抗高血圧ペプチド
本発明は、医薬調製物、栄養補助食品における有効成分として、または食品添加物として使用し得る新規抗高血圧ペプチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬品、栄養補助食品における有効成分として、または食品添加物として使用し得る新規抗高血圧ペプチドに関する。
【０００２】
発明の背景
高血圧症、すなわち、高血圧は、世界で約１億７千万人の人々が発症している疾患である。高血圧は、臨床的には、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上と定義されている。高血圧症は、多くの場合、冠動脈疾患、卒中および心筋梗塞の原因であるため、それらの人々にとって深刻な脅威である。
【０００３】
高血圧症の原因は、ほとんどの場合、分かっていないが、高血圧症の一調節因子であるレニン−アンジオテンシン機構はよく研究されている。この機構では、アンジオテンシンＩと呼ばれるペプチドがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用によって切断される。この反応生成物であるアンジオテンシンIIは強力な血管収縮薬である。アンジオテンシンIIは、血管壁の平滑筋の収縮を刺激することによって、高血圧症を誘発する。さらに、アンジオテンシンIIは、ブラジキニン（血圧を降下させるペプチド）の分解を促す。そのため、酵素ＡＣＥを阻害することによって、高血圧症を誘発するペプチドであるアンジオテンシンIIの形成が阻止されるだけでなく、血圧を降下させるペプチド（ブラジキニン）の分解も阻害される。この酵素を阻害することによって、これらのプロセスが阻止されることから、ＡＣＥの阻害薬は抗高血圧作用を有する。
【０００４】
高血圧症を治療するための医薬品はいくつか市場に出ている。このような、いわゆるＡＣＥ阻害薬の例が；ベナゼプリル（ロテンシン）；カプトプリル（カポテン）；カプトプリル／ヒドロクロロチアジド（カポジド）；マレイン酸エナラプリル（バソテック）；フォシノプリルナトリウム（モノプリル）；リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）；キナプリル／炭酸マグネシウム（アキュプリル）；ラミプリル（アルテース）；トランドラプリル（Ｍａｖｉｋ）である。これらの医薬品は血圧を降下させるのに有効であるが、これらのＡＣＥ阻害薬のマイナス面は、夜間の空咳、めまい、立ちくらみおよび頭痛の発生をはじめとするそれらの副作用である。ＡＣＥ阻害薬はまた、カリウム蓄積と腎臓の問題を引き起こすことはあるため、カリウムレベルと腎臓機能をモニタリングする必要がある。さらに、ＡＣＥ阻害薬は総て、生命を脅かし得る重度のアレルギー反応を引き起こす可能性があると思われる。
【０００５】
また、食材からもたらされるいくつかのペプチドが、高血圧症を治療する可能性について研究されてきた。これらのペプチドはＡＣＥを阻害するうえ、ヒト安全性試験によれば、副作用は全く生じないようである。１日用量、１日につき最大３０グラムでは、ＡＣＥ阻害薬に典型的な夜間の空咳などの副作用は全く生じなかった。
【０００６】
いくつかの食品が、ＡＣＥを阻害するペプチドの単離に利用されてきた。例えば、ウシ乳汁、大豆、ニワトリの筋肉およびツナのタンパク質画分からペプチドが同定された。ＡＣＥ阻害ペプチドを含有するタンパク質加水分解物は、すでに数種類が市場に出回っており、栄養補助食品または食品添加物として販売されている。
【０００７】
ＡＣＥ阻害作用についての研究には、乳汁タンパク質から得られるペプチドが最適なものであろう。数種類のペプチドが単離されており、それらのペプチドは高血圧のラットに加えて、ヒトにおいてさえも研究されている（総説については、FitzGerald and Meisel 2000, British Journal of Nutrition 84, S33-S37参照）。抗高血圧作用を有する乳汁由来ペプチドの例は、乳汁の発酵中に産生するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＶＰＰ）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＰＰ）である。これらのＡＣＥ阻害ペプチドは、高血圧ラットおよび高血圧ヒトにおいて高血圧を降下させる。
【０００８】
しかしながら、現在までに見つけられているＡＣＥ阻害ペプチドの多くは、消化管において吸収されないか、または分解されないために、高血圧を降下しない。そのため、ＡＣＥの阻害薬であるということだけでは、高血圧の被験体において高血圧を降下させ得るペプチドとしては不十分であり、そのようなペプチドは生物学的に利用可能なものであり、無傷で血管壁の平滑筋のレニン−アンジオテンシン機構に達することが必要である。よって、無傷で吸収され、高血圧被験体において抗高血圧作用を発揮する新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定することが望ましいであろう。
【０００９】
発明の概要
従って、本発明は、その態様の１つにおいて、抗高血圧作用を有する新規食物由来ペプチドを提供する。本発明に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドは、配列番号１、配列番号２および配列番号３、アミノ酸８個以下を有する、前記アミノ酸配列を含んでなるペプチド、これらのペプチドの断片、ならびに前記ペプチドおよびそれらの断片の付加塩、エステル、溶媒和物および無水物である。ペプチド、配列番号１、配列番号２および配列番号３は、ヤギ乳汁とヒツジ乳汁の両方の加水分解カゼイン画分から単離され、同定されている。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、ならびに前記ペプチドおよびそれらの断片の付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる抗高血圧組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる医薬組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる抗高血圧組成物を含有する食品組成物およびタンパク質加水分解物を提供することである。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、高血圧症に伴って起こる卒中、冠動脈性心臓病、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤のような心血管疾患を軽減または予防する方法を提供することであり、その方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの有効量を投与することを含む。
本発明の最後の態様は、本発明のペプチドおよび加水分解物の製造方法である。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様に含まれるペプチドは、以下に示すものである：
アミノ酸８個以下を有する、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの断片。
配列番号７、配列番号８および配列番号９に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド断片。
【００１５】
また、本発明の第１の態様には、ペプチドの誘導体、例えば、既述のペプチドの酸付加塩または塩基付加塩、特に、医薬上許容される塩、エステル、溶媒和物および無水物も含まれる。
【００１６】
上記のペプチドおよびそれらの断片において、Ｔｙｒはアミノ酸Ｌ−チロシンを表し、ＧｌｙはＬ−グリシンを表し、ＰｒｏはＬ−プロリンを表し、ＩｌｅはＬ−イソロイシンを表し、ＡｓｎはＬ−アスパラギンを表し、ＳｅｒはＬ−セリンを表し、ＬｅｕはＬ−ロイシンを表し、ＶａｌはＬ−バリンを表し、ＰｈｅはＬ−フェニルアラニンを表し、ＧｌｕはＬ−グルタミン酸を表し、そして、ＬｙｓはＬ−リシンを表す。本発明に含まれる総てのペプチドは、酵素、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害する新規ペプチドであり、それらのペプチドが消化管から無傷で吸収される結果として、高血圧症が予防または軽減される。このために、これらのペプチドの１つを治療量で使用してもよいし、これらのペプチドの任意の組み合わせを使用してもよい。これらのペプチドについての有効量は決定されており、１日につき体重１ｋｇ当たり２ｍｇ〜２００ｍｇ間、好ましくは１日につき体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜５０ｍｇの間であることが分かった。記載される有効量とは、本発明に含まれるペプチドの合量であり、この有効量によって、高血圧被験体(subject)における収縮期血圧を１０ｍｍＨｇ以上降下させ得る。
