抗肥満用免疫原性ハイブリッドポリペプチド及びこれを含む抗肥満ワクチン組成物
アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドとヘルパーＴ細胞エピトープを含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端と融合した免疫原ハイブリッドポリペプチド、及びこれを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドとヘルパーＴ細胞エピトープを含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープ部分のＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチド、及びこれを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
最近、韓国では、西欧的食生活の影響で動脈硬化症及び冠状動脈疾患（coronary atherosclerotic disease：ＣＡＤ）が益々増加しつつあり、これによる死亡率も高くなってきている。この種の疾患の原因となる血清脂質としては、コレステロール(cholesterol)、トリグリセリド(triglyceride：ＴＧ)、遊離脂肪酸(free fatty acid)、リン脂質(phospholipid)などがあり、アポリポ蛋白質(apolipoprotein)と共にリポ蛋白質を形成して血液循環によって運搬されている。中でも、ＬＤＬ(low density lipoprotein)は主にＴＧやコレステロールの運搬を担当しており、ＬＤＬ−コレステロール数値の変化は前述したような疾病の予後を示す尺度となる。
【０００３】
脂質代謝に関連した成人病の主要因子であるＬＤＬ−コレステロールは、各組織の細胞膜のＬＤＬ受容体に結合して組織内に蓄積、活用されるか、スカベンジャー細胞により捕獲されてから加水分解されて遊離コレステロールの形でアポＥリポ蛋白質と共にＨＤＬへ伝達されて肝で再活用されるか、胆汁酸の形に処理されて排泄される経路が明らかになっている。この過程において、アポリポ蛋白質は、リポ蛋白質の構造的恒常性を保ち、脂肪質分解酵素の補助因子機能、及び細胞膜上の特定の受容体と結合する非常に重要な機能を行っている。
【０００４】
アポリポ蛋白質Ｂ−１００（Ａｐｏ Ｂ−１００）は、このような低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の主な蛋白質成分であり、またＩＤＬ、ＶＬＤＬ、キロミクロン(chylomicron)に存在しているため、血中にある抗体がＡｐｏ Ｂ−１００を認識するように誘導すると、食細胞によるＬＤＬ−消去(clearance)が容易に起こり得るであろう。これを根拠とし、最近、ワクチンを用いてＬＤＬ−コレステロールの数値を低め且つ動脈硬化を減少させるための研究が行われている。このような抗−コレステロールワクチン療法により誘導された抗体はＩｇＭタイプであり、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＬＤＬと結合するものと思われるが、このことから高コレステロール及びアテローム性動脈硬化症に対する予防及び治療用ワクチンの可能性が提示されている(Bailey, et al., Cholesterol vaccines. Science 264, 1067-1068, 1994; Palinski W et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 821-5, 1995; Wu R. de Faire U et al., Hypertension. 33, 53-9, 1999)。また、アポリポ蛋白質Ｂ−１００は、４５６０個のアミノ酸残基（２４個のシグナルペプチドを含む）からなる巨大な蛋白質分子であって、分子量は５００ｋＤａを超過する(Elovson J et al., Biochemistry, 24: 1569-1578, 1985)。主に肝から分泌される両親媒性の分子なので、リポ蛋白質のリピドとの相互作用が可能であり、水溶液の環境とも相互作用が可能である(Segrest J. P et al., Adv. Protein Chem., 45: 303-369, 1994)。アポリポ蛋白質Ｂ−１００は、ＬＤＬ粒子の大きさと構造を安定化させる役割と、収容基との結合によって血漿内ＬＤＬコレステロールの恒常性を調節するのに重要な役割をする(Brown MS et al., Science, 232 : 34-47, 1986)。
【０００５】
本願の発明者により出願された韓国特許公開第２００２−００１８９７１号では、Ａｐｏ Ｂ−１００のエピトープに対するミメティックペプチド(mimetic peptide)が抗肥満効果を持つと記述している。ところが、前記出願では、単に、前述したＢ細胞のエピトープであるミメティックペプチドが抗肥満効果を示すことを開示している。
【０００６】
本発明の前には、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとを融合させて免疫原性を増強させようとしたことがなく、免疫反応を増強させるために蛋白質キャリアまたは補助剤として使用した試みのみがあった。
【０００７】
米国特許第５，８４３，４４６号では、ＬＨＲＨの免疫原性を増強させるために、ＬＨＲＨにこれとは異なる蛋白質を結合させることができるが、この場合、主要免疫反応がＬＨＲＨに対して誘導されるよりは、結合したキャリア蛋白質に対して誘導され、却ってＬＨＲＨに対する免疫抑制が誘導されるおそれがあるという問題について記述している。これから分かるように、Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強させるための追加物質の選別、結合方式、結合位置などについての研究開発は、持続的な努力が必要である。
【０００８】
ハプテンの免疫原性を高めるために媒体蛋白質と融合させようとする試みがたくさんあったが、一律的な相乗効果を得ることはできなかった。特に、本発明のようなＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとの線形連結の際に、これらの方向性、それぞれのエピトープの種類などによって寧ろ免疫原性が消失してしまう場合もあり(Francis, M. J. et al., Nature 330: 168-170, 1987)、リンカーの存在により抗原性が減少する場合も発生した(Partidos, C. et al., Mol. Immunol. 29:651-658, 1992)。このようにペプチドワクチンのデザインに一貫的に適用することが可能な様態が存在せず、デザインされたワクチンの効能も予測することができない。同一の理由から、疎水性が非常に強いＰＢ１4ペプチドを、異種のペプチドであるＴ細胞エピトープと融合させる場合、抗原性を示す部位を分子の内部に取り入れて抗体誘導能の低下をもたらす可能性も排除することができない。
【０００９】
このような背景の下で、本発明者らは、抗肥満効果を示すアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドであるＰＢ１4を増強させるために様々な試みを重ねた結果、ミメティックエピトープのＣ末端にヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端を融合させたハイブリッドポリペプチドが優れた免疫増強効果を示し、肥満の予防または治療に効果的に使用できることを確認した。このようなハイブリッドポリペプチドが、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープの有利な活性または効果を中和させる免疫反応を誘導するか有害な副作用を起すことなく、優れた抗肥満活性を示すことができるということは、全く類推できない効果であった。
【００１０】
〔発明の開示〕
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
【００１１】
他の様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチンを提供する。
【００１２】
別の様態として、本発明は、前述した免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む形質転換体、及び前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して前記ハイブリッドポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１４】
図１はｐＢ１4Ｔの製作図を示す。
【００１５】
図２はｐＢ１4Ｔの制限酵素切断を示す。
【００１６】
図３はＤＮＡ配列から類推したｐＢ１4Ｔの一次構造を示す。
【００１７】
図４は形質転換された大腸菌(Escherichia coli)Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔを、ＩＰＴＧでｐＢ１4Ｔの発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１4Ｔは矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー；レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン３〜７：ＩＰＴＧ誘導１、２、３、４及び５時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【００１８】
図５は形質転換された大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8を、ＩＰＴＧでＰＢ１8の発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１8は矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー、レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン2〜5：ＩＰＴＧ誘導１、２、３及び4時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8。
【００１９】
図６は大腸菌溶解物(lysate)のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、上澄液（レイン１）と沈殿物（レイン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１4Ｔは、矢印で表示したように沈澱物に現われた。
【００２０】
図７は大腸菌溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、全体溶解物（レイン１）、上澄液（レイン２）及び沈澱物（レイン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１8は、矢印で表示したように沈殿物に現われた。
【００２１】
図８は精製されたＰＢ１4Ｔペプチドをウェスタンブロット分析した結果である。抗ＰＢ１4ウサギ抗体（Ａ）と抗ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（Ｂ）を用いてＰＢ１4Ｔを分析した。レイン１：大腸菌Ｍ５、レイン２：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ、レイン３：ＩＰＴＧ誘導３時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【００２２】
図９はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4溶出プロファイルを示す。
【００２３】
図１０はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4Ｔ溶出プロファイルを示す。
【００２４】
図１１はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１8溶出プロファイルを示す。
【００２５】
図１２はｐＴＢ１4の製作図を示す。
【００２６】
図１３は精製されたＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4をウェスタンブロット分析した結果である。パネルＡはマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認し、パネルＢはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認した。
【００２７】
図１４はＤＮＡ配列から類推したＴＢ１4／ｐＱＥ３０の一次構造を示す。
【００２８】
図１５は対照グループ(normal)、模擬グループ(mock)、ワクチン処理グループにおけるＳＤ系白ネズミの体重増加を比較したグラフを示す。対照グループ（■）はＰＢＳで注射され、模擬グループ（▲）はオボアルブミンで注射された。ワクチン処理グループはＰＢ１4を媒体蛋白質ＯＶＡに抱合させたＰＢ１4＋ＯＶＡ（◆）ペプチドとＰＢ１4Ｔ（●）ペプチドで注射された。このようなペプチド注射は、２週間隔で３回ずつ行われた。矢印は、ワクチン処理の時点を示す。
【００２９】
図１６は抗−ＰＢ１4、抗−ＰＢ１4Ｔ及び抗−ＰＴＢ１4の抗体力価変化を測定した結果である。
【００３０】
図１７は血清内トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール量を測定した結果である。
【００３１】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は、アポリポ蛋白質に対する免疫原性を強化させるための一つの方法として、アポリポ蛋白質、特にアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープが融合した形の免疫原性ハイブリッドペプチドを提供しようとする。このように、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープを連結した結果、抗体誘導能が強化されたうえ、ワクチン効能期間が延長されて優れた抗肥満効果を示した。
【００３３】
本発明で使用される用語「エピトープのミメティックペプチド」は、エピトープの最小部分を模倣するペプチドであって、抗体によって認識できるように天然エピトープと十分類似であるか、天然エピトープと交差反応する抗体を増加させることが可能なエピトープを意味し、ミモトープ(mimotope)ともいう。このようなミメティックペプチドは、生体内で非自己(non-self)と認知されるという利点があり、その場合、免疫反応において自己寛容(self tolerance)の問題を克服することができるという長所がある。前述したアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドは、アポリボ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体によって認識され、アポリポ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００を特異的に認識して結合するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含み、これらの断片、例えばＦｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２なども含む。特にモノクローナル抗体が好ましく、より好ましくはＭａｂ Ｂ９及びＭａｂ Ｂ２３が使用される。
【００３４】
本発明において、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含む。したがって、好ましい様態において、本発明は、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含み、アポリポ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体によって認識されるペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ポリペプチドに関する。
【００３５】
本発明者らは、ファージディスプレイペプチドライブラリ(phage displayed peptide library)からバイオパニング(biopanning)を用いてアポリポ蛋白質Ｂ−１００に対するモノクローナル抗体Ｍａｂ Ｂ９またはＭａｂ Ｂ２３によって認識できるミメティックペプチド（配列番号１、２及び３）を究明した。
【００３６】
前述した配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドは、前記配列番号のアミノ酸配列１個からなる単量体の形であってもよいが、免疫原性を一層増強させるために前記配列番号のアミノ酸配列が２個以上、好ましくは３〜８個、より好ましくは３〜６個が連結された多量体の形を取ってもよい。最も好ましくは、４個が連結された四量体（配列番号４）である。多量体の形を取る場合、単量体を形成するアミノ酸配列は、直接またはリンカーを介して共有結合で連結できる。リンカーを介して連結される場合、アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスバラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンを１個〜５個ずつ使用して連結させることができ、使用可能な好ましいアミノン酸としては、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、プロリンを例示することができる。より好ましくは遺伝子操作の容易性を考慮してバリン、ロイシン、アスパラギン酸などの中から選択された２つのアミノ酸を連結して使用することができる。好ましくは、前記配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が前記リンカーを介して２個以上連結されたミメティックペプチドが使用される。
【００３７】
本発明において「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、適当な効率でＭＨＣクラスII分子に結合することができ、Ｔ細胞を刺激し或いはＭＨＣクラスIIとの複合体でＴ細胞と結合することができるアミノ酸配列を意味する。その場合、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞上に存在する特定の受容体によって認識され、Ｂ細胞が抗体生産細胞に分化するのに要求される信号を提供する役割も果たし、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導して標的細胞の溶菌を誘導する。Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞を刺激させ且つ免疫反応を強化する限り特定なものと限定されず、目的に適した多様な蛋白質、ペプチドなどが使用可能である。本発明の目的上、Ｔ細胞エピトープは、ヘルパーＴ細胞エピトープが好ましく使用される。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト(Plasmodium falciparum circumsporozoite)ヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、破傷風トキソイド(Tetanus toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、麻疹(measles)ウィルスＦ蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、 百日咳ワクチン(pertussis vaccine)、ＢＣＧ(Bacile Calmette-Guerin)、ポリオワクチン(polio vaccine)、流行性耳下腺炎ワクチン(mumps vaccine)、 風疹ワクチン(rubella vaccine)、狂犬病ワクチン(rabies vaccine)、ツベルクリンの精製蛋白質誘導体、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)、これらの断片または配合物などに由来したＴ細胞エピトープ配列を含むことができる。前述したＴ細胞エピトープは、特定の目的に応じて選択されたアミノ酸残基を添加、欠失、置換して使用することができ、また２つ以上の相異なるＴ細胞エピトープが結合している多量体の形でも提供できる。本発明の具体例では、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を使用した。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）遺伝子の大きさは３．２ｋｂであって、大きく４種の重要な蛋白質に対する情報を持っており、Ｓ遺伝子（表現抗原蛋白質）、Ｃ遺伝子（コア蛋白質）、Ｐ遺伝子（ＤＮＡ重合酵素）及びＸ遺伝子から構成されている。Ｓ遺伝子の場合、ＨＢｓＡｇをコードしているＳ領域とｐｒｅＳ領域に分けられる。ｐｒｅＳ領域は、ＨＢＶの菌株に応じて１０８または１１９個のアミノ酸をコードしているｐｒｅＳ１と、サブタイプに関係なく５５個のアミノ酸残基からなるｐｒｅＳ２とに分けられる。ＨＢＶ ｐｒｅＳ２蛋白質は、体内免疫反応過程でヘルパーＴ細胞を活性化させ、これはＨＢＶに対する抗体の形成を促進させることができる。
