抗酸化剤及びその製造方法並びに該抗酸化剤を含有する抗酸化組成物
【課題】スイートコーン粒を原料とした抗酸化活性を有する７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸（ＧＯＡ）の製造方法、それを含む抗酸化剤及び抗酸化組成物を提供する。
【解決手段】喫食の適期で収穫したスイートコーン粒を原料とし、水、含水有機溶剤、または有機溶剤を抽出溶媒として抽出し、さらに含水有機溶剤を溶出溶媒としたクロマトグラフィーによってＧＯＡを精製する方法を提供する。また、精製したＧＯＡを含有する抗酸化剤および抗酸化組成物を提供する。
【解決手段】喫食の適期で収穫したスイートコーン粒を原料とし、水、含水有機溶剤、または有機溶剤を抽出溶媒として抽出し、さらに含水有機溶剤を溶出溶媒としたクロマトグラフィーによってＧＯＡを精製する方法を提供する。また、精製したＧＯＡを含有する抗酸化剤および抗酸化組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有する７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸（以下、「ＧＯＡ」と称する。）の製造方法、それを含有する抗酸化剤及び抗酸化組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素やフリーラジカルは、癌、動脈硬化、及び老化の原因となることが知られており、近年、それらを消去する抗酸化物質が注目を集めている。古くから抗酸化物質としては、ビタミンＡ、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンなどのカロテノイド類、イソフラボン、ケルセチン、ナリンゲニンなどのフラボノイド類、ビタミンＣ、ビタミンＥなどのビタミン類、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、システイン、アンセリン、カルノシン、グルタチオンなど、多くの物質が知られている。しかし、それぞれの物質が消去できる活性酸素種が異なることや各物質の疎水性や分子量の違いから、生体に対する作用は異なることが知られており、新たな構造を有する抗酸化物質は新たな作用を持つ可能性があるため、依然として新規な抗酸化物質の探索が進められている。そのような研究の中から見出された化合物としては、フェルラ酸−２，３−ジヒドロキシプロピル（特許文献１）、Ｎ−（４−メチルサクシンイミド−ｎ−ブチル）−ｐ−クマルアミド（特許文献２）、バラノフォニン、エリスロ−ブドレノールＡ、及びスレオ−ブドレノールＡ（特許文献３）、ルテオリン−７−グルコサイド（特許文献４）、4-(3,4-Dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2-naphtalenecarboxylic acid（特許文献５）、キサントン誘導体（特許文献６）、マロツシン酸、及びマロチン酸（特許文献７）、Phloroglucinol誘導体（特許文献８）などが挙げられるが、より消費者にとって安全、安心な抗酸化物質の開発が望まれていた。
【０００３】
スイートコーンは、大きく分けてスイート種とスーパースイート種に分類される。スイート種は、ｓｕ１(sugary1)という遺伝子を持っていて、穀類として利用されるデント種やフリント種に比べ糖の合成が２〜３倍多く、甘味が強く、主に缶詰用として用いられている。一方、スーパースイート種は、スイート種と同様に、澱粉の代わりに糖を蓄積するが、乾燥時に収縮して表面にしわがよるといった特徴を有する。スーパースイート種は、ｓｈ２(shrunken2)という遺伝子を持っており、スイート種の４倍の糖を蓄積し、主に生食用として用いられている（非特許文献１、２）。
【０００４】
本発明者らは、過去の研究により、スーパースイート種の抗酸化活性は、スイート種、デント種、フリント種、ポプ種といった他のコーン類よりも高く、新鮮重量換算では、トマトやホウレンソウのような野菜と同等の抗酸化活性を有することを明らかにしていたが、その抗酸化活性の主成分については明らかになっていなかった（非特許文献３）。
【０００５】
Ｎｉｗａらは、工業的なでんぷん製造工程で生じる副産物のコーングルテンミールを５０％エタノール抽出、水酸化ナトリウムによる加水分解、塩酸による弱酸性化、酢酸エチル抽出、ＨＰＬＣ分画により、２００ｇのコーングルテンミールから２１．５ｍｇの７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸(7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid)（以下、「ＨＯＡ」と称する。）を単離（収率０．０１１％）できること、また、単離したＨＯＡがヒドロキシルラジカル消去活性を有することを報告している（非特許文献４）。しかし、ＨＯＡの量が少ないため産業上利用できず、また疎水性が高いため、利用が制限されるといった課題があった。７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸（ＧＯＡ）はスイート種スイートコーン種子発芽後のコーン粒や根において、アイソトープラベルしたインドール−３−酢酸やＨＯＡから合成されること、またスイート種スイートコーン種子発芽後のコーン粒のＧＯＡ及びＨＯＡの量はそれぞれ０．４５９ｍｇ／１００ｇ新鮮重量、０．１６６ｍｇ／１００ｇ新鮮重量（非特許文献５、６から算出した値）であったことが報告されている（非特許文献５、６、７）。しかし、生理活性を測定できるレベルでＧＯＡを単離精製したという報告はなく、植物ホルモンであるオーキシンの代謝物として知られているものの、その活性に関する報告はなかった。
【特許文献１】特開平６−１５８０４３号公報
【特許文献２】特開平６−１５８０４４号公報
【特許文献３】特開２０００−１０４０６３号公報
【特許文献４】特開２００２−３８１５１号公報
【特許文献５】特開２００５−１７１００３号公報
【特許文献６】特開２００６−０８９６６１号公報
【特許文献７】特開２００７−２５４４２７号公報
【特許文献８】特開２００７−２８４４３５号公報
【非特許文献１】菊地一徳、「コーン製品の知識」、幸書房（1993）
【非特許文献２】Tracy, W. F., History, Genetics, and Breeding of Supersweet (shrunken2) Sweet Corn, Plant Breeding Reviews, 14, 189-236 (1997)
【非特許文献３】永安ら、日本農芸化学会大会講演要旨集、p222 (2006)
【非特許文献４】Niwa, T. et al., Oxidative Reaction of Oxindole-3-acetic Acids, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1870-1874 (2003)
【非特許文献５】Nonhebel, H. M. and Bandurski, R. S., Oxidation of Indole-3-acetic Acid and Oxindole-3-acetic Acid to 2,3-Dihydroxy-2-oxo-1H Indole-3-acetic Acid-7’-O-β-D-Glucopyranoside in Zea mays Seedlings, Plant Physiol., 76, 979-983 (1984)
【非特許文献６】Lewer , P. and Bandurski, R. S., Occurrence and metabolism of 7-hydroxy-2-indolinone-3-acetic acid in Zea mays, Phytochemistry 26, 1247-1250, 1987
