抗腫瘍化合物及びその医薬組成物
インシリコ分子モデリングにより同定され、そしてこの化合物とカゼインキナーゼ２酵素の基質中のリン酸化ドメイン又はその環境との相互作用によりリン酸化事象の阻止を可能にする構造を持つ化合物。また、本発明は該化合物を含有する医薬組成物及び新生物に関係する疾患の治療のための医薬品の製造にそれを使用することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子薬理学の分野に属し、特に腫瘍学、より具体的には、インシリコ分子モデル形成により得られ、直接又は間接の相互作用によりカゼインキナーゼ２基質のリン酸化受容部をブロックする能力により、明らかな細胞毒性及び抗腫瘍作用を持つ化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）は、細胞増殖の増加に関与するセリン／トレオニン酵素であり、悪性形質転換の間は細胞内において主に核に存在する（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．，Ｙｕ Ｓ．，Ｗａｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：５７３−５８２）。さらに、病原性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の重要なウイルスタンパク質の一部はＣＫ２の基質であることが報告されている（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｍａｒｉｎ Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２７：１４５−１５１；Ｆｒａｎｃｋ Ｎ．，Ｌｅ Ｓｅｙｅｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７９：２７００−２００８）。
【０００３】
世界中の他のグループの結果により、上皮由来の種々の固形癌におけるＣＫ２レベルが、正常組織に対して３から７倍の範囲で高いこと（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．，Ｙｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｏｌ．１６：５７３−５８２；Ｆａｕｓｔ Ｒ．Ａ．，Ｇａｐａｎｙ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｌａｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｈｏｒｍａｔｉｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｔｕｍｏｒｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１：３１−３５）、さらに、ＣＫ２酵素のリン酸化活性は、細胞の悪性形質転換において非常に重要な事象であり、それは腫瘍進行の強力なマーカーであり（Ｓｅｌｄｉｎ Ｄ．Ｃ．，Ｌｅｄｅｒ Ｐ，（１９９５）Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩα ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｉｌｅｒｏｉｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：８９４−８９７）、他方ＣＫ２の過剰発現は、シグナリングカスケードＷｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎにおける上方調節により哺乳動物細胞の腫瘍化を誘発する（Ｌａｎｄｅｓｍａｎ−Ｂｏｌｌａｇ Ｅ，Ｒｏｍｉｅｎ−Ｍｏｕｒｅｚ Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：３２４７−３２５７）。最近の知見では、ＣＫ２が、クロマチンのリモデリングのようないくつかの他の過程（Ｂａｒｚ Ｔ．，Ａｃｋｅｎｍａｎｎ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｇｌｏｂａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：１５６３−１５７７）及び細胞生存の調節（Ｕｎｇｅｒ Ｇ．Ｍ．，Ｄａｖｉｓ Ａ．Ｔ．，Ｓｌａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．，Ａｈｍｅｄ Ｋ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ；ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，４：７７−８４）において必須の役割をしていることも示唆されている。癌の発生過程の理解の上で最も重要なことは、ＣＫ２−仲介リン酸化は細胞生存のための非常に強いシグナルであるため、この酵素が細胞生理にとって抗アポトーシスメディエーターと考えられることを示す知見であった（Ａｈｍｅｄ Ｋ．，Ｇｅｒｂｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｃｏｃｈｅｔ Ｃ．（２００２）Ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｑｕａｄ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２：２２６−２２９；Ｔｏｒｒｅｓ Ｊ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＰＴＥＮ ｂｙ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ＰＴＥＮ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８：３０６５２−６０）。
【０００４】
以上の知見に基づいて、ＣＫ２仲介リン酸化は、癌の治療処置のための可能性がある標的として使用するのに適した生化学的事象として確認され、その事象の潜在的阻害物質は総てそのような状態の治療のための見込みのある候補とされている。これまで、世界中のいくつかのグループが、二つの実験方法によりＣＫ２仲介リン酸化を阻害するために、異なる方法を開発してきた：ａ）ＣＫ２酵素の直接的阻害、又はｂ）総てのＣＫ２基質に共通して記述される酸性ドメインの近くにあるリン酸化部位のブロック（防護）。いずれの方法についても、著者達は、ＣＫ２仲介リン酸化事象の阻害が、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発を生じることを実証でき、このことは癌治療のための薬物を発見するための有望な標的としてＣＫ２を実験的に確証したことを意味する。
【０００５】
