抗菌ペプチドの産生能復元剤としてのグリチルリチン
抗菌ペプチドの産生量を向上させることができる薬剤。当該薬剤はグリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする。抗菌ペプチドはディフェンシン又はカセリシジンであることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症の発症予防に有用な抗菌ペプチドの産生能復元剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の疾病に罹患している患者や外科手術後の患者は、多くの場合、病原菌に対する免疫力が低下している。そして、このような患者は、健常者ではほとんど発症することがない感染症を、容易に発症することが知られている。この場合の感染症は、発症した患者自身の生命を脅かすことはもとより、患者間での感染症の蔓延を招く院内感染の原因ともなり、大きな医療問題となっている。なかでも、近年特に問題となっているのは、黄色ブドウ球菌、腸球菌、緑膿菌等を病原菌とする感染症である。通常、感染症は、抗生物質の投与によって治療され、病原菌の体内でのバランスがコントロールされるが、抗生物質に対して耐性を有する耐性菌の出現によって抗生物質の使用が制限されるようになり、各種感染症における有効な治療法の選択肢が限られ、新たな治療法の確立が強く望まれている。
【０００３】
例えば、火傷患者では、緑膿菌による感染症が頻繁に見られ、健常者では全く問題にならないような非常に僅かな量の緑膿菌によっても、敗血症等を発症することが知られている。
火傷患者における緑膿菌感染症の発症メカニズムについては、マウスを使用したモデルで詳細に解析されている。そして、火傷させたマウスでは、元来皮膚中に存在する抗菌ペプチドの一種であるｍｕｒｉｎｅ ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｃｉｎ １及び３（以下、それぞれＭＢＤ−１、ＭＢＤ−３と略記する）の量が、火傷部位周囲の皮膚中で顕著に減少していることが知られており（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，（１３５４〜１３６２），２００８参照）、これによる免疫力の低下が、緑膿菌感染症の発症原因であると考えられている。ＭＢＤ−１及びＭＢＤ−３は、表皮ケラチノサイトで産生されるが、火傷部位に出現する未熟骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞）で産生されるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びケモカインＣＣＬ２の作用により、減少すると考えられている。
【０００４】
このような、抗菌ペプチドの産生量減少が発症原因の一つである感染症も、その他の感染症同様に、従来は抗生物質の投与によって治療を行うのが主流となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記のように、抗生物質の投与は、新たな耐性菌を生む可能性があるという問題点があった。例えば、新規な薬剤耐性の獲得能が高い緑膿菌においては、特にこのような危険性が高い。そして、ほとんどの感染症に対しては、抗生物質の投与に代わる有効な治療法が無いという問題点があった。そこで、抗生物質の投与に代わる、安全性が高く且つ効果が高い、感染症の発症予防法の開発が強く望まれている。例えば、患者自身の病原菌に対する免疫力を健常者並みに回復させることができれば、有望な感染症の発症予防法になると考えられる。そして、抗菌ペプチドの産生量減少が発症原因となる感染症においては、抗菌ペプチドの産生量を健常者並みに向上させることが重要であると考えられる。しかし、このような感染症の発症予防法はこれまでに知られていない。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、抗菌ペプチドの産生量を向上させることができる薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝臓疾患やアレルギー疾患の治療薬であり、安全性に定評のあるグリチルリチンが、全く意外にも、マウスにおいて、ＭＢＤ−１及びＭＢＤ−３の産生量を向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、上記課題を解決するため、
本発明の第一実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする抗菌ペプチドの産生能復元剤が提供される。抗菌ペプチドは、ディフェンシン又はカセリシジンであることが好ましい。
【０００９】
本発明の第二実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする日和見感染防御剤が提供される。
本発明の第三実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物の有効量を、抗菌ペプチドの産生能復元を必要とする被検対象に投与することを含む、被検対象における抗菌ペプチドの産生能復元方法が提供される。
本発明の第四実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物の有効量を、日和見感染防御を必要とする被検対象に投与することを含む、被検対象における日和見感染防御方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、抗菌ペプチドの産生量を向上させることができ、感染症の発症を予防できる。また、新たな耐性菌を生む危険性が低く、しかも安全性が高い感染症の発症予防法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図２】参考例１〜３におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図３】参考例４〜６におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図４】実施例２及び比較例２における、マウスの血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量を示すグラフである。
【図５】実施例３及び比較例３における、マウスの皮膚組織ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図６】実施例４、比較例４及び参考例７〜９における、マウスの表皮ケラチノサイト及び／又はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図７】実施例５、比較例５及び参考例１０〜１２における、マウスのＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト及び／又はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を示すグラフである。
【図８】実施例６〜９、比較例６及び参考例７〜８における、マウスの表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中、あるいはマウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図９】参考例１３〜１５における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の量を示すグラフである。
【図１０】参考例１３〜１７における、マウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図１１】参考例１７及び参考例１８〜２０における、マウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図１２】実施例１０及び比較例７における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＣＣＬ２の量を示すグラフである。
【図１３】実施例１０及び比較例７における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＩＬ−１０の量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗菌ペプチドの産生能復元剤（以下、復元剤と略記する）は、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０と略記する）及びケモカインＣＣＬ２（以下、ＣＣＬ２と略記する）の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする。
本発明の復元剤は、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の少なくとも一方を産生する細胞に作用して、これらの産生能を阻害することで、抗菌ペプチドの産生能を復元すると考えられる。