【００１７】
本発明の第２の態様は、本発明の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる組成物を含む。特に、前記組成物は、本発明の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの医薬上許容される誘導体と、医薬上許容される担体と、結合剤および／または補助材料を含んでなる医薬組成物である。前記ペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。担体材料、結合剤および／または補助材料は、処方物または調製物の他の成分と組み合わせることができ、処置された生物に副作用を及ぼさないように、医薬的にも薬理学的にも許容されるものでなけらばならない。医薬組成物は単回投与形態であり得る。その組成物は、薬理学分野において公知の方法に従って製造される。投与に適した有効物質の適切な量は、特に、現場での治療の関数として変化し得る。一般に、単回投与用処方物中の有効物質の濃度は、処方物総量の５％〜９５％である。本発明のペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる食品組成物である。前記ペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。好ましい食用組成物は、飲料、煎じ食品(infused food)、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムならびに中間食品から選択される。また、本発明は、食品組成物として、ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁から得られる、本発明のペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つが富化されたタンパク質加水分解物も意図する。本発明の好ましいタンパク質加水分解物において、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの塩の合量がタンパク質加水分解物の０．１％〜５％の間、好ましくは１％〜２％の間（乾燥重量）である。栄養補助食品および食品原料成分を含む食用組成物の製造において本発明のペプチドおよびそれらの誘導体、ならびにタンパク質加水分解物を用いることができることは明らかである。
【００１９】
本発明に含まれるペプチドは、それを必要としている人に実質的な純粋な形で投与することができるし、より複雑な組成物の一部として与えることもできる。ペプチド総和の実質的に純粋な形態は、純度が少なくとも５０重量％と定義される。ペプチドを、それを必要としている人により複雑な混合物の一部として与える場合には、その人に与えるこの混合物の量は、本発明に記載されるペプチド総和が有効量に達するような量であるべきである。これらのペプチドを含むか、またはそれらのペプチドが添加される得る混合物の例は、乾燥タンパク質抽出物、加水分解タンパク質抽出物、乾燥植物抽出物、カカオパウダー、乾燥食用組成物などである。記載されるペプチドを必要としている人は、本発明のペプチドを、医薬組成物として、これらのペプチドを含む組成物の一部として、例えば、栄養補助食品として、またはこれらのペプチドが有効量で添加された食品マトリックスの一部として、純粋な形態で消費することができる。本発明のペプチドを含む抗高血圧組成物を添加し得る食品マトリックスの例としては、飲料、煎じ食品、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダ用ドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムおよび中間食品が挙げられる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、医薬として用いるための、特に、哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための本発明のペプチドまたはそれらの誘導体、本発明の組成物または加水分解物である。同様に、本発明のペプチドまたはそれらの誘導体を、医薬の製造において、特に、哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療用または予防用の医薬の製造において使用することができる。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、本発明のペプチドの製造のための方法である。従って、それらのペプチドは、以下に示す工程を含む方法によって製造することができる：
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁、好ましくは脱脂粉乳、のカゼイン画分を得る工程。このカゼイン画分は、好ましくは精密濾過によるか、または酸性化によって得られる。
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程。製造すべきペプチドに応じて、異なるプロテアーゼを使用する必要がある。従って、配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を有するペプチドを得るためには、サブチリシンまたは同等のプロテアーゼが使用され、任意のバチルス(Bacillus)種、例えば、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のサブチリシン酵素が有用である。また、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の配列を含んでなるペプチド、特に、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６の配列を有するペプチドまたは前記ペプチドの断片、特に、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９の配列を有する断片を得るためには、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンが使用される。
ｃ）加水分解工程後に、プロテアーゼを、好ましくは熱処理、例えば、加水分解物を９０℃に１０分間加熱すること、によるか、または酸性化によって不活性化する工程。
ｄ）本発明のペプチドを、さらに、限外濾過、ナノフィルトレーション、クロマトグラフィーまたは電気透析などの方法により単離し、精製する工程。
本発明のペプチドは、固相合成法(Atherton and Sheppard (1989). Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford, IRL Press)によっても製造することができる。
本発明のさらにもう１つの態様は、本発明のタンパク質加水分解物の製造である。従って、前記加水分解物は、以下に示す工程を含む方法によって製造することができる：
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁、好ましくは脱脂粉乳、のカゼイン画分を得る工程。このカゼイン画分は、好ましくは精密濾過によるか、または酸性化によって得られる。
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程。加水分解物の組成に応じて、異なるプロテアーゼを使用する必要がある。
ｃ）加水分解工程後に、プロテアーゼを、好ましくは熱処理、例えば、加水分解物を９０℃に１０分間加熱すること、によるか、または酸性化によって不活性化する工程。
ｄ）さらに、その混合物の本発明のペプチドを富化する工程。
ｅ）所望により、その加水分解物を乾燥させて、粉末を得る工程。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
抗高血圧組成物の製造