例えば、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール（ＴＢＢ）のようなこの酵素の直接的阻害物質が、マイクロモル濃度範囲において、Ｊｕｒｋａｔ細胞において強力なアポトーシス−及びカスパーゼ依存性分解誘発物質として試験された（Ｒｕｚｚｅｎｅ Ｍ．，Ｐｅｎｚｏ Ｄ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４，５，６，７−ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＴＢＢ）ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＨＳ１）ｉｎ Ｊｕｋａｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３６４：４１−４７）。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＣＫ２酵素の発現を阻害することにより、マウスの実験的癌モデルにおいてインビトロアポトーシス作用及び抗腫瘍作用が示された（Ｇｕｏ Ｃ．，Ｙｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：５９９２−５９９９；Ｓｌａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：７１２−７２１）。
【０００６】
アントラキノン誘導体、フラボノイド及びハロゲン化アゾベンジルイミダゾール類のような他の化合物は、ＣＫ２ ＡＴＰ結合部位阻害物質として記述され（Ｓａｒｎｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９３：１５９−１６８）、［５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル］酢酸（ＩＱＡ）は、ハイスループットスクリーニングを使用して選択的ＣＫ２阻害物質として報告されている（Ｖａｎｇｒｅｖｅｌｉｎｇｈｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｂｙ［５−ｏｘｏ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｏ−（１，２−ａ）ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ−７−ｙｌ］ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＱＡ）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：２５５６−２６６２）。
【０００７】
前記の化合物は、マイクロモル範囲の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）においてＣＫ２活性阻害作用を示したが、癌の実験モデルにおける抗腫瘍作用が報告された形跡はない。
【０００８】
ＣＫ２−仲介リン酸化過程を阻害する他の記述された方法は、この酵素の基質に認められる酸性ドメインの中のリン酸化部位をブロックすることであった。特許出願ＷＯ ０３／０５４００２及びＰｅｒｅａ Ｓ．Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｆｏ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｅｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：７１２７−７１２９の研究の中で、著者らは、インビトロでＣＫ２基質のリン酸化をブロックし、前臨床癌モデルにおいて腫瘍細胞毒性及び抗腫瘍作用を示す環状ペプチドファミリーの使用を提案している。しかし、この報告に記述されたペプチドは、本質的に細胞の中に侵入できないという欠点を有しているので、膜を通過できるペプチドをそれに融合する必要がある。一般的に、小型分子に比較した場合に、ペプチドを使用することは循環及び分解によりインビボ安定性は減少する欠点があり、経口投与のために製剤化することは非常に困難であり、それらは容易には細胞の中に送りこめない（Ｌｕｄｇｅｒ Ｗｅｓｓ，Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｅｎｔｕｒｙ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５，２００４）。文献中に広く記述されているペプチドの他の問題としては、早いクリアランス、免疫原性の可能性及び治療用量当たりのコストが、一般的に非ペプチド性薬物より大きいことが知られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
治療薬剤候補としての前記環状ペプチドを使用することの潜在的欠点を考慮して、本発明は、基質上のリン酸化部位と直接的又は間接的に相互作用することによりＣＫ２−仲介リン酸化を阻害し、癌の動物モデルにおいて細胞毒性及び抗腫瘍作用を発現できる化合物を記述する。
【００１０】
本明細書に記述される化合物は、充分明確な化学構造を持ち、以下の作用の一つ又はいくつかを達成することができる：
Ａ：その化合物をＣＫ２基質のリン酸化ドメイン又はその周囲に結合させ、この酵素が基質に結合するのを直接的又は間接的に阻害する。
Ｂ：その化合物をＣＫ２基質のリン酸化ドメインに結合させて、酵素を結合させるがリン酸受容セリンへのリン酸基の移行を直接的又は間接的にブロックする。
Ｃ：その化合物をＣＫ２タンパク質基質へ結合させて、リン酸化ドメイン、その周囲又はその両者の立体構造の変化を生じさせて、ＣＫ２の結合又はリン酸受容セリンへのリン酸基の移行を直接的又は間接的にブロックする。
【００１１】
したがって、これらの化合物は、主に、ＣＫ２−仲介リン酸化の生化学事象を阻害する能力を持つことにより特徴付けられる。
【００１２】
特別な認識において、本発明は、指定された電子混成を持つ元素が連続的に結合したある原子団が分子のいずれかの部分に存在することにより規定される特別な化学構造により特徴付けられる化合物に関係し、その原子団は次の５つの構造グループに分類される：
Ｉ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２，３−Ｎ
ＩＩ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−［（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＩＩ．Ｎ−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＶ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ２）−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２−Ｃ（ｓｐ２）−Ｎ
Ｖ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ３）−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−Ｃ（ｓｐ３）−Ｎ
【００１３】
このような構造クラスに属するいくつかの化合物を以下に示す：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【００１４】
上記分子は、共通のリン酸化部位の徹底的分子モデリング（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．Ａ．（２００３）Ｏｎｅ−ｔｈｏｕｓａｎｄ−ａｎｄ−ｏｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ １７：３４９−３６０）、ＣＫ２酵素に対する分子結合によるその確証、そしてさらにわれわれの研究室で作成した約１，２００，０００個の化合物を含む化学的に多様性のあるデータベースの大規模な分子スクリーニングにより請求する機能のために記述された。