【００１３】
本発明の復元剤が産生能を復元できる抗菌ペプチドは、ＩＬ−１０又はＣＣＬ２により産生が阻害されるものである。なかでも、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン等のディフェンシン及びカセリシジンが好適である。β−ディフェンシンとしては、ヒトβ−ディフェンシン−１（ＨＢＤ−１）、ヒトβ−ディフェンシン−２（ＨＢＤ−２）、ヒトβ−ディフェンシン−３（ＨＢＤ−３）、ヒトβ−ディフェンシン−４（ＨＢＤ−４）等のヒトβ−ディフェンシン（ＨＢＤ）が好適である。α−ディフェンシンとしては、ヒト好中球ディフェンシン−１（ＨＮＰ−１）、ヒト好中球ディフェンシン−２（ＨＮＰ−２）、ヒト好中球ディフェンシン−３（ＨＮＰ−３）等のヒト好中球ディフェンシン（ＨＮＰ）が好適である。カセリシジンとしてはカセリシジン抗菌ペプチド−１８（ＣＡＰ−１８）が好適である。
【００１４】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、例えば、甘草から抽出することにより得られるが、市販品を使用しても良い。市販品としては、株式会社ミノファーゲン製薬製のものが好適である。
【００１５】
グリチルリチンの薬学上許容される塩としては、グリチルリチンと無機あるいは有機塩基とを、一定のモル比で作用させて得られるものが例示できる。好ましいものとして具体的には、グリチルリチンモノアンモニウム塩、グリチルリチンジアンモニウム塩等のアンモニウム塩；グリチルリチンモノナトリウム塩、グリチルリチンジナトリウム塩、グリチルリチンモノカリウム塩、グリチルリチンジカリウム塩等のアルカリ金属塩；グリチルリチンコリン塩；グリチルリチンカルシウム塩；グリチルリチンマグネシウム塩；グリチルリチンアルミニウム塩等が例示できる。これらの中でも、グリチルリチンモノアンモニウム塩が特に好ましい。
【００１６】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、単独で使用しても良く、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて適宜調整すれば良い。
【００１７】
本発明の復元剤の製剤形態は特に限定されず、目的に応じて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤（水薬等）等の経口剤；吸入剤、坐剤、注射剤等の非経口剤等から適宜選択すれば良い。これら製剤形態の復元剤は、いずれも公知の方法で製造できる。
【００１８】
経口剤等の製剤形態とする場合には、これら製剤の製造に通常使用される賦形剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、矯味剤、着色剤、香料、緩衝剤等を配合しても良い。
【００１９】
前記賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、果糖、デキストリン、デンプン、食塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、無水ケイ酸、カオリン等が例示できる。
【００２０】
前記滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、タルク、トウモロコシデンプン、マクロゴール等が例示できる。
【００２１】
前記可塑剤としては、ポリエチレングリコ−ル、プロピレングリコ−ル、グリセリン類、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル等が例示できる。
【００２２】
前記結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン、水飴、甘草エキス、トラガント、単シロップ、ゼラチン等が例示できる。
前記崩壊剤としては、デンプン、カンテン、カルメロ−スカルシウム、カルメロ−ス、結晶セルロ−ス等が例示できる。
前記湿潤剤としては、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロ−ス、カルメロ−スナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロ−ス等が挙げられる。
【００２３】
前記矯味剤としては、白糖、ハチミツ、サッカリンナトリウム、ハッカ、ユ−カリ油、ケイヒ油等が例示できる。
前記着色剤としては、酸化鉄、β−カロチン、クロロフィル、水溶性食用タ−ル色素等が例示できる。
前記香料としては、レモン油、オレンジ油、ｄｌ−又はl−メント−ル等が例示できる。
【００２４】
吸入剤、注射剤等、非経口剤の製剤形態とする場合には、使用できる溶媒として、注射用蒸留水、無菌の非水性溶媒、懸濁剤等が例示できる。非水性の溶媒又は懸濁剤の基剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が好ましいものとして例示できる。
【００２５】
本発明の復元剤には、本発明の効果を妨げない範囲内で、上記成分以外の薬学上許容される任意成分を、必要に応じて適宜配合しても良い。
前記任意成分としては、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が例示できる。
【００２６】
本発明の復元剤の投与方法は、経口投与及び非経口投与のいずれでも良い。
復元剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜異なるが、経口投与の場合は通常、成人一人一日あたり、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩の量として、５０〜 ３０００ｍｇ／人であることが好ましく、３００〜２５００ｍｇ／人であることがより好ましい。また、非経口の場合は通常、成人一人一日あたり、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩の量として、２５〜２５００ｍｇ／人であることが好ましく、１５０〜２０００ｍｇ／人であることがより好ましい。
本発明の復元剤は、所定量を一日に一回又は複数回に分けて投与する。
【００２７】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、肝臓疾患やアレルギー疾患の治療薬として長年の使用実績があり、その安全性の高さに定評がある。本発明の復元剤は、このようなグリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなるので、高い安全性を有する。さらに、抗菌ペプチドの産生能を復元するという、生体が本来有している機能を強化する作用を有するものであり、新たな耐性菌を生む危険性も低い。このように、本発明の復元剤は、安全性が高い感染症の発症予防法を提供するものである。
本発明の復元剤は、火傷患者への適用が好適であるが、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害することで、抗菌ペプチドの産生能を復元する限り、適用対象は火傷患者に限定されるものではなく、感染症の発症予防が必要なあらゆる患者を適用対象とすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、具体的に実施例を挙げ、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００２９】
＜緑膿菌投与マウスの生存率の比較＞
［実施例１］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に１００ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Fｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ）量の緑膿菌を塗布した。次いで、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、火傷させてから２時間後、２４時間後及び７２時間後にそれぞれ腹腔内に投与し、マウスの生死を確認した。同様の操作を１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図１に示す。なお、図１のグラフの横軸は、緑膿菌感染後の日数（日）を示す。
【００３０】
［比較例１］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例１と同様に、マウスの生存率を確認した。結果を図１に示す。
【００３１】
図１から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例１）は、７日後まで死亡した個体が無く、投与しなかったマウス（比較例１）よりも、２日後以降の生存率が顕著に高かった。
