抗ＣＤＨ３抗体およびその使用
本発明は、放射性同位体で標識可能な抗ＣＤＨ３抗体に関する。さらに、本発明は、有効成分として抗ＣＤＨ３抗体を含む方法および薬学的組成物を提供する。ＣＤＨ３は膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞において強く発現されるので、本発明は、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の治療において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤＨ３抗体、該抗体を用いてＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたは診断するための方法、および、該抗体を含む薬学的組成物または診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリンは、カルシウム依存性の細胞間結合を形成し、かつ形態形成においてならびに成体組織および臓器の発達および維持において必須の役割を果たす、細胞間接着糖タンパク質である（非特許文献１）。胚形成中に、特異的なカドヘリンの細胞発現は、細胞選別および組織層形成の過程において極めて重要である同種親和性相互作用をもたらす（非特許文献２〜４）。これらの細胞付着の変化は細胞不安定化において重要な役割を果たし、上皮構造の綿密に調節された分化過程を改変する可能性がある（非特許文献５〜６）。このため、カドヘリンの機能喪失または過剰発現およびこれらのタンパク質を体系化している遺伝子の制御の基礎となる分子機構は、発癌に影響を与える（非特許文献７）。
【０００３】
カドヘリンファミリーは、それぞれが特異的な組織分布を示す、古典的なＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンを含むさまざまなサブファミリーに細分される（非特許文献８）。Ｅ−カドヘリンは全ての上皮組織において発現されるが、Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）の発現は、前立腺および皮膚を含む重層上皮の基底層または下層、ならびに乳房筋上皮細胞のみに限られる（非特許文献９〜１０）。
【０００４】
広範な証拠により、異常なＰ−カドヘリン発現が、細胞増殖、ならびに結腸、乳房、肺、甲状腺、および子宮頚部の腫瘍と関連することも現在明らかとなっている（非特許文献１１〜１２）。ヒトＰ−カドヘリンは、外陰部類表皮癌に対して産生されたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９モノクローナル抗体によって認識される抗原であることが報告された（非特許文献１０）。Ｐ−カドヘリン媒介性の接着および細胞内シグナル伝達の調節は、インビボでの腫瘍細胞の増殖および生存の低下をもたらすものと予想される。したがって、細胞増殖および固形腫瘍進行においてＰ−カドヘリンが有するものと思われる中心的な役割を考慮すれば、種々の癌を有する患者に治療的恩恵を提供できるＰ−カドヘリンに対する抗体を産生することが望ましい。
【０００５】
癌特異的分子に対するモノクローナル抗体は、癌治療において有用であることが証明されている（非特許文献１３）。乳癌、悪性リンパ腫、および結腸癌に対するトラスツズマブ（非特許文献１４）、リツキシマブ（非特許文献１５）、およびベバシズマブ（非特許文献１６）のようなヒト化抗体またはキメラ抗体の臨床応用の成功例の他に、他の分子標的に対するいくつかのモノクローナル抗体が開発中であり、これらの抗腫瘍活性が評価中である。これらのモノクローナル抗体は、効果的な治療法のない腫瘍を有する患者に希望を与えるものと期待される。これらのモノクローナル抗体に関するその他の重要な課題の一つは、標的分子を発現している細胞に対するこれらの特異的な反応により、重篤な毒性を伴うことなく癌細胞に対して選択的な治療効果を達成することである（非特許文献１７〜１９、特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報第２００２／０９７３９５号
【特許文献２】国際公開公報第２００４／１１０３４５号
【特許文献３】国際公開公報第２００６／１１４７０４号
【特許文献４】国際公開公報第２００７／１０２５２５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Conacci-Sorrell M, et al., J Clin Invest, 109:987-91, (2002
【非特許文献２】Nose A, et al., Cell, 54:993-1001, (1988)
【非特許文献３】Steinberg MS, et al.,. Proc Natl Acad Sci USA, 91:206-9, (1994)
【非特許文献４】Takeichi M. Science, 251:1451-5, (1991)
【非特許文献５】Daniel CW, et al., Dev Biol, 169:511-9, (1995)
【非特許文献６】Nose A and Takeichi M. J Cell Biol, 103:2649-58, (1986)
【非特許文献７】Behrens J. Cancer Metastasis Rev, 18:15-30(1999)
【非特許文献８】Takeichi M. Development, 102:639-55(1988)
【非特許文献９】Takeichi M. J Cell Biol 103:2649-58, (1986)
【非特許文献１０】Shimoyama Y, et al., Cancer Res, 49:2128-33(1989)
【非特許文献１１】Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001)
【非特許文献１２】Stefansson, et al., J. Clin. Oncol. 22(7):1242-1252 (2004)
【非特許文献１３】Harris, M. Lancet Oncol, 5：292-302 (2004)
【非特許文献１４】Baselga, J. Oncology, 61：SuuplSuupl 2 14-21 (2004)
【非特許文献１５】Maloney, D.G., et al. Blood, 90：2188-2195 (1997)
【非特許文献１６】Ferrara, N., et al. Nat Rev Drug Discov, 3：391-400 (2004)
【非特許文献１７】Crist, W.M., et al. J Clin Oncol, 19：3091-3102 (2001)
【非特許文献１８】Wunder, J.S., et al. J Bone Joint Surg Am, 80：1020-1033 (1998)
【非特許文献１９】Ferguson, W.S. and Goorin, A.M. Cancer Invest, 19：292-315 (2001)
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどのＣＤＨ３ポリペプチドまたはその断片を特異的に認識する、ＣＤＨ３に対するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体が、癌細胞株を含有する異種移植マウスにおいて顕著な抗腫瘍効果を有する証拠を提供する。
【０００９】
具体的には、本発明は以下に関する：
［１］抗体がＨ（重）鎖Ｖ（可変）領域およびＬ（軽）鎖Ｖ領域を含み、該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつ該抗体がＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその断片。
典型的な態様において、前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、および一本鎖抗体からなる群より選択される。
［２］本発明の抗体またはその断片は、細胞毒性剤、治療剤、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合させることができる。典型的な態様において、前記抗体は放射性同位体標識で標識される。より典型的な態様において、前記放射性同位体標識は、９０イットリウム（９０Ｙ）、１２５ヨウ素（１２５I）、および１１１インジウム（１１１Ｉｎ）からなる群より選択される。
［３］対象において、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法であって、本発明の抗体またはその断片の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
［４］対象におけるＣＤＨ３関連疾患または該疾患を発症する素因の診断または予後判定のための方法であって、
（ａ）本発明の抗体または断片と対象由来の試料または標本とを接触させる段階；
（ｂ）試料または標本中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３ポリペプチドの相対存在量に基づき、該対象が疾患を患っているかまたはその発症リスクを有するか否かを判定する段階
を含む、方法。
［５］ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、本発明の抗体またはその断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物。
［６］ＣＤＨ３関連疾患の診断または予後判定のためのキットであって、本発明の抗体またはその断片を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、腫瘍増殖に対する９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３抗体（クローン＃３、＃４、＃５、および＃６）の効果を示す。９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３抗体、特にクローン＃３、＃４、および＃６は、ヌードマウスに移植されたＨ１３７３細胞の増殖を効果的に抑制したが、非標識抗ＣＤＨ３抗体の投与による腫瘍増殖の抑制は示されなかった。
【図２】図２は、抗ＣＤＨ３抗体（クローン＃３、＃４、＃５、および＃６）の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。クローン＃３、＃４、および＃５のバンド形成パターンから、ＩｇＧ重鎖および軽鎖に対応する２本のバンドが明らかになったが、クローン＃６のバンド形成パターンからは、２本の重鎖バンドおよび１本の軽鎖バンドが明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
態様の説明
本発明は抗ＣＤＨ３抗体、それを含む組成物、および、癌などのＣＤＨ３関連疾患の治療または予防におけるそれらの使用に関する。典型的な態様において、抗体は放射性同位体標識で標識される。膵臓癌患者から採取された、膵臓癌細胞および正常細胞の遺伝子発現解析用のｃＤＮＡマイクロアレイが報告されている（Nakamura et al.,(2004)Oncogene;23: 2385-400）。その後、膵臓癌細胞において発現が特異的に増強されるいくつかの遺伝子が同定された。細胞膜タンパク質である胎盤カドヘリン（Ｐ−カドヘリン；ＣＤＨ３）はこれらの遺伝子の１つであり、主要臓器での低い発現レベルを示した。副作用の危険性が回避されるので、このような特徴は、癌治療の標的遺伝子にとって適切である。さらに、肺癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、前立腺癌細胞株、乳癌細胞株、胃癌細胞株、および肝臓癌細胞株などの他の癌細胞株において、ＣＤＨ３の同様の過剰発現が確認された（国際公開公報第２００７／１０２５２５号）。
【００１２】
定義
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはそのペプチドに対する特異的反応性を有する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合した抗体、および抗体断片を含むことができる。さらに、本明細書において抗体は最も広い意味で使用されており、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、無傷の(intact)モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を網羅する。「抗体」とは全てのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を指す。
【００１３】
「抗体断片」とは無傷の抗体の一部分であり、無傷の抗体の１つまたは複数の抗原結合領域または可変領域を一般的に含む。したがって本発明において、抗体断片は無傷の抗体の1つまたは複数の抗原結合部分を含むことができる。本明細書において用いられる、抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＣＤＨ３）に特異的に結合できる能力を保持する抗体の一つまたは複数の免疫学的に活性な断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって実行されうることが示されている。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ならびに一本鎖抗体分子が含まれる。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷の抗体によって認識される同一の抗原と結合する。「抗体断片」という用語はまた、特異的抗原に結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子操作ポリペプチド、例えば軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位も含む。
【００１４】