【００１５】
本発明は、記述された化合物の同族変異体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）も含む。同族変異体とは、本明細書に記述された分子と化学的性質が類似してもしなくても、ＣＫ２仲介リン酸化に対する阻害作用と同じ作用を達成させることができる化学構造を有する分子のことである。
【００１６】
その他に、本発明の実現には、１以上のこの化合物及び／又はそれらの医薬として受容し得る塩のみ、又は他の医薬として許容される賦形剤又は添加物と共に含む、医薬組成物が好ましい。また、インビトロ、インビボ又は生体付随装置（ｂｏｄｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ）での腫瘍細胞の増殖を阻害するため、生体組織での癌の治療のため、及び／又はＣＫ２酵素が病理的役割を持つ可能性がある他の状態のための、医薬品の製造における記述した化合物の使用も本発明の一部である。
【００１７】
この記述された化学的分子は、最少のアミノ酸配列Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ／Ｄ（式中Ｘは好ましくはリシン又はアルギニンとは異なるアミノ酸である）のリン酸化を阻害する能力、さらにこの共通配列を持たず、このタイプの化合物と結合し、ＣＫ２仲介リン酸化を阻害する能力を持つ他のタンパク質により規定される。
【００１８】
本発明に記述された化合物を定義するために、著者らは、充分に定義されているこの酵素の共通リン酸化部位の徹底的な分子モデリングを行い（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．Ａ．（２００３）Ｏｎｅ−ｔｈｏｕｓａｎｄ−ａｎｄ−ｏｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：３４９−３６８）、ＣＫ２酵素に対する分子結合によるその確証、そしてさらにわれわれの研究室で作成した約１，２００，０００個の化合物を含む化学的に多様性のあるデータベースの大規模な分子スクリーニングによる分析を行った。
【００１９】
平均を上回る算出結合エネルギーを持つ化合物を総て陽性として初回に選択し、より厳密な選択値により二回目のスクリーニングにかけ、構造の規則性を見るためにさらに分析した。第二回目のスクリーニングにおいて選抜された化合物の化学構造を、算出結合エネルギーの可能な最高値に達するように最適化した。このようにして推定された化合物を合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、赤外スペクトル分析、マススペクトル分析及び核磁気共鳴により分析し、最後にインビトロ及びインビボの有効性を評価した。本発明により記述された化合物は、ＣＫ２仲介リン酸化事象の阻害能力に関して同等に有効である。
【００２０】
本発明に記述された化合物は、ヒト腫瘍細胞において、細胞透過性補助剤を使用せずに、用量依存的に細胞毒性を発現する。このエビデンスは、化合分子は細胞機構により輸送され、そして細胞内の標的に達することができることを示す過去の知見と一致する（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ，Ｐａｇａｎｏ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｂｙ ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：１２９３１−１２９３６）。
【００２１】
同様に、これらの化合物のインビトロ細胞毒性試験においてナノモルの範囲でＩＣ５０値が見出されたことは勇気付けるものであった。これらの結果は、ＣＫ２リン酸化ドメインを阻害する既報の環状ペプチドよりも記述の化合物の細胞毒性活性が優れることを示している。
【００２２】
インビトロの結果に一致して、局所的及び全身的に投与した場合に、本発明の化合物は強力な抗腫瘍作用を有している。同様に、本発明の化合物は、０．５及び２ｍｇ／Ｋｇの低い投与量において、抗腫瘍作用を示すことが立証され、既報の環状ペプチドで記述された投与量の１０から２０倍少ないことを示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
特別な態様の詳細な説明／実施例
本発明は以下の実施例により説明される：
【実施例】
【００２４】
実施例１：インシリコ分子モデリングによる化合物の選抜。
コンピューターモデルを使用して開発された大規模な仮想スクリーニングにより、受容体−リガンド複合体の算出結合エネルギーの高値に基づいていくつかの化合物が選抜された（表１）。この概算のエネルギー値は、われわれの研究室で開発したコンピュータープログラムを使用して、立体構造及びいくつかのエネルギー要素の徹底的分析結果を考慮して推定した。
【表１】
【００２５】
実施例２：典型的なＣＫ２基質のリン酸化に対する記述された化合物の影響。
アッセイは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉに発現させたヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＶＨＰ−１６）のオンコプロテインＥ７を基質として使用するインビトロリン酸化反応を実施することである。次いで、得られたＥ７−ＧＳＴをグルタチオン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。酵素反応の前に、Ｅ７−ＧＳＴを種々の濃度の化合物と１時間３７℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌのＴｒｉｓ：ＨＣＬ ２５ｍＭ ｐＨ７．５緩衝液、１μＣｉの３２Ｐ−γＡＴＰ，１００μＭ ＡＴＰ、４０μｌのＥ７−ＧＳＴ含有樹脂、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１単位のＣＫ２酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物中において行われ、４０分間３７℃で進行させた。反応の後、樹脂を０．５ ｍｌの反応緩衝液で３回洗い、最後にＥ７−ＧＳＴのリン酸化レベルを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）中で分析した。リン酸化タンパク質の可視化は、Ｘ線感受性のフィルムを乾燥ＰＡＧＥゲルに暴露することにより行われ、定量化はフィルムのデンシトメトリー分析により行われた。ＩＣ５０値は、それぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値は、酵素活性の５０％を阻害する濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００２６】
ＩＣ５０値から判断して、本明細書に記述する化合物は典型的なＣＫ２基質の有効な阻害物質であることを、表２のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較してこの化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表２】
【００２７】
実施例３．ＣＫ２共通部位のリン酸化に対する記述した化合物の作用。
