抗腫瘍活性を有するＡＫＴ／ＰＫＢの阻害剤
本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ経路の阻害のための材料および方法に関する。１つの実施形態において、本発明の化合物は、Ａｋｔタンパク質のキナーゼ活性および／またはリン酸化レベルを阻害する。本発明は、式Ｉの化合物の有効量と細胞を接触させることを含む、Ａｋｔタンパク質の発現が上昇されるかまたは構成的に活性のある癌細胞または他の細胞を阻害または殺傷する方法にも関する。本発明は、人または動物に対して式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、人または動物中の癌または腫瘍を治療する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年７月１２日に出願された米国仮出願第６０／９４９，３６５号の利益を主張し、任意の図、表、核酸配列、アミノ酸配列および図面を含むその全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
政府支援
【０００２】
本出願の主題は、助成金番号Ｒ０１ＣＡ１０７０７８、ＤＡＭＤ１７−０２−１−０６７１およびＷ８１ＸＷＨ−０５−１−００２１の下で、国立衛生研究所−国立癌研究所およびＡＲＭＹ／ＭＲＭＣからの研究助成金によって支援された。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
プロテインキナーゼＢとも呼ばれるＡｋｔは、セリン／スレオニンキナーゼのサブファミリーを示す。Ａｋｔは、ｖ−ａｋｔ癌遺伝子産物の細胞ホモログとして最初に記載され（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ． １９９１）、それは３つのメンバーのＡｋｔ１／ＰＫＢα、Ａｋｔ２／ＰＫＢβおよびＡｋｔ３／ＰＫＢγを有する（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１ａ； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１ｂ）。Ａｋｔの活性化は、膜輸送を仲介するプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインの完全性、ならびに活性化ループ中のＴｈｒ308、およびＳｅｒ473のリン酸化に依存する（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ＰＩ３ Ｋによって生産されたフォスフォイノシチド（ＰｔｄＩｎｓ−３，４−Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３）は、ＡｋｔのＰＨドメインへ直接結合し、分子中のコンフォメーション変化を引き起こし、それはＡｋｔの活性化ループをＴｈｒ308でＰＤＫ１によってリン酸化することができる（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ａｋｔの完全活性化もまた、Ｃ末端の疎水性モチーフ内のＳｅｒ473のリン酸化に関連する（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ｔｈｒ308のリン酸化におけるＰＤＫ１の役割は十分に確立されているが、Ｓｅｒ473のリン酸化の機構は論争の的になっている。この修飾に関与する多数の候補酵素が提案され、それらはインテグリン結合キナーゼ（Ｐｅｒｓａｄ ｅｔ ａｌ． ２００１）、キナーゼＰＲＫ２の複合体中にある場合のＰＤＫ１（Ｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０００）、自己リン酸化を介してＡｋｔそれ自体（Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００）、ＤＮＡ依存性キナーゼ（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）、およびリクター（ｒｉｃｔｏｒ）−ｍＴＯＲ複合体（Ｓａｒｂａｓｓｏｙ ｅｔ ａｌ． ２００５）を含む。Ａｋｔの活性は、ヒト悪性腫瘍中で頻繁に変異している腫瘍抑制因子ＰＴＥＮによって負に調節される（Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ． ２０００）。ＰＴＥＮは、ＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３をＰｔｄＩｎｓ−４，５−Ｐ２に変換することによってＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３の細胞内濃度を低下させ、その結果としてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を阻害する、二重特異性タンパク質および脂質ホスファターゼをコードする（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【０００４】
Ａｋｔは多数の分子をリン酸化および／またはそれらと相互作用して、細胞の増殖、生存、移動および分化における役割を含む正常な細胞機能を発揮させる（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００１）。多くの証拠から、Ａｋｔが腫瘍発生および進行において重大な役割を持つことが実証される。さらに、Ａｋｔ経路の異常な過活性化はすべてのヒト腫瘍の最大５０％で検出され（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００１； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）、密接に化学耐性に関連する（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ． ２００２）。したがって、Ａｋｔは抗癌薬物開発のための魅力的な標的であった（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【０００５】
過去数年において、組み合わせ化学、ハイスループットおよび仮想スクリーニング、ならびに従来の医薬品化学を介して、Ａｋｔ経路の何十もの阻害剤が同定された。Ａｋｔの脂質ベースの阻害剤は第１に開発されたものであり、ペリホシン（Ｋｏｎｄａｐａｋａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、ＰＸ−３１６（Ｍｅｕｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ． ２００４）およびホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（Ｃａｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ． ２００４）を含み、ＡｋｔのＰＨドメインと相互作用するようにデザインされた。さらに、いくつかのＡｋｔアンタゴニストは、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングおよび合理的設計を使用して同定された。これらの阻害剤は、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセタート（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）、インダゾール−ピリジンＡ−４４３６５４（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ． ２００５）、アイソフォーム特異的アロステリックキナーゼ阻害剤（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ２００５）、およびトリシリビン／ＴＣＮとも呼ばれるＡｋｔ／ＰＫＢシグナリング阻害剤−２（ＡＰＩ−２）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）を含む。ＡＰＩ−２／ＴＣＮは、以前に行われた第Ｉ相および第ＩＩ相の試験において抗腫瘍活性を示す三環式ヌクレオシドであるが、肝毒性、高血糖、血小板減少および高トリグリセリド血症を含む複数の毒性によりさらなる開発は妨げられた（Ｆｅｕｎ ｅｔ ａｌ． １９９３； Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９６）。我々は、ＮＣＩ多様性セットのスクリーニングによって、ＡＰＩ−２がＡｋｔキナーゼ活性を阻害し、高Ａｋｔ活性を示すヒト癌細胞の異種移植片のアポトーシスを刺激することを以前に示した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）。この結果からこの薬物の研究に新たな関心が持たれ、より低用量でＡｋｔを阻害し、以前の関連した副作用なしに腫瘍細胞アポトーシスを誘導しうる可能性が提出される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ経路の阻害のための化合物、組成物および方法に関する。１つの実施形態において、本発明の化合物は、Ａｋｔタンパク質のキナーゼ活性および／またはリン酸化レベルを阻害する。本発明の化合物は、式Ｉで示される一般的な構造を有する。特異的実施形態において、本発明の化合物（本明細書においてＡＰＩ−１と呼ばれる）は、構造：
【化１】
を有する。
【０００７】
ＡＰＩ−１などの本発明の化合物は、異常なＡｋｔを有するヒト腫瘍細胞におけるＡｋｔシグナリングを阻害し、細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導を導く。異種移植ヌードマウスモデルにおいて、本発明の化合物は、過活性化されたＡｋｔを有する細胞における腫瘍増殖をかなり阻害するが、低レベルのＡｋｔを有する腫瘍においては阻害しない。
【０００８】
本発明は、式Ｉの化合物の有効量と細胞を接触させることを含む、Ａｋｔタンパク質の発現が上昇されるかまたは構成的に活性のある癌細胞または他の細胞を阻害または殺傷する方法にも関する。
【０００９】
本発明は、人または動物に対して式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、人または動物中の癌または腫瘍を治療する方法にも関する。
【００１０】
セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢ経路は、ヒト癌において頻繁に過活性化され、細胞外および細胞内の腫瘍形成シグナルの変換のための基本的な節点として機能し、したがってそれは分子治療のための標的を示す。国立癌研究所の多様性セットのスクリーニングによって、低分子のＡｋｔ経路阻害剤のＡＰＩ（Ａｋｔ／ＰＫＢシグナリング阻害剤）−１が同定された。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔファミリーの３つのメンバーのキナーゼ活性およびリン酸化レベルを阻害する。しかしながら、それは上流活性化因子（ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１）の活性には効果がなかった。さらに、構成的に活性のあるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化レベルは、細胞培養において主としてＡＰＩ−１によって阻害されるが、それはＡｋｔキナーゼ活性にはインビトロで効果がなかった。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔについて高度に選択的であり、ＰＫＣ、ＳＧＫ、ＰＫＡ、ＳＴＡＴ３、Ｅｒｋ−１／２、またはＪＮＫの活性化を阻害しない。ＡＰＩ−１によるＡｋｔの阻害は、構成的に活性化されたＡｋｔを保有するヒト癌細胞において、細胞増殖停止およびアポトーシスの誘導をもたらした。重要なことには、ＡＰＩ−１は、Ａｋｔが上昇したヒト癌細胞のヌードマウスにおいて腫瘍増殖を選択的に阻害したが、Ａｋｔが上昇しないこれらの癌細胞の増殖は阻害しない。これらのデーターは、ＡＰＩ−１がインビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を有するＡｋｔ経路阻害剤であり、過活性化Ａｋｔを発現する癌患者のための可能性のある抗癌剤でありえることを示唆する。
【００１１】
Ａｋｔは、癌細胞の生存、増殖および腫瘍進行を調節する主要な経路である。上昇したレベルのＡｋｔキナーゼは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（グリーベック）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ハークプチン（Ｈｅｒｃｐｔｉｎ））、およびｍＴＯＲ（ラパマイシン）の細胞毒性化学療法薬および低分子阻害剤を含む様々な癌治療法に対する耐性に寄与することがよく報告されていた。Ａｋｔのブロックは、過活性化Ａｋｔを有する癌細胞において腫瘍増殖を阻害し、化学療法および他の標的化された治療に対して癌細胞をより感受性にする。他の抗腫瘍薬物とのＡＰＩ−１の組合せはより強力な抗腫瘍効果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔ阻害剤の候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１の化学構造を示す。
【図１Ｂ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１がＡｋｔの３つのメンバーを阻害することを示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−Ａｋｔ１、ＨＡ−ＡＫＴ２およびＨＡ−ＡＫＴ３によりトランスフェクションし、ＥＧＦ刺激前にＡＰＩ−１（１０μＭ）により処理し、細胞を溶解し、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物はインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。下部パネルは、トランスフェクションしたＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３の発現を示す、抗ＨＡ抗体により検出したウエスタンブロットである。
【図１Ｃ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１が、ＯＶＣＡＲ３細胞（それらは過活性化Ａｋｔを発現する）においてＡｋｔのリン酸化レベルを阻害することを示す図示である。細胞を示された濃度でＡＰＩ−１により２時間処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体によるイムノブロット解析を行なった（上部パネル）。下部パネルは全Ａｋｔの発現を示す。
【図１Ｄ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１がインビトロでＡｋｔを阻害しないことを示した図示である。示された量のＡＰＩ−１を含むキナーゼバッファー中の構成的に活性のあるＡｋｔ組換えタンパク質のインビトロキナーゼ分析。化合物Ｅ（複数のキナーゼ阻害剤のＡＴＰ競合物）を陽性対照として使用した。実験は３回反復した。
【図２Ａ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロＰＩ３Ｋキナーゼ分析を示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞は血清飢餓を行い、ＥＧＦ刺激前に３０分間ＡＰＩ−１（１０μＭ）またはワートマニン（１ｎＭ）により処理した。細胞を溶解し、抗ｐ１１０α抗体により免疫沈降した。免疫沈降物は、基質としてＰＩ−４−Ｐを使用する、インビトロキナーゼ分析を行なった。
【図２Ｂ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＰＤＫ１活性化に対するＡＰＩ−１の効果を示す図示である。インビトロキナーゼ分析は、示された化合物の存在下で製造者説明書に従って、ＰＤＫ１キナーゼキット（アップステート・バイオテクノロジー社 （Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ） ）により実行された。
【図２Ｃ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロのＰＫＡキナーゼ分析を示す図示である。組換えＰＫＡを、示された阻害剤（ＡＰＩ−１またはＰＫＡＩ）および基質ケンプチドを含むＡＤＢバッファー（アップステート・バイオテクノロジー社）中でインキュベートした。キナーゼ活性を定量した。
【図２Ｄ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。生細胞における、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＰＤＫのキナーゼ活性に対するＡＰＩ−１の効果を示す図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１の示された濃度により１時間処理した。細胞を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図２Ｅ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロＳＧＫキナーゼ分析を示す図示である。組換えＳＧＫタンパク質をＡＰＩ−１または化合物Ｅと共にインキュベートした。キナーゼ分析は、ＳＧＫ基質ペプチドおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰの追加によって開始された。キナーゼ活性を定量した。
【図２Ｆ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−ＳＧＫによりトランスフェクションし、ＥＧＦ刺激前にＡＰＩ−１またはワートマニンにより処理した場合の結果を示す図示である。インビトロキナーゼは、基質としてヒストン−Ｈ２Ｂを使用して、ＨＡ−ＳＧＫ免疫沈降物により実行された。
【図２Ｇ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＡＰＩ−１が、Ｅｒｋ、ｐ３８、ＪＮＫおよびＳｔａｔ３のリン酸化を阻害しないことを示す図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１により３時間処理し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図３Ａ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＰＩ−１が構成的に活性のあるＡｋｔを阻害することを実証する図示である。ＨＥＫ２９３細胞を、示されたＨＡ−ｍｙｒ−Ａｋｔ１、ＨＡ−Ａｋｔ１−Ｅ４０ＫおよびＨＡ−ｍｙｒ−Ａｋｔ２によりトランスフェクションした。ＡＰＩ−１による１時間の処理に後続して、細胞を溶解して、抗ＨＡ抗体により免疫沈降させた。免疫沈降物に、インビトロキナーゼ分析（上部パネル）、および示された抗体によるイムノブロット（中央および下部のパネル）を行なった。
【図３Ｂ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＰＩ−１がＡｋｔの下流の標的のリン酸化を阻害することを実証する図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１（１０μＭ）により示された時間処理し、示された抗体によりイムノブロットした。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔおよびその下流の標的（ＧＳＫ３βおよびＳ６タンパク質）のリン酸化レベルを有意に低下させる。
【図３Ｃ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＫＴ−ＳＩ１は、Ａｋｔの下流の標的のリン酸化を阻害した。
【図３Ｄ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＫＴ−ＳＩ１は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２複合体を妨害しなかった。
【図４Ａ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。ＡＰＩ−１による処理に後続する結果を示すウエスタンブロットであり、Ａｋｔのリン酸化レベルおよびＰＡＲＰ切断は、示されたヒト癌細胞株において抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体および切断ＰＡＲＰ抗体により検出された（上部および中央のパネル）。ブロットは抗アクチン抗体により再プロービングした（下部パネル）。
【図４Ｂ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。示された細胞株を異なる用量のＡＰＩ−１により２４時間処理し、次にＭＴＴ分析により解析した細胞増殖分析である。
【図４Ｃ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。示された細胞株を異なる用量のＡＰＩ−１により２４時間処理し、次にＭＴＴ分析により解析した細胞増殖分析である。
【図４Ｄ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）によって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｅ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｆ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｇ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図５Ａ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｂ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｃ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｄ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｅ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｆ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｇ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｈ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｉ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｊ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｋ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。ＡＰＩ−１がインビボでＡｋｔリン酸化を阻害することを実証する。ＡＰＩ−１処理された腫瘍試料および無処理の腫瘍試料を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図５Ｌ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。ＡＰＩ−１がインビボでＡｋｔリン酸化を阻害することを実証する。ＡＰＩ−１処理された腫瘍試料および無処理の腫瘍試料を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図６Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図６Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図６Ｃ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図７Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｃ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｄ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｅ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図８Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮがリン酸化Ａｋｔレベルを阻害することを示した図である。野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７ＫによりトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された試薬により処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体（上部）および抗Ｍｙｃ抗体（下部）によりイムノブロットした。