【００３８】
本発明で使用された用語「ハイブリッドポリペプチド」とは、一般に、起源の異なる異種ペプチドが連結された形のペプチドをいい、本発明では、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとを連結した形のペプチドを意味する。このようなハイブリッドポリペプチドは、それぞれのパトナーが決定された後、化学的に合成するか、遺伝子組み換え方法で発現及び精製して得ることができる。好ましくは、Ｂ細胞エピトープをコードする遺伝子配列とＴ細胞エピトープをコードする遺伝子配列とを連結したハイブリッド遺伝子を細胞発現システムで発現させて提供される。このようなハイブリッドポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとが直接或いはリンカーなどの連結子を介して連結できる。リンカーを介して連結される場合、これによる免疫反応の誘導に不利な影響を及ぼさないように選定されるべきである。
【００３９】
本発明で使用された用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含む残基が共有ペプチド結合によって結合した全長のアミノ酸鎖を含む用語であって、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどがこれに含まれるが、特に、本発明では、数個〜数十個のアミノ酸が共有結合したペプチド２種以上が互いに連結されたハイブリッドポリペプチドを意味する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、２種以上のペプチド、例えばＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとが連結されたポリペプチドである。ポリペプチドを構成するそれぞれのペプチド配列は、前述したようなエピトープに該当する配列を含み、それに隣接して配置された配列も共に含むことができる。これらのペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または２つの相異なる配置のアミノ酸の多様な組合せを取ることができる。本発明のハイブリッドポリペプチドは、全的に前述したようなＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、及び任意にその隣接配列を含んだ抗原性部分のみからなってもよく、付加配列を含んでもよい。ところが、このような付加配列は、全体免疫原性(immunogenicity)を減少させないことが好ましい。このような付加配列としては、リンカー配列を例示することができる。
【００４０】
本発明で使用された用語「免疫原性」とは、細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導して異物に対して対処する能力をいう。このような免疫反応を誘導する物質を免疫原と呼ぶ。本発明は、免疫原性物質として、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープを両方とも備えるポリペプチドを使用する。
【００４１】
本発明者らは、Ｂ細胞エピトープを持っているが、それ自体ではＴ細胞エピトープ部分が欠如している抗肥満機能的ペプチドであるＡｐｏ Ｂ−１００ミメティックペプチドの四量体ＰＢ１4のＣ末端部分と、Ｔ細胞エピトープを持っているＨＢＶのｐｒｅＳ２の一部（Ｔ断片）とを連結し、ＰＢ１4Ｔの発現用遺伝子断片を製作した（図１）。ＰＢ１4断片を得るためにＢａｍＨＩとＸｈｏＩを、Ｔ断片を得るためにＳａｌＩとＨｉｎｄIIIを使用し、ＰＢ１4Ｔの遺伝子断片とベクターｐＱＥ３０とを結合して大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。制限酵素切断（図２）とＤＮＡ配列分析（図３）によってＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープ部分とが連結されている正しいクローンであることを確認し、このクローンをｐＢ１4Ｔと命名した。ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の発現のためにｐＱＥ３０ベクターを使用したが、ベクター自体内にある開始コドンから蛋白質の発現が始まり、精製を便利にするための６個のヒスチジンも共に発現し、エンテロキナーゼ(enterokinase)部位も発現する。このように発現する蛋白質の大きさは、ＰＢ１4Ｔは１６．２ｋＤａであり、ＰＢ１8は１６．５ｋＤａであった。時間帯別にサンプルを得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって発現を確認した（図４、図５）。
【００４２】
したがって、本発明の具体的な実施様態によって四量体のアポリポ蛋白質Ｂ−１００のミメティックペプチドとＢ型肝炎ウィルスの表面抗原ｐｒｅＳ２とが連結された配列番号９の免疫原性ハイブリッドポリペプチドが提供できる。
【００４３】
本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドは、化学的に合成するか、遺伝子組み換え方法によって生産することができ、好ましくは組み換えベクターを用いてこれを宿主細胞に形質転換させ、これから発現されたポリペプチドを分離、精製して生産することができる。
【００４４】
したがって、他の様態として、本発明は、前記免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクトル、及び前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４５】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して前記免疫原性ハイブリッドポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００４６】
遺伝子組み換え方法によって本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを生産する過程は、次の段階を含む。
【００４７】
第１段階は、ハイブリッドペプチドをコードする遺伝子をベクターに挿入して組み換えベクターを製造する段階である。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウィルス、コスミドなど多様な形のベクターを使用することができる。組み換えベクターは、クローニングベクター及び発現ベクターを含む。クローニングベクターは、複製基点、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドの複製基点を含み、他のＤＮＡ切片が付着し、付着している切片が複製できる「レプリコン」である。発現ベクターは、蛋白質の合成に使用されるように開発された。組み換えベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。本願において、「外来ＤＮＡ」とは、外来種から起源するＤＮＡを意味し、或いは同一の種から起源する場合には本来の形から実質的に変形された形を意味する。また、細胞で正常的に発現しない非変化ＤＮＡ配列も含む。この場合、外来遺伝子は、転写される特定の目的の核酸でポリペプチドを暗号する。組み換えベクターは、宿主細胞における形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。前記組み換えベクターは、個体の細胞内で遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物であって、このような遺伝子作製物を製造するために、標準組み換えＤＮＡ技術を利用することができる。組み換えベクターの種類は、原核細胞または真核細胞の各種宿主細胞で目的の遺伝子を発現させ、目的の蛋白質を生産する機能を行うものであれば、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモータと強い発現力を保有しながら自然状態と類似な形の外来蛋白質を大量生産することが可能なベクターが好ましい。組み換えベクターは、少なくともプロモータ、開始コドン、目的の蛋白質を暗号化する遺伝子、終結コドンターミネータを含んでいることが好ましい。その他に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、目的の遺伝子の５’側と３’側の非解読領域、選別マーカー領域、または複製可能単位などを適切に含むこともできる。
【００４８】
第２段階は、前記組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換させた後、培養する段階である。組み換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造するための方法としては、文献（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（２版）、Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃(gene gun)などを利用することができる。前記組み換えベクターが発現する形質転換体を栄養培地で培養すると、有用な蛋白質を大量に製造、分離可能である。培地と培養条件は、宿主細胞に応じて、寛容されるものを適切に選択して用いることができる。培養の際に細胞の生育と蛋白質の大量生産に適するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適切に調節しなければならない。本発明に係る組み換えベクターで形質転換できる宿主細胞は、原核細胞と真核細胞を両方とも含み、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常用いられる。細菌、例えばエシェリキア、シュードモナス、バシラス、ストレプトミセス、真菌、酵母などの周知の真核及び原核宿主、ＳＦ９(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０などの動物細胞などが使用できる宿主細胞の例である。好ましくは、大腸菌が使用できる。
【００４９】
第３段階は、ハイブリッドペプチドの発現を誘導、蓄積する段階である。本発明では、誘導因子ＩＰＴＧを用いてペプチドの発現を誘導し、誘導時間は蛋白質の量を最大化されるように調節した。
【００５０】
第４段階は、ハイブリッドペプチドを分離、精製する段階である。一般に、組み換え的に生産されたペプチドは、培地または細胞分解物から回収できる。膜結合型の場合、適切な界面活性剤溶液（たとえばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を使用し、或いは酵素的切断によって膜から遊離できる。ハイブリッドペプチドの発現に使用された細胞は、凍結−解凍反復、音波処理、機械的破壊または細胞分解剤などの多様な物質的または化学的手段によって破壊でき、通常の生化学分離技術によって分離、精製可能である(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990)。電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈澱、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着アフィニティクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）、等電点電気泳動法、並びにその多様な変化及び複合方法を含むが、これらに局限されない。
【００５１】
本発明では、具体的にＰＢ１4Ｔの遺伝子断片をベクターｐＱＥ３０と結合して大腸菌に形質転換した。ｐＱＥ３０は、ファージＴ５プロモータからなるプロモータとＩＰＴＧを誘導剤として使用するｌａｃオペレーターシステムを持っている、大腸菌から蛋白質を大量生産するのに有用なベクターである。ＰＢ１4Ｔを認識することが可能な２つの抗体、１次抗体はウサギ抗−ＰＢ１４ポリクローナル抗体とマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって正しく発現することを確認し、蛋白質の精製を始めた。ＰＢ１4とＰＢ１4Ｔは不溶性なので、８Ｍ尿素に変性させた後、ヒスチジンタグ（ｔａｇ）蛋白質用Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いてＰＢ１4とＰＢ１4Ｔを精製した。
【００５２】
上述したように発現及び精製したポリペプチドをマウスに接種した後、それによる体重の増加、血清内抗体力価、血清内脂質含量の変化を分析した。その結果、ハイブリッドポリペプチドでワクチン化されたグループが、対照グループ、またはハイブリッドされていないミメティックペプチドでワクチン化されたグループに比べて体重増加が抑制され、ミメティックペプチドに対する抗体力価が高く、残存期間が長く、ＴＧ及びＬＤＬ−コレステロールの数値も低くなることを確認した。
【００５３】
ペプチドワクチンのデザインに一貫的に適用することが可能な様態が存在せず、デザインされたワクチンの効能も予測することができない。同一の理由から、疎水性が非常に強いＰＢ１4ペプチドを異種ペプチドであるＴ細胞エピトープと融合させる場合、抗原性を示す部位を分子の内部に取り入れて抗体誘導能の低下をもたらす可能性も排除することができない。このようにその結果を類推し難い状況で、本発明者らは、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープを連結したハイブリッドポリペプチドを設計し、抗肥満に対する増加した免疫原性を立証した。
【００５４】
人工合成ハイブリッドポリペプチド及びこれを含むワクチンの免疫原性は、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープが存在しなければならず、また、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープとの連結順序(orientation)によってワクチンの効能が異なる。すなわち、ヘルパーＴ細胞のエピトープがＢ細胞エピトープのＮ末端に位置するか、Ｃ末端に位置するかによって抗体誘導能が異なる(Partidos, C, Stanley, C, and Steward, M, The effect of orientation of epitope on the immunogenicity of chimeric synthetic peptides representing measles virus protein sequences, Molecular Immunology,29(5),651-658,1992)。
【００５５】
本発明者らは、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープとの連結順序による免疫誘導効果の差異を確認するために、前記ＰＢ１4のＣ末端部分とＴ断片とを連結して製作したＢ１4Ｔ遺伝子断片とは異なり、ＰＢ１4のＮ末端部分とＴ断片とを連結してＴＢ１4遺伝子断片を製作した（図１２）。具体的に、実施例９による方法によってベクターｐＴＢ１4を製作し、大腸菌Ｍ１５に形質転換させて発現させ、発現したハイブリッドポリペプチドＰＴＢ１4は、Ｈｉｓ−Ｔａｇが存在するので、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行って精製した。
【００５６】
ＰＴＢ１4とＰＢ１4Ｔの抗体誘導反応性及び免疫原性を比較するために、白ネズミを用いて免疫化した後、採血してこれを比較した。ＰＴＢ１4の抗体誘導能はＰＢ１4よりは多少向上しており、残存期間の長期化現象を示したが、ＰＢ１4Ｔに比べて約５０〜６０％程度に著しく弱いことを確認することができた（図１６）。これは、体重増加抑制効能においても同一の結果を示した（表２）。前述したように、本発明のＰＢ１4のＣ末端部分とＴ断片とを連結して製作したＰＢ１4Ｔポリペプチドの免疫原性及び肥満抑制効能がより優れることを確認することができた。
【００５７】
したがって、別の様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチンを提供する。
【００５８】
免疫原が示す反応の大きさ及び観察された個体の比率を比較すると、優れた効果を示すワクチンとして使用できるかどうかを判断することができる。本発明では、肥満予防及び治療用ワクチンという元々の発明の目的に合うように、（ａ）体重の増加推移観察、（ｂ）血清内抗体力価の観察、及び（ｃ）血清内脂質含量の変化によって免疫反応効果を検定し、抗原の優れた形態を立証した。
【００５９】
具体的に、７週齢ＳＤ系白ネズミ(rat)の抗原注射による体重の変化を、精製ＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔのペプチド１００μｇを腹腔に２週間隔３回注射した後、体重増加グラフで確認した（図１５）。１次注射とブーストのときまでは各グループの身体質量は２９２〜２９７ｇと同様であったが、２回注射の１週後から、ワクチン化されたグループが対照グループ及び模擬グループとは差異を示し始めた。これは、最初注射による微弱な免疫反応が２次注射によってブーストされた後、増強した免疫応答反応によって体重増加が抑制されることを示す。対照グループ及び模擬グループよりはワクチン処理したときに体重の増加程度が減少し、また、ＰＢ１4形態のペプチドよりＰＢ１4Ｔ形態のペプチドがより優れた体重増加抑制効果を示す（表２）。３次注射後にも、体重増加の偏差は維持された。また、キャリア蛋白質であるオボアルブミンを抱合させた形のＰＢ１4よりは均質なキメラ抗原ＰＢ１4Ｔが免疫応答反応を効率よく誘導することを確認することができた。ワクチン処理されたグループにおけるＳＤ系白ネズミの抗体力価は、１０、１２、１４、１６週齢でＥＬＩＳＡ分析した（図１６）。ＰＢ１4Ｔを注射したグループがＰＢ１4を注射したグループに比べて抗体力価が増加し、１４週齢では、ＰＢ１4Ｔでワクチン処理されたグループが、ＰＢ１4ワクチン処理されたグループよりＯ．Ｄ数値が１．５倍高かった。１６週齢では、ＰＢ１4グループにおいて力価の減少が現われたが、ＰＢ１4Ｔグループは力価の増加が維持された。血清内脂質水準は、ワクチン処理されたグループが、対照グループ及び模擬グループより全体的にＴＧ及びコレステロールの数値が低かった。特に、ＬＤＬ−コレステロールは正常値の６０％水準と低くなった（図１７）。
【００６０】
前記結果は、Ｂ細胞エピトープであるＰＢ１4のみが在る形態より、Ｔ細胞エピトープが共に融合している形態が一層高い免疫原性を示し、効果的なワクチン組成物として使用できることを立証する。
【００６１】
また、本発明者らは、ＰＢ１4Ｔの効能を愛玩犬を対象として臨床実験した。ＰＢ１4Ｔをアルミナと混合して１０匹の愛玩犬に２週間隔で２回接種した後、体重変化を観察した結果、間食を始めとした高脂肪食を無制限提供しても、体重の増加は全く観察されなかった（表４）。抗体誘導の度合いにおいても、２次接種後、各愛玩犬の血清を採取して抗体力価をＥＬＩＳＡ実験法によって測定した結果、５０００〜５００００倍希釈した血清でも高い吸光度を示して優れた効果を発揮した。
【００６２】
本発明の抗肥満ワクチンは、抗原、薬剤学的に許容可能な担体、適切な補助剤、その他の通常の物質からなり、免疫学的効果量で投与する。本発明において、「免疫学的効果量」とは、肥満治療及び予防効果を示すことができる程度の十分な量と、副作用や深刻なまたは過度な免疫反応を起さない程度の量を意味し、正確な投与濃度は投与される特定の免疫原によって異なり、免疫反応の発生を検査するために、当業者が公知の方法を用いてこれを決定することができる。また、投与形態及び経路、収容者の年齢、健康及び体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、及び治療回数によって変化できる。担体は、当分野に公知になっているもので、安定化剤、希釈剤、緩衝液を含む。適切な安定化剤は、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、澱粉、糖、デキストラン及びブドウ糖などの炭水化物；アルブミンまたはカゼインなどの蛋白質などを含む。適切な希釈剤には塩、ハンクス平衡塩、リンガー液などを含む。適切な緩衝液には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土金属炭酸塩などを含む。また、ワクチンには、免疫反応を改善または強化させるために、少なくとも一つの補助剤などを含む。適切な補助剤には、ペプチド；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；Ｍａｒｃｏｌ ５２などのミネラル油または植物性油及び少なくとも一つの乳化剤からなる組成物、またはリゾレシチン、多価陽イオン、多価陰イオンなどの表面活性物質などが含まれる。本発明のワクチン組成物は、個別治療剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与してもよい。ワクチン組成物は、公知の投与経路によって投与される。このような方法には、経口、経皮、筋肉、腹膜、静脈、皮下、鼻腔経路を利用することができるが、これらに局限されない。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へ移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００６３】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