このアッセイは、ＣＫ２基質の最適化された共通リン酸化ドメインとして広く受入れられている配列ＲＲＲＥＥＥＴＥＥＥを基質として使用するインビトロリン酸化反応を行うことである。
【００２８】
酵素反応の前に、基質ペプチドを種々の濃度の化合物と１時間３７℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌのＴｒｉｓ：ＨＣＬ ２５ｍＭ ｐＨ７．５緩衝液，１μＣｉの３２Ｐ−γＡＴＰ，１００μＭ ＡＴＰ、４０μｌのＥ７−ＧＳＴ含有樹脂，０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１単位のＣＫ２酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物中において行われ、１０分間３７℃で進行させた。反応の後、５μｌの反応混合物をＷｈａｔｍａｎｎ ＰＥ−８１ペーパーフィルターに供し、１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４で４回洗い、最後に放射能を伴うペーパーを測定し、各検体のｃｐｍ値を直接ＣＫ２酵素活性と相関させた。
【００２９】
ＩＣ５０値は、それぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値を、酵素活性の５０％阻害濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００３０】
ＩＣ５０値から判断して、ここに記述された化合物は典型的なＣＫ２基質の有効な阻害物質であることを、表３のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較してこの化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表３】
【００３１】
実施例４：本明細書に記述する化合物のヒト腫瘍細胞に対する作用
ヒト非小細胞肺癌のＨ−１２５細胞を、９６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ（ＤＭＥＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２×１０４細胞／ｍｌ密度で接種した。２４時間後、本明細書に記述する化合物を０．５〜１００ｎＭの範囲で培地に加え、この混合物を７２時間３７℃で５％ＣＯ２中インキュベートし、最後に２０μｌの１．９０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＳ溶液を加えた。プレートをさらに１時間同じインキュベーション条件に保ち、４９２ｎｍで吸光度を測定した。結果は、いずれの化合物も加えない対照に対する増殖パーセンテージとして評価し、ＩＣ５０値はそれぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値を、酵素活性の５０％阻害濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００３２】
ＩＣ５０値から判断して、本明細書に記述する化合物は、培養ヒト腫瘍細胞に対する強力なインビトロ細胞毒性作用を持つことを、表４のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較して、この化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表４】
【００３３】
実施例５：ヌードマウス移植モデルに移植されたヒト腫瘍のモデルにおける本発明の化合物の抗腫瘍作用。
６〜８週齢の雌ＢａｌｂＣヌードマウスをこのアッセイに使用した。この腫瘍移植モデルにおいて、２５０μｌのＰＢＳに懸濁した５，０００，０００個のＨ−１２５細胞を動物の背部に注射した。腫瘍が触診可能の約５０ｍｍ３の体積になった後、化合物Ｃ３２４２５、Ｃ３３４２６及びＣ３３４２７の２００μｇを毎日５日間直接投与した。図１に示すように、化合物の投与の結果、有意な抗腫瘍応答を生じた。この結果は、ＣＫ２仲介リン酸化を阻害する化合物は、実験的腫瘍の妥当なモデルにおいて抗腫瘍応答を発現することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】マウスに移植されたヒト腫瘍モデルにおける化合物の抗腫瘍作用。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子薬理学の分野に属し、特に腫瘍学、より具体的には、インシリコ分子モデル形成により得られ、直接又は間接の相互作用によりカゼインキナーゼ２基質のリン酸化受容部をブロックする能力により、明らかな細胞毒性及び抗腫瘍作用を持つ化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）は、細胞増殖の増加に関与するセリン／トレオニン酵素であり、悪性形質転換の間は細胞内において主に核に存在する（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．，Ｙｕ Ｓ．，Ｗａｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：５７３−５８２）。さらに、病原性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の重要なウイルスタンパク質の一部はＣＫ２の基質であることが報告されている（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｍａｒｉｎ Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２７：１４５−１５１；Ｆｒａｎｃｋ Ｎ．，Ｌｅ Ｓｅｙｅｃ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＮＳ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７９：２７００−２００８）。
【０００３】
世界中の他のグループの結果により、上皮由来の種々の固形癌におけるＣＫ２レベルが、正常組織に対して３から７倍の範囲で高いこと（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．，Ｙｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｏｌ．１６：５７３−５８２；Ｆａｕｓｔ Ｒ．Ａ．，Ｇａｐａｎｙ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｌａｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｈｏｒｍａｔｉｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｔｕｍｏｒｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１：３１−３５）、さらに、ＣＫ２酵素のリン酸化活性は、細胞の悪性形質転換において非常に重要な事象であり、それは腫瘍進行の強力なマーカーであり（Ｓｅｌｄｉｎ Ｄ．Ｃ．