【図８Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮがリン酸化Ａｋｔレベルを阻害することを示した図である。野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７ＫによりトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された試薬により処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体（上部）および抗Ｍｙｃ抗体（下部）によりイムノブロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する化合物および組成物に関する。１つの実施形態において、本発明の化合物は、Ａｋｔタンパク質のキナーゼ活性および／またはリン酸化レベルを阻害する。本発明の化合物は、式Ｉ：
【化２】
（Ｉ）
（式中、
Ｘは独立してＯ、ＮまたはＳであり；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ1は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＯＨにより任意に置換されるアルキル、または−ＯＨにより任意に置換されるアルコキシであり；
および、Ｒ2は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキル、またはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意に置換することができ；
Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキルまたはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨまたはハロゲンまたはアルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができる）；または
その類似体もしくは薬学的に許容される塩で示される一般的な構造を有する。
【００１４】
１つの実施形態において、各ＸはＮである。例示された実施形態において、ＹはＯである。別の例示された実施形態において、各Ｒ1は独立して−ＯＨまたは−ＣＨ2ＯＨである。なお別の実施形態において、Ｒ2は−ＯＨにより任意に置換される−ＮＨ2である。さらに実施形態において、Ｒ2は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2である。
【００１５】
具体的な実施形態において、本発明の化合物は、以下の構造（式ＩＩ）：
【化３】
（ＩＩ）
を有する 。
【００１６】
本発明の化合物は、ＰＴＥＮ変異などの上流レギュレーターの変化からの結果として生じる高度に活性化された野生型Ａｋｔだけでなく、ｍｙｒ−ＡＫＴ１、Ｍｙｒ−ＡＫＴ２およびＥ４０Ｋ−ＡＫＴ１を含む、構成的に活性のあるＡｋｔ変異体も阻害する。最近の研究は、脂質結合ポケット中のアミノ酸１７でのグルタミン酸のリジン置換（Ｅ１７Ｋ）をもたらす、ヒトの乳癌、結腸直腸癌および卵巣癌におけるＡＫＴ１のＰＨドメイン中の再発性体細胞変異を同定した（Ｃａｒｐｔｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。Ｌｙｓ１７はポケットの静電的相互作用を変化させて、フォスフォイノシチドリガンドによる新しい水素結合を形成する。この変異は細胞膜への病的な局在を介してＡＫＴ１を活性化し、細胞を形質転換し、マウスにおける白血病を誘導する。さらに、Ｅ１７Ｋ置換はアロステリックキナーゼ阻害剤への感受性を低下させる（Ｃａｒｐｔｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。Ｅ４０Ｋ−ＡＫＴ１変異体は細胞膜に局在できるＥ１７Ｋに類似しているので（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ． １９９８）、ＡＰＩ−１はＥ１７Ｋ−ＡＫＴ１もまた阻害しうる。
【００１７】
単離された化合物として本発明の化合物を投与することができるが、これらの化合物は、医薬組成物の一部としても投与することができる。本発明は、したがってさらに少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う組成物を提供する。医薬組成物は、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、皮下投与などのような様々な投与経路に適合させることができる。当業者によって決定することができるように、継続的に、または明瞭なインターバルで投与することができる。
【００１８】
本発明の化合物は、薬学的に有益な組成物を調製する公知の方法に従って製剤化することができる。製剤は、当業者に周知であり容易に利用可能な多数の出典中に記述されている。例えば、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｍａｒｔｉｎ １９９５）は、本発明に関連して使用できる製剤について記述する。投与に適切な製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの製剤を血液と等張にする溶質を含みうる水性の滅菌済み注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含みうる水性および非水性の滅菌済み懸濁物を含む。製剤は、単位用量またはマルチ用量の容器（例えば密封したアンプル、バイアル）中に提供され、使用前に、滅菌済み液体担体（例えば注射用の水）の条件のみを必要とする、冷凍乾燥（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時注射溶液および懸濁物は、滅菌済みの粉末、顆粒、タブレットなどから調製することができる。特に上で言及された成分に加えて、本発明の組成物は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野における従来の他の薬剤を含みうることが理解されるべきである。
【００１９】
本明細書において使用されるように、アルキルは、直鎖または分岐鎖である、１〜２０の炭素原子を有する飽和炭化水素基または一価不飽和炭化水素基もしくは多価不飽和炭化水素基を意味し、Ｃ1-Xアルキルは、１〜「Ｘ」の炭素原子数を含む直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。例えば、Ｃ1-6アルキルは、１〜６の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。アルコキシは、アルキル基が以前に本明細書において記述されているようなものである、アルキル−Ｏ−基を意味する。
【００２０】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素などの周期表のハロゲンを意味する。
【００２１】
用語「任意に置換される」は、任意の利用可能な１つまたは複数の位置で、１つまたは複数の有機基または無機基（例えばアルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、またはハロゲン）により任意に置換されることを意味する。
【００２２】
飽和アルキル基の例は、メチル、エチル、Ｎ−プロピル、イソプロピル、Ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、Ｎ−ペンチル、Ｎ−ヘキシル、Ｎ−ヘプチルおよびＮ−オクチルを含むが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基は、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ヘキセニル、ビニル、２−プロピニル、２−イソペンテニル、２−ブタジエニル、エチニル、１−プロピニル、３−プロピニルおよび３−ブチニルを含む。具体的には、「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、４−ノネニル、５−ノネニル、６−ノネニル、７−ノネニル、８−ノネニル、１−デケニル、２−デケニル、３−デケニル、４−デケニル、５−デケニル、６−デケニル、７−デケニル、８−デケニル、９−デケニル；１−ウンデケニル、２−ウンデケニル、３−ウンデケニル、４−ウンデケニル、５−ウンデケニル、６−ウンデケニル、７−ウンデケニル、８−ウンデケニル、９−ウンデケニル、１０−ウンデケニル、１−ドデケニル、２−ドデケニル、３−ドデケニル、４−ドデケニル、５−ドデケニル、６−ドデケニル、７−ドデケニル、８−ドデケニル、９−ドデケニル、１０−ドデケニル、１１−ドデケニル、１−トリデケニル、２−トリデケニル、３−トリデケニル、４−トリデケニル、５−トリデケニル、６−トリデケニル、７−トリデケニル、８−トリデケニル、９−トリデケニル、１０−トリデケニル、１１−トリデケニル、１２−トリデケニル、１−テトラデケニル、２−テトラデケニル、３−テトラデケニル、４−テトラデケニル、５−テトラデケニル、６−テトラデケニル、７−テトラデケニル、８−テトラデケニル、９−テトラデケニル、１０−テトラデケニル、１１−テトラデケニル、１２−テトラデケニル、１３−テトラデケニル、１−ペンタデケニル、２−ペンタデケニル、３−ペンタデケニル、４−ペンタデケニル、５−ペンタデケニル、６−ペンタデケニル、７−ペンタデケニル、８−ペンタデケニル、９−ペンタデケニル、１０−ペンタデケニル、１１−ペンタデケニル、１２−ペンタデケニル、１３−ペンタデケニル、または１４−ペンタデケニルを含むことができ；「アルコキシ」は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンタオキシ、３−ペンタオキシ、ヘキサオキシ、ヘプチロキシ、オクチロキシ、ノニロキシ、デシロキシ、ウンデシロキシ、ドデシロキシ、トリデシロキシ、テトラデシロキシ、またはペンタデシロキシを含むことができる。
【００２３】
本発明の化合物は、当業者によって調製することができるすべて水和物および塩を含む。本発明の化合物が安定した無毒な酸性塩または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性の条件下で、塩として化合物を投与することは適切でありうる。薬学的に許容される塩の例は、生理学的な許容されるアニオンを形成する酸により形成された有機酸の付加塩（例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩）である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩塩を含む、適切な無機塩類もまた形成することができる。
【００２４】
化合物の薬学的に許容される塩は、当技術分野における周知の標準的手順を使用して、例えば、生理学的に許容されるアニオンを与える適切な酸とアミンなどの十分に塩基性の化合物を反応させることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えばナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩、またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩もまた作製することができる。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「類似体」は、実質的にもう一つの化合物と同種類のものであるが、例えば、側鎖基の追加、親構造の酸化または還元によって修飾されうる化合物を指す。本発明の化合物の類似体は、一般に公知の標準的反応を使用して容易に調製することができる。これらの標準的反応は、水素化反応、アルキル化反応、アセチル化反応および酸性化反応を含むが、これらに限定されない。化学的修飾は、分子中に存在するすべての官能基を保護すること、および所望の反応を行なった後にそれらを脱保護することによって、科学文献中で公知の標準的手順を使用して、当業者によって成し遂げることができる（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｋｏｎｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． ２０００；それらの各々はその全体を参照することにより本明細書に組み入れられる）。所望の生物学的活性（アポトーシスの誘導、細胞毒性、細胞静止、細胞周期停止の誘導、抗血管形成特性などのような）を示す類似体は、細胞分析または他のインビトロもしくはインビボの分析を使用して、同定または確認することができる。
【００２６】
本発明の化合物は１つまたは複数の非対称的に置換された炭素原子（すなわち炭素中心）を含むことができることが理解される。本発明の化合物における１つまたは複数の不斉中心の存在は、立体異性体を生じさせることができ、各場合において、本発明は、鏡像異性体および偏左右異性体を含むそのようなすべての立体異性体、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物に拡張するように理解されるべきである。
【００２７】
本発明の化合物および組成物は、様々な非治療目的および治療目的に有用である。化合物および組成物は、動物およびヒトにおける異常な細胞増殖の減少のために使用できる。化合物のかかる抗増殖特性のために、それらはインビトロおよびインビボを含む様々な設定における望まれない細胞増殖を減少させるのに有用である。
【００２８】
化合物およびそれらを含む組成物の治療適用は、現時点でまたは将来的に当業者に公知の任意の適切な治療方法および技術によって成し遂げることができる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物および組成物の調製のための出発材料または中間体としての用途を有する。
【００２９】
本発明の化合物およびその組成物は、任意で不活性希釈剤などの薬学的に許容される担体と組み合わせて、望まれない細胞増殖の部位（腫瘍部位または良性の皮膚増殖など、例えば腫瘍または皮膚増殖に対して注射または局所的に適用される）または真菌感染の部位などの１つまたは複数の解剖学的な部位で局所的に投与することができる。本発明の化合物およびその組成物は、任意で不活性希釈剤など薬学的に許容される担体または経口送達のための吸収可能な食用担体と組み合わせて、全身的に（静脈内または経口的など）投与することができる。それらはハードシェルゼラチンカプセルまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入できるか、タブレットに圧縮できるか、または患者の食餌の食品に直接組み入れることができる。経口の治療投与のために、活性化合物は１つまたは複数の賦形剤と組み合わせることができ、摂取可能なタブレット、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ剤、ウエハー、エアゾールスプレーおよび同種のものの形態で使用できる。
【００３０】
タブレット、トローチ、ピル、カプセルおよび同種のものは、以下のものもまた含むことができる。トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸および同種のものなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなど甘味剤、またはペパーミント、ヒメコウジ油もしくはチェリーフレーバーなどの着香剤を追加できる。単位投与量形態がカプセルである場合、上述のタイプの材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含むことができる。様々な他の材料は、被膜として、またはそうでなければ固体単位の投与量形態の物理的形態を修飾するように存在しうる。例えば、タブレット、ピルまたはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖および同種のものにより被覆できる。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリーフレーバーまたはオレンジフレーバーなどの香味料を含むことができる。当然、任意の単位投与量形態の調製に使用される任意の材料は、使用する量で薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は徐放性の調製物および装置の中へ組み入れることができる。
【００３１】
本発明の化合物および組成物（その薬学的に許容される塩または類似体を含む）は、注入または注射によって静脈内に、筋肉内に、または腹腔内に投与することができる。活性薬剤またはその塩の溶液は無毒な界面活性剤と任意で混合されて、水中で調製することができる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびその混合物、ならびに油中でも調製することができる。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する防腐剤を含むことができる。
【００３２】
注射または注入に適切な薬学的投与量形態は、任意でリポソーム中でカプセル化された滅菌済みの注射可能もしくは注入可能な溶液または分散物の即時調整に適合する活性成分を含む、滅菌済みの水性の溶液もしくは分散物または滅菌済みの粉末を含むことができる。最終的な投与量形態は、滅菌済みで流動的であり、製造および保存の条件下で安定しているべきである。液体担体または媒質は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、および同種のもの）、植物油、無毒なグリセリルエステル、および適切なそれらの混合物を含む、溶媒または液体分散媒でありえる。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散物の場合で必要とされる粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。任意で、微生物活動の防止は、様々な他の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同種のもの）によって成し遂げることができる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウム）を含むことは好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の含有によって成し遂げることができる。
【００３３】
滅菌済みの注射可能な溶液は、上で列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要とされた量で本発明の化合物を組み入れ、必要に応じて続いて濾過滅菌することによって調製される。滅菌済みの注射可能な溶液の調製のための滅菌済み粉末の場合において、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥の技術であり、事前に滅菌済みの濾過溶液中に存在する任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末をもたらす。
【００３４】
局所投与のために、本発明の化合物は液体または固体として適用されうる。しかしながら、皮膚科学的に許容される担体（固体または液体でありうる）と組み合わせて、組成物として皮膚に局所的に投与することが一般的に望ましいだろう。本発明の化合物および組成物を被験体の皮膚に局所的に適用して、悪性腫瘍または良性腫瘍のサイズを減少させる（および完全な除去を含みうる）か、または感染部位を治療することができる。本発明の化合物は、増殖部位または感染部位に直接適用することができる。好ましくは、化合物は、軟膏、クリーム、ローション、溶液、チンキ、または同種のものなどの製剤で増殖部位または感染部位に適用される。皮膚の病変への薬理学的物質の送達のための薬物送達システムは、米国特許第５，１６７，６４９号中で記述されたようなものも使用することができる。
【００３５】
有用な固体担体は、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ、および同種のものなどの微粉固体を含む。有用な液体担体は、水、アルコールもしくはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドを含み、化合物は任意で非毒性界面活性剤の補助によって、効果的なレベルで溶解または分散させることができる。香料および追加の抗生物質のような補助剤を追加して、規定の使用のための特性を最適化することができる。結果として生ずる液体組成物は、吸収性パッドから適用するか、救急絆および他の包帯を使用して浸透させるか、例えばポンプタイプ噴霧器またはエアゾール噴霧器を使用して罹患した領域上にスプレーすることができる。
【００３６】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステルなどの増粘剤、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾鉱物材もまた、液体担体と共に使用して、使用者の皮膚への直接的な適用のために、塗布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸、および同種のものを形成することができる。皮膚へ化合物を送達するために使用できる有用な皮膚科学的組成物の例は、米国特許第４，６０８，３９２号；米国特許第４，９９２，４７８号；米国特許第４，５５９，１５７号；および米国特許第４，８２０，５０８号で開示される。
【００３７】
本発明の化合物および医薬組成物の有用な投与量は、インビトロの活性と動物モデルにおけるインビボの活性との比較によって決定することができる。マウス、および他の動物、ヒトに対する有効量の推定のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号を参照。
【００３８】