【非特許文献７】Nonhebel, H. M., Kruse, L. I. and Bandurski, R. S., Indole-3-acetic acid catabolism in Zea mays seedlings. Metabolic conversion of oxindole-3-acetic acid to 7-hydroxy-2-oxindole-3-acetic acid 7'-O-beta-D-glucopyranoside, J. Biol. Chem. 260, 12685-12689, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前項記載の背景技術下に、本発明は、喫食の適期で収穫したスイートコーン粒を原料としたＧＯＡの製造方法、及びそれを含有する抗酸化剤及び抗酸化組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前項記載の課題を解決すべく鋭意研究した結果、喫食の適期で収穫したスイートコーン粒中の主要な抗酸化物質としてＧＯＡを見出し、この物質がスイートコーンにおいて、他のコーン類、穀類、大豆、野菜類に比べ極めて多いことから、これを原料とした効率的なＧＯＡの製造方法を確立し、本発明を完成するに至った。なお、ＧＯＡを生理活性が測定できるレベルで製造する方法は、これまで検討されておらず、その点で本発明は極めて特異的なものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、抗酸化活性を有するＧＯＡの製造方法、それを含有する抗酸化剤に関する。また、ＧＯＡを日常的に摂取しやすくするために調製した飲食品組成物、例えば、ＧＯＡに、他の食品素材、調味素材、酸化防止剤、着色料、香料、香辛料抽出物、甘味料、酸味料、調味料、乳化剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、流動性促進剤、賦形剤などを添加し、顆粒化、カプセル化、錠剤化、可溶化して得られる固体状または液体状飲食品組成物に関するものである。
【０００９】
さらに別の観点において、本発明は、上記スイートコーンから抽出されたＧＯＡやこれにグルコシダーゼを作用させて得られるＨＯＡを、それぞれ約１重量％及び約０．１重量％以上含む抗酸化組成物を提供する。これらの組成物は天然物に含まれるこれらの化合物が１０倍以上濃縮されたものであり、抗酸化作用を有する食品用、医薬品用又は化粧品用組成物として有用である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、抗酸化活性を有するＧＯＡを高収量かつ高純度に簡便な方法で製造し得る。また、得られたＧＯＡは、抗酸化活性を顕著に有する抗酸化剤または抗酸化組成物として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る化合物７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸(7-(O-Glucosyloxy)-oxindole-3-acetic acid)（ＧＯＡ）は、植物ホルモンであるオーキシンの代謝物としてコーン(Zea mays)の実生(seedling)から初めて見出された。その代謝経路は、以下の反応式に示したように、インドール−３−酢酸からオキシインドール−３−酢酸、及び７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸を経て合成されることが報告され（非特許文献５及び６参照）下記式（１）に示す構造を有する。この化合物は、また２，３−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−酢酸、又はより単純に７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸−グルコシドと称される場合もある。
【００１２】
本発明に係る化合物のスイートコーンからの抽出方法は特に限定されないが、水分含量が８０％以下となり糖含量が高くなる喫食の適期に圃場からスイートコーンの果実を収穫した後、コーン粒をコーン軸から脱粒し、粉砕機にてペースト状にすることが好ましい。スイートコーンの品種や産地も特に限定されないが、好ましくは、スーパースイート種スイートコーンが原料として使用される。
【００１３】
このペーストから直接、またはペースト乾燥品の粉砕物から抽出溶媒を用いてＧＯＡを抽出するが、本ペーストをスチーム加熱し、乾燥した後粉砕した粉末から抽出することが好ましい。ペーストの乾燥法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、減圧ドラム乾燥、真空ベルト乾燥などが用いられる。乾燥品の粉砕法としては、衝撃式粉砕、せん断式粉砕、圧縮式粉砕、磨砕式粉砕などが用いられる。抽出溶媒としては、水、含水有機溶剤、または有機溶剤が用いられるが、好ましくはエタノールまたはエタノールを１０−９５％の範囲で含有する含水エタノールが用いられる。抽出工程における抽出温度は特に限定されないが、有効成分の安定性の観点から１００℃以下が好ましい。抽出時間は特に限定されないが、有効成分の濃度を向上させるという観点からは、１５分以上とすることが好ましい。
【００１４】
本抽出物から清澄な液体を得る目的で固形残渣の除去を行い、これを適宜濃縮する。そのような除去法としては、静置分離、濾過、遠心分離などが用いられる。また濃縮法としては、蒸発濃縮、膜濃縮、凍結濃縮などが用いられる。
【００１５】
このように濃縮した液体または固体を必要に応じて溶媒に溶解し、この溶液を、含水有機溶剤を溶出溶媒とするクロマトグラフィーによる分画に供する。ここで、抽出物の溶解に使用する溶剤は、溶解が可能であれば特に限定されない。
【００１６】
本分画工程において使用するクロマトグラフィーの種類や溶出方法は特に限定されない。クロマトグラフィーの種類としては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーが挙げられ、その充填剤も特に限定されず、複数のクロマトグラフィーを組み合わせて分画を行うこともできる。溶出方法としては、例えば、抽出物をクロマトグラフィーの媒質に吸着させた後に、濃度の異なる含水有機溶剤を段階的に数種類用いるか、もしくは連続的に含水有機溶剤の溶剤濃度を変化させてＧＯＡ含有画分を溶出させることができる。含水有機溶剤を構成する有機溶剤の種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類が好ましい。また二種類以上の有機溶剤の混合物であってもよい。
【００１７】
次に、クロマトグラフィーによって分画したＧＯＡ含有画分を適宜濃縮し乾燥物を得る。そのような濃縮法としては、蒸発濃縮、膜濃縮、凍結濃縮などが用いられる。
【００１８】
このようにして、本発明に係るＧＯＡ精製物が得られる。このＧＯＡ精製物のＧＯＡ含有量は、好ましくは重量比２０％以上、さらに好ましくは５０重量％以上、最も好ましくは８０重量％以上である。上限は特に限定されるものではないが、この精製によりＧＯＡ含量を９０重量％まで高めることができ、水分や賦形剤を含んで安定した精製物とすることができる。精製されたＧＯＡは、フリーラジカル消去活性を有し、抗酸化剤であることが明らかとなった。フリーラジカル消去活性の測定方法は特に限定されるものではないが、比較的安定なラジカルを持つ１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いることが好ましい。この方法は、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨが抗酸化剤によって還元されることにより５１７ｎｍにおける吸光度の減少を捕らえて絵抗酸化能を評価する。
【００１９】
本発明のＧＯＡは、抗酸化活性を有することから、これを少なくとも１重量％含むことにより抗酸化組成物として利用可能であり、特に機能性食品などに好適に用いることができる。また、本発明のＧＯＡを含有する抗酸化組成物は、抗酸化活性を有することから、例えば、動脈硬化症、癌、高血圧、糖尿病、脳血管症、高脂血症、心筋梗塞、肌のシミなどの予防や治療を目的とする医薬組成物又は食品組成物（食品または食品添加物）としての利用も可能である。
【００２０】
本発明品の食品用抗酸化組成物の形態としては，例えば、畜産加工品（ハム、ソーセージ、ベーコンなど）、水産加工品（ちくわ，かまぼこ、はんぺんなど）、菓子類（クッキー、ケーキ、キャンデーなど）、飲料（果汁飲料、清涼飲料、栄養ドリンク、ゼリー飲料、スープなど）、乳製品（ヨーグルト、チーズ、バターなど）、主食類（パン、麺類、ご飯など）、惣菜類（ギョウザ、シュウマイ、ハンバーグなど）などが例示され、配合量としては、摂取者の体重、年齢、症状などに応じて適宜調整することができるが、一般に１〜５０％程度とされる。上記の形態の他、顆粒状、粉状、カプセル状、錠剤などであってもよく、この場合の配合量としては、摂取者の体重、年齢、症状などに応じて適宜調整することができるが、一般に１〜５０％程度とされる。これらの食品はそれぞれ常法に準じて調製することができる。
【００２１】