，Ｌｅｄｅｒ Ｐ，（１９９５）Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩα ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｉｌｅｒｏｉｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：８９４−８９７）、他方ＣＫ２の過剰発現は、シグナリングカスケードＷｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎにおける上方調節により哺乳動物細胞の腫瘍化を誘発する（Ｌａｎｄｅｓｍａｎ−Ｂｏｌｌａｇ Ｅ，Ｒｏｍｉｅｎ−Ｍｏｕｒｅｚ Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：３２４７−３２５７）。最近の知見では、ＣＫ２が、クロマチンのリモデリングのようないくつかの他の過程（Ｂａｒｚ Ｔ．，Ａｃｋｅｎｍａｎｎ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ａ ｇｌｏｂａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：１５６３−１５７７）及び細胞生存の調節（Ｕｎｇｅｒ Ｇ．Ｍ．，Ｄａｖｉｓ Ａ．Ｔ．，Ｓｌａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．，Ａｈｍｅｄ Ｋ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ；ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，４：７７−８４）において必須の役割をしていることも示唆されている。癌の発生過程の理解の上で最も重要なことは、ＣＫ２−仲介リン酸化は細胞生存のための非常に強いシグナルであるため、この酵素が細胞生理にとって抗アポトーシスメディエーターと考えられることを示す知見であった（Ａｈｍｅｄ Ｋ．，Ｇｅｒｂｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｃｏｃｈｅｔ Ｃ．（２００２）Ｊｏｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｑｕａｄ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２：２２６−２２９；Ｔｏｒｒｅｓ Ｊ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＰＴＥＮ ｂｙ ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ＰＴＥＮ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８：３０６５２−６０）。
【０００４】
以上の知見に基づいて、ＣＫ２仲介リン酸化は、癌の治療処置のための可能性がある標的として使用するのに適した生化学的事象として確認され、その事象の潜在的阻害物質は総てそのような状態の治療のための見込みのある候補とされている。これまで、世界中のいくつかのグループが、二つの実験方法によりＣＫ２仲介リン酸化を阻害するために、異なる方法を開発してきた：ａ）ＣＫ２酵素の直接的阻害、又はｂ）総てのＣＫ２基質に共通して記述される酸性ドメインの近くにあるリン酸化部位のブロック（防護）。いずれの方法についても、著者達は、ＣＫ２仲介リン酸化事象の阻害が、腫瘍細胞のアポトーシスの誘発を生じることを実証でき、このことは癌治療のための薬物を発見するための有望な標的としてＣＫ２を実験的に確証したことを意味する。
【０００５】
例えば、４，５，６，７−テトラブロモトリアゾール（ＴＢＢ）のようなこの酵素の直接的阻害物質が、マイクロモル濃度範囲において、Ｊｕｒｋａｔ細胞において強力なアポトーシス−及びカスパーゼ依存性分解誘発物質として試験された（Ｒｕｚｚｅｎｅ Ｍ．，Ｐｅｎｚｏ Ｄ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ４，５，６，７−ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＴＢＢ）ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＨＳ１）ｉｎ Ｊｕｋａｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３６４：４１−４７）。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してＣＫ２酵素の発現を阻害することにより、マウスの実験的癌モデルにおいてインビトロアポトーシス作用及び抗腫瘍作用が示された（Ｇｕｏ Ｃ．，Ｙｕ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：５９９２−５９９９；Ｓｌａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＣＫ２ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：７１２−７２１）。
【０００６】
アントラキノン誘導体、フラボノイド及びハロゲン化アゾベンジルイミダゾール類のような他の化合物は、ＣＫ２ ＡＴＰ結合部位阻害物質として記述され（Ｓａｒｎｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００２）Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ−２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９３：１５９−１６８）、［５−オキソ−５，６−ジヒドロインドロ−（１，２−ａ）キナゾリン−７−イル］酢酸（ＩＱＡ）は、ハイスループットスクリーニングを使用して選択的ＣＫ２阻害物質として報告されている（Ｖａｎｇｒｅｖｅｌｉｎｇｈｅ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｂｙ［５−ｏｘｏ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｉｎｄｏｌｏ−（１，２−ａ）ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ−７−ｙｌ］ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＩＱＡ）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：２５５６−２６６２）。
【０００７】
前記の化合物は、マイクロモル範囲の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）においてＣＫ２活性阻害作用を示したが、癌の実験モデルにおける抗腫瘍作用が報告された形跡はない。
【０００８】