【００３２】
［参考例１〜３］
正常マウスの背部に、マウス一匹あたり１０６ＣＦＵ量（参考例１）、１０７ＣＦＵ量（参考例２）、１０８ＣＦＵ量（参考例３）の緑膿菌をそれぞれ感染させ、マウスの生死を確認した。同様の操作を一区分あたり１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図２に示す。なお、図２のグラフの横軸は、感染（緑膿菌塗布）後の日数（日）を示す。
図２から明らかなように、緑膿菌投与量が多いほど、マウスの生存率が低くなった。
【００３３】
［参考例４〜６］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に、マウス一匹あたり５０ＣＦＵ量（参考例４）、１０３ＣＦＵ量（参考例５）、１０４ＣＦＵ量（参考例６）の緑膿菌を、それぞれ皮内感染させ、マウスの生死を確認した。同様の操作を一区分あたり１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図３に示す。なお、図３のグラフの横軸は、緑膿菌感染後の時間的経過（日数）を示す。
図３から明らかなように、参考例１〜３よりも少ない緑膿菌投与量で、緑膿菌感染が多いほどマウスの生存率が低くなった。
【００３４】
＜緑膿菌感染マウスの検体中における緑膿菌量の比較＞
［実施例２］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に１００ＣＦＵ量の緑膿菌を感染させた。次いで、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、緑膿菌感染から２時間後及び１２時間後にそれぞれ腹腔内に投与した。次いで、緑膿菌感染から４８時間後に、マウスから血液及び脾臓を採取し、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量をｃｏｌｏｎｙ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ法で測定した。結果を図４に示す。なお、図４のグラフの縦軸は、検体１ｍｌ中の緑膿菌量（ＣＦＵ量）を示す。
【００３５】
［比較例２］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例２と同様に、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量を測定した。結果を図４に示す。
【００３６】
図４から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例２）は、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中のいずれにおいても、投与しなかったマウス（比較例２）より緑膿菌量が顕著に少なかった。
【００３７】
＜皮膚組織中におけるＭＢＤ−１の量の比較＞
［実施例３］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、火傷させてから２時間後に腹腔内投与した。火傷させてから０．５時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後及び２４時間後に、それぞれ火傷部位の周囲から皮膚組織を採取し、これをホモジネートして、ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５に示す。なお、図５のグラフの横軸は、火傷後の時間（時間）を示す。
【００３８】
［比較例３］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例３と同様に、ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図５に示す。
【００３９】
図５から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例３）の方が、投与しなかったマウス（比較例３）よりもＭＢＤ−１の量が多かった。
【００４０】
＜培養細胞ごとのＭＢＤ−１の量の比較＞
［実施例４］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（ＥＫ）を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて２×１０６細胞／ｍｌに調整した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で、前記表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図６に示す。
【００４１】
［比較例４］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４２】
［参考例７］
表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４３】
［参考例８］
表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４４】
［参考例９］
Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４５】
図６から明らかなように、グリチルリチンを共存させた実施例４の方が、共存させなかった比較例４よりもＭＢＤ−１の量が多かった。一方、グリチルリチンは表皮ケラチノサイトに対して、ＭＢＤ−１の産生能促進効果を有していなかった（参考例７及び８）。したがって、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、表皮ケラチノサイトに対してＭＢＤ−１の産生能阻害効果を有するが、グリチルリチンはこの阻害効果を低減する、ＭＢＤ−１産生能復元剤として作用することが確認できた。
【００４６】
＜培養細胞ごとのＭＢＤ−３の量の比較＞
［実施例５］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（ＥＫ）を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて２×１０６細胞／ｍｌに調整した。ＭＢＤ−３を誘導するために、１μｇ／ｍｌ量のリポ多糖（ＬＰＳ）で６時間処理した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で、前記ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−３の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図７に示す。
【００４７】
［比較例５］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００４８】
［参考例１０］
ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００４９】
［参考例１１］
ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００５０】
［参考例１２］
Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００５１】
図７から明らかなように、グリチルリチンを共存させた実施例５の方が、共存させなかった比較例５よりもＭＢＤ−３の量が多かった。一方、グリチルリチンはＬＰＳ処理表皮ケラチノサイトに対して、ＭＢＤ−３の産生能促進効果を有していなかった（参考例１０及び１１）。したがって、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイトに対してＭＢＤ−３の産生能阻害効果を有するが、グリチルリチンはこの阻害効果を低減する、ＭＢＤ−３産生能復元剤として作用することが確認できた。
【００５２】
＜ＭＢＤ−１産生能復元に関するグリチルリチンの用量依存性の確認＞
［実施例６〜９］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を採取した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を採取した。そして、培地としてケラチノサイト培養用培地を使用し、グリチルリチンを１μｇ／ｍｌ量（実施例６）、１０μｇ／ｍｌ量（実施例７）、１００μｇ／ｍｌ量（実施例８）、３００μｇ／ｍｌ量（実施例９）共存させ、前記表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図８の片対数グラフに示す。
【００５３】
［比較例６］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例６〜９と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図８の棒グラフに示す。なお、図８には、前記参考例７及び８の結果もあわせて示す。また、二つのグラフで、縦軸（ＭＢＤ−１の量）を共通化している。