〔実施例〕
＜実験材料＞
ＤＮＡミニプレップキット(miniprep kit)とゲルからＤＮＡを抽出するために使用されたキットはＮｕｃｅｌｏｇｅｎ製を、細胞培養に必要なバクト−トリプトン(bacto-trypton)、バクト−酵素抽出物(bacto-yeast extract)、アガ(agar)などは、Ｄｉｆｃｏ社（Ｄｅｔｒｏｔｉ、ＭＩ）製を、制限酵素はＴａｋａｒａ製を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＮＥＢ製をそれぞれ使用した。ベクターはｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、菌株は大腸菌ＪＭ１０９及びＭ１５（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用した。
【００６５】
蛋白質の生成を誘導するためのＩＰＴＧはＳｉｇｍａ社製を、発現された蛋白質を精製するためのＮｉ−ＮＴＡレジンはＮｏｖａｇｅｎ社製を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット、ＥＣＬなどに用いられた予備染色マーカー(prestained marker)はＮＥＢ社製であった。蛋白質を変性状態にするために使用された尿素はＤｕｃｈｅｆａ社製であり、精製時に使用されたイミダゾールはＵＳＢ製であった。透析に使用された膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ製のＭＷＣＯ ３５００であり、蛋白質凝集防止のために使用された試薬はＡｍｒｅｓｃｏ製のＣＨＡＰＳであった。ＥＬＩＳＡに使用された抗体は、Ｓｉｇｍａ製のＨＲＰ結合抗−白ネズミＩｇＧであった。ウェスタンブロットとＥＣＬに使用された基質溶液として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴはＳｉｇｍａ製を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウェスタンブロット検出試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ製を使用した。補助剤は、フロイントアジュバント（Freund Adjuvant；Ｓｉｇｍａ社製）と水酸化アルミニウム（Ｒｅｈｅｉｓ社製）を使用した。蛋白質の定量は、ＢＣＡ蛋白質検査法（Ｐｉｅｒｃｅ）とＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。
【００６６】
血清内中性脂肪はトリグリザイム−Ｖを、総コレステロールはコレステザイム−Ｖを、ＨＤＬコレステロールはＨＤＬ−Ｃ５５５（シンヤン化学社製）を、ＬＤＬコレステロールはＥＺＬＤＬコレステロール（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて測定した。ＬＤＬ測定器は、Ｒａｎｄｏｘ製を使用した。
【００６７】
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）系白ネズミは、（株）大韓バイオリンクから購入し、５週齢以上の雄を使用した。白ネズミの飼料としては韓国の（株）Ｓａｍｔａｋｏ製（成分：天然蛋白質１８％以上、粗脂肪５．３％、粗繊維４．５％、回分８．０％）を使用した。
【００６８】
組み換えＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１4ペプチドの精製のために、超音波粉砕緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）、結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）、洗浄緩衝液（５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）、溶出緩衝液（４００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）を使用した。
【００６９】
＜実施例１：抗肥満作用ペプチドＰＢ１4Ｔ人工遺伝子の作成＞
ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｔIIＳＫベクターに入っているＢ１4断片を得るために、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、ＰＣＲ２．１ベクターに入っているＴ断片を得るために、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII制限酵素を用いて切断した。２つのベクターから得られた切片、Ｂ１4とＴに対して、Ｂ１4のＸｈｏＩ粘着末端とＴのＳａｌＩ粘着末端が相補的なので、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１２時間結合させた。その結果、連結部位はＳａｌＩまたはＸｈｏＩによって切られなくなり、Ｂ１4Ｔ断片を得るためにもう１回ＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切った。蛋白質を発現するために選択されたベクターシステムとしてｐＱＥ３０プラスミドを使用した。このベクターは、発現させようとする蛋白質が６Ｘヒスチジンと融合蛋白質の形で発現して精製が容易となるように考案された。Ｂ１4Ｔ遺伝子断片をｐＱＥ３０ベクターのＳａｌＩ及びＨｉｎｄIII部位と結合した。こして作られたクローンをｐＢ１4Ｔと命名した（図１）。大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させた後、プラスミドを分離してＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切って、４５０ｂｐ断片が挿入されたことを確認した（図２）。
【００７０】
前述した組み換えベクターｐＢ１4Ｔは、大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔの形であって、２００４年３月４日付けでＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganisms、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５６２で寄託された。
【００７１】
＜実施例２：抗肥満作用ペプチドＰＢ１8人工遺伝子の作成＞
ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫベクターに入っているＢ１4断片をＳａｌＩとＸｈｏＩで切って得た。ｐＢＸ４ベクター（Ｂ１4断片が挿入されているｐＱＸ３０ベクター、韓国特許公開第２００２−００１８９７１号）をＳａｌＩで切って前記Ｂ１4断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩中結合させた。
【００７２】
＜実施例３：遺伝子塩基配列の決定＞
クローニングされたｐＢ１4Ｔの塩基配列を確認するために、プラスミド濃度を３００〜５００ｎｇ／μＬとして韓国の（株）コアバイオシステムにＤＮＡ塩基配列分析を依頼し、正しいクローンであることを確認した（図３）。
【００７３】
＜実施例４：組み換えＰＢ１4Ｔペプチドの発現＞
ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8は、ｐＱＥ３０ベクターで発現するので、ベクター自体内の開始コドンから蛋白質の発現が始まり、精製を便利にするために６個のヒスチジンも共に発現し、エンテロキナーゼ部位も含んでいる。ペプチドの発現に使用した宿主細胞は、大腸菌Ｍ１５であって、アンピシリンとカナマイシンが含有されたＬＢプレートに塗抹してコロニーを得た後、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）が含有されたＬＢ培地１０ｍＬで一晩中培養した。時間の変化に伴う蛋白質の誘導を調べるために、一晩中培養した培養液中の１ｍＬを新鮮なＬＢ培地５０ｍＬに接種した。本培養液を６００ｎｍで吸光度が０．４〜０．５となるまで３７℃で１時間３０分振とう培養した後、ＩＰＴＧを最終１ｍＭ濃度となるように加え、５時間培養を行い続けて１時間ごとに１ｍＬずつ分取した。ＩＰＴＧを加える前に１ｍＬを予め取って非誘導対照グループとして使用した。それぞれの培養液は、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離してペレットを得た後、２×ＳＤＳサンプル緩衝液３０μＬに溶かしてＳＤＳ−ＰＡＧＥの際にサンプルとして使用した。こうして計算された蛋白質の大きさは、それぞれＰＢ１4Ｔは１６．２ｋＤａ、ＰＢ１8は１６．５ｋＤａであった。時間帯別にサンプルを得てＳＤＳ−ＰＡＧＥによって発現を確認した結果を、図４及び図５に示す。
【００７４】
＜実施例５：組み換えＰＢ１4Ｔペプチドのウェスタンブロット＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて大きさの分析によってＰＢ１4Ｔを確認したが、正確な蛋白質が発現するかを確認するために、ＰＢ１4Ｔを認識することが可能な２つの抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＰＢ１4Ｔウェスタンブロットの対照グループには、Ｍ１５にＢ１4ＴがサブクローニングされていないｐＱＥ３０ベクターのみを形質転換させて使用した。サンプルは、ＩＰＴＧで誘導する前のものと、ＩＰＴＧ誘導３時間後のものにした。１次抗体は、ウサギ抗−ＰＢ１4ポリクローナル抗体、マウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体をＰＢＳに１：１００００で希釈して使用した。１次抗体を認識することが可能な２次抗体は、ペルオキシダーゼが結合している山羊抗−ウサギＩｇＧ、山羊抗−マウスＩｇＧをＰＢＳに１：１００００で希釈して使用した。発色反応は、ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓウェスタンブロットキットを使用し、膜をカセットに入れて富士メディカルのＸ線フィルムを入れた後、１０秒間露出させて現像した。ウサギ抗−ＰＢ１4ポリクローナル抗体はＰＢ１4ＴのＰＢ１4断片を認識する抗体であり、マウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体は、ＰＢ１4ＴのＴ断片を認識する抗体なので、正確に蛋白質が発現すると、２つの抗体を使用したブロックの全てでバンドが現われるべきである。図８に示すように、それぞれの抗体がＰＢ１4ＴのＰＢ１4とＴを認識したので、ＰＢ１4Ｔが正確に発現したことを確認できた。
【００７５】
＜実施例６：組み換えＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8ペプチドのバクテリア細胞位置の確認＞
ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の細胞位置確認は、ＩＰＴＧで誘導してから３時間が経過したサンプルを遠心分離し、それを超音波緩衝液で再懸濁させた後、超音波により得られたペレットと上澄み液それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。具体的に、ＩＰＴＧで発現が誘導された細胞を４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、得られたペレットをしばらく−２０℃で凍らせてから氷上で溶かし、その後超音波分解緩衝液をペレット１ｇに対して５ｍＬの割合で入れて再懸濁した。細胞を溶解させるために、３０秒ずつ１５サイクル（サイクルの間に１分間休止）で超音波粉砕した。４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を分離し、これを可溶性蛋白質の入っている非加工抽出物Ａ（粗抽出物Ａ）として使用し、残っているペレットは、不溶性蛋白質の入っている非加工抽出物Ｂ（粗抽出物Ｂ）として使用した。それぞれのサンプルに２×ＳＤＳサンプル緩衝液を混ぜて９５℃で５分間沸かした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。上澄み液よりはペレットに所望の蛋白質が多量現われることから、不溶性が強いことを確認した（図６及び図７）。
【００７６】
＜実施例７：組み換えＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の精製＞
ペプチドを精製するためにヒスチジンタグ蛋白質用Ｎｉ−ＮＴＡレジンを使用した。レジンに結合しているＮｉ+と末端にヒスチジンヘキサマー融合蛋白質が相互作用する性質を利用することにより親和力を利用したアフィニティクロマトグラフィーの一つの方法である。遺伝子組み換えされた大腸菌を接種したＬＢ培地１０ｍＬを一晩中前培養した後、５００ｍＬのＬＢ培地に全量接種して６００ｎｍで吸光度０．４〜０．５となるまで３７℃で培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭで加え、４時間培養した後、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞ペレット得て−２０℃に置いた。氷上で溶かしたペレットに超音波粉砕緩衝液を湿潤細胞と５ｍＬ／ｇの割合で入れて再懸濁させて超音波粉砕を行った。超音波粉砕をして細胞を溶解させ、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレットを得た。結合緩衝液を、残っている上澄み液の体積と同一の体積となるようにペレットに入れた後、再懸濁させ、細胞残骸を除去するために超音波粉砕を３サイクル行った。これを再び４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して得た上澄み液を精製用サンプルとして使用した。
【００７７】
Ｎｉ−ＮＴＡレジン充填カラムの大きさは直径１ｃｍ、高さ１５ｃｍであり、レジンは２ｍＬ、流速は２ｍＬ／ｍｉｎとした。レジンをカラムに充填した後、３〜５倍体積の蒸留水で洗浄し、５倍体積の１×荷電された緩衝液（５０ｍＭ ＮｉＳＯ4）を流してＮｉ2+を結合させた後、結合緩衝液で平衡化してＮｉ−キレート化親和性樹脂を製造した。レジンにサンプルローディングを２回行った。こうしてサンプルローディングが完了すると、さらに結合緩衝液で１．０範囲の２８０ｎｍ吸光度で基底線に到達するまで流した。その後、洗浄緩衝液で１０分間流し、平衡化が完了すると、洗浄緩衝液から溶出緩衝液にイミダゾールの濃度勾配をかけ、レジンに残留する蛋白質を完璧に溶出させるために溶出緩衝液のみを１０分間さらに流した。分画は層２０個であり、それぞれ２ｍＬずつであった。精製されたペプチドは８Ｍ尿素状態であり、尿素を除去するために、ＰＢＳを用いて一晩中透析を行った。
【００７８】
前述したように、それぞれの蛋白質が強い不溶性を持つため、精製は８Ｍ尿素入り緩衝液で蛋白質を変性させてから行い、樹脂に結合した蛋白質を溶出させるためにイミダゾールを使用し、濃度は５０ｍＭ〜４００ｍＭの濃度勾配で精製した。その結果が図９、図１０及び図１１に示されている。約３００ｍＭのイミダゾール濃度のとき、大部分の蛋白質が溶出した。それぞれの蛋白質の収率は１Ｌ培養の際にＰＢ１8の場合には３〜３．５ｍｇ、ＰＢ１4Ｔの場合には４〜４．５ｍｇであった。
【００７９】
＜実施例８：組み換えＰＢ１4Ｔ、ＰＢ１4及びＰＢ１8ペプチドの定量＞
ＰＢ１4Ｔ、ＰＢ１4、ＰＢ１8は、ＰＢＳで透析を行うと、尿素が除去されるので、蛋白質の凝集による沈殿が発生し、この状態では蛋白質の定量を正確に行うことができなかった。精製された蛋白質の凝集状態を除去するために、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳを使用した。定量は、ＢＣＡ蛋白質定量法、ブラッドフォード法を用いて行った。２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを１０００、５００、２５０、１２５、６２．５μｇ／ｍＬと逐次希釈して標準として用いた。ＢＣＡ分析は、Ｐｉｅｒｃｅ社製のプロトコールによって行い、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍで吸光度を測定し、ブラッドフォード試薬はサンプルと室温で１０分間反応させた後、５９５ｎｍで吸光度を測定し、ＢＳＡの逐次希釈液のＢＣＡ或いはブラッドフォード蛋白質定量発色反応の吸光度を標準定量線として用いてサンプルの蛋白質の濃度を定量した。
【００８０】
＜実施例９：ＰＴＢ１4の発現のためのベクターｐＴＢ１4の製作＞
Ｍ１５大腸菌株に形質転換されている発現用ベクターｐＱＥ３０においてＴカセット（ｐｒｅＳ２）をＫｐｎＩ（Ｔａｋａｒａ）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ）制限酵素で二重切断によって分離し、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔも同一の酵素で処理した。分離したＴカセットとｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔをそれぞれゲル上で確認して分離溶出させ、溶出させたベクターとＴカセットはＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ４μＬ、Ｔカセット４μＬ、リガーゼ１μＬ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、１Ｗｅｉｓｓμ／ｍＬ）、１０×緩衝液（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μＬを１．５ｍＬのチューブに入れて１６℃で一晩中培養させた。組み換えされたベクターをＪＭ１０９細胞と混ぜて４２℃で９０秒間熱衝撃を与えた後、ＬＢ培地を入れて３７℃で１時間培養した。これをＬＢ（Ａｍｐ）培地に接種し、３７℃で培養してコロニーを確認した。確認されたコロニー中の幾つかを任意選択して培養過程、プラスミド分離精製、制限酵素切断を経てアガロースゲル上でＤＮＡ断片のサイズによって確認した。Ｔカセット内にはＸｈｏＩ部位が存在するが、これを無くさなければ、連結されたＴＢ4カセットを得ることができなかった。すなわち、Ｔとは、Ｔカセット（ＨＢＶウィルスのｐｒｅＳ２遺伝子、１８３ｂｐ）の３’末端近く（Ｔカセットの５’を基準として約１５０ｂｐ）にＸｈｏＩ部位が存在してクローニングに使用することができないので、内部のＸｈｏＩ部位を点突然変異させたＸｈｏＩで切られない新しい配列のＴカセットの形態である。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐｒｅＳ２は、Ｔカセット内部のＸｈｏＩ部位により短いＤＮＡ断片（３０ｂｐ）が切り出された。この部分に合成オリゴマーを挿入した。セルフライゲーション(Self-ligation)を防ぐために、ベクターは３７℃、３０分間アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＧｅｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理し、９５℃で５分間脱リン酸させてゲル上で溶出させた。オリゴマーは、３７℃で３０分、６５℃で２０分間処理して５’−リン酸化させた。９５℃で５分間静置反応させた後、熱遮断(heat block)をして徐々に冷やしながらアニーリングさせた。オリゴマーとｐＢ１ｕｅｓｃｒｐｔ−Ｔリガーゼを用いて１６℃で一晩中培養した。組み換えされたｐＢ１ｕｅｓｃｒｔｉｐ−ＴをＪＭ１０９細胞に形質転換導入してＬＢ（Ａｍｐ）培地でコロニーを確認し、コロニー選別過程を経て、所望のプラスミドを持った細胞を確保した。オリゴマーはｐｒｅｓＳ２の当該部分の２８個のヌクレオチドからなっており、但し、ＸｈｏＩ部位を無くすために、センス−オリゴマー５’の５番目のヌクレオチドをＧからＡに変え、これによりアミノ酸配列がアルギニンからリジンに変わった。センスとアンチセンスでそれぞれ２８ｍｅｒを製作してアニーリングさせ、これを、ＸｈｏＩで処理したｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐｒｅＳ２内に挿入した。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＴをＳａｌＩ、ＸｈｏＩで二重切断し、ｐＱＥ３０−Ｂ4をＳａｌＩで処理してそれぞれをゲル上で分離溶出させた。５’側が切り出されたｐＱＥ３０−Ｂ4に、分離されたＴを挿入し、ｐＱＥ３０−ｐＴＢ4を作成した。組み換えされたＴＢ4をＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切ってバンドの大きさを確認した。こうして作成されたベクターをｐＴＢ１4と命名した（図１３）。
【００８１】
＜実施例１０：ＰＴＢ１4の発現及び精製＞
