抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤
【課題】活性酸素（フリーラジカル）による皮膚老化や皮膚疾患を防止・抑制する優れたフリーラジカル捕捉能を有し、かつ優れたコラーゲン産生促進作用を有する新しい植物由来の抗酸化剤、コラーゲン産生促進剤を提供する。
【解決手段】シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むものとする。
【解決手段】シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むものとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤に関し、より詳しくは、植物抽出物を有効成分として含む抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外線により活性酸素が発生することは周知である。活性酸素のうち、フリーラジカル型のものは脂質などの酸化性基質と反応すると、連鎖的な酸化反応を誘発する。したがって、フリーラジカルとなる活性酸素は、皮膚等の身体組織に対するダメージを増幅する。
【０００３】
皮膚は、常時、酸素や紫外線にさらされるため、フリーラジカルによる酸化ストレスのダメージが最も大きな組織である。近年では、紫外線により発生した種々の活性酸素が、皮脂や脂質の過酸化、蛋白変性、酵素阻害等を引き起こし、それが、短期的には皮膚の炎症などを誘発する。また、長期的には、老化やガンなどの原因となると考えられている。
【０００４】
また、活性酸素や過酸化脂質は、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎、乾癬などの皮膚疾患にも関与すると考えられている。このように、皮膚老化や皮膚疾患には、活性酸素（フリーラジカルやＯ2-）が深く関与している。
【０００５】
フリーラジカルやＯ2-を捕捉する能力を備える物質は、ラジカル連鎖反応を抑制したり、停止させたりすることができ、例えば抗酸化剤と呼ばれているものが相当する。
したがって、抗酸化剤を配合した皮膚外用剤は、光酸化ストレスによる皮膚老化（例えば、シミ、しわ、たるみなど）の予防・改善効果が期待できる。また、フリーラジカルが関連する各種皮膚疾患用皮膚外用剤としても、予防・改善効果が期待できる。
【０００６】
酸化防止剤として知られているビタミンＥやビタミンＣは、生体内におけるフリーラジカル捕捉型抗酸化物質である。また、ＢＨＴやＢＨＡの合成抗酸化物質も知られている。また、植物由来の酸化防止剤としては、シイタケ、エノキタケ、シメジ、カワラタケ、マツタケ、マンネンタケ、ホウウロクタケ、ナメコ、その他の担子菌類の抽出物が報告されている（特許文献１〜３）。さらに、ゴマノハグサ科モウズイカ属植物の抽出物からなる抗酸化剤や（特許文献４）、ムラサキ科カキバチシャノキ属植物の抽出物からなる抗酸化剤（特許文献５）が報告されている。
【０００７】
一方、皮膚は外側から角層、表皮層、基底膜及び真皮より構成されており、真皮はその中でも最も領域の広い部分である。膠原線維、弾性線維、糖タンパク質、プロテオグリカンが複合的に三次元状に広がった不均一の構造をしており、それぞれの構造物は液相を保有したゲル状態にある。膠原線維は主にコラーゲンからなり、その中でもＩ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンのほかにはIII、IV、VII、IX及びXII型コラーゲンの存在が知られている。老化皮膚に見られるしわ・たるみの発生は、外見上の加齢変化の主たるものであり、多くの中高年齢者にとって切実な問題となっている。しわ・たるみの成因の一つは、皮膚組織が加齢に伴ない菲薄化することによる。老化した皮膚において、真皮の主要なマトリックス成分であるI 型コラーゲン線維の減少が著しく、このことが皮膚の厚さが減少する主たる原因となっている可能性が高い。
従って、Ｉ型コラーゲンの産生を促進させてＩ型コラーゲン量を維持することが、しわ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。また、さらにＩ型、III型コラーゲンの産生促進は皮膚の創傷治癒の改善にも有効である。
【０００８】
従来、Ｉ型、III型コラーゲンの産生を促進させることで皮膚の加齢変化を予防・改善する天然物由来の成分としては、例えば、ダイゼイン、ダイズジン、ゲニスタイン、およびゲニスチンから選ばれるイソフラボン化合物、フィトステロールや（特許文献６参照）、特定の植物プランクトンの抽出物（特許文献７参照）が報告されている。
【０００９】
また、特許文献８には、保湿作用を有する植物抽出物の一つとしてミカエリソウの抽出物が挙げられている。本発明はミカエリソウ抽出物による抗酸化作用やＩ型コラーゲン産生促進作用に関するものであるが、特許文献８の記載と本発明の内容とは全く異なるものである。
即ち、特許文献８の保湿効果は水分残存率（％）で評価したものであるが、乾燥によるしわは、肌に潤いを補う保湿剤によって改善することができ、多くの化粧品に配合されてきた。一方、加齢に伴う新陳代謝の低下によってできるしわ（縮緬様のしわ）は、主に真皮線維芽細胞のコラーゲン産生量の低下によっておこるものだからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３１７０１６号公報
【特許文献２】特開平６−６５５７５号公報
【特許文献３】特開昭５９−１２４９８４号公報
【特許文献４】特開平１１−１７１７２３号公報
【特許文献５】特開平１１−１７１７２０号公報
【特許文献６】特開２００１−３９８４９号公報
【特許文献７】特開２００７−１８６４７１号公報
【特許文献８】特開２００４−３２３４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のようなことから、植物由来の抗酸化剤、コラーゲン産生促進剤について、新たな抗酸化効果、コラーゲン産生促進効果を奏する植物を見出すことが求められている。
本発明はこのような従来の事情に対処してなされたもので、優れた抗酸化作用やコラーゲン産生促進作用を有する新しい植物由来の抗酸化剤、コラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、このような現状に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、従来効果のあることが知られていなかった特定の植物抽出物に優れた抗酸化作用およびコラーゲン産生促進作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とする抗酸化剤である。
【００１４】
本発明は、シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を有しており、活性酸素（フリーラジカルやＯ2-）による皮膚老化や皮膚疾患を防止・抑制する優れたフリーラジカル捕捉能を有するものである。
【００１６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生を促進する効果に優れ、かつ安全なものである。よって本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、コラーゲンの産生を促進して、コラーゲン量を維持することができ、しわ・たるみの予防・改善及び皮膚創傷治癒を促進し、コラーゲン不足に起因する種々の症状の改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明によるミカエリソウ抽出物のＳＯＤ様活性の結果を示す図である。
【図２】本発明によるミカエリソウ抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性の結果を示す図である。
【図３】本発明によるミカエリソウ抽出物のコラーゲン産生促進活性の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
本発明で用いられる植物であるミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.)は見返り草とも表記される。シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）に属する植物であり、日本の主に本州の山地に群生する落葉小高木である。
【００１９】
本発明の植物抽出物に、抗酸化作用やコラーゲン産生促進作用があるという報告はこれまでになく、いずれも本発明者らによって初めて見出されたものである。
【００２０】
本発明に用いられるミカエリソウの抽出物は、葉、茎、または全草を適宜、そのまま、乾燥あるいは粉砕した後、溶媒にて抽出することにより得られる。抽出は室温静置で行っても良いが、必要に応じて加温、攪拌、加熱還流により抽出を促進することが可能である。得られた抽出液は、そのまま、あるいは適宜濾過・濃縮・脱色などの処理を施して用いることが出来る。また、一旦溶媒を除去した後に、抽出に用いた溶媒とは異なる溶媒に再溶解して用いることも可能である。得られた抽出物を活性炭やカラムマトグラフィーなどによりさらに精製して用いることも可能である。
