抗腫瘍剤の治療効果予測方法、抗腫瘍剤の治療効果予測キットおよび抗腫瘍剤
【課題】本発明の目的は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の予測方法を提供することにある。
【解決手段】前記課題は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含む抗腫瘍剤の治療効果予測方法によって解決することができる。
【解決手段】前記課題は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含む抗腫瘍剤の治療効果予測方法によって解決することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤の治療効果予測方法に関し、特には、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カワラタケから抽出される蛋白多糖体は、抗腫瘍活性などを示す。例えば、特開昭６０−４５５３３号公報（特許文献１）には、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分とする抗腫瘍剤などが記載されている。このような蛋白多糖体のなかで、カワラタケ由来の蛋白多糖体の一種であるＰＳＫ（登録商標）（商品名「クレスチン」（登録商標））は、皮内投与や静脈内投与だけでなく、経口投与によっても抗腫瘍活性を示すことが特長であり、臨床的にも経口投与製剤として用いられている。
【０００３】
ＰＳＫは、約１８〜３８％の蛋白質を含む蛋白多糖体であり、５０００以上（ゲル濾過法）の分子量、例えば５０００〜３０００００（ゲル濾過法）の分子量を有するものである。主要画分の糖部分はβ−Ｄ−グルカンで、このグルカン部分の構造は、１→３、１→４及び１→６結合を含む分枝構造である。
【０００４】
最近、腫瘍に対する抗腫瘍剤の治療効果又は治療の予後を予測することにより、最適な抗腫瘍剤の選択、抗腫瘍剤の投与量の調節などを行い、抗腫瘍剤の治療効果を上昇させる試みが行われている。
【０００５】
例えば、特許文献２には、抗癌剤投与後の患者の予後と正の相関を示す８つの遺伝子群と、負の相関を示す８つの遺伝子群の発現データ基づいた、大腸癌組織における抗腫瘍剤投与後の患者の予後予測手法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献３には、ｐ１６０ファミリー分子群の発現量とＳＰ１１０ファミリー発現量とを比較することによる肝臓癌におけるＲＡＲ−α作動薬の治療効果予測手法が開示されている。
【０００７】
更に、特許文献４には、乳癌細胞の核内のメニンの発現に基づいた乳癌における抗腫瘍剤の選択手法が開示されている。具体的には、特許文献４では、メニンが陽性の場合には、エストロゲンレセプターを遮断するタモキシフェンなどの治療薬を避けて、エストロゲン合成そのものを阻害するＬＨ−ＲＨアナログか、又はアロマターゼ阻害剤を用いるようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６０−４５５３３号公報
【特許文献２】特開２００７−３７４０９号公報
【特許文献３】国際公開２００７／０４９５４２号
【特許文献４】特開２００４−１０１３５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（英国）２００７年、第１２１巻、ｐ．４３９−４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一方、ＰＳＫの治療効果の予測に関しても、患者の免疫系と治療効果との関連から、細胞性免疫活性、血清ＩＡＰ及びシアル酸値、ＳＩ値及びＧ／Ｌ比、サイトカイン産生能、並びにＨＬＡタイピングなどが予測因子として有用であるかについて、検討されてきている。しかしながら、現在までのところ、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤では、治療効果を予測（評価）するためのマーカーは見出されていない。
【００１１】
そのため、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤では、用いた際の治療効果を事前に予測することができないという問題を有している。
【００１２】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、その主たる目的は、ＰＳＫに代表されるようなカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、腫瘍移植モデルマウスを用いカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の研究を行ったところ、移植された腫瘍の種類によって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が顕著に異なることを見出した。そこで、本発明者らは、腫瘍細胞にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の差異を規定する要因があると仮定し、その要因を特定することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することが可能であると考えた。
【００１４】
本発明者らは、鋭意検討した結果、抗腫瘍剤の治療効果が低い腫瘍細胞においては、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が多いのに対して、抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍細胞においては、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がないか、又はＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低いことを見出した。
【００１５】
更に、本発明者らは、抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍細胞を有する対象（癌患者）においては、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高いことを見出した。すなわち、本発明者らは、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）においては、ＰＳＫなどのカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が高く、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が低い対象（癌患者）においては、ＰＳＫなどのカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が低いことを見出した。
【００１６】
本発明は、係る新たな知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
【００１７】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測している。
【００１９】
これは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が、対象（癌患者）の腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現量に応じて変化するためである。
【００２０】
このように、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現量を測定することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００２１】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程は、前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び患者の体液中における可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在の少なくとも１つを分析する工程であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記腫瘍が、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程において発現を分析するＮＫＧ２Ｄリガンドは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドであることが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３であり、前記膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢであることが好ましい。
【００２３】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３に結合する抗体、並びにＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いて分析することが好ましい。本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体発現を分析する受容体発現分析工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の免疫細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測している。
【００２５】
これは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が、対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量に応じて変化するためである。
【００２６】
このように、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量を測定することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００２７】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記受容体発現分析工程は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、及び免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現の少なくとも１つを分析する工程であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測キットは、上述の抗腫瘍剤の治療効果予測方法に用いる抗腫瘍剤の治療効果予測キットであって、ＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体、からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２８】
上記の構成によれば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を効果的に予測することができる治療効果予測キットを提供することができる。
【００２９】
なお、本発明は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、対象となる腫瘍細胞が膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも一方を発現していない場合に投与する抗腫瘍剤、および、
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合に投与する抗腫瘍剤についても包含する。
【００３０】
本発明に係る抗腫瘍剤は、治療効果の高い腫瘍を有する対象（癌患者）を選択して、投与されるため、高い治療効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法によれば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を、予め正確に予測することが可能である。これによって、治療効果の得られないと予測される患者に対しては、事前に他の抗腫瘍剤の使用を選択するようにすることができる。
【００３２】
また、中程度の治療効果が得られると予測される患者に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の投与量を増加させることにより、治療効果を高めることができる。なお、治療効果が高いと予測される患者に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の投与量を減らすことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄリガンドを示す模式図である。
【図２】腫瘍細胞（ＭｅｔｈＡ細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞、４Ｔ１細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、Ｓ１８０細胞、ＩＳＯＳ−１細胞、及びＣＴ２６細胞）におけるＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０）の発現をフローサイトメトリーで測定したグラフである。
【図３】ＭｅｔｈＡ細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が非発現）、４Ｔ１細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ発現、Ｈ６０非発現）、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が発現）に対するＰＳＫの抗腫瘍効果を示す図である。
【図４】ＭｅｔｈＡ細胞又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を移植したマウスにおけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現（Ａ）と細胞内ＩＦＮ−γの産生（Ｂ）を示すグラフである。
【図５】ＭｅｔｈＡ細胞又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を移植したマウスにＰＳＫを投与した際の細胞内ＩＦＮ−γの産生への影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法、抗腫瘍剤の治療効果予測キットおよび抗腫瘍剤の一実施形態について、以下に説明する。
【００３５】
本明細書、特許請求の範囲、及び図面（以下、本明細書等）において「分析」とは、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方の意味が含まれる意味で用いている。
【００３６】
また、本明細書等における「および／または」は、少なくともいずれか一方であることを意味している。すなわち、「Ａおよび／またはＢ」と表記した場合は、ＡおよびＢの少なくともいずれか一方であることを意味している。
【００３７】
［１］抗腫瘍剤の治療効果予測方法
（抗腫瘍剤）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法における抗腫瘍剤は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤であり、例としてＰＳＫを挙げることができる。ＰＳＫは、商品名「クレスチン」の名称で販売されており、カワラタケ菌ＣＭ１０１株〔ＦＥＲＭ−Ｐ２４１２（ＡＴＣＣ２０５４７）〕の菌糸体を水系溶媒、例えば、熱水又はアルカリ溶液（例えば、アルカリ金属の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液）で抽出し、精製した後に乾燥して得ることができる。主要画分の糖部分はβ−Ｄ−グルカンで、このグルカン部分の構造はβ１→３、β１→４及びβ１→６結合を含む分枝構造である。主な構成単糖はグルコースやマンノースであり、約１８〜３８％のタンパク質を含む。
【００３８】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、抗腫瘍活性を有するものであれば、限定されるものではない。例えば、クレスチン、並びにクレスチンのジェネリック医薬品であるアスクレ（日医工）、クレチール末（沢井製薬）、チオレスチン散（長生堂）、チオレスチン散（田辺製薬販売）、カルボクリン末（大洋薬品工業）、及びカルボクリン末（日本ケミファ）であってもよい。従って、これらのジェネリック医薬品であっても、本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法を用いることによって、治療効果を予測することが可能である。
【００３９】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの種類）
ＮＫＧ２Ｄリガンドは、主に、ＮＫ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、γδＴ細胞に発現しているＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドである。本発明において分析されるＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＮＫＧ２Ｄ受容体と結合するものであれば、特に限定されるものではなく、ＮＫＧ２Ｄ受容体以外の受容体に結合できるものも含む。また、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、動物種によっても種類やアミノ酸配列が異なっているが、動物種によって限定されるものではない。
【００４０】
ヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、MHC class I chain related protein A（以下、ＭＩＣＡと称する）、MHC class I chain related protein B（以下、ＭＩＣＢと称する）、UL16 binding protein 1（以下、ＵＬＢＰ１と称する）、UL16 binding protein ２（以下、ＵＬＢＰ２と称する）、UL16 binding protein ３（以下、ＵＬＢＰ３と称する）、Retinoic acid early transcript 1E（以下、ＲＡＥＴ１Ｅと称する）、及びRetinoic acid early transcript 1G（以下、ＲＡＥＴ１Ｇと称する）の７種類をあげることができる。この７種類のＮＫＧ２Ｄリガンドを、細胞膜との結合の違いにより分類した場合、２種類に分類することができる（図１）。
【００４１】
第１は、膜貫通領域及び細胞質内領域を有するＮＫＧ２Ｄリガンド（以下、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドと称する）であり、図１におけるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇが該当する。なお、ヒトの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞外領域にα１、α２及びα３ドメインを有するＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのα１α２α３サブグループと、α１、及びα２ドメインを有するＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇのα１α２サブグループに、更に分類することができる。
【００４２】
第２は、膜アンカー領域を有するＮＫＧ２Ｄリガンド（以下、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドと称する）であり、図１におけるＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３が該当する。なお、ヒトの膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞外領域にα１及びα２ドメインを有する。
【００４３】
また、マウスのＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、retinoic acid early 1α（以下、Ｒａｅ１αと称する）、retinoic acid early 1β（以下、Ｒａｅ１βと称する）、retinoic acid early 1γ（以下、Ｒａｅ１γと称する）、retinoic acid early 1δ（以下、Ｒａｅ１δと称する）、retinoic acid early 1ε（以下、Ｒａｅ１εと称する）、Ｈ６０、及びmurine ULBP-like transcript 1（以下、ＭＵＬＴ１と称する）の７種を挙げることができる。
【００４４】
マウスのＮＫＧ２ＤリガンドのそれぞれをヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドと同じように、細胞膜との結合の違いにより７種のＮＫＧ２Ｄリガンドを分類すると、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εは、膜アンカー領域を有する膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに分類され、Ｈ６０及びＭＵＬＴ１は、膜貫通領域及び細胞質内領域を有する膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに分類される。
【００４５】
マウスの膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの細胞外領域は、いずれもα１及びα２ドメインを有する。また、マウスの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドには、ヒトのα１α２α３サブグループに属するα３ドメインを有するものは、報告されていない。
【００４６】