本発明の抗酸化組成物には、本発明の効果を妨げない範囲内で、種々の食品素材や食品添加物を添加することができる。このようなものとしては、糖類（グルコース、スクロース、トレハロース、でんぷん、デキストリン、シクロデキストリンなど）、油脂類（植物油、魚油、動物油など）、タンパク質（大豆タンパク質、乳タンパク質など）、ビタミン（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ビオチン、パントテン酸、アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥＥ、ビタミンＫ、β−カロテンなど）、ミネラル（カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、銅、クロム、ヨウ素、セレン、マンガン、モリブデンなど）、食物繊維（セルロース、ペクチン、寒天など）などの栄養成分；食品としての機能（味、食感、物性、安全性、保存性など）を付与するための食品素材（乾燥野菜、粉乳など）、調味素材（胡椒、ローズマリー、タイム、セイジ、粉末醤油、粉末味噌、粉末酒、砂糖、食塩、各種エキス粉など）、酸化防止剤（α−トコフェロール、セージ抽出物など）、着色料（カラメル色素、アナトー色素、ペニバナ色素、パプリカ色素など）、香料、香辛料抽出物、甘味料（アスパルテーム、アセスルファムＫなど）、酸味料（クエン酸、酢酸など）、調味料（グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸など）、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、レシチンなど）、増粘剤（グアーガム、ゼラチンなど）、結合剤（デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、崩壊剤（デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなど）、流動性促進剤（軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなど）を挙げることができる。当然のことながら、これらに限らず、その他の食品素材や食品添加物を配合することもできる。さらに、抗酸化作用のある他の素材（ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、トコトリエノール、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチン、イソフラボン、ケルセチン、ナリンゲニン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、システイン、アンセリン、カルノシンなど）やその他の健康増進作用を有する素材と組み合わせて使用することも可能である。
【００２２】
さらに本発明の抗酸化組成物には、上記ＧＯＡをグルコシダーゼと反応させて得られる７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸（ＨＯＡ）を含んでいてもよい。反応に用いるグルコシダーゼとしては特に限定されないが、微生物、高等植物および動物等から得られるβ−グルコシダーゼが好ましい。天然物に含まれるＨＯＡの含量は極めて低いため、本発明の抗酸化組成物はスイートコーンより抽出したＧＯＡを酵素変換することによって少なくとも０．１重量％のＨＯＡを含む。好ましくはさらに含量を高めることができ、例えば、１重量％以上又は１０重量％以上である。また、本発明の抗酸化組成物はＧＯＡとＨＯＡとの両方を含んでもよく、好ましくは１重量％以上のＧＯＡと０．１重量％以上のＨＯＡを含む。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例１］ スーパースイート種の抗酸化物質含有画分の特定
スーパースイート種のコーン果実を喫食の適期（種子としては未熟）に収穫後、コーン軸からコーン粒を分離した。次に、コーン粒をミキサーで磨砕し、コーンペーストを調製した。このペーストをスチーム加熱した後、ドラムドライヤーで乾燥し、粉砕機で粉砕してパウダーを得た。このパウダーを８０％エタノールにて抽出後、抽出物を下記条件のＨＰＬＣにより、図１に示した１２画分に分画して回収した。各画分を乾固し、５００μｌの８０％エタノールに懸濁後、各画分のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去活性は、反応液量を１５０μＬにして９６ウェルマイクロプレートを用いたことを除き、実験マニュアル（篠原和毅ら編，食品機能研究法，株式会社光琳，２１８（２０００））に記載の方法に従って測定した。その結果を表１に示したが、画分６のＤＰＰＨ消去活性が最も高いことが明らかとなった。
【００２５】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
流速：１．０ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（７０％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００−９０％（０−５分）、９０−８５％（５−２０分）、８５−７０％（２０−３５分）、７０−６７％（３５−６０分）、６７−３０％（６０−７０分）、３０−０％（７０−８０分）、０％（８０−９０分）、０−１００％（９０−９５分）、１００％（９５−１１０分）
【００２６】
【表１】
【００２７】
［実施例２］ 画分６の構造の推定
画分６の構造を決定するため、以下の条件でＨＰＬＣ−ＭＳを実施した。その結果、画分６の２本のピークは共に、分子量が３６９であり、7-(O-Glucosyloxy)-oxindole-3-acetic acid（ＧＯＡ）と推定した。１つの物質が２本のピークになる理由としては、溶液中で異性体が平衡状態をとっているためと推測された。また、ＧＯＡの直後に溶出される画分７中に、ＧＯＡのアグリコンであり分子量が２０７の7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid（ＨＯＡ）と推定される物質を確認した。
【００２８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
ＭＳ検出部：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＡＰＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
流速：０．３ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（７０％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００％（０−１５分）、１００−９０％（１５−３０分）、９０−８０％（３０−５０分）、８０−７０％（５０−６５分）、７０−６０％（６５−１００分）、６０−４０％（１００−１３５分）、４０−０％（１３５−１６０分）、０％（１６０−１７５分）、０−１００％（１７５−１８０分）、１００％（１８０−２１０分）
【００２９】
［実施例３］ ＧＯＡの精製
これまでにＧＯＡは非常に少量しか自然界に見出されておらず、その生理活性を評価することができなかった。そこでスーパースイート種コーン粒を原料としたＧＯＡの製造方法を確立するため、種々の検討を行った。その結果、以下の方法にて生理活性が評価できるレベルのＧＯＡを製造できることが明らかとなった。
【００３０】
喫食の適期に収穫したスーパースイート種コーン粒（種子としては未熟）のペースト乾燥物３６ｇを８０％エタノール９０ｍｌで２回抽出し、抽出液を濃縮遠心機により乾固した。これをメタノールに溶解した後、下記のＨＰＬＣ分画条件１により分画し、分画液を濃縮遠心機で乾固した。この乾燥物を少量のメタノールに溶解し、ＨＰＬＣにより下記のＨＰＬＣ分画条件２により分画し、分画液を濃縮遠心機で乾固した。本精製物をデシケーターでさらに一晩乾燥後−８０℃で保存した。得られたＧＯＡ精製物は１０ｍｇであった（収率０．０２８％）。
【００３１】
ＨＰＬＣ分画条件１
カラム：ＣＡＰＳＥＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ８０ ２０ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（資生堂社）
流速：６．０ｍｌ／分
オーブン温度：室温
移動相：２５％メタノール、０．１％蟻酸
分析時間：３０分
ＨＰＬＣ分画条件２
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
流速：１．０ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（１５％メタノール、０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（９９．９％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００％（０−２０分）、１００−３０％（２０−２２分）、３０％（２２−３２分）、３０−１００％（３２−３５分）、１００％（３５−５０分）
【００３２】
［実施例４］ ＧＯＡの加水分解
