール ２．０ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の線維芽細胞増殖促進剤、ＭＭＰ−１活性阻害剤、エラスターゼ活性阻害剤、プロフィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、及び老化防止用皮膚外用剤は、皮膚の老化の予防又は改善に大きく貢献できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤。
【請求項３】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするエラスターゼ活性阻害剤。
【請求項４】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項６】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項７】
ダビジゲニンを配合したことを特徴とする老化防止用皮膚外用剤。
【請求項１】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）活性阻害剤。
【請求項３】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするエラスターゼ活性阻害剤。
【請求項４】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするプロフィラグリン産生促進剤。
【請求項５】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
【請求項６】
ダビジゲニンを有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項７】
ダビジゲニンを配合したことを特徴とする老化防止用皮膚外用剤。
【公開番号】特開２０１２−１０２０４０（Ｐ２０１２−１０２０４０Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５１３３２（Ｐ２０１０−２５１３３２）
【出願日】平成２２年１１月９日（２０１０．１１．９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月９日（２０１０．１１．９）
【出願人】（５９１０８２４２１）丸善製薬株式会社 (239)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]