本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本発明の化合物を含む医薬組成物にも関する。経口投与、局所投与または非経口投与に適合した、化合物の量を含む医薬組成物は、本発明の好ましい実施形態を構成する。本発明の文脈中で患者（特にヒト）に投与される用量は、適当な期間枠にわたって患者において治療効果を達成するのに十分であり、致死毒性がなく、許容されるレベル以上の副作用または病的状態を好ましくは引き起こさないものであるべきである。当業者は、病理学的状態の重症度およびステージに加えて、被験体の条件（健康）、被験体の体重、もしあれば併用療法の種類、処理の頻度、治療係数を含む様々な因子に、投与量が依存することを認識するだろう。
【００３９】
本発明は、式Ｉの化合物、またはその塩もしくは類似体の有効量と細胞を接触させることを含む、Ａｋｔタンパク質の発現が上昇されるかまたは構成的に活性のある、癌細胞もしくは腫瘍細胞または他の細胞の生存または増殖を阻害するかまたは殺傷する方法にも関する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。１つの実施形態において、細胞はヒト細胞または他の哺乳類細胞である。本方法を使用して阻害または殺傷することができる癌細胞は、転移性の性質の細胞を含んでいる。したがって、癌細胞または腫瘍細胞の転移の阻害もまた本発明によって検討される。本方法はインビトロまたはインビボで実行することができる。
【００４０】
本発明は、式Ｉの化合物、またはその塩もしくは類似体の有効量を人または動物に投与することを含む、人または動物における癌または腫瘍などの腫瘍学的障害を治療する方法にも関する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される式を有する。１つの実施形態において、本発明の化合物または組成物の有効量は、腫瘍学的障害を有し、その治療を必要とする患者に投与される。阻害剤は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法の前か、それらの後か、またはそれらと併用して、投与することができる。本発明の方法は、腫瘍学的障害の治療を必要としているか、または必要としうる患者の同定を任意で含むことができる。本発明の方法を使用する治療を必要とする患者は、医学または獣医学の当業者に公知の標準的技術を必要に応じて使用して同定することができる。１つの実施形態において、患者は、霊長類（サル、チンパンジー、類人猿など）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタもしくはウマ、または腫瘍学的障害がある他の動物などの、ヒトまたは他の哺乳類でありえる。患者への投与のための本発明の化合物の投与および製剤化のための手段は、当技術分野において公知であり、それらの実施例は本明細書において記述される。本発明の範囲内の腫瘍学的障害は、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）および脳の癌および／または腫瘍を含むが、これらに限定されない。本発明による治療のために検討される具体的な癌は、癌腫、カポジ肉腫、黒色腫、中皮腫軟部組織肉腫、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および他のもの）、およびリンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、および多発性骨髄腫を含む。
【００４１】
腫瘍学的障害の治療のために、本発明によって検討される化合物および組成物は、他の抗腫瘍性もしくは抗癌性の薬剤もしくは物質（例えば化学療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤など）および／または放射線療法および／または腫瘍を除去する外科的治療の前か、それらの後か、またはそれらと組み合わせて、治療を必要とする患者に投与することができる。例えば、本発明の化合物および組成物は、タキソールまたはビンブラスチンなどの有糸分裂阻害剤、シクロホスアミドまたはイフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシルまたはヒドロキシウレアなどの抗代謝剤、アドリアマイシンまたはブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレーター、エトポシドまたはカンプトテシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、アンジオスタチンなどの抗血管新生剤、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、および／または例えばグリーベック（ノバルティスファーマ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社）およびハーセプチン（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）などのそれぞれ他の抗癌薬物または抗体により、患者が、治療される予定か、または治療されているか、または治療されてきた、癌治療法において使用することができる。これらの他の物質または放射線治療は、本発明の化合物と同様の、または異なる回数で与えることができる。本発明の範囲内で検討される他の化学療法剤の例は、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン（tioguanine/thioguanine）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンを含むが、これらに限定されない。例示された実施形態において、化学療法剤はメルファランである。本発明の範囲内で検討された免疫療法剤の例は、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、トラスツザマブ（ｔｒａｓｔｕｚａｍａｂ）（ハーセプチン）を含むが、これらに限定されない。本発明は、化学療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤、または放射線療法の投与の前か、それらの後か、および／またはそれらと組み合わせて、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、腫瘍学的障害を治療する方法にも関する。
【００４２】
本発明は、本発明の化合物または組成物の有効量と細胞を接触させることによって、細胞中のＡｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する方法にも関する。１つの実施形態において、化合物は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２および／またはＡＫＴ３タンパク質に結合し、それらの活性を阻害する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。１つの実施形態において、細胞はヒト細胞または哺乳類細胞であり、異常な増殖、生存、移動または分化を示す癌細胞もしくは腫瘍細胞または他の細胞になりえる。１つの実施形態において、細胞は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３などのＡｋｔタンパク質を、構成的に発現するか、または上昇レベルもしくは異常レベルで発現する。
【００４３】
本発明は、本発明の化合物または組成物の治療的有効量が人または動物に投与される、細胞中のＡｋｔタンパク質の構成的発現、異常な発現、または上昇した発現に関連する障害を有する人または動物を治療する方法にも関する。障害は、例えば、異常な細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化によって特徴づけられるものでありえる。１つの実施形態において、化合物は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３タンパク質に結合し、それらの活性を阻害する。具体的な実施形態において、化合物は式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。
【００４４】
治療される障害または疾患の条件に依存して、適切な用量は標的細胞の増加または増殖を減少させる量でありえる。癌の情況において、適切な用量は、悪性腫瘍などの癌組織において、所望反応を達成することが公知である活性薬剤の濃度をもたらすものである。好ましい投与量は、管理し難い副作用なしに癌細胞増殖の最大の阻害をもたらす量である。当業者によって決定することができるように、化合物の投与は継続的、または異なるインターバルでありえる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、所望療法の治療のためのかかる投薬量の投与を提供するために、本発明の医薬組成物は、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、１つまたは複数の化合物の総重量で、約０．１％〜４５％、特に１〜１５％の間で含まれうる。例示的に、投与される活性のある成分の投与量レベルは、静脈内、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；皮下、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；筋肉内、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；経口的、０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、および好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ；鼻腔内滴下、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；ならびにエアロゾル、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇの動物（身体）重量でありえる。
【００４６】
本発明は、１つまたは複数の容器中に、本発明の１つまたは複数の化合物、または本発明の化合物を含む組成物、または前述のものの類似体もしくは塩を含むキットにも関する。１つの実施形態において、キットは、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは類似体を含む。本発明のキットは、薬学的に許容される担体および／または希釈剤を任意で含むことができる。１つの実施形態において、本発明のキットは１つまたは複数の他の成分または添加物または本明細書において記述されるような補助剤を含む。他の実施形態において、キットは、本明細書において記述される薬剤などの１つまたは複数の抗癌剤を含む。１つの実施形態において、本発明のキットは、キットの化合物または組成物を投与する方法について記述する説明書または包装材料を含む。キットの容器は、任意の適切な材料（例えばガラス、プラスチック、金属など）、および任意の適切なサイズ、形状、または立体配置でありえる。１つの実施形態において、本発明の化合物は、タブレット、ピル、または粉末の形態などの固形としてキット中に提供される。他の実施形態において、本発明の化合物は液体または溶液としてキット中に提供される。１つの実施形態において、キットは、液体または溶液の形態で本発明の化合物を含むアンプルまたはシリンジを含む。
【００４７】
開示された方法から利益を得る哺乳類種は、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サルなどの霊長類；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムポットベリーピッグ、ウサギ、およびフェレットなどの飼育された動物（例えばペット）；ウシ、水牛、バイソン、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの飼育された家畜；クマ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、カバ、サイ、キリン、アンテロープ、ナマケモノ、カモシカ、シマウマ、ウィルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、コモリネズミ、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、イルカおよびクジラなどの典型的には動物園において見出される外来動物を含むが、これらに限定されない。開示された方法から利益を得てもよい他の種は魚類、両生類、鳥および爬虫類を含む。本明細書において使用されるように、「患者」、「被験体」という用語は同じ意味で使用され、かかるヒト種および非ヒト種を含むように意図される。同様に、本発明のインビトロの方法は、かかるヒト種および非ヒト種の細胞に対して実行することができる。
材料および方法
【００４８】
細胞株およびＮＣＩ多様性セット。この研究において使用されるすべて細胞株は、ＡＴＣＣから購入したか、または事前に記載されたものである。（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０００； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）。ＮＣＩ構造多様性セットは、およそ１４０，０００の化合物のＮＣＩ薬物寄託場所から選択された１，９９２の化合物のライブラリーである。これらの多様性セット化合物の選択、構造および活性に関する詳細なデーターは、ＮＣＩの開発的な治療プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）ウェブサイトで見出すことができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１）。
【００４９】
Ａｋｔにより形質転換した細胞の増殖阻害についてのスクリーニング。ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＬＸＳＮベクターによりトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３対照細胞（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）を、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングした。５μＭのＮＣＩ多様性セット化合物による処理に後続して、細胞増殖は、セルタイター９６ワン・ソリューション・セル・プロリファレーション（ＣｅｌｌＴｉｅｒ ９６ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）により検出された。ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害するが、ＬＸＳＮによりトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は阻害しない化合物をＡｋｔ阻害剤の候補と見なし、詳しい解析を行なった。
【００５０】
インビトロのプロテインキナーゼ、細胞生存およびアポトーシス分析。以前に記述されたように、インビトロのキナーゼを実行した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０００）。細胞生存はＭＴＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）により分析した。アポトーシスは、アネキシンＶ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）により検出し、製造者の説明書に従って実行した。組換えのＡｋｔおよびＰＤＫ１は、アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から購入した。
【００５１】
ヌードマウス腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍活性。腫瘍細胞を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、以前に報告されるように８週齢のメスヌードマウスの右脇腹および左脇腹（２×１０6細胞／脇腹）に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。腫瘍が約１００〜１５０ ｍｍ3に達した時に、動物は無作為化され、媒質または薬物を毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）投薬した。対照動物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２０％）媒質を投与し、処理動物に２０％ＤＭＳＯ中のＡＰＩ−１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。
【００５２】
本明細書において参照または引用したすべての特許、特許出願、仮出願、および出版物は、すべて図および表を含むその全体を参照することにより、この明細書の明確な教示に矛盾しない程度まで組み入れられる。
【００５３】
以下は本発明の実行のための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定として解釈されるべきでない。特に断りのない限り、すべてのパーセンテージは重量により、すべての溶媒混合比率は体積による。
【実施例１】
【００５４】
ＮＣＩ多様性セットのスクリーニングによる低分子Ａｋｔ／ＰＫＢ経路阻害剤−１（ＡＰＩ−１）の同定
【００５５】
Ａｋｔ経路の異常な活性化がすべてのヒト悪性腫瘍のほとんど５０％において起こり、Ａｋｔの阻害が細胞増殖停止およびアポトーシスを誘導するという事実のために、抗癌薬を見出だすために低分子Ａｋｔ阻害剤を開発することは産業および学界からの関心を引いた（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｇｒａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００６）。何十ものＡｋｔ阻害剤が報告されているが、それらの多くはインビボでの抗腫瘍活性を欠く。脂質ベースのＡｋｔ阻害剤（ペリホシン）は第Ｉ相および第ＩＩ相の研究において報告された（Ｖａｎ Ｕｍｍｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ２００６）。しかしながら、どちらの研究においてもＡｋｔの修飾は査定されなかった。膵臓癌におけるペリホシンの最近の第ＩＩ相研究は、第一ステージの間の許容できない有害事象を受けて終結した（Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ． ２００７）。それにもかかわらず、最小の副作用を備え他のキナーゼ活性の阻害を欠く強力な選択的Ａｋｔ阻害剤を開発する必要がある。Ａｋｔの低分子阻害剤を同定するために、我々は、「材料および方法」中で記述されているように、ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害が可能であるが、空ベクターＬＸＳＮによりトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害が可能でない薬剤について、ＮＣＩからの１，９９２化合物の化学的ライブラリー（ＮＣＩ多様性セット）を評価した。三重実験は、３２の化合物がＡＫＴ２により形質転換した細胞のみの増殖を阻害したことを示した。我々は、以前にそれらのうちの１つ（インビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を有する全Ａｋｔ阻害剤であり、現在第Ｉ相臨床試験中である、ＡＰＩ−２／トリシリビンと命名された）の特性を評価した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【００５６】
本研究において、我々は、Ａｋｔ／ＰＫＢ阻害剤−１（ＡＰＩ−１）が生細胞におけるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化レベルを特異的に阻害することを示した。図１ＡはＡＰＩ−１（ＮＳＣ１７７２２３）の化学構造を示し、それは化学名を有しておらず、ＮＣＩ６０細胞株において検査されていない（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。ＡＰＩ−１が、形質転換していない親細胞以上にＡＫＴ２形質転換細胞を選択的に阻害したので、ＡＰＩ−１がＡＫＴ２キナーゼの阻害剤であるか、Ａｋｔの他の２つのメンバーも阻害するかどうかを最初に調べた。ＨＡのタグを付加した野生型のＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３により、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。一晩の血清飢餓に後続して、細胞はＥＧＦ刺激の前に６０分間ＡＰＩ−１により処理し、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物はインビトロキナーゼ分析を行なった。図１Ｂは、ＡＰＩ−１がＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３のインスリン誘導性キナーゼ活性を抑制したことを示す。ＡＰＩ−１が生細胞においてＡｋｔを阻害するかどうかを次に調べる。ＯＶＣＡＲ３細胞（リン酸化Ａｋｔを上昇したレベルで発現する）を、異なる用量のＡＰＩ−１により３時間処理した。抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体によるイムノブロット解析から、ＡＰＩ−１がＡｋｔのリン酸化レベルおよびＩＣ50を効率的に減少させるのは、およそ０．８μＭであることが示された。しかしながら、全体のＡｋｔレベルは変化しなかった（図１Ｃ）。さらに、ＡＰＩ−１が直接インビトロのＡｋｔキナーゼ活性を阻害するかどうかを調べた。構成的に活性のあるＡｋｔ組換えタンパク質を、異なる量のＡＰＩ−１、および陽性対照として化合物Ｅ（Ａｋｔを含む全キナーゼのＡＴＰ競合阻害剤）を含むキナーゼバッファー中で、Ａｋｔ／ＳＧＫ基質ペプチド（アップステート社）と共にインキュベートした。三重実験から、ＡＰＩ−１はＡｋｔキナーゼ活性に対する効果がないことが示され（図１Ｄ）、ＡＰＩ−１が直接インビトロでＡｋｔを阻害せず、ＡＰＩ−１がＡＴＰとしても、また基質競合物としても機能しないことが示唆された。
【実施例２】
【００５７】
ＡＰＩ−１はＡｋｔの上流の活性化因子を阻害しない
【００５８】
Ａｋｔは、ＰＴＥＮにより負に調節されるＰＩ３Ｋ依存的様式を介して、細胞外刺激および細胞内シグナル分子によって活性化される。ＰＩ３Ｋの活性化またはＰＴＥＮの変異は、Ａｋｔキナーゼ活性の誘導を導くＰＤＫ１を活性化するだろう。したがって、ＡｋｔのＡＰＩ−１阻害は、ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１などのＡｋｔの１つまたは複数の標的上流分子に由来しうる。この目的のために、ＡＰＩ−１がＰＩ３Ｋおよび／またはＰＤＫ１を阻害するかどうかを次に調べた。ＨＥＫ２９３細胞は血清飢餓を行い、次にＥＧＦ刺激の前にＡＰＩ−１またはＰＩ３Ｋ阻害剤（ワートマニン）により１時間処理した。ＰＩ３Ｋを抗ｐ１１０α抗体により免疫沈降した。免疫沈降物は、基質としてＰＩ−４−Ｐを使用してインビトロのＰＩ３Ｋキナーゼ分析を行なった。図２Ａ中で示されるように、ＥＧＦにより誘導されたＰＩ３Ｋ活性はワートマニンによって阻害されたが、ＡＰＩ−１によって阻害されなかった。ＡＰＩ−１の効果を評価するために、リードアウト（アップステート・バイオテクノロジー社）としてＳＧＫキナーゼを使用して、ＰＤＫ１によりインビトロのＰＤＫ１キナーゼ分析を実行した。ＰＤＫ１阻害剤ＵＣＮ−０１とは異なり（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、ＡＰＩ−１はインビトロのＰＤＫ１キナーゼ活性に効果がなかった（図２Ｂ）。生細胞におけるＰＤＫ１活性化に対するＡＰＩ−１の効果をさらに評価するために、ＯＶＣＡＲ３細胞のＡＰＩ−１処理に後いて、ＰＤＫ１−Ｓｅｒ２４１（自己リン酸化され、活性のために重要な残基（Ｃａｓａｍａｙｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９９））のリン酸化レベルを調べた。図２Ｄは、ＰＤＫ１のリン酸化レベルがＡＰＩ−１によって阻害されなかったことを示す。