【００５４】
図８から明らかなように、グリチルリチンが１０μｇ／ｍｌ量（実施例７）、１００μｇ／ｍｌ量（実施例８）、３００μｇ／ｍｌ量（実施例９）の場合に、ＭＢＤ−１産生能復元効果が特に優れていることが確認できた。
【００５５】
＜表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能阻害因子の確認（１）＞
［参考例１３〜１５］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。培養開始から４８時間後上清を回収し、上清検体中のＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図９に示す。
次いで、前記培養上清を２．５μｇ／ｍｌ量のＣＣＬ２中和抗体（参考例１３）、ＩＬ−１０中和抗体（参考例１４）、ＣＣＬ２中和抗体とＩＬ−１０中和抗体にて、３７℃で１時間処理した。前記処理済培養上清を、最終濃度が上記培地の１５体積％となるように添加した。この培地を用いて、正常マウスの皮膚組織から分離した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始４８時間後上清を回収し、上清検体中のＭＢＤ−１量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０に示す。
【００５６】
［参考例１６］
ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体のいずれも使用しなかったこと以外は、参考例１３〜１５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図１０に示す。
【００５７】
［参考例１７］
中和抗体に対するイソタイプコントロール抗体を使用して、正常マウスの皮膚から採取した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０に示す。
【００５８】
図１０から明らかなように、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体を共に添加しない場合に、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が最も阻害されることが確認された（参考例１６）。また、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体の少なくとも一方を添加することにより、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が復元することが確認された（参考例１３〜１５）。そして、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体の一方のみを添加した場合（参考例１３及び１４）よりも、両方を添加した場合（参考例１５）の方が、ＭＢＤ−１産生能の復元効果が高いことが確認された。
以上より、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞由来のＣＣＬ２及びＩＬ−１０により、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが示された。
【００５９】
＜表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能阻害因子の確認（２）＞
［参考例１８〜２０］
リコンビナントを使用し、ここに、公知の組み替えＤＮＡ技術で作製したＣＣＬ２（５ｎｇ／ｍｌ）（参考例１８）、ＩＬ−１０（１ｎｇ／ｍｌ）（参考例１９）、ＣＣＬ２（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１０（１ｎｇ／ｍｌ）（参考例２０）の共存下で、正常マウスの皮膚から採取した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に示す。なお、図１１には、上記参考例１７の結果もあわせて示した。
【００６０】
図１１から明らかなように、ＣＣＬ２及びＩＬ−１０の少なくとも一方を添加することにより、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが確認された（参考例１８〜２０）。そして、ＣＣＬ２及びＩＬ−１０の一方のみを添加した場合（参考例１８及び１９）よりも、両方を添加した場合（参考例２０）の方が、ＭＢＤ−１産生能の阻害効果が高いことが確認された。
以上より、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞由来のＣＣＬ２及びＩＬ−１０により、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが示された。
【００６１】
＜グリチルリチンのＣＣＬ２及びＩＬ−１０産生阻害効果の確認＞
［実施例１０］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を採取した。そして、培地としてケラチノサイト培養培地を使用し、グリチルリチンを１０μｇ／ｍｌ量共存させ、前記Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を９６穴プレート内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＣＣＬ２及びＩＬ−１０の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１２及び１３に示す。図１２はＣＣＬ２の量、図１３はＩＬ−１０の量をそれぞれ示す。
【００６２】
［比較例７］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例１０と同様に、培養上清中におけるＣＣＬ２及びＩＬ−１０の量を測定した。結果を図１２及び１３に示す。
【００６３】
図１２及び１３から明らかなように、グリチルリチンは、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のＣＣＬ２及びＩＬ−１０の産生能を共に阻害することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、火傷患者の感染症予防に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症の発症予防に有用な抗菌ペプチドの産生能復元剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の疾病に罹患している患者や外科手術後の患者は、多くの場合、病原菌に対する免疫力が低下している。そして、このような患者は、健常者ではほとんど発症することがない感染症を、容易に発症することが知られている。この場合の感染症は、発症した患者自身の生命を脅かすことはもとより、患者間での感染症の蔓延を招く院内感染の原因ともなり、大きな医療問題となっている。なかでも、近年特に問題となっているのは、黄色ブドウ球菌、腸球菌、緑膿菌等を病原菌とする感染症である。通常、感染症は、抗生物質の投与によって治療され、病原菌の体内でのバランスがコントロールされるが、抗生物質に対して耐性を有する耐性菌の出現によって抗生物質の使用が制限されるようになり、各種感染症における有効な治療法の選択肢が限られ、新たな治療法の確立が強く望まれている。
【０００３】
例えば、火傷患者では、緑膿菌による感染症が頻繁に見られ、健常者では全く問題にならないような非常に僅かな量の緑膿菌によっても、敗血症等を発症することが知られている。
火傷患者における緑膿菌感染症の発症メカニズムについては、マウスを使用したモデルで詳細に解析されている。そして、火傷させたマウスでは、元来皮膚中に存在する抗菌ペプチドの一種であるｍｕｒｉｎｅ ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｃｉｎ １及び３（以下、それぞれＭＢＤ−１、ＭＢＤ−３と略記する）の量が、火傷部位周囲の皮膚中で顕著に減少していることが知られており（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，（１３５４〜１３６２），２００８参照）、これによる免疫力の低下が、緑膿菌感染症の発症原因であると考えられている。ＭＢＤ−１及びＭＢＤ−３は、表皮ケラチノサイトで産生されるが、火傷部位に出現する未熟骨髄性細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞）で産生されるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びケモカインＣＣＬ２の作用により、減少すると考えられている。
【０００４】