本明細書において用いられる、ＣＤＲと「機能的に等価な」という用語は、それを有する抗体に、元のＣＤＲを有する抗体と実質的に等しい抗原結合活性および抗原特異性を与える、ＣＤＲを指す。ＣＤＲと機能的に等価な例としては、元のＣＤＲに対して１つまたは複数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され、および／または付加されているものが挙げられる。抗原結合活性および抗原特異性が維持される限り、アミノ酸変異の数または割合は特に限定されない。しかしながら、可変領域に含まれる元のＣＤＲのアミノ酸配列の２０％またはそれ未満を変化させることが一般的に好ましい。より好ましくは、変異の割合は１５％またはそれ未満、１０％またはそれ未満、５％またはそれ未満である。好ましい態様において、アミノ酸変異の数は１０個またはそれ未満、５個またはそれ未満、４個またはそれ未満、３個またはそれ未満、２個またはそれ未満、１個またはそれ未満である。当業者は、元のＣＤＲの特性を保持する、許容可能な変異を理解するであろう。
【００１５】
抗体の産生
本発明では、抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体を用いる。これらの抗体は当技術分野において周知の方法によって提供される。
本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について以下に記載する。
【００１６】
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えばモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によっても産生されうる。
【００１７】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターなどをＣＤＨ３ポリペプチドで免疫して、ＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいてＣＤＨ３ポリペプチドで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００１８】
調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含有することが好ましい適切な培養培地中に播種し、その培地中で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地には典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含めることができ（ＨＡＴ培地）、これらの物質によってＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【００１９】
好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を補助し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞を含む。ヒトモノクローナル抗体の産生に関して、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００２０】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、または、放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などの、インビトロ結合測定によって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の３０スキャッチャード分析によって判定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適した培養培地の例として、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
【００２１】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００２２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡを単離すると、発現ベクターの中に配し、これを次に、免疫グロブリンタンパク質を他の方法では産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)が含まれる。
【００２３】
ＣＤＨ３に対して反応性を示す特異的抗体または抗体断片を産生するための別の方法とは、細菌中で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部分をコードする発現ライブラリーを、ＣＤＨ３タンパク質またはペプチドを用いてスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域、およびＦｖ領域をファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)；Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)；およびMcCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)を参照されたい。例えばＣＤＨ３ペプチドを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ＣＤＨ３に対して反応性を有する免疫グロブリン断片を同定することができる。あるいは、抗体またはその断片を産生するためにＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手できる）を用いてもよい。
【００２４】
さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991)では、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離についてそれぞれ記載している。その後の刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）について記載されている。このようにこれらの技術は、モノクローナル抗体単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な手段である。
【００２５】
例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列を相同的なマウス配列と置き換えることにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部もしくは一部を共有結合的に連結することにより、ＤＮＡを改変することもできる。
【００２６】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、またはそれらを抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、ある抗原に対して特異性を有する一つの抗原結合部位および別の抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【００２７】
本発明は、疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／またはＣＤＨ３発現細胞の増殖の阻害に適した抗体を提供する。本発明はまた、ＣＤＨ３関連疾患の診断に適した抗体を提供する。本発明において、マウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、および＃５の樹立に成功し、これらの抗体、特にクローン＃３は、ＣＤＨ３発現細胞（例えば、癌細胞）の増殖を効果的に抑制することが実証された。さらに、これらのクローンの可変領域内にはグリコシル化部位が存在しない。この特性は、抗体の均一性を支持しうるので、治療薬の開発にとって有利である。
【００２８】
また本発明において、グリコシル化部位を持たない、クローン＃６のバリアントの樹立に成功した。クローン＃６は、さまざまなＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害する能力をもつ抗体として実証されているが、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ２内にグリコシル化部位を有する。本発明のバリアントは、グリコシル化部位のアスパラギン残基がセリン残基、トレオニン残基、アラニン残基、またはグルタミン残基に変更されている。
【００２９】
マウスモノクローナル抗体クローン＃３、クローン＃４、および＃５のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６に示されている。マウスモノクローナル抗体クローン＃３、クローン＃４、および＃５のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４に示されている。さらに、クローン＃６のバリアントのＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、および８０に示されている。クローン＃６のバリアントのＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されている。
【００３０】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲは、当技術分野において周知の方法にしたがって決定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら（Kabat E. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition）またはＣｈｏｔｈｉａら（Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917）によって記載された方法が、ＣＤＲ決定に関して一般的に用いられる。
【００３１】
したがって本発明は、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む抗体またはその断片を提供し、ここで該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつここで該抗体は、ＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる。
【００３２】
好ましい態様において、Ｋａｂａｔの定義によってＣＤＲを決定してもよい（Kabat E. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition）。Ｋａｂａｔの定義によって決定された各クローンのＣＤＲを以下に記載する。クローン＃３のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＦＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＣＤＲ２：ＲＡＮＲＬＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）である。
クローン＃４のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＣＤＲ２：ＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）である。
クローン＃５のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＣＤＲ２：ＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）である。
クローン＃６のバリアントのＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）、ＣＤＲ２：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、ＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）、ＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、またはＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、およびＣＤＲ３：ＳＧＹＧＮＬＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＣＤＲ２：ＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、およびＣＤＲ３：ＱＨＹＨＩＹＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）である。
【００３３】
したがって本発明はまた、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む抗体またはその断片も提供し、ここで該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；および
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択される。
【００３４】
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）の１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）の１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、または８０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
【００３５】