【実施例３】
【００５９】
ＡＰＩ−１は、ＡＧＣキナーゼメンバーのＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳＧＫ、ならびに他のシグナリング分子のＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＳＴＡＴ３以上にＡｋｔに高度に選択的である。
【００６０】
Ａｋｔは、ＡＧＣ（ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣ）キナーゼファミリーに属し、このファミリーは、ＰＫＡ、ＰＫＣ、血清およびグルココルチコイド誘導性キナーゼ（ＳＧＫ）、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ、ｐ７０S6K、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ、ならびにＰＫＣ関連キナーゼもまた含む。ＡＧＣキナーゼファミリーの中で、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳＧＫのタンパク質構造は、他のメンバーよりもＡｋｔキナーゼに非常に近い。したがって、次にこれらの３つのキナーゼの酵素活性に対するＡＰＩ−１の効果を検討した。インビトロのＰＫＡキナーゼ分析およびＳＧＫキナーゼ分析は、キナーゼバッファー中のケンプチドまたはＡｋｔ／ＳＧＫ基質ペプチドおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰの追加によるキナーゼ分析の開始の前の３０分間、組換えＰＫＡタンパク質または組換えＳＧＫタンパク質との、示された用量のＡＰＩ−１または特異的阻害剤の前インキュベーションによって実行された。インビトロキナーゼ分析は、ＰＫＡおよびＳＧＫのキナーゼ活性がＰＫＡＩおよび化合物Ｅによってそれぞれ阻害されるが、ＡＰＩ−１にはそれらの活性に対する効果ないことを示した（図２Ｃおよび２Ｅ）。生細胞におけるＰＫＡおよびＰＫＣαの活性化に対するＡＰＩ−１の効果をさらに評価するために、ＯＶＣＡＲ３細胞は示された用量のＡＰＩ−１またはＰＫＡおよびＰＫＣの特異的阻害剤により処理され、ＰＫＡおよびＰＫＣのリン酸化レベルがＡＰＩ−１によって阻害されないことがイムノブロット解析により示された（図２Ｄ）。さらに、ＨＥＫ２９３細胞をＨＡのタグを付加したＳＧＫによりトランスフェクションした。インビトロキナーゼ分析から、ＥＧＦに誘導されたＳＧＫキナーゼ活性はワートマニンによって減少されるが、ＡＰＩ−１によって減少されないことが示された（図２Ｆ）。
【００６１】
ＡＰＩ−１が他の腫瘍形成性の生存経路に効果があるかどうか決定するために、ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１（１０ａＭ）により異なる時間処理し、市販で入手可能な抗リン酸化抗体によりイムノブロットした。ＡＰＩ−１処理後には、Ｓｔａｔ３、ＪＮＫ、ｐ３８およびＥｒｋ１／２のリン酸化レベルの検出可能な変化は観察されなかった（図２Ｇ）。これらのデーターは、ＡＰＩ−１がＡｋｔ経路を特異的に阻害できることを示す。
【実施例４】
【００６２】
ＡＰＩ−１は構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害する。
【００６３】
ＡＰＩ−１はＡｋｔをインビトロで直接阻害することができなかったが、ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１に対する影響なしに生細胞におけるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化を停止したので、この化合物がＡＴＰ結合部位ではなくＡｋｔタンパク質と相互作用して、ＰＤＫ１およびＰＤＫ２によるＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３のリン酸化を防止することが推測された。これが真であるならば、構成的に活性のあるＡｋｔの活性化がまだＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３のリン酸化を必要とするので、ＡＰＩ−１は構成的に活性のあるＡｋｔの活性化もまた阻害すべきである（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。この仮説を検証するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡのタグを付加したＭｙｒ−Ａｋｔ１、−Ａｋｔ２および−Ａｋｔ１Ｅ４０Ｋによりトランスフェクションした。一晩の血清飢餓に後続して、細胞をＡＰＩ−１ありまたはＡＰＩなしで処理した。Ｍｙｒ−Ａｋｔ１、Ｍｙｒ−Ａｋｔ２およびＡｋｔ１−Ｅ４０Ｋを、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物に、インビトロキナーゼ分析および抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体によるイムノブロット解析を行なった。図３Ａは、Ｍｙｒ−Ａｋｔ１、Ｍｙｒ−Ａｋｔ２およびＡｋｔ１−Ｅ４０Ｋのリン酸化レベルだけでなく、インビトロのＡｋｔキナーゼ活性もＡＰＩ−１によって阻害されたことを示し、ＡＰＩ−１がＡｋｔ分子に結合して細胞内での活性化を阻害するという概念を支援する。
【００６４】
Ａｋｔは多数のタンパク質のリン酸化を介してその細胞機能を発揮する（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。次にＡＰＩ−１がＡｋｔの下流の標的を阻害するかどうかを調べた。ＧＳＫ３βおよびｍＴＯＲは主要なＡｋｔ標的のうちの２つであるので、ＧＳＫβおよびＳ６（ｐ７０S6Kの基質）のリン酸化レベルでＡＰＩ−１の影響を評価した。ＡＰＩ−１によるＯＶＣＡＲ３の処理に続くイムノブロット解析から、ＡＰＩ−１がそれらのリン酸化を非常に阻害することが明らかになった（図３Ｂ）。
【実施例５】
【００６５】
ＡＰＩ−１は細胞増殖を抑制し、Ａｋｔを過剰発現または活性化するヒト癌細胞株においてアポトーシスを誘導する
【００６６】
Ａｋｔは主要な増殖促進および生存促進の経路である。上昇したＡｋｔキナーゼを有する癌細胞は化学療法薬に誘導された細胞増殖停止および細胞死に対してより高い耐性を示すが、Ａｋｔのノックダウンは異なるアポトーシス促進刺激によって誘導されるアポトーシスに感受性を持つ（Ｓｏｌｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｊｅｔｚｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。ＡＰＩ−１が選択的にＡｋｔ経路を阻害する能力は、Ａｋｔの異常な発現／活性化を有するそれらの腫瘍細胞において、優先的に増殖を阻害することおよび／またはアポトーシスを誘導することを示唆する。これを検査するために、構成的に活性のあるＡｋｔを発現する細胞（Ａｋｔの過剰発現（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８、ＭＣＦ７およびＰＡＮＣ１）またはＰＴＥＮ遺伝子の変異（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ）によって引き起こされた）、および行なってない細胞（ＯＶＣＡＲ５、ＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ、ＤＵ−１４５およびＣＯＬＯ３５７）の処理にＡＰＩ−１を使用した。イムノブロット解析から、上昇したＡｋｔを発現する細胞においてＡＰＩ−１によりＡｋｔのリン酸化レベルが有意に阻害されるが、リン酸化Ａｋｔは低レベルのＡｋｔを示す細胞株においてもまたＡＰＩ−１により減少されることが示された（図４Ａおよびデーター不掲載）。しかしながら、ＡＰＩ−１はＰＡＲＰ切断を誘導し、低レベルのＡｋｔを有する細胞と比較して、Ａｋｔを過剰発現／活性化する細胞において、はるかに高い程度で細胞増殖を阻害する（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）。ＡＰＩ−１処理は、Ａｋｔを過剰発現／活性化する細胞株のＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡ８、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ７においておよそ５０〜７０％で細胞増殖を阻害したが、ＯＶＣＡＲ５およびＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ細胞において約１０〜３０％のみ阻害した（図４Ｂおよび４Ｃ）。さらに、ＡＰＩ−１は、ＯＶＡＣＡＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８においてそれぞれ９倍および４．６倍でアポトーシスを誘導するが、ＡＰＩ−１−処理したＯＶＣＡＲ５およびＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ細胞においてはるかに少ないアポトーシスが観察された（図４Ｄ〜４Ｇ）。したがって、ＡＰＩ−１は細胞増殖を阻害し、異常なＡｋｔを発現する細胞においてアポトーシスを優先的に誘導する。
【実施例６】
【００６７】
ＡＰＩ−１は、Ａｋｔを過剰発現するヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害する
【００６８】
Ａｋｔの異常な活性化および過剰発現がヒトの卵巣癌および膵臓癌で頻繁に検出されること（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２）、およびＡｋｔのアンチセンスが癌細胞の増殖および浸潤を有意に阻害すること（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９６）は、以前に示されている。さらに、ＰＩ３Ｋ、ＨＳＰ７０、Ｓｒｃおよびファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤によるＡｋｔ経路の阻害は、細胞増殖の停止およびアポトーシスの誘導をもたらした（Ｓｏｌｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２００３）。ＡＰＩ−１は、上昇したＡｋｔレベルを有する癌細胞においてＡｋｔシグナリングを阻害しアポトーシスおよび細胞増殖停止を誘導するので（図４Ａ〜４Ｇ）、ヌードマウスにおいて、上昇したＡｋｔレベルを有する腫瘍の増殖は、低レベルのＡｋｔを有する腫瘍よりも、ＡＰＩ−１に対してより感受性であるべきだと推論された。この目的のために、Ａｋｔを過剰発現する細胞（ＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ−１）をマウスの左脇腹に皮下移植し、低レベルのＡｋｔを発現する細胞株（ＯＶＣＡＲ５およびＣＯＬＯ３５７）を右脇腹に皮下移植した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、動物を無作為化し、媒質またはＡＰＩ−１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかにより腹腔内処理した。図５Ａ〜５Ｊで示されるように、媒質対照により処理したＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ１の腫瘍は増殖し続けた。ＡＰＩ−１は、ＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ１腫瘍増殖をそれぞれ７０％および５０％阻害した（図５Ｃ〜５Ｆおよび５Ｇ〜５Ｊ）。これとは対照的に、ＡＰＩ−１は、ヌードマウスにおけるＯＶＣＡＲ５およびＣＯＬＯ３５７の細胞の増殖に対して効果がほとんどなかった（図５Ａ〜５Ｊ）。ＡＰＩ−１は、用量１０ｍｇ／ｋｇ／日で、マウスの血糖値、体重、活動性および食物摂取量に対して影響はなかった（データー不掲載）。処理された腫瘍サンプルにおいて、Ａｋｔのリン酸化レベルはＡＰＩ−１によって約７０％減少されたが、全Ａｋｔ含有量の変化はなかった（図５Ｋ〜５Ｌ）。総合すれば、これらの結果は、ＡＰＩ−１が上昇したＡｋｔレベルを有する腫瘍の増殖を選択的に阻害することを示す。
【００６９】
本明細書において記述された実施例および実施形態が説明の目的のみのためのものあり、それらに照らして様々な修飾または変更が当業者に対して示唆され、本出願の趣旨および範囲、および添付された請求項の範囲内に含まれるべきであることが理解される。さらに、本明細書において開示された任意の発明またはその実施形態の任意の要素または限定は、任意のおよび／もしくは他のすべての要素もしくは限定（個別にまたは任意の組合せで）、または本明細書において開示された他の発明またはその実施形態と組み合わせることができ、すべてのかかる組合せは本発明の範囲でそれらに限定されずに検討される。
【００７０】
参照文献
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年７月１２日に出願された米国仮出願第６０／９４９，３６５号の利益を主張し、任意の図、表、核酸配列、アミノ酸配列および図面を含むその全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。
政府支援
【０００２】
本出願の主題は、助成金番号Ｒ０１ＣＡ１０７０７８、ＤＡＭＤ１７−０２−１−０６７１およびＷ８１ＸＷＨ−０５−１−００２１の下で、国立衛生研究所−国立癌研究所およびＡＲＭＹ／ＭＲＭＣからの研究助成金によって支援された。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
プロテインキナーゼＢとも呼ばれるＡｋｔは、セリン／スレオニンキナーゼのサブファミリーを示す。Ａｋｔは、ｖ−ａｋｔ癌遺伝子産物の細胞ホモログとして最初に記載され（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ． １９９１）、それは３つのメンバーのＡｋｔ１／ＰＫＢα、Ａｋｔ２／ＰＫＢβおよびＡｋｔ３／ＰＫＢγを有する（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１ａ； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１ｂ）。Ａｋｔの活性化は、膜輸送を仲介するプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインの完全性、ならびに活性化ループ中のＴｈｒ308、およびＳｅｒ473のリン酸化に依存する（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９９５）。ＰＩ３ Ｋによって生産されたフォスフォイノシチド（ＰｔｄＩｎｓ−３，４−Ｐ２およびＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３）は、ＡｋｔのＰＨドメインへ直接結合し、分子中のコンフォメーション変化を引き起こし、それはＡｋｔの活性化ループをＴｈｒ308でＰＤＫ１によってリン酸化することができる（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ａｋｔの完全活性化もまた、Ｃ末端の疎水性モチーフ内のＳｅｒ473のリン酸化に関連する（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。Ｔｈｒ308のリン酸化におけるＰＤＫ１の役割は十分に確立されているが、Ｓｅｒ473のリン酸化の機構は論争の的になっている。この修飾に関与する多数の候補酵素が提案され、それらはインテグリン結合キナーゼ（Ｐｅｒｓａｄ ｅｔ ａｌ． ２００１）、キナーゼＰＲＫ２の複合体中にある場合のＰＤＫ１（Ｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０００）、自己リン酸化を介してＡｋｔそれ自体（Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００）、ＤＮＡ依存性キナーゼ（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）、およびリクター（ｒｉｃｔｏｒ）−ｍＴＯＲ複合体（Ｓａｒｂａｓｓｏｙ ｅｔ ａｌ． ２００５）を含む。Ａｋｔの活性は、ヒト悪性腫瘍中で頻繁に変異している腫瘍抑制因子ＰＴＥＮによって負に調節される（Ｖａｚｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ． ２０００）。ＰＴＥＮは、ＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３をＰｔｄＩｎｓ−４，５−Ｐ２に変換することによってＰｔｄＩｎｓ−３，４，５−Ｐ３の細胞内濃度を低下させ、その結果としてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を阻害する、二重特異性タンパク質および脂質ホスファターゼをコードする（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【０００４】
Ａｋｔは多数の分子をリン酸化および／またはそれらと相互作用して、細胞の増殖、生存、移動および分化における役割を含む正常な細胞機能を発揮させる（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００１）。多くの証拠から、Ａｋｔが腫瘍発生および進行において重大な役割を持つことが実証される。さらに、Ａｋｔ経路の異常な過活性化はすべてのヒト腫瘍の最大５０％で検出され（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００１； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）、密接に化学耐性に関連する（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ． ２００２）。したがって、Ａｋｔは抗癌薬物開発のための魅力的な標的であった（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ． ２００２）。
【０００５】
過去数年において、組み合わせ化学、ハイスループットおよび仮想スクリーニング、ならびに従来の医薬品化学を介して、Ａｋｔ経路の何十もの阻害剤が同定された。Ａｋｔの脂質ベースの阻害剤は第１に開発されたものであり、ペリホシン（Ｋｏｎｄａｐａｋａ ｅｔ ａｌ． ２００３）、ＰＸ−３１６（Ｍｅｕｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ． ２００４）およびホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（Ｃａｓｔｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ． ２００４）を含み、ＡｋｔのＰＨドメインと相互作用するようにデザインされた。さらに、いくつかのＡｋｔアンタゴニストは、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングおよび合理的設計を使用して同定された。これらの阻害剤は、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセタート（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００４）、インダゾール−ピリジンＡ−４４３６５４（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ． ２００５）、アイソフォーム特異的アロステリックキナーゼ阻害剤（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ２００５）、およびトリシリビン／ＴＣＮとも呼ばれるＡｋｔ／ＰＫＢシグナリング阻害剤−２（ＡＰＩ−２）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）を含む。ＡＰＩ−２／ＴＣＮは、以前に行われた第Ｉ相および第ＩＩ相の試験において抗腫瘍活性を示す三環式ヌクレオシドであるが、肝毒性、高血糖、血小板減少および高トリグリセリド血症を含む複数の毒性によりさらなる開発は妨げられた（Ｆｅｕｎ ｅｔ ａｌ． １９９３； Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９６）。我々は、ＮＣＩ多様性セットのスクリーニングによって、ＡＰＩ−２がＡｋｔキナーゼ活性を阻害し、高Ａｋｔ活性を示すヒト癌細胞の異種移植片のアポトーシスを刺激することを以前に示した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）。この結果からこの薬物の研究に新たな関心が持たれ、より低用量でＡｋｔを阻害し、以前の関連した副作用なしに腫瘍細胞アポトーシスを誘導しうる可能性が提出される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ経路の阻害のための化合物、組成物および方法に関する。１つの実施形態において、本発明の化合物は、Ａｋｔタンパク質のキナーゼ活性および／またはリン酸化レベルを阻害する。本発明の化合物は、式Ｉで示される一般的な構造を有する。特異的実施形態において、本発明の化合物（本明細書においてＡＰＩ−１と呼ばれる）は、構造：
【化１】
を有する。
【０００７】
ＡＰＩ−１などの本発明の化合物は、異常なＡｋｔを有するヒト腫瘍細胞におけるＡｋｔシグナリングを阻害し、細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導を導く。異種移植ヌードマウスモデルにおいて、本発明の化合物は、過活性化されたＡｋｔを有する細胞における腫瘍増殖をかなり阻害するが、低レベルのＡｋｔを有する腫瘍においては阻害しない。
【０００８】
本発明は、式Ｉの化合物の有効量と細胞を接触させることを含む、Ａｋｔタンパク質の発現が上昇されるかまたは構成的に活性のある癌細胞または他の細胞を阻害または殺傷する方法にも関する。
【０００９】
本発明は、人または動物に対して式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、人または動物中の癌または腫瘍を治療する方法にも関する。
【００１０】
セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢ経路は、ヒト癌において頻繁に過活性化され、細胞外および細胞内の腫瘍形成シグナルの変換のための基本的な節点として機能し、したがってそれは分子治療のための標的を示す。国立癌研究所の多様性セットのスクリーニングによって、低分子のＡｋｔ経路阻害剤のＡＰＩ（Ａｋｔ／ＰＫＢシグナリング阻害剤）−１が同定された。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔファミリーの３つのメンバーのキナーゼ活性およびリン酸化レベルを阻害する。しかしながら、それは上流活性化因子（ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１）の活性には効果がなかった。さらに、構成的に活性のあるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化レベルは、細胞培養において主としてＡＰＩ−１によって阻害されるが、それはＡｋｔキナーゼ活性にはインビトロで効果がなかった。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔについて高度に選択的であり、ＰＫＣ、ＳＧＫ、ＰＫＡ、ＳＴＡＴ３、Ｅｒｋ−１／２、またはＪＮＫの活性化を阻害しない。ＡＰＩ−１によるＡｋｔの阻害は、構成的に活性化されたＡｋｔを保有するヒト癌細胞において、細胞増殖停止およびアポトーシスの誘導をもたらした。重要なことには、ＡＰＩ−１は、Ａｋｔが上昇したヒト癌細胞のヌードマウスにおいて腫瘍増殖を選択的に阻害したが、Ａｋｔが上昇しないこれらの癌細胞の増殖は阻害しない。これらのデーターは、ＡＰＩ−１がインビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を有するＡｋｔ経路阻害剤であり、過活性化Ａｋｔを発現する癌患者のための可能性のある抗癌剤でありえることを示唆する。
【００１１】
Ａｋｔは、癌細胞の生存、増殖および腫瘍進行を調節する主要な経路である。上昇したレベルのＡｋｔキナーゼは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（グリーベック）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ（ハークプチン（Ｈｅｒｃｐｔｉｎ））、およびｍＴＯＲ（ラパマイシン）の細胞毒性化学療法薬および低分子阻害剤を含む様々な癌治療法に対する耐性に寄与することがよく報告されていた。Ａｋｔのブロックは、過活性化Ａｋｔを有する癌細胞において腫瘍増殖を阻害し、化学療法および他の標的化された治療に対して癌細胞をより感受性にする。他の抗腫瘍薬物とのＡＰＩ−１の組合せはより強力な抗腫瘍効果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔ阻害剤の候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１の化学構造を示す。
【図１Ｂ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１がＡｋｔの３つのメンバーを阻害することを示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−Ａｋｔ１、ＨＡ−ＡＫＴ２およびＨＡ−ＡＫＴ３によりトランスフェクションし、ＥＧＦ刺激前にＡＰＩ−１（１０μＭ）により処理し、細胞を溶解し、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物はインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。下部パネルは、トランスフェクションしたＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３の発現を示す、抗ＨＡ抗体により検出したウエスタンブロットである。
【図１Ｃ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１が、ＯＶＣＡＲ３細胞（それらは過活性化Ａｋｔを発現する）においてＡｋｔのリン酸化レベルを阻害することを示す図示である。細胞を示された濃度でＡＰＩ−１により２時間処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体によるイムノブロット解析を行なった（上部パネル）。下部パネルは全Ａｋｔの発現を示す。
【図１Ｄ】ＮＣＩ多様性セットからのＡｋｔインヒビターの候補としてのＡＰＩ−１の同定の図示である。ＡＰＩ−１がインビトロでＡｋｔを阻害しないことを示した図示である。示された量のＡＰＩ−１を含むキナーゼバッファー中の構成的に活性のあるＡｋｔ組換えタンパク質のインビトロキナーゼ分析。化合物Ｅ（複数のキナーゼ阻害剤のＡＴＰ競合物）を陽性対照として使用した。実験は３回反復した。
【図２Ａ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロＰＩ３Ｋキナーゼ分析を示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞は血清飢餓を行い、ＥＧＦ刺激前に３０分間ＡＰＩ−１（１０μＭ）またはワートマニン（１ｎＭ）により処理した。細胞を溶解し、抗ｐ１１０α抗体により免疫沈降した。免疫沈降物は、基質としてＰＩ−４−Ｐを使用する、インビトロキナーゼ分析を行なった。
【図２Ｂ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＰＤＫ１活性化に対するＡＰＩ−１の効果を示す図示である。インビトロキナーゼ分析は、示された化合物の存在下で製造者説明書に従って、ＰＤＫ１キナーゼキット（アップステート・バイオテクノロジー社 （Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ） ）により実行された。
【図２Ｃ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロのＰＫＡキナーゼ分析を示す図示である。組換えＰＫＡを、示された阻害剤（ＡＰＩ−１またはＰＫＡＩ）および基質ケンプチドを含むＡＤＢバッファー（アップステート・バイオテクノロジー社）中でインキュベートした。キナーゼ活性を定量した。
【図２Ｄ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。生細胞における、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＰＤＫのキナーゼ活性に対するＡＰＩ−１の効果を示す図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１の示された濃度により１時間処理した。細胞を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図２Ｅ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。インビトロＳＧＫキナーゼ分析を示す図示である。組換えＳＧＫタンパク質をＡＰＩ−１または化合物Ｅと共にインキュベートした。キナーゼ分析は、ＳＧＫ基質ペプチドおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰの追加によって開始された。キナーゼ活性を定量した。
【図２Ｆ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＨＥＫ２９３細胞をＨＡ−ＳＧＫによりトランスフェクションし、ＥＧＦ刺激前にＡＰＩ−１またはワートマニンにより処理した場合の結果を示す図示である。インビトロキナーゼは、基質としてヒストン−Ｈ２Ｂを使用して、ＨＡ−ＳＧＫ免疫沈降物により実行された。
【図２Ｇ】ＡＰＩ−１が、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、およびＡＧＣキナーゼファミリーの非常によく関連したメンバーを阻害しないことを示す図示である。ＡＰＩ−１が、Ｅｒｋ、ｐ３８、ＪＮＫおよびＳｔａｔ３のリン酸化を阻害しないことを示す図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１により３時間処理し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図３Ａ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＰＩ−１が構成的に活性のあるＡｋｔを阻害することを実証する図示である。ＨＥＫ２９３細胞を、示されたＨＡ−ｍｙｒ−Ａｋｔ１、ＨＡ−Ａｋｔ１−Ｅ４０ＫおよびＨＡ−ｍｙｒ−Ａｋｔ２によりトランスフェクションした。ＡＰＩ−１による１時間の処理に後続して、細胞を溶解して、抗ＨＡ抗体により免疫沈降させた。免疫沈降物に、インビトロキナーゼ分析（上部パネル）、および示された抗体によるイムノブロット（中央および下部のパネル）を行なった。
【図３Ｂ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＰＩ−１がＡｋｔの下流の標的のリン酸化を阻害することを実証する図示である。ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１（１０μＭ）により示された時間処理し、示された抗体によりイムノブロットした。ＡＰＩ−１は、Ａｋｔおよびその下流の標的（ＧＳＫ３βおよびＳ６タンパク質）のリン酸化レベルを有意に低下させる。
【図３Ｃ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＫＴ−ＳＩ１は、Ａｋｔの下流の標的のリン酸化を阻害した。
【図３Ｄ】ＡＰＩ−１が、構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害することを実証する図示である。ＡＫＴ−ＳＩ１は、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２複合体を妨害しなかった。
【図４Ａ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。ＡＰＩ−１による処理に後続する結果を示すウエスタンブロットであり、Ａｋｔのリン酸化レベルおよびＰＡＲＰ切断は、示されたヒト癌細胞株において抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体および切断ＰＡＲＰ抗体により検出された（上部および中央のパネル）。ブロットは抗アクチン抗体により再プロービングした（下部パネル）。
【図４Ｂ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。示された細胞株を異なる用量のＡＰＩ−１により２４時間処理し、次にＭＴＴ分析により解析した細胞増殖分析である。
【図４Ｃ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。示された細胞株を異なる用量のＡＰＩ−１により２４時間処理し、次にＭＴＴ分析により解析した細胞増殖分析である。
【図４Ｄ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）によって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｅ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｆ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図４Ｇ】ＡＰＩ−１が、上昇したＡｋｔのヒト癌細胞においてＡｋｔ活性および細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することを示す図示である。細胞をＡＰＩ−１により処理し、アネキシンＶおよびＰＩにより染色し、ファックスキャンによって解析したアポトーシス解析を示す。
【図５Ａ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｂ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｃ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｄ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｅ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｆ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。対照群の写真（図５Ａ）およびＡＰＩ−１−処理した群の写真（図５Ｂ）および関連したグラフ（図５Ｃ〜５Ｆ）である。右側に低レベルのＡｋｔ細胞および左側に上昇したレベルのＡｋｔ細胞で、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、「材料および方法」において記述されているように、媒質または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＡＰＩ−１のいずれかにより動物を処理した。上昇したレベルのＡｋｔを発現するＰＡＮＣ１／ＯＶＣＡＲ３（それぞれ図５Ｅおよび５Ｃ）、および低レベルのＡｋｔを示すＣＯＬＯ３５７／ＯＶＣＡＲ５（それぞれ図５Ｆおよび５Ｄ）を有するマウスの表示であり、異種移植はＡＰＩ−１または媒質（Ａ）により処理された。パネルＢは、１０マウス／群による腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｇ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｈ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｉ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｊ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。実験の終了時の腫瘍サイズ（左側）および重量（右側）の例を示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、ＡＰＩ−１は、ＰＡＮＣ１およびＯＶＣＡＲ３の異種移植の腫瘍重量を有意に減少させた（＊Ｐ＝０．０２）。
【図５Ｋ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。ＡＰＩ−１がインビボでＡｋｔリン酸化を阻害することを実証する。ＡＰＩ−１処理された腫瘍試料および無処理の腫瘍試料を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図５Ｌ】マウス異種移植において、上昇したＡｋｔを有する癌細胞株中でＡＰＩ−１が抗腫瘍活性を示すことを実証する図である。ＡＰＩ−１がインビボでＡｋｔリン酸化を阻害することを実証する。ＡＰＩ−１処理された腫瘍試料および無処理の腫瘍試料を溶解し、示された抗体によりイムノブロットした。
【図６Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図６Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図６Ｃ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＩＧＦ−１に誘導されるＡｋｔの細胞膜移行を阻害することを示した図である。ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上でＭｙｃ−ＡＫＴ１によりトランスフェクションし、一晩血清飢餓を行い、次に３０分間ＡＫＴ−ＳＩ１あり（図６Ｃ）、またはＡＫＴ−ＳＩ１なしで（図６Ｂ）処理し、その後ＩＧＦ１により１５分間刺激した。固定に後続して、細胞を抗Ｍｙｃモノクローナル抗体、続いてＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体により免疫染色して、サイトゾルまたは膜におけるエピトープのタグを付加したタンパク質の存在を示した（図６Ｂ）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＩＧＦ１による処理のない細胞を対照として使用した（図６Ａ）。
【図７Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｃ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｄ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図７Ｅ】ＡＫＴ−ＳＩ１がＡｋｔキナーゼ活性、特に構成的に活性のあるＡｋｔの阻害においてＡＰＩ−２／ＴＣＮよりも強力であることを示した図である。ＡＫＴ−ＳＩ１構造はＡＰＩ−２／ＴＣＮとリボース糖部分を共有しているが（図７Ａ）、これらの２つの分子の残りの部分に化学的類似性はない。しかしながら、それらのＡｋｔ阻害能力を比較した。ＨＥＫ２９３細胞を、野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１（図７Ｂおよび７Ｃ）および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７Ｋ（図７Ｄおよび７Ｅ）によりトランスフェクションした。３６時間のインキュベーションに後続して、細胞に一晩飢餓血清を行なった。野生型Ａｋｔをトランスフェクションした細胞は、ＡＫＴ−ＳＩ１（図７Ｂおよび７Ｄ）またはＡＰＩ−２／ＴＣＮ（図７Ｃおよび７Ｅ）により３０分間処理し、続いてＥＧＦにより１５分間刺激した。免疫沈降を抗Ｍｙｃの抗体により実行し、免疫沈降物で基質としてヒストンＨ２Ｂを使用するインビトロキナーゼ分析を行なった（上部）。ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮによるＡｋｔキナーゼ活性の阻害は、相対的活性として定量および計算した（中央）。ウエスタンブロット解析は免疫沈降したＡＫＴ１タンパク質を示す（下部パネル）。実験は３回反復した。
【図８Ａ】ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮがリン酸化Ａｋｔレベルを阻害することを示した図である。野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７ＫによりトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された試薬により処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体（上部）および抗Ｍｙｃ抗体（下部）によりイムノブロットした。
【図８Ｂ】ＡＫＴ−ＳＩ１およびＡＰＩ−２／ＴＣＮがリン酸化Ａｋｔレベルを阻害することを示した図である。野生型Ｍｙｃ−ＡＫＴ１および構成的に活性のあるＭｙｃ−ＡＫＴ１−Ｅ１７ＫによりトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、示された試薬により処理し、抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体（上部）および抗Ｍｙｃ抗体（下部）によりイムノブロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、Ａｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する化合物および組成物に関する。１つの実施形態において、本発明の化合物は、Ａｋｔタンパク質のキナーゼ活性および／またはリン酸化レベルを阻害する。本発明の化合物は、式Ｉ：
【化２】
（Ｉ）
（式中、
Ｘは独立してＯ、ＮまたはＳであり；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ1は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＯＨにより任意に置換されるアルキル、または−ＯＨにより任意に置換されるアルコキシであり；
および、Ｒ2は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキル、またはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意に置換することができ；
Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキルまたはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨまたはハロゲンまたはアルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができる）；または
その類似体もしくは薬学的に許容される塩で示される一般的な構造を有する。
【００１４】
１つの実施形態において、各ＸはＮである。例示された実施形態において、ＹはＯである。別の例示された実施形態において、各Ｒ1は独立して−ＯＨまたは−ＣＨ2ＯＨである。なお別の実施形態において、Ｒ2は−ＯＨにより任意に置換される−ＮＨ2である。さらに実施形態において、Ｒ2は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2である。
【００１５】
具体的な実施形態において、本発明の化合物は、以下の構造（式ＩＩ）：
【化３】
（ＩＩ）
を有する 。
【００１６】
本発明の化合物は、ＰＴＥＮ変異などの上流レギュレーターの変化からの結果として生じる高度に活性化された野生型Ａｋｔだけでなく、ｍｙｒ−ＡＫＴ１、Ｍｙｒ−ＡＫＴ２およびＥ４０Ｋ−ＡＫＴ１を含む、構成的に活性のあるＡｋｔ変異体も阻害する。最近の研究は、脂質結合ポケット中のアミノ酸１７でのグルタミン酸のリジン置換（Ｅ１７Ｋ）をもたらす、ヒトの乳癌、結腸直腸癌および卵巣癌におけるＡＫＴ１のＰＨドメイン中の再発性体細胞変異を同定した（Ｃａｒｐｔｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。Ｌｙｓ１７はポケットの静電的相互作用を変化させて、フォスフォイノシチドリガンドによる新しい水素結合を形成する。この変異は細胞膜への病的な局在を介してＡＫＴ１を活性化し、細胞を形質転換し、マウスにおける白血病を誘導する。さらに、Ｅ１７Ｋ置換はアロステリックキナーゼ阻害剤への感受性を低下させる（Ｃａｒｐｔｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００７）。Ｅ４０Ｋ−ＡＫＴ１変異体は細胞膜に局在できるＥ１７Ｋに類似しているので（Ｂｅｌｌａｃｏｓａ ｅｔ ａｌ． １９９８）、ＡＰＩ−１はＥ１７Ｋ−ＡＫＴ１もまた阻害しうる。
【００１７】
単離された化合物として本発明の化合物を投与することができるが、これらの化合物は、医薬組成物の一部としても投与することができる。本発明は、したがってさらに少なくとも１つの薬学的に許容される担体を伴う組成物を提供する。医薬組成物は、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、皮下投与などのような様々な投与経路に適合させることができる。当業者によって決定することができるように、継続的に、または明瞭なインターバルで投与することができる。
【００１８】
本発明の化合物は、薬学的に有益な組成物を調製する公知の方法に従って製剤化することができる。製剤は、当業者に周知であり容易に利用可能な多数の出典中に記述されている。例えば、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（Ｍａｒｔｉｎ １９９５）は、本発明に関連して使用できる製剤について記述する。投与に適切な製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの製剤を血液と等張にする溶質を含みうる水性の滅菌済み注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含みうる水性および非水性の滅菌済み懸濁物を含む。製剤は、単位用量またはマルチ用量の容器（例えば密封したアンプル、バイアル）中に提供され、使用前に、滅菌済み液体担体（例えば注射用の水）の条件のみを必要とする、冷凍乾燥（凍結乾燥）条件で保存することができる。即時注射溶液および懸濁物は、滅菌済みの粉末、顆粒、タブレットなどから調製することができる。特に上で言及された成分に加えて、本発明の組成物は、当該製剤のタイプを考慮して、当技術分野における従来の他の薬剤を含みうることが理解されるべきである。