このような、抗菌ペプチドの産生量減少が発症原因の一つである感染症も、その他の感染症同様に、従来は抗生物質の投与によって治療を行うのが主流となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記のように、抗生物質の投与は、新たな耐性菌を生む可能性があるという問題点があった。例えば、新規な薬剤耐性の獲得能が高い緑膿菌においては、特にこのような危険性が高い。そして、ほとんどの感染症に対しては、抗生物質の投与に代わる有効な治療法が無いという問題点があった。そこで、抗生物質の投与に代わる、安全性が高く且つ効果が高い、感染症の発症予防法の開発が強く望まれている。例えば、患者自身の病原菌に対する免疫力を健常者並みに回復させることができれば、有望な感染症の発症予防法になると考えられる。そして、抗菌ペプチドの産生量減少が発症原因となる感染症においては、抗菌ペプチドの産生量を健常者並みに向上させることが重要であると考えられる。しかし、このような感染症の発症予防法はこれまでに知られていない。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、抗菌ペプチドの産生量を向上させることができる薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、肝臓疾患やアレルギー疾患の治療薬であり、安全性に定評のあるグリチルリチンが、全く意外にも、マウスにおいて、ＭＢＤ−１及びＭＢＤ−３の産生量を向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、上記課題を解決するため、
本発明の第一実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする抗菌ペプチドの産生能復元剤が提供される。抗菌ペプチドは、ディフェンシン又はカセリシジンであることが好ましい。
【０００９】
本発明の第二実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする日和見感染防御剤が提供される。
本発明の第三実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物の有効量を、抗菌ペプチドの産生能復元を必要とする被検対象に投与することを含む、被検対象における抗菌ペプチドの産生能復元方法が提供される。
本発明の第四実施態様において、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０及びケモカインＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害する化合物の有効量を、日和見感染防御を必要とする被検対象に投与することを含む、被検対象における日和見感染防御方法が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、抗菌ペプチドの産生量を向上させることができ、感染症の発症を予防できる。また、新たな耐性菌を生む危険性が低く、しかも安全性が高い感染症の発症予防法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１及び比較例１におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図２】参考例１〜３におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図３】参考例４〜６におけるマウスの生存率を示すグラフである。
【図４】実施例２及び比較例２における、マウスの血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量を示すグラフである。
【図５】実施例３及び比較例３における、マウスの皮膚組織ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図６】実施例４、比較例４及び参考例７〜９における、マウスの表皮ケラチノサイト及び／又はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図７】実施例５、比較例５及び参考例１０〜１２における、マウスのＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト及び／又はＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を示すグラフである。
【図８】実施例６〜９、比較例６及び参考例７〜８における、マウスの表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中、あるいはマウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図９】参考例１３〜１５における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の量を示すグラフである。
【図１０】参考例１３〜１７における、マウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図１１】参考例１７及び参考例１８〜２０における、マウスの表皮ケラチノサイトの培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を示すグラフである。
【図１２】実施例１０及び比較例７における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＣＣＬ２の量を示すグラフである。
【図１３】実施例１０及び比較例７における、マウスのＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の培養上清中におけるＩＬ−１０の量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗菌ペプチドの産生能復元剤（以下、復元剤と略記する）は、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなり、インターロイキン−１０（以下、ＩＬ−１０と略記する）及びケモカインＣＣＬ２（以下、ＣＣＬ２と略記する）の少なくとも一方の産生を阻害する化合物を有効成分とする。
本発明の復元剤は、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の少なくとも一方を産生する細胞に作用して、これらの産生能を阻害することで、抗菌ペプチドの産生能を復元すると考えられる。
【００１３】
本発明の復元剤が産生能を復元できる抗菌ペプチドは、ＩＬ−１０又はＣＣＬ２により産生が阻害されるものである。なかでも、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン等のディフェンシン及びカセリシジンが好適である。β−ディフェンシンとしては、ヒトβ−ディフェンシン−１（ＨＢＤ−１）、ヒトβ−ディフェンシン−２（ＨＢＤ−２）、ヒトβ−ディフェンシン−３（ＨＢＤ−３）、ヒトβ−ディフェンシン−４（ＨＢＤ−４）等のヒトβ−ディフェンシン（ＨＢＤ）が好適である。α−ディフェンシンとしては、ヒト好中球ディフェンシン−１（ＨＮＰ−１）、ヒト好中球ディフェンシン−２（ＨＮＰ−２）、ヒト好中球ディフェンシン−３（ＨＮＰ−３）等のヒト好中球ディフェンシン（ＨＮＰ）が好適である。カセリシジンとしてはカセリシジン抗菌ペプチド−１８（ＣＡＰ−１８）が好適である。
【００１４】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、例えば、甘草から抽出することにより得られるが、市販品を使用しても良い。市販品としては、株式会社ミノファーゲン製薬製のものが好適である。
【００１５】
グリチルリチンの薬学上許容される塩としては、グリチルリチンと無機あるいは有機塩基とを、一定のモル比で作用させて得られるものが例示できる。好ましいものとして具体的には、グリチルリチンモノアンモニウム塩、グリチルリチンジアンモニウム塩等のアンモニウム塩；グリチルリチンモノナトリウム塩、グリチルリチンジナトリウム塩、グリチルリチンモノカリウム塩、グリチルリチンジカリウム塩等のアルカリ金属塩；グリチルリチンコリン塩；グリチルリチンカルシウム塩；グリチルリチンマグネシウム塩；グリチルリチンアルミニウム塩等が例示できる。これらの中でも、グリチルリチンモノアンモニウム塩が特に好ましい。
【００１６】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、単独で使用しても良く、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率は、目的に応じて適宜調整すれば良い。
【００１７】