ＣＫ２−仲介リン酸化過程を阻害する他の記述された方法は、この酵素の基質に認められる酸性ドメインの中のリン酸化部位をブロックすることであった。特許出願ＷＯ ０３／０５４００２及びＰｅｒｅａ Ｓ．Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｆｏ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｅｔｉｄｅ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：７１２７−７１２９の研究の中で、著者らは、インビトロでＣＫ２基質のリン酸化をブロックし、前臨床癌モデルにおいて腫瘍細胞毒性及び抗腫瘍作用を示す環状ペプチドファミリーの使用を提案している。しかし、この報告に記述されたペプチドは、本質的に細胞の中に侵入できないという欠点を有しているので、膜を通過できるペプチドをそれに融合する必要がある。一般的に、小型分子に比較した場合に、ペプチドを使用することは循環及び分解によりインビボ安定性は減少する欠点があり、経口投与のために製剤化することは非常に困難であり、それらは容易には細胞の中に送りこめない（Ｌｕｄｇｅｒ Ｗｅｓｓ，Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｉｏｃｅｎｔｕｒｙ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５，２００４）。文献中に広く記述されているペプチドの他の問題としては、早いクリアランス、免疫原性の可能性及び治療用量当たりのコストが、一般的に非ペプチド性薬物より大きいことが知られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
治療薬剤候補としての前記環状ペプチドを使用することの潜在的欠点を考慮して、本発明は、基質上のリン酸化部位と直接的又は間接的に相互作用することによりＣＫ２−仲介リン酸化を阻害し、癌の動物モデルにおいて細胞毒性及び抗腫瘍作用を発現できる化合物を記述する。
【００１０】
本明細書に記述される化合物は、充分明確な化学構造を持ち、以下の作用の一つ又はいくつかを達成することができる：
Ａ：その化合物をＣＫ２基質のリン酸化ドメイン又はその周囲に結合させ、この酵素が基質に結合するのを直接的又は間接的に阻害する。
Ｂ：その化合物をＣＫ２基質のリン酸化ドメインに結合させて、酵素を結合させるがリン酸受容セリンへのリン酸基の移行を直接的又は間接的にブロックする。
Ｃ：その化合物をＣＫ２タンパク質基質へ結合させて、リン酸化ドメイン、その周囲又はその両者の立体構造の変化を生じさせて、ＣＫ２の結合又はリン酸受容セリンへのリン酸基の移行を直接的又は間接的にブロックする。
【００１１】
したがって、これらの化合物は、主に、ＣＫ２−仲介リン酸化の生化学事象を阻害する能力を持つことにより特徴付けられる。
【００１２】
特別な認識において、本発明は、指定された電子混成を持つ元素が連続的に結合したある原子団が分子のいずれかの部分に存在することにより規定される特別な化学構造により特徴付けられる化合物に関係し、その原子団は次の５つの構造グループに分類される：
Ｉ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２，３−Ｎ
ＩＩ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−［（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＩＩ．Ｎ−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＶ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ２）−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２−Ｃ（ｓｐ２）−Ｎ
Ｖ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ３）−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−Ｃ（ｓｐ３）−Ｎ
【００１３】
このような構造クラスに属するいくつかの化合物を以下に示す：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【００１４】
上記分子は、共通のリン酸化部位の徹底的分子モデリング（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．Ａ．（２００３）Ｏｎｅ−ｔｈｏｕｓａｎｄ−ａｎｄ−ｏｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ １７：３４９−３６０）、ＣＫ２酵素に対する分子結合によるその確証、そしてさらにわれわれの研究室で作成した約１，２００，０００個の化合物を含む化学的に多様性のあるデータベースの大規模な分子スクリーニングにより請求する機能のために記述された。
【００１５】
本発明は、記述された化合物の同族変異体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖａｒｉａｎｔ）も含む。同族変異体とは、本明細書に記述された分子と化学的性質が類似してもしなくても、ＣＫ２仲介リン酸化に対する阻害作用と同じ作用を達成させることができる化学構造を有する分子のことである。
【００１６】
その他に、本発明の実現には、１以上のこの化合物及び／又はそれらの医薬として受容し得る塩のみ、又は他の医薬として許容される賦形剤又は添加物と共に含む、医薬組成物が好ましい。また、インビトロ、インビボ又は生体付随装置（ｂｏｄｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｖｉｃｅｓ）での腫瘍細胞の増殖を阻害するため、生体組織での癌の治療のため、及び／又はＣＫ２酵素が病理的役割を持つ可能性がある他の状態のための、医薬品の製造における記述した化合物の使用も本発明の一部である。
【００１７】
この記述された化学的分子は、最少のアミノ酸配列Ｓ／Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｅ／Ｄ（式中Ｘは好ましくはリシン又はアルギニンとは異なるアミノ酸である）のリン酸化を阻害する能力、さらにこの共通配列を持たず、このタイプの化合物と結合し、ＣＫ２仲介リン酸化を阻害する能力を持つ他のタンパク質により規定される。
【００１８】
本発明に記述された化合物を定義するために、著者らは、充分に定義されているこの酵素の共通リン酸化部位の徹底的な分子モデリングを行い（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ．，Ｐｉｎｎａ Ｌ．Ａ．（２００３）Ｏｎｅ−ｔｈｏｕｓａｎｄ−ａｎｄ−ｏｎｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：３４９−３６８）、ＣＫ２酵素に対する分子結合によるその確証、そしてさらにわれわれの研究室で作成した約１，２００，０００個の化合物を含む化学的に多様性のあるデータベースの大規模な分子スクリーニングによる分析を行った。
【００１９】
平均を上回る算出結合エネルギーを持つ化合物を総て陽性として初回に選択し、より厳密な選択値により二回目のスクリーニングにかけ、構造の規則性を見るためにさらに分析した。第二回目のスクリーニングにおいて選抜された化合物の化学構造を、算出結合エネルギーの可能な最高値に達するように最適化した。このようにして推定された化合物を合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し、赤外スペクトル分析、マススペクトル分析及び核磁気共鳴により分析し、最後にインビトロ及びインビボの有効性を評価した。本発明により記述された化合物は、ＣＫ２仲介リン酸化事象の阻害能力に関して同等に有効である。
【００２０】