【００２１】
本発明に用いられる抽出溶媒は、通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール等のアルコール類、含水エタノールや含水メタノールのような含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル、クロロホルム等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができるが、特に含水エタノール(例えば５０％エタノール)が好ましい。
また、これらの抽出物を溶媒分画や活性炭処理やカラムクロマトグラフィーなどにより精製して用いても良い。
【００２２】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤はミカエリソウの抽出物を含むことを特徴とするが、本発明の効果を損なわない範囲において他の種々の成分を含有することが出来る。
【００２３】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤は、皮膚外用基剤に配合して、抗酸化作用およびコラーゲン産生促進作用に基づく皮膚外用剤とすることができる。これらの皮膚外用剤は、特に化粧料、医薬品、医薬部外品等の分野において好適に用いることができる。
【００２４】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤における植物抽出物の配合量は、ミカエリソウ抽出物成分の乾燥残分として、通常０．１ｐｐｍ以上、好ましくは１ｐｐｍ以上である。配合量が少なすぎると効果が十分に発揮されない。上限は本発明の効果を損なわない範囲において特に限定されないが、過剰に配合しても増量に見合った顕著な効果が得られないこと、また、製剤設計や使用性などにおいて悪影響を及ぼすこともあることなどから、通常１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。
【００２５】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤は、本発明による抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を皮膚外用基剤に配合して製造される。皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、植物エキス類、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２６】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、アルコキシサリチル酸および／またはその塩類等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
【実施例】
【００２８】
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれによりなんら限定されるものではない。配合量は特記しない限り質量％で示す。
最初に、本実施例で用いた植物抽出物の調製方法、抗酸化効果（活性酸素消去効果およびラジカル消去効果）、コラーゲン産生促進効果に関する試験方法とその結果について説明する。
【００２９】
１．試料の調製
（製造例１）
ミカエリソウ（見返り草）の葉と茎の乾燥粉砕物１２ｇに５０％エタノールを１０倍量加えて室温にて１週間かけて抽出後、４℃にて１晩放置し、ろ過後不溶物を取り除いた。得られたろ過液を５０％エタノールエキスと呼び、さらに凍結乾燥して得られた固形物を５０％エタノールエキス乾固物と呼び、２．５ｇ（収率；２１％）を得た。
（製造例２）
ミカエリソウ（見返り草）の葉と茎の乾燥粉砕物１２ｇにメタノールを１０倍量加えて室温にて１週間かけて抽出後、４℃にて１晩放置し、ろ過後不溶物を取り除いた。得られたろ過液をメタノールエキスと呼び、さらに凍結乾燥して得られた固形物をメタノールエキス乾固物と呼び、２．０ｇ（収率；１６％）を得た。
【００３０】
２．活性酸素消去作用（ＳＯＤ；スーパーオキシドディスムターゼ様活性）の測定法およびその結果
（１）原理
本酵素（ＳＯＤ）は皮膚の老化（シワの発生、老人性色素斑など）を加速させる原因であるといわれる活性酸素の１つであるスーパーオキサイドアニオンＯ2-を過酸化水素と酸素に分解する酵素である。すなわちスーパーオキサイドアニオンの検出方法としてニトロブルートエラゾリウムを用い、その減少について還元呈色反応を利用して阻害率を求めることで被験成分のＳＯＤ様活性とする。詳細について以下記載する。
【００３１】
（２）手順
発色試薬は、ニトロブルーテトラゾリウム（０．２４nmol/l），キサンチン０．４mmol/lを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、酵素原液としてはキサンチンオキシダーゼ（Butter milk由来）０．０４９単位／ｍｌを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して用いた。ブランク液は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い、反応停止液はドデシル硫酸ナトリウム（６９０mmol/l）を用いた。
操作手順は製造例により得られたエキス乾固物を２０％ＤＩＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）溶液にてそれぞれの濃度に希釈後、９６穴プレートに１０μlづつ分取し発色試薬１００μlを添加し混和した。本検には酵素液を、盲検にはブランク液をそれぞれ１００μlづつ添加し、３７℃で２８分間正確に加温した後、反応停止液２０μｌ添加することで反応を止めた。測定はプレートリーダーを用い吸光度５６０nmにて実施した。なお検体数は１群ｎ＝４（穴）で実施した。
【００３２】
（３）計算方法
ＳＯＤ様活性は、以下の式にあてはめて算出した。
ＳＯＤ様活性（阻害率％）＝((Ebl-(Ebl-bl))−(Es-(Es-bl)))／( Ebl-(Ebl-bl))＊100
＝1-(Es-(Es-bl))／(Ebl-(Ebl-bl))＊100
Ebl；試験試料を除いた溶液に酵素液を加えた溶液の波長５６０nmの吸光度
(Ebl-bl)；試験試料を除いた溶液に酵素液を除いた溶液の波長５６０nmの吸光度
Es；試験試料の溶液に、酵素液を加えた溶液の波長５６０nmの吸光度
(Es-bl)；試験試料の溶液に酵素液を除いた溶液の５６０nmの吸光度
【００３３】
（４）結果
結果を図１に示す。図１（ａ）は、製造例２で調製したメタノールエキス乾固物のＳＯＤ様活性を示す図であり、図１（ｂ）は、製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物のＳＯＤ様活性を示す図である。
図１（ａ）（ｂ）から、ミカエリソウ抽出物のＳＯＤ様活性は、５０％エタノールエキス乾固物、メタノールエキス乾固物において活性を有することが明らかとなった。
【００３４】
３．ラジカル消去作用（ＤＰＰＨ；ラジカル消去試験法）の測定法およびその結果
（１）原理
ＤＰＰＨラジカルは可視域（５１７nm）に吸収波長を持ち、かつ還元されると吸収波長がなくなることを利用し、被験物質のラジカル消去能を吸光度の低下から評価する。
【００３５】
（２）手順
１mM ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，Ｍｗ;394.32）の保存液をＤＩＭＳＯ（Dimethyl sulfozide）を用いて調製し、使用時に０．１mM ＤＰＰＨ溶液に希釈して評価に供した。試験試料は２０％ＤＩＭＳＯ溶液にて希釈し、１０μｌづつｎ＝４（穴）として９６穴プレートに分注し、直ちに０．１mM ＤＰＰＨ ９０μｌを添加後、室温にて１０分間ゆっくり攪拌しながら反応させた。測定はプレートリーダーを用い、５１７nmの吸光度を測定しラジカル消去能を評価した。
【００３６】
（３）計算方法
ラジカル消去活性は、以下の式にあてはめて算出した。
ラジカル消去率（％）＝((Ｃt-Cb)-(St-Sb))／(Cｔ-Cb)＊100
＝１−（St-Sb）／(Cｔ-Cb))＊100
Ｃｔ；試験試料を除いた溶液にＤＰＰＨを加えた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｃｂ；試験試料を除いた溶液にＤＰＰＨを除いた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｓｔ；試験試料の溶液にＤＰＰＨを加えた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｓｂ；試験試料の溶液にＤＰＰＨを除いた溶液の波長５１７nmの吸光度
【００３７】
（４）結果
結果を図２に示す。図２の■は、製造例２で調製したメタノールエキス乾固物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示す図であり、図２の□は、製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示す図である。