【００１９】
本明細書において使用されるように、アルキルは、直鎖または分岐鎖である、１〜２０の炭素原子を有する飽和炭化水素基または一価不飽和炭化水素基もしくは多価不飽和炭化水素基を意味し、Ｃ1-Xアルキルは、１〜「Ｘ」の炭素原子数を含む直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。例えば、Ｃ1-6アルキルは、１〜６の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。アルコキシは、アルキル基が以前に本明細書において記述されているようなものである、アルキル−Ｏ−基を意味する。
【００２０】
用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素などの周期表のハロゲンを意味する。
【００２１】
用語「任意に置換される」は、任意の利用可能な１つまたは複数の位置で、１つまたは複数の有機基または無機基（例えばアルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、またはハロゲン）により任意に置換されることを意味する。
【００２２】
飽和アルキル基の例は、メチル、エチル、Ｎ−プロピル、イソプロピル、Ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、Ｎ−ペンチル、Ｎ−ヘキシル、Ｎ−ヘプチルおよびＮ−オクチルを含むが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基は、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ヘキセニル、ビニル、２−プロピニル、２−イソペンテニル、２−ブタジエニル、エチニル、１−プロピニル、３−プロピニルおよび３−ブチニルを含む。具体的には、「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、４−ヘプテニル、５−ヘプテニル、１−ノネニル、２−ノネニル、３−ノネニル、４−ノネニル、５−ノネニル、６−ノネニル、７−ノネニル、８−ノネニル、１−デケニル、２−デケニル、３−デケニル、４−デケニル、５−デケニル、６−デケニル、７−デケニル、８−デケニル、９−デケニル；１−ウンデケニル、２−ウンデケニル、３−ウンデケニル、４−ウンデケニル、５−ウンデケニル、６−ウンデケニル、７−ウンデケニル、８−ウンデケニル、９−ウンデケニル、１０−ウンデケニル、１−ドデケニル、２−ドデケニル、３−ドデケニル、４−ドデケニル、５−ドデケニル、６−ドデケニル、７−ドデケニル、８−ドデケニル、９−ドデケニル、１０−ドデケニル、１１−ドデケニル、１−トリデケニル、２−トリデケニル、３−トリデケニル、４−トリデケニル、５−トリデケニル、６−トリデケニル、７−トリデケニル、８−トリデケニル、９−トリデケニル、１０−トリデケニル、１１−トリデケニル、１２−トリデケニル、１−テトラデケニル、２−テトラデケニル、３−テトラデケニル、４−テトラデケニル、５−テトラデケニル、６−テトラデケニル、７−テトラデケニル、８−テトラデケニル、９−テトラデケニル、１０−テトラデケニル、１１−テトラデケニル、１２−テトラデケニル、１３−テトラデケニル、１−ペンタデケニル、２−ペンタデケニル、３−ペンタデケニル、４−ペンタデケニル、５−ペンタデケニル、６−ペンタデケニル、７−ペンタデケニル、８−ペンタデケニル、９−ペンタデケニル、１０−ペンタデケニル、１１−ペンタデケニル、１２−ペンタデケニル、１３−ペンタデケニル、または１４−ペンタデケニルを含むことができ；「アルコキシ」は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンタオキシ、３−ペンタオキシ、ヘキサオキシ、ヘプチロキシ、オクチロキシ、ノニロキシ、デシロキシ、ウンデシロキシ、ドデシロキシ、トリデシロキシ、テトラデシロキシ、またはペンタデシロキシを含むことができる。
【００２３】
本発明の化合物は、当業者によって調製することができるすべて水和物および塩を含む。本発明の化合物が安定した無毒な酸性塩または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性の条件下で、塩として化合物を投与することは適切でありうる。薬学的に許容される塩の例は、生理学的な許容されるアニオンを形成する酸により形成された有機酸の付加塩（例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびα−グリセロリン酸塩）である。塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩塩を含む、適切な無機塩類もまた形成することができる。
【００２４】
化合物の薬学的に許容される塩は、当技術分野における周知の標準的手順を使用して、例えば、生理学的に許容されるアニオンを与える適切な酸とアミンなどの十分に塩基性の化合物を反応させることによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えばナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩、またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩もまた作製することができる。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「類似体」は、実質的にもう一つの化合物と同種類のものであるが、例えば、側鎖基の追加、親構造の酸化または還元によって修飾されうる化合物を指す。本発明の化合物の類似体は、一般に公知の標準的反応を使用して容易に調製することができる。これらの標準的反応は、水素化反応、アルキル化反応、アセチル化反応および酸性化反応を含むが、これらに限定されない。化学的修飾は、分子中に存在するすべての官能基を保護すること、および所望の反応を行なった後にそれらを脱保護することによって、科学文献中で公知の標準的手順を使用して、当業者によって成し遂げることができる（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｋｏｎｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ． ２０００；それらの各々はその全体を参照することにより本明細書に組み入れられる）。所望の生物学的活性（アポトーシスの誘導、細胞毒性、細胞静止、細胞周期停止の誘導、抗血管形成特性などのような）を示す類似体は、細胞分析または他のインビトロもしくはインビボの分析を使用して、同定または確認することができる。
【００２６】
本発明の化合物は１つまたは複数の非対称的に置換された炭素原子（すなわち炭素中心）を含むことができることが理解される。本発明の化合物における１つまたは複数の不斉中心の存在は、立体異性体を生じさせることができ、各場合において、本発明は、鏡像異性体および偏左右異性体を含むそのようなすべての立体異性体、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物に拡張するように理解されるべきである。
【００２７】
本発明の化合物および組成物は、様々な非治療目的および治療目的に有用である。化合物および組成物は、動物およびヒトにおける異常な細胞増殖の減少のために使用できる。化合物のかかる抗増殖特性のために、それらはインビトロおよびインビボを含む様々な設定における望まれない細胞増殖を減少させるのに有用である。
【００２８】
化合物およびそれらを含む組成物の治療適用は、現時点でまたは将来的に当業者に公知の任意の適切な治療方法および技術によって成し遂げることができる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物および組成物の調製のための出発材料または中間体としての用途を有する。
【００２９】
本発明の化合物およびその組成物は、任意で不活性希釈剤などの薬学的に許容される担体と組み合わせて、望まれない細胞増殖の部位（腫瘍部位または良性の皮膚増殖など、例えば腫瘍または皮膚増殖に対して注射または局所的に適用される）または真菌感染の部位などの１つまたは複数の解剖学的な部位で局所的に投与することができる。本発明の化合物およびその組成物は、任意で不活性希釈剤など薬学的に許容される担体または経口送達のための吸収可能な食用担体と組み合わせて、全身的に（静脈内または経口的など）投与することができる。それらはハードシェルゼラチンカプセルまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入できるか、タブレットに圧縮できるか、または患者の食餌の食品に直接組み入れることができる。経口の治療投与のために、活性化合物は１つまたは複数の賦形剤と組み合わせることができ、摂取可能なタブレット、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ剤、ウエハー、エアゾールスプレーおよび同種のものの形態で使用できる。
【００３０】
タブレット、トローチ、ピル、カプセルおよび同種のものは、以下のものもまた含むことができる。トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸および同種のものなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなど甘味剤、またはペパーミント、ヒメコウジ油もしくはチェリーフレーバーなどの着香剤を追加できる。単位投与量形態がカプセルである場合、上述のタイプの材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含むことができる。様々な他の材料は、被膜として、またはそうでなければ固体単位の投与量形態の物理的形態を修飾するように存在しうる。例えば、タブレット、ピルまたはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖および同種のものにより被覆できる。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリーフレーバーまたはオレンジフレーバーなどの香味料を含むことができる。当然、任意の単位投与量形態の調製に使用される任意の材料は、使用する量で薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は徐放性の調製物および装置の中へ組み入れることができる。
【００３１】
本発明の化合物および組成物（その薬学的に許容される塩または類似体を含む）は、注入または注射によって静脈内に、筋肉内に、または腹腔内に投与することができる。活性薬剤またはその塩の溶液は無毒な界面活性剤と任意で混合されて、水中で調製することができる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびその混合物、ならびに油中でも調製することができる。通常の保存および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する防腐剤を含むことができる。
【００３２】
注射または注入に適切な薬学的投与量形態は、任意でリポソーム中でカプセル化された滅菌済みの注射可能もしくは注入可能な溶液または分散物の即時調整に適合する活性成分を含む、滅菌済みの水性の溶液もしくは分散物または滅菌済みの粉末を含むことができる。最終的な投与量形態は、滅菌済みで流動的であり、製造および保存の条件下で安定しているべきである。液体担体または媒質は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、および同種のもの）、植物油、無毒なグリセリルエステル、および適切なそれらの混合物を含む、溶媒または液体分散媒でありえる。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散物の場合で必要とされる粒子サイズの維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。任意で、微生物活動の防止は、様々な他の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、および同種のもの）によって成し遂げることができる。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、緩衝剤または塩化ナトリウム）を含むことは好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の含有によって成し遂げることができる。
【００３３】
滅菌済みの注射可能な溶液は、上で列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要とされた量で本発明の化合物を組み入れ、必要に応じて続いて濾過滅菌することによって調製される。滅菌済みの注射可能な溶液の調製のための滅菌済み粉末の場合において、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥の技術であり、事前に滅菌済みの濾過溶液中に存在する任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末をもたらす。
【００３４】
局所投与のために、本発明の化合物は液体または固体として適用されうる。しかしながら、皮膚科学的に許容される担体（固体または液体でありうる）と組み合わせて、組成物として皮膚に局所的に投与することが一般的に望ましいだろう。本発明の化合物および組成物を被験体の皮膚に局所的に適用して、悪性腫瘍または良性腫瘍のサイズを減少させる（および完全な除去を含みうる）か、または感染部位を治療することができる。本発明の化合物は、増殖部位または感染部位に直接適用することができる。好ましくは、化合物は、軟膏、クリーム、ローション、溶液、チンキ、または同種のものなどの製剤で増殖部位または感染部位に適用される。皮膚の病変への薬理学的物質の送達のための薬物送達システムは、米国特許第５，１６７，６４９号中で記述されたようなものも使用することができる。
【００３５】
有用な固体担体は、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ、および同種のものなどの微粉固体を含む。有用な液体担体は、水、アルコールもしくはグリコールまたは水−アルコール／グリコールブレンドを含み、化合物は任意で非毒性界面活性剤の補助によって、効果的なレベルで溶解または分散させることができる。香料および追加の抗生物質のような補助剤を追加して、規定の使用のための特性を最適化することができる。結果として生ずる液体組成物は、吸収性パッドから適用するか、救急絆および他の包帯を使用して浸透させるか、例えばポンプタイプ噴霧器またはエアゾール噴霧器を使用して罹患した領域上にスプレーすることができる。
【００３６】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステルなどの増粘剤、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾鉱物材もまた、液体担体と共に使用して、使用者の皮膚への直接的な適用のために、塗布可能なペースト、ゲル、軟膏、石鹸、および同種のものを形成することができる。皮膚へ化合物を送達するために使用できる有用な皮膚科学的組成物の例は、米国特許第４，６０８，３９２号；米国特許第４，９９２，４７８号；米国特許第４，５５９，１５７号；および米国特許第４，８２０，５０８号で開示される。
【００３７】
本発明の化合物および医薬組成物の有用な投与量は、インビトロの活性と動物モデルにおけるインビボの活性との比較によって決定することができる。マウス、および他の動物、ヒトに対する有効量の推定のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号を参照。
【００３８】
本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本発明の化合物を含む医薬組成物にも関する。経口投与、局所投与または非経口投与に適合した、化合物の量を含む医薬組成物は、本発明の好ましい実施形態を構成する。本発明の文脈中で患者（特にヒト）に投与される用量は、適当な期間枠にわたって患者において治療効果を達成するのに十分であり、致死毒性がなく、許容されるレベル以上の副作用または病的状態を好ましくは引き起こさないものであるべきである。当業者は、病理学的状態の重症度およびステージに加えて、被験体の条件（健康）、被験体の体重、もしあれば併用療法の種類、処理の頻度、治療係数を含む様々な因子に、投与量が依存することを認識するだろう。
【００３９】
本発明は、式Ｉの化合物、またはその塩もしくは類似体の有効量と細胞を接触させることを含む、Ａｋｔタンパク質の発現が上昇されるかまたは構成的に活性のある、癌細胞もしくは腫瘍細胞または他の細胞の生存または増殖を阻害するかまたは殺傷する方法にも関する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。１つの実施形態において、細胞はヒト細胞または他の哺乳類細胞である。本方法を使用して阻害または殺傷することができる癌細胞は、転移性の性質の細胞を含んでいる。したがって、癌細胞または腫瘍細胞の転移の阻害もまた本発明によって検討される。本方法はインビトロまたはインビボで実行することができる。
【００４０】
本発明は、式Ｉの化合物、またはその塩もしくは類似体の有効量を人または動物に投与することを含む、人または動物における癌または腫瘍などの腫瘍学的障害を治療する方法にも関する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される式を有する。１つの実施形態において、本発明の化合物または組成物の有効量は、腫瘍学的障害を有し、その治療を必要とする患者に投与される。阻害剤は、化学療法、免疫療法および／または放射線療法の前か、それらの後か、またはそれらと併用して、投与することができる。本発明の方法は、腫瘍学的障害の治療を必要としているか、または必要としうる患者の同定を任意で含むことができる。本発明の方法を使用する治療を必要とする患者は、医学または獣医学の当業者に公知の標準的技術を必要に応じて使用して同定することができる。１つの実施形態において、患者は、霊長類（サル、チンパンジー、類人猿など）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタもしくはウマ、または腫瘍学的障害がある他の動物などの、ヒトまたは他の哺乳類でありえる。患者への投与のための本発明の化合物の投与および製剤化のための手段は、当技術分野において公知であり、それらの実施例は本明細書において記述される。本発明の範囲内の腫瘍学的障害は、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）および脳の癌および／または腫瘍を含むが、これらに限定されない。本発明による治療のために検討される具体的な癌は、癌腫、カポジ肉腫、黒色腫、中皮腫軟部組織肉腫、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、および他のもの）、およびリンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、および多発性骨髄腫を含む。
【００４１】
腫瘍学的障害の治療のために、本発明によって検討される化合物および組成物は、他の抗腫瘍性もしくは抗癌性の薬剤もしくは物質（例えば化学療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤など）および／または放射線療法および／または腫瘍を除去する外科的治療の前か、それらの後か、またはそれらと組み合わせて、治療を必要とする患者に投与することができる。例えば、本発明の化合物および組成物は、タキソールまたはビンブラスチンなどの有糸分裂阻害剤、シクロホスアミドまたはイフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシルまたはヒドロキシウレアなどの抗代謝剤、アドリアマイシンまたはブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレーター、エトポシドまたはカンプトテシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、アンジオスタチンなどの抗血管新生剤、タモキシフェンなどの抗エストロゲン、および／または例えばグリーベック（ノバルティスファーマ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社）およびハーセプチン（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）などのそれぞれ他の抗癌薬物または抗体により、患者が、治療される予定か、または治療されているか、または治療されてきた、癌治療法において使用することができる。これらの他の物質または放射線治療は、本発明の化合物と同様の、または異なる回数で与えることができる。本発明の範囲内で検討される他の化学療法剤の例は、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ（ｃｒｉｓａｎｔａｓｐａｓｅ）、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン（tioguanine/thioguanine）、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンを含むが、これらに限定されない。例示された実施形態において、化学療法剤はメルファランである。本発明の範囲内で検討された免疫療法剤の例は、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、トラスツザマブ（ｔｒａｓｔｕｚａｍａｂ）（ハーセプチン）を含むが、これらに限定されない。本発明は、化学療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤、または放射線療法の投与の前か、それらの後か、および／またはそれらと組み合わせて、本発明の化合物の有効量を投与することを含む、腫瘍学的障害を治療する方法にも関する。
【００４２】
本発明は、本発明の化合物または組成物の有効量と細胞を接触させることによって、細胞中のＡｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する方法にも関する。１つの実施形態において、化合物は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２および／またはＡＫＴ３タンパク質に結合し、それらの活性を阻害する。具体的な実施形態において、化合物は、式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。１つの実施形態において、細胞はヒト細胞または哺乳類細胞であり、異常な増殖、生存、移動または分化を示す癌細胞もしくは腫瘍細胞または他の細胞になりえる。１つの実施形態において、細胞は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３などのＡｋｔタンパク質を、構成的に発現するか、または上昇レベルもしくは異常レベルで発現する。