発現ベクターｐＴＢ１4をＭ１５に導入してＬＢ（Ａｍｐ、Ｋａｎ）培地２Ｌに培養した。これを７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して湿潤細胞９ｇを回収した。遺伝子組み換えで発現されたハイブリッドポリペプチドＰＴＢ4は、Ｈｉｓ−Ｔａｇが存在するので、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムは、レジン体積４ｍＬで直径１．８ｃｍ、高さ８ｃｍのものを使用した。Ｅｃｏｎｏ ｓｙｓｔｅｍの吸光度範囲は０．５、記録計の用紙速度は２ｃｍ／ｈｏｕｒ、サンプルローディング速度は２ｍＬ／ｍｉｎに合わせて使用した。まず、湿潤細胞に超音波粉砕緩衝液(sonication buffer)を入れて超音波破砕によって細胞を壊し、４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットのみを結合緩衝液に溶かした後、アフィニティクロマトグラフィーで精製した。まず、結合溶液をカラムに流しながらレジンを沈殿させた。検出器を見ながら、ベースラインを定め、一定の値を指すと、超音波粉砕したサンプルを入れた。サンプルがカラム内に入って再び一定の値を指すまで待ってから洗浄溶液を流し、その後さらに一定の値を指すと、溶出溶液も流してＰＴＢ１4を分離した。発現及び精製されたハイブリッドポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロットで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたＰＴＢ１4を半乾燥トランスファ(semi-dry transfer)を用いて膜に移した。ブロッキング溶液（０．５％ casein−phosphate buffered saline-tween、０．０２％ＮａＮ3）を用いて３７℃で２時間恒温処理した後、Tris-buffered saline-tween（ＴＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．６）で２分ずつ２回洗浄した。その後、１次抗体を３７℃で１時間処理し、ＴＢＳ−Ｔで５分ずつ４回洗浄した。２時抗体も１時間処理した後、同一の方法で洗浄した。Ｔカセットの確認には抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（１：１００００）、山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体（１：１００００）を使用し、Ｂカセットの確認にはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清（１：１００００）、山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体（１：１００００）を使用した。ＥＣＬキット溶液を乾燥膜上に散布して５分間反応させ、これをＥＣＬキットとしてバンドを確認した。その結果、Ｂカセットは、ウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体を用いてＰＢ１4ＴとＰＴＢ１4でのみ約１６ＫＤａのバンドが現われたことを見ることができ、Ｔカセットは、抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体を用いて、ＰＢ１4では約８ｋＤａのバンドが観察され、ＰＢ１4ＴとＰＴＢ１4では１６ｋＤａのバンドが見えてそれぞれのハイブリッドポリペプチドが正確に発現、精製されたことを確認した（図１４）。
【００８２】
＜実施例１１：ＰＢ１4とオボアルブミンとの連結＞
ＰＢ１4をキャリア蛋白質としてのオブアルブミンと連結した。キャリア蛋白質とＰＢ１4のモル比が約１：１０となるようにした。約１時間４℃で反応バイアルで攪拌し、２％グルタルアルデヒド溶液を入れた後、３時間攪拌し、ＰＢＳ緩衝液でＭＷＣＯ３０００透析膜を用いて一晩中透析して残余のグルタルアルデヒドを除去した。
【００８３】
＜実施例１２：ワクチン処理（免疫化）＞
７週齢のＳＤ系白ネズミを６グループに分けてワクチン処理を行った（表１）。実施例７及び実施例１０で精製及び定量したペプチド１００μｇを、表１に示すように、それぞれの補助剤と混合して１００μＬとなるようにして腹腔に注射した。注射は２週間隔で７、９及び１１週齢に３回にわたって行った。補助剤はフロイントアジュバントと水酸化アルミニウムを使用した。フロイントアジュバントはペプチドと同量で混ぜ、水酸化アルミニウムは５．８ｍｇ／ｍＬを最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調整した後、ペプチドと室温で攪拌しながら恒温処理した。最初ブースト５日目、最終ブースト５日目、２週目及び４週目に尻から採血した。
【００８４】
【表１】
【００８５】
前記ワクチン処理後の体重変化を図１５にグラフで示した。最初注射してからブーストするまでは、各グループ別体重が２９２〜２９７ｇと同様であったが、２回注射後１週前からは、ワクチン処理グループ、対照グループおよび模擬グループの体重の差異が見られた。１８週齢のとき、対照グループおよび模擬グループとＰＢ１4注射グループとの体重の差異は１６ｇであり、ＰＢ１4Ｔ注射グループとの体重の差異は２７ｇであった（表２）。これは、最初注射による微弱な免疫反応が２次注射によってブーストされた後、増強した免疫応答反応によって体重の増加が抑制されることを示す。３次注射後にも、体重増加の偏差は維持された。
【００８６】
【表２】
【００８７】
表２において、標準偏差は、５匹のＳＤ系白ネズミに対して計算されたものであり、それぞれの単位はｇで表わす。
【００８８】
＜実施例１３：抗体力価の測定＞
血清サンプルを用いて間接的ＥＬＩＳＡ法によって抗体力価を測定した。微細力価平板(microtiter plate)にＰＢ１4を各ウェルに１００ｎｇの濃度で１００μＬずつ仕込んだ。４℃で一晩中処理した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％カゼイン、０．０２％ＮａＮ3）を添加し、３７℃で１時間恒温処理した。ＰＢＳＴで３回洗い出し、ＳＤ系白ネズミワクチン処理によって得た血清をＰＢＳに１／５００〜１／８０００倍で希釈して１００μＬずつ使用し、３７℃で１時間恒温処理した。各ウェルをＰＢＳＴで３回洗い出し、２次抗体としての山羊抗−白ネズミＩｇＧの１／１０００倍希釈液で培養した。ＯＰＤ発色反応を行い、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００８９】
ＳＤ系白ネズミが１０、１２、１４、１６週齢のとき、ワクチン処理グループで白ネズミの抗体力価を確認した結果が図１６に示されている。力価はそれぞれの血清希釈比を１／２０００にしたとき、ＥＬＩＳＡ結果、吸光度が０．６を基準とした。１／５００〜１／８０００倍で希釈してＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4を注射したグループは、１４週齢までは抗体力価が増加し、ＰＢ１4ＴグループはＰＢ１4よりＯ．Ｄ数値で１．５倍高かったが、ＰＴＢ１4グループはＰＢ１4グループに比べて多少向上した。１６週齢のときは、ＰＢ１4グループでは力価が減少し、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4のグループでは力価が維持されたが、ＰＴＢ１4はＰＢ１4Ｔに比べて約５０〜６０％と著しく弱いことを確認することができた。
【００９０】
＜実施例１４：血清脂質含量の測定＞
ＴＧと総コレステロールの測定は、発色試薬２００μＬに血清４μＬを入れて３７℃で５分間高温処理した後、それぞれ５０５ｎｍ、５００ｎｍで吸光度を測定した。ＨＤＬの測定は、血清と沈澱試薬を１：１で混ぜた後、室温で１０分間放置し、その後３０００ｒｐｍ以上で１０分間遠心分離して得た上澄液を発色試薬２００μＬに４μＬ入れて３７℃で５分間恒温処理した後、５５５ｍｍで吸光度を測定した。ＬＤＬコレステロールの測定はＥＺ ＬＤＬコレステロールキット（Ｓｉｇｍａ社製）を使用し、ＬＤＬカリブレータはＲａｎｄｏｘ社製を使用し、製造社から提供されたプロトコールによってキット内の試薬１１５０μＬに血清４μＬを入れて３７℃で５分間反応させた後、試薬２５０μＬを添加してさらに３７℃で５分間反応し、その後６００ｎｍで吸光度を測定した。各測定シートから得た吸光度と標準試液を比較して濃度を計算した。
ＳＤ系白ネズミへの３次注射後５週目の血清で分析した結果が表３に示されている。
【００９１】
【表３】
【００９２】
表３において、標準偏差は５匹のＳＤ系白ネズミに対して計算されたものであり、それぞれの単位はｍｇ／ｄＬで示した。
【００９３】
対照グループおよび模擬グループでは、全体的にＴＧ及びコレステロールの数値がワクチン処理グループより約１０ｍｇ／ｄＬ（１０ｍｇ／１００ｍＬ）高かった。同じワクチン処理グループにおけるＴＧとＬＤＬコレステロールの数値は、ＰＢ１4で高かったが、その差異は大きくなかった（図１７）。
【００９４】
＜実施例１５：愛玩犬を対象とした臨床実験結果＞
ＰＢ１4Ｔをアジュバントとしてのアルミナと混合した混合物（２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを１０匹の愛玩犬（韓国アンサン動物病院で肥満管理を受けている愛玩犬）に筋肉注射又は皮下注射の形で２週間隔で２回接種した後、１．５〜３ヶ月間体重の変化を観察した。その結果、抗体が徐々に減少する形に維持され（半減期：３ヶ月）、間食を始めとした高脂肪食を無制限提供しても、体重は全く増加していない。具体的に、接種した１０匹の愛玩犬の全てが、間食及び高カロリー食餌を摂取する場合でも体重の増加が抑制されることを確認した。特に、ヨークシャーテリア(Yorkshire terrier)種の場合、性別及び年齢による体重増加が予想される状況でも、ＰＢ１4Ｔの接種により体重が増加しないことを確認することができた。
【００９５】
また、各愛玩犬の血清を採取して抗体誘導の度合いを確認するために、２次接種後１週目に、ＰＢ１4Ｔ或いはＰＢ１4を認識する血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡ実験法で測定した。その結果、５０００〜５００００倍で希釈した血清においても０．５の高い吸光度を示して抗体誘導能も非常に優れた。
【００９６】
【表４】
【００９７】
〔産業上の利用可能性〕
本発明の抗肥満効果を示すアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのＣ末端にヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端を融合させたハイブリッドポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープの有利な活性または効果を中和させる免疫反応を誘導するか有害な副作用を起すことなく、優れた免疫増強効果を示して肥満の予防または治療に効果的に使用できる。
特許手続き上微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
このページの下端に確認された国際寄託当局から規則7.1に基づいて発行された原寄託申請の受託証
To：Ｈｙｏ Ｊｏｏｎ Ｋｉｍ．
韓国（〒４２５−７９１）京畿道安山市常緑樹区四１洞漢陽大学校ＨＢＩ６０４
┌──────────────────────────────────────┐
Ｉ．微生物表示 │
├─────────────────┬────────────────────┤
寄託者によって与えられた識別番号： 国際寄託当局によって与えられた受託番号 │
Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ ： │
│ ＫＣＣＭ−１０５６２ │
├─────────────────┴────────────────────┤
II. 科学的性質および／または提示された分類学的表示 │
├──────────────────────────────────────┤
前記Ｉで識別された微生物は、下記のとおりである。 │
［ ］科学的性質 │
［ ］提示された分類学的表示 │
（該当欄にＸ表示） │
├──────────────────────────────────────┤
III．受付および受託 │
├──────────────────────────────────────┤
本国際寄託当局は、前記Ｉに表示された微生物が２００４年３月４日付で受付され │
たことを確認する。（原寄託日）1 │
├──────────────────────────────────────┤
IV．国際寄託当局 │
├───────────────────┬──────────────────┤
名称：韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ 本国際寄託当局を代表する委任状を有 │
） する者又は権限保有職員の署名 │
住所：韓国（〒１２０−０９１）ソウル市 │ │
西大門区弘済１洞３６１−２２１ 日付：２００４年３月１２日 │
ユリムビル │ │
└───────────────────┴──────────────────┘
1 規則６．４（ｄ）適用、この日付は国際寄託当局の資格を得た日付であるが、国際寄託当局の資格の獲得後、ブダペスト条約の外でなされた寄託がブダペスト条約下の寄託に転換される場合、この日付は国際寄託当局が微生物を受付けた日付である。
書式ＢＰ／４ 単一ページ
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ｐＢ１4Ｔの製作図を示す。
【図２】ｐＢ１4Ｔの制限酵素切断を示す。
【図３】ＤＮＡ配列から類推したｐＢ１4Ｔの一次構造を示す。
【図４】形質転換された大腸菌(Escherichia coli)Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔを、ＩＰＴＧでｐＢ１4Ｔの発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１4Ｔは矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー；レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン３〜７：ＩＰＴＧ誘導１、２、３、４及び５時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【図５】形質転換された大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8を、ＩＰＴＧでＰＢ１8の発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１8は矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー、レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン2〜5：ＩＰＴＧ誘導１、２、３及び4時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8。
【図６】大腸菌溶解物(lysate)のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、上澄液（レイン１）と沈殿物（レイン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１4Ｔは、矢印で表示したように沈澱物に現われた。
【図７】大腸菌溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、全体溶解物（レイン１）、上澄液（レイン２）及び沈澱物（レイン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１8は、矢印で表示したように沈殿物に現われた。
【図８】精製されたＰＢ１4Ｔペプチドをウェスタンブロット分析した結果である。抗ＰＢ１4ウサギ抗体（Ａ）と抗ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（Ｂ）を用いてＰＢ１4Ｔを分析した。レイン１：大腸菌Ｍ５、レイン２：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ、レイン３：ＩＰＴＧ誘導３時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【図９】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4溶出プロファイルを示す。
【図１０】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4Ｔ溶出プロファイルを示す。
【図１１】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１8溶出プロファイルを示す。
【図１２】ｐＴＢ１4の製作図を示す。
【図１３】精製されたＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4をウェスタンブロット分析した結果である。パネルＡはマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認し、パネルＢはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認した。
【図１４】ＤＮＡ配列から類推したＴＢ１4／ｐＱＥ３０の一次構造を示す。
【図１５】対照グループ(normal)、模擬グループ(mock)、ワクチン処理グループにおけるＳＤ系白ネズミの体重増加を比較したグラフを示す。対照グループ（■）はＰＢＳで注射され、模擬グループ（▲）はオボアルブミンで注射された。ワクチン処理グループはＰＢ１4を媒体蛋白質ＯＶＡに抱合させたＰＢ１4＋ＯＶＡ（◆）ペプチドとＰＢ１4Ｔ（●）ペプチドで注射された。このようなペプチド注射は、２週間隔で３回ずつ行われた。矢印は、ワクチン処理の時点を示す。
【図１６】抗−ＰＢ１4、抗−ＰＢ１4Ｔ及び抗−ＰＴＢ１4の抗体力価変化を測定した結果である。
【図１７】血清内トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール量を測定した結果である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドとヘルパーＴ細胞エピトープを含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープ部分のＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチド、及びこれを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
最近、韓国では、西欧的食生活の影響で動脈硬化症及び冠状動脈疾患（coronary atherosclerotic disease：ＣＡＤ）が益々増加しつつあり、これによる死亡率も高くなってきている。この種の疾患の原因となる血清脂質としては、コレステロール(cholesterol)、トリグリセリド(triglyceride：ＴＧ)、遊離脂肪酸(free fatty acid)、リン脂質(phospholipid)などがあり、アポリポ蛋白質(apolipoprotein)と共にリポ蛋白質を形成して血液循環によって運搬されている。中でも、ＬＤＬ(low density lipoprotein)は主にＴＧやコレステロールの運搬を担当しており、ＬＤＬ−コレステロール数値の変化は前述したような疾病の予後を示す尺度となる。
【０００３】
脂質代謝に関連した成人病の主要因子であるＬＤＬ−コレステロールは、各組織の細胞膜のＬＤＬ受容体に結合して組織内に蓄積、活用されるか、スカベンジャー細胞により捕獲されてから加水分解されて遊離コレステロールの形でアポＥリポ蛋白質と共にＨＤＬへ伝達されて肝で再活用されるか、胆汁酸の形に処理されて排泄される経路が明らかになっている。この過程において、アポリポ蛋白質は、リポ蛋白質の構造的恒常性を保ち、脂肪質分解酵素の補助因子機能、及び細胞膜上の特定の受容体と結合する非常に重要な機能を行っている。
【０００４】
アポリポ蛋白質Ｂ−１００（Ａｐｏ Ｂ−１００）は、このような低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の主な蛋白質成分であり、またＩＤＬ、ＶＬＤＬ、キロミクロン(chylomicron)に存在しているため、血中にある抗体がＡｐｏ Ｂ−１００を認識するように誘導すると、食細胞によるＬＤＬ−消去(clearance)が容易に起こり得るであろう。これを根拠とし、最近、ワクチンを用いてＬＤＬ−コレステロールの数値を低め且つ動脈硬化を減少させるための研究が行われている。このような抗−コレステロールワクチン療法により誘導された抗体はＩｇＭタイプであり、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＬＤＬと結合するものと思われるが、このことから高コレステロール及びアテローム性動脈硬化症に対する予防及び治療用ワクチンの可能性が提示されている(Bailey, et al., Cholesterol vaccines. Science 264, 1067-1068, 1994; Palinski W et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 821-5, 1995; Wu R. de Faire U et al., Hypertension. 33, 53-9, 1999)。また、アポリポ蛋白質Ｂ−１００は、４５６０個のアミノ酸残基（２４個のシグナルペプチドを含む）からなる巨大な蛋白質分子であって、分子量は５００ｋＤａを超過する(Elovson J et al., Biochemistry, 24: 1569-1578, 1985)。主に肝から分泌される両親媒性の分子なので、リポ蛋白質のリピドとの相互作用が可能であり、水溶液の環境とも相互作用が可能である(Segrest J. P et al., Adv. Protein Chem., 45: 303-369, 1994)。アポリポ蛋白質Ｂ−１００は、ＬＤＬ粒子の大きさと構造を安定化させる役割と、収容基との結合によって血漿内ＬＤＬコレステロールの恒常性を調節するのに重要な役割をする(Brown MS et al., Science, 232 : 34-47, 1986)。