なお、図１は、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ １に記載されているヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄリガンドの構造を示したものである。また、表１にヒト及びマウスのＫＧ２Ｄリガンドのアミノ酸配列及び塩基配列のアクセッション番号を示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の解析は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現をグループとして、まとめて行ってもよい。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドのそれぞれの発現、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドのそれぞれの発現を個別に解析してもよい。
【００４９】
例えば、マウスの場合、膜アンカー型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εをグループとして、まとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＨ６０及びＭＵＬＴ１をグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。但し、マウスの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの１つであるＭＵＬＴ１は、マウスの正常組織（細胞）においても発現が観察される。従って、本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法においては、ＭＵＬＴ１の発現の有無（又は高低）による治療効果の予測を排除するものではないが、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドとして、Ｈ６０の発現のみを解析することが好ましい。
【００５０】
ヒトの場合にも、膜アンカー型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３をグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇをグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。更に、ヒトの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、α１α２α３サブグループであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、並びにα１α２サブグループであるＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇを、それぞれまとめて解析するようにしてもよい。
【００５１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、他の抗癌剤と併用しない場合であっても、ＮＫＧ２Ｄリガンドが全く発現していない腫瘍細胞に最も高い治療効果を示し、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している腫瘍細胞にはほとんど治療効果を示さない。
【００５２】
従って、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することが可能である。治療効果の予測は、ＮＫＧ２Ｄリガンドのすべて種類のリガンドの発現を分析することによっても可能であるし、ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つのリガンドの発現を分析することによっても可能である。
【００５３】
例えば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、他の抗癌剤と併用しない場合であっても、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現していない腫瘍、又は発現が低い腫瘍に対して高い治療効果を示すが、特には膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現していない腫瘍に対して顕著な治療効果を示す。すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現していない腫瘍、または発現が低い腫瘍に対して高い治療効果を示す。
【００５４】
一方で、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの両方を発現している腫瘍に対しては、抗腫瘍剤の単独投与では治療効果が低いが、特には膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い腫瘍に対して、抗腫瘍剤の単独投与の治療効果が低い。すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している腫瘍に対して、抗腫瘍剤の単独投与では治療効果が低い。
【００５５】
なお、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方を発現していない腫瘍、又はいずれか一方の発現が低い腫瘍に対しては、中程度の治療効果を示す。特には、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方を発現していない腫瘍に対しての治療効果が高い。
【００５６】
また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍、又は膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低く、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現している（又は発現が高い）腫瘍に対して、中程度の治療効果を示す。特には、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍に対して治療効果が高い。
【００５７】
すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）のいずれか一方を発現している腫瘍、又はいずれか一方の発現が低い腫瘍に対して、中程度の治療効果を示す。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）を発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している腫瘍、又は膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）の発現が低く、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している（又は発現が高い）腫瘍に対して中程度の治療効果を示す。
【００５８】
ここで、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドがいずれも発現していないことを意味しており、実質的に検出限界以下であることを意味する。例えば、マウスでは、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εがいずれも発現していないことを意味している。同様に、ヒトでは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３がいずれも発現していないことを意味している。また、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低い」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がいずれも低いことを意味している。例えば、マウスでは、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εの発現がいずれも低いことを意味している。同様に、ヒトでは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３の発現がいずれも低いことを意味している。
【００５９】
ここで、本明細書等において、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドがいずれも発現していないことを意味しており、実質的に検出限界以下であることを意味する。ヒトでは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇがいずれも発現していないことを意味している。マウスでは、ＭＵＬＴ１およびＨ６０がいずれも発現していないことを意味するが、ＭＵＬＴ１の発現の有無にかかわらず、Ｈ６０が発現していないことを意味する場合もある。
【００６０】
また、本明細書等において、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低い」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がいずれも低いことを意味している。ヒトでは、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇの発現がいずれも低いことを意味している。マウスでは、ＭＵＬＴ１およびＨ６０の発現がいずれも低いことを意味するが、ＭＵＬＴ１の発現の有無にかかわらず、Ｈ６０の発現が低いことを意味することもある。
【００６１】
すなわち、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していることを意味することになる。また、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つの発現が高いことを意味することになる。同様に、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していることを意味することになる。更に、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つの発現が高いことを意味することになる。
【００６２】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析する手法）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法において、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の分析は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいはＮＫＧ２Ｄリガンドの存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではない。具体的には、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、（１）腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、（２）腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現を分析することにより行うことができる。また、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドには、タンパク質のプロセシングを受け、可溶性のＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質として血液中に分泌されるものがある。従って、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、（３）患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の存在を分析することによっても行うことができる。なお、可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の存在の分析は、体液中のプロテアーゼなどによって分解された可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの断片を分析することによっても行うことができる。
【００６３】
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現を分析する手法としては、ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法）を挙げることができる。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現を分析する手法の詳細については、下記に詳述する。
【００６４】
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現及び患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在を解析する手法としては、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体又はその断片を用い、ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質を測定する免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット）を挙げることができる。
【００６５】
なお、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドをグループとしてｍＲＮＡの発現を解析する場合、そのグループに属する各ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする塩基配列の共通部分に基づいてプライマー又はプローブを作製すればよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループ、又はα１α２サブグループを、グループとしてｍＲＮＡの発現を解析する場合は、それぞれＭＩＣＡ及びＭＩＣＢをコードする塩基配列の共通部分、又はＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇをコードする塩基配列の共通部分に基づいて、プライマー又はプローブを作製すればよい。また、ｍＲＮＡの発現を個別に解析する場合には、それぞれのＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする塩基配列の特異的な部分に基づいて、プライマー又はプローブを作製すればよい。
【００６６】
具体的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列又は配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、又は２７に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列を基に、プライマー及びプローブを作製することができる。例えば、ヒトの膜膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループのｍＲＮＡを検出するためには、配列番号１及び３の塩基配列をアラインし、一定の塩基配列の領域（例えば、１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ）において８０％以上、好ましく９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列の領域からプライマー又はプローブを作製することにより、膜膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループのｍＲＮＡを検出することが可能である。また、プライマーとして、混合塩基を含むｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ プライマーを用いることも可能である。
【００６７】
また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドをグループとしてタンパク質の発現を解析する場合は、例えば、そのグループに属するすべてのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループ、又はα１α２サブグループを、グループとしてタンパク質の発現を解析する場合は、それぞれＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに特異的に結合する抗体、又はＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。タンパク質の発現を個別に解析する場合は、それぞれのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。
【００６８】
（ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ発現分析の詳細）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現は、試料中の遺伝子（例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなど）と、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用いてハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができる。これらの中でもリアルタイムＰＣＲ法などのＰＣＲ法が、正確且つ簡便であり、好ましい。
【００６９】
リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、インターカレーター法又はＴａｑＭａｎ法を挙げることができる。インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）をフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲの反応系に加える方法である。また、ＴａｑＭａｎ法は、プライマーセット及び５’末端をレポーター色素により修飾すると共に、３’末端をクエンチャー色素により修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲの反応系に加える方法である。なお、これらのリアルタイムＰＣＲ法は市販のキット及び装置を用いて実施するようにすればよい。
【００７０】
サザンブロット法、ノザンブロット法、又はＰＣＲ法に用いるプライマー及びプローブは、ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作製することができる。具体的には、表１に記載のＮＫＧ２Ｄリガンドの塩基配列から、適当な塩基配列を選択して作製すればよい。プライマーの長さは、特に限定されるものではないが、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであることが最も好ましい。プローブの長さも、特に限定されるものではないが、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることが好ましく、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであることがより好ましく、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒであることが最も好ましい。
【００７１】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質発現分析の詳細）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、フローサイトメトリー又はウエスタンブロット）を用いて分析することができる。これらの中でも、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現については、免疫組織染色法、フローサイトメトリー、又はウエスタンブロットにより分析することが好ましく、患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在については、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測定法により分析することが好ましい。
【００７２】
免疫組織染色法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知の免疫組織染色法に従って行うことが可能である。免疫組織染色法の一例について以下に簡単に記載する。まず、癌患者の生検材料から調製した組織切片に、マウス抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を結合させる。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として結合させ、３，３’−ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidine）染色する。染色後、顕微鏡により、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を確認することができるようになる。
【００７３】
フローサイトメトリーは、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知の方法に従って行うことが可能である。フローサイトメトリーの一例について、以下に間単に説明する。癌患者から得られた癌細胞に、フィコエリスリン（ＰＥ）標識したマウス抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を４℃で結合させる。これによって、フローサイトメーターにより、ＮＫＧ２Ｄリガンドの癌細胞表面への発現を確認することができるようになる。
【００７４】