図２から分かるように、ミカエリソウの５０％エタノールエキス乾固物の溶液およびメタノールエキス乾固物の溶液のＤＰＰＨ活性は、無添加群と比較し有意な活性が認められた。
【００３８】
４．線維芽細胞のコラーゲン産生促進作用の試験法およびその結果
（１）手順
ヒト皮膚由来の線維芽細胞HF0(K)P=8.5を４００万個培養し、１０万個／穴で２４穴に播種し、０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥで培養した。翌日試験試料であるメタノールエキス乾固物または５０％エタノールエキス乾固物の濃度が１０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍとなるように添加するとともに、０．２５mMとなるようアスコルビン酸リン酸マグネシウムを添加し、次に血清濃度が０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭとなるよう調製した。正対照としてはＴＧＦ−β（２ng/μl）を用いた。３日間培養後、培養上清の総コラーゲン量を測定した。培養上清中に分泌されたＩ型コラーゲンの量は酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。すなわち抗ＰＩＰモノクローナル抗体プレートに標準抗体液を１００μｌづつ加え、あらかじめ調製した標準液は培養上清中の２０μｌずつ添加し、３７℃で３時間反応した。反応液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄後、基質溶液（3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン溶液）を１００μｌずつ加えて室温で１５分間反応させ、抗体プレート・ＰＩＰ抗原・標準抗体の結合体をつくった。次に１Ｎ硫酸を溶解した反応停止液を１００μｌ加えよく攪拌し反応をとめた。蒸留水を対照として４５０nmでマイクロプレートリーダーにて４０５nmの吸光度を測定し、Ｉ型コラーゲン量を算出した。またコラーゲン産生促進作用（Ｉ型コラーゲン量／細胞数）を評価するために細胞数の測定を行った。以下に細胞数測定法を記載する。
【００３９】
（２）細胞数測定法
（２−１）手順
試験試料の添加３日後に培地を吸引除去し、５％ＦＢＳで洗浄後、６０μlのHoechstを１２mlのHoechst培地に加えて攪拌し、その５００μlを６ウェルプレートに添加した。３７℃で１時間反応させた後、９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（励起波長３５５nm、測定波長４６０nm）を用いて細胞数を算出した。
【００４０】
（２−２）計算方法
コラーゲン産生促進作用は、以下の式を用いて算出した。
コラーゲン産生促進率（％）＝（試験試料を添加した細胞が産生するＩ型コラーゲン量／試験試料を添加した群の細胞数）÷（試験試料を添加していない細胞が産生するＩ型コラーゲン量／試験試料を添加していない群の細胞数）×１００
なお細胞毒性によるコラーゲン産生量の増加を排除するために、細胞増殖率が２０％に満たない細胞毒性が高い群は、コラーゲン産生促進データから外すこととした。
【００４１】
（３）結果
結果を図３に示す。図３は製造例２で調製したメタノールエキス乾固物の溶液と製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物の溶液のコラーゲン産生促進作用を示す図である。
ミカエリソウのメタノールエキス乾固物および５０％エタノールエキス乾固物のコラーゲン産生促進作用は、５０％エタノール乾固物の方がメタノール乾固物と比較して高く、５０％エタノール乾固物は添加濃度１０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍにおいて無添加と比較し、有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００４２】
以上の結果から本発明のミカエリソウ抽出物は優れた抗酸化効果およびコラーゲン産生促進効果を示すことから、ヒトの肌に対してもすぐれた抗酸化作用、コラーゲン産生促進作用を奏するものである。したがって、該植物抽出物を外用剤に配合して、肌の老化を防ぎ、若々しく健康な肌の状態を維持する抗老化剤や各種皮膚疾患治療剤として用いることができる。
【００４３】
以下に、種々の剤型の本発明による抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤の配合例を処方例として説明する。本発明はこの処方例によって何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲によって特定されるものであることはいうまでもない。
各処方中のミカエリソウ抽出物含量は抽出溶媒を除去した後の乾燥残分量として表した。
【００４４】
配合処方例１（化粧水） 質量％
トリメチルグリシン １．０
本坑酸化剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス乾固物 ０．０００１
グリセリン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
アルギン酸ナトリウム ０．１
エチルアルコール ５．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル ０．２
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４５】
配合処方例２（化粧水） 質量％
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリセリン ２．０
１，３−ブチレングリコール ４．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド １．０
ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／７ジメチルエーテル ３．０
エリスリトール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
ジイソステアリン酸ポリグリセリル ０．３
トリエチルヘキサノイン ０．３
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
精製水 残余
【００４６】
配合処方例３（化粧水） 質量％
トラネキサム酸 １．０
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
リポ酸 ０．１
ハマメリス葉エキス ０．１
ヒポタウリン ０．１
クララエキス ０．１
トウニンエキス ０．１
ブナの芽エキス ０．１
本坑酸化剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．０１
アスコルビン酸リン酸マグネシウム ０．１
チオタウリン ０．１
緑茶エキス ０．１
西洋ハッカエキス ０．１
イリス根エキス １．０
トリメチルグリシン １．０
グリセリン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ヒドロキシエチルセルロース ０．０５
エチルアルコール ５．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル ０．２
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４７】
配合処方例４（乳液） 質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５
酢酸トコフェロール ０．５
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス乾固物 ０．００１
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ０．０５
ウイキョウエキス ０．１
酵母エキス ０．１
ジオウエキス ０．１
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン ０．１
グリセリン ６．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド ３．０
ヒマワリ油 １．０
スクワラン ２．０
イソドデカン ４．０
ジメチルポリシロキサン ３．０
キサンタンガム ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．１
エチルアルコール ５．０
水酸化カリウム 適量
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ベンガラ 適量
黄酸化鉄 適量
エチルパラベン 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４８】
配合処方例５（日中用乳液） 質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