したがって、一態様において本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６、６８、７２、７６、および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域ならびに／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含む抗体、またはその断片を提供する。
好ましい態様において、本発明の抗体は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；または
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域
を含む。
【００３６】
本発明の抗体は従来の方法によって調製することができる。例えば、従来の遺伝子組み換え技術にしたがって、抗体ポリペプチドをコードするポリペプチドを適切なベクターに組み込み、該ベクターを宿主に導入し、かつ該宿主から抗体を産生させることによって、抗体を調製することができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75を参照されたい）。
【００３７】
本発明の抗体のＶ領域をコードするポリヌクレオチドの核酸配列は、本発明の抗体のＶ領域のアミノ酸配列から推定することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および１１に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃３のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２７に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃４のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および４３に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃５のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、７１、７５または７９、および５９に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃６のバリアントのＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。本発明の抗体のＶ領域をコードするポリヌクレオチドは、固相技術（Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron (1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J (1984) 3, 801-5）およびオリゴヌクレオチド合成技術（Jones et al. Nature (1986) 321, 522-5）のような従来の方法によって配列情報に基づき合成することができる。
【００３８】
抗体Ｖ領域をコードするポリヌクレオチドを、抗体定常（Ｃ）領域をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターに組み込む。
本発明において用いられる抗体の産生のため、該抗体（抗体遺伝子）をコードするポリペプチドを、発現制御要素（例えば、エンハンサー、プロモーター）の制御下で抗体遺伝子が発現できるように、発現ベクターに組み込む。発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００３９】
抗体遺伝子の発現において、抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドとＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを別個の発現ベクターに組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に同時形質転換する。あるいは、抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドとＬ鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を単一の発現ベクターに一緒に組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する（例えば、国際公開公報第９４／１１５２３号）。
【００４０】
抗体遺伝子は公知の方法によって発現させることができる。哺乳類細胞における発現の場合、従来の有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、およびポリ（Ａ）シグナル（抗体遺伝子の３'末端に対して下流に位置する）を、機能的に連結させることができる。例えば、有用なプロモーター／エンハンサー系として、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー系を用いることができる。
他のプロモーター／エンハンサー系、例えば、ウイルス（例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０））に由来するもの、ならびに哺乳類細胞に由来するもの（例えば、ヒト伸長因子１α（ＨＥＦ１α））を本発明における抗体の発現に用いることもできる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はＭｕｌｌｉｇａｎら（Nature (1979) 277, 108-14.）の方法によって容易に行うことができる。ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はＭｉｚｕｓｈｉｍａら（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.）の方法によって容易に行うことができる。
【００４１】
大腸菌における発現の場合、従来の有用なプロモーター、関心対象の抗体を分泌させるためのシグナル配列、および抗体遺伝子を、機能的に連結させることができる。プロモーターとして、ｌａｃＺプロモーターまたはａｒａＢプロモーターを用いることができる。ｌａｃＺプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はＷａｒｄら（Nature (1098) 341, 544-6.; FASBE J. (1992) 6, 2422-7.）の方法によって行うことができ、その一方でａｒａＢプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はＢｅｔｔｅｒら（Science (1988) 240, 1041-3.）の方法によって行うことができる。
【００４２】
抗体の分泌のためのシグナル配列に関して、関心対象の抗体が大腸菌の細胞周辺腔に分泌されることが意図される場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S.P. et al, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83.）を用いることができる。細胞周辺腔の中に分泌された抗体を単離し、その後、抗体が適切な立体構造をとるように再び折り畳ませる。
【００４３】
ウイルス（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ））などに由来する複製起点を用いることができる。宿主細胞系における遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターには、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などの選択マーカー遺伝子をさらに含めてもよい。本発明において用いられる抗体の産生に関しては、真核生物および原核生物の細胞系を含む任意の発現系を用いることができる。真核生物細胞には、動物（例えば、哺乳類、昆虫、カビおよび真菌、酵母）の樹立細胞株が含まれる。原核生物細胞には、大腸菌細胞などの細菌細胞が含まれる。本発明において用いられる抗体は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅＬａ細胞などの哺乳類細胞において発現されることが好ましい。
【００４４】
次に、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して、関心対象の抗体を産生させる。宿主細胞の培養は任意の公知の方法によって行うことができる。本明細書において使用できる培養培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０またはＩＭＤＭ培地であってよい。培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）などの血清サプリメントを含んでもよい。
【００４５】
組み換え抗体の産生において、上記の宿主細胞のほかに、トランスジェニック動物を宿主として用いることもできる。例えば、抗体遺伝子を、動物の母乳中で元来産生されるタンパク質（例えば、βカゼイン）をコードする遺伝子の所定部位へ挿入して、融合遺伝子を調製する。抗体遺伝子が導入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片を非ヒト動物の胚へ注射し、この胚を次に、雌性動物へ導入する。該胚を体内に有する該雌性動物はトランスジェニック非ヒト動物を産む。関心対象の抗体は該トランスジェニック非ヒト動物またはその子孫から母乳中に分泌される。該抗体を含有する母乳の量を増加させる目的で、適切なホルモンを該トランスジェニック動物に投与することができる（Ebert, K.M. et al, Bio/Technology (1994) 12, 699-702.）。
【００４６】
上記のように発現され産生された抗体を、細胞または宿主動物の体から単離し、精製することができる。本発明において用いられる抗体の単離および精製は、アフィニティーカラムに対して行うことができる。抗体の単離および精製に従来用いられる他の方法を用いることもでき；したがって、方法は特に限定されない。例えば、さまざまなクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析および透析を単独でまたは組み合わせて用いて、関心対象の抗体を単離および精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００４７】
（ｉｉ）キメラ抗体およびヒト化抗体
本発明において、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む、人工的に改変された組み換え抗体を用いることができる。これらの改変抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。例えば、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL, (1984) 81: 6851-5.; Neuberger et al., Nature (1984), 312: 604-8.; Takeda et al., Nature (1985) 314: 452-4.）を用いることができる。
【００４８】
キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子、例えば、「ヒト化抗体」である。
【００４９】
本発明によるキメラ抗体は、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結させ、連結産物を発現ベクターに組み込み、得られた組み換え発現ベクターを宿主に導入してキメラ抗体を産生することにより、調製することができる。
ヒト化抗体は「再構成ヒト抗体」とも称され、非ヒト哺乳類（例えば、マウス）の抗体のＣＤＲがヒト抗体のＣＤＲに移植されている。そのようなヒト化抗体を産生するための一般的な遺伝子組み換え手法も公知である（例えば欧州特許第１２５０２３号；国際公開公報第９６／０２５７６号）。
【００５０】
具体的には、マウス抗体ＣＤＲがフレームワーク領域（ＦＲ）を介して連結されている核酸配列を設計し、該ＣＤＲの末端領域および該ＦＲと重複する領域を有するように設計されたプライマーとしていくつかのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結し、連結産物を発現ベクターに組み込む。得られた組み換え発現ベクターを宿主に導入し、それによってヒト化抗体を産生する（例えば、国際公開公報第９６／０２５７６号）。
【００５１】
ＣＤＲを介して連結されるＦＲは、該ＣＤＲが機能的な抗原結合部位を形成できるように選択される。必要なら、抗体Ｖ領域のＦＲ中のアミノ酸は、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成できるように交換されてもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-6.）。
【００５２】
キメラ抗体は、非ヒト哺乳類抗体に由来するＶ領域およびヒト抗体に由来するＣ領域から構成される。ヒト化抗体は、非ヒト哺乳類抗体に由来するＣＤＲならびにヒト抗体に由来するＦＲおよびＣ領域から構成される。ヒト化抗体は、人体に対する抗体の抗原性が低減されるので、臨床用途に有用でありうる。
本発明において用いられるキメラ抗体またはヒト化抗体の具体例は、Ｖ領域がマウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、もしくはクローン＃６のバリアントに由来する抗体、または、ＣＤＲがマウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、もしくはクローン＃６のバリアントに由来する抗体である。そのようなキメラ抗体およびヒト化抗体を産生するための方法は、以下に記述される。
【００５３】