本発明に記述された化合物は、ヒト腫瘍細胞において、細胞透過性補助剤を使用せずに、用量依存的に細胞毒性を発現する。このエビデンスは、化合分子は細胞機構により輸送され、そして細胞内の標的に達することができることを示す過去の知見と一致する（Ｍｅｇｇｉｏ Ｆ，Ｐａｇａｎｏ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｂｙ ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３：１２９３１−１２９３６）。
【００２１】
同様に、これらの化合物のインビトロ細胞毒性試験においてナノモルの範囲でＩＣ５０値が見出されたことは勇気付けるものであった。これらの結果は、ＣＫ２リン酸化ドメインを阻害する既報の環状ペプチドよりも記述の化合物の細胞毒性活性が優れることを示している。
【００２２】
インビトロの結果に一致して、局所的及び全身的に投与した場合に、本発明の化合物は強力な抗腫瘍作用を有している。同様に、本発明の化合物は、０．５及び２ｍｇ／Ｋｇの低い投与量において、抗腫瘍作用を示すことが立証され、既報の環状ペプチドで記述された投与量の１０から２０倍少ないことを示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
特別な態様の詳細な説明／実施例
本発明は以下の実施例により説明される：
【実施例】
【００２４】
実施例１：インシリコ分子モデリングによる化合物の選抜。
コンピューターモデルを使用して開発された大規模な仮想スクリーニングにより、受容体−リガンド複合体の算出結合エネルギーの高値に基づいていくつかの化合物が選抜された（表１）。この概算のエネルギー値は、われわれの研究室で開発したコンピュータープログラムを使用して、立体構造及びいくつかのエネルギー要素の徹底的分析結果を考慮して推定した。
【表１】
【００２５】
実施例２：典型的なＣＫ２基質のリン酸化に対する記述された化合物の影響。
アッセイは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉに発現させたヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＶＨＰ−１６）のオンコプロテインＥ７を基質として使用するインビトロリン酸化反応を実施することである。次いで、得られたＥ７−ＧＳＴをグルタチオン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。酵素反応の前に、Ｅ７−ＧＳＴを種々の濃度の化合物と１時間３７℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌのＴｒｉｓ：ＨＣＬ ２５ｍＭ ｐＨ７．５緩衝液、１μＣｉの３２Ｐ−γＡＴＰ，１００μＭ ＡＴＰ、４０μｌのＥ７−ＧＳＴ含有樹脂、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１単位のＣＫ２酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物中において行われ、４０分間３７℃で進行させた。反応の後、樹脂を０．５ ｍｌの反応緩衝液で３回洗い、最後にＥ７−ＧＳＴのリン酸化レベルを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）中で分析した。リン酸化タンパク質の可視化は、Ｘ線感受性のフィルムを乾燥ＰＡＧＥゲルに暴露することにより行われ、定量化はフィルムのデンシトメトリー分析により行われた。ＩＣ５０値は、それぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値は、酵素活性の５０％を阻害する濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００２６】
ＩＣ５０値から判断して、本明細書に記述する化合物は典型的なＣＫ２基質の有効な阻害物質であることを、表２のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較してこの化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表２】
【００２７】
実施例３．ＣＫ２共通部位のリン酸化に対する記述した化合物の作用。
このアッセイは、ＣＫ２基質の最適化された共通リン酸化ドメインとして広く受入れられている配列ＲＲＲＥＥＥＴＥＥＥを基質として使用するインビトロリン酸化反応を行うことである。
【００２８】
酵素反応の前に、基質ペプチドを種々の濃度の化合物と１時間３７℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌのＴｒｉｓ：ＨＣＬ ２５ｍＭ ｐＨ７．５緩衝液，１μＣｉの３２Ｐ−γＡＴＰ，１００μＭ ＡＴＰ、４０μｌのＥ７−ＧＳＴ含有樹脂，０．２Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１単位のＣＫ２酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の混合物中において行われ、１０分間３７℃で進行させた。反応の後、５μｌの反応混合物をＷｈａｔｍａｎｎ ＰＥ−８１ペーパーフィルターに供し、１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４で４回洗い、最後に放射能を伴うペーパーを測定し、各検体のｃｐｍ値を直接ＣＫ２酵素活性と相関させた。
【００２９】
ＩＣ５０値は、それぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値を、酵素活性の５０％阻害濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００３０】
ＩＣ５０値から判断して、ここに記述された化合物は典型的なＣＫ２基質の有効な阻害物質であることを、表３のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較してこの化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表３】
【００３１】
実施例４：本明細書に記述する化合物のヒト腫瘍細胞に対する作用
ヒト非小細胞肺癌のＨ−１２５細胞を、９６−ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ（ＤＭＥＭ）培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２×１０４細胞／ｍｌ密度で接種した。２４時間後、本明細書に記述する化合物を０．５〜１００ｎＭの範囲で培地に加え、この混合物を７２時間３７℃で５％ＣＯ２中インキュベートし、最後に２０μｌの１．９０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＳ溶液を加えた。プレートをさらに１時間同じインキュベーション条件に保ち、４９２ｎｍで吸光度を測定した。結果は、いずれの化合物も加えない対照に対する増殖パーセンテージとして評価し、ＩＣ５０値はそれぞれの用量−作用曲線を使用して評価した。このＩＣ５０値を、酵素活性の５０％阻害濃度とみなされる。並行して、同じ条件下に、ＣＫ２基質リン酸化部位の阻害物質として既に報告されている環状ペプチドＰ１５を使用してアッセイする対照実験が比較として行われた。
【００３２】
ＩＣ５０値から判断して、本明細書に記述する化合物は、培養ヒト腫瘍細胞に対する強力なインビトロ細胞毒性作用を持つことを、表４のデータは示している。注目すべきことは、マイクロモル濃度の範囲だけで有効であり、既報の環状ペプチドに比較して、この化合物の阻害能力は非常に強いことである。