ウエスタンブロット法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知のウエスタンブロット法に従って行うことが可能である。ウエスタンブロット法の一例について、以下に簡単に説明する。まず、癌患者の生検材料から調製した試料を電気泳動する。続いて、電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜などのブロット膜に転写する。ブロット膜は適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）でブロッキングする。その後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識した抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を接触させ、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合させる。最後に、ブロット膜を洗浄し、酵素に対する発色基質又は発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
【００７５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一例について、以下に簡単に説明する。まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体をブロッキングする。捕捉抗体が固相化された不溶性担体（プレート又はビーズ等）に、ＮＫＧ２Ｄリガンドの含まれる可能性のある被検試料を一次反応液と一緒に加えることにより、捕捉抗体とＮＫＧ２Ｄリガンドとを結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかったＮＫＧ２Ｄリガンドおよび夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体と、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素と、が結合した標識抗体（２次抗体）を添加することにより、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＮＫＧ２Ｄリガンド−標識抗体の免疫複合体が不溶性担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄した後に標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加することにより、酵素と基質を反応させたシグナルを検出する。
【００７６】
なお、免疫学的分析方法に用いる抗体は、免疫抗原としてＮＫＧ２Ｄリガンドを用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能である。モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えばウサギの皮内に、ＮＫＧ２Ｄリガンドを単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫し、血中の抗体価が上昇した時点で採血してそのまま抗血清とするか、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００７７】
また、免疫学的分析方法に用いる抗体として、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗原結合部位を含む抗体フラグメントを用いることも可能である。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。
【００７８】
ヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な抗体としては、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＲＡＥＴ１Ｅ、又はＲＡＥＴ１Ｇに特異的に結合する抗体を用いることもできる。また膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３）に結合する抗体、又は膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇ）に結合する抗体を用いてもよい。あるいは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いてもよいし、α１α２サブグループであるＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇに結合する抗体を用いてもよい。マウスのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な抗体としては、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε、Ｈ６０又はＭＵＬＴ１に特異的に結合する抗体を用いることができる。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）に結合する抗体、又は膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０及びＭＵＬＴ１）に結合する抗体を用いてもよい。
【００７９】
（ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現による治療効果の予測）
本発明では、対象（癌患者）の免疫細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析することによっても抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、主にＮＫ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、及びγδＴ細胞に発現する活性型受容体である。ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現した腫瘍細胞は、対応するＮＫＧ２Ｄ受容体を発現しているＮＫ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞等により攻撃を受けやすい。すなわち、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍細胞は、免疫細胞によって排除されやすい。
【００８０】
一方、ＮＫ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞等は、慢性的にＮＫＧ２Ｄリガンドに曝露される事により、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が減少するため、活性が低下する可能性がある。このように、ＮＫＧ２Ｄ受容体とＮＫＧ２Ｄリガンドとは免疫細胞の活性化と抑制の両面に関与する。
【００８１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が低い腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量より高い。
【００８２】
すなわち、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対しては、他の抗がん剤との併用しない場合でも、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は高い治療効果を示す。一方、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が低い対象（癌患者）に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の単独の投与では治療効果が低い。
【００８３】
このように、腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量を測定することによって、抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００８４】
免疫細胞は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を発現しているものであれば、限定されるものではない。免疫細胞として、例えばＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及び活性化マクロファージ（マウスにおいて）などを挙げることができ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が好ましい。免疫細胞において、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高いとは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の高い対象（患者）及び治療効果の低い対象（患者）を比較した場合に、統計学的に有意に高いすべての場合を含む。
【００８５】
例えば、後述の実施例に示すように、ＣＤ８陽性Ｔ細胞においては、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）及び治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）のＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合は、いずれも正常個体のそれよりも高い。しかしながら、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）と治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）とでは、ＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合に明らかな差が認められる。実際に治療効果の予測を行う場合は、例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合が一定以上の対象（患者）を、治療効果があると予測することが可能である。また、ＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現量が一定以上の対象（患者）を、治療効果があると予測することも可能である。
【００８６】
一方、実施例には示していないが、ＮＫ細胞においては、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）及び治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）のＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合は、いずれも正常個体のそれよりも低いことがある。しかしながら、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）と治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）とでは、ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞の割合に明らかな差が認められるため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と同じように、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の予測を行うことが可能である。
【００８７】
（ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析する手法）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法において、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析するための手法は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を定量的又は半定量的に決定することができる限り、特に限定されるものではない。具体的には、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、又は免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現を分析するようにすればよい。
【００８８】
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法）により分析することができる。また、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体又はその断片を用いてＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質を測定する免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット）により分析することができる。
【００８９】
それぞれの具体的な方法は、上述の[１]抗腫瘍剤の治療効果予測方法において説明したものと同様であるため、ここではその説明を省略する。すなわち、ＮＫＧ２ＤリガンドをＮＫＧ２Ｄ受容体に読み換えるようにすればよい。なお、ｍＲＮＡの測定に用いるプローブ及びプライマーは、配列番号２９に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列又は配列番号３１又は３３に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列を基に作製することができる。また、免疫学的測定方法に用いる抗体は、配列番号３０に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号３２又は３４に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として用いることにより作製することができる。なお、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体（以下、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１と称することがある）と、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体（以下、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２と称することがある）とは、スプライシングの異なるスプライシングバリアントである。また、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体は、配列番号３１で表される塩基配列にコードされており、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体は、配列番号３３で表される塩基配列にコードされている。前記マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２は、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１のＮ末側に１３アミノ酸が付加されたものである。従って、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体抗体の多くは、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１及びマウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２に結合することが可能であり、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体の検出用プライマー及びプローブの多くも、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１及びマウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２のｍＲＮＡの検出に用いることができる。
【００９０】
（付記事項）
本発明の治療効果予測方法の対象となる癌（悪性腫瘍）としては、例えば、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。これらの中でも、特に、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、又は胃癌を対象とすることが好ましい。
【００９１】
本発明の治療効果予測方法を適用することのできる動物としては、ヒトを挙げることができる。もちろん、本発明の治療効果予測方法を適用することのできる動物は、抗腫瘍剤を適用する動物であればヒトに限定されるものではなく、非ヒト動物であってもよい。なお、本明細書等において、「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物全般を意味している。非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ハムスター、フェレット、又はラットなどを挙げることができるが、もちろんこれらの動物に限定されるものではない。
【００９２】
［２］抗腫瘍剤の治療効果予測キット
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測キット（以下、単にキットとも称する）は、前記の抗腫瘍剤の治療効果予測方法を実行するために用いるものである。
【００９３】
従って、ＮＫＧ２Ｄリガンドの分析方法として免疫学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を含む。ＮＫＧ２Ｄリガンドの分析方法として分子生物学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含む。また、ＮＫＧ２Ｄ受容体の分析方法として免疫学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体を含む。
【００９４】
同様に、ＮＫＧ２Ｄ受容体の分析方法として分子生物学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含む。
【００９５】
免疫学的分析方法を用いるキットには、用いる免疫学的手法に応じて、ＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体もしくはその断片、または、ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する抗体もしくはその断片が、所望の形態で含まれていることが好ましい。抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体フラグメントとしては、ＮＫＧ２Ｄリガンド又はＮＫＧ２Ｄ受容体への特異的結合能を有するもの、すなわち抗原結合部位を有するものであれば特に限定されるものではない。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
【００９６】
測定手法として酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法を用いる場合、本発明に係るキットにおける抗体は標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含まれていることが好ましい。酵素免疫測定法において用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。蛍光抗体法において用いる蛍光物質としては、フルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を挙げることができる。また、放射免疫測定法において用いる放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を挙げることができる。なお、本発明に係るキットでは、その他の標識物質として、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を用いてもよい。また、本発明のキットは、酵素又は化学発光物質に対する適当な基質等を含んでいてもよい。
【００９７】
分子生物学的分析方法を用いるキットには、ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブ、またはＮＫＧ２Ｄ受容体をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブが含まれていることが好ましい。本発明のキットにおいて用いられるプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）及びプローブは、混合物として含まれていてもよいし、個別の試薬として含まれていてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブに加えて、ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、サザンブロット法、又はノザンブロット法を行うために必要な試薬及び／又は酵素を含んでいてもよい。
【００９８】
なお、本発明のキットは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果予測用であることを明記した使用説明書を含んでいてもよい。カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果予測用である旨の記載は、キットの容器に付されていてもよい。
【００９９】
［３］抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含むものであり、上述した抗腫瘍剤の治療効果予測方法において治療効果があると判断された場合に投与されるものである。本発明の抗腫瘍剤は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍に対しては、他の抗がん剤と併用しない場合でも高い治療効果を示す。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方が発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍に対しては、中程度の治療効果を示す。