ヤギ乳汁５００Ｌのカゼイン画分を、乳汁をｐＨ３．０に調整することによって得、乳漿タンパク質を遠心分離により除去した。カゼインタンパク質を蒸発濃縮し、１Ｌ当たりタンパク質１０ｇとした。次に、カゼイン溶液に、プロテアーゼ、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のサブチリシン（Genencor社製Multifect P-3000、１容量％）を添加し、５５℃にて３時間培養した。加熱すること（１００℃にて１０分間）により反応を終了させ、その混合物を、最後に乾燥させた。ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、記載されている微小配列決定法(Matsudaira P. A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. Academic Press 1993)により同定した。簡潔には、カゼイン加水分解物をAKTA Explorer(Amersham Biosciences)において、Resource RP(Amersham Biosciences)カラムと水−アセトニトリルの直線勾配（０〜１００％、流速０．２ｍｌ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。画分１ｍｌを集め、標準的な酵素アッセイ法によりＡＣＥ阻害測定を実施した(Wu et al. 2002 J. Chromatography 950, 125-130)。画分番号１７は高いＡＣＥ阻害活性を示し、この画分を２回目の精製に用いた。この際、ペプチドの分離は、以下の条件を用いたＨＰＬＣ(Waters)により行った；Zorbax 17カラム材料、溶出剤としてトリフルオロ酢酸および流速０．５ｍｌ／分。図１に典型的な分離を示している。画分０．５ｍｌを集め、それらのＡＣＥ阻害能力を判定した。３つの画分（図１参照）にＡＣＥ阻害活性があることが分かり、それらの画分を微小配列決定に用いた（Eurosequence, Netherlandsにより実施）。このようにして、カゼイン加水分解物において以下の新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定した：配列番号１、配列番号２および配列番号３。３つのものは総て、β−カゼインから得られたペプチド、配列番号１（β−ＣＮ ｆ７８−８３）、配列番号２（β−ＣＮ ｆ８４−
８７）および配列番号３（β−ＣＮ ｆ１８１−１８４）である。得られた加水分解物中の各ペプチドの量は、質量検出器(Waters)を備えたＨＰＬＣにより測定した。各ペプチドについての標準曲線を純粋な合成ペプチドを用いて作成した。加水分解物中の各ペプチドの量は、おおよそで、配列番号１；０．３０重量％、配列番号２；０．２８重量％および配列番号３；０．１９重量％であった。ヒツジ乳汁５００Ｌおよびウシ乳汁５００Ｌを用いて、本実施例に記載の手順を繰り返した。ヒツジ乳汁から得られた加水分解物において、３種類のペプチド総てが確認された（配列番号１（β−ＣＮ ｆ７８−８３）；０．３９重量％、配列番号２（β−ＣＮ ｆ８４−８７）；０．３６重量％および配列番号３（β−ＣＮ ｆ１８１−１８４）；０．２５重量％）が、これらのペプチドはウシ乳汁から得られた加水分解物には存在しなかった。実施例４、５および６に記載される試験には、ヤギ乳汁から得られた加水分解物を用いた。
【００２３】
実施例２
アンジオテンシン変換酵素の阻害
本発明に含まれるペプチドのＩＣ５０値を決定するために、純粋なペプチド（純度＞９５重量％）を１０μｍｏｌ規模でのカスタム固相合成により製造し、続いてＨＰＬＣにより精製した（合成および精製はEurosequence, Netherlandsにより実施）。ＡＣＥアッセイには、精製ＡＣＥ酵素(Sigma)を使用した(Wu et al. 2002 J. Chromatography 950, 125-130)。配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドがＡＣＥの強力な阻害薬であることが分かった（以下の表を参照）。配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、特に、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するペプチドも優れたＡＣＥ阻害薬である（以下の表を参照）。最後に、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列の断片であるペプチド（それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９）をＡＣＥ阻害活性について試験した。それらのＩＣ５０値から分かるように、これらのペプチドも優れたＡＣＥ阻害薬である（以下の表を参照）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例３
抗高血圧ペプチドのバイオアベイラビリティ
ペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）（純度＞９５重量％、各５００μｇ）をマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ、３ヶ月齢）に経口投与した。２時間後、マウスを犠牲にし、血液サンプルを採取した。その血液サンプルを遠心分離後（５分、３０００ｇ）、血漿を回収し、乾燥させ、酢酸エチルに再懸濁した。次に、サンプルをＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し、血漿サンプル中に存在する本発明のペプチドの量を標準曲線を用いて算定した。それらの経口投与の２時間後、３種類のペプチド総てが血漿サンプル中に以下の量で見られた：配列番号１：７．５μｇ／ｍｌ、配列番号２：１．２μｇ／ｍｌおよび配列番号３：０．９μｇ／ｍｌ。これらの結果は、本発明のペプチドが生物学的に利用可能であり、消化管から無傷で吸収されるということを示している。
【００２６】
実施例４
高血圧ラットにおける血圧降下作用
本試験では自然高血圧発症ラット（雌）を使用した。試験期間は、６週齢のラット１０匹に、実施例１の組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）をそれらの飲料水に溶かして与えた。これらのラットは１日当たり実施例１の組成物約７０〜９０ｍｇの間を摂取すると推定された。別のラット１０匹を対照として使用した。両群のラットには、飼料（標準的な食物）と飲料水を自由に摂取させた。試験開始時と２週間経過するごとに収縮期血圧を測定した（標準的なtail cuff法）。図２は、試験期間の両群における収縮期血圧の経過を示す図である。対照ラットでは、収縮期血圧が齢６週間から、定常状態に達する１４週間まで着実に増加した。実施例１に記載の組成物を消費したラットの群では、同様に収縮期血圧が１４週間まで増加したが、その増加は有意に低下していた（１４週間について、ｐ＜０．００５）。また、１４週間以降の収縮期血圧は対照群よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、本発明のペプチドを含む実施例１の組成物が自然高血圧発症ラットにおいて収縮期血圧の降下を引き起こすということをはっきりと示している。本発明者らは、実施例１の組成物が抗高血圧組成物であると推断する。
【００２７】
実施例５
高血圧ヒトにおける血圧降下作用
４０名の投薬治療を行っていない非喫煙者、高血圧の男性（２０名）および女性（２０名）を２群に無作為化した。２０名には、毎日５週間、実施例１の組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）２５グラムを水で服用し、通常の生活習慣を守るように指示した。残る２０名のボランティアには、毎日５週間、プラシーボ（粉乳）２５グラムを水で服用し、通常の生活習慣を守るように指示した。参加者は、毎週、早朝に、血圧測定、採血、副作用の評価、食事の評価および一般モニタリングについてGeneral Clinical Research Clinicに報告した。
【００２８】
処置の１０日後に、収縮期血圧と弛緩期血圧の両方において有意な降下が起こり、試験中持続した。プラシーボを服用した対照群とは対照的に、実施例１の組成物を服用したボランティアでは、平均して、収縮期血圧（平均１２ｍｍＨｇの降下）と弛緩期血圧（平均８ｍｍＨｇの降下）が降下した。両群間には、肝機能および腎機能などの処置に関連する副作用には差がなかった。
これらの試験結果に基づき、本発明に記載される抗高血圧ペプチドを含有する実施例１の組成物は、未治療の高血圧患者における収縮期血圧と弛緩期血圧の両方を降下させる。
【００２９】
実施例６
抗高血圧組成物を含有する食品の製造