【００４３】
本発明は、本発明の化合物または組成物の治療的有効量が人または動物に投与される、細胞中のＡｋｔタンパク質の構成的発現、異常な発現、または上昇した発現に関連する障害を有する人または動物を治療する方法にも関する。障害は、例えば、異常な細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化によって特徴づけられるものでありえる。１つの実施形態において、化合物は、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３タンパク質に結合し、それらの活性を阻害する。具体的な実施形態において、化合物は式ＩＩ、またはその塩もしくは類似体で示される構造を有する。
【００４４】
治療される障害または疾患の条件に依存して、適切な用量は標的細胞の増加または増殖を減少させる量でありえる。癌の情況において、適切な用量は、悪性腫瘍などの癌組織において、所望反応を達成することが公知である活性薬剤の濃度をもたらすものである。好ましい投与量は、管理し難い副作用なしに癌細胞増殖の最大の阻害をもたらす量である。当業者によって決定することができるように、化合物の投与は継続的、または異なるインターバルでありえる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、所望療法の治療のためのかかる投薬量の投与を提供するために、本発明の医薬組成物は、担体または希釈剤を含む全組成物の重量に基づいて、１つまたは複数の化合物の総重量で、約０．１％〜４５％、特に１〜１５％の間で含まれうる。例示的に、投与される活性のある成分の投与量レベルは、静脈内、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；皮下、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；筋肉内、０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ；経口的、０．０１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、および好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ；鼻腔内滴下、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ；ならびにエアロゾル、０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇの動物（身体）重量でありえる。
【００４６】
本発明は、１つまたは複数の容器中に、本発明の１つまたは複数の化合物、または本発明の化合物を含む組成物、または前述のものの類似体もしくは塩を含むキットにも関する。１つの実施形態において、キットは、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは類似体を含む。本発明のキットは、薬学的に許容される担体および／または希釈剤を任意で含むことができる。１つの実施形態において、本発明のキットは１つまたは複数の他の成分または添加物または本明細書において記述されるような補助剤を含む。他の実施形態において、キットは、本明細書において記述される薬剤などの１つまたは複数の抗癌剤を含む。１つの実施形態において、本発明のキットは、キットの化合物または組成物を投与する方法について記述する説明書または包装材料を含む。キットの容器は、任意の適切な材料（例えばガラス、プラスチック、金属など）、および任意の適切なサイズ、形状、または立体配置でありえる。１つの実施形態において、本発明の化合物は、タブレット、ピル、または粉末の形態などの固形としてキット中に提供される。他の実施形態において、本発明の化合物は液体または溶液としてキット中に提供される。１つの実施形態において、キットは、液体または溶液の形態で本発明の化合物を含むアンプルまたはシリンジを含む。
【００４７】
開示された方法から利益を得る哺乳類種は、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サルなどの霊長類；イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムポットベリーピッグ、ウサギ、およびフェレットなどの飼育された動物（例えばペット）；ウシ、水牛、バイソン、ウマ、ロバ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの飼育された家畜；クマ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、カバ、サイ、キリン、アンテロープ、ナマケモノ、カモシカ、シマウマ、ウィルドビースト、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、コモリネズミ、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、イルカおよびクジラなどの典型的には動物園において見出される外来動物を含むが、これらに限定されない。開示された方法から利益を得てもよい他の種は魚類、両生類、鳥および爬虫類を含む。本明細書において使用されるように、「患者」、「被験体」という用語は同じ意味で使用され、かかるヒト種および非ヒト種を含むように意図される。同様に、本発明のインビトロの方法は、かかるヒト種および非ヒト種の細胞に対して実行することができる。
材料および方法
【００４８】
細胞株およびＮＣＩ多様性セット。この研究において使用されるすべて細胞株は、ＡＴＣＣから購入したか、または事前に記載されたものである。（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７； Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０００； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５）。ＮＣＩ構造多様性セットは、およそ１４０，０００の化合物のＮＣＩ薬物寄託場所から選択された１，９９２の化合物のライブラリーである。これらの多様性セット化合物の選択、構造および活性に関する詳細なデーターは、ＮＣＩの開発的な治療プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）ウェブサイトで見出すことができる（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９１）。
【００４９】
Ａｋｔにより形質転換した細胞の増殖阻害についてのスクリーニング。ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＬＸＳＮベクターによりトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３対照細胞（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９７）を、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングした。５μＭのＮＣＩ多様性セット化合物による処理に後続して、細胞増殖は、セルタイター９６ワン・ソリューション・セル・プロリファレーション（ＣｅｌｌＴｉｅｒ ９６ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）により検出された。ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を阻害するが、ＬＸＳＮによりトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は阻害しない化合物をＡｋｔ阻害剤の候補と見なし、詳しい解析を行なった。
【００５０】
インビトロのプロテインキナーゼ、細胞生存およびアポトーシス分析。以前に記述されたように、インビトロのキナーゼを実行した（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０００）。細胞生存はＭＴＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社）により分析した。アポトーシスは、アネキシンＶ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）により検出し、製造者の説明書に従って実行した。組換えのＡｋｔおよびＰＤＫ１は、アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から購入した。
【００５１】
ヌードマウス腫瘍異種移植モデルにおける抗腫瘍活性。腫瘍細胞を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、以前に報告されるように８週齢のメスヌードマウスの右脇腹および左脇腹（２×１０6細胞／脇腹）に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。腫瘍が約１００〜１５０ ｍｍ3に達した時に、動物は無作為化され、媒質または薬物を毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）投薬した。対照動物にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２０％）媒質を投与し、処理動物に２０％ＤＭＳＯ中のＡＰＩ−１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。
【００５２】
本明細書において参照または引用したすべての特許、特許出願、仮出願、および出版物は、すべて図および表を含むその全体を参照することにより、この明細書の明確な教示に矛盾しない程度まで組み入れられる。
【００５３】
以下は本発明の実行のための手順を説明する実施例である。これらの実施例は限定として解釈されるべきでない。特に断りのない限り、すべてのパーセンテージは重量により、すべての溶媒混合比率は体積による。
【実施例１】
【００５４】
ＮＣＩ多様性セットのスクリーニングによる低分子Ａｋｔ／ＰＫＢ経路阻害剤−１（ＡＰＩ−１）の同定
【００５５】
Ａｋｔ経路の異常な活性化がすべてのヒト悪性腫瘍のほとんど５０％において起こり、Ａｋｔの阻害が細胞増殖停止およびアポトーシスを誘導するという事実のために、抗癌薬を見出だすために低分子Ａｋｔ阻害剤を開発することは産業および学界からの関心を引いた（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５； Ｇｒａｎｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ． ２００６）。何十ものＡｋｔ阻害剤が報告されているが、それらの多くはインビボでの抗腫瘍活性を欠く。脂質ベースのＡｋｔ阻害剤（ペリホシン）は第Ｉ相および第ＩＩ相の研究において報告された（Ｖａｎ Ｕｍｍｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００４； Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ２００６）。しかしながら、どちらの研究においてもＡｋｔの修飾は査定されなかった。膵臓癌におけるペリホシンの最近の第ＩＩ相研究は、第一ステージの間の許容できない有害事象を受けて終結した（Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ． ２００７）。それにもかかわらず、最小の副作用を備え他のキナーゼ活性の阻害を欠く強力な選択的Ａｋｔ阻害剤を開発する必要がある。Ａｋｔの低分子阻害剤を同定するために、我々は、「材料および方法」中で記述されているように、ＡＫＴ２により形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害が可能であるが、空ベクターＬＸＳＮによりトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖阻害が可能でない薬剤について、ＮＣＩからの１，９９２化合物の化学的ライブラリー（ＮＣＩ多様性セット）を評価した。三重実験は、３２の化合物がＡＫＴ２により形質転換した細胞のみの増殖を阻害したことを示した。我々は、以前にそれらのうちの１つ（インビトロおよびインビボで抗腫瘍活性を有する全Ａｋｔ阻害剤であり、現在第Ｉ相臨床試験中である、ＡＰＩ−２／トリシリビンと命名された）の特性を評価した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４）。
【００５６】
本研究において、我々は、Ａｋｔ／ＰＫＢ阻害剤−１（ＡＰＩ−１）が生細胞におけるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化レベルを特異的に阻害することを示した。図１ＡはＡＰＩ−１（ＮＳＣ１７７２２３）の化学構造を示し、それは化学名を有しておらず、ＮＣＩ６０細胞株において検査されていない（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。ＡＰＩ−１が、形質転換していない親細胞以上にＡＫＴ２形質転換細胞を選択的に阻害したので、ＡＰＩ−１がＡＫＴ２キナーゼの阻害剤であるか、Ａｋｔの他の２つのメンバーも阻害するかどうかを最初に調べた。ＨＡのタグを付加した野生型のＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３により、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。一晩の血清飢餓に後続して、細胞はＥＧＦ刺激の前に６０分間ＡＰＩ−１により処理し、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物はインビトロキナーゼ分析を行なった。図１Ｂは、ＡＰＩ−１がＡｋｔ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３のインスリン誘導性キナーゼ活性を抑制したことを示す。ＡＰＩ−１が生細胞においてＡｋｔを阻害するかどうかを次に調べる。ＯＶＣＡＲ３細胞（リン酸化Ａｋｔを上昇したレベルで発現する）を、異なる用量のＡＰＩ−１により３時間処理した。抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｓ４７３抗体によるイムノブロット解析から、ＡＰＩ−１がＡｋｔのリン酸化レベルおよびＩＣ50を効率的に減少させるのは、およそ０．８μＭであることが示された。しかしながら、全体のＡｋｔレベルは変化しなかった（図１Ｃ）。さらに、ＡＰＩ−１が直接インビトロのＡｋｔキナーゼ活性を阻害するかどうかを調べた。構成的に活性のあるＡｋｔ組換えタンパク質を、異なる量のＡＰＩ−１、および陽性対照として化合物Ｅ（Ａｋｔを含む全キナーゼのＡＴＰ競合阻害剤）を含むキナーゼバッファー中で、Ａｋｔ／ＳＧＫ基質ペプチド（アップステート社）と共にインキュベートした。三重実験から、ＡＰＩ−１はＡｋｔキナーゼ活性に対する効果がないことが示され（図１Ｄ）、ＡＰＩ−１が直接インビトロでＡｋｔを阻害せず、ＡＰＩ−１がＡＴＰとしても、また基質競合物としても機能しないことが示唆された。
【実施例２】
【００５７】
ＡＰＩ−１はＡｋｔの上流の活性化因子を阻害しない
【００５８】
Ａｋｔは、ＰＴＥＮにより負に調節されるＰＩ３Ｋ依存的様式を介して、細胞外刺激および細胞内シグナル分子によって活性化される。ＰＩ３Ｋの活性化またはＰＴＥＮの変異は、Ａｋｔキナーゼ活性の誘導を導くＰＤＫ１を活性化するだろう。したがって、ＡｋｔのＡＰＩ−１阻害は、ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１などのＡｋｔの１つまたは複数の標的上流分子に由来しうる。この目的のために、ＡＰＩ−１がＰＩ３Ｋおよび／またはＰＤＫ１を阻害するかどうかを次に調べた。ＨＥＫ２９３細胞は血清飢餓を行い、次にＥＧＦ刺激の前にＡＰＩ−１またはＰＩ３Ｋ阻害剤（ワートマニン）により１時間処理した。ＰＩ３Ｋを抗ｐ１１０α抗体により免疫沈降した。免疫沈降物は、基質としてＰＩ−４−Ｐを使用してインビトロのＰＩ３Ｋキナーゼ分析を行なった。図２Ａ中で示されるように、ＥＧＦにより誘導されたＰＩ３Ｋ活性はワートマニンによって阻害されたが、ＡＰＩ−１によって阻害されなかった。ＡＰＩ−１の効果を評価するために、リードアウト（アップステート・バイオテクノロジー社）としてＳＧＫキナーゼを使用して、ＰＤＫ１によりインビトロのＰＤＫ１キナーゼ分析を実行した。ＰＤＫ１阻害剤ＵＣＮ−０１とは異なり（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）、ＡＰＩ−１はインビトロのＰＤＫ１キナーゼ活性に効果がなかった（図２Ｂ）。生細胞におけるＰＤＫ１活性化に対するＡＰＩ−１の効果をさらに評価するために、ＯＶＣＡＲ３細胞のＡＰＩ−１処理に後いて、ＰＤＫ１−Ｓｅｒ２４１（自己リン酸化され、活性のために重要な残基（Ｃａｓａｍａｙｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９９））のリン酸化レベルを調べた。図２Ｄは、ＰＤＫ１のリン酸化レベルがＡＰＩ−１によって阻害されなかったことを示す。
【実施例３】
【００５９】
ＡＰＩ−１は、ＡＧＣキナーゼメンバーのＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳＧＫ、ならびに他のシグナリング分子のＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＳＴＡＴ３以上にＡｋｔに高度に選択的である。
【００６０】
Ａｋｔは、ＡＧＣ（ＰＫＡ／ＰＫＧ／ＰＫＣ）キナーゼファミリーに属し、このファミリーは、ＰＫＡ、ＰＫＣ、血清およびグルココルチコイド誘導性キナーゼ（ＳＧＫ）、ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ、ｐ７０S6K、マイトジェンおよびストレス活性化プロテインキナーゼ、ならびにＰＫＣ関連キナーゼもまた含む。ＡＧＣキナーゼファミリーの中で、ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＳＧＫのタンパク質構造は、他のメンバーよりもＡｋｔキナーゼに非常に近い。したがって、次にこれらの３つのキナーゼの酵素活性に対するＡＰＩ−１の効果を検討した。インビトロのＰＫＡキナーゼ分析およびＳＧＫキナーゼ分析は、キナーゼバッファー中のケンプチドまたはＡｋｔ／ＳＧＫ基質ペプチドおよび［γ−32Ｐ］ＡＴＰの追加によるキナーゼ分析の開始の前の３０分間、組換えＰＫＡタンパク質または組換えＳＧＫタンパク質との、示された用量のＡＰＩ−１または特異的阻害剤の前インキュベーションによって実行された。インビトロキナーゼ分析は、ＰＫＡおよびＳＧＫのキナーゼ活性がＰＫＡＩおよび化合物Ｅによってそれぞれ阻害されるが、ＡＰＩ−１にはそれらの活性に対する効果ないことを示した（図２Ｃおよび２Ｅ）。生細胞におけるＰＫＡおよびＰＫＣαの活性化に対するＡＰＩ−１の効果をさらに評価するために、ＯＶＣＡＲ３細胞は示された用量のＡＰＩ−１またはＰＫＡおよびＰＫＣの特異的阻害剤により処理され、ＰＫＡおよびＰＫＣのリン酸化レベルがＡＰＩ−１によって阻害されないことがイムノブロット解析により示された（図２Ｄ）。さらに、ＨＥＫ２９３細胞をＨＡのタグを付加したＳＧＫによりトランスフェクションした。インビトロキナーゼ分析から、ＥＧＦに誘導されたＳＧＫキナーゼ活性はワートマニンによって減少されるが、ＡＰＩ−１によって減少されないことが示された（図２Ｆ）。
【００６１】
ＡＰＩ−１が他の腫瘍形成性の生存経路に効果があるかどうか決定するために、ＯＶＣＡＲ３細胞をＡＰＩ−１（１０ａＭ）により異なる時間処理し、市販で入手可能な抗リン酸化抗体によりイムノブロットした。ＡＰＩ−１処理後には、Ｓｔａｔ３、ＪＮＫ、ｐ３８およびＥｒｋ１／２のリン酸化レベルの検出可能な変化は観察されなかった（図２Ｇ）。これらのデーターは、ＡＰＩ−１がＡｋｔ経路を特異的に阻害できることを示す。
【実施例４】
【００６２】
ＡＰＩ−１は構成的に活性のあるＡｋｔおよびその下流の標的を阻害する。
【００６３】
ＡＰＩ−１はＡｋｔをインビトロで直接阻害することができなかったが、ＰＩ３ＫおよびＰＤＫ１に対する影響なしに生細胞におけるＡｋｔのキナーゼ活性およびリン酸化を停止したので、この化合物がＡＴＰ結合部位ではなくＡｋｔタンパク質と相互作用して、ＰＤＫ１およびＰＤＫ２によるＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３のリン酸化を防止することが推測された。これが真であるならば、構成的に活性のあるＡｋｔの活性化がまだＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３のリン酸化を必要とするので、ＡＰＩ−１は構成的に活性のあるＡｋｔの活性化もまた阻害すべきである（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ２００１）。この仮説を検証するために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡのタグを付加したＭｙｒ−Ａｋｔ１、−Ａｋｔ２および−Ａｋｔ１Ｅ４０Ｋによりトランスフェクションした。一晩の血清飢餓に後続して、細胞をＡＰＩ−１ありまたはＡＰＩなしで処理した。Ｍｙｒ−Ａｋｔ１、Ｍｙｒ−Ａｋｔ２およびＡｋｔ１−Ｅ４０Ｋを、抗ＨＡ抗体により免疫沈降した。免疫沈降物に、インビトロキナーゼ分析および抗リン酸化−Ａｋｔ−Ｔ３０８抗体によるイムノブロット解析を行なった。図３Ａは、Ｍｙｒ−Ａｋｔ１、Ｍｙｒ−Ａｋｔ２およびＡｋｔ１−Ｅ４０Ｋのリン酸化レベルだけでなく、インビトロのＡｋｔキナーゼ活性もＡＰＩ−１によって阻害されたことを示し、ＡＰＩ−１がＡｋｔ分子に結合して細胞内での活性化を阻害するという概念を支援する。
【００６４】
Ａｋｔは多数のタンパク質のリン酸化を介してその細胞機能を発揮する（Ｄａｔｔａ ｅｔ ａｌ． １９９９）。次にＡＰＩ−１がＡｋｔの下流の標的を阻害するかどうかを調べた。ＧＳＫ３βおよびｍＴＯＲは主要なＡｋｔ標的のうちの２つであるので、ＧＳＫβおよびＳ６（ｐ７０S6Kの基質）のリン酸化レベルでＡＰＩ−１の影響を評価した。ＡＰＩ−１によるＯＶＣＡＲ３の処理に続くイムノブロット解析から、ＡＰＩ−１がそれらのリン酸化を非常に阻害することが明らかになった（図３Ｂ）。
【実施例５】
【００６５】
ＡＰＩ−１は細胞増殖を抑制し、Ａｋｔを過剰発現または活性化するヒト癌細胞株においてアポトーシスを誘導する
【００６６】