本抗酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
酢酸トコフェロール ０．１
１，３−ブチレングリコール ５．０
スクワラン ０．５
イソドデカン １０．０
イソヘキサデカン ２５．０
ジメチルポリシロキサン ２．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 １．５
トリメチルシロキシケイ酸 １．０
４−ｔ−ブチル−４´−メトキシジベンゾイルメタン １．０
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル ５．０
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０
シリコーン被覆微粒子酸化チタン ４．０
ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト ０．５
球状ポリエチレン末 ３．０
タルク ５．０
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４９】
配合処方例６（乳液） 質量％
Ｄ−アルギニン ０．１
ローヤルゼリーエキス ０．１
酵母エキス ０．１
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％−１，３−ブタンジオール抽出物 １．０
グリチルレチン酸ステアリル ０．０５
酢酸トコフェロール ０．１
アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
グリセリン ５．０
ジプロピレングリコール ７．０
ポリエチレングリコール１５００ ２．０
流動パラフィン ７．０
ワセリン ３．０
ベヘニルアルコール １．０
バチルアルコール ２．０
ホホバ油 １．０
ステアリン酸 ０．５
イソステアリン酸 ０．５
ベヘニン酸 ０．５
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット ３．０
２−エチルヘキサン酸セチル ３．０
モノステアリン酸グリセリン １．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン １．０
カルボキシビニルポリマー ０．１５
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
水酸化カリウム 適量
メチルパラベン 適量
香料 適量
精製水 残余
【００５０】
配合処方例７（乳液） 質量％
アスコルビン酸グルコシド １．５
トラネキサム酸 １．０
酢酸トコフェロール ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．０１
パントテニルエチルエーテル ０．１
グリチルレチン酸ステアリル ０．１
グリセリン ７．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール２００００ ０．５
ワセリン ２．０
ホホバ油 ３．０
スクワラン ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル ０．５
ベヘニルアルコール ０．５
バチルアルコール ０．２
ジメチルポリシロキサン ２．０
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル ３．０
４−ｔ−ブチル−４´−メトキシジベンゾイルメタン ０．１
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル ０．１
キサンタンガム ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．２
エタノール ５．０
水酸化カリウム 適量
ピロ亜硫酸ナトリウム 適量
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
黄酸化鉄 適量
パラオキシ安息香酸エステル 適量
精製水 残余
【００５１】
配合処方例８（クリーム） 質量％
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノール抽出物 １．０
４−メトキシサリチル酸カリウム ３．０
プロピレングリコール ５．０
グリセリン ８．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ７．０
水添ラノリン ２．０
スクワラン ５．０
２−オクチルドデシルアルコール ６．０
ポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル ３．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ２．０
水酸化カリウム 適量
エチルパラベン 適量
香料 適量
イオン交換水 残余
【００５２】
配合処方例９（クリーム） 質量％
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
３−Ｏ−エチルアスコルビン酸 １．０
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．１
コエンザイムＱ１０ ０．０３
トラネキサム酸 ２．０
酢酸トコフェロール ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
パントテニルエチルエーテル ０．１
グリチルレチン酸ステアリル ０．１
グリセリン ７．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール２００００ ０．５
ワセリン ２．０
ベヘニルアルコール ０．５
バチルアルコール ０．２
スクワラン ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル ０．５
ホホバ油 ３．０
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット １．０
ジメチルポリシロキサン ２．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
キサンタンガム ０．１
エタノール ５．０
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
黄酸化鉄 適量
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
水酸化カリウム 適量
パラオキシ安息香酸エステル 適量
精製水 残余
【００５３】
配合処方例１０（二層タイプ日中用乳液） 質量％
トラネキサム酸 ２．０
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０２
グルタチオン １．０
チオタウリン ０．０５
クララエキス １．０
ジプロピレングリコール ５．０
ジメチルポリシロキサン ５．０
イソヘキサデカン ２５．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 ２．０
ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト ０．５
ブチルエチルプロパンジオール ０．５
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル ７．５
トリメチルシロキシケイ酸 ５．０
球状ポリアクリル酸アルキル粉末 ５．０
パルミチン酸デキストリン被覆微粒子酸化亜鉛 １５．０
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
メチルパラベン 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００５４】
配合処方例１１（ジェル） 質量％
４−メトキシサリチル酸カリウム ０．１
オドリコソウエキス ０．１
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
アスコルビン酸グルコシド ２．０
酢酸トコフェロール ０．１
オウゴンエキス ０．１
ユキノシタエキス ０．１
グリセリン ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール１５００ ３．０
ポリエチレングリコール２００００ ３．０
寒天末 １．５
キサンタンガム ０．３
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．０５
オクタン酸セチル ３．０
ジメチルポリシロキサン ５．０
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ジブチルヒドロキシトルエン 適量
黄酸化鉄 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