富化ジュースを以下の成分を用いて製造した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
加工技術
濃縮ジュースに、水および水溶性成分を加えて、最終製品を製造した。次に、実施例１の抗高血圧組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）を添加し、混合し、得られた製品を低温殺菌し、ホモジナイズした。最後に、製品を冷却し、パッケージングした。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に含まれるペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）の精製中に得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。矢印は、微小配列決定(microsequencing)に用いられる、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を示している。
【図２】自然高血圧発症ラットの収縮期血圧に対する実施例１の組成物の効果を示す図である。白丸は対照群における収縮期血圧を示し、黒四角は実施例１の組成物の消費群における収縮期血圧を示している。データは平均±ＳＥＭ（各群、ｎ＝１０）である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、医薬品、栄養補助食品における有効成分として、または食品添加物として使用し得る新規抗高血圧ペプチドに関する。
【０００２】
発明の背景
高血圧症、すなわち、高血圧は、世界で約１億７千万人の人々が発症している疾患である。高血圧は、臨床的には、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上と定義されている。高血圧症は、多くの場合、冠動脈疾患、卒中および心筋梗塞の原因であるため、それらの人々にとって深刻な脅威である。
【０００３】
高血圧症の原因は、ほとんどの場合、分かっていないが、高血圧症の一調節因子であるレニン−アンジオテンシン機構はよく研究されている。この機構では、アンジオテンシンＩと呼ばれるペプチドがアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用によって切断される。この反応生成物であるアンジオテンシンIIは強力な血管収縮薬である。アンジオテンシンIIは、血管壁の平滑筋の収縮を刺激することによって、高血圧症を誘発する。さらに、アンジオテンシンIIは、ブラジキニン（血圧を降下させるペプチド）の分解を促す。そのため、酵素ＡＣＥを阻害することによって、高血圧症を誘発するペプチドであるアンジオテンシンIIの形成が阻止されるだけでなく、血圧を降下させるペプチド（ブラジキニン）の分解も阻害される。この酵素を阻害することによって、これらのプロセスが阻止されることから、ＡＣＥの阻害薬は抗高血圧作用を有する。
【０００４】
高血圧症を治療するための医薬品はいくつか市場に出ている。このような、いわゆるＡＣＥ阻害薬の例が；ベナゼプリル（ロテンシン）；カプトプリル（カポテン）；カプトプリル／ヒドロクロロチアジド（カポジド）；マレイン酸エナラプリル（バソテック）；フォシノプリルナトリウム（モノプリル）；リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）；キナプリル／炭酸マグネシウム（アキュプリル）；ラミプリル（アルテース）；トランドラプリル（Ｍａｖｉｋ）である。これらの医薬品は血圧を降下させるのに有効であるが、これらのＡＣＥ阻害薬のマイナス面は、夜間の空咳、めまい、立ちくらみおよび頭痛の発生をはじめとするそれらの副作用である。ＡＣＥ阻害薬はまた、カリウム蓄積と腎臓の問題を引き起こすことはあるため、カリウムレベルと腎臓機能をモニタリングする必要がある。さらに、ＡＣＥ阻害薬は総て、生命を脅かし得る重度のアレルギー反応を引き起こす可能性があると思われる。
【０００５】
また、食材からもたらされるいくつかのペプチドが、高血圧症を治療する可能性について研究されてきた。これらのペプチドはＡＣＥを阻害するうえ、ヒト安全性試験によれば、副作用は全く生じないようである。１日用量、１日につき最大３０グラムでは、ＡＣＥ阻害薬に典型的な夜間の空咳などの副作用は全く生じなかった。
【０００６】
いくつかの食品が、ＡＣＥを阻害するペプチドの単離に利用されてきた。例えば、ウシ乳汁、大豆、ニワトリの筋肉およびツナのタンパク質画分からペプチドが同定された。ＡＣＥ阻害ペプチドを含有するタンパク質加水分解物は、すでに数種類が市場に出回っており、栄養補助食品または食品添加物として販売されている。
【０００７】
ＡＣＥ阻害作用についての研究には、乳汁タンパク質から得られるペプチドが最適なものであろう。数種類のペプチドが単離されており、それらのペプチドは高血圧のラットに加えて、ヒトにおいてさえも研究されている（総説については、FitzGerald and Meisel 2000, British Journal of Nutrition 84, S33-S37参照）。抗高血圧作用を有する乳汁由来ペプチドの例は、乳汁の発酵中に産生するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＶＰＰ）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＰＰ）である。これらのＡＣＥ阻害ペプチドは、高血圧ラットおよび高血圧ヒトにおいて高血圧を降下させる。
【０００８】
しかしながら、現在までに見つけられているＡＣＥ阻害ペプチドの多くは、消化管において吸収されないか、または分解されないために、高血圧を降下しない。そのため、ＡＣＥの阻害薬であるということだけでは、高血圧の被験体において高血圧を降下させ得るペプチドとしては不十分であり、そのようなペプチドは生物学的に利用可能なものであり、無傷で血管壁の平滑筋のレニン−アンジオテンシン機構に達することが必要である。よって、無傷で吸収され、高血圧被験体において抗高血圧作用を発揮する新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定することが望ましいであろう。
【０００９】
発明の概要
従って、本発明は、その態様の１つにおいて、抗高血圧作用を有する新規食物由来ペプチドを提供する。本発明に含まれるＡＣＥ阻害ペプチドは、配列番号１、配列番号２および配列番号３、アミノ酸８個以下を有する、前記アミノ酸配列を含んでなるペプチド、これらのペプチドの断片、ならびに前記ペプチドおよびそれらの断片の付加塩、エステル、溶媒和物および無水物である。ペプチド、配列番号１、配列番号２および配列番号３は、ヤギ乳汁とヒツジ乳汁の両方の加水分解カゼイン画分から単離され、同定されている。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、ならびに前記ペプチドおよびそれらの断片の付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる抗高血圧組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる医薬組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの１つ以上を含んでなる抗高血圧組成物を含有する食品組成物およびタンパク質加水分解物を提供することである。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、高血圧症に伴って起こる卒中、冠動脈性心臓病、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤のような心血管疾患を軽減または予防する方法を提供することであり、その方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、これらのアミノ酸配列を含んでなるペプチドおよびこれらのペプチドの断片、またはそれらの許容される付加塩、エステル、溶媒和物および無水物からなる群から選択されるペプチドの有効量を投与することを含む。
本発明の最後の態様は、本発明のペプチドおよび加水分解物の製造方法である。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様に含まれるペプチドは、以下に示すものである：
アミノ酸８個以下を有する、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド。