【０１００】
従って、本発明の抗腫瘍剤は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくともいずれか一方が発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍を有する対象（癌患者）に対して、抗腫瘍効果を奏する。更に、本発明の抗腫瘍剤は、ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍を有する対象（癌患者）に対しても、抗腫瘍効果を奏する。
【０１０１】
また、本発明の抗腫瘍剤は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対しても他の抗がん剤との併用することなく高い治療効果を示す。すなわち、本発明の抗腫瘍剤は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対する投与も効果的である。
【０１０２】
本発明の抗腫瘍剤の対象となる癌（悪性腫瘍）としては、上述した癌と同様である。すなわち、例えば、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。これらの中でも、特に、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、又は胃癌に対して投与することが好ましい。
【０１０３】
また、本発明の抗腫瘍剤は、上述した治療効果予測方法を適用することができる動物に対して適用することができる。すなわち、本発明にかかる抗腫瘍剤は、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ハムスター、フェレット、又はラットなどに利用することができる。
【０１０４】
本発明の抗腫瘍剤は、一般にヒトを対象とする場合、１日当り３ｇを１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。もちろん投与量はこれに限定されるものではなく、症状によって適宜増減することができる。
【０１０５】
なお、本発明の抗腫瘍剤の好適な投与量は、年令、個人差、又は病状などに応じて適宜変化することはいうまでもない。また、本発明の抗腫瘍剤の好適な投与量は、投与対象がヒトであるかあるいはその他の動物であるかによっても変化する。
【０１０６】
本発明の抗腫瘍剤の投与形態としては、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁剤、スティック剤、分包包装体、又は乳剤等であることが好ましい。カプセル剤として服用する場合は、通常のゼラチンの他に、必要に応じて腸溶性のカプセルを用いることもできる。錠剤として用いる場合は、体内でもとの微小粒体に解錠されるようにすればよい。また、本発明の抗腫瘍剤は。アルミゲルやケイキサレートなどの電解質調節剤と配合した複合剤の形態で用いることもできる。
【０１０７】
（参考形態）
なお、本発明は、
腫瘍の治療方法であって、
腫瘍の患者から腫瘍の試料を採取する工程と、
前記試料中のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を測定する工程と、
膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの両方、又はいずれか一方が発現していない場合にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤をその患者に投与する工程と、を含む腫瘍の治療方法を含む。
【０１０８】
また、本発明は、
腫瘍の治療方法であって、
腫瘍の患者から免疫細胞を含む試料を採取する工程と、
前記試料中のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を測定する工程と、
ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤をその患者に投与する工程と、を含む腫瘍の治療方法を含む。
【０１０９】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる態様についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
《実施例１：腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現》
マウスの腫瘍細胞７種類について、ＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅ−１及びＨ６０の発現を調べた。細胞としては、ＭｅｔｈＡ細胞（マウス肉腫由来）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ由来）、４Ｔ１細胞（マウス乳癌由来）、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞（マウス肉腫由来）、Ｓ１８０細胞（マウス肉腫由来）、ＩＳＯＳ−１細胞（マウス肉腫由来）、ＣＴ２６細胞（マウス大腸癌由来）を用いた。抗体としては、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εのすべてのＲａｅ−１ ｆａｍｉｌｙに結合するＰＥ標識抗Ｒａｅ−１抗体（R&D systems社）及びＨ６０に結合するＰＥ標識抗Ｈ６０抗体を用いた。陰性コントロールとしては、アイソタイプコントロール抗体を用いた。
【０１１２】
なお、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドであり、Ｈ６０は、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドである。
【０１１３】
約１ｘ１０５個の腫瘍細胞にそれぞれの抗体を加え、氷上にて、約１時間反応させた後、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０の発現を分析した。結果を、図２に示す。破線が、ＰＥ標識抗Ｒａｅ−１抗体又はＰＥ標識抗Ｈ６０抗体を用いた、Ｒａｅ−１又はＨ６０の発現を示しており、実線がコントロールのＩｇＧの結果である。
【０１１４】
図２に示すように、７つの腫瘍細胞は、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を、両方とも発現していないＭｅｔｈＡ細胞、Ｓ１８０細胞、及びＢ１６Ｆ１０細胞のグループ（以下、グループ（１）と称する）、Ｈ６０を発現しているが、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙを発現していない４Ｔ１細胞、ＣＴ２６細胞のグループ（以下、グループ（２）と称する）、及びＲａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を両方とも発現しているＫ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞のグループ（以下、グループ（３）と称する）の３グループに分かれた。
【０１１５】
《実施例２：腫瘍移植マウスでのＰＳＫの治療効果の検討》
（Ａ）６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、又は４ＴＩ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植し、翌日よりＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与後、ＭｅｔｈＡ細胞移植群は２３日、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植群は１４日まで、４ＴＩ細胞移植群は１８日まで、腫瘍の体積を測定した。結果を図３に示す。腫瘍体積は、黒四角がＰＳＫが投与された群を示し、黒菱形が生理食塩水を投与された群を示す。
【０１１６】
（Ｂ）６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、４Ｔ１細胞、ＩＳＯＳ−１細胞、又はＣＴ２６細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。また、６週齢のメスのＩＣＲマウスにＳ１８０細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。移植の翌日よりＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与後、それぞれの腫瘍の体積を測定し、ＰＳＫの治療効果を判定した。結果を表２に示す。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
表２及び図３より明らかなように、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を発現していないグループ（１）の腫瘍細胞（ＭｅｔｈＡ細胞、Ｓ１８０細胞、及びＢ１６Ｆ１０細胞）に対して、ＰＳＫによる顕著な抗腫瘍効果が認められた。Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙは発現していないが、Ｈ６０を発現している、グループ（２）の腫瘍細胞（４Ｔ１細胞、及びＣＴ２６細胞）に対して、中程度の抗腫瘍効果が認められた。一方、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が発現しているＫ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞のグループ（３）の腫瘍細胞（Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞においては、ＰＳＫの抗腫瘍効果は認められなかった。
【０１１９】
このように、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の有無とＰＳＫの抗腫瘍効果とは相関しており、腫瘍組織および血清中のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が、ＰＳＫの治療に対する感受性又は非感受性の予測因子として用いることができることが示された。
【０１２０】
《実施例３：ＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現と細胞内ＩＦＮ−γの産生》
本実施例では、腫瘍移植マウスにおけるＣＤ８陽性細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現及び細胞内ＩＦＮ−γの産生を検討した。
【０１２１】
（１）腫瘍細胞の移植
６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス、それぞれ８匹にマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。移植後２〜４週間目に、マウスをジエチルエーテル麻酔により屠殺し、クリーンベンチ内にて下大静脈より血液採取及び脾臓摘出を行った。
【０１２２】
（２）血液細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現解析
血液は１ｍＬシリンジ（テルモ）を用いてＥＤＴＡ含有採血管（ＢＤ）に回収し混和した後、４００ｕＬを１５ｍＬチューブに移した。血液に１×ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）を加え、攪拌し、室温にて１５分反応させ赤血球を溶血させた。遠心及び洗浄した細胞を、細胞計数板を用いて計数した。得られた血液細胞に、ＦｃＢｌｏｃｋを添加後、ＰｅｒＣＰ−ＣＤ８抗体及びＰＥ−ｃｏｎｔｒｏｌ／ＮＫＧ２Ｄ受容体抗体を加え、４℃で反応させ、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により解析した。
【０１２３】
（３）脾臓細胞における細胞内ＩＦＮ−γの産生の解析
脾臓は金属メッシュ上でつぶした後、１００μｍのファルコンフィルタを通して５０ｍＬチューブに濾過し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットをＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、細胞計数板を用いて、細胞数を計数した。脾臓細胞に１×ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）を加え、攪拌し、室温にて１５分反応させ赤血球を溶血させた。更に、遠心及び洗浄した細胞を、細胞計数板を用いて計数した。得られた脾細胞２×１０６ｃｅｌｌｓを１５ｍＬ ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅに移し、刺激群は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（１０μｇ／ｍＬ：ＢＤ社製）、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ）及びＡ２３１８７（２５０ｎｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ）を添加後３７℃、ＣＯ２５％条件下で５時間培養した。コントロールの無刺激群は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａのみを加えて、同じ操作を行った。それぞれの細胞を洗浄後、ＦｃＢｌｏｃｋを添加後、標識抗体（ＡＰＣ−ＣＤ８）を加え、氷上で反応させ、更に固定／透過液で処理した後、無刺激群、及び刺激群を各々２本のチューブに分注し、標識抗体（ＦＩＴＣ−ＩＦＮ−γ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を加えて反応後、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により解析した。
【０１２４】
結果を図４に示す。ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスでは、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスと比較して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高かった。また、ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスと比較して、Ｋ−Ｂａｌｂ移植マウスの脾臓細胞中のＣＤ８陽性Ｔ細胞において細胞内ＩＦＮ−γの産生が減少していた。
【０１２５】
これらの結果と、実施例２のＭｅｔｈＡ細胞及びＫ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスにおけるＰＳＫの治療効果とから、治療対象（癌患者）の免疫細胞においてＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合、その治療対象の腫瘍に対して、ＰＳＫの治療効果が高いことが示された。したがって、対象（癌患者）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を調べることによって、ＰＳＫの治療効果を予測することが可能である。
【０１２６】
《実施例４：末梢における免疫細胞の細胞内ＩＦＮ−γの産生に対するＰＳＫの影響》
本実施例では、腫瘍移植マウスにおけるＣＤ８陽性細胞の細胞内ＩＦＮ−γの産生に対するＰＳＫ投与の影響を検討した。６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＭｅｔｈＡ細胞、又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植し、腫瘍体積が５００ｍｍ３〜７００ｍｍ３に達した段階で群分けを行い、ＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与開始後に、３回投与後マウスをジエチルエーテル麻酔により屠殺し、クリーンベンチ内にて脾臓摘出を行った。得られた脾臓を用いて、実施例３の（３）の操作を繰り返した。結果を図５に示す。ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスでは、ＰＳＫ投与によりＣＤ８陽性細胞における細胞内ＩＦＮ−γの産生が上昇していた。一方、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスでは、ＰＳＫ投与による細胞内ＩＦＮ−γの産生増加は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の使用を選択する際の指標として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤の治療効果予測方法に関し、特には、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カワラタケから抽出される蛋白多糖体は、抗腫瘍活性などを示す。例えば、特開昭６０−４５５３３号公報（特許文献１）には、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分とする抗腫瘍剤などが記載されている。このような蛋白多糖体のなかで、カワラタケ由来の蛋白多糖体の一種であるＰＳＫ（登録商標）（商品名「クレスチン」（登録商標））は、皮内投与や静脈内投与だけでなく、経口投与によっても抗腫瘍活性を示すことが特長であり、臨床的にも経口投与製剤として用いられている。
【０００３】
ＰＳＫは、約１８〜３８％の蛋白質を含む蛋白多糖体であり、５０００以上（ゲル濾過法）の分子量、例えば５０００〜３０００００（ゲル濾過法）の分子量を有するものである。主要画分の糖部分はβ−Ｄ−グルカンで、このグルカン部分の構造は、１→３、１→４及び１→６結合を含む分枝構造である。
【０００４】
最近、腫瘍に対する抗腫瘍剤の治療効果又は治療の予後を予測することにより、最適な抗腫瘍剤の選択、抗腫瘍剤の投与量の調節などを行い、抗腫瘍剤の治療効果を上昇させる試みが行われている。
【０００５】
例えば、特許文献２には、抗癌剤投与後の患者の予後と正の相関を示す８つの遺伝子群と、負の相関を示す８つの遺伝子群の発現データ基づいた、大腸癌組織における抗腫瘍剤投与後の患者の予後予測手法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献３には、ｐ１６０ファミリー分子群の発現量とＳＰ１１０ファミリー発現量とを比較することによる肝臓癌におけるＲＡＲ−α作動薬の治療効果予測手法が開示されている。
【０００７】
更に、特許文献４には、乳癌細胞の核内のメニンの発現に基づいた乳癌における抗腫瘍剤の選択手法が開示されている。具体的には、特許文献４では、メニンが陽性の場合には、エストロゲンレセプターを遮断するタモキシフェンなどの治療薬を避けて、エストロゲン合成そのものを阻害するＬＨ−ＲＨアナログか、又はアロマターゼ阻害剤を用いるようにしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６０−４５５３３号公報
【特許文献２】特開２００７−３７４０９号公報
【特許文献３】国際公開２００７／０４９５４２号
【特許文献４】特開２００４−１０１３５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（英国）２００７年、第１２１巻、ｐ．４３９−４４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一方、ＰＳＫの治療効果の予測に関しても、患者の免疫系と治療効果との関連から、細胞性免疫活性、血清ＩＡＰ及びシアル酸値、ＳＩ値及びＧ／Ｌ比、サイトカイン産生能、並びにＨＬＡタイピングなどが予測因子として有用であるかについて、検討されてきている。しかしながら、現在までのところ、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤では、治療効果を予測（評価）するためのマーカーは見出されていない。
【００１１】
そのため、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤では、用いた際の治療効果を事前に予測することができないという問題を有している。
【００１２】
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、その主たる目的は、ＰＳＫに代表されるようなカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、腫瘍移植モデルマウスを用いカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の研究を行ったところ、移植された腫瘍の種類によって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が顕著に異なることを見出した。そこで、本発明者らは、腫瘍細胞にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の差異を規定する要因があると仮定し、その要因を特定することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することが可能であると考えた。
【００１４】
本発明者らは、鋭意検討した結果、抗腫瘍剤の治療効果が低い腫瘍細胞においては、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が多いのに対して、抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍細胞においては、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がないか、又はＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低いことを見出した。
【００１５】