１ｍｇのＧＯＡを１ｍｌの水に溶解し、１８ユニットのβ−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母工業社）を添加した。これを３０℃で２時間反応させ、５ｍｌのエタノールを添加し反応を停止した。沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した後、上清を濃縮遠心機で乾固した。これを蟻酸でｐＨ３に調製した水と１−ブタノールの１：１混合液を用いて水層と１−ブタノール層に分配した。構成糖を含有する水層は濃縮乾固し、ＮＭＲ分析に供した。１−ブタノール層は乾固後、実施例３に記載のＨＰＬＣ分画により、7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid（ＨＯＡ）を精製した。
【００３３】
［実施例５］ 精製したＧＯＡの構造確認
精製したＧＯＡをＤＭＳＯ−ｄ６に懸濁し、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分析により構造を確認した。本物質のアグリコン部分は、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ、及びＣＯＳＹ、並びにＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１３Ｃ−ＮＭＲ、ＴＯＣＳＹ、及びＨＳＱＣにより解析した。また、本物質の構成糖はＢｒｕｋｅｒ ＡＶ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣにより解析した。精製したＧＯＡのアグリコンの１Ｈ−ＮＭＲの値（ｐｐｍ）は、δ＝２．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，１６．７Ｈｚ），δ＝２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１６．８Ｈｚ），δ＝３．６７（１Ｈ，ｍ），δ＝６．８６（１Ｈ，ｍ），δ＝６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．８Ｈｚ），δ＝７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，８．２Ｈｚ），δ＝１０．１９（１Ｈ，ｓ）、１３Ｃ−ＮＭＲの値は、δ＝３４．１（ｄ），δ＝４２．５（ｓ），δ＝１１５．７（ｄ），δ＝１１７．８（ｄ），δ＝１２１．９（ｓ），δ＝１３０．５（ｓ），δ＝１３２．２（ｄ），δ＝１４１．５（ｄ），δ＝１７２．２（ｓ），δ＝１７８．１（ｄ）であった。また、β−グルコシダーゼ処理して得られた構成糖と構成糖／Ｄ−グルコースの等量混合物のＨＳＱＣ比較から、構成糖がＤ−グルコースであることを確認した。従ってこれらの結果、並びに非特許文献５及び７のデータから、精製したＧＯＡの構造を確認した。
【００３４】
［実施例６］ 各種穀類、大豆、及び野菜類のＧＯＡ及びＨＯＡ含量の測定
スイート種スイートコーンのパウダー調製は、実施例１のスーパースイート種と同様の収穫時期及び方法により実施した。野菜のパウダー調製は、生鮮の野菜の凍結乾燥を行った後、粉砕機で粉砕することにより実施した。乾燥している穀類や大豆のパウダー調製は、粉砕機で粉砕することのみにより実施した。１５０ｍｇのこれらの試料に内部標準として１００μｌの５００μＭフラボンを添加し、１ｍｌの８０％エタノールで３回抽出した。遠心分離後の上清を濃縮遠心機により乾固し、５００μｌのメタノールに溶解後、フィルターろ過（０．２５μｍ）を行った。このサンプル中のＧＯＡ及びＨＯＡの含量を、実施例１に記載のＨＰＬＣ分析法に従い、精製したＧＯＡ及びＨＯＡを標準物質として使用し測定した（１０μｌサンプル注入時検出限界 ＧＯＡ：１．３ｍｇ／１００ｇ乾燥粉砕物、ＨＯＡ：０．７ｍｇ／１００ｇ乾燥粉砕物）。コーン類については、それぞれの品種について由来の異なる４検体を測定した（ただしフリント種は１検体）。また、穀類、大豆、野菜類については由来の異なる３検体を測定した。
【００３５】
コーン以外のサンプル（大麦、小麦、玄米、大豆、トマト、ポテト、ホウレンソウ、オニオン、パンプキン）においては、上記の分析だけでなく、さらに感度を上げて追加分析を実施した。追加分析では抽出時に内部標準のフラボンは添加せず、３００ｍｇの試料から３ｍｌの８０％エタノールで３回抽出し、遠心分離後の上清を濃縮遠心機により乾固し、３００μｌのメタノールに溶解後、フィルターろ過（０．２５μｍ）を行った。このサンプル中のＧＯＡ及びＨＯＡ含量の測定は、実施例１に記載したＨＰＬＣ分析法に従い実施した（４０μｌサンプル注入時検出限界 ＧＯＡ：９２μｇ／１００ｇ乾燥粉砕物、ＨＯＡ：５２μｇ／１００ｇ乾燥粉砕物）。
【００３６】
表２に示すように、コーン類は供試した全ての品種においてＧＯＡまたはＨＯＡを含有していたが、コーン以外のサンプル（大麦、小麦、玄米、大豆、トマト、ポテト、ホウレンソウ、オニオン、パンプキン）のＧＯＡ及びＨＯＡ含量は全て検出限界以下であった。従って、ＧＯＡ及びＨＯＡはコーン類に特異的な物質であると考えられた。また、スーパースイート種のＧＯＡ含量は、コーン類の中でも最も高く、スイート種がこれに続き、フリント種、ポプ種、デント種ではＧＯＡは検出限界以下であった。また、スーパースイート種やスイート種のコーン粒中のＧＯＡ含量は、非特許文献５から算出した値〔発芽時のコーン粒：０．４５９ｍｇ／１００ｇ新鮮重量（水分７５％と仮定すると１．８４ｍｇ／１００ｇ乾燥重量（ＤＭ））〕に比べ、それぞれ約６４倍、約４０倍であり極めて量が多かった。その理由としては、非特許文献６では種子発芽後のスイート種コーン粒から抽出しているのに対し、本発明者らは喫食の適期で収穫したスーパースイート種コーン粒（種子としては未熟）から抽出したためと考えられ、本発明の優位性が証明された。一方、ＨＯＡは供試した全てのコーン品種に認められたが、スイートコーンにおける量はＧＯＡの１０％以下と極めて少なかった。これらのことから、ＧＯＡ製造の原料としては、喫食の適期で収穫したスイートコーンのコーン粒が最適であり、スーパースイート種がより好ましいことが明らかとなった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
［実施例７］ ＧＯＡ及びＨＯＡの抗酸化活性の測定
実施例１に記載の方法に従い、ＧＯＡ及びＨＯＡの抗酸化活性をＤＰＰＨラジカル消去活性として測定した。測定では、Ｔｒｏｌｏｘを同時に測定し、Ｔｒｏｌｏｘ等量（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／μｍｏｌ）として活性を表した。表３に示すように、ＧＯＡのＤＰＰＨ消去活性はＨＯＡよりも弱いものの、ＨＯＡにＤ−グルコースが１つ結合しており水溶性が高いため（ＧＯＡは水／１−ブタノールの１回の分配で７５％が水層に移行するが、ＨＯＡは大部分が１−ブタノールに移行）、食品への配合が行いやすく体内への吸収性に勝ると考えられた。
【００３９】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば抗酸化作用を有する食品組成物を容易に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】スーパースイート種抽出物のＨＰＬＣのクロマトグラム（縦軸は２５０ｎｍの吸光度）を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有する７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸（以下、「ＧＯＡ」と称する。）の製造方法、それを含有する抗酸化剤及び抗酸化組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素やフリーラジカルは、癌、動脈硬化、及び老化の原因となることが知られており、近年、それらを消去する抗酸化物質が注目を集めている。古くから抗酸化物質としては、ビタミンＡ、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチンなどのカロテノイド類、イソフラボン、ケルセチン、ナリンゲニンなどのフラボノイド類、ビタミンＣ、ビタミンＥなどのビタミン類、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、システイン、アンセリン、カルノシン、グルタチオンなど、多くの物質が知られている。しかし、それぞれの物質が消去できる活性酸素種が異なることや各物質の疎水性や分子量の違いから、生体に対する作用は異なることが知られており、新たな構造を有する抗酸化物質は新たな作用を持つ可能性があるため、依然として新規な抗酸化物質の探索が進められている。そのような研究の中から見出された化合物としては、フェルラ酸−２，３−ジヒドロキシプロピル（特許文献１）、Ｎ−（４−メチルサクシンイミド−ｎ−ブチル）−ｐ−クマルアミド（特許文献２）、バラノフォニン、エリスロ−ブドレノールＡ、及びスレオ−ブドレノールＡ（特許文献３）、ルテオリン−７−グルコサイド（特許文献４）、4-(3,4-Dihydroxyphenyl)-6,7-dihydroxy-2-naphtalenecarboxylic acid（特許文献５）、キサントン誘導体（特許文献６）、マロツシン酸、及びマロチン酸（特許文献７）、Phloroglucinol誘導体（特許文献８）などが挙げられるが、より消費者にとって安全、安心な抗酸化物質の開発が望まれていた。