配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの断片。
配列番号７、配列番号８および配列番号９に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド断片。
【００１５】
また、本発明の第１の態様には、ペプチドの誘導体、例えば、既述のペプチドの酸付加塩または塩基付加塩、特に、医薬上許容される塩、エステル、溶媒和物および無水物も含まれる。
【００１６】
上記のペプチドおよびそれらの断片において、Ｔｙｒはアミノ酸Ｌ−チロシンを表し、ＧｌｙはＬ−グリシンを表し、ＰｒｏはＬ−プロリンを表し、ＩｌｅはＬ−イソロイシンを表し、ＡｓｎはＬ−アスパラギンを表し、ＳｅｒはＬ−セリンを表し、ＬｅｕはＬ−ロイシンを表し、ＶａｌはＬ−バリンを表し、ＰｈｅはＬ−フェニルアラニンを表し、ＧｌｕはＬ−グルタミン酸を表し、そして、ＬｙｓはＬ−リシンを表す。本発明に含まれる総てのペプチドは、酵素、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害する新規ペプチドであり、それらのペプチドが消化管から無傷で吸収される結果として、高血圧症が予防または軽減される。このために、これらのペプチドの１つを治療量で使用してもよいし、これらのペプチドの任意の組み合わせを使用してもよい。これらのペプチドについての有効量は決定されており、１日につき体重１ｋｇ当たり２ｍｇ〜２００ｍｇ間、好ましくは１日につき体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜５０ｍｇの間であることが分かった。記載される有効量とは、本発明に含まれるペプチドの合量であり、この有効量によって、高血圧被験体(subject)における収縮期血圧を１０ｍｍＨｇ以上降下させ得る。
【００１７】
本発明の第２の態様は、本発明の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる組成物を含む。特に、前記組成物は、本発明の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの医薬上許容される誘導体と、医薬上許容される担体と、結合剤および／または補助材料を含んでなる医薬組成物である。前記ペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。担体材料、結合剤および／または補助材料は、処方物または調製物の他の成分と組み合わせることができ、処置された生物に副作用を及ぼさないように、医薬的にも薬理学的にも許容されるものでなけらばならない。医薬組成物は単回投与形態であり得る。その組成物は、薬理学分野において公知の方法に従って製造される。投与に適した有効物質の適切な量は、特に、現場での治療の関数として変化し得る。一般に、単回投与用処方物中の有効物質の濃度は、処方物総量の５％〜９５％である。本発明のペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる食品組成物である。前記ペプチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは組成物中、哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する。好ましい食用組成物は、飲料、煎じ食品(infused food)、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムならびに中間食品から選択される。また、本発明は、食品組成物として、ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁から得られる、本発明のペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つが富化されたタンパク質加水分解物も意図する。本発明の好ましいタンパク質加水分解物において、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの塩の合量がタンパク質加水分解物の０．１％〜５％の間、好ましくは１％〜２％の間（乾燥重量）である。栄養補助食品および食品原料成分を含む食用組成物の製造において本発明のペプチドおよびそれらの誘導体、ならびにタンパク質加水分解物を用いることができることは明らかである。
【００１９】
本発明に含まれるペプチドは、それを必要としている人に実質的な純粋な形で投与することができるし、より複雑な組成物の一部として与えることもできる。ペプチド総和の実質的に純粋な形態は、純度が少なくとも５０重量％と定義される。ペプチドを、それを必要としている人により複雑な混合物の一部として与える場合には、その人に与えるこの混合物の量は、本発明に記載されるペプチド総和が有効量に達するような量であるべきである。これらのペプチドを含むか、またはそれらのペプチドが添加される得る混合物の例は、乾燥タンパク質抽出物、加水分解タンパク質抽出物、乾燥植物抽出物、カカオパウダー、乾燥食用組成物などである。記載されるペプチドを必要としている人は、本発明のペプチドを、医薬組成物として、これらのペプチドを含む組成物の一部として、例えば、栄養補助食品として、またはこれらのペプチドが有効量で添加された食品マトリックスの一部として、純粋な形態で消費することができる。本発明のペプチドを含む抗高血圧組成物を添加し得る食品マトリックスの例としては、飲料、煎じ食品、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダ用ドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムおよび中間食品が挙げられる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、医薬として用いるための、特に、哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための本発明のペプチドまたはそれらの誘導体、本発明の組成物または加水分解物である。同様に、本発明のペプチドまたはそれらの誘導体を、医薬の製造において、特に、哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療用または予防用の医薬の製造において使用することができる。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、本発明のペプチドの製造のための方法である。従って、それらのペプチドは、以下に示す工程を含む方法によって製造することができる：
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁、好ましくは脱脂粉乳、のカゼイン画分を得る工程。このカゼイン画分は、好ましくは精密濾過によるか、または酸性化によって得られる。
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程。製造すべきペプチドに応じて、異なるプロテアーゼを使用する必要がある。従って、配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を有するペプチドを得るためには、サブチリシンまたは同等のプロテアーゼが使用され、任意のバチルス(Bacillus)種、例えば、バチルス・アミロリクエファシエンス由来のサブチリシン酵素が有用である。また、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の配列を含んでなるペプチド、特に、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６の配列を有するペプチドまたは前記ペプチドの断片、特に、配列番号７、配列番号８もしくは配列番号９の配列を有する断片を得るためには、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシンまたはサーモリシンが使用される。
ｃ）加水分解工程後に、プロテアーゼを、好ましくは熱処理、例えば、加水分解物を９０℃に１０分間加熱すること、によるか、または酸性化によって不活性化する工程。
ｄ）本発明のペプチドを、さらに、限外濾過、ナノフィルトレーション、クロマトグラフィーまたは電気透析などの方法により単離し、精製する工程。