本発明の復元剤の製剤形態は特に限定されず、目的に応じて錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤（水薬等）等の経口剤；吸入剤、坐剤、注射剤等の非経口剤等から適宜選択すれば良い。これら製剤形態の復元剤は、いずれも公知の方法で製造できる。
【００１８】
経口剤等の製剤形態とする場合には、これら製剤の製造に通常使用される賦形剤、滑沢剤、可塑剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、矯味剤、着色剤、香料、緩衝剤等を配合しても良い。
【００１９】
前記賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、果糖、デキストリン、デンプン、食塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、無水ケイ酸、カオリン等が例示できる。
【００２０】
前記滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、タルク、トウモロコシデンプン、マクロゴール等が例示できる。
【００２１】
前記可塑剤としては、ポリエチレングリコ−ル、プロピレングリコ−ル、グリセリン類、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、アセチルグリセリン脂肪酸エステル、クエン酸トリエチル等が例示できる。
【００２２】
前記結合剤としては、ゼラチン、アラビアゴム、セルロースエステル、ポリビニルピロリドン、水飴、甘草エキス、トラガント、単シロップ、ゼラチン等が例示できる。
前記崩壊剤としては、デンプン、カンテン、カルメロ−スカルシウム、カルメロ−ス、結晶セルロ−ス等が例示できる。
前記湿潤剤としては、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロ−ス、カルメロ−スナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロ−ス等が挙げられる。
【００２３】
前記矯味剤としては、白糖、ハチミツ、サッカリンナトリウム、ハッカ、ユ−カリ油、ケイヒ油等が例示できる。
前記着色剤としては、酸化鉄、β−カロチン、クロロフィル、水溶性食用タ−ル色素等が例示できる。
前記香料としては、レモン油、オレンジ油、ｄｌ−又はl−メント−ル等が例示できる。
【００２４】
吸入剤、注射剤等、非経口剤の製剤形態とする場合には、使用できる溶媒として、注射用蒸留水、無菌の非水性溶媒、懸濁剤等が例示できる。非水性の溶媒又は懸濁剤の基剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、オリーブ油、コーン油、オレイン酸エチル等が好ましいものとして例示できる。
【００２５】
本発明の復元剤には、本発明の効果を妨げない範囲内で、上記成分以外の薬学上許容される任意成分を、必要に応じて適宜配合しても良い。
前記任意成分としては、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤等が例示できる。
【００２６】
本発明の復元剤の投与方法は、経口投与及び非経口投与のいずれでも良い。
復元剤の投与量は、患者の年齢、症状等により適宜異なるが、経口投与の場合は通常、成人一人一日あたり、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩の量として、５０〜 ３０００ｍｇ／人であることが好ましく、３００〜２５００ｍｇ／人であることがより好ましい。また、非経口の場合は通常、成人一人一日あたり、グリチルリチン又はその薬学上許容される塩の量として、２５〜２５００ｍｇ／人であることが好ましく、１５０〜２０００ｍｇ／人であることがより好ましい。
本発明の復元剤は、所定量を一日に一回又は複数回に分けて投与する。
【００２７】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩は、肝臓疾患やアレルギー疾患の治療薬として長年の使用実績があり、その安全性の高さに定評がある。本発明の復元剤は、このようなグリチルリチン又はその薬学上許容される塩からなるので、高い安全性を有する。さらに、抗菌ペプチドの産生能を復元するという、生体が本来有している機能を強化する作用を有するものであり、新たな耐性菌を生む危険性も低い。このように、本発明の復元剤は、安全性が高い感染症の発症予防法を提供するものである。
本発明の復元剤は、火傷患者への適用が好適であるが、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２の少なくとも一方の産生を阻害することで、抗菌ペプチドの産生能を復元する限り、適用対象は火傷患者に限定されるものではなく、感染症の発症予防が必要なあらゆる患者を適用対象とすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、具体的に実施例を挙げ、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００２９】
＜緑膿菌投与マウスの生存率の比較＞
［実施例１］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に１００ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Fｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ）量の緑膿菌を塗布した。次いで、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、火傷させてから２時間後、２４時間後及び７２時間後にそれぞれ腹腔内に投与し、マウスの生死を確認した。同様の操作を１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図１に示す。なお、図１のグラフの横軸は、緑膿菌感染後の日数（日）を示す。
【００３０】
［比較例１］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例１と同様に、マウスの生存率を確認した。結果を図１に示す。
【００３１】
図１から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例１）は、７日後まで死亡した個体が無く、投与しなかったマウス（比較例１）よりも、２日後以降の生存率が顕著に高かった。
【００３２】
［参考例１〜３］
正常マウスの背部に、マウス一匹あたり１０６ＣＦＵ量（参考例１）、１０７ＣＦＵ量（参考例２）、１０８ＣＦＵ量（参考例３）の緑膿菌をそれぞれ感染させ、マウスの生死を確認した。同様の操作を一区分あたり１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図２に示す。なお、図２のグラフの横軸は、感染（緑膿菌塗布）後の日数（日）を示す。
図２から明らかなように、緑膿菌投与量が多いほど、マウスの生存率が低くなった。
【００３３】
［参考例４〜６］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に、マウス一匹あたり５０ＣＦＵ量（参考例４）、１０３ＣＦＵ量（参考例５）、１０４ＣＦＵ量（参考例６）の緑膿菌を、それぞれ皮内感染させ、マウスの生死を確認した。同様の操作を一区分あたり１０匹のマウスに対して行い、マウスの生存率を確認した。結果を図３に示す。なお、図３のグラフの横軸は、緑膿菌感染後の時間的経過（日数）を示す。
図３から明らかなように、参考例１〜３よりも少ない緑膿菌投与量で、緑膿菌感染が多いほどマウスの生存率が低くなった。
【００３４】
＜緑膿菌感染マウスの検体中における緑膿菌量の比較＞
［実施例２］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、該火傷部位に１００ＣＦＵ量の緑膿菌を感染させた。次いで、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、緑膿菌感染から２時間後及び１２時間後にそれぞれ腹腔内に投与した。次いで、緑膿菌感染から４８時間後に、マウスから血液及び脾臓を採取し、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量をｃｏｌｏｎｙ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ法で測定した。結果を図４に示す。なお、図４のグラフの縦軸は、検体１ｍｌ中の緑膿菌量（ＣＦＵ量）を示す。
【００３５】
［比較例２］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例２と同様に、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中の緑膿菌量を測定した。結果を図４に示す。
【００３６】