水酸化ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤に関し、より詳しくは、植物抽出物を有効成分として含む抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外線により活性酸素が発生することは周知である。活性酸素のうち、フリーラジカル型のものは脂質などの酸化性基質と反応すると、連鎖的な酸化反応を誘発する。したがって、フリーラジカルとなる活性酸素は、皮膚等の身体組織に対するダメージを増幅する。
【０００３】
皮膚は、常時、酸素や紫外線にさらされるため、フリーラジカルによる酸化ストレスのダメージが最も大きな組織である。近年では、紫外線により発生した種々の活性酸素が、皮脂や脂質の過酸化、蛋白変性、酵素阻害等を引き起こし、それが、短期的には皮膚の炎症などを誘発する。また、長期的には、老化やガンなどの原因となると考えられている。
【０００４】
また、活性酸素や過酸化脂質は、アトピー性皮膚炎や接触皮膚炎、乾癬などの皮膚疾患にも関与すると考えられている。このように、皮膚老化や皮膚疾患には、活性酸素（フリーラジカルやＯ2-）が深く関与している。
【０００５】
フリーラジカルやＯ2-を捕捉する能力を備える物質は、ラジカル連鎖反応を抑制したり、停止させたりすることができ、例えば抗酸化剤と呼ばれているものが相当する。
したがって、抗酸化剤を配合した皮膚外用剤は、光酸化ストレスによる皮膚老化（例えば、シミ、しわ、たるみなど）の予防・改善効果が期待できる。また、フリーラジカルが関連する各種皮膚疾患用皮膚外用剤としても、予防・改善効果が期待できる。
【０００６】
酸化防止剤として知られているビタミンＥやビタミンＣは、生体内におけるフリーラジカル捕捉型抗酸化物質である。また、ＢＨＴやＢＨＡの合成抗酸化物質も知られている。また、植物由来の酸化防止剤としては、シイタケ、エノキタケ、シメジ、カワラタケ、マツタケ、マンネンタケ、ホウウロクタケ、ナメコ、その他の担子菌類の抽出物が報告されている（特許文献１〜３）。さらに、ゴマノハグサ科モウズイカ属植物の抽出物からなる抗酸化剤や（特許文献４）、ムラサキ科カキバチシャノキ属植物の抽出物からなる抗酸化剤（特許文献５）が報告されている。
【０００７】
一方、皮膚は外側から角層、表皮層、基底膜及び真皮より構成されており、真皮はその中でも最も領域の広い部分である。膠原線維、弾性線維、糖タンパク質、プロテオグリカンが複合的に三次元状に広がった不均一の構造をしており、それぞれの構造物は液相を保有したゲル状態にある。膠原線維は主にコラーゲンからなり、その中でもＩ型コラーゲンが全体の８０％を占める。Ｉ型コラーゲンのほかにはIII、IV、VII、IX及びXII型コラーゲンの存在が知られている。老化皮膚に見られるしわ・たるみの発生は、外見上の加齢変化の主たるものであり、多くの中高年齢者にとって切実な問題となっている。しわ・たるみの成因の一つは、皮膚組織が加齢に伴ない菲薄化することによる。老化した皮膚において、真皮の主要なマトリックス成分であるI 型コラーゲン線維の減少が著しく、このことが皮膚の厚さが減少する主たる原因となっている可能性が高い。
従って、Ｉ型コラーゲンの産生を促進させてＩ型コラーゲン量を維持することが、しわ・たるみの予防・改善に有効であると考えられる。また、さらにＩ型、III型コラーゲンの産生促進は皮膚の創傷治癒の改善にも有効である。
【０００８】
従来、Ｉ型、III型コラーゲンの産生を促進させることで皮膚の加齢変化を予防・改善する天然物由来の成分としては、例えば、ダイゼイン、ダイズジン、ゲニスタイン、およびゲニスチンから選ばれるイソフラボン化合物、フィトステロールや（特許文献６参照）、特定の植物プランクトンの抽出物（特許文献７参照）が報告されている。
【０００９】
また、特許文献８には、保湿作用を有する植物抽出物の一つとしてミカエリソウの抽出物が挙げられている。本発明はミカエリソウ抽出物による抗酸化作用やＩ型コラーゲン産生促進作用に関するものであるが、特許文献８の記載と本発明の内容とは全く異なるものである。
即ち、特許文献８の保湿効果は水分残存率（％）で評価したものであるが、乾燥によるしわは、肌に潤いを補う保湿剤によって改善することができ、多くの化粧品に配合されてきた。一方、加齢に伴う新陳代謝の低下によってできるしわ（縮緬様のしわ）は、主に真皮線維芽細胞のコラーゲン産生量の低下によっておこるものだからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−３１７０１６号公報
【特許文献２】特開平６−６５５７５号公報
【特許文献３】特開昭５９−１２４９８４号公報
【特許文献４】特開平１１−１７１７２３号公報
【特許文献５】特開平１１−１７１７２０号公報
【特許文献６】特開２００１−３９８４９号公報
【特許文献７】特開２００７−１８６４７１号公報
【特許文献８】特開２００４−３２３４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のようなことから、植物由来の抗酸化剤、コラーゲン産生促進剤について、新たな抗酸化効果、コラーゲン産生促進効果を奏する植物を見出すことが求められている。
本発明はこのような従来の事情に対処してなされたもので、優れた抗酸化作用やコラーゲン産生促進作用を有する新しい植物由来の抗酸化剤、コラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、このような現状に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、従来効果のあることが知られていなかった特定の植物抽出物に優れた抗酸化作用およびコラーゲン産生促進作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明は、シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とする抗酸化剤である。
【００１４】
本発明は、シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を有しており、活性酸素（フリーラジカルやＯ2-）による皮膚老化や皮膚疾患を防止・抑制する優れたフリーラジカル捕捉能を有するものである。
【００１６】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生を促進する効果に優れ、かつ安全なものである。よって本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、コラーゲンの産生を促進して、コラーゲン量を維持することができ、しわ・たるみの予防・改善及び皮膚創傷治癒を促進し、コラーゲン不足に起因する種々の症状の改善に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明によるミカエリソウ抽出物のＳＯＤ様活性の結果を示す図である。
【図２】本発明によるミカエリソウ抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性の結果を示す図である。
【図３】本発明によるミカエリソウ抽出物のコラーゲン産生促進活性の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
本発明で用いられる植物であるミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.)は見返り草とも表記される。シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）に属する植物であり、日本の主に本州の山地に群生する落葉小高木である。
【００１９】
本発明の植物抽出物に、抗酸化作用やコラーゲン産生促進作用があるという報告はこれまでになく、いずれも本発明者らによって初めて見出されたものである。
【００２０】
本発明に用いられるミカエリソウの抽出物は、葉、茎、または全草を適宜、そのまま、乾燥あるいは粉砕した後、溶媒にて抽出することにより得られる。抽出は室温静置で行っても良いが、必要に応じて加温、攪拌、加熱還流により抽出を促進することが可能である。得られた抽出液は、そのまま、あるいは適宜濾過・濃縮・脱色などの処理を施して用いることが出来る。また、一旦溶媒を除去した後に、抽出に用いた溶媒とは異なる溶媒に再溶解して用いることも可能である。得られた抽出物を活性炭やカラムマトグラフィーなどによりさらに精製して用いることも可能である。
【００２１】
本発明に用いられる抽出溶媒は、通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール等のアルコール類、含水エタノールや含水メタノールのような含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル、クロロホルム等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができるが、特に含水エタノール(例えば５０％エタノール)が好ましい。
また、これらの抽出物を溶媒分画や活性炭処理やカラムクロマトグラフィーなどにより精製して用いても良い。
【００２２】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤はミカエリソウの抽出物を含むことを特徴とするが、本発明の効果を損なわない範囲において他の種々の成分を含有することが出来る。