例えば、初めに、クローン＃３、＃４、＃５の抗体、またはクローン＃６のバリアントのＶ領域またはＣＤＲをコードする遺伝子を、抗体産生細胞のＲＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによって調製する（例えば、Larrick et al., 「Methods: a Companion to Methods in Enzymology」, Vol. 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」 in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995、およびWard et al., 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」 in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications; ならびにBirch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995を参照されたい）。抗体のＶ領域またはＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Jones et al. Nature (1986) 321, 522-5）によって合成してもよい。次に、増幅されたまたは合成された産物を従来の手順にしたがってアガロースゲル電気泳動に供し、関心対象のＤＮＡ断片を切り出し、回収し、精製して、ベクターＤＮＡに連結する。
【００５４】
得られたＤＮＡおよびベクターＤＮＡを、公知の連結キットを用いて連結し、組み換えベクターを構築することができる。ベクターＤＮＡは公知の方法で調製することができる：J. Sambrook, et al., 「Molecular Cloning」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。ベクターＤＮＡを制限酵素で消化し、所望のＤＮＡのヌクレオチド配列を公知の方法によって、または自動化シーケンサーを用いて、決定することができる。
【００５５】
マウスモノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされたら（以後、抗体のＬまたはＨ鎖はマウス抗体の場合「マウスＬまたはＨ鎖」およびヒト抗体の場合「ヒトＬまたはＨ鎖」とも称される）、マウスＶ領域をコードするＤＮＡおよびヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡを連結し、発現させて、キメラ抗体を得る。
【００５６】
キメラ抗体を調製するための標準的な方法は、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスシグナル配列およびＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター内に既に存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含む。あるいは、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスシグナル配列およびＶ領域配列を、ヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後に、哺乳類細胞発現ベクターへの連結を行う。
【００５７】
ヒト抗体Ｃ領域を含むポリペプチドは、例えば、ヒトＨ鎖のＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３もしくはＣγ４またはＬ鎖のＣλもしくはＣκを含む、ヒト抗体のＨまたはＬ鎖Ｃ領域のいずれであってもよい。キメラ抗体を調製するために、２つの発現ベクターを最初に構築する；すなわち、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素の制御下にマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびにエンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素の制御下にマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。次いで、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）のような宿主細胞をこれらの発現ベクターで同時形質転換し、形質転換された細胞をインビトロまたはインビボで培養して、キメラ抗体を産生する（例えば、国際公開公報第９１／１６９２８号を参照されたい）。
【００５８】
あるいは、クローニングされたｃＤＮＡ中に存在するマウスシグナル配列ならびにマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスシグナル配列ならびにマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを、単一の発現ベクターに導入し（例えば、国際公開公報第９４／１１５２３号を参照されたい）、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し；次いで、形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、所望のキメラ抗体を産生する。キメラ抗体のＨ鎖の発現用のベクターは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ」とも称される）を、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードする核酸配列を含むゲノムＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡ」とも称される）または該領域をコードするｃＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｃ領域のｃＤＮＡ」とも称される）を含んだ適切な発現ベクターに導入することによって、得ることができる。Ｈ鎖Ｃ領域は、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４領域を含む。
【００５９】
Ｈ鎖Ｃ領域をコードする、特にＣγ１領域をコードするゲノムＤＮＡを有する発現ベクターは、例えば、ＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（国際公開公報第９２／１９７５９号）およびＤＨＥＲ−ＩＮＣＲＥＭＥＮＴ Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭｌ−ｆ（国際公開公報第９２／１９７５９号）を含む。あるいは、既述（Liu, A. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994）のようにヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来のｃＤＮＡを用いてヒトＣ領域ライブラリを調製することができる。マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをこれらの発現ベクターに挿入する場合、ＰＣＲ法によってｃＤＮＡに適切な核酸配列を導入することができる。例えば、ｃＤＮＡがその５'末端に適切な制限酵素の認識配列を有しかつその開始コドンの直前に、転写効率を改善するためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計された、ＰＣＲプライマー、および、該ｃＤＮＡがその３'末端に適切な制限酵素の認識配列を有しかつ、ゲノムＤＮＡの一次転写産物を適切にスプライシングしてｍＲＮＡを与えるためのスプライスドナー部位を有するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを実施して、これらの適切な核酸配列を発現ベクターに導入することができる。
【００６０】
マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする構築されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素で処理することができ、次いでこれを発現ベクターに挿入して、Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１領域）をコードするゲノムＤＮＡを含んだキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。あるいは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする構築されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素で処理し、Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡに連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような発現ベクターに挿入して、キメラＨ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築してもよい。
【００６１】
キメラ抗体のＬ鎖の発現用ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとを連結し、適切な発現ベクターに導入することにより、得ることができる。Ｌ鎖Ｃ領域は、例えば、κ鎖およびλ鎖を含む。マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターが構築される場合、認識配列またはＫｏｚａｋコンセンサス配列などの適切な核酸配列をＰＣＲ法によって該発現ベクターに導入することができる。
【００６２】
ヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡの全核酸配列をＤＮＡ合成装置によって合成し、ＰＣＲ法によって構築してもよい。ヒトＬλ鎖Ｃ領域は少なくとも４つの異なるアイソタイプを有することが公知であり、各アイソタイプを用いて発現ベクターを構築することができる。ヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードする構築されたｃＤＮＡと、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする上記の構築されたｃＤＮＡとを、適切な制限酵素部位の間で連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの発現ベクターに挿入して、キメラ抗体のＬλ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築することができる。マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡに連結されるヒトＬκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡを含んだＨＥＦ−ＰＭｌ ｋ−ｇｋから構築することができる（国際公開公報第９２／１９７５９号を参照されたい）。あるいは、既述（Liu, A. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994）のように、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来のｃＤＮＡを用いてヒトＣ領域ライブラリを調製することもできる。
【００６３】
適切な制限酵素の認識配列を、ＰＣＲ法によって、Ｌκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５'末端および３'末端に導入することができ、上記で構築されたマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡとＬκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを互いに連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような発現ベクターに挿入して、キメラ抗体のＬκ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築することができる。
【００６４】
非ヒト抗体のヒト化は、対応するヒト抗体の配列の代わりにＣＤＲ配列を用いることにより、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に本質的にしたがって、行うことができる。
【００６５】
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト化抗体を作出するためには、該マウスモノクローナル抗体のＦＲと該ヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。したがって、Protein Data Bankを使って、マウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、またはクローン＃６のバリアントのＨおよびＬ鎖のＶ領域と、構造が解明されている全ての既知抗体のＶ領域との間で比較を行う。さらにそれらを、抗体ＦＲの長さ、およびアミノ酸の相同性などに基づいてＫａｂａｔらが分類したヒト抗体サブグループ（ＨＳＧ：ヒトサブグループ）と同時に比較する（Kabat, E'.A. et al, US Dep, Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991）。
【００６６】
ヒト化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを設計するための第一段階は、設計の基礎としてヒト抗体Ｖ領域を選択することである。例えば、マウス抗体Ｖ領域のＦＲと８０％超の相同性を有するヒト抗体Ｖ領域のＦＲをヒト化抗体の産生において用いることができる。