【０００３】
スイートコーンは、大きく分けてスイート種とスーパースイート種に分類される。スイート種は、ｓｕ１(sugary1)という遺伝子を持っていて、穀類として利用されるデント種やフリント種に比べ糖の合成が２〜３倍多く、甘味が強く、主に缶詰用として用いられている。一方、スーパースイート種は、スイート種と同様に、澱粉の代わりに糖を蓄積するが、乾燥時に収縮して表面にしわがよるといった特徴を有する。スーパースイート種は、ｓｈ２(shrunken2)という遺伝子を持っており、スイート種の４倍の糖を蓄積し、主に生食用として用いられている（非特許文献１、２）。
【０００４】
本発明者らは、過去の研究により、スーパースイート種の抗酸化活性は、スイート種、デント種、フリント種、ポプ種といった他のコーン類よりも高く、新鮮重量換算では、トマトやホウレンソウのような野菜と同等の抗酸化活性を有することを明らかにしていたが、その抗酸化活性の主成分については明らかになっていなかった（非特許文献３）。
【０００５】
Ｎｉｗａらは、工業的なでんぷん製造工程で生じる副産物のコーングルテンミールを５０％エタノール抽出、水酸化ナトリウムによる加水分解、塩酸による弱酸性化、酢酸エチル抽出、ＨＰＬＣ分画により、２００ｇのコーングルテンミールから２１．５ｍｇの７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸(7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid)（以下、「ＨＯＡ」と称する。）を単離（収率０．０１１％）できること、また、単離したＨＯＡがヒドロキシルラジカル消去活性を有することを報告している（非特許文献４）。しかし、ＨＯＡの量が少ないため産業上利用できず、また疎水性が高いため、利用が制限されるといった課題があった。７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸（ＧＯＡ）はスイート種スイートコーン種子発芽後のコーン粒や根において、アイソトープラベルしたインドール−３−酢酸やＨＯＡから合成されること、またスイート種スイートコーン種子発芽後のコーン粒のＧＯＡ及びＨＯＡの量はそれぞれ０．４５９ｍｇ／１００ｇ新鮮重量、０．１６６ｍｇ／１００ｇ新鮮重量（非特許文献５、６から算出した値）であったことが報告されている（非特許文献５、６、７）。しかし、生理活性を測定できるレベルでＧＯＡを単離精製したという報告はなく、植物ホルモンであるオーキシンの代謝物として知られているものの、その活性に関する報告はなかった。
【特許文献１】特開平６−１５８０４３号公報
【特許文献２】特開平６−１５８０４４号公報
【特許文献３】特開２０００−１０４０６３号公報
【特許文献４】特開２００２−３８１５１号公報
【特許文献５】特開２００５−１７１００３号公報
【特許文献６】特開２００６−０８９６６１号公報
【特許文献７】特開２００７−２５４４２７号公報
【特許文献８】特開２００７−２８４４３５号公報
【非特許文献１】菊地一徳、「コーン製品の知識」、幸書房（1993）
【非特許文献２】Tracy, W. F., History, Genetics, and Breeding of Supersweet (shrunken2) Sweet Corn, Plant Breeding Reviews, 14, 189-236 (1997)
【非特許文献３】永安ら、日本農芸化学会大会講演要旨集、p222 (2006)
【非特許文献４】Niwa, T. et al., Oxidative Reaction of Oxindole-3-acetic Acids, Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 1870-1874 (2003)
【非特許文献５】Nonhebel, H. M. and Bandurski, R. S., Oxidation of Indole-3-acetic Acid and Oxindole-3-acetic Acid to 2,3-Dihydroxy-2-oxo-1H Indole-3-acetic Acid-7’-O-β-D-Glucopyranoside in Zea mays Seedlings, Plant Physiol., 76, 979-983 (1984)
【非特許文献６】Lewer , P. and Bandurski, R. S., Occurrence and metabolism of 7-hydroxy-2-indolinone-3-acetic acid in Zea mays, Phytochemistry 26, 1247-1250, 1987
【非特許文献７】Nonhebel, H. M., Kruse, L. I. and Bandurski, R. S., Indole-3-acetic acid catabolism in Zea mays seedlings. Metabolic conversion of oxindole-3-acetic acid to 7-hydroxy-2-oxindole-3-acetic acid 7'-O-beta-D-glucopyranoside, J. Biol. Chem. 260, 12685-12689, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前項記載の背景技術下に、本発明は、喫食の適期で収穫したスイートコーン粒を原料としたＧＯＡの製造方法、及びそれを含有する抗酸化剤及び抗酸化組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前項記載の課題を解決すべく鋭意研究した結果、喫食の適期で収穫したスイートコーン粒中の主要な抗酸化物質としてＧＯＡを見出し、この物質がスイートコーンにおいて、他のコーン類、穀類、大豆、野菜類に比べ極めて多いことから、これを原料とした効率的なＧＯＡの製造方法を確立し、本発明を完成するに至った。なお、ＧＯＡを生理活性が測定できるレベルで製造する方法は、これまで検討されておらず、その点で本発明は極めて特異的なものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、抗酸化活性を有するＧＯＡの製造方法、それを含有する抗酸化剤に関する。また、ＧＯＡを日常的に摂取しやすくするために調製した飲食品組成物、例えば、ＧＯＡに、他の食品素材、調味素材、酸化防止剤、着色料、香料、香辛料抽出物、甘味料、酸味料、調味料、乳化剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、流動性促進剤、賦形剤などを添加し、顆粒化、カプセル化、錠剤化、可溶化して得られる固体状または液体状飲食品組成物に関するものである。
【０００９】
さらに別の観点において、本発明は、上記スイートコーンから抽出されたＧＯＡやこれにグルコシダーゼを作用させて得られるＨＯＡを、それぞれ約１重量％及び約０．１重量％以上含む抗酸化組成物を提供する。これらの組成物は天然物に含まれるこれらの化合物が１０倍以上濃縮されたものであり、抗酸化作用を有する食品用、医薬品用又は化粧品用組成物として有用である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、抗酸化活性を有するＧＯＡを高収量かつ高純度に簡便な方法で製造し得る。また、得られたＧＯＡは、抗酸化活性を顕著に有する抗酸化剤または抗酸化組成物として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る化合物７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸(7-(O-Glucosyloxy)-oxindole-3-acetic acid)（ＧＯＡ）は、植物ホルモンであるオーキシンの代謝物としてコーン(Zea mays)の実生(seedling)から初めて見出された。その代謝経路は、以下の反応式に示したように、インドール−３−酢酸からオキシインドール−３−酢酸、及び７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸を経て合成されることが報告され（非特許文献５及び６参照）下記式（１）に示す構造を有する。この化合物は、また２，３−ジヒドロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−１Ｈ−インドール−３−酢酸、又はより単純に７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸−グルコシドと称される場合もある。