【０００５】
本願の発明者により出願された韓国特許公開第２００２−００１８９７１号では、Ａｐｏ Ｂ−１００のエピトープに対するミメティックペプチド(mimetic peptide)が抗肥満効果を持つと記述している。ところが、前記出願では、単に、前述したＢ細胞のエピトープであるミメティックペプチドが抗肥満効果を示すことを開示している。
【０００６】
本発明の前には、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとを融合させて免疫原性を増強させようとしたことがなく、免疫反応を増強させるために蛋白質キャリアまたは補助剤として使用した試みのみがあった。
【０００７】
米国特許第５，８４３，４４６号では、ＬＨＲＨの免疫原性を増強させるために、ＬＨＲＨにこれとは異なる蛋白質を結合させることができるが、この場合、主要免疫反応がＬＨＲＨに対して誘導されるよりは、結合したキャリア蛋白質に対して誘導され、却ってＬＨＲＨに対する免疫抑制が誘導されるおそれがあるという問題について記述している。これから分かるように、Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強させるための追加物質の選別、結合方式、結合位置などについての研究開発は、持続的な努力が必要である。
【０００８】
ハプテンの免疫原性を高めるために媒体蛋白質と融合させようとする試みがたくさんあったが、一律的な相乗効果を得ることはできなかった。特に、本発明のようなＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとの線形連結の際に、これらの方向性、それぞれのエピトープの種類などによって寧ろ免疫原性が消失してしまう場合もあり(Francis, M. J. et al., Nature 330: 168-170, 1987)、リンカーの存在により抗原性が減少する場合も発生した(Partidos, C. et al., Mol. Immunol. 29:651-658, 1992)。このようにペプチドワクチンのデザインに一貫的に適用することが可能な様態が存在せず、デザインされたワクチンの効能も予測することができない。同一の理由から、疎水性が非常に強いＰＢ１4ペプチドを、異種のペプチドであるＴ細胞エピトープと融合させる場合、抗原性を示す部位を分子の内部に取り入れて抗体誘導能の低下をもたらす可能性も排除することができない。
【０００９】
このような背景の下で、本発明者らは、抗肥満効果を示すアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドであるＰＢ１4を増強させるために様々な試みを重ねた結果、ミメティックエピトープのＣ末端にヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端を融合させたハイブリッドポリペプチドが優れた免疫増強効果を示し、肥満の予防または治療に効果的に使用できることを確認した。このようなハイブリッドポリペプチドが、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープの有利な活性または効果を中和させる免疫反応を誘導するか有害な副作用を起すことなく、優れた抗肥満活性を示すことができるということは、全く類推できない効果であった。
【００１０】
〔発明の開示〕
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
【００１１】
他の様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端がヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端と融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチンを提供する。
【００１２】
別の様態として、本発明は、前述した免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む形質転換体、及び前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して前記ハイブリッドポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００１３】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【００１４】
図１はｐＢ１4Ｔの製作図を示す。
【００１５】
図２はｐＢ１4Ｔの制限酵素切断を示す。
【００１６】
図３はＤＮＡ配列から類推したｐＢ１4Ｔの一次構造を示す。
【００１７】
図４は形質転換された大腸菌(Escherichia coli)Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔを、ＩＰＴＧでｐＢ１4Ｔの発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１4Ｔは矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー；レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン３〜７：ＩＰＴＧ誘導１、２、３、４及び５時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【００１８】
図５は形質転換された大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8を、ＩＰＴＧでＰＢ１8の発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１8は矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー、レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン2〜5：ＩＰＴＧ誘導１、２、３及び4時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8。
【００１９】
図６は大腸菌溶解物(lysate)のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、上澄液（レイン１）と沈殿物（レイン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１4Ｔは、矢印で表示したように沈澱物に現われた。
【００２０】
図７は大腸菌溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、全体溶解物（レイン１）、上澄液（レイン２）及び沈澱物（レイン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１8は、矢印で表示したように沈殿物に現われた。
【００２１】
図８は精製されたＰＢ１4Ｔペプチドをウェスタンブロット分析した結果である。抗ＰＢ１4ウサギ抗体（Ａ）と抗ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（Ｂ）を用いてＰＢ１4Ｔを分析した。レイン１：大腸菌Ｍ５、レイン２：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ、レイン３：ＩＰＴＧ誘導３時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【００２２】
図９はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4溶出プロファイルを示す。
【００２３】
図１０はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4Ｔ溶出プロファイルを示す。
【００２４】
図１１はイミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１8溶出プロファイルを示す。
【００２５】
図１２はｐＴＢ１4の製作図を示す。
【００２６】
図１３は精製されたＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4をウェスタンブロット分析した結果である。パネルＡはマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認し、パネルＢはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認した。
【００２７】
図１４はＤＮＡ配列から類推したＴＢ１4／ｐＱＥ３０の一次構造を示す。
【００２８】
図１５は対照グループ(normal)、模擬グループ(mock)、ワクチン処理グループにおけるＳＤ系白ネズミの体重増加を比較したグラフを示す。対照グループ（■）はＰＢＳで注射され、模擬グループ（▲）はオボアルブミンで注射された。ワクチン処理グループはＰＢ１4を媒体蛋白質ＯＶＡに抱合させたＰＢ１4＋ＯＶＡ（◆）ペプチドとＰＢ１4Ｔ（●）ペプチドで注射された。このようなペプチド注射は、２週間隔で３回ずつ行われた。矢印は、ワクチン処理の時点を示す。
【００２９】
図１６は抗−ＰＢ１4、抗−ＰＢ１4Ｔ及び抗−ＰＴＢ１4の抗体力価変化を測定した結果である。
【００３０】
図１７は血清内トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール量を測定した結果である。
【００３１】
〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は、アポリポ蛋白質に対する免疫原性を強化させるための一つの方法として、アポリポ蛋白質、特にアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープが融合した形の免疫原性ハイブリッドペプチドを提供しようとする。このように、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープを連結した結果、抗体誘導能が強化されたうえ、ワクチン効能期間が延長されて優れた抗肥満効果を示した。
【００３３】
本発明で使用される用語「エピトープのミメティックペプチド」は、エピトープの最小部分を模倣するペプチドであって、抗体によって認識できるように天然エピトープと十分類似であるか、天然エピトープと交差反応する抗体を増加させることが可能なエピトープを意味し、ミモトープ(mimotope)ともいう。このようなミメティックペプチドは、生体内で非自己(non-self)と認知されるという利点があり、その場合、免疫反応において自己寛容(self tolerance)の問題を克服することができるという長所がある。前述したアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドは、アポリボ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体によって認識され、アポリポ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００を特異的に認識して結合するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を含み、これらの断片、例えばＦｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２なども含む。特にモノクローナル抗体が好ましく、より好ましくはＭａｂ Ｂ９及びＭａｂ Ｂ２３が使用される。
【００３４】
本発明において、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含む。したがって、好ましい様態において、本発明は、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含み、アポリポ蛋白質Ｂ−１００と特異的に結合する抗体によって認識されるペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ポリペプチドに関する。
【００３５】
本発明者らは、ファージディスプレイペプチドライブラリ(phage displayed peptide library)からバイオパニング(biopanning)を用いてアポリポ蛋白質Ｂ−１００に対するモノクローナル抗体Ｍａｂ Ｂ９またはＭａｂ Ｂ２３によって認識できるミメティックペプチド（配列番号１、２及び３）を究明した。
【００３６】
前述した配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含むアポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドは、前記配列番号のアミノ酸配列１個からなる単量体の形であってもよいが、免疫原性を一層増強させるために前記配列番号のアミノ酸配列が２個以上、好ましくは３〜８個、より好ましくは３〜６個が連結された多量体の形を取ってもよい。最も好ましくは、４個が連結された四量体（配列番号４）である。多量体の形を取る場合、単量体を形成するアミノ酸配列は、直接またはリンカーを介して共有結合で連結できる。リンカーを介して連結される場合、アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスバラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンを１個〜５個ずつ使用して連結させることができ、使用可能な好ましいアミノン酸としては、バリン、ロイシン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、プロリンを例示することができる。より好ましくは遺伝子操作の容易性を考慮してバリン、ロイシン、アスパラギン酸などの中から選択された２つのアミノ酸を連結して使用することができる。好ましくは、前記配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が前記リンカーを介して２個以上連結されたミメティックペプチドが使用される。
【００３７】
本発明において「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、適当な効率でＭＨＣクラスII分子に結合することができ、Ｔ細胞を刺激し或いはＭＨＣクラスIIとの複合体でＴ細胞と結合することができるアミノ酸配列を意味する。その場合、Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞上に存在する特定の受容体によって認識され、Ｂ細胞が抗体生産細胞に分化するのに要求される信号を提供する役割も果たし、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導して標的細胞の溶菌を誘導する。Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞を刺激させ且つ免疫反応を強化する限り特定なものと限定されず、目的に適した多様な蛋白質、ペプチドなどが使用可能である。本発明の目的上、Ｔ細胞エピトープは、ヘルパーＴ細胞エピトープが好ましく使用される。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト(Plasmodium falciparum circumsporozoite)ヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、破傷風トキソイド(Tetanus toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、麻疹(measles)ウィルスＦ蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、 百日咳ワクチン(pertussis vaccine)、ＢＣＧ(Bacile Calmette-Guerin)、ポリオワクチン(polio vaccine)、流行性耳下腺炎ワクチン(mumps vaccine)、 風疹ワクチン(rubella vaccine)、狂犬病ワクチン(rabies vaccine)、ツベルクリンの精製蛋白質誘導体、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)、これらの断片または配合物などに由来したＴ細胞エピトープ配列を含むことができる。前述したＴ細胞エピトープは、特定の目的に応じて選択されたアミノ酸残基を添加、欠失、置換して使用することができ、また２つ以上の相異なるＴ細胞エピトープが結合している多量体の形でも提供できる。本発明の具体例では、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原を使用した。Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）遺伝子の大きさは３．２ｋｂであって、大きく４種の重要な蛋白質に対する情報を持っており、Ｓ遺伝子（表現抗原蛋白質）、Ｃ遺伝子（コア蛋白質）、Ｐ遺伝子（ＤＮＡ重合酵素）及びＸ遺伝子から構成されている。Ｓ遺伝子の場合、ＨＢｓＡｇをコードしているＳ領域とｐｒｅＳ領域に分けられる。ｐｒｅＳ領域は、ＨＢＶの菌株に応じて１０８または１１９個のアミノ酸をコードしているｐｒｅＳ１と、サブタイプに関係なく５５個のアミノ酸残基からなるｐｒｅＳ２とに分けられる。ＨＢＶ ｐｒｅＳ２蛋白質は、体内免疫反応過程でヘルパーＴ細胞を活性化させ、これはＨＢＶに対する抗体の形成を促進させることができる。
【００３８】
本発明で使用された用語「ハイブリッドポリペプチド」とは、一般に、起源の異なる異種ペプチドが連結された形のペプチドをいい、本発明では、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとを連結した形のペプチドを意味する。このようなハイブリッドポリペプチドは、それぞれのパトナーが決定された後、化学的に合成するか、遺伝子組み換え方法で発現及び精製して得ることができる。好ましくは、Ｂ細胞エピトープをコードする遺伝子配列とＴ細胞エピトープをコードする遺伝子配列とを連結したハイブリッド遺伝子を細胞発現システムで発現させて提供される。このようなハイブリッドポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとが直接或いはリンカーなどの連結子を介して連結できる。リンカーを介して連結される場合、これによる免疫反応の誘導に不利な影響を及ぼさないように選定されるべきである。
【００３９】
本発明で使用された用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸を含む残基が共有ペプチド結合によって結合した全長のアミノ酸鎖を含む用語であって、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどがこれに含まれるが、特に、本発明では、数個〜数十個のアミノ酸が共有結合したペプチド２種以上が互いに連結されたハイブリッドポリペプチドを意味する。本発明のハイブリッドポリペプチドは、２種以上のペプチド、例えばＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープとが連結されたポリペプチドである。ポリペプチドを構成するそれぞれのペプチド配列は、前述したようなエピトープに該当する配列を含み、それに隣接して配置された配列も共に含むことができる。これらのペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または２つの相異なる配置のアミノ酸の多様な組合せを取ることができる。本発明のハイブリッドポリペプチドは、全的に前述したようなＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、及び任意にその隣接配列を含んだ抗原性部分のみからなってもよく、付加配列を含んでもよい。ところが、このような付加配列は、全体免疫原性(immunogenicity)を減少させないことが好ましい。このような付加配列としては、リンカー配列を例示することができる。
【００４０】
本発明で使用された用語「免疫原性」とは、細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導して異物に対して対処する能力をいう。このような免疫反応を誘導する物質を免疫原と呼ぶ。本発明は、免疫原性物質として、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープを両方とも備えるポリペプチドを使用する。
【００４１】