【００６７】
ヒト化抗体において、抗体のＶ領域のフレームワーク（ＦＲ）領域およびＣ領域はヒトに由来し、Ｖ領域のＣＤＲはマウスに由来する。ヒト化抗体のＶ領域を含むポリペプチドは、ヒト抗体のＤＮＡ断片が鋳型として利用可能である限り、ＰＣＲ法によってＣＤＲ移植と呼ばれる方式で産生することができる。「ＣＤＲ移植」とは、マウス由来のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を作出し、鋳型としてのヒト抗体のＣＤＲと置き換える方法を指す。鋳型として用いられるべきヒト抗体のＤＮＡ断片が利用不可能な場合、データベースに登録された核酸配列をＤＮＡ合成装置で合成してもよく、ヒト化抗体のＶ領域のＤＮＡをＰＣＲ法によって産生することができる。さらに、アミノ酸配列しかデータベースに登録されていない場合、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らによりUS Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991の中で報じられたような抗体におけるコドン用法に関する知識に基づき、全核酸配列をアミノ酸配列から推定してもよい。この核酸配列をＤＮＡ合成装置で合成し、ヒト化抗体Ｖ領域のＤＮＡをＰＣＲ法によって調製して適切な宿主に導入した後に、発現させ、所望のポリペプチドを産生させることができる。鋳型としてヒト抗体のＤＮＡ断片が利用可能である場合、ＰＣＲ法によるＣＤＲ移植の一般的な手順を以下に記述する。
【００６８】
最初に、各ＣＤＲに対応するマウス由来ＤＮＡ断片を合成する。ＣＤＲ１〜３を、先にクローニングされたマウスＨおよびＬ鎖のＶ領域の核酸配列に基づいて合成する。例えば、ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃３に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＶＨ ＣＤＲ１）、８（ＶＨ ＣＤＲ２）および１０（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＶＬ ＣＤＲ１）、１６（ＶＬ ＣＤＲ２）および１８（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃４に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（ＶＨ ＣＤＲ１）、２４（ＶＨ ＣＤＲ２）および２６（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ＶＬ ＣＤＲ１）、３２（ＶＬ ＣＤＲ２）および３４（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃５に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８（ＶＨ ＣＤＲ１）、４０（ＶＨ ＣＤＲ２）および４２（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６（ＶＬ ＣＤＲ１）、４８（ＶＬ ＣＤＲ２）および５０（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がクローン＃６のマウスモノクローナル抗体バリアントに基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４（ＶＨ ＣＤＲ１）、７０、７４、７８または８２（ＶＨ ＣＤＲ２）および６６（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ＶＬ ＣＤＲ１）、６４（ＶＬ ＣＤＲ２）および６６（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。
【００６９】
ヒト化抗体のＨ鎖Ｖ領域のＤＮＡを任意のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、例えば、ヒトＨ鎖Ｃγ１領域のＤＮＡに連結させることができる。上記のように、Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを適切な制限酵素で処理し、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素下のヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結して、ヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域のＤＮＡを含んだ発現ベクターを作出することができる。
【００７０】
ヒト化抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡを任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のＤＮＡに、連結させてもよい。Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを適切な制限酵素で処理し、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素下のヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結して、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを作出することができる。
ヒト化抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されているものなどの単一の発現ベクターに導入することもでき、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することができ、該形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、所望のヒト化抗体を産生することができる。
【００７１】
キメラ抗体またはヒト化抗体を産生するため、上記のような２つの発現ベクターを調製する必要がある。したがって、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーターのような発現制御要素の制御下にマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびに、発現制御要素の制御下にマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。ヒト化抗体については、発現制御要素の制御下にヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびに発現制御要素の制御下にヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。
【００７２】
次いで、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）のような宿主細胞をこれらの発現ベクターで同時形質転換することができ、得られた形質転換細胞をインビトロまたはインビボで培養してキメラ抗体またはヒト化抗体を産生することができる（例えば、国際公開公報第９１／１６９２８号を参照されたい）。あるいは、Ｈ鎖ＶおよびＣ領域をコードするＤＮＡならびにＬ鎖ＶおよびＣ領域をコードするＤＮＡを単一のベクターに連結し、適切な宿主細胞内に形質転換して抗体を産生してもよい。したがって、キメラ抗体の発現において、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列、マウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリーダー配列、マウスＬ鎖Ｖ領域、およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、例えば国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されるものなどの単一の発現ベクターに導入することができる。ヒト化抗体の発現において、ヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、例えば国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されるものなどの単一の発現ベクターに導入することができる。そのようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生する。
【００７３】
任意の発現系を用いて、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生することができる。例えば真核生物細胞は、樹立された哺乳類細胞株、真菌細胞および酵母細胞などの動物細胞を含み；原核生物細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞を含む。好ましくは、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体はＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞中で発現される。
哺乳類細胞における発現にとって有用な任意の従来のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーターを用いることが好ましい。さらに、哺乳類細胞における遺伝子発現用のプロモーターはウイルスプロモーター、例えばレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス（ＳＶ）４０のプロモーター、ならびに哺乳類細胞由来のプロモーター、例えばヒトポリペプチド鎖伸長因子１α（ＨＥＦ−Ｉα）のプロモーターを含むことができる。例えば、ＳＶ４０プロモーターはＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Nature, 277, 108-14,1979）にしたがって容易に用いることができ；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓらの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990）はＨＥＦ−Ｉαプロモーターと共に容易に用いることができる。
【００７４】
複製起点は、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）に由来する複製起点を含む。さらに発現ベクターは、宿主細胞系における遺伝子コピー数を増加させるために、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３'）ＩＩもしくはＩ（ｎｅｏ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子を選択マーカーとして含むことができる。
キメラ抗体またはヒト化抗体をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによってこのように産生された関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体を、細胞から単離し、次いで精製することができる。
【００７５】
関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体の単離および精製は、プロテインＡアガロースカラムを用いることによって実行できるが、タンパク質の単離および精製において用いられる任意の方法によっても行うことができ、したがって限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィー、限外ろ過、塩析および透析を任意で選択しまたは組み合わせて、キメラ抗体またはヒト化抗体を単離および精製してもよい。
キメラ抗体またはヒト化抗体を単離した後に、得られた精製抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【００７６】
キメラ抗体またはヒト化抗体の正常細胞に対する結合活性を含む抗原結合活性またはその他の活性の測定は、任意の公知の方法によって行うことができる（Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。抗体の抗原結合活性の測定のための方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩＡ（放射免疫アッセイ）または蛍光アッセイのような技術を利用することができる。ＥＬＩＳＡでは、抗体がプレートに固定化されており、抗体に対する抗原をプレートに添加し、その後、所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を添加する。次に、一次抗体を認識しかつアルカリホスファターゼなどの酵素でタグ付けされている二次抗体をプレートに添加し、これをプレインキュベートする。洗浄後、ｐ−ニトロフェニルホスフェートのような酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、関心対象の試料の抗原結合活性を評価する。抗原結合活性の評価はＢＩＡコア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行うこともできる。
【００７７】
抗原結合活性を保持するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および移入配列から選択して組み合わせることができる。
【００７８】
（ｉｉｉ）抗体断片