【表４】
【００３３】
実施例５：ヌードマウス移植モデルに移植されたヒト腫瘍のモデルにおける本発明の化合物の抗腫瘍作用。
６〜８週齢の雌ＢａｌｂＣヌードマウスをこのアッセイに使用した。この腫瘍移植モデルにおいて、２５０μｌのＰＢＳに懸濁した５，０００，０００個のＨ−１２５細胞を動物の背部に注射した。腫瘍が触診可能の約５０ｍｍ３の体積になった後、化合物Ｃ３２４２５、Ｃ３３４２６及びＣ３３４２７の２００μｇを毎日５日間直接投与した。図１に示すように、化合物の投与の結果、有意な抗腫瘍応答を生じた。この結果は、ＣＫ２仲介リン酸化を阻害する化合物は、実験的腫瘍の妥当なモデルにおいて抗腫瘍応答を発現することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】マウスに移植されたヒト腫瘍モデルにおける化合物の抗腫瘍作用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の条件：
ａ．基質上のリン酸受容部位に結合し、それにより基質に対するＣＫ２酵素の結合を直接的又は間接的に阻止する。
ｂ．リン酸受容セリンへのリン酸の転移を直接的又は間接的に阻止する。
ｃ．ＣＫ２脂質タンパク質に結合してリン酸化ドメイン、その隣接部位、又は両者の立体構造変化を引き起こし、直接的又は間接的にａ又はｂにより作用する、
の一つ又はいくつかを充たすことが特徴であるカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）仲介リン酸化を阻止する化合物。
【請求項２】
化学的構造が、指定された電子混成を持つ元素が連続して結合したある原子団が分子のいずれかの部分に存在しそして以下の５つの構造グループ：
Ｉ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２，３−Ｎ
ＩＩ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−［（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＩＩ．Ｎ−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＶ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ２）−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２−Ｃ（ｓｐ２）−Ｎ
Ｖ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ３）−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−Ｃ（ｓｐ３）−Ｎ
の少なくとも１つから選択された請求項１に記載の化合物及びその同族変異体。
【請求項３】
請求項１及び２に記載の化合物及びその医薬として受容される塩の１つ以上を、医薬として許容される賦形剤又は添加物と共に含む、ＣＫ２酵素が病理的に及び／又は他の腫瘍関連過程（ｎｅｏｐｌａｓｉｃ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓｓ）に役割を持つ可能性がある疾患又は状態を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
インビトロ、インビボ又は身体付随装置における腫瘍細胞の増殖を阻害するため、生体組織における癌及び／又はＣＫ２酵素が病理的役割を持つ可能性がある他の状態の治療のための医薬品の製造における請求項１又は２のいずれか一つに記載の化合物の使用。
【請求項１】
以下の条件：
ａ．基質上のリン酸受容部位に結合し、それにより基質に対するＣＫ２酵素の結合を直接的又は間接的に阻止する。
ｂ．リン酸受容セリンへのリン酸の転移を直接的又は間接的に阻止する。
ｃ．ＣＫ２脂質タンパク質に結合してリン酸化ドメイン、その隣接部位、又は両者の立体構造変化を引き起こし、直接的又は間接的にａ又はｂにより作用する、
の一つ又はいくつかを充たすことが特徴であるカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）仲介リン酸化を阻止する化合物。
【請求項２】
化学的構造が、指定された電子混成を持つ元素が連続して結合したある原子団が分子のいずれかの部分に存在しそして以下の５つの構造グループ：
Ｉ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２，３−Ｎ
ＩＩ． Ｎ−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−［（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＩＩ．Ｎ−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２，３−Ｎ
ＩＶ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ２）−［Ｃ（ｓｐ３）］１，２−Ｃ（ｓｐ２）−Ｎ
Ｖ． Ｎ−Ｃ（ｓｐ３）−［Ｃ（ｓｐ２）］１，２−Ｃ（ｓｐ３）−Ｎ
の少なくとも１つから選択された請求項１に記載の化合物及びその同族変異体。
【請求項３】
請求項１及び２に記載の化合物及びその医薬として受容される塩の１つ以上を、医薬として許容される賦形剤又は添加物と共に含む、ＣＫ２酵素が病理的に及び／又は他の腫瘍関連過程（ｎｅｏｐｌａｓｉｃ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓｓ）に役割を持つ可能性がある疾患又は状態を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
インビトロ、インビボ又は身体付随装置における腫瘍細胞の増殖を阻害するため、生体組織における癌及び／又はＣＫ２酵素が病理的役割を持つ可能性がある他の状態の治療のための医薬品の製造における請求項１又は２のいずれか一つに記載の化合物の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５４３７３５（Ｐ２００８−５４３７３５Ａ）
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１０３８９（Ｐ２００８−５１０３８９）
【出願日】平成１８年５月５日（２００６．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／０００００２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１９７１３
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月５日（２００６．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／０００００２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１９７１３
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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