Ａｋｔは主要な増殖促進および生存促進の経路である。上昇したＡｋｔキナーゼを有する癌細胞は化学療法薬に誘導された細胞増殖停止および細胞死に対してより高い耐性を示すが、Ａｋｔのノックダウンは異なるアポトーシス促進刺激によって誘導されるアポトーシスに感受性を持つ（Ｓｏｌｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｊｅｔｚｔ ｅｔ ａｌ． ２００３）。ＡＰＩ−１が選択的にＡｋｔ経路を阻害する能力は、Ａｋｔの異常な発現／活性化を有するそれらの腫瘍細胞において、優先的に増殖を阻害することおよび／またはアポトーシスを誘導することを示唆する。これを検査するために、構成的に活性のあるＡｋｔを発現する細胞（Ａｋｔの過剰発現（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡＲ８、ＭＣＦ７およびＰＡＮＣ１）またはＰＴＥＮ遺伝子の変異（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ）によって引き起こされた）、および行なってない細胞（ＯＶＣＡＲ５、ＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ、ＤＵ−１４５およびＣＯＬＯ３５７）の処理にＡＰＩ−１を使用した。イムノブロット解析から、上昇したＡｋｔを発現する細胞においてＡＰＩ−１によりＡｋｔのリン酸化レベルが有意に阻害されるが、リン酸化Ａｋｔは低レベルのＡｋｔを示す細胞株においてもまたＡＰＩ−１により減少されることが示された（図４Ａおよびデーター不掲載）。しかしながら、ＡＰＩ−１はＰＡＲＰ切断を誘導し、低レベルのＡｋｔを有する細胞と比較して、Ａｋｔを過剰発現／活性化する細胞において、はるかに高い程度で細胞増殖を阻害する（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）。ＡＰＩ−１処理は、Ａｋｔを過剰発現／活性化する細胞株のＯＶＣＡＲ３、ＯＶＣＡ８、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ７においておよそ５０〜７０％で細胞増殖を阻害したが、ＯＶＣＡＲ５およびＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ細胞において約１０〜３０％のみ阻害した（図４Ｂおよび４Ｃ）。さらに、ＡＰＩ−１は、ＯＶＡＣＡＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８においてそれぞれ９倍および４．６倍でアポトーシスを誘導するが、ＡＰＩ−１−処理したＯＶＣＡＲ５およびＭＤＡ−ＭＢ４３５ｓ細胞においてはるかに少ないアポトーシスが観察された（図４Ｄ〜４Ｇ）。したがって、ＡＰＩ−１は細胞増殖を阻害し、異常なＡｋｔを発現する細胞においてアポトーシスを優先的に誘導する。
【実施例６】
【００６７】
ＡＰＩ−１は、Ａｋｔを過剰発現するヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害する
【００６８】
Ａｋｔの異常な活性化および過剰発現がヒトの卵巣癌および膵臓癌で頻繁に検出されること（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９２）、およびＡｋｔのアンチセンスが癌細胞の増殖および浸潤を有意に阻害すること（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９６）は、以前に示されている。さらに、ＰＩ３Ｋ、ＨＳＰ７０、Ｓｒｃおよびファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤によるＡｋｔ経路の阻害は、細胞増殖の停止およびアポトーシスの誘導をもたらした（Ｓｏｌｉｔ ｅｔ ａｌ． ２００３； Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ２００３）。ＡＰＩ−１は、上昇したＡｋｔレベルを有する癌細胞においてＡｋｔシグナリングを阻害しアポトーシスおよび細胞増殖停止を誘導するので（図４Ａ〜４Ｇ）、ヌードマウスにおいて、上昇したＡｋｔレベルを有する腫瘍の増殖は、低レベルのＡｋｔを有する腫瘍よりも、ＡＰＩ−１に対してより感受性であるべきだと推論された。この目的のために、Ａｋｔを過剰発現する細胞（ＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ−１）をマウスの左脇腹に皮下移植し、低レベルのＡｋｔを発現する細胞株（ＯＶＣＡＲ５およびＣＯＬＯ３５７）を右脇腹に皮下移植した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ3の平均サイズに達した時に、動物を無作為化し、媒質またはＡＰＩ−１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかにより腹腔内処理した。図５Ａ〜５Ｊで示されるように、媒質対照により処理したＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ１の腫瘍は増殖し続けた。ＡＰＩ−１は、ＯＶＣＡＲ３およびＰＡＮＣ１腫瘍増殖をそれぞれ７０％および５０％阻害した（図５Ｃ〜５Ｆおよび５Ｇ〜５Ｊ）。これとは対照的に、ＡＰＩ−１は、ヌードマウスにおけるＯＶＣＡＲ５およびＣＯＬＯ３５７の細胞の増殖に対して効果がほとんどなかった（図５Ａ〜５Ｊ）。ＡＰＩ−１は、用量１０ｍｇ／ｋｇ／日で、マウスの血糖値、体重、活動性および食物摂取量に対して影響はなかった（データー不掲載）。処理された腫瘍サンプルにおいて、Ａｋｔのリン酸化レベルはＡＰＩ−１によって約７０％減少されたが、全Ａｋｔ含有量の変化はなかった（図５Ｋ〜５Ｌ）。総合すれば、これらの結果は、ＡＰＩ−１が上昇したＡｋｔレベルを有する腫瘍の増殖を選択的に阻害することを示す。
【００６９】
本明細書において記述された実施例および実施形態が説明の目的のみのためのものあり、それらに照らして様々な修飾または変更が当業者に対して示唆され、本出願の趣旨および範囲、および添付された請求項の範囲内に含まれるべきであることが理解される。さらに、本明細書において開示された任意の発明またはその実施形態の任意の要素または限定は、任意のおよび／もしくは他のすべての要素もしくは限定（個別にまたは任意の組合せで）、または本明細書において開示された他の発明またはその実施形態と組み合わせることができ、すべてのかかる組合せは本発明の範囲でそれらに限定されずに検討される。
【００７０】
参照文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
（Ｉ）
（式中、
Ｘは独立してＯ、ＮまたはＳであり；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ1は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＯＨにより任意に置換されるアルキル、または−ＯＨにより任意に置換されるアルコキシであり；
Ｒ2は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキル、またはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができ；
Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキルまたはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができる）；または
その薬学的に許容される塩。
【請求項２】
各ＸがＮであるか、またはＹがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各Ｒ1が、独立して−ＯＨまたは−ＣＨ2ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2が、−ＯＨにより任意に置換される−ＮＨ2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、構造：
【化２】
を有する、請求項１に記載の化合物
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、１つまたは複数の抗癌剤を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗癌剤が、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、メルファラン、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、またはトラスツザマブ（ハーセプチン）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、１つまたは複数の有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、または抗エストロゲンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
Ａｋｔタンパク質の上昇した発現もしくは構成的に活性のある発現を有する細胞の生存もしくは増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量と該細胞を接触させることを含む該方法。
【請求項１３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、癌または腫瘍細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）、または脳の癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
人または動物における腫瘍学的障害を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の治療上の有効量の投与を含む該方法。
【請求項１７】
前記腫瘍学的障害が、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）、または脳の癌および／または腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、抗腫瘍剤および／または抗癌剤、および／または放射線療法、および／または外科的治療の前に、それらの後に、またはそれらと組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍学的障害が、Ａｋｔタンパク質の上昇した発現または構成的に活性のある発現を有する細胞に関連するかまたは特徴づけられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、腫瘍学的障害を有しているかまたは治療を必要とする人または動物を同定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物の投与経路が、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、皮下投与、局所投与、または鼻腔内投与である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
１つまたは複数の容器中に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つまたは複数の化合物または請求項７〜１１のいずれか一項に記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
【請求項２３】
前記キットが、薬学的に許容される担体および／または希釈剤をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットが、１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記抗癌剤が、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、メルファラン、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、またはトラスツザマブ（ハーセプチン）である、請求項２４に記載のキット
【請求項２６】
前記キットが、１つまたは複数の有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、または抗エストロゲンをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
細胞におけるＡｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量と細胞を接触させることを含む該方法。
【請求項２８】
前記化合物が、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３に結合し、それらのキナーゼ活性を阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞がＡｋｔタンパク質を構成的に発現するか、または前記細胞がＡｋｔタンパク質を上昇したレベルで発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が腫瘍または癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化が阻害される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が、細胞におけるＡｋｔタンパク質の構成的発現、異常な発現または上昇した発現に関連する、人または動物における障害を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量の投与を含む該方法。
【請求項３４】
前記化合物が、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、またはＡＫＴ３に結合し、それらのキナーゼ活性を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害が、異常な細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化によって特徴づけられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化１】
（Ｉ）
（式中、
Ｘは独立してＯ、ＮまたはＳであり；
ＹはＯ、ＮまたはＳであり；
Ｒ1は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＯ2、ハロゲン、−ＯＨにより任意に置換されるアルキル、または−ＯＨにより任意に置換されるアルコキシであり；
Ｒ2は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキル、またはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができ；
Ｒ3は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキルまたはアルコキシであり、それらのいずれかは、−ＯＨ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより任意で置換することができる）；または
その薬学的に許容される塩。
【請求項２】
各ＸがＮであるか、またはＹがＯである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各Ｒ1が、独立して−ＯＨまたは−ＣＨ2ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2が、−ＯＨにより任意に置換される−ＮＨ2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2が、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、構造：
【化２】
を有する、請求項１に記載の化合物
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項８】
前記組成物が、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、１つまたは複数の抗癌剤を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗癌剤が、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、メルファラン、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、またはトラスツザマブ（ハーセプチン）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、１つまたは複数の有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、または抗エストロゲンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
Ａｋｔタンパク質の上昇した発現もしくは構成的に活性のある発現を有する細胞の生存もしくは増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量と該細胞を接触させることを含む該方法。
【請求項１３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、癌または腫瘍細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）、または脳の癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
人または動物における腫瘍学的障害を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の治療上の有効量の投与を含む該方法。
【請求項１７】
前記腫瘍学的障害が、肛門、胆管、膀胱、骨、骨髄、腸管（大腸および直腸を含む）、乳房、目、胆嚢、腎臓、口、喉頭、食道、胃、精巣、頚管、頭部、首、卵巣、肺、中皮腫、神経内分泌、陰茎、皮膚、脊髄、甲状腺、膣、外陰部、子宮、肝臓、筋肉、膵臓、前立腺、血球（リンパ球および他の免疫系細胞を含む）、または脳の癌および／または腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、抗腫瘍剤および／または抗癌剤、および／または放射線療法、および／または外科的治療の前に、それらの後に、またはそれらと組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍学的障害が、Ａｋｔタンパク質の上昇した発現または構成的に活性のある発現を有する細胞に関連するかまたは特徴づけられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、腫瘍学的障害を有しているかまたは治療を必要とする人または動物を同定することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物の投与経路が、腸内投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、皮下投与、局所投与、または鼻腔内投与である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
１つまたは複数の容器中に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つまたは複数の化合物または請求項７〜１１のいずれか一項に記載の１つまたは複数の組成物を含むキット。
【請求項２３】
前記キットが、薬学的に許容される担体および／または希釈剤をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記キットが、１つまたは複数の抗癌剤をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記抗癌剤が、アルトレタミン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブスルファン、ホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブチル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ（グリーベック）、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、チオテパ、チオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、メルファラン、アレムツズマブ、セツキシマブ（エルビタックス）、ゲムツズマブ、ヨウ素１３１トシツモマブ、リツキシマブ、またはトラスツザマブ（ハーセプチン）である、請求項２４に記載のキット
【請求項２６】
前記キットが、１つまたは複数の有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、ＤＮＡインターカレーター、トポイソメラーゼ阻害剤、抗血管新生剤、または抗エストロゲンをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
細胞におけるＡｋｔ／ＰＫＢ経路を阻害する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量と細胞を接触させることを含む該方法。
【請求項２８】
前記化合物が、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、および／またはＡＫＴ３に結合し、それらのキナーゼ活性を阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞がＡｋｔタンパク質を構成的に発現するか、または前記細胞がＡｋｔタンパク質を上昇したレベルで発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が腫瘍または癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化が阻害される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が、細胞におけるＡｋｔタンパク質の構成的発現、異常な発現または上昇した発現に関連する、人または動物における障害を治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物または請求項７〜１１のいずれかに記載の組成物の有効量の投与を含む該方法。
【請求項３４】
前記化合物が、Ａｋｔ１、ＡＫＴ２、またはＡＫＴ３に結合し、それらのキナーゼ活性を阻害する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害が、異常な細胞増殖、細胞生存、細胞移動、および／または細胞分化によって特徴づけられる、請求項３３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【図５Ｌ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図５Ｊ】
【図５Ｋ】
【図５Ｌ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３３２０６（Ｐ２０１０−５３３２０６Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１６２９７（Ｐ２０１０−５１６２９７）
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９９７４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００９７９３
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９８０１４３３３）ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６９９７４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００９７９３
【国際公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【出願人】（３９８０１４３３３）ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ (17)
【Ｆターム（参考）】
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