本発明者らは、Ｂ細胞エピトープを持っているが、それ自体ではＴ細胞エピトープ部分が欠如している抗肥満機能的ペプチドであるＡｐｏ Ｂ−１００ミメティックペプチドの四量体ＰＢ１4のＣ末端部分と、Ｔ細胞エピトープを持っているＨＢＶのｐｒｅＳ２の一部（Ｔ断片）とを連結し、ＰＢ１4Ｔの発現用遺伝子断片を製作した（図１）。ＰＢ１4断片を得るためにＢａｍＨＩとＸｈｏＩを、Ｔ断片を得るためにＳａｌＩとＨｉｎｄIIIを使用し、ＰＢ１4Ｔの遺伝子断片とベクターｐＱＥ３０とを結合して大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。制限酵素切断（図２）とＤＮＡ配列分析（図３）によってＴ細胞エピトープとＢ細胞エピトープ部分とが連結されている正しいクローンであることを確認し、このクローンをｐＢ１4Ｔと命名した。ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の発現のためにｐＱＥ３０ベクターを使用したが、ベクター自体内にある開始コドンから蛋白質の発現が始まり、精製を便利にするための６個のヒスチジンも共に発現し、エンテロキナーゼ(enterokinase)部位も発現する。このように発現する蛋白質の大きさは、ＰＢ１4Ｔは１６．２ｋＤａであり、ＰＢ１8は１６．５ｋＤａであった。時間帯別にサンプルを得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって発現を確認した（図４、図５）。
【００４２】
したがって、本発明の具体的な実施様態によって四量体のアポリポ蛋白質Ｂ−１００のミメティックペプチドとＢ型肝炎ウィルスの表面抗原ｐｒｅＳ２とが連結された配列番号９の免疫原性ハイブリッドポリペプチドが提供できる。
【００４３】
本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドは、化学的に合成するか、遺伝子組み換え方法によって生産することができ、好ましくは組み換えベクターを用いてこれを宿主細胞に形質転換させ、これから発現されたポリペプチドを分離、精製して生産することができる。
【００４４】
したがって、他の様態として、本発明は、前記免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクトル、及び前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００４５】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して前記免疫原性ハイブリッドポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００４６】
遺伝子組み換え方法によって本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを生産する過程は、次の段階を含む。
【００４７】
第１段階は、ハイブリッドペプチドをコードする遺伝子をベクターに挿入して組み換えベクターを製造する段階である。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウィルス、コスミドなど多様な形のベクターを使用することができる。組み換えベクターは、クローニングベクター及び発現ベクターを含む。クローニングベクターは、複製基点、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドの複製基点を含み、他のＤＮＡ切片が付着し、付着している切片が複製できる「レプリコン」である。発現ベクターは、蛋白質の合成に使用されるように開発された。組み換えベクターは、通常、外来ＤＮＡの断片が挿入されたキャリアであって、一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。本願において、「外来ＤＮＡ」とは、外来種から起源するＤＮＡを意味し、或いは同一の種から起源する場合には本来の形から実質的に変形された形を意味する。また、細胞で正常的に発現しない非変化ＤＮＡ配列も含む。この場合、外来遺伝子は、転写される特定の目的の核酸でポリペプチドを暗号する。組み換えベクターは、宿主細胞における形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。前記組み換えベクターは、個体の細胞内で遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物であって、このような遺伝子作製物を製造するために、標準組み換えＤＮＡ技術を利用することができる。組み換えベクターの種類は、原核細胞または真核細胞の各種宿主細胞で目的の遺伝子を発現させ、目的の蛋白質を生産する機能を行うものであれば、特に限定されないが、強力な活性を示すプロモータと強い発現力を保有しながら自然状態と類似な形の外来蛋白質を大量生産することが可能なベクターが好ましい。組み換えベクターは、少なくともプロモータ、開始コドン、目的の蛋白質を暗号化する遺伝子、終結コドンターミネータを含んでいることが好ましい。その他に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、目的の遺伝子の５’側と３’側の非解読領域、選別マーカー領域、または複製可能単位などを適切に含むこともできる。
【００４８】
第２段階は、前記組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換させた後、培養する段階である。組み換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造するための方法としては、文献（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual（２版）、Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃(gene gun)などを利用することができる。前記組み換えベクターが発現する形質転換体を栄養培地で培養すると、有用な蛋白質を大量に製造、分離可能である。培地と培養条件は、宿主細胞に応じて、寛容されるものを適切に選択して用いることができる。培養の際に細胞の生育と蛋白質の大量生産に適するように温度、培地のｐＨ及び培養時間などの条件を適切に調節しなければならない。本発明に係る組み換えベクターで形質転換できる宿主細胞は、原核細胞と真核細胞を両方とも含み、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常用いられる。細菌、例えばエシェリキア、シュードモナス、バシラス、ストレプトミセス、真菌、酵母などの周知の真核及び原核宿主、ＳＦ９(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０などの動物細胞などが使用できる宿主細胞の例である。好ましくは、大腸菌が使用できる。
【００４９】
第３段階は、ハイブリッドペプチドの発現を誘導、蓄積する段階である。本発明では、誘導因子ＩＰＴＧを用いてペプチドの発現を誘導し、誘導時間は蛋白質の量を最大化されるように調節した。
【００５０】
第４段階は、ハイブリッドペプチドを分離、精製する段階である。一般に、組み換え的に生産されたペプチドは、培地または細胞分解物から回収できる。膜結合型の場合、適切な界面活性剤溶液（たとえばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）を使用し、或いは酵素的切断によって膜から遊離できる。ハイブリッドペプチドの発現に使用された細胞は、凍結−解凍反復、音波処理、機械的破壊または細胞分解剤などの多様な物質的または化学的手段によって破壊でき、通常の生化学分離技術によって分離、精製可能である(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990)。電気泳動、遠心分離、ゲルろ過、沈澱、透析、クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着アフィニティクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透ＨＰＬＣ）、等電点電気泳動法、並びにその多様な変化及び複合方法を含むが、これらに局限されない。
【００５１】
本発明では、具体的にＰＢ１4Ｔの遺伝子断片をベクターｐＱＥ３０と結合して大腸菌に形質転換した。ｐＱＥ３０は、ファージＴ５プロモータからなるプロモータとＩＰＴＧを誘導剤として使用するｌａｃオペレーターシステムを持っている、大腸菌から蛋白質を大量生産するのに有用なベクターである。ＰＢ１4Ｔを認識することが可能な２つの抗体、１次抗体はウサギ抗−ＰＢ１４ポリクローナル抗体とマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体を使用するウェスタンブロットによって正しく発現することを確認し、蛋白質の精製を始めた。ＰＢ１4とＰＢ１4Ｔは不溶性なので、８Ｍ尿素に変性させた後、ヒスチジンタグ（ｔａｇ）蛋白質用Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いてＰＢ１4とＰＢ１4Ｔを精製した。
【００５２】
上述したように発現及び精製したポリペプチドをマウスに接種した後、それによる体重の増加、血清内抗体力価、血清内脂質含量の変化を分析した。その結果、ハイブリッドポリペプチドでワクチン化されたグループが、対照グループ、またはハイブリッドされていないミメティックペプチドでワクチン化されたグループに比べて体重増加が抑制され、ミメティックペプチドに対する抗体力価が高く、残存期間が長く、ＴＧ及びＬＤＬ−コレステロールの数値も低くなることを確認した。
【００５３】
ペプチドワクチンのデザインに一貫的に適用することが可能な様態が存在せず、デザインされたワクチンの効能も予測することができない。同一の理由から、疎水性が非常に強いＰＢ１4ペプチドを異種ペプチドであるＴ細胞エピトープと融合させる場合、抗原性を示す部位を分子の内部に取り入れて抗体誘導能の低下をもたらす可能性も排除することができない。このようにその結果を類推し難い状況で、本発明者らは、アポリポ蛋白質のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドにＴ細胞エピトープを連結したハイブリッドポリペプチドを設計し、抗肥満に対する増加した免疫原性を立証した。
【００５４】
人工合成ハイブリッドポリペプチド及びこれを含むワクチンの免疫原性は、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープが存在しなければならず、また、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープとの連結順序(orientation)によってワクチンの効能が異なる。すなわち、ヘルパーＴ細胞のエピトープがＢ細胞エピトープのＮ末端に位置するか、Ｃ末端に位置するかによって抗体誘導能が異なる(Partidos, C, Stanley, C, and Steward, M, The effect of orientation of epitope on the immunogenicity of chimeric synthetic peptides representing measles virus protein sequences, Molecular Immunology,29(5),651-658,1992)。
【００５５】
本発明者らは、Ｂ細胞エピトープとヘルパーＴ細胞エピトープとの連結順序による免疫誘導効果の差異を確認するために、前記ＰＢ１4のＣ末端部分とＴ断片とを連結して製作したＢ１4Ｔ遺伝子断片とは異なり、ＰＢ１4のＮ末端部分とＴ断片とを連結してＴＢ１4遺伝子断片を製作した（図１２）。具体的に、実施例９による方法によってベクターｐＴＢ１4を製作し、大腸菌Ｍ１５に形質転換させて発現させ、発現したハイブリッドポリペプチドＰＴＢ１4は、Ｈｉｓ−Ｔａｇが存在するので、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行って精製した。
【００５６】
ＰＴＢ１4とＰＢ１4Ｔの抗体誘導反応性及び免疫原性を比較するために、白ネズミを用いて免疫化した後、採血してこれを比較した。ＰＴＢ１4の抗体誘導能はＰＢ１4よりは多少向上しており、残存期間の長期化現象を示したが、ＰＢ１4Ｔに比べて約５０〜６０％程度に著しく弱いことを確認することができた（図１６）。これは、体重増加抑制効能においても同一の結果を示した（表２）。前述したように、本発明のＰＢ１4のＣ末端部分とＴ断片とを連結して製作したＰＢ１4Ｔポリペプチドの免疫原性及び肥満抑制効能がより優れることを確認することができた。
【００５７】
したがって、別の様態として、本発明は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００のエピトープのミメティックペプチドのアミノ酸配列を含み、前記ミメティックペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端とが融合した免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチンを提供する。
【００５８】
免疫原が示す反応の大きさ及び観察された個体の比率を比較すると、優れた効果を示すワクチンとして使用できるかどうかを判断することができる。本発明では、肥満予防及び治療用ワクチンという元々の発明の目的に合うように、（ａ）体重の増加推移観察、（ｂ）血清内抗体力価の観察、及び（ｃ）血清内脂質含量の変化によって免疫反応効果を検定し、抗原の優れた形態を立証した。
【００５９】
具体的に、７週齢ＳＤ系白ネズミ(rat)の抗原注射による体重の変化を、精製ＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔのペプチド１００μｇを腹腔に２週間隔３回注射した後、体重増加グラフで確認した（図１５）。１次注射とブーストのときまでは各グループの身体質量は２９２〜２９７ｇと同様であったが、２回注射の１週後から、ワクチン化されたグループが対照グループ及び模擬グループとは差異を示し始めた。これは、最初注射による微弱な免疫反応が２次注射によってブーストされた後、増強した免疫応答反応によって体重増加が抑制されることを示す。対照グループ及び模擬グループよりはワクチン処理したときに体重の増加程度が減少し、また、ＰＢ１4形態のペプチドよりＰＢ１4Ｔ形態のペプチドがより優れた体重増加抑制効果を示す（表２）。３次注射後にも、体重増加の偏差は維持された。また、キャリア蛋白質であるオボアルブミンを抱合させた形のＰＢ１4よりは均質なキメラ抗原ＰＢ１4Ｔが免疫応答反応を効率よく誘導することを確認することができた。ワクチン処理されたグループにおけるＳＤ系白ネズミの抗体力価は、１０、１２、１４、１６週齢でＥＬＩＳＡ分析した（図１６）。ＰＢ１4Ｔを注射したグループがＰＢ１4を注射したグループに比べて抗体力価が増加し、１４週齢では、ＰＢ１4Ｔでワクチン処理されたグループが、ＰＢ１4ワクチン処理されたグループよりＯ．Ｄ数値が１．５倍高かった。１６週齢では、ＰＢ１4グループにおいて力価の減少が現われたが、ＰＢ１4Ｔグループは力価の増加が維持された。血清内脂質水準は、ワクチン処理されたグループが、対照グループ及び模擬グループより全体的にＴＧ及びコレステロールの数値が低かった。特に、ＬＤＬ−コレステロールは正常値の６０％水準と低くなった（図１７）。
【００６０】
前記結果は、Ｂ細胞エピトープであるＰＢ１4のみが在る形態より、Ｔ細胞エピトープが共に融合している形態が一層高い免疫原性を示し、効果的なワクチン組成物として使用できることを立証する。
【００６１】
また、本発明者らは、ＰＢ１4Ｔの効能を愛玩犬を対象として臨床実験した。ＰＢ１4Ｔをアルミナと混合して１０匹の愛玩犬に２週間隔で２回接種した後、体重変化を観察した結果、間食を始めとした高脂肪食を無制限提供しても、体重の増加は全く観察されなかった（表４）。抗体誘導の度合いにおいても、２次接種後、各愛玩犬の血清を採取して抗体力価をＥＬＩＳＡ実験法によって測定した結果、５０００〜５００００倍希釈した血清でも高い吸光度を示して優れた効果を発揮した。
【００６２】
本発明の抗肥満ワクチンは、抗原、薬剤学的に許容可能な担体、適切な補助剤、その他の通常の物質からなり、免疫学的効果量で投与する。本発明において、「免疫学的効果量」とは、肥満治療及び予防効果を示すことができる程度の十分な量と、副作用や深刻なまたは過度な免疫反応を起さない程度の量を意味し、正確な投与濃度は投与される特定の免疫原によって異なり、免疫反応の発生を検査するために、当業者が公知の方法を用いてこれを決定することができる。また、投与形態及び経路、収容者の年齢、健康及び体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、及び治療回数によって変化できる。担体は、当分野に公知になっているもので、安定化剤、希釈剤、緩衝液を含む。適切な安定化剤は、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、澱粉、糖、デキストラン及びブドウ糖などの炭水化物；アルブミンまたはカゼインなどの蛋白質などを含む。適切な希釈剤には塩、ハンクス平衡塩、リンガー液などを含む。適切な緩衝液には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ土金属炭酸塩などを含む。また、ワクチンには、免疫反応を改善または強化させるために、少なくとも一つの補助剤などを含む。適切な補助剤には、ペプチド；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；Ｍａｒｃｏｌ ５２などのミネラル油または植物性油及び少なくとも一つの乳化剤からなる組成物、またはリゾレシチン、多価陽イオン、多価陰イオンなどの表面活性物質などが含まれる。本発明のワクチン組成物は、個別治療剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次または同時に投与してもよい。ワクチン組成物は、公知の投与経路によって投与される。このような方法には、経口、経皮、筋肉、腹膜、静脈、皮下、鼻腔経路を利用することができるが、これらに局限されない。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へ移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００６３】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
〔実施例〕
＜実験材料＞
ＤＮＡミニプレップキット(miniprep kit)とゲルからＤＮＡを抽出するために使用されたキットはＮｕｃｅｌｏｇｅｎ製を、細胞培養に必要なバクト−トリプトン(bacto-trypton)、バクト−酵素抽出物(bacto-yeast extract)、アガ(agar)などは、Ｄｉｆｃｏ社（Ｄｅｔｒｏｔｉ、ＭＩ）製を、制限酵素はＴａｋａｒａ製を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＮＥＢ製をそれぞれ使用した。ベクターはｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用し、菌株は大腸菌ＪＭ１０９及びＭ１５（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用した。
【００６５】
蛋白質の生成を誘導するためのＩＰＴＧはＳｉｇｍａ社製を、発現された蛋白質を精製するためのＮｉ−ＮＴＡレジンはＮｏｖａｇｅｎ社製を使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット、ＥＣＬなどに用いられた予備染色マーカー(prestained marker)はＮＥＢ社製であった。蛋白質を変性状態にするために使用された尿素はＤｕｃｈｅｆａ社製であり、精製時に使用されたイミダゾールはＵＳＢ製であった。透析に使用された膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ製のＭＷＣＯ ３５００であり、蛋白質凝集防止のために使用された試薬はＡｍｒｅｓｃｏ製のＣＨＡＰＳであった。ＥＬＩＳＡに使用された抗体は、Ｓｉｇｍａ製のＨＲＰ結合抗−白ネズミＩｇＧであった。ウェスタンブロットとＥＣＬに使用された基質溶液として、ＢＣＩＰ／ＮＢＴはＳｉｇｍａ製を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウェスタンブロット検出試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ製を使用した。補助剤は、フロイントアジュバント（Freund Adjuvant；Ｓｉｇｍａ社製）と水酸化アルミニウム（Ｒｅｈｅｉｓ社製）を使用した。蛋白質の定量は、ＢＣＡ蛋白質検査法（Ｐｉｅｒｃｅ）とＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。
【００６６】
血清内中性脂肪はトリグリザイム−Ｖを、総コレステロールはコレステザイム−Ｖを、ＨＤＬコレステロールはＨＤＬ−Ｃ５５５（シンヤン化学社製）を、ＬＤＬコレステロールはＥＺＬＤＬコレステロール（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて測定した。ＬＤＬ測定器は、Ｒａｎｄｏｘ製を使用した。
【００６７】
ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）系白ネズミは、（株）大韓バイオリンクから購入し、５週齢以上の雄を使用した。白ネズミの飼料としては韓国の（株）Ｓａｍｔａｋｏ製（成分：天然蛋白質１８％以上、粗脂肪５．３％、粗繊維４．５％、回分８．０％）を使用した。