【００１２】
本発明に係る化合物のスイートコーンからの抽出方法は特に限定されないが、水分含量が８０％以下となり糖含量が高くなる喫食の適期に圃場からスイートコーンの果実を収穫した後、コーン粒をコーン軸から脱粒し、粉砕機にてペースト状にすることが好ましい。スイートコーンの品種や産地も特に限定されないが、好ましくは、スーパースイート種スイートコーンが原料として使用される。
【００１３】
このペーストから直接、またはペースト乾燥品の粉砕物から抽出溶媒を用いてＧＯＡを抽出するが、本ペーストをスチーム加熱し、乾燥した後粉砕した粉末から抽出することが好ましい。ペーストの乾燥法としては、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、減圧ドラム乾燥、真空ベルト乾燥などが用いられる。乾燥品の粉砕法としては、衝撃式粉砕、せん断式粉砕、圧縮式粉砕、磨砕式粉砕などが用いられる。抽出溶媒としては、水、含水有機溶剤、または有機溶剤が用いられるが、好ましくはエタノールまたはエタノールを１０−９５％の範囲で含有する含水エタノールが用いられる。抽出工程における抽出温度は特に限定されないが、有効成分の安定性の観点から１００℃以下が好ましい。抽出時間は特に限定されないが、有効成分の濃度を向上させるという観点からは、１５分以上とすることが好ましい。
【００１４】
本抽出物から清澄な液体を得る目的で固形残渣の除去を行い、これを適宜濃縮する。そのような除去法としては、静置分離、濾過、遠心分離などが用いられる。また濃縮法としては、蒸発濃縮、膜濃縮、凍結濃縮などが用いられる。
【００１５】
このように濃縮した液体または固体を必要に応じて溶媒に溶解し、この溶液を、含水有機溶剤を溶出溶媒とするクロマトグラフィーによる分画に供する。ここで、抽出物の溶解に使用する溶剤は、溶解が可能であれば特に限定されない。
【００１６】
本分画工程において使用するクロマトグラフィーの種類や溶出方法は特に限定されない。クロマトグラフィーの種類としては、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーが挙げられ、その充填剤も特に限定されず、複数のクロマトグラフィーを組み合わせて分画を行うこともできる。溶出方法としては、例えば、抽出物をクロマトグラフィーの媒質に吸着させた後に、濃度の異なる含水有機溶剤を段階的に数種類用いるか、もしくは連続的に含水有機溶剤の溶剤濃度を変化させてＧＯＡ含有画分を溶出させることができる。含水有機溶剤を構成する有機溶剤の種類は特に限定されないが、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類が好ましい。また二種類以上の有機溶剤の混合物であってもよい。
【００１７】
次に、クロマトグラフィーによって分画したＧＯＡ含有画分を適宜濃縮し乾燥物を得る。そのような濃縮法としては、蒸発濃縮、膜濃縮、凍結濃縮などが用いられる。
【００１８】
このようにして、本発明に係るＧＯＡ精製物が得られる。このＧＯＡ精製物のＧＯＡ含有量は、好ましくは重量比２０％以上、さらに好ましくは５０重量％以上、最も好ましくは８０重量％以上である。上限は特に限定されるものではないが、この精製によりＧＯＡ含量を９０重量％まで高めることができ、水分や賦形剤を含んで安定した精製物とすることができる。精製されたＧＯＡは、フリーラジカル消去活性を有し、抗酸化剤であることが明らかとなった。フリーラジカル消去活性の測定方法は特に限定されるものではないが、比較的安定なラジカルを持つ１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を用いることが好ましい。この方法は、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨが抗酸化剤によって還元されることにより５１７ｎｍにおける吸光度の減少を捕らえて絵抗酸化能を評価する。
【００１９】
本発明のＧＯＡは、抗酸化活性を有することから、これを少なくとも１重量％含むことにより抗酸化組成物として利用可能であり、特に機能性食品などに好適に用いることができる。また、本発明のＧＯＡを含有する抗酸化組成物は、抗酸化活性を有することから、例えば、動脈硬化症、癌、高血圧、糖尿病、脳血管症、高脂血症、心筋梗塞、肌のシミなどの予防や治療を目的とする医薬組成物又は食品組成物（食品または食品添加物）としての利用も可能である。
【００２０】
本発明品の食品用抗酸化組成物の形態としては，例えば、畜産加工品（ハム、ソーセージ、ベーコンなど）、水産加工品（ちくわ，かまぼこ、はんぺんなど）、菓子類（クッキー、ケーキ、キャンデーなど）、飲料（果汁飲料、清涼飲料、栄養ドリンク、ゼリー飲料、スープなど）、乳製品（ヨーグルト、チーズ、バターなど）、主食類（パン、麺類、ご飯など）、惣菜類（ギョウザ、シュウマイ、ハンバーグなど）などが例示され、配合量としては、摂取者の体重、年齢、症状などに応じて適宜調整することができるが、一般に１〜５０％程度とされる。上記の形態の他、顆粒状、粉状、カプセル状、錠剤などであってもよく、この場合の配合量としては、摂取者の体重、年齢、症状などに応じて適宜調整することができるが、一般に１〜５０％程度とされる。これらの食品はそれぞれ常法に準じて調製することができる。
【００２１】
本発明の抗酸化組成物には、本発明の効果を妨げない範囲内で、種々の食品素材や食品添加物を添加することができる。このようなものとしては、糖類（グルコース、スクロース、トレハロース、でんぷん、デキストリン、シクロデキストリンなど）、油脂類（植物油、魚油、動物油など）、タンパク質（大豆タンパク質、乳タンパク質など）、ビタミン（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ビオチン、パントテン酸、アスコルビン酸、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥＥ、ビタミンＫ、β−カロテンなど）、ミネラル（カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、銅、クロム、ヨウ素、セレン、マンガン、モリブデンなど）、食物繊維（セルロース、ペクチン、寒天など）などの栄養成分；食品としての機能（味、食感、物性、安全性、保存性など）を付与するための食品素材（乾燥野菜、粉乳など）、調味素材（胡椒、ローズマリー、タイム、セイジ、粉末醤油、粉末味噌、粉末酒、砂糖、食塩、各種エキス粉など）、酸化防止剤（α−トコフェロール、セージ抽出物など）、着色料（カラメル色素、アナトー色素、ペニバナ色素、パプリカ色素など）、香料、香辛料抽出物、甘味料（アスパルテーム、アセスルファムＫなど）、酸味料（クエン酸、酢酸など）、調味料（グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸など）、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、レシチンなど）、増粘剤（グアーガム、ゼラチンなど）、結合剤（デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、崩壊剤（デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなど）、流動性促進剤（軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなど）を挙げることができる。当然のことながら、これらに限らず、その他の食品素材や食品添加物を配合することもできる。さらに、抗酸化作用のある他の素材（ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、トコトリエノール、リコピン、ルテイン、ゼアキサンチン、イソフラボン、ケルセチン、ナリンゲニン、α−リポ酸、コエンザイムＱ１０、システイン、アンセリン、カルノシンなど）やその他の健康増進作用を有する素材と組み合わせて使用することも可能である。
【００２２】