【００２３】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤は、皮膚外用基剤に配合して、抗酸化作用およびコラーゲン産生促進作用に基づく皮膚外用剤とすることができる。これらの皮膚外用剤は、特に化粧料、医薬品、医薬部外品等の分野において好適に用いることができる。
【００２４】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤における植物抽出物の配合量は、ミカエリソウ抽出物成分の乾燥残分として、通常０．１ｐｐｍ以上、好ましくは１ｐｐｍ以上である。配合量が少なすぎると効果が十分に発揮されない。上限は本発明の効果を損なわない範囲において特に限定されないが、過剰に配合しても増量に見合った顕著な効果が得られないこと、また、製剤設計や使用性などにおいて悪影響を及ぼすこともあることなどから、通常１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。
【００２５】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤は、本発明による抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を皮膚外用基剤に配合して製造される。皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、植物エキス類、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２６】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、アルコキシサリチル酸および／またはその塩類等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００２７】
本発明の抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤を含む皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
【実施例】
【００２８】
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれによりなんら限定されるものではない。配合量は特記しない限り質量％で示す。
最初に、本実施例で用いた植物抽出物の調製方法、抗酸化効果（活性酸素消去効果およびラジカル消去効果）、コラーゲン産生促進効果に関する試験方法とその結果について説明する。
【００２９】
１．試料の調製
（製造例１）
ミカエリソウ（見返り草）の葉と茎の乾燥粉砕物１２ｇに５０％エタノールを１０倍量加えて室温にて１週間かけて抽出後、４℃にて１晩放置し、ろ過後不溶物を取り除いた。得られたろ過液を５０％エタノールエキスと呼び、さらに凍結乾燥して得られた固形物を５０％エタノールエキス乾固物と呼び、２．５ｇ（収率；２１％）を得た。
（製造例２）
ミカエリソウ（見返り草）の葉と茎の乾燥粉砕物１２ｇにメタノールを１０倍量加えて室温にて１週間かけて抽出後、４℃にて１晩放置し、ろ過後不溶物を取り除いた。得られたろ過液をメタノールエキスと呼び、さらに凍結乾燥して得られた固形物をメタノールエキス乾固物と呼び、２．０ｇ（収率；１６％）を得た。
【００３０】
２．活性酸素消去作用（ＳＯＤ；スーパーオキシドディスムターゼ様活性）の測定法およびその結果
（１）原理
本酵素（ＳＯＤ）は皮膚の老化（シワの発生、老人性色素斑など）を加速させる原因であるといわれる活性酸素の１つであるスーパーオキサイドアニオンＯ2-を過酸化水素と酸素に分解する酵素である。すなわちスーパーオキサイドアニオンの検出方法としてニトロブルートエラゾリウムを用い、その減少について還元呈色反応を利用して阻害率を求めることで被験成分のＳＯＤ様活性とする。詳細について以下記載する。
【００３１】
（２）手順
発色試薬は、ニトロブルーテトラゾリウム（０．２４nmol/l），キサンチン０．４mmol/lを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、酵素原液としてはキサンチンオキシダーゼ（Butter milk由来）０．０４９単位／ｍｌを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して用いた。ブランク液は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い、反応停止液はドデシル硫酸ナトリウム（６９０mmol/l）を用いた。
操作手順は製造例により得られたエキス乾固物を２０％ＤＩＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）溶液にてそれぞれの濃度に希釈後、９６穴プレートに１０μlづつ分取し発色試薬１００μlを添加し混和した。本検には酵素液を、盲検にはブランク液をそれぞれ１００μlづつ添加し、３７℃で２８分間正確に加温した後、反応停止液２０μｌ添加することで反応を止めた。測定はプレートリーダーを用い吸光度５６０nmにて実施した。なお検体数は１群ｎ＝４（穴）で実施した。
【００３２】
（３）計算方法
ＳＯＤ様活性は、以下の式にあてはめて算出した。
ＳＯＤ様活性（阻害率％）＝((Ebl-(Ebl-bl))−(Es-(Es-bl)))／( Ebl-(Ebl-bl))＊100
＝1-(Es-(Es-bl))／(Ebl-(Ebl-bl))＊100
Ebl；試験試料を除いた溶液に酵素液を加えた溶液の波長５６０nmの吸光度
(Ebl-bl)；試験試料を除いた溶液に酵素液を除いた溶液の波長５６０nmの吸光度
Es；試験試料の溶液に、酵素液を加えた溶液の波長５６０nmの吸光度
(Es-bl)；試験試料の溶液に酵素液を除いた溶液の５６０nmの吸光度
【００３３】
（４）結果
結果を図１に示す。図１（ａ）は、製造例２で調製したメタノールエキス乾固物のＳＯＤ様活性を示す図であり、図１（ｂ）は、製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物のＳＯＤ様活性を示す図である。
図１（ａ）（ｂ）から、ミカエリソウ抽出物のＳＯＤ様活性は、５０％エタノールエキス乾固物、メタノールエキス乾固物において活性を有することが明らかとなった。
【００３４】
３．ラジカル消去作用（ＤＰＰＨ；ラジカル消去試験法）の測定法およびその結果
（１）原理
ＤＰＰＨラジカルは可視域（５１７nm）に吸収波長を持ち、かつ還元されると吸収波長がなくなることを利用し、被験物質のラジカル消去能を吸光度の低下から評価する。
【００３５】
（２）手順
１mM ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，Ｍｗ;394.32）の保存液をＤＩＭＳＯ（Dimethyl sulfozide）を用いて調製し、使用時に０．１mM ＤＰＰＨ溶液に希釈して評価に供した。試験試料は２０％ＤＩＭＳＯ溶液にて希釈し、１０μｌづつｎ＝４（穴）として９６穴プレートに分注し、直ちに０．１mM ＤＰＰＨ ９０μｌを添加後、室温にて１０分間ゆっくり攪拌しながら反応させた。測定はプレートリーダーを用い、５１７nmの吸光度を測定しラジカル消去能を評価した。
【００３６】
（３）計算方法
ラジカル消去活性は、以下の式にあてはめて算出した。
ラジカル消去率（％）＝((Ｃt-Cb)-(St-Sb))／(Cｔ-Cb)＊100
＝１−（St-Sb）／(Cｔ-Cb))＊100
Ｃｔ；試験試料を除いた溶液にＤＰＰＨを加えた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｃｂ；試験試料を除いた溶液にＤＰＰＨを除いた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｓｔ；試験試料の溶液にＤＰＰＨを加えた溶液の波長５１７nmの吸光度
Ｓｂ；試験試料の溶液にＤＰＰＨを除いた溶液の波長５１７nmの吸光度
【００３７】
（４）結果
結果を図２に示す。図２の■は、製造例２で調製したメタノールエキス乾固物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示す図であり、図２の□は、製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示す図である。
図２から分かるように、ミカエリソウの５０％エタノールエキス乾固物の溶液およびメタノールエキス乾固物の溶液のＤＰＰＨ活性は、無添加群と比較し有意な活性が認められた。
【００３８】
４．線維芽細胞のコラーゲン産生促進作用の試験法およびその結果
（１）手順