【００６８】
組み換えＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１4ペプチドの精製のために、超音波粉砕緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．９）、結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）、洗浄緩衝液（５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）、溶出緩衝液（４００ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．９）を使用した。
【００６９】
＜実施例１：抗肥満作用ペプチドＰＢ１4Ｔ人工遺伝子の作成＞
ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｔIIＳＫベクターに入っているＢ１4断片を得るために、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、ＰＣＲ２．１ベクターに入っているＴ断片を得るために、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII制限酵素を用いて切断した。２つのベクターから得られた切片、Ｂ１4とＴに対して、Ｂ１4のＸｈｏＩ粘着末端とＴのＳａｌＩ粘着末端が相補的なので、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１２時間結合させた。その結果、連結部位はＳａｌＩまたはＸｈｏＩによって切られなくなり、Ｂ１4Ｔ断片を得るためにもう１回ＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切った。蛋白質を発現するために選択されたベクターシステムとしてｐＱＥ３０プラスミドを使用した。このベクターは、発現させようとする蛋白質が６Ｘヒスチジンと融合蛋白質の形で発現して精製が容易となるように考案された。Ｂ１4Ｔ遺伝子断片をｐＱＥ３０ベクターのＳａｌＩ及びＨｉｎｄIII部位と結合した。こして作られたクローンをｐＢ１4Ｔと命名した（図１）。大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させた後、プラスミドを分離してＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切って、４５０ｂｐ断片が挿入されたことを確認した（図２）。
【００７０】
前述した組み換えベクターｐＢ１4Ｔは、大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔの形であって、２００４年３月４日付けでＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganisms、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０５６２で寄託された。
【００７１】
＜実施例２：抗肥満作用ペプチドＰＢ１8人工遺伝子の作成＞
ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫベクターに入っているＢ１4断片をＳａｌＩとＸｈｏＩで切って得た。ｐＢＸ４ベクター（Ｂ１4断片が挿入されているｐＱＸ３０ベクター、韓国特許公開第２００２−００１８９７１号）をＳａｌＩで切って前記Ｂ１4断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩中結合させた。
【００７２】
＜実施例３：遺伝子塩基配列の決定＞
クローニングされたｐＢ１4Ｔの塩基配列を確認するために、プラスミド濃度を３００〜５００ｎｇ／μＬとして韓国の（株）コアバイオシステムにＤＮＡ塩基配列分析を依頼し、正しいクローンであることを確認した（図３）。
【００７３】
＜実施例４：組み換えＰＢ１4Ｔペプチドの発現＞
ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8は、ｐＱＥ３０ベクターで発現するので、ベクター自体内の開始コドンから蛋白質の発現が始まり、精製を便利にするために６個のヒスチジンも共に発現し、エンテロキナーゼ部位も含んでいる。ペプチドの発現に使用した宿主細胞は、大腸菌Ｍ１５であって、アンピシリンとカナマイシンが含有されたＬＢプレートに塗抹してコロニーを得た後、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍＬ）が含有されたＬＢ培地１０ｍＬで一晩中培養した。時間の変化に伴う蛋白質の誘導を調べるために、一晩中培養した培養液中の１ｍＬを新鮮なＬＢ培地５０ｍＬに接種した。本培養液を６００ｎｍで吸光度が０．４〜０．５となるまで３７℃で１時間３０分振とう培養した後、ＩＰＴＧを最終１ｍＭ濃度となるように加え、５時間培養を行い続けて１時間ごとに１ｍＬずつ分取した。ＩＰＴＧを加える前に１ｍＬを予め取って非誘導対照グループとして使用した。それぞれの培養液は、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離してペレットを得た後、２×ＳＤＳサンプル緩衝液３０μＬに溶かしてＳＤＳ−ＰＡＧＥの際にサンプルとして使用した。こうして計算された蛋白質の大きさは、それぞれＰＢ１4Ｔは１６．２ｋＤａ、ＰＢ１8は１６．５ｋＤａであった。時間帯別にサンプルを得てＳＤＳ−ＰＡＧＥによって発現を確認した結果を、図４及び図５に示す。
【００７４】
＜実施例５：組み換えＰＢ１4Ｔペプチドのウェスタンブロット＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて大きさの分析によってＰＢ１4Ｔを確認したが、正確な蛋白質が発現するかを確認するために、ＰＢ１4Ｔを認識することが可能な２つの抗体を用いてウェスタンブロットを行った。ＰＢ１4Ｔウェスタンブロットの対照グループには、Ｍ１５にＢ１4ＴがサブクローニングされていないｐＱＥ３０ベクターのみを形質転換させて使用した。サンプルは、ＩＰＴＧで誘導する前のものと、ＩＰＴＧ誘導３時間後のものにした。１次抗体は、ウサギ抗−ＰＢ１4ポリクローナル抗体、マウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体をＰＢＳに１：１００００で希釈して使用した。１次抗体を認識することが可能な２次抗体は、ペルオキシダーゼが結合している山羊抗−ウサギＩｇＧ、山羊抗−マウスＩｇＧをＰＢＳに１：１００００で希釈して使用した。発色反応は、ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓウェスタンブロットキットを使用し、膜をカセットに入れて富士メディカルのＸ線フィルムを入れた後、１０秒間露出させて現像した。ウサギ抗−ＰＢ１4ポリクローナル抗体はＰＢ１4ＴのＰＢ１4断片を認識する抗体であり、マウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体は、ＰＢ１4ＴのＴ断片を認識する抗体なので、正確に蛋白質が発現すると、２つの抗体を使用したブロックの全てでバンドが現われるべきである。図８に示すように、それぞれの抗体がＰＢ１4ＴのＰＢ１4とＴを認識したので、ＰＢ１4Ｔが正確に発現したことを確認できた。
【００７５】
＜実施例６：組み換えＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8ペプチドのバクテリア細胞位置の確認＞
ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の細胞位置確認は、ＩＰＴＧで誘導してから３時間が経過したサンプルを遠心分離し、それを超音波緩衝液で再懸濁させた後、超音波により得られたペレットと上澄み液それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。具体的に、ＩＰＴＧで発現が誘導された細胞を４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、得られたペレットをしばらく−２０℃で凍らせてから氷上で溶かし、その後超音波分解緩衝液をペレット１ｇに対して５ｍＬの割合で入れて再懸濁した。細胞を溶解させるために、３０秒ずつ１５サイクル（サイクルの間に１分間休止）で超音波粉砕した。４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を分離し、これを可溶性蛋白質の入っている非加工抽出物Ａ（粗抽出物Ａ）として使用し、残っているペレットは、不溶性蛋白質の入っている非加工抽出物Ｂ（粗抽出物Ｂ）として使用した。それぞれのサンプルに２×ＳＤＳサンプル緩衝液を混ぜて９５℃で５分間沸かした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。上澄み液よりはペレットに所望の蛋白質が多量現われることから、不溶性が強いことを確認した（図６及び図７）。
【００７６】
＜実施例７：組み換えＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＢ１8の精製＞
ペプチドを精製するためにヒスチジンタグ蛋白質用Ｎｉ−ＮＴＡレジンを使用した。レジンに結合しているＮｉ+と末端にヒスチジンヘキサマー融合蛋白質が相互作用する性質を利用することにより親和力を利用したアフィニティクロマトグラフィーの一つの方法である。遺伝子組み換えされた大腸菌を接種したＬＢ培地１０ｍＬを一晩中前培養した後、５００ｍＬのＬＢ培地に全量接種して６００ｎｍで吸光度０．４〜０．５となるまで３７℃で培養した。ＩＰＴＧを１ｍＭで加え、４時間培養した後、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞ペレット得て−２０℃に置いた。氷上で溶かしたペレットに超音波粉砕緩衝液を湿潤細胞と５ｍＬ／ｇの割合で入れて再懸濁させて超音波粉砕を行った。超音波粉砕をして細胞を溶解させ、４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離してペレットを得た。結合緩衝液を、残っている上澄み液の体積と同一の体積となるようにペレットに入れた後、再懸濁させ、細胞残骸を除去するために超音波粉砕を３サイクル行った。これを再び４℃、９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して得た上澄み液を精製用サンプルとして使用した。
【００７７】
Ｎｉ−ＮＴＡレジン充填カラムの大きさは直径１ｃｍ、高さ１５ｃｍであり、レジンは２ｍＬ、流速は２ｍＬ／ｍｉｎとした。レジンをカラムに充填した後、３〜５倍体積の蒸留水で洗浄し、５倍体積の１×荷電された緩衝液（５０ｍＭ ＮｉＳＯ4）を流してＮｉ2+を結合させた後、結合緩衝液で平衡化してＮｉ−キレート化親和性樹脂を製造した。レジンにサンプルローディングを２回行った。こうしてサンプルローディングが完了すると、さらに結合緩衝液で１．０範囲の２８０ｎｍ吸光度で基底線に到達するまで流した。その後、洗浄緩衝液で１０分間流し、平衡化が完了すると、洗浄緩衝液から溶出緩衝液にイミダゾールの濃度勾配をかけ、レジンに残留する蛋白質を完璧に溶出させるために溶出緩衝液のみを１０分間さらに流した。分画は層２０個であり、それぞれ２ｍＬずつであった。精製されたペプチドは８Ｍ尿素状態であり、尿素を除去するために、ＰＢＳを用いて一晩中透析を行った。
【００７８】
前述したように、それぞれの蛋白質が強い不溶性を持つため、精製は８Ｍ尿素入り緩衝液で蛋白質を変性させてから行い、樹脂に結合した蛋白質を溶出させるためにイミダゾールを使用し、濃度は５０ｍＭ〜４００ｍＭの濃度勾配で精製した。その結果が図９、図１０及び図１１に示されている。約３００ｍＭのイミダゾール濃度のとき、大部分の蛋白質が溶出した。それぞれの蛋白質の収率は１Ｌ培養の際にＰＢ１8の場合には３〜３．５ｍｇ、ＰＢ１4Ｔの場合には４〜４．５ｍｇであった。
【００７９】
＜実施例８：組み換えＰＢ１4Ｔ、ＰＢ１4及びＰＢ１8ペプチドの定量＞
ＰＢ１4Ｔ、ＰＢ１4、ＰＢ１8は、ＰＢＳで透析を行うと、尿素が除去されるので、蛋白質の凝集による沈殿が発生し、この状態では蛋白質の定量を正確に行うことができなかった。精製された蛋白質の凝集状態を除去するために、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳを使用した。定量は、ＢＣＡ蛋白質定量法、ブラッドフォード法を用いて行った。２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを１０００、５００、２５０、１２５、６２．５μｇ／ｍＬと逐次希釈して標準として用いた。ＢＣＡ分析は、Ｐｉｅｒｃｅ社製のプロトコールによって行い、３７℃で３０分間反応させ、５６２ｎｍで吸光度を測定し、ブラッドフォード試薬はサンプルと室温で１０分間反応させた後、５９５ｎｍで吸光度を測定し、ＢＳＡの逐次希釈液のＢＣＡ或いはブラッドフォード蛋白質定量発色反応の吸光度を標準定量線として用いてサンプルの蛋白質の濃度を定量した。
【００８０】
＜実施例９：ＰＴＢ１4の発現のためのベクターｐＴＢ１4の製作＞
Ｍ１５大腸菌株に形質転換されている発現用ベクターｐＱＥ３０においてＴカセット（ｐｒｅＳ２）をＫｐｎＩ（Ｔａｋａｒａ）、ＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ）制限酵素で二重切断によって分離し、ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔも同一の酵素で処理した。分離したＴカセットとｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔをそれぞれゲル上で確認して分離溶出させ、溶出させたベクターとＴカセットはＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ４μＬ、Ｔカセット４μＬ、リガーゼ１μＬ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、１Ｗｅｉｓｓμ／ｍＬ）、１０×緩衝液（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μＬを１．５ｍＬのチューブに入れて１６℃で一晩中培養させた。組み換えされたベクターをＪＭ１０９細胞と混ぜて４２℃で９０秒間熱衝撃を与えた後、ＬＢ培地を入れて３７℃で１時間培養した。これをＬＢ（Ａｍｐ）培地に接種し、３７℃で培養してコロニーを確認した。確認されたコロニー中の幾つかを任意選択して培養過程、プラスミド分離精製、制限酵素切断を経てアガロースゲル上でＤＮＡ断片のサイズによって確認した。Ｔカセット内にはＸｈｏＩ部位が存在するが、これを無くさなければ、連結されたＴＢ4カセットを得ることができなかった。すなわち、Ｔとは、Ｔカセット（ＨＢＶウィルスのｐｒｅＳ２遺伝子、１８３ｂｐ）の３’末端近く（Ｔカセットの５’を基準として約１５０ｂｐ）にＸｈｏＩ部位が存在してクローニングに使用することができないので、内部のＸｈｏＩ部位を点突然変異させたＸｈｏＩで切られない新しい配列のＴカセットの形態である。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐｒｅＳ２は、Ｔカセット内部のＸｈｏＩ部位により短いＤＮＡ断片（３０ｂｐ）が切り出された。この部分に合成オリゴマーを挿入した。セルフライゲーション(Self-ligation)を防ぐために、ベクターは３７℃、３０分間アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＧｅｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理し、９５℃で５分間脱リン酸させてゲル上で溶出させた。オリゴマーは、３７℃で３０分、６５℃で２０分間処理して５’−リン酸化させた。９５℃で５分間静置反応させた後、熱遮断(heat block)をして徐々に冷やしながらアニーリングさせた。オリゴマーとｐＢ１ｕｅｓｃｒｐｔ−Ｔリガーゼを用いて１６℃で一晩中培養した。組み換えされたｐＢ１ｕｅｓｃｒｔｉｐ−ＴをＪＭ１０９細胞に形質転換導入してＬＢ（Ａｍｐ）培地でコロニーを確認し、コロニー選別過程を経て、所望のプラスミドを持った細胞を確保した。オリゴマーはｐｒｅｓＳ２の当該部分の２８個のヌクレオチドからなっており、但し、ＸｈｏＩ部位を無くすために、センス−オリゴマー５’の５番目のヌクレオチドをＧからＡに変え、これによりアミノ酸配列がアルギニンからリジンに変わった。センスとアンチセンスでそれぞれ２８ｍｅｒを製作してアニーリングさせ、これを、ＸｈｏＩで処理したｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｐｒｅＳ２内に挿入した。ｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＴをＳａｌＩ、ＸｈｏＩで二重切断し、ｐＱＥ３０−Ｂ4をＳａｌＩで処理してそれぞれをゲル上で分離溶出させた。５’側が切り出されたｐＱＥ３０−Ｂ4に、分離されたＴを挿入し、ｐＱＥ３０−ｐＴＢ4を作成した。組み換えされたＴＢ4をＳａｌＩとＨｉｎｄIIIで切ってバンドの大きさを確認した。こうして作成されたベクターをｐＴＢ１4と命名した（図１３）。
【００８１】
＜実施例１０：ＰＴＢ１4の発現及び精製＞
発現ベクターｐＴＢ１4をＭ１５に導入してＬＢ（Ａｍｐ、Ｋａｎ）培地２Ｌに培養した。これを７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して湿潤細胞９ｇを回収した。遺伝子組み換えで発現されたハイブリッドポリペプチドＰＴＢ4は、Ｈｉｓ−Ｔａｇが存在するので、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−結合レジンを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムは、レジン体積４ｍＬで直径１．８ｃｍ、高さ８ｃｍのものを使用した。Ｅｃｏｎｏ ｓｙｓｔｅｍの吸光度範囲は０．５、記録計の用紙速度は２ｃｍ／ｈｏｕｒ、サンプルローディング速度は２ｍＬ／ｍｉｎに合わせて使用した。まず、湿潤細胞に超音波粉砕緩衝液(sonication buffer)を入れて超音波破砕によって細胞を壊し、４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットのみを結合緩衝液に溶かした後、アフィニティクロマトグラフィーで精製した。まず、結合溶液をカラムに流しながらレジンを沈殿させた。検出器を見ながら、ベースラインを定め、一定の値を指すと、超音波粉砕したサンプルを入れた。サンプルがカラム内に入って再び一定の値を指すまで待ってから洗浄溶液を流し、その後さらに一定の値を指すと、溶出溶液も流してＰＴＢ１4を分離した。発現及び精製されたハイブリッドポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロットで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたＰＴＢ１4を半乾燥トランスファ(semi-dry transfer)を用いて膜に移した。ブロッキング溶液（０．５％ casein−phosphate buffered saline-tween、０．０２％ＮａＮ3）を用いて３７℃で２時間恒温処理した後、Tris-buffered saline-tween（ＴＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．６）で２分ずつ２回洗浄した。その後、１次抗体を３７℃で１時間処理し、ＴＢＳ−Ｔで５分ずつ４回洗浄した。２時抗体も１時間処理した後、同一の方法で洗浄した。Ｔカセットの確認には抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（１：１００００）、山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体（１：１００００）を使用し、Ｂカセットの確認にはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清（１：１００００）、山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体（１：１００００）を使用した。ＥＣＬキット溶液を乾燥膜上に散布して５分間反応させ、これをＥＣＬキットとしてバンドを確認した。その結果、Ｂカセットは、ウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体を用いてＰＢ１4ＴとＰＴＢ１4でのみ約１６ＫＤａのバンドが現われたことを見ることができ、Ｔカセットは、抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体を用いて、ＰＢ１4では約８ｋＤａのバンドが観察され、ＰＢ１4ＴとＰＴＢ１4では１６ｋＤａのバンドが見えてそれぞれのハイブリッドポリペプチドが正確に発現、精製されたことを確認した（図１４）。
【００８２】
＜実施例１１：ＰＢ１4とオボアルブミンとの連結＞
ＰＢ１4をキャリア蛋白質としてのオブアルブミンと連結した。キャリア蛋白質とＰＢ１4のモル比が約１：１０となるようにした。約１時間４℃で反応バイアルで攪拌し、２％グルタルアルデヒド溶液を入れた後、３時間攪拌し、ＰＢＳ緩衝液でＭＷＣＯ３０００透析膜を用いて一晩中透析して残余のグルタルアルデヒドを除去した。
【００８３】