さらに本発明の抗酸化組成物には、上記ＧＯＡをグルコシダーゼと反応させて得られる７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸（ＨＯＡ）を含んでいてもよい。反応に用いるグルコシダーゼとしては特に限定されないが、微生物、高等植物および動物等から得られるβ−グルコシダーゼが好ましい。天然物に含まれるＨＯＡの含量は極めて低いため、本発明の抗酸化組成物はスイートコーンより抽出したＧＯＡを酵素変換することによって少なくとも０．１重量％のＨＯＡを含む。好ましくはさらに含量を高めることができ、例えば、１重量％以上又は１０重量％以上である。また、本発明の抗酸化組成物はＧＯＡとＨＯＡとの両方を含んでもよく、好ましくは１重量％以上のＧＯＡと０．１重量％以上のＨＯＡを含む。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例１］ スーパースイート種の抗酸化物質含有画分の特定
スーパースイート種のコーン果実を喫食の適期（種子としては未熟）に収穫後、コーン軸からコーン粒を分離した。次に、コーン粒をミキサーで磨砕し、コーンペーストを調製した。このペーストをスチーム加熱した後、ドラムドライヤーで乾燥し、粉砕機で粉砕してパウダーを得た。このパウダーを８０％エタノールにて抽出後、抽出物を下記条件のＨＰＬＣにより、図１に示した１２画分に分画して回収した。各画分を乾固し、５００μｌの８０％エタノールに懸濁後、各画分のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ＤＰＰＨラジカル消去活性は、反応液量を１５０μＬにして９６ウェルマイクロプレートを用いたことを除き、実験マニュアル（篠原和毅ら編，食品機能研究法，株式会社光琳，２１８（２０００））に記載の方法に従って測定した。その結果を表１に示したが、画分６のＤＰＰＨ消去活性が最も高いことが明らかとなった。
【００２５】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
流速：１．０ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（７０％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００−９０％（０−５分）、９０−８５％（５−２０分）、８５−７０％（２０−３５分）、７０−６７％（３５−６０分）、６７−３０％（６０−７０分）、３０−０％（７０−８０分）、０％（８０−９０分）、０−１００％（９０−９５分）、１００％（９５−１１０分）
【００２６】
【表１】
【００２７】
［実施例２］ 画分６の構造の推定
画分６の構造を決定するため、以下の条件でＨＰＬＣ−ＭＳを実施した。その結果、画分６の２本のピークは共に、分子量が３６９であり、7-(O-Glucosyloxy)-oxindole-3-acetic acid（ＧＯＡ）と推定した。１つの物質が２本のピークになる理由としては、溶液中で異性体が平衡状態をとっているためと推測された。また、ＧＯＡの直後に溶出される画分７中に、ＧＯＡのアグリコンであり分子量が２０７の7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid（ＨＯＡ）と推定される物質を確認した。
【００２８】
ＨＰＬＣ−ＭＳ条件
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
ＭＳ検出部：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ ＡＰＩ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
流速：０．３ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（７０％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００％（０−１５分）、１００−９０％（１５−３０分）、９０−８０％（３０−５０分）、８０−７０％（５０−６５分）、７０−６０％（６５−１００分）、６０−４０％（１００−１３５分）、４０−０％（１３５−１６０分）、０％（１６０−１７５分）、０−１００％（１７５−１８０分）、１００％（１８０−２１０分）
【００２９】
［実施例３］ ＧＯＡの精製
これまでにＧＯＡは非常に少量しか自然界に見出されておらず、その生理活性を評価することができなかった。そこでスーパースイート種コーン粒を原料としたＧＯＡの製造方法を確立するため、種々の検討を行った。その結果、以下の方法にて生理活性が評価できるレベルのＧＯＡを製造できることが明らかとなった。
【００３０】
喫食の適期に収穫したスーパースイート種コーン粒（種子としては未熟）のペースト乾燥物３６ｇを８０％エタノール９０ｍｌで２回抽出し、抽出液を濃縮遠心機により乾固した。これをメタノールに溶解した後、下記のＨＰＬＣ分画条件１により分画し、分画液を濃縮遠心機で乾固した。この乾燥物を少量のメタノールに溶解し、ＨＰＬＣにより下記のＨＰＬＣ分画条件２により分画し、分画液を濃縮遠心機で乾固した。本精製物をデシケーターでさらに一晩乾燥後−８０℃で保存した。得られたＧＯＡ精製物は１０ｍｇであった（収率０．０２８％）。
【００３１】
ＨＰＬＣ分画条件１
カラム：ＣＡＰＳＥＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ８０ ２０ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（資生堂社）
流速：６．０ｍｌ／分
オーブン温度：室温
移動相：２５％メタノール、０．１％蟻酸
分析時間：３０分
ＨＰＬＣ分画条件２
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ ４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ（ナカライテスク社）
流速：１．０ｍｌ／分
オーブン温度：３０℃
移動相：移動相Ａ（１５％メタノール、０．１％蟻酸）、移動相Ｂ（９９．９％メタノール、０．１％蟻酸）
移動相Ａの条件：１００％（０−２０分）、１００−３０％（２０−２２分）、３０％（２２−３２分）、３０−１００％（３２−３５分）、１００％（３５−５０分）
【００３２】
［実施例４］ ＧＯＡの加水分解
１ｍｇのＧＯＡを１ｍｌの水に溶解し、１８ユニットのβ−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母工業社）を添加した。これを３０℃で２時間反応させ、５ｍｌのエタノールを添加し反応を停止した。沈殿したタンパク質を遠心分離により除去した後、上清を濃縮遠心機で乾固した。これを蟻酸でｐＨ３に調製した水と１−ブタノールの１：１混合液を用いて水層と１−ブタノール層に分配した。構成糖を含有する水層は濃縮乾固し、ＮＭＲ分析に供した。１−ブタノール層は乾固後、実施例３に記載のＨＰＬＣ分画により、7-Hydroxyoxindole-3-acetic acid（ＨＯＡ）を精製した。
【００３３】
［実施例５］ 精製したＧＯＡの構造確認
精製したＧＯＡをＤＭＳＯ−ｄ６に懸濁し、ＮＭＲ（核磁気共鳴）分析により構造を確認した。本物質のアグリコン部分は、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＭＢＣ、ＮＯＥＳＹ、及びＣＯＳＹ、並びにＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１３Ｃ−ＮＭＲ、ＴＯＣＳＹ、及びＨＳＱＣにより解析した。また、本物質の構成糖はＢｒｕｋｅｒ ＡＶ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社）による１Ｈ−ＮＭＲ、ＨＳＱＣにより解析した。精製したＧＯＡのアグリコンの１Ｈ−ＮＭＲの値（ｐｐｍ）は、δ＝２．６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．２，１６．７Ｈｚ），δ＝２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３，１６．８Ｈｚ），δ＝３．６７（１Ｈ，ｍ），δ＝６．８６（１Ｈ，ｍ），δ＝６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．８Ｈｚ），δ＝７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．３，８．２Ｈｚ），δ＝１０．１９（１Ｈ，ｓ）、１３Ｃ−ＮＭＲの値は、δ＝３４．１（ｄ），δ＝４２．５（ｓ），δ＝１１５．７（ｄ），δ＝１１７．８（ｄ），δ＝１２１．９（ｓ），δ＝１３０．５（ｓ），δ＝１３２．２（ｄ），δ＝１４１．５（ｄ），δ＝１７２．２（ｓ），δ＝１７８．１（ｄ）であった。また、β−グルコシダーゼ処理して得られた構成糖と構成糖／Ｄ−グルコースの等量混合物のＨＳＱＣ比較から、構成糖がＤ−グルコースであることを確認した。従ってこれらの結果、並びに非特許文献５及び７のデータから、精製したＧＯＡの構造を確認した。