ヒト皮膚由来の線維芽細胞HF0(K)P=8.5を４００万個培養し、１０万個／穴で２４穴に播種し、０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥで培養した。翌日試験試料であるメタノールエキス乾固物または５０％エタノールエキス乾固物の濃度が１０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍとなるように添加するとともに、０．２５mMとなるようアスコルビン酸リン酸マグネシウムを添加し、次に血清濃度が０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭとなるよう調製した。正対照としてはＴＧＦ−β（２ng/μl）を用いた。３日間培養後、培養上清の総コラーゲン量を測定した。培養上清中に分泌されたＩ型コラーゲンの量は酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。すなわち抗ＰＩＰモノクローナル抗体プレートに標準抗体液を１００μｌづつ加え、あらかじめ調製した標準液は培養上清中の２０μｌずつ添加し、３７℃で３時間反応した。反応液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄後、基質溶液（3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン溶液）を１００μｌずつ加えて室温で１５分間反応させ、抗体プレート・ＰＩＰ抗原・標準抗体の結合体をつくった。次に１Ｎ硫酸を溶解した反応停止液を１００μｌ加えよく攪拌し反応をとめた。蒸留水を対照として４５０nmでマイクロプレートリーダーにて４０５nmの吸光度を測定し、Ｉ型コラーゲン量を算出した。またコラーゲン産生促進作用（Ｉ型コラーゲン量／細胞数）を評価するために細胞数の測定を行った。以下に細胞数測定法を記載する。
【００３９】
（２）細胞数測定法
（２−１）手順
試験試料の添加３日後に培地を吸引除去し、５％ＦＢＳで洗浄後、６０μlのHoechstを１２mlのHoechst培地に加えて攪拌し、その５００μlを６ウェルプレートに添加した。３７℃で１時間反応させた後、９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダー（励起波長３５５nm、測定波長４６０nm）を用いて細胞数を算出した。
【００４０】
（２−２）計算方法
コラーゲン産生促進作用は、以下の式を用いて算出した。
コラーゲン産生促進率（％）＝（試験試料を添加した細胞が産生するＩ型コラーゲン量／試験試料を添加した群の細胞数）÷（試験試料を添加していない細胞が産生するＩ型コラーゲン量／試験試料を添加していない群の細胞数）×１００
なお細胞毒性によるコラーゲン産生量の増加を排除するために、細胞増殖率が２０％に満たない細胞毒性が高い群は、コラーゲン産生促進データから外すこととした。
【００４１】
（３）結果
結果を図３に示す。図３は製造例２で調製したメタノールエキス乾固物の溶液と製造例１で調製した５０％エタノールエキス乾固物の溶液のコラーゲン産生促進作用を示す図である。
ミカエリソウのメタノールエキス乾固物および５０％エタノールエキス乾固物のコラーゲン産生促進作用は、５０％エタノール乾固物の方がメタノール乾固物と比較して高く、５０％エタノール乾固物は添加濃度１０ｐｐｍおよび１００ｐｐｍにおいて無添加と比較し、有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。
【００４２】
以上の結果から本発明のミカエリソウ抽出物は優れた抗酸化効果およびコラーゲン産生促進効果を示すことから、ヒトの肌に対してもすぐれた抗酸化作用、コラーゲン産生促進作用を奏するものである。したがって、該植物抽出物を外用剤に配合して、肌の老化を防ぎ、若々しく健康な肌の状態を維持する抗老化剤や各種皮膚疾患治療剤として用いることができる。
【００４３】
以下に、種々の剤型の本発明による抗酸化剤およびコラーゲン産生促進剤の配合例を処方例として説明する。本発明はこの処方例によって何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲によって特定されるものであることはいうまでもない。
各処方中のミカエリソウ抽出物含量は抽出溶媒を除去した後の乾燥残分量として表した。
【００４４】
配合処方例１（化粧水） 質量％
トリメチルグリシン １．０
本坑酸化剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス乾固物 ０．０００１
グリセリン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
アルギン酸ナトリウム ０．１
エチルアルコール ５．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル ０．２
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４５】
配合処方例２（化粧水） 質量％
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリセリン ２．０
１，３−ブチレングリコール ４．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド １．０
ＰＥＧ／ＰＰＧ−１４／７ジメチルエーテル ３．０
エリスリトール １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．５
ジイソステアリン酸ポリグリセリル ０．３
トリエチルヘキサノイン ０．３
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
精製水 残余
【００４６】
配合処方例３（化粧水） 質量％
トラネキサム酸 １．０
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
リポ酸 ０．１
ハマメリス葉エキス ０．１
ヒポタウリン ０．１
クララエキス ０．１
トウニンエキス ０．１
ブナの芽エキス ０．１
本坑酸化剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．０１
アスコルビン酸リン酸マグネシウム ０．１
チオタウリン ０．１
緑茶エキス ０．１
西洋ハッカエキス ０．１
イリス根エキス １．０
トリメチルグリシン １．０
グリセリン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ヒドロキシエチルセルロース ０．０５
エチルアルコール ５．０
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル ０．２
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４７】
配合処方例４（乳液） 質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０５
酢酸トコフェロール ０．５
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス乾固物 ０．００１
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ０．０５
ウイキョウエキス ０．１
酵母エキス ０．１
ジオウエキス ０．１
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン ０．１
グリセリン ６．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリオキシエチレンメチルグルコシド ３．０
ヒマワリ油 １．０
スクワラン ２．０
イソドデカン ４．０
ジメチルポリシロキサン ３．０
キサンタンガム ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．１
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．１
エチルアルコール ５．０
水酸化カリウム 適量
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ベンガラ 適量
黄酸化鉄 適量
エチルパラベン 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４８】
配合処方例５（日中用乳液） 質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
本抗酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
酢酸トコフェロール ０．１
１，３−ブチレングリコール ５．０
スクワラン ０．５
イソドデカン １０．０
イソヘキサデカン ２５．０
ジメチルポリシロキサン ２．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 １．５
トリメチルシロキシケイ酸 １．０
４−ｔ−ブチル−４´−メトキシジベンゾイルメタン １．０
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル ５．０
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０
シリコーン被覆微粒子酸化チタン ４．０
ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト ０．５
球状ポリエチレン末 ３．０
タルク ５．０
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００４９】
配合処方例６（乳液） 質量％
Ｄ−アルギニン ０．１
ローヤルゼリーエキス ０．１
酵母エキス ０．１
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％−１，３−ブタンジオール抽出物 １．０
グリチルレチン酸ステアリル ０．０５
酢酸トコフェロール ０．１
アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム ０．１
グリセリン ５．０
ジプロピレングリコール ７．０
ポリエチレングリコール１５００ ２．０
流動パラフィン ７．０
ワセリン ３．０
ベヘニルアルコール １．０
バチルアルコール ２．０
ホホバ油 １．０
ステアリン酸 ０．５
イソステアリン酸 ０．５
ベヘニン酸 ０．５
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット ３．０
２−エチルヘキサン酸セチル ３．０
モノステアリン酸グリセリン １．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン １．０
カルボキシビニルポリマー ０．１５
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
水酸化カリウム 適量
メチルパラベン 適量
香料 適量
精製水 残余
【００５０】
配合処方例７（乳液） 質量％
アスコルビン酸グルコシド １．５
トラネキサム酸 １．０
酢酸トコフェロール ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．０１
パントテニルエチルエーテル ０．１
グリチルレチン酸ステアリル ０．１
グリセリン ７．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール２００００ ０．５
ワセリン ２．０
ホホバ油 ３．０
スクワラン ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル ０．５
ベヘニルアルコール ０．５
バチルアルコール ０．２
ジメチルポリシロキサン ２．０
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット ０．１
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル ３．０
４−ｔ−ブチル−４´−メトキシジベンゾイルメタン ０．１
ジパラメトキシ桂皮酸モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル ０．１
キサンタンガム ０．１
カルボキシビニルポリマー ０．２
エタノール ５．０
水酸化カリウム 適量
ピロ亜硫酸ナトリウム 適量
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
黄酸化鉄 適量
パラオキシ安息香酸エステル 適量
精製水 残余
【００５１】
配合処方例８（クリーム） 質量％
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノール抽出物 １．０
４−メトキシサリチル酸カリウム ３．０
プロピレングリコール ５．０
グリセリン ８．０
ステアリン酸 ２．０
ステアリルアルコール ７．０
水添ラノリン ２．０
スクワラン ５．０
２−オクチルドデシルアルコール ６．０
ポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル ３．０
グリセリンモノステアリン酸エステル ２．０
水酸化カリウム 適量
エチルパラベン 適量
香料 適量
イオン交換水 残余
【００５２】
配合処方例９（クリーム） 質量％
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
３−Ｏ−エチルアスコルビン酸 １．０
本コラーゲン産生促進剤ミカエリソウ／５０％エタノールエキス ０．１
コエンザイムＱ１０ ０．０３
トラネキサム酸 ２．０
酢酸トコフェロール ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５
パントテニルエチルエーテル ０．１
グリチルレチン酸ステアリル ０．１
グリセリン ７．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール２００００ ０．５
ワセリン ２．０
ベヘニルアルコール ０．５
バチルアルコール ０．２
スクワラン ２．０
ヒドロキシステアリン酸フィトステリル ０．５
ホホバ油 ３．０
テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリット １．０
ジメチルポリシロキサン ２．０
イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １．０
カルボキシビニルポリマー ０．２
キサンタンガム ０．１
エタノール ５．０
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
黄酸化鉄 適量
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
水酸化カリウム 適量
パラオキシ安息香酸エステル 適量
精製水 残余
【００５３】
配合処方例１０（二層タイプ日中用乳液） 質量％
トラネキサム酸 ２．０
４−メトキシサリチル酸カリウム １．０
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．０２
グルタチオン １．０
チオタウリン ０．０５
クララエキス １．０
ジプロピレングリコール ５．０
ジメチルポリシロキサン ５．０
イソヘキサデカン ２５．０
ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体 ２．０
ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト ０．５
ブチルエチルプロパンジオール ０．５
パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル ７．５
トリメチルシロキシケイ酸 ５．０
球状ポリアクリル酸アルキル粉末 ５．０
パルミチン酸デキストリン被覆微粒子酸化亜鉛 １５．０
ＥＤＴＡ３ナトリウム 適量
メチルパラベン 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【００５４】
配合処方例１１（ジェル） 質量％
４−メトキシサリチル酸カリウム ０．１
オドリコソウエキス ０．１
本坑酸化剤ミカエリソウ／メタノールエキス乾固物／５０％−１，３ブタンジオール置換液 ０．１
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
アスコルビン酸グルコシド ２．０
酢酸トコフェロール ０．１
オウゴンエキス ０．１
ユキノシタエキス ０．１
グリセリン ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ポリエチレングリコール１５００ ３．０
ポリエチレングリコール２００００ ３．０
寒天末 １．５
キサンタンガム ０．３
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 ０．０５
オクタン酸セチル ３．０
ジメチルポリシロキサン ５．０
ヘキサメタリン酸ナトリウム 適量
ジブチルヒドロキシトルエン 適量
黄酸化鉄 適量
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
水酸化ナトリウム 適量
フェノキシエタノール 適量
香料 適量
精製水 残余
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項１】
シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
シソ科テンニンソウ属（Leucosceptrum）ミカエリソウ（Leucosceptrum stellipila (Miq.) の抽出物を含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１４４４４６（Ｐ２０１２−１４４４４６Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７０６（Ｐ２０１１−１７０６）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【出願人】（０００００１９５９）株式会社 資生堂 (1,748)
【Ｆターム（参考）】
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