本発明のペプチドは、固相合成法(Atherton and Sheppard (1989). Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford, IRL Press)によっても製造することができる。
本発明のさらにもう１つの態様は、本発明のタンパク質加水分解物の製造である。従って、前記加水分解物は、以下に示す工程を含む方法によって製造することができる：
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁、好ましくは脱脂粉乳、のカゼイン画分を得る工程。このカゼイン画分は、好ましくは精密濾過によるか、または酸性化によって得られる。
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程。加水分解物の組成に応じて、異なるプロテアーゼを使用する必要がある。
ｃ）加水分解工程後に、プロテアーゼを、好ましくは熱処理、例えば、加水分解物を９０℃に１０分間加熱すること、によるか、または酸性化によって不活性化する工程。
ｄ）さらに、その混合物の本発明のペプチドを富化する工程。
ｅ）所望により、その加水分解物を乾燥させて、粉末を得る工程。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１
抗高血圧組成物の製造
ヤギ乳汁５００Ｌのカゼイン画分を、乳汁をｐＨ３．０に調整することによって得、乳漿タンパク質を遠心分離により除去した。カゼインタンパク質を蒸発濃縮し、１Ｌ当たりタンパク質１０ｇとした。次に、カゼイン溶液に、プロテアーゼ、バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)由来のサブチリシン（Genencor社製Multifect P-3000、１容量％）を添加し、５５℃にて３時間培養した。加熱すること（１００℃にて１０分間）により反応を終了させ、その混合物を、最後に乾燥させた。ペプチドをＨＰＬＣにより精製し、記載されている微小配列決定法(Matsudaira P. A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. Academic Press 1993)により同定した。簡潔には、カゼイン加水分解物をAKTA Explorer(Amersham Biosciences)において、Resource RP(Amersham Biosciences)カラムと水−アセトニトリルの直線勾配（０〜１００％、流速０．２ｍｌ）を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。画分１ｍｌを集め、標準的な酵素アッセイ法によりＡＣＥ阻害測定を実施した(Wu et al. 2002 J. Chromatography 950, 125-130)。画分番号１７は高いＡＣＥ阻害活性を示し、この画分を２回目の精製に用いた。この際、ペプチドの分離は、以下の条件を用いたＨＰＬＣ(Waters)により行った；Zorbax 17カラム材料、溶出剤としてトリフルオロ酢酸および流速０．５ｍｌ／分。図１に典型的な分離を示している。画分０．５ｍｌを集め、それらのＡＣＥ阻害能力を判定した。３つの画分（図１参照）にＡＣＥ阻害活性があることが分かり、それらの画分を微小配列決定に用いた（Eurosequence, Netherlandsにより実施）。このようにして、カゼイン加水分解物において以下の新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定した：配列番号１、配列番号２および配列番号３。３つのものは総て、β−カゼインから得られたペプチド、配列番号１（β−ＣＮ ｆ７８−８３）、配列番号２（β−ＣＮ ｆ８４−
８７）および配列番号３（β−ＣＮ ｆ１８１−１８４）である。得られた加水分解物中の各ペプチドの量は、質量検出器(Waters)を備えたＨＰＬＣにより測定した。各ペプチドについての標準曲線を純粋な合成ペプチドを用いて作成した。加水分解物中の各ペプチドの量は、おおよそで、配列番号１；０．３０重量％、配列番号２；０．２８重量％および配列番号３；０．１９重量％であった。ヒツジ乳汁５００Ｌおよびウシ乳汁５００Ｌを用いて、本実施例に記載の手順を繰り返した。ヒツジ乳汁から得られた加水分解物において、３種類のペプチド総てが確認された（配列番号１（β−ＣＮ ｆ７８−８３）；０．３９重量％、配列番号２（β−ＣＮ ｆ８４−８７）；０．３６重量％および配列番号３（β−ＣＮ ｆ１８１−１８４）；０．２５重量％）が、これらのペプチドはウシ乳汁から得られた加水分解物には存在しなかった。実施例４、５および６に記載される試験には、ヤギ乳汁から得られた加水分解物を用いた。
【００２３】
実施例２
アンジオテンシン変換酵素の阻害
本発明に含まれるペプチドのＩＣ５０値を決定するために、純粋なペプチド（純度＞９５重量％）を１０μｍｏｌ規模でのカスタム固相合成により製造し、続いてＨＰＬＣにより精製した（合成および精製はEurosequence, Netherlandsにより実施）。ＡＣＥアッセイには、精製ＡＣＥ酵素(Sigma)を使用した(Wu et al. 2002 J. Chromatography 950, 125-130)。配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドがＡＣＥの強力な阻害薬であることが分かった（以下の表を参照）。配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、特に、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するペプチドも優れたＡＣＥ阻害薬である（以下の表を参照）。最後に、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列の断片であるペプチド（それぞれ、配列番号７、配列番号８および配列番号９）をＡＣＥ阻害活性について試験した。それらのＩＣ５０値から分かるように、これらのペプチドも優れたＡＣＥ阻害薬である（以下の表を参照）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例３
抗高血圧ペプチドのバイオアベイラビリティ
ペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）（純度＞９５重量％、各５００μｇ）をマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ、３ヶ月齢）に経口投与した。２時間後、マウスを犠牲にし、血液サンプルを採取した。その血液サンプルを遠心分離後（５分、３０００ｇ）、血漿を回収し、乾燥させ、酢酸エチルに再懸濁した。次に、サンプルをＨＰＬＣ−ＭＳにより分析し、血漿サンプル中に存在する本発明のペプチドの量を標準曲線を用いて算定した。それらの経口投与の２時間後、３種類のペプチド総てが血漿サンプル中に以下の量で見られた：配列番号１：７．５μｇ／ｍｌ、配列番号２：１．２μｇ／ｍｌおよび配列番号３：０．９μｇ／ｍｌ。これらの結果は、本発明のペプチドが生物学的に利用可能であり、消化管から無傷で吸収されるということを示している。
【００２６】
実施例４
高血圧ラットにおける血圧降下作用
本試験では自然高血圧発症ラット（雌）を使用した。試験期間は、６週齢のラット１０匹に、実施例１の組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）をそれらの飲料水に溶かして与えた。これらのラットは１日当たり実施例１の組成物約７０〜９０ｍｇの間を摂取すると推定された。別のラット１０匹を対照として使用した。両群のラットには、飼料（標準的な食物）と飲料水を自由に摂取させた。試験開始時と２週間経過するごとに収縮期血圧を測定した（標準的なtail cuff法）。図２は、試験期間の両群における収縮期血圧の経過を示す図である。対照ラットでは、収縮期血圧が齢６週間から、定常状態に達する１４週間まで着実に増加した。実施例１に記載の組成物を消費したラットの群では、同様に収縮期血圧が１４週間まで増加したが、その増加は有意に低下していた（１４週間について、ｐ＜０．００５）。また、１４週間以降の収縮期血圧は対照群よりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、本発明のペプチドを含む実施例１の組成物が自然高血圧発症ラットにおいて収縮期血圧の降下を引き起こすということをはっきりと示している。本発明者らは、実施例１の組成物が抗高血圧組成物であると推断する。
【００２７】
実施例５
高血圧ヒトにおける血圧降下作用