図４から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例２）は、血液検体中及び脾臓ホモジネート検体中のいずれにおいても、投与しなかったマウス（比較例２）より緑膿菌量が顕著に少なかった。
【００３７】
＜皮膚組織中におけるＭＢＤ−１の量の比較＞
［実施例３］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ量（１０ｍｇ／ｋｇ量）のグリチルリチンを、火傷させてから２時間後に腹腔内投与した。火傷させてから０．５時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後及び２４時間後に、それぞれ火傷部位の周囲から皮膚組織を採取し、これをホモジネートして、ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５に示す。なお、図５のグラフの横軸は、火傷後の時間（時間）を示す。
【００３８】
［比較例３］
グリチルリチンに代わり生理食塩水を腹腔内投与したこと以外は、実施例３と同様に、ホモジネート液中のＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図５に示す。
【００３９】
図５から明らかなように、グリチルリチンを投与したマウス（実施例３）の方が、投与しなかったマウス（比較例３）よりもＭＢＤ−１の量が多かった。
【００４０】
＜培養細胞ごとのＭＢＤ−１の量の比較＞
［実施例４］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（ＥＫ）を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて２×１０６細胞／ｍｌに調整した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で、前記表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図６に示す。
【００４１】
［比較例４］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４２】
［参考例７］
表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４３】
［参考例８］
表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４４】
［参考例９］
Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例４と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図６に示す。
【００４５】
図６から明らかなように、グリチルリチンを共存させた実施例４の方が、共存させなかった比較例４よりもＭＢＤ−１の量が多かった。一方、グリチルリチンは表皮ケラチノサイトに対して、ＭＢＤ−１の産生能促進効果を有していなかった（参考例７及び８）。したがって、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、表皮ケラチノサイトに対してＭＢＤ−１の産生能阻害効果を有するが、グリチルリチンはこの阻害効果を低減する、ＭＢＤ−１産生能復元剤として作用することが確認できた。
【００４６】
＜培養細胞ごとのＭＢＤ−３の量の比較＞
［実施例５］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（ＥＫ）を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて２×１０６細胞／ｍｌに調整した。ＭＢＤ−３を誘導するために、１μｇ／ｍｌ量のリポ多糖（ＬＰＳ）で６時間処理した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で、前記ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−３の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図７に示す。
【００４７】
［比較例５］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００４８】
［参考例１０］
ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００４９】
［参考例１１］
ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）のみを、１０μｇ／ｍｌ量のグリチルリチン共存下で培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００５０】
［参考例１２］
Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）のみを、グリチルリチンを共存させずに培養したこと以外は、実施例５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−３の量を測定した。結果を図７に示す。
【００５１】
図７から明らかなように、グリチルリチンを共存させた実施例５の方が、共存させなかった比較例５よりもＭＢＤ−３の量が多かった。一方、グリチルリチンはＬＰＳ処理表皮ケラチノサイトに対して、ＭＢＤ−３の産生能促進効果を有していなかった（参考例１０及び１１）。したがって、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞は、ＬＰＳ処理表皮ケラチノサイトに対してＭＢＤ−３の産生能阻害効果を有するが、グリチルリチンはこの阻害効果を低減する、ＭＢＤ−３産生能復元剤として作用することが確認できた。
【００５２】
＜ＭＢＤ−１産生能復元に関するグリチルリチンの用量依存性の確認＞
［実施例６〜９］
正常マウスの皮膚から表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を採取した。また、正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を採取した。そして、培地としてケラチノサイト培養用培地を使用し、グリチルリチンを１μｇ／ｍｌ量（実施例６）、１０μｇ／ｍｌ量（実施例７）、１００μｇ／ｍｌ量（実施例８）、３００μｇ／ｍｌ量（実施例９）共存させ、前記表皮ケラチノサイト及びＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を同一のトランスウェル内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図８の片対数グラフに示す。
【００５３】
［比較例６］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例６〜９と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図８の棒グラフに示す。なお、図８には、前記参考例７及び８の結果もあわせて示す。また、二つのグラフで、縦軸（ＭＢＤ−１の量）を共通化している。
【００５４】
図８から明らかなように、グリチルリチンが１０μｇ／ｍｌ量（実施例７）、１００μｇ／ｍｌ量（実施例８）、３００μｇ／ｍｌ量（実施例９）の場合に、ＭＢＤ−１産生能復元効果が特に優れていることが確認できた。
【００５５】
＜表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能阻害因子の確認（１）＞
［参考例１３〜１５］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を採取し、１０％非働化牛胎児血清加ＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０５細胞／ｍｌに調整した。培養開始から４８時間後上清を回収し、上清検体中のＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０及びＣＣＬ２量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図９に示す。
次いで、前記培養上清を２．５μｇ／ｍｌ量のＣＣＬ２中和抗体（参考例１３）、ＩＬ−１０中和抗体（参考例１４）、ＣＣＬ２中和抗体とＩＬ−１０中和抗体にて、３７℃で１時間処理した。前記処理済培養上清を、最終濃度が上記培地の１５体積％となるように添加した。この培地を用いて、正常マウスの皮膚組織から分離した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始４８時間後上清を回収し、上清検体中のＭＢＤ−１量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０に示す。
【００５６】