更に、本発明者らは、抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍細胞を有する対象（癌患者）においては、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高いことを見出した。すなわち、本発明者らは、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）においては、ＰＳＫなどのカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が高く、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が低い対象（癌患者）においては、ＰＳＫなどのカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が低いことを見出した。
【００１６】
本発明は、係る新たな知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
【００１７】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測している。
【００１９】
これは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が、対象（癌患者）の腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現量に応じて変化するためである。
【００２０】
このように、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現量を測定することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００２１】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程は、前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び患者の体液中における可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在の少なくとも１つを分析する工程であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記腫瘍が、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程において発現を分析するＮＫＧ２Ｄリガンドは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドであることが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３であり、前記膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢであることが好ましい。
【００２３】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記リガンド発現分析工程におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３に結合する抗体、並びにＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いて分析することが好ましい。本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体発現を分析する受容体発現分析工程を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の免疫細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析することにより、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測している。
【００２５】
これは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が、対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量に応じて変化するためである。
【００２６】
このように、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量を測定することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００２７】
また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法では、前記受容体発現分析工程は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、及び免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現の少なくとも１つを分析する工程であることが好ましい。また、本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測キットは、上述の抗腫瘍剤の治療効果予測方法に用いる抗腫瘍剤の治療効果予測キットであって、ＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体、ＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、及びＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体、からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする。
【００２８】
上記の構成によれば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を効果的に予測することができる治療効果予測キットを提供することができる。
【００２９】
なお、本発明は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、対象となる腫瘍細胞が膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも一方を発現していない場合に投与する抗腫瘍剤、および、
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合に投与する抗腫瘍剤についても包含する。
【００３０】
本発明に係る抗腫瘍剤は、治療効果の高い腫瘍を有する対象（癌患者）を選択して、投与されるため、高い治療効果を得ることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法によれば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を、予め正確に予測することが可能である。これによって、治療効果の得られないと予測される患者に対しては、事前に他の抗腫瘍剤の使用を選択するようにすることができる。
【００３２】
また、中程度の治療効果が得られると予測される患者に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の投与量を増加させることにより、治療効果を高めることができる。なお、治療効果が高いと予測される患者に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の投与量を減らすことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄリガンドを示す模式図である。
【図２】腫瘍細胞（ＭｅｔｈＡ細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞、４Ｔ１細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、Ｓ１８０細胞、ＩＳＯＳ−１細胞、及びＣＴ２６細胞）におけるＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０）の発現をフローサイトメトリーで測定したグラフである。
【図３】ＭｅｔｈＡ細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が非発現）、４Ｔ１細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ発現、Ｈ６０非発現）、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞（Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が発現）に対するＰＳＫの抗腫瘍効果を示す図である。
【図４】ＭｅｔｈＡ細胞又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を移植したマウスにおけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現（Ａ）と細胞内ＩＦＮ−γの産生（Ｂ）を示すグラフである。
【図５】ＭｅｔｈＡ細胞又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を移植したマウスにＰＳＫを投与した際の細胞内ＩＦＮ−γの産生への影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法、抗腫瘍剤の治療効果予測キットおよび抗腫瘍剤の一実施形態について、以下に説明する。
【００３５】
本明細書、特許請求の範囲、及び図面（以下、本明細書等）において「分析」とは、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方の意味が含まれる意味で用いている。
【００３６】
また、本明細書等における「および／または」は、少なくともいずれか一方であることを意味している。すなわち、「Ａおよび／またはＢ」と表記した場合は、ＡおよびＢの少なくともいずれか一方であることを意味している。
【００３７】
［１］抗腫瘍剤の治療効果予測方法
（抗腫瘍剤）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法における抗腫瘍剤は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤であり、例としてＰＳＫを挙げることができる。ＰＳＫは、商品名「クレスチン」の名称で販売されており、カワラタケ菌ＣＭ１０１株〔ＦＥＲＭ−Ｐ２４１２（ＡＴＣＣ２０５４７）〕の菌糸体を水系溶媒、例えば、熱水又はアルカリ溶液（例えば、アルカリ金属の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液）で抽出し、精製した後に乾燥して得ることができる。主要画分の糖部分はβ−Ｄ−グルカンで、このグルカン部分の構造はβ１→３、β１→４及びβ１→６結合を含む分枝構造である。主な構成単糖はグルコースやマンノースであり、約１８〜３８％のタンパク質を含む。
【００３８】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、抗腫瘍活性を有するものであれば、限定されるものではない。例えば、クレスチン、並びにクレスチンのジェネリック医薬品であるアスクレ（日医工）、クレチール末（沢井製薬）、チオレスチン散（長生堂）、チオレスチン散（田辺製薬販売）、カルボクリン末（大洋薬品工業）、及びカルボクリン末（日本ケミファ）であってもよい。従って、これらのジェネリック医薬品であっても、本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法を用いることによって、治療効果を予測することが可能である。
【００３９】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの種類）
ＮＫＧ２Ｄリガンドは、主に、ＮＫ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、γδＴ細胞に発現しているＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドである。本発明において分析されるＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＮＫＧ２Ｄ受容体と結合するものであれば、特に限定されるものではなく、ＮＫＧ２Ｄ受容体以外の受容体に結合できるものも含む。また、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、動物種によっても種類やアミノ酸配列が異なっているが、動物種によって限定されるものではない。
【００４０】
ヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、MHC class I chain related protein A（以下、ＭＩＣＡと称する）、MHC class I chain related protein B（以下、ＭＩＣＢと称する）、UL16 binding protein 1（以下、ＵＬＢＰ１と称する）、UL16 binding protein ２（以下、ＵＬＢＰ２と称する）、UL16 binding protein ３（以下、ＵＬＢＰ３と称する）、Retinoic acid early transcript 1E（以下、ＲＡＥＴ１Ｅと称する）、及びRetinoic acid early transcript 1G（以下、ＲＡＥＴ１Ｇと称する）の７種類をあげることができる。この７種類のＮＫＧ２Ｄリガンドを、細胞膜との結合の違いにより分類した場合、２種類に分類することができる（図１）。
【００４１】
第１は、膜貫通領域及び細胞質内領域を有するＮＫＧ２Ｄリガンド（以下、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドと称する）であり、図１におけるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇが該当する。なお、ヒトの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞外領域にα１、α２及びα３ドメインを有するＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのα１α２α３サブグループと、α１、及びα２ドメインを有するＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇのα１α２サブグループに、更に分類することができる。
【００４２】
第２は、膜アンカー領域を有するＮＫＧ２Ｄリガンド（以下、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドと称する）であり、図１におけるＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３が該当する。なお、ヒトの膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、細胞外領域にα１及びα２ドメインを有する。
【００４３】
また、マウスのＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、retinoic acid early 1α（以下、Ｒａｅ１αと称する）、retinoic acid early 1β（以下、Ｒａｅ１βと称する）、retinoic acid early 1γ（以下、Ｒａｅ１γと称する）、retinoic acid early 1δ（以下、Ｒａｅ１δと称する）、retinoic acid early 1ε（以下、Ｒａｅ１εと称する）、Ｈ６０、及びmurine ULBP-like transcript 1（以下、ＭＵＬＴ１と称する）の７種を挙げることができる。
【００４４】
マウスのＮＫＧ２ＤリガンドのそれぞれをヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドと同じように、細胞膜との結合の違いにより７種のＮＫＧ２Ｄリガンドを分類すると、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εは、膜アンカー領域を有する膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに分類され、Ｈ６０及びＭＵＬＴ１は、膜貫通領域及び細胞質内領域を有する膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに分類される。
【００４５】
マウスの膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの細胞外領域は、いずれもα１及びα２ドメインを有する。また、マウスの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドには、ヒトのα１α２α３サブグループに属するα３ドメインを有するものは、報告されていない。
【００４６】
なお、図１は、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ １に記載されているヒト及びマウスのＮＫＧ２Ｄリガンドの構造を示したものである。また、表１にヒト及びマウスのＫＧ２Ｄリガンドのアミノ酸配列及び塩基配列のアクセッション番号を示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の解析は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現をグループとして、まとめて行ってもよい。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドのそれぞれの発現、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドのそれぞれの発現を個別に解析してもよい。
【００４９】
例えば、マウスの場合、膜アンカー型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εをグループとして、まとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＨ６０及びＭＵＬＴ１をグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。但し、マウスの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの１つであるＭＵＬＴ１は、マウスの正常組織（細胞）においても発現が観察される。従って、本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法においては、ＭＵＬＴ１の発現の有無（又は高低）による治療効果の予測を排除するものではないが、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドとして、Ｈ６０の発現のみを解析することが好ましい。
【００５０】
ヒトの場合にも、膜アンカー型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３をグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇをグループとしてまとめて解析するようにしてもよいし、それぞれ個別に解析するようにしてもよい。更に、ヒトの膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドは、α１α２α３サブグループであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、並びにα１α２サブグループであるＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇを、それぞれまとめて解析するようにしてもよい。
【００５１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、他の抗癌剤と併用しない場合であっても、ＮＫＧ２Ｄリガンドが全く発現していない腫瘍細胞に最も高い治療効果を示し、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している腫瘍細胞にはほとんど治療効果を示さない。
【００５２】
従って、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析することによって、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果を予測することが可能である。治療効果の予測は、ＮＫＧ２Ｄリガンドのすべて種類のリガンドの発現を分析することによっても可能であるし、ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つのリガンドの発現を分析することによっても可能である。
【００５３】
例えば、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は、他の抗癌剤と併用しない場合であっても、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現していない腫瘍、又は発現が低い腫瘍に対して高い治療効果を示すが、特には膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現していない腫瘍に対して顕著な治療効果を示す。すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現していない腫瘍、または発現が低い腫瘍に対して高い治療効果を示す。
【００５４】
一方で、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの両方を発現している腫瘍に対しては、抗腫瘍剤の単独投与では治療効果が低いが、特には膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い腫瘍に対して、抗腫瘍剤の単独投与の治療効果が低い。すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している腫瘍に対して、抗腫瘍剤の単独投与では治療効果が低い。