【００３４】
［実施例６］ 各種穀類、大豆、及び野菜類のＧＯＡ及びＨＯＡ含量の測定
スイート種スイートコーンのパウダー調製は、実施例１のスーパースイート種と同様の収穫時期及び方法により実施した。野菜のパウダー調製は、生鮮の野菜の凍結乾燥を行った後、粉砕機で粉砕することにより実施した。乾燥している穀類や大豆のパウダー調製は、粉砕機で粉砕することのみにより実施した。１５０ｍｇのこれらの試料に内部標準として１００μｌの５００μＭフラボンを添加し、１ｍｌの８０％エタノールで３回抽出した。遠心分離後の上清を濃縮遠心機により乾固し、５００μｌのメタノールに溶解後、フィルターろ過（０．２５μｍ）を行った。このサンプル中のＧＯＡ及びＨＯＡの含量を、実施例１に記載のＨＰＬＣ分析法に従い、精製したＧＯＡ及びＨＯＡを標準物質として使用し測定した（１０μｌサンプル注入時検出限界 ＧＯＡ：１．３ｍｇ／１００ｇ乾燥粉砕物、ＨＯＡ：０．７ｍｇ／１００ｇ乾燥粉砕物）。コーン類については、それぞれの品種について由来の異なる４検体を測定した（ただしフリント種は１検体）。また、穀類、大豆、野菜類については由来の異なる３検体を測定した。
【００３５】
コーン以外のサンプル（大麦、小麦、玄米、大豆、トマト、ポテト、ホウレンソウ、オニオン、パンプキン）においては、上記の分析だけでなく、さらに感度を上げて追加分析を実施した。追加分析では抽出時に内部標準のフラボンは添加せず、３００ｍｇの試料から３ｍｌの８０％エタノールで３回抽出し、遠心分離後の上清を濃縮遠心機により乾固し、３００μｌのメタノールに溶解後、フィルターろ過（０．２５μｍ）を行った。このサンプル中のＧＯＡ及びＨＯＡ含量の測定は、実施例１に記載したＨＰＬＣ分析法に従い実施した（４０μｌサンプル注入時検出限界 ＧＯＡ：９２μｇ／１００ｇ乾燥粉砕物、ＨＯＡ：５２μｇ／１００ｇ乾燥粉砕物）。
【００３６】
表２に示すように、コーン類は供試した全ての品種においてＧＯＡまたはＨＯＡを含有していたが、コーン以外のサンプル（大麦、小麦、玄米、大豆、トマト、ポテト、ホウレンソウ、オニオン、パンプキン）のＧＯＡ及びＨＯＡ含量は全て検出限界以下であった。従って、ＧＯＡ及びＨＯＡはコーン類に特異的な物質であると考えられた。また、スーパースイート種のＧＯＡ含量は、コーン類の中でも最も高く、スイート種がこれに続き、フリント種、ポプ種、デント種ではＧＯＡは検出限界以下であった。また、スーパースイート種やスイート種のコーン粒中のＧＯＡ含量は、非特許文献５から算出した値〔発芽時のコーン粒：０．４５９ｍｇ／１００ｇ新鮮重量（水分７５％と仮定すると１．８４ｍｇ／１００ｇ乾燥重量（ＤＭ））〕に比べ、それぞれ約６４倍、約４０倍であり極めて量が多かった。その理由としては、非特許文献６では種子発芽後のスイート種コーン粒から抽出しているのに対し、本発明者らは喫食の適期で収穫したスーパースイート種コーン粒（種子としては未熟）から抽出したためと考えられ、本発明の優位性が証明された。一方、ＨＯＡは供試した全てのコーン品種に認められたが、スイートコーンにおける量はＧＯＡの１０％以下と極めて少なかった。これらのことから、ＧＯＡ製造の原料としては、喫食の適期で収穫したスイートコーンのコーン粒が最適であり、スーパースイート種がより好ましいことが明らかとなった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
［実施例７］ ＧＯＡ及びＨＯＡの抗酸化活性の測定
実施例１に記載の方法に従い、ＧＯＡ及びＨＯＡの抗酸化活性をＤＰＰＨラジカル消去活性として測定した。測定では、Ｔｒｏｌｏｘを同時に測定し、Ｔｒｏｌｏｘ等量（μｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／μｍｏｌ）として活性を表した。表３に示すように、ＧＯＡのＤＰＰＨ消去活性はＨＯＡよりも弱いものの、ＨＯＡにＤ−グルコースが１つ結合しており水溶性が高いため（ＧＯＡは水／１−ブタノールの１回の分配で７５％が水層に移行するが、ＨＯＡは大部分が１−ブタノールに移行）、食品への配合が行いやすく体内への吸収性に勝ると考えられた。
【００３９】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば抗酸化作用を有する食品組成物を容易に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】スーパースイート種抽出物のＨＰＬＣのクロマトグラム（縦軸は２５０ｎｍの吸光度）を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
前記７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸が、スイートコーン粒を抽出処理して得られる請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記スイートコーンがスーパースイート種である請求項２に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
前記抽出処理が、スイートコーン粒を磨砕し、水、含水有機溶剤、又は有機溶剤を抽出溶媒として抽出した後、抽出画分をクロマトグラフィーにより精製することを含む請求項２又は３に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤を飲食品に添加してなることを特徴とする機能性飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤を少なくとも１重量％含有する食品用、医薬品用又は化粧品用抗酸化組成物。
【請求項７】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤とグルコシダーゼとを反応して得られる７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸を少なくとも０．１重量％含むことを特徴とする抗酸化組成物。
【請求項８】
スイートコーン粒を磨砕し、水、含水有機溶剤、又は有機溶剤を抽出溶媒として抽出した後、抽出画分をクロマトグラフィーにより精製することを含む、抗酸化性物質７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸の製造方法。
【請求項１】
７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項２】
前記７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸が、スイートコーン粒を抽出処理して得られる請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記スイートコーンがスーパースイート種である請求項２に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
前記抽出処理が、スイートコーン粒を磨砕し、水、含水有機溶剤、又は有機溶剤を抽出溶媒として抽出した後、抽出画分をクロマトグラフィーにより精製することを含む請求項２又は３に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤を飲食品に添加してなることを特徴とする機能性飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤を少なくとも１重量％含有する食品用、医薬品用又は化粧品用抗酸化組成物。
【請求項７】
請求項１〜４何れか記載の抗酸化剤とグルコシダーゼとを反応して得られる７−ヒドロキシオキシインドール−３−酢酸を少なくとも０．１重量％含むことを特徴とする抗酸化組成物。
【請求項８】
スイートコーン粒を磨砕し、水、含水有機溶剤、又は有機溶剤を抽出溶媒として抽出した後、抽出画分をクロマトグラフィーにより精製することを含む、抗酸化性物質７−（Ｏ−グルコシルオキシ）−オキシインドール−３−酢酸の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１７３８２２（Ｐ２００９−１７３８２２Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６０７６（Ｐ２００８−１６０７６）
【出願日】平成２０年１月２８日（２００８．１．２８）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２８日（２００８．１．２８）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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