［参考例１６］
ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体のいずれも使用しなかったこと以外は、参考例１３〜１５と同様に、培養上清中におけるＭＢＤ−１の量を測定した。結果を図１０に示す。
【００５７】
［参考例１７］
中和抗体に対するイソタイプコントロール抗体を使用して、正常マウスの皮膚から採取した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１０に示す。
【００５８】
図１０から明らかなように、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体を共に添加しない場合に、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が最も阻害されることが確認された（参考例１６）。また、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体の少なくとも一方を添加することにより、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が復元することが確認された（参考例１３〜１５）。そして、ＣＣＬ２中和抗体及びＩＬ−１０中和抗体の一方のみを添加した場合（参考例１３及び１４）よりも、両方を添加した場合（参考例１５）の方が、ＭＢＤ−１産生能の復元効果が高いことが確認された。
以上より、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞由来のＣＣＬ２及びＩＬ−１０により、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが示された。
【００５９】
＜表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能阻害因子の確認（２）＞
［参考例１８〜２０］
リコンビナントを使用し、ここに、公知の組み替えＤＮＡ技術で作製したＣＣＬ２（５ｎｇ／ｍｌ）（参考例１８）、ＩＬ−１０（１ｎｇ／ｍｌ）（参考例１９）、ＣＣＬ２（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１０（１ｎｇ／ｍｌ）（参考例２０）の共存下で、正常マウスの皮膚から採取した表皮ケラチノサイト（２×１０６細胞／ｍｌ）を３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＭＢＤ−１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に示す。なお、図１１には、上記参考例１７の結果もあわせて示した。
【００６０】
図１１から明らかなように、ＣＣＬ２及びＩＬ−１０の少なくとも一方を添加することにより、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが確認された（参考例１８〜２０）。そして、ＣＣＬ２及びＩＬ−１０の一方のみを添加した場合（参考例１８及び１９）よりも、両方を添加した場合（参考例２０）の方が、ＭＢＤ−１産生能の阻害効果が高いことが確認された。
以上より、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞由来のＣＣＬ２及びＩＬ−１０により、表皮ケラチノサイトのＭＢＤ−１産生能が阻害されることが示された。
【００６１】
＜グリチルリチンのＣＣＬ２及びＩＬ−１０産生阻害効果の確認＞
［実施例１０］
正常マウスの背部に火傷を生じさせ、１２時間後に該火傷部位の周囲の皮膚組織からＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）を採取した。そして、培地としてケラチノサイト培養培地を使用し、グリチルリチンを１０μｇ／ｍｌ量共存させ、前記Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞を９６穴プレート内で３７℃にて培養した。培養開始から４８時間後の培養上清中におけるＣＣＬ２及びＩＬ−１０の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１２及び１３に示す。図１２はＣＣＬ２の量、図１３はＩＬ−１０の量をそれぞれ示す。
【００６２】
［比較例７］
グリチルリチンを共存させなかったこと以外は、実施例１０と同様に、培養上清中におけるＣＣＬ２及びＩＬ−１０の量を測定した。結果を図１２及び１３に示す。
【００６３】
図１２及び１３から明らかなように、グリチルリチンは、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のＣＣＬ２及びＩＬ−１０の産生能を共に阻害することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、火傷患者の感染症予防に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドがディフェンシン又はカセリシジンである請求項１に記載の抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項３】
錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤、吸入剤、坐剤及び注射剤から選択される形態である請求項１に記載の抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項４】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする日和見感染防御剤。
【請求項５】
抗菌ペプチドの産生能復元剤の製造のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩の使用。
【請求項６】
日和見感染防御剤の製造のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩の使用。
【請求項７】
抗菌ペプチドの産生能復元剤への使用のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩。
【請求項８】
日和見感染防御剤への使用のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩。
【請求項１】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドがディフェンシン又はカセリシジンである請求項１に記載の抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項３】
錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、細粒剤、液剤、吸入剤、坐剤及び注射剤から選択される形態である請求項１に記載の抗菌ペプチドの産生能復元剤。
【請求項４】
グリチルリチン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする日和見感染防御剤。
【請求項５】
抗菌ペプチドの産生能復元剤の製造のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩の使用。
【請求項６】
日和見感染防御剤の製造のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩の使用。
【請求項７】
抗菌ペプチドの産生能復元剤への使用のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩。
【請求項８】
日和見感染防御剤への使用のためのグリチルリチン又はその薬学上許容される塩。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５３２８３１（Ｐ２０１２−５３２８３１Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１０５１（Ｐ２０１２−５０１０５１）
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６２０１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４９１０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６２０１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４９１０
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（０００１７０３５８）株式会社ミノファーゲン製薬 (16)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]