＜実施例１２：ワクチン処理（免疫化）＞
７週齢のＳＤ系白ネズミを６グループに分けてワクチン処理を行った（表１）。実施例７及び実施例１０で精製及び定量したペプチド１００μｇを、表１に示すように、それぞれの補助剤と混合して１００μＬとなるようにして腹腔に注射した。注射は２週間隔で７、９及び１１週齢に３回にわたって行った。補助剤はフロイントアジュバントと水酸化アルミニウムを使用した。フロイントアジュバントはペプチドと同量で混ぜ、水酸化アルミニウムは５．８ｍｇ／ｍＬを最終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調整した後、ペプチドと室温で攪拌しながら恒温処理した。最初ブースト５日目、最終ブースト５日目、２週目及び４週目に尻から採血した。
【００８４】
【表１】
【００８５】
前記ワクチン処理後の体重変化を図１５にグラフで示した。最初注射してからブーストするまでは、各グループ別体重が２９２〜２９７ｇと同様であったが、２回注射後１週前からは、ワクチン処理グループ、対照グループおよび模擬グループの体重の差異が見られた。１８週齢のとき、対照グループおよび模擬グループとＰＢ１4注射グループとの体重の差異は１６ｇであり、ＰＢ１4Ｔ注射グループとの体重の差異は２７ｇであった（表２）。これは、最初注射による微弱な免疫反応が２次注射によってブーストされた後、増強した免疫応答反応によって体重の増加が抑制されることを示す。３次注射後にも、体重増加の偏差は維持された。
【００８６】
【表２】
【００８７】
表２において、標準偏差は、５匹のＳＤ系白ネズミに対して計算されたものであり、それぞれの単位はｇで表わす。
【００８８】
＜実施例１３：抗体力価の測定＞
血清サンプルを用いて間接的ＥＬＩＳＡ法によって抗体力価を測定した。微細力価平板(microtiter plate)にＰＢ１4を各ウェルに１００ｎｇの濃度で１００μＬずつ仕込んだ。４℃で一晩中処理した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％カゼイン、０．０２％ＮａＮ3）を添加し、３７℃で１時間恒温処理した。ＰＢＳＴで３回洗い出し、ＳＤ系白ネズミワクチン処理によって得た血清をＰＢＳに１／５００〜１／８０００倍で希釈して１００μＬずつ使用し、３７℃で１時間恒温処理した。各ウェルをＰＢＳＴで３回洗い出し、２次抗体としての山羊抗−白ネズミＩｇＧの１／１０００倍希釈液で培養した。ＯＰＤ発色反応を行い、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００８９】
ＳＤ系白ネズミが１０、１２、１４、１６週齢のとき、ワクチン処理グループで白ネズミの抗体力価を確認した結果が図１６に示されている。力価はそれぞれの血清希釈比を１／２０００にしたとき、ＥＬＩＳＡ結果、吸光度が０．６を基準とした。１／５００〜１／８０００倍で希釈してＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4を注射したグループは、１４週齢までは抗体力価が増加し、ＰＢ１4ＴグループはＰＢ１4よりＯ．Ｄ数値で１．５倍高かったが、ＰＴＢ１4グループはＰＢ１4グループに比べて多少向上した。１６週齢のときは、ＰＢ１4グループでは力価が減少し、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4のグループでは力価が維持されたが、ＰＴＢ１4はＰＢ１4Ｔに比べて約５０〜６０％と著しく弱いことを確認することができた。
【００９０】
＜実施例１４：血清脂質含量の測定＞
ＴＧと総コレステロールの測定は、発色試薬２００μＬに血清４μＬを入れて３７℃で５分間高温処理した後、それぞれ５０５ｎｍ、５００ｎｍで吸光度を測定した。ＨＤＬの測定は、血清と沈澱試薬を１：１で混ぜた後、室温で１０分間放置し、その後３０００ｒｐｍ以上で１０分間遠心分離して得た上澄液を発色試薬２００μＬに４μＬ入れて３７℃で５分間恒温処理した後、５５５ｍｍで吸光度を測定した。ＬＤＬコレステロールの測定はＥＺ ＬＤＬコレステロールキット（Ｓｉｇｍａ社製）を使用し、ＬＤＬカリブレータはＲａｎｄｏｘ社製を使用し、製造社から提供されたプロトコールによってキット内の試薬１１５０μＬに血清４μＬを入れて３７℃で５分間反応させた後、試薬２５０μＬを添加してさらに３７℃で５分間反応し、その後６００ｎｍで吸光度を測定した。各測定シートから得た吸光度と標準試液を比較して濃度を計算した。
ＳＤ系白ネズミへの３次注射後５週目の血清で分析した結果が表３に示されている。
【００９１】
【表３】
【００９２】
表３において、標準偏差は５匹のＳＤ系白ネズミに対して計算されたものであり、それぞれの単位はｍｇ／ｄＬで示した。
【００９３】
対照グループおよび模擬グループでは、全体的にＴＧ及びコレステロールの数値がワクチン処理グループより約１０ｍｇ／ｄＬ（１０ｍｇ／１００ｍＬ）高かった。同じワクチン処理グループにおけるＴＧとＬＤＬコレステロールの数値は、ＰＢ１4で高かったが、その差異は大きくなかった（図１７）。
【００９４】
＜実施例１５：愛玩犬を対象とした臨床実験結果＞
ＰＢ１4Ｔをアジュバントとしてのアルミナと混合した混合物（２ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを１０匹の愛玩犬（韓国アンサン動物病院で肥満管理を受けている愛玩犬）に筋肉注射又は皮下注射の形で２週間隔で２回接種した後、１．５〜３ヶ月間体重の変化を観察した。その結果、抗体が徐々に減少する形に維持され（半減期：３ヶ月）、間食を始めとした高脂肪食を無制限提供しても、体重は全く増加していない。具体的に、接種した１０匹の愛玩犬の全てが、間食及び高カロリー食餌を摂取する場合でも体重の増加が抑制されることを確認した。特に、ヨークシャーテリア(Yorkshire terrier)種の場合、性別及び年齢による体重増加が予想される状況でも、ＰＢ１4Ｔの接種により体重が増加しないことを確認することができた。
【００９５】
また、各愛玩犬の血清を採取して抗体誘導の度合いを確認するために、２次接種後１週目に、ＰＢ１4Ｔ或いはＰＢ１4を認識する血清中の抗体力価をＥＬＩＳＡ実験法で測定した。その結果、５０００〜５００００倍で希釈した血清においても０．５の高い吸光度を示して抗体誘導能も非常に優れた。
【００９６】
【表４】
【００９７】
〔産業上の利用可能性〕
本発明の抗肥満効果を示すアポリポ蛋白質Ｂ−１００のＢ細胞エピトープのミメティックペプチドのＣ末端にヘルパーＴ細胞のエピトープのＮ末端を融合させたハイブリッドポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープの有利な活性または効果を中和させる免疫反応を誘導するか有害な副作用を起すことなく、優れた免疫増強効果を示して肥満の予防または治療に効果的に使用できる。
特許手続き上微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
このページの下端に確認された国際寄託当局から規則7.1に基づいて発行された原寄託申請の受託証
To：Ｈｙｏ Ｊｏｏｎ Ｋｉｍ．
韓国（〒４２５−７９１）京畿道安山市常緑樹区四１洞漢陽大学校ＨＢＩ６０４
┌──────────────────────────────────────┐
Ｉ．微生物表示 │
├─────────────────┬────────────────────┤
寄託者によって与えられた識別番号： 国際寄託当局によって与えられた受託番号 │
Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ ： │
│ ＫＣＣＭ−１０５６２ │
├─────────────────┴────────────────────┤
II. 科学的性質および／または提示された分類学的表示 │
├──────────────────────────────────────┤
前記Ｉで識別された微生物は、下記のとおりである。 │
［ ］科学的性質 │
［ ］提示された分類学的表示 │
（該当欄にＸ表示） │
├──────────────────────────────────────┤
III．受付および受託 │
├──────────────────────────────────────┤
本国際寄託当局は、前記Ｉに表示された微生物が２００４年３月４日付で受付され │
たことを確認する。（原寄託日）1 │
├──────────────────────────────────────┤
IV．国際寄託当局 │
├───────────────────┬──────────────────┤
名称：韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ 本国際寄託当局を代表する委任状を有 │
） する者又は権限保有職員の署名 │
住所：韓国（〒１２０−０９１）ソウル市 │ │
西大門区弘済１洞３６１−２２１ 日付：２００４年３月１２日 │
ユリムビル │ │
└───────────────────┴──────────────────┘
1 規則６．４（ｄ）適用、この日付は国際寄託当局の資格を得た日付であるが、国際寄託当局の資格の獲得後、ブダペスト条約の外でなされた寄託がブダペスト条約下の寄託に転換される場合、この日付は国際寄託当局が微生物を受付けた日付である。
書式ＢＰ／４ 単一ページ
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ｐＢ１4Ｔの製作図を示す。
【図２】ｐＢ１4Ｔの制限酵素切断を示す。
【図３】ＤＮＡ配列から類推したｐＢ１4Ｔの一次構造を示す。
【図４】形質転換された大腸菌(Escherichia coli)Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔを、ＩＰＴＧでｐＢ１4Ｔの発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１4Ｔは矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー；レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン３〜７：ＩＰＴＧ誘導１、２、３、４及び５時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【図５】形質転換された大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8を、ＩＰＴＧでＰＢ１8の発現を誘導した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した結果である。発現された組み換えＰＢ１8は矢印で表示した。レインＭ：予め染色された蛋白質サイズマーカー、レイン１：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５；レイン2〜5：ＩＰＴＧ誘導１、２、３及び4時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１8。
【図６】大腸菌溶解物(lysate)のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、上澄液（レイン１）と沈殿物（レイン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１4Ｔは、矢印で表示したように沈澱物に現われた。
【図７】大腸菌溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。バクテリア溶解物を遠心分離して上澄液と沈殿物に分離した後、全体溶解物（レイン１）、上澄液（レイン２）及び沈澱物（レイン３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。ＰＢ１8は、矢印で表示したように沈殿物に現われた。
【図８】精製されたＰＢ１4Ｔペプチドをウェスタンブロット分析した結果である。抗ＰＢ１4ウサギ抗体（Ａ）と抗ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体（Ｂ）を用いてＰＢ１4Ｔを分析した。レイン１：大腸菌Ｍ５、レイン２：ＩＰＴＧで誘導されていない大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ、レイン３：ＩＰＴＧ誘導３時間後の大腸菌Ｍ１５／ｐＢ１4Ｔ。
【図９】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4溶出プロファイルを示す。
【図１０】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１4Ｔ溶出プロファイルを示す。
【図１１】イミダゾールの線形濃度勾配によるＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーのＰＢ１8溶出プロファイルを示す。
【図１２】ｐＴＢ１4の製作図を示す。
【図１３】精製されたＰＢ１4、ＰＢ１4Ｔ及びＰＴＢ１4をウェスタンブロット分析した結果である。パネルＡはマウス抗−ｐｒｅＳ２モノクローナル抗体と山羊抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認し、パネルＢはウサギ抗−ＰＢ１4抗血清と山羊抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体と確認した。
【図１４】ＤＮＡ配列から類推したＴＢ１4／ｐＱＥ３０の一次構造を示す。
【図１５】対照グループ(normal)、模擬グループ(mock)、ワクチン処理グループにおけるＳＤ系白ネズミの体重増加を比較したグラフを示す。対照グループ（■）はＰＢＳで注射され、模擬グループ（▲）はオボアルブミンで注射された。ワクチン処理グループはＰＢ１4を媒体蛋白質ＯＶＡに抱合させたＰＢ１4＋ＯＶＡ（◆）ペプチドとＰＢ１4Ｔ（●）ペプチドで注射された。このようなペプチド注射は、２週間隔で３回ずつ行われた。矢印は、ワクチン処理の時点を示す。
【図１６】抗−ＰＢ１4、抗−ＰＢ１4Ｔ及び抗−ＰＴＢ１4の抗体力価変化を測定した結果である。
【図１７】血清内トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール量を測定した結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含むペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端とが融合する、免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
【請求項２】
ペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が２〜８個連結されてなることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が４個連結されてなることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列が４個連結されてなることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヘルパーＴ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト(Plasmodium falciparum circumsporozoite)ヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、破傷風トキソイド(Tetanus toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、麻疹(measles)ウィルスＦ蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ及び狂犬病ウィルスヘルパーＴ細胞エピトープよりなるグループの中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｔ細胞エピトープがＢ型肝炎ウィルス表面抗原のヘルパーＴ細胞エピトープであることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｔ細胞エピトープがＢ型肝炎ウィルス表面抗原のｐｒｅＳ２ヘルパーＴ細胞エピトープであることを特徴とする、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｔ細胞エピトープが配列番号７のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号９のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項１３】
ｐＢ１4Ｔ（ＫＣＣＭ−１０５６２）であることを特徴とする、請求項１２に記載の組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１】
配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列を含むペプチドのＣ末端とヘルパーＴ細胞エピトープのＮ末端とが融合する、免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
【請求項２】
ペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が２〜８個連結されてなることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ペプチドは、配列番号１、２及び３の中から選択されたアミノ酸配列が４個連結されてなることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列が４個連結されてなることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヘルパーＴ細胞エピトープは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)主要外膜蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ、プラスモジウム・ファルシパルム・サーカムスポロゾイト(Plasmodium falciparum circumsporozoite)ヘルパーＴ細胞エピトープ、大腸菌ＴｒａＴヘルパーＴ細胞エピトープ、破傷風トキソイド(Tetanus toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、ジフテリアトキソイド(diphtheria toxoid)ヘルパーＴ細胞エピトープ、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)トリオースリン酸イソメラーゼヘルパーＴ細胞エピトープ、麻疹(measles)ウィルスＦ蛋白質ヘルパーＴ細胞エピトープ及び狂犬病ウィルスヘルパーＴ細胞エピトープよりなるグループの中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｔ細胞エピトープがＢ型肝炎ウィルス表面抗原のヘルパーＴ細胞エピトープであることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｔ細胞エピトープがＢ型肝炎ウィルス表面抗原のｐｒｅＳ２ヘルパーＴ細胞エピトープであることを特徴とする、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｔ細胞エピトープが配列番号７のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号９のアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチン。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項１３】
ｐＢ１4Ｔ（ＫＣＣＭ−１０５６２）であることを特徴とする、請求項１２に記載の組み換えベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組み換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養して請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００８−５００８１３（Ｐ２００８−５００８１３Ａ）
【公表日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０３８４０（Ｐ２００７−５０３８４０）
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８７８００
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５０６３１５３４３）エスジェイ バイオメッド インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８７８００
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５０６３１５３４３）エスジェイ バイオメッド インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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