４０名の投薬治療を行っていない非喫煙者、高血圧の男性（２０名）および女性（２０名）を２群に無作為化した。２０名には、毎日５週間、実施例１の組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）２５グラムを水で服用し、通常の生活習慣を守るように指示した。残る２０名のボランティアには、毎日５週間、プラシーボ（粉乳）２５グラムを水で服用し、通常の生活習慣を守るように指示した。参加者は、毎週、早朝に、血圧測定、採血、副作用の評価、食事の評価および一般モニタリングについてGeneral Clinical Research Clinicに報告した。
【００２８】
処置の１０日後に、収縮期血圧と弛緩期血圧の両方において有意な降下が起こり、試験中持続した。プラシーボを服用した対照群とは対照的に、実施例１の組成物を服用したボランティアでは、平均して、収縮期血圧（平均１２ｍｍＨｇの降下）と弛緩期血圧（平均８ｍｍＨｇの降下）が降下した。両群間には、肝機能および腎機能などの処置に関連する副作用には差がなかった。
これらの試験結果に基づき、本発明に記載される抗高血圧ペプチドを含有する実施例１の組成物は、未治療の高血圧患者における収縮期血圧と弛緩期血圧の両方を降下させる。
【００２９】
実施例６
抗高血圧組成物を含有する食品の製造
富化ジュースを以下の成分を用いて製造した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
加工技術
濃縮ジュースに、水および水溶性成分を加えて、最終製品を製造した。次に、実施例１の抗高血圧組成物（配列番号１、配列番号２および配列番号３の配列を有するペプチドを富化したヤギカゼイン加水分解物）を添加し、混合し、得られた製品を低温殺菌し、ホモジナイズした。最後に、製品を冷却し、パッケージングした。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に含まれるペプチド（配列番号１、配列番号２および配列番号３）の精製中に得られたＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。矢印は、微小配列決定(microsequencing)に用いられる、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を示している。
【図２】自然高血圧発症ラットの収縮期血圧に対する実施例１の組成物の効果を示す図である。白丸は対照群における収縮期血圧を示し、黒四角は実施例１の組成物の消費群における収縮期血圧を示している。データは平均±ＳＥＭ（各群、ｎ＝１０）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸８個以下を有する、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ペプチド。
【請求項２】
配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
少なくとも３個のアミノ酸を有する、請求項３に記載のペプチドの断片。
【請求項５】
配列番号７、配列番号８および配列番号９に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチドの断片。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のペプチドの酸付加塩または塩基付加塩、特に、医薬上許容される塩、エステル、溶媒和物および無水物。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の誘導体が医薬上許容されること、および医薬上許容される担体が存在することを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体が哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる、食品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体が哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在することを特徴とする、請求項１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
飲料、煎じ食品、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムならびに中間食品から選択される食品である、請求項１０または請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１３】
ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁から得られる、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つが富化された、タンパク質加水分解物。
【請求項１４】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの塩の合量がタンパク質加水分解物の０．１％〜５％の間、好ましくは１％〜２％の間（乾燥重量）である、請求項１３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項１５】
栄養補助食品、食品原料成分または食用組成物の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたは請求項１３および請求項１４に記載のタンパク質加水分解物の使用。
【請求項１６】
医薬として用いるための、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体。
【請求項１７】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体。
【請求項１８】
医薬として用いるための、請求項７〜１２に記載の組成物、ならびに請求項１３および請求項１４に記載の加水分解物。
【請求項１９】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための、請求項７〜１２に記載の組成物、ならびに請求項１３および請求項１４に記載の加水分解物。
【請求項２０】
医薬の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の使用。
【請求項２１】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療用または予防用の医薬の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の使用。
【請求項２２】
請求項１、請求項２、請求項４および請求項５に記載のペプチドの製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程、
ｃ）プロテアーゼを不活性化する工程、
ｄ）そのペプチドを単離する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
請求項３に記載のペプチドの製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をサブチリシンを用いて加水分解する工程、
ｃ）サブチリシンを不活性化する工程、
ｄ）そのペプチドを単離する工程
を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１３および請求項１４に記載のタンパク質加水分解物の製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程、
ｃ）プロテアーゼを不活性化する工程、
ｄ）その混合物の、請求項１〜６に記載のペプチドを富化する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
ｅ）加水分解物を乾燥させて粉末を得る工程
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼがサブチリシンである、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
サブチリシンが、バチルス種の発酵培養液から得られた１種以上の化合物もしくはバチルス種の細胞抽出物から得られた１種以上の化合物、またはバチルス種の発酵培養液から得られた１種以上の化合物を固定化している固相支持体もしくはバチルス種の細胞抽出物から得られた１種以上の化合物を固定化している固相支持体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