【００５５】
なお、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方を発現していない腫瘍、又はいずれか一方の発現が低い腫瘍に対しては、中程度の治療効果を示す。特には、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方を発現していない腫瘍に対しての治療効果が高い。
【００５６】
また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍、又は膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低く、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現している（又は発現が高い）腫瘍に対して、中程度の治療効果を示す。特には、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍に対して治療効果が高い。
【００５７】
すなわち、マウスにおいては、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）のいずれか一方を発現している腫瘍、又はいずれか一方の発現が低い腫瘍に対して、中程度の治療効果を示す。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）を発現しておらず、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している腫瘍、又は膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）の発現が低く、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）を発現している（又は発現が高い）腫瘍に対して中程度の治療効果を示す。
【００５８】
ここで、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドがいずれも発現していないことを意味しており、実質的に検出限界以下であることを意味する。例えば、マウスでは、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εがいずれも発現していないことを意味している。同様に、ヒトでは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３がいずれも発現していないことを意味している。また、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低い」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がいずれも低いことを意味している。例えば、マウスでは、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εの発現がいずれも低いことを意味している。同様に、ヒトでは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３の発現がいずれも低いことを意味している。
【００５９】
ここで、本明細書等において、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドがいずれも発現していないことを意味しており、実質的に検出限界以下であることを意味する。ヒトでは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇがいずれも発現していないことを意味している。マウスでは、ＭＵＬＴ１およびＨ６０がいずれも発現していないことを意味するが、ＭＵＬＴ１の発現の有無にかかわらず、Ｈ６０が発現していないことを意味する場合もある。
【００６０】
また、本明細書等において、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が低い」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの発現がいずれも低いことを意味している。ヒトでは、ＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇの発現がいずれも低いことを意味している。マウスでは、ＭＵＬＴ１およびＨ６０の発現がいずれも低いことを意味するが、ＭＵＬＴ１の発現の有無にかかわらず、Ｈ６０の発現が低いことを意味することもある。
【００６１】
すなわち、本明細書等において、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していることを意味することになる。また、「膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い」とは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つの発現が高いことを意味することになる。同様に、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現している」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していることを意味することになる。更に、「膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が高い」とは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドに属するＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つの発現が高いことを意味することになる。
【００６２】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析する手法）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法において、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の分析は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいはＮＫＧ２Ｄリガンドの存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではない。具体的には、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、（１）腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、（２）腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現を分析することにより行うことができる。また、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドには、タンパク質のプロセシングを受け、可溶性のＮＫＧ２Ｄリガンドタンパク質として血液中に分泌されるものがある。従って、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、（３）患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の存在を分析することによっても行うことができる。なお、可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の存在の分析は、体液中のプロテアーゼなどによって分解された可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドの断片を分析することによっても行うことができる。
【００６３】
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現を分析する手法としては、ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法）を挙げることができる。腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現を分析する手法の詳細については、下記に詳述する。
【００６４】
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現及び患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在を解析する手法としては、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体又はその断片を用い、ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質を測定する免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット）を挙げることができる。
【００６５】
なお、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２ＤリガンドをグループとしてｍＲＮＡの発現を解析する場合、そのグループに属する各ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする塩基配列の共通部分に基づいてプライマー又はプローブを作製すればよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループ、又はα１α２サブグループを、グループとしてｍＲＮＡの発現を解析する場合は、それぞれＭＩＣＡ及びＭＩＣＢをコードする塩基配列の共通部分、又はＲＡＥＴ１Ｅ、及びＲＡＥＴ１Ｇをコードする塩基配列の共通部分に基づいて、プライマー又はプローブを作製すればよい。また、ｍＲＮＡの発現を個別に解析する場合には、それぞれのＮＫＧ２Ｄリガンドをコードする塩基配列の特異的な部分に基づいて、プライマー又はプローブを作製すればよい。
【００６６】
具体的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、又は１３に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列又は配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、又は２７に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列を基に、プライマー及びプローブを作製することができる。例えば、ヒトの膜膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループのｍＲＮＡを検出するためには、配列番号１及び３の塩基配列をアラインし、一定の塩基配列の領域（例えば、１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ）において８０％以上、好ましく９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列の領域からプライマー又はプローブを作製することにより、膜膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループのｍＲＮＡを検出することが可能である。また、プライマーとして、混合塩基を含むｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ プライマーを用いることも可能である。
【００６７】
また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドをグループとしてタンパク質の発現を解析する場合は、例えば、そのグループに属するすべてのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。また、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループ、又はα１α２サブグループを、グループとしてタンパク質の発現を解析する場合は、それぞれＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに特異的に結合する抗体、又はＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。タンパク質の発現を個別に解析する場合は、それぞれのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体を用いることによって解析するようにすればよい。
【００６８】
（ＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡ発現分析の詳細）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現は、試料中の遺伝子（例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなど）と、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用いてハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができる。これらの中でもリアルタイムＰＣＲ法などのＰＣＲ法が、正確且つ簡便であり、好ましい。
【００６９】
リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、インターカレーター法又はＴａｑＭａｎ法を挙げることができる。インターカレーター法は、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）をフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用いてＰＣＲの反応系に加える方法である。また、ＴａｑＭａｎ法は、プライマーセット及び５’末端をレポーター色素により修飾すると共に、３’末端をクエンチャー色素により修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲの反応系に加える方法である。なお、これらのリアルタイムＰＣＲ法は市販のキット及び装置を用いて実施するようにすればよい。
【００７０】
サザンブロット法、ノザンブロット法、又はＰＣＲ法に用いるプライマー及びプローブは、ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作製することができる。具体的には、表１に記載のＮＫＧ２Ｄリガンドの塩基配列から、適当な塩基配列を選択して作製すればよい。プライマーの長さは、特に限定されるものではないが、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであることが好ましく、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることがより好ましく、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであることが最も好ましい。プローブの長さも、特に限定されるものではないが、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることが好ましく、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであることがより好ましく、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒであることが最も好ましい。
【００７１】
（ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質発現分析の詳細）
腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、フローサイトメトリー又はウエスタンブロット）を用いて分析することができる。これらの中でも、腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現については、免疫組織染色法、フローサイトメトリー、又はウエスタンブロットにより分析することが好ましく、患者の体液中の可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在については、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測定法により分析することが好ましい。
【００７２】
免疫組織染色法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知の免疫組織染色法に従って行うことが可能である。免疫組織染色法の一例について以下に簡単に記載する。まず、癌患者の生検材料から調製した組織切片に、マウス抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を結合させる。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として結合させ、３，３’−ジアミノベンジジン（3,3'-diaminobenzidine）染色する。染色後、顕微鏡により、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を確認することができるようになる。
【００７３】
フローサイトメトリーは、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知の方法に従って行うことが可能である。フローサイトメトリーの一例について、以下に間単に説明する。癌患者から得られた癌細胞に、フィコエリスリン（ＰＥ）標識したマウス抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を４℃で結合させる。これによって、フローサイトメーターにより、ＮＫＧ２Ｄリガンドの癌細胞表面への発現を確認することができるようになる。
【００７４】
ウエスタンブロット法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を用いることを除いては、公知のウエスタンブロット法に従って行うことが可能である。ウエスタンブロット法の一例について、以下に簡単に説明する。まず、癌患者の生検材料から調製した試料を電気泳動する。続いて、電気泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜などのブロット膜に転写する。ブロット膜は適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）でブロッキングする。その後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で標識した抗ＮＫＧ２Ｄリガンド抗体を接触させ、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合させる。最後に、ブロット膜を洗浄し、酵素に対する発色基質又は発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。
【００７５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一例について、以下に簡単に説明する。まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体をブロッキングする。捕捉抗体が固相化された不溶性担体（プレート又はビーズ等）に、ＮＫＧ２Ｄリガンドの含まれる可能性のある被検試料を一次反応液と一緒に加えることにより、捕捉抗体とＮＫＧ２Ｄリガンドとを結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかったＮＫＧ２Ｄリガンドおよび夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体と、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素と、が結合した標識抗体（２次抗体）を添加することにより、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＮＫＧ２Ｄリガンド−標識抗体の免疫複合体が不溶性担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄した後に標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加することにより、酵素と基質を反応させたシグナルを検出する。
【００７６】
なお、免疫学的分析方法に用いる抗体は、免疫抗原としてＮＫＧ２Ｄリガンドを用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能である。モノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５）に従って作製することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えばウサギの皮内に、ＮＫＧ２Ｄリガンドを単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫し、血中の抗体価が上昇した時点で採血してそのまま抗血清とするか、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００７７】
また、免疫学的分析方法に用いる抗体として、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗原結合部位を含む抗体フラグメントを用いることも可能である。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。
【００７８】
ヒトのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な抗体としては、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＲＡＥＴ１Ｅ、又はＲＡＥＴ１Ｇに特異的に結合する抗体を用いることもできる。また膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２及びＵＬＢＰ３）に結合する抗体、又は膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇ）に結合する抗体を用いてもよい。あるいは、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのα１α２α３サブグループであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いてもよいし、α１α２サブグループであるＲＡＥＴ１Ｅ及びＲＡＥＴ１Ｇに結合する抗体を用いてもよい。マウスのＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な抗体としては、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε、Ｈ６０又はＭＵＬＴ１に特異的に結合する抗体を用いることができる。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１ε）に結合する抗体、又は膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０及びＭＵＬＴ１）に結合する抗体を用いてもよい。
【００７９】
（ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現による治療効果の予測）
本発明では、対象（癌患者）の免疫細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析することによっても抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、主にＮＫ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、及びγδＴ細胞に発現する活性型受容体である。ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現した腫瘍細胞は、対応するＮＫＧ２Ｄ受容体を発現しているＮＫ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞等により攻撃を受けやすい。すなわち、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現している腫瘍細胞は、免疫細胞によって排除されやすい。
【００８０】
一方、ＮＫ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞等は、慢性的にＮＫＧ２Ｄリガンドに曝露される事により、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が減少するため、活性が低下する可能性がある。このように、ＮＫＧ２Ｄ受容体とＮＫＧ２Ｄリガンドとは免疫細胞の活性化と抑制の両面に関与する。
【００８１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が高い腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果が低い腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量より高い。
【００８２】
すなわち、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対しては、他の抗がん剤との併用しない場合でも、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤は高い治療効果を示す。一方、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が低い対象（癌患者）に対しては、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の単独の投与では治療効果が低い。
【００８３】
このように、腫瘍を有する対象（癌患者）の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現量を測定することによって、抗腫瘍剤の治療効果を予測することができる。
【００８４】
免疫細胞は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を発現しているものであれば、限定されるものではない。免疫細胞として、例えばＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及び活性化マクロファージ（マウスにおいて）などを挙げることができ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が好ましい。免疫細胞において、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高いとは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の高い対象（患者）及び治療効果の低い対象（患者）を比較した場合に、統計学的に有意に高いすべての場合を含む。
【００８５】
例えば、後述の実施例に示すように、ＣＤ８陽性Ｔ細胞においては、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）及び治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）のＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合は、いずれも正常個体のそれよりも高い。しかしながら、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）と治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）とでは、ＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合に明らかな差が認められる。実際に治療効果の予測を行う場合は、例えば、ＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合が一定以上の対象（患者）を、治療効果があると予測することが可能である。また、ＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現量が一定以上の対象（患者）を、治療効果があると予測することも可能である。
【００８６】
一方、実施例には示していないが、ＮＫ細胞においては、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）及び治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）のＮＫＧ２Ｄ受容体陽性細胞の割合は、いずれも正常個体のそれよりも低いことがある。しかしながら、治療効果の高い対象（ＭｅｔｈＡを移植されたマウス）と治療効果の低い対象（Ｋ−Ｂａｌｂを移植されたマウス）とでは、ＮＫＧ２Ｄ陽性細胞の割合に明らかな差が認められるため、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と同じように、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果の予測を行うことが可能である。
【００８７】
（ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析する手法）
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測方法において、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を分析するための手法は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を定量的又は半定量的に決定することができる限り、特に限定されるものではない。具体的には、ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、又は免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現を分析するようにすればよい。
【００８８】
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法（例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法）により分析することができる。また、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体又はその断片を用いてＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質を測定する免疫学的分析方法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット）により分析することができる。
【００８９】
それぞれの具体的な方法は、上述の[１]抗腫瘍剤の治療効果予測方法において説明したものと同様であるため、ここではその説明を省略する。すなわち、ＮＫＧ２ＤリガンドをＮＫＧ２Ｄ受容体に読み換えるようにすればよい。なお、ｍＲＮＡの測定に用いるプローブ及びプライマーは、配列番号２９に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列又は配列番号３１又は３３に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体の塩基配列を基に作製することができる。また、免疫学的測定方法に用いる抗体は、配列番号３０に示したヒトＮＫＧ２Ｄ受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号３２又は３４に示したマウスＮＫＧ２Ｄ受容体のアミノ酸配列を有するタンパク質を抗原として用いることにより作製することができる。なお、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体（以下、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１と称することがある）と、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体（以下、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２と称することがある）とは、スプライシングの異なるスプライシングバリアントである。また、配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体は、配列番号３１で表される塩基配列にコードされており、配列番号３４で表されるアミノ酸配列からなるマウスＮＫＧ２Ｄ受容体は、配列番号３３で表される塩基配列にコードされている。前記マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２は、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１のＮ末側に１３アミノ酸が付加されたものである。従って、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体抗体の多くは、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１及びマウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２に結合することが可能であり、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体の検出用プライマー及びプローブの多くも、マウスＮＫＧ２Ｄ受容体−１及びマウスＮＫＧ２Ｄ受容体−２のｍＲＮＡの検出に用いることができる。
【００９０】
（付記事項）
本発明の治療効果予測方法の対象となる癌（悪性腫瘍）としては、例えば、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。これらの中でも、特に、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、又は胃癌を対象とすることが好ましい。
【００９１】
本発明の治療効果予測方法を適用することのできる動物としては、ヒトを挙げることができる。もちろん、本発明の治療効果予測方法を適用することのできる動物は、抗腫瘍剤を適用する動物であればヒトに限定されるものではなく、非ヒト動物であってもよい。なお、本明細書等において、「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物全般を意味している。非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ハムスター、フェレット、又はラットなどを挙げることができるが、もちろんこれらの動物に限定されるものではない。
【００９２】
［２］抗腫瘍剤の治療効果予測キット
本発明の抗腫瘍剤の治療効果予測キット（以下、単にキットとも称する）は、前記の抗腫瘍剤の治療効果予測方法を実行するために用いるものである。
【００９３】
従って、ＮＫＧ２Ｄリガンドの分析方法として免疫学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄリガンドに対する抗体を含む。ＮＫＧ２Ｄリガンドの分析方法として分子生物学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含む。また、ＮＫＧ２Ｄ受容体の分析方法として免疫学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄ受容体に対する抗体を含む。
【００９４】
同様に、ＮＫＧ２Ｄ受容体の分析方法として分子生物学的分析方法を用いる場合には、本発明に係るキットはＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含む。
【００９５】
免疫学的分析方法を用いるキットには、用いる免疫学的手法に応じて、ＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合する抗体もしくはその断片、または、ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する抗体もしくはその断片が、所望の形態で含まれていることが好ましい。抗体としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体フラグメントとしては、ＮＫＧ２Ｄリガンド又はＮＫＧ２Ｄ受容体への特異的結合能を有するもの、すなわち抗原結合部位を有するものであれば特に限定されるものではない。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
【００９６】
測定手法として酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法を用いる場合、本発明に係るキットにおける抗体は標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含まれていることが好ましい。酵素免疫測定法において用いる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。蛍光抗体法において用いる蛍光物質としては、フルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を挙げることができる。また、放射免疫測定法において用いる放射性同位体としては、３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を挙げることができる。なお、本発明に係るキットでは、その他の標識物質として、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を用いてもよい。また、本発明のキットは、酵素又は化学発光物質に対する適当な基質等を含んでいてもよい。
【００９７】
分子生物学的分析方法を用いるキットには、ＮＫＧ２Ｄリガンドをコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブ、またはＮＫＧ２Ｄ受容体をコードするヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブが含まれていることが好ましい。本発明のキットにおいて用いられるプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）及びプローブは、混合物として含まれていてもよいし、個別の試薬として含まれていてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブに加えて、ＰＣＲ法（例えば、リアルタイムＰＣＲ法）、サザンブロット法、又はノザンブロット法を行うために必要な試薬及び／又は酵素を含んでいてもよい。
【００９８】
なお、本発明のキットは、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果予測用であることを明記した使用説明書を含んでいてもよい。カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の治療効果予測用である旨の記載は、キットの容器に付されていてもよい。
【００９９】
［３］抗腫瘍剤
本発明の抗腫瘍剤は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含むものであり、上述した抗腫瘍剤の治療効果予測方法において治療効果があると判断された場合に投与されるものである。本発明の抗腫瘍剤は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍に対しては、他の抗がん剤と併用しない場合でも高い治療効果を示す。また、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれか一方が発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍に対しては、中程度の治療効果を示す。
【０１００】
従って、本発明の抗腫瘍剤は、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくともいずれか一方が発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍を有する対象（癌患者）に対して、抗腫瘍効果を奏する。更に、本発明の抗腫瘍剤は、ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも１つが発現していない腫瘍、又はそれらの発現が低い腫瘍を有する対象（癌患者）に対しても、抗腫瘍効果を奏する。
【０１０１】
また、本発明の抗腫瘍剤は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対しても他の抗がん剤との併用することなく高い治療効果を示す。すなわち、本発明の抗腫瘍剤は、免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い対象（癌患者）に対する投与も効果的である。
【０１０２】
本発明の抗腫瘍剤の対象となる癌（悪性腫瘍）としては、上述した癌と同様である。すなわち、例えば、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。これらの中でも、特に、大腸癌（結腸・直腸癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、又は胃癌に対して投与することが好ましい。
【０１０３】
また、本発明の抗腫瘍剤は、上述した治療効果予測方法を適用することができる動物に対して適用することができる。すなわち、本発明にかかる抗腫瘍剤は、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ハムスター、フェレット、又はラットなどに利用することができる。
【０１０４】
本発明の抗腫瘍剤は、一般にヒトを対象とする場合、１日当り３ｇを１〜３回に分けて経口投与することが好ましい。もちろん投与量はこれに限定されるものではなく、症状によって適宜増減することができる。
【０１０５】
なお、本発明の抗腫瘍剤の好適な投与量は、年令、個人差、又は病状などに応じて適宜変化することはいうまでもない。また、本発明の抗腫瘍剤の好適な投与量は、投与対象がヒトであるかあるいはその他の動物であるかによっても変化する。
【０１０６】
本発明の抗腫瘍剤の投与形態としては、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁剤、スティック剤、分包包装体、又は乳剤等であることが好ましい。カプセル剤として服用する場合は、通常のゼラチンの他に、必要に応じて腸溶性のカプセルを用いることもできる。錠剤として用いる場合は、体内でもとの微小粒体に解錠されるようにすればよい。また、本発明の抗腫瘍剤は。アルミゲルやケイキサレートなどの電解質調節剤と配合した複合剤の形態で用いることもできる。
【０１０７】
（参考形態）
なお、本発明は、
腫瘍の治療方法であって、
腫瘍の患者から腫瘍の試料を採取する工程と、
前記試料中のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を測定する工程と、
膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの両方、又はいずれか一方が発現していない場合にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤をその患者に投与する工程と、を含む腫瘍の治療方法を含む。
【０１０８】
また、本発明は、
腫瘍の治療方法であって、
腫瘍の患者から免疫細胞を含む試料を採取する工程と、
前記試料中のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を測定する工程と、
ＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合にカワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤をその患者に投与する工程と、を含む腫瘍の治療方法を含む。
【０１０９】
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる態様についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
《実施例１：腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの発現》
マウスの腫瘍細胞７種類について、ＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅ−１及びＨ６０の発現を調べた。細胞としては、ＭｅｔｈＡ細胞（マウス肉腫由来）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ由来）、４Ｔ１細胞（マウス乳癌由来）、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞（マウス肉腫由来）、Ｓ１８０細胞（マウス肉腫由来）、ＩＳＯＳ−１細胞（マウス肉腫由来）、ＣＴ２６細胞（マウス大腸癌由来）を用いた。抗体としては、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、及びＲａｅ１εのすべてのＲａｅ−１ ｆａｍｉｌｙに結合するＰＥ標識抗Ｒａｅ−１抗体（R&D systems社）及びＨ６０に結合するＰＥ標識抗Ｈ６０抗体を用いた。陰性コントロールとしては、アイソタイプコントロール抗体を用いた。
【０１１２】
なお、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドであり、Ｈ６０は、膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドである。
【０１１３】
約１ｘ１０５個の腫瘍細胞にそれぞれの抗体を加え、氷上にて、約１時間反応させた後、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０の発現を分析した。結果を、図２に示す。破線が、ＰＥ標識抗Ｒａｅ−１抗体又はＰＥ標識抗Ｈ６０抗体を用いた、Ｒａｅ−１又はＨ６０の発現を示しており、実線がコントロールのＩｇＧの結果である。
【０１１４】
図２に示すように、７つの腫瘍細胞は、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を、両方とも発現していないＭｅｔｈＡ細胞、Ｓ１８０細胞、及びＢ１６Ｆ１０細胞のグループ（以下、グループ（１）と称する）、Ｈ６０を発現しているが、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙを発現していない４Ｔ１細胞、ＣＴ２６細胞のグループ（以下、グループ（２）と称する）、及びＲａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を両方とも発現しているＫ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞のグループ（以下、グループ（３）と称する）の３グループに分かれた。
【０１１５】
《実施例２：腫瘍移植マウスでのＰＳＫの治療効果の検討》
（Ａ）６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、又は４ＴＩ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植し、翌日よりＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与後、ＭｅｔｈＡ細胞移植群は２３日、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植群は１４日まで、４ＴＩ細胞移植群は１８日まで、腫瘍の体積を測定した。結果を図３に示す。腫瘍体積は、黒四角がＰＳＫが投与された群を示し、黒菱形が生理食塩水を投与された群を示す。
【０１１６】
（Ｂ）６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスにマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、４Ｔ１細胞、ＩＳＯＳ−１細胞、又はＣＴ２６細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。６週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。また、６週齢のメスのＩＣＲマウスにＳ１８０細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。移植の翌日よりＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与後、それぞれの腫瘍の体積を測定し、ＰＳＫの治療効果を判定した。結果を表２に示す。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
表２及び図３より明らかなように、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０を発現していないグループ（１）の腫瘍細胞（ＭｅｔｈＡ細胞、Ｓ１８０細胞、及びＢ１６Ｆ１０細胞）に対して、ＰＳＫによる顕著な抗腫瘍効果が認められた。Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙは発現していないが、Ｈ６０を発現している、グループ（２）の腫瘍細胞（４Ｔ１細胞、及びＣＴ２６細胞）に対して、中程度の抗腫瘍効果が認められた。一方、Ｒａｅ−１ ｆａｍｉｌｙ及びＨ６０が発現しているＫ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞のグループ（３）の腫瘍細胞（Ｋ−Ｂａｌｂ細胞、及びＩＳＯＳ−１細胞においては、ＰＳＫの抗腫瘍効果は認められなかった。
【０１１９】
このように、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の有無とＰＳＫの抗腫瘍効果とは相関しており、腫瘍組織および血清中のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が、ＰＳＫの治療に対する感受性又は非感受性の予測因子として用いることができることが示された。
【０１２０】
《実施例３：ＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現と細胞内ＩＦＮ−γの産生》
本実施例では、腫瘍移植マウスにおけるＣＤ８陽性細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体の発現及び細胞内ＩＦＮ−γの産生を検討した。
【０１２１】
（１）腫瘍細胞の移植
６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス、それぞれ８匹にマウス肉腫細胞のＭｅｔｈＡ細胞、又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植した。移植後２〜４週間目に、マウスをジエチルエーテル麻酔により屠殺し、クリーンベンチ内にて下大静脈より血液採取及び脾臓摘出を行った。
【０１２２】
（２）血液細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現解析
血液は１ｍＬシリンジ（テルモ）を用いてＥＤＴＡ含有採血管（ＢＤ）に回収し混和した後、４００ｕＬを１５ｍＬチューブに移した。血液に１×ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）を加え、攪拌し、室温にて１５分反応させ赤血球を溶血させた。遠心及び洗浄した細胞を、細胞計数板を用いて計数した。得られた血液細胞に、ＦｃＢｌｏｃｋを添加後、ＰｅｒＣＰ−ＣＤ８抗体及びＰＥ−ｃｏｎｔｒｏｌ／ＮＫＧ２Ｄ受容体抗体を加え、４℃で反応させ、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により解析した。
【０１２３】
（３）脾臓細胞における細胞内ＩＦＮ−γの産生の解析
脾臓は金属メッシュ上でつぶした後、１００μｍのファルコンフィルタを通して５０ｍＬチューブに濾過し、１０００ｒｐｍで５分間遠心した。ペレットをＲＰＭＩ１６４０で懸濁し、細胞計数板を用いて、細胞数を計数した。脾臓細胞に１×ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）を加え、攪拌し、室温にて１５分反応させ赤血球を溶血させた。更に、遠心及び洗浄した細胞を、細胞計数板を用いて計数した。得られた脾細胞２×１０６ｃｅｌｌｓを１５ｍＬ ｒｏｕｎｄ ｔｕｂｅに移し、刺激群は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（１０μｇ／ｍＬ：ＢＤ社製）、ＰＭＡ（５ｎｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ）及びＡ２３１８７（２５０ｎｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ）を添加後３７℃、ＣＯ２５％条件下で５時間培養した。コントロールの無刺激群は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａのみを加えて、同じ操作を行った。それぞれの細胞を洗浄後、ＦｃＢｌｏｃｋを添加後、標識抗体（ＡＰＣ−ＣＤ８）を加え、氷上で反応させ、更に固定／透過液で処理した後、無刺激群、及び刺激群を各々２本のチューブに分注し、標識抗体（ＦＩＴＣ−ＩＦＮ−γ／ｃｏｎｔｒｏｌ）を加えて反応後、フローサイトメトリー（FacsCalibur：BECON DICKINSON社製）により解析した。
【０１２４】
結果を図４に示す。ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスでは、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスと比較して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高かった。また、ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスと比較して、Ｋ−Ｂａｌｂ移植マウスの脾臓細胞中のＣＤ８陽性Ｔ細胞において細胞内ＩＦＮ−γの産生が減少していた。
【０１２５】
これらの結果と、実施例２のＭｅｔｈＡ細胞及びＫ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスにおけるＰＳＫの治療効果とから、治療対象（癌患者）の免疫細胞においてＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合、その治療対象の腫瘍に対して、ＰＳＫの治療効果が高いことが示された。したがって、対象（癌患者）のＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現を調べることによって、ＰＳＫの治療効果を予測することが可能である。
【０１２６】
《実施例４：末梢における免疫細胞の細胞内ＩＦＮ−γの産生に対するＰＳＫの影響》
本実施例では、腫瘍移植マウスにおけるＣＤ８陽性細胞の細胞内ＩＦＮ−γの産生に対するＰＳＫ投与の影響を検討した。６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＭｅｔｈＡ細胞、又はＫ−Ｂａｌｂ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ皮下移植し、腫瘍体積が５００ｍｍ３〜７００ｍｍ３に達した段階で群分けを行い、ＰＳＫ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水を１００μＬ、週３回腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。ＰＳＫ投与開始後に、３回投与後マウスをジエチルエーテル麻酔により屠殺し、クリーンベンチ内にて脾臓摘出を行った。得られた脾臓を用いて、実施例３の（３）の操作を繰り返した。結果を図５に示す。ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスでは、ＰＳＫ投与によりＣＤ８陽性細胞における細胞内ＩＦＮ−γの産生が上昇していた。一方、Ｋ−Ｂａｌｂ細胞移植マウスでは、ＰＳＫ投与による細胞内ＩＦＮ−γの産生増加は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明に係る抗腫瘍剤の治療効果予測方法は、カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の使用を選択する際の指標として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項２】
前記リガンド発現分析工程は、
前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、
前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び
患者の体液中における可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在の少なくとも１つを分析する工程である、請求項１に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項４】
前記リガンド発現分析工程において発現を分析するＮＫＧ２Ｄリガンドは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項５】
前記膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３であり、前記膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、請求項４に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項６】
前記リガンド発現分析工程におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３に結合する抗体、並びにＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いて分析する、請求項４又は５に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項７】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体発現を分析する受容体発現分析工程を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項８】
前記受容体発現分析工程は、
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、及び
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現
の少なくとも１つを分析する工程である、請求項７に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法に用いる抗腫瘍剤の治療効果予測キットであって、
ＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、
ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体、
ＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、及び
ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体、
からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測キット。
【請求項１０】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、対象となる腫瘍細胞が膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも一方を発現していない場合に投与することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項１１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合に投与することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、対象となる腫瘍のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を分析するリガンド発現分析工程を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項２】
前記リガンド発現分析工程は、
前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２ＤリガンドのｍＲＮＡの発現、
前記対象となる腫瘍細胞におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び
患者の体液中における可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在の少なくとも１つを分析する工程である、請求項１に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項４】
前記リガンド発現分析工程において発現を分析するＮＫＧ２Ｄリガンドは、膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項５】
前記膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３であり、前記膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、請求項４に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項６】
前記リガンド発現分析工程におけるＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質の発現、及び可溶性ＮＫＧ２Ｄリガンドのタンパク質又はその断片の存在は、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、及びＵＬＢＰ３に結合する抗体、並びにＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢに結合する抗体を用いて分析する、請求項４又は５に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項７】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を含む抗腫瘍剤の腫瘍に対する治療効果を予測する抗腫瘍剤の治療効果予測方法であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体発現を分析する受容体発現分析工程を含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項８】
前記受容体発現分析工程は、
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のｍＲＮＡの発現、及び
免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体のタンパク質の発現
の少なくとも１つを分析する工程である、請求項７に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤の治療効果予測方法に用いる抗腫瘍剤の治療効果予測キットであって、
ＮＫＧ２Ｄリガンドのヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、
ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する抗体、
ＮＫＧ２Ｄ受容体のヌクレオチドにハイブリダイズするプローブ及び／又はプライマー、及び
ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する抗体、
からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、抗腫瘍剤の治療効果予測キット。
【請求項１０】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、対象となる腫瘍細胞が膜アンカー型ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び膜貫通型ＮＫＧ２Ｄリガンドの少なくとも一方を発現していない場合に投与することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項１１】
カワラタケ由来の蛋白多糖体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、治療対象の免疫細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現が高い場合に投与することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２１７９５（Ｐ２０１２−２１７９５Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５７７２８（Ｐ２０１０−１５７７２８）
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１２日（２０１０．７．１２）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
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