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ'）２断片を形成させてもよい（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ'）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。また抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
【００７９】
（ｉｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも二つの異なる抗原決定基に対する結合特異性を有する抗体である。例示として、細胞防御機構が癌細胞に集中するように、抗癌細胞マーカー結合アームと、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２またはＣＤ３）のような白血球上の誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）分子またはＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃｙＲＩＨ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）に結合するアームとを組み合わせることができる。また二重特異性抗体を用いて、細胞毒性物質を癌細胞に局在化させることもできる。これらの抗体は、癌細胞マーカー結合アームおよび細胞毒性物質（例えばサポリン、抗インターフェロン−ａ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）に結合するアームを包含する。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【００８０】
二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野において公知である。全長の二重特異性抗体の従来的な産生は、二本の鎖が別々の特異性を有する、二対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の同時発現に基づいている（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為の組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうちの１種だけが的確な二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階によって通常行われる、的確な分子の精製は、かなり煩雑であり、産物の収量は低い。類似の手順が国際公開公報第９３／０８８２９号に、およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【００８１】
別のアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原の組み合わせ部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合させることが好ましい。融合体の少なくとも一つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これにより、構築に用いる、比率が同等でないポリペプチド鎖三本によって最適な収量が得られる態様において、三つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際の高い柔軟性が得られる。しかしながら、等しい比率のポリペプチド鎖少なくとも二本の発現が高収量で起こる場合または比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターの中に二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【００８２】
このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、およびもう一方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖が存在しないことにより簡便な分離方法が得られるため、この非対称構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離が容易になることが分かった。このアプローチは国際公開公報第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【００８３】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の境界面を遺伝子操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい境界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の境界面由来の一つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖とサイズが同一であるか類似している補完的な「空洞」を、第二の抗体分子の境界面に作製する。これによって、ホモ二量体などのその他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収量を増大させるための機構が得られる。
【００８４】
二重特異性抗体は架橋抗体または「ヘテロ結合」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体中の抗体の一方をアビジンとカップリングさせ、もう一方をビオチンとカップリングさせることができる。そのような抗体は例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化することが提唱されており（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染症の治療について提唱されている（国際公開公報第９１／００３６０号、国際公開公報第９２／２００３７３号、およびＥＰ ０３０８９）。ヘテロ結合抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技術とともに開示されている。
【００８５】
抗体断片から二重特異性抗体を作製するための技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)では、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ'）２断片を作製する手順について記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨害する。次に、作製されたＦａｂ'断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ'−ＴＮＢ誘導体の一つを、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ'−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として用いることができる。
【００８６】
最近の進歩によって大腸菌からＦａｂ'−ＳＨ断片を直接回収することが容易になっており、それを化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 2 17-225 (1992)では、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ'）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ'断片を大腸菌から別々に分泌させ、インビトロにおいて指向性の化学的カップリングに供して、二重特異性抗体を形成させる。
【００８７】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体が産生されている（Kostelny et al., J Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992)）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次に再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を抗体ホモ二量体の産生に利用することもできる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記載されている「ダイアボディ」技術によって、二重特異性抗体断片を作製するための代替的な機構が提供されている。この断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨおよびＶＬドメインを別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対形成させ、それにより二つの抗原結合部位を形成させる。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J Immunol., 152: 5368 (1994)を参照されたい。
結合価が２を上回る抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J； Immunol. 147: 60 (1991)。
【００８８】
（ｖ）抗体結合体およびその他の修飾
本発明の抗体を、任意で、細胞毒性物質または治療剤と結合させる。
例えば、治療剤には、癌の治療に有用である任意の化学療法剤が含まれる。化学療法剤の例には、以下が含まれる：チオテパおよびシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノべムビチン、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６ージアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ＆ｃｏｍｍａｔ；；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬＯ， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＷ， Ｒｈ６ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに、上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体。治療剤にはまた、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む）；および抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【００８９】
カリチアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン、およびＣＣ １０６５などの低分子毒素の１つまたは複数と抗体との結合体もまた、本明細書において意図される。本発明の好ましい一態様において、１個または複数のメイタンシン分子に抗体を結合させる（例えば、抗体分子あたり約１〜約１０個のメイタンシン分子）。メイタンシンを例えばＭａｙ ＳＳ−Ｍｅに変換してもよく、メイタンシノイド−抗体結合体を作製するためにこれを還元してＭａｙ−ＳＨ３とし、修飾抗体と反応させることができる（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）。
あるいは、抗体を一つまたは複数のカリケアマイシン分子と結合させることもできる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡを切断することができる。使用できるカリケアマイシンの構造的類似体にはγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびＯＩ１が含まれるが、これらに限定されることはない（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)およびLode et al, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）。
【００９０】
使用できる酵素活性をもつ毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害因子、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日付で公開された国際公開公報第９３／２１２３２号を参照されたい。
【００９１】