バチルス種がバチルス・アミロリクエファシエンスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
アミノ酸８個以下を有する、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ペプチド。
【請求項２】
配列番号４、配列番号５および配列番号６に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
少なくとも３個のアミノ酸を有する、請求項３に記載のペプチドの断片。
【請求項５】
配列番号７、配列番号８および配列番号９に示される配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のペプチドの断片。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のペプチドの酸付加塩または塩基付加塩、特に、医薬上許容される塩、エステル、溶媒和物および無水物。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる、組成物。
【請求項８】
請求項６に記載の誘導体が医薬上許容されること、および医薬上許容される担体が存在することを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体が哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６に記載の少なくとも１つのペプチドまたはそれらの誘導体を含んでなる、食品組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体が哺乳類において高血圧を降下させるのに有効な量で存在することを特徴とする、請求項１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
飲料、煎じ食品、乳汁、ヨーグルト、チーズ、香味乳飲料、パン、ケーキ、バター、マーガリン、ソース、香辛料、サラダドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート、アイシングおよびフィリング、ソフト冷凍製品、糖菓、チューインガムならびに中間食品から選択される食品である、請求項１０または請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１３】
ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁から得られる、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の少なくとも１つが富化された、タンパク質加水分解物。
【請求項１４】
請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの塩の合量がタンパク質加水分解物の０．１％〜５％の間、好ましくは１％〜２％の間（乾燥重量）である、請求項１３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項１５】
栄養補助食品、食品原料成分または食用組成物の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたは請求項１３および請求項１４に記載のタンパク質加水分解物の使用。
【請求項１６】
医薬として用いるための、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体。
【請求項１７】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体。
【請求項１８】
医薬として用いるための、請求項７〜１２に記載の組成物、ならびに請求項１３および請求項１４に記載の加水分解物。
【請求項１９】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療または予防に用いるための、請求項７〜１２に記載の組成物、ならびに請求項１３および請求項１４に記載の加水分解物。
【請求項２０】
医薬の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の使用。
【請求項２１】
哺乳類における高血圧症、卒中、冠動脈疾患、心筋梗塞、メタボリック症候群、末梢血管疾患または腹大動脈瘤の治療用または予防用の医薬の製造における、請求項１〜６に記載のペプチドまたはそれらの誘導体の使用。
【請求項２２】
請求項１、請求項２、請求項４および請求項５に記載のペプチドの製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程、
ｃ）プロテアーゼを不活性化する工程、
ｄ）そのペプチドを単離する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
請求項３に記載のペプチドの製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をサブチリシンを用いて加水分解する工程、
ｃ）サブチリシンを不活性化する工程、
ｄ）そのペプチドを単離する工程
を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１３および請求項１４に記載のタンパク質加水分解物の製造方法であって、
ａ）ヤギ乳汁またはヒツジ乳汁のカゼイン画分を得る工程、
ｂ）そのカゼイン画分をプロテアーゼを用いて加水分解する工程、
ｃ）プロテアーゼを不活性化する工程、
ｄ）その混合物の、請求項１〜６に記載のペプチドを富化する工程
を含む、方法。
【請求項２５】
ｅ）加水分解物を乾燥させて粉末を得る工程
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プロテアーゼがサブチリシンである、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
サブチリシンが、バチルス種の発酵培養液から得られた１種以上の化合物もしくはバチルス種の細胞抽出物から得られた１種以上の化合物、またはバチルス種の発酵培養液から得られた１種以上の化合物を固定化している固相支持体もしくはバチルス種の細胞抽出物から得られた１種以上の化合物を固定化している固相支持体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
バチルス種がバチルス・アミロリクエファシエンスである、請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２３９４０（Ｐ２００７−５２３９４０Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００１６５（Ｐ２００７−５００１６５）
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１９９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２９２７
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０４３７１５５０）プレバ、バイオテック、ソシエダッド、アノニマ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＬＥＶＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２３日（２００５．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００１９９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２９２７
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０４３７１５５０）プレバ、バイオテック、ソシエダッド、アノニマ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＬＥＶＡ ＢＩＯＴＥＣＨ， Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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