本発明はさらに、種々の放射性同位体に結合した抗体を意図する。例としては１１１Ｉｎ、２ｌｌＡｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２ｌ２Ｂｉ、３２Ｐ、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。本発明において、本発明の抗体は使用の直前に放射性核種で標識されてもよく、放射標識抗体として提供されてもよい。周知の技術によって腫瘍特異的な抗体にカップリングされて、腫瘍細胞および組織を特異的に損傷させる部位に送達されうる多数の放射性核種および化学的細胞毒性物質が存在することを当業者は理解するであろう（例えば、１９８５年９月１７日付で刊行されたＷ．Ａ．Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５４２，２２５号；およびPastan et al., 1986, Cell, 47:641-648を参照されたい）。例えば、使用に適したイメージング試薬および細胞毒性試薬には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ（例えば、Sumerdon et al., 1990, Nucl. Med. Biol., 17:247-254）および９９ｍＴｃ；フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識；ルシフェリンのような化学発光標識、ならびに磁気共鳴イメージングで用いるための常磁性イオン（Lauffer et al., 1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339-342）が含まれる。当技術分野で公知かつ実践されるプロトコルおよび技術を用いて、そのような試薬により抗体を標識することができる。例えば、抗体の放射標識に関する技術については、Wenzel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York, 1983;Colcer et al., 1986, Meth. Enzymol., 121:802-816;およびMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin et al., Academic Press, 1985, pp. 303-316を参照されたい。正常組織に対する毒性は限定しながら、腫瘍もしくは癌細胞および／または組織に送達される線量を最大化することに関しては、イットリウム−９０（９０Ｙ）標識モノクローナル抗体が記載されている（例えば、Goodwin and Meares, 1997, Cancer Supplement, 80:2675-2680）。ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）およびレニウム−１８６を含むがこれらに限定されない他の細胞毒性放射性核種を、本発明のモノクローナル抗体の標識のために用いることもできる。放射性核種のなかでもイットリウム−９０（９０Ｙ）は放射免疫療法に適している可能性がある。なぜなら、イットリウム−９０（９０Ｙ）は、より高いβエネルギー（２．３ＭｅＶ ｖｓ ０．６１ＭｅＶ）を腫瘍に送達しかつ５〜１０ｍｍの路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有し、その結果として、標的細胞と隣接細胞の両方を死滅できる能力が向上するので、イットリウム−９０はヨウ素−１３１（１３１Ｉ）よりも有利であり、特に巨大腫瘍または血管新生の乏しい腫瘍において有利であるためである。
使用される検出可能な／検出用の標識は、使用するイメージング様式にしたがって選択される。例えば、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素１３１（１３１Ｉ）のような放射標識を、平面スキャンのためにまたは単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のために用いることができる。また、フッ素−１９のような陽電子放出性の標識を陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）において用いることもできる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）のような常磁性イオンを磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において用いることができる。例えばＸ線、ＣＡＴスキャンまたはＭＲＩによる、注射後の癌細胞の可視化のために、放射線不透過性標識でモノクローナル抗体を標識することもできる。特に、ＣＤＨ３関連疾患（例えば癌）については、癌内部の標識の局在性によって疾患の拡大を判定することができる。例えば、ＣＤＨ３を発現している癌内部に存在しかつ検出可能な標識の量によって、診断される対象における癌または腫瘍の有無の判定が可能になる。
【００９２】
抗体と細胞毒性物質との結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリイルジトリオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジピミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素はVitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるための例示的なキレート剤である（国際公開公報第９４／１１０２６号を参照されたい）。リンカーは、細胞中での細胞毒薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Charm et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）を用いることができる。
【００９３】
あるいは、抗体および細胞毒性物質を含む融合タンパク質を、例えば組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。
さらに別の態様において、腫瘍の前標的化における利用のため、抗体を（ストレプトアビジンのような）「受容体」と結合させることができ、ここで、抗体−受容体の結合体を患者に投与し、次に除去剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて循環系から未結合の結合体を取り除き、その後、細胞毒性物質（例えば放射性ヌクレオチド）と結合させた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【００９４】
本発明の抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開公報第８１／０１１４５号を参照されたい）を活性な抗癌薬へと変換するプロドラッグ活性化酵素と結合させてもよい（例えば、国際公開公報第８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい）。
そのような結合体の酵素成分には、プロドラッグをより活性なその細胞毒性形態へと変換させる様式でプロドラッグに対して作用できる、任意の酵素が含まれる。
【００９５】
本発明の方法において有用である酵素には、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモライシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用な、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、１３−ガラクトシダーゼおよびノイラミニラーゼなどの糖質分解酵素；１３−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な１３−ラクタマーゼ；ならびに、アミン窒素の位置でそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されることはない。あるいは、当技術分野において「アブザイム」としても公知である酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することもできる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照されたい）。腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のため、本明細書に記載されているように抗体−アブザイム結合体を調製することができる。
【００９６】
本発明の酵素を、上記のヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当技術分野において周知の技術によって、抗体に共有結合させることができる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結されている、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって構築することもできる（例えば、Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)を参照されたい）。
【００９７】
抗体の他の修飾が本明細書において意図される。例えば抗体を、さまざまな非タンパク性重合体、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体のうち一つと連結することができる。
【００９８】
本明細書において開示する抗体はリポソームとして製剤化することもできる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日付で公開された国際公開公報第９７／３８７３１号に記載されているような当技術分野において公知の方法によって、調製される。循環時間を増大させたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００９９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームを規定の孔径をもつフィルタから押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'断片を、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982）に記載のリポソームと結合させることができる。任意で、化学療法剤をリポソームに含めてもよい（Gabizon et al. ANational Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照されたい）。
【０１００】
本明細書において記載する抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい可能性がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または残基への挿入および／または残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴を保有しているという条件で、最終構築物を得るために欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数または位置の変更のような抗体の翻訳後過程を変化させることもできる。
【０１０１】
抗体の突然変異誘発のために好ましい位置である特定の残基または領域を同定するために有用な方法は、Cunningham and Wells Science, 244 : 1081-1085 (1989)によって記載されているように「アラニン走査突然変異誘発法」と呼ばれる。ここでは、標的残基または残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与えるために、中性のまたは負の電荷をもつアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。次に、さらなるまたは他のバリアントを置換部位においてまたはその代わりに導入することにより、置換に対し機能的な感度を示すこれらのアミノ酸位置を正確化する。このように、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は予め判定するが、突然変異それ自体の性質を予め判定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を解析するため、ａｌａ走査法または無作為変異導入法を標的のコドンまたは領域で行い、発現された抗体バリアントを所望の活性に関してスクリーニングする。
【０１０２】
アミノ酸配列の挿入には、１残基長から、１００またはそれ以上の残基長を含有するポリペプチドまで及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞毒性ポリペプチドと融合した抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントは、酵素、または抗体の血清中半減期を増大させるポリペプチドの、抗体Ｎ末端またはＣ末端との融合を含む。
【０１０３】
別のタイプのバリアントはアミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントでは、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。抗体の置換型変異誘発のために最大の関心対象となる部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの修飾も意図されている。
【０１０４】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、
（ａ）例えば、シートもしくはへリックス立体構造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、
（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または
（ｃ）側鎖のかさ高さ
を維持することに対するその影響が有意に異なる置換を選択することによって、達成される。
【０１０５】
天然に存在する残基は、以下の共通した側鎖の特性に基づく群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５）鎖方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうち一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０１０６】
抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンと置換し、分子の酸化安定性を向上させかつ異常な架橋結合を抑制することもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を向上させることができる（とりわけ抗体がＦｖ断片のような断片である場合）。
【０１０７】
特に好ましいタイプの置換バリアントでは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。通常、さらなる開発のために選択される得られたバリアントでは、それらが作製された親抗体と比較して生物学的特性が改善しているであろう。そのような置換バリアントを作製するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡単に言えば、幾つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位における全ての可能なアミノ置換を得る。このようにして作製された抗体バリアントを、糸状ファージ粒子から各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として一価の形で提示させる。ファージに提示されたバリアントを次に、本明細書において開示するようにその生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾の候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発法を行って、抗原結合に有意に寄与している超可変領域残基を同定することができる。あるいはまたはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して抗体と抗原との間の接触点を同定することも有利でありうる。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書において説明する技術による置換の候補である。そのようなバリアントが作製されると、バリアントのパネルを本明細書において記載するようにスクリーニングに供し、さらなる開発のために、一つまたは複数の関連アッセイ法において優れた特性を有する抗体を選択することができる。
【０１０８】
抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、または、オリゴヌクレオチドを介した（もしくは部位特異的な）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および以前に調製されたバリアントもしくは非バリアント型の抗体のカセット突然変異誘発による調製を含むが、これらに限定されることはない。
【０１０９】
本発明において用いられる抗体を修飾して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を増大させるようにエフェクタ機能を改善することが望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして作製されたホモ二量体抗体では、内部移行能力が向上し、かつ／または補体媒介性細胞殺滅および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が増大しうる。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J linmunol 148 : 2918-2922 (1992)を参照されたい。
【０１１０】
Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて、抗腫瘍活性が増大したホモ二量体抗体を調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有しかつそれによって補体溶解およびＡＤＣＣ能が増大されうる抗体を設計することもできる（Stevenson et al. Anti-CancerDrugDesign 3: 2 19-230 (1989)を参照されたい）。
【０１１１】
抗体の血清中半減期を増大させるため、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようにサルベージ受容体結合性の抗原決定基を抗体（とりわけ抗体断片）に組み入れることができる。本明細書で用いる「サルベージ受容体結合性の抗原決定基」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期の増大の原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域の抗原決定基を指す。
【０１１２】
ＣＤＨ３関連疾患の診断
本発明の抗体は、癌などのＣＤＨ３関連疾患を診断するためのマーカーとして用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体を用いて対象由来の試料中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出することにより、ＣＤＨ３関連疾患を診断することができる。したがって、本発明は、対象由来の試料において本発明の抗体を用いてＣＤＨ３ポリペプチドを検出することにより、対象においてＣＤＨ３関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための方法を提供する。本方法は以下の段階を含む：
（ａ）対象由来の試料または検体を本発明の抗体またはその断片と接触させる段階；
（ｂ）試料または検体中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３タンパク質の相対存在量に基づき対象が疾患を患っているかまたは疾患を発現するリスクがあるかどうか判断する段階。
典型的な態様において、ＣＤＨ３関連疾患は癌であり、より具体的には膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌である。
【０１１３】
あるいは、他の態様において、本発明の抗体を、生体内の癌を検出または可視化するために用いてもよい。より具体的には、本発明は、以下の段階を含む、癌を検出またはイメージングする方法を提供する：
（１）対象に本発明の抗体またはその断片を投与する段階；
（２）生体内における該抗体または断片の蓄積または局在を検出する段階、および
（３）該対象内での該抗体または断片の位置を決定する段階。
あるいは、本発明によると、癌細胞または組織を対象において検出することができる。例えば本発明は、以下の段階を含む、ＣＤＨ３が発現している癌を対象において検出するための方法を提供する：本発明の抗体またはその断片を対象に投与して、該抗体または断片を対象の細胞または組織中のＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合させる段階；該細胞または組織に結合した該抗体を可視化する段階；および、該細胞または組織中に対する該抗体の結合度合いを正常な対照細胞または組織と比較する段階であって、該対象の細胞または組織対する該抗体の結合度合いが該正常な対照細胞または組織と比べて上昇したことが、該対象における癌の指標となる、段階。
【０１１４】
好ましくは、生体内へ投与された抗体を追跡するために、検出可能な分子で抗体を標識してもよい。例えば、蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識された抗体の挙動をインビボで追跡することができる。そのような分子で抗体を標識するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１１５】
蛍光物質または発光物質で標識された抗体は、例えば、内視鏡または腹腔鏡を用いて観察することができる。放射性同位体を用いる場合、放射性同位体の放射能を追跡することによって、抗体の局在をイメージングすることができる。本発明において、インビボでの本発明の抗体の局在または蓄積は、癌細胞の存在を示す。
【０１１６】
類似の方法が他の抗体にも利用されており、当業者は、体内で検出可能なように結合した抗体または断片の位置のイメージングに適したさまざまな方法を認識するであろう。非限定的な指針として、約１０〜１０００マイクログラム（ｍｃｇ）、好ましくは約５０〜５００ｍｃｇ、より好ましくは約１００〜３００ｍｃｇ、より好ましくは約２００〜３００ｍｃｇの精製抗体が投与される。例えば、ヒトに適用可能な投与量としては、約１００〜２００ｍｃｇ／ｋｇ体重、または３５０〜７００ｍｇ／ｍ２体表面積が挙げられる。
【０１１７】
ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキット
本発明は、ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキットを提供する。具体的には、本キットは、ＣＤＨ３ポリペプチドの検出試薬として、本発明の抗体またはその断片を含む。一態様において、本発明のキットのための抗体を蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識することができる。抗体を標識するための方法および標識抗体を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。
【０１１８】
さらに本キットは、陽性および陰性の対照試薬、ならびに本発明の抗体を検出するための二次抗体を含むことができる。例えば、健常対象または非癌性組織から得られた組織試料は、有用な陰性対照試薬として役立ちうる。本発明のキットはさらに、緩衝液、希釈液、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明を記した添付文書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含めて、商業的見地または使用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。これらの試薬などを、ラベルした容器中に保持することができる。適切な容器としてはボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。
【０１１９】
他の態様において、本発明はさらに、本発明の抗体を含む、診断される対象内の癌の検出、イメージング、または治療に用いるキットを提供する。あるいは本発明は、癌を含むＣＤＨ３関連疾患について診断される対象に投与するために本発明の抗体を含む診断剤が使用されるような、該診断剤も提供する。好ましい態様において、本発明の抗体は放射性同位体で標識することができる。例えば、本発明のキットは、キレート剤および放射性物質で修飾された本発明の抗体を含むことができる。ＭＸ−ＤＯＰＡは抗体を修飾するのに好ましいキレート剤である。その一方で、バイオイメージングのためのトレーサーとしてインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）を用いることができる。あるいは、ＣＤＨ３関連疾患の放射免疫療法のために、抗体をβ核種、例えばイットリウム−９０（９０Ｙ）で標識することができる。本発明において、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）またはイットリウム−９０（９０Ｙ）をその塩または溶液として提供してもよい。インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）またはイットリウム−９０（９０Ｙ）の適切な塩は塩化物である。
好ましい態様において、ＣＤＨ３関連疾患は膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌である。
【０１２０】
治療的使用
本発明の抗体を用いて、ＣＤＨ３関連疾患を治療および／もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法および薬学的組成物を、以下に記載する。典型的な態様において、ＣＤＨ３関連疾患は癌、例えば膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞であるが、これらに限定されることはない。具体的には、本発明によって対象におけるＣＤＨ３関連疾患を治療および／もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法は、該対象に本発明の抗体またはその断片の有効量を投与する段階を含む。
【０１２１】
本発明の対象は、哺乳動物および鳥類の動物を含む動物であってよい。例えば哺乳動物には、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、およびイヌが含まれうる。
【０１２２】
本明細書記載の抗体またはその断片はＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合することができ、したがって該抗体またはその断片が対象に投与されると、該対象内のＣＤＨ３ポリペプチドに結合して、癌性細胞などのＣＤＨ３発現細胞の増殖を抑制しうる。あるいは、該抗体またはその断片を治療成分と結合させて対象に投与すると、対象内のＣＤＨ３ポリペプチドを発現している領域（すなわち罹患領域）に送達されて、治療成分が、罹患領域へと選択的に送達され、そこで作用することができる。そのような治療成分は、癌に対する治療効果を持つとして公知のまたは開発予定の任意の治療物質であってよく、かつ、非限定的に放射性同位体標識および化学療法剤を含む。治療物質として使用できる放射性同位体標識は、β線エネルギーおよびその放出効果、γ線放出の有無、そのエネルギーおよび放出効果、物理的半減期、ならびに標識化手順を含む、種々の要素に依って選択することができる。一般的に、イットリウム（９０Ｙなど）ならびにヨウ素（１２５Ｉおよび１３１Ｉなど）に基づく放射性同位体標識を用いることができる。化学療法剤は、癌の治療に関して公知のまたは開発予定の任意の薬剤であってよく、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセルを含むが、これらに限定されることはない。本発明の抗体またはその断片は、ＣＤＨ３ポリペプチドに選択的に結合可能であるが正常細胞には結合せず、したがって該抗体もしくはその断片または放射性同位体または化学療法剤によって引き起こされる副作用を効果的に回避することができ、それゆえ、治療効果が高くなると考えられる。
【０１２３】
本明細書記載の抗体またはその断片を、ＣＤＨ３関連疾患を治療または予防するのに有効な用量で対象に投与することができる。有効な用量とは、治療された対象において健康に良い利益をもたらすのに十分な、抗体またはその断片の量を指す。薬学的組成物が本発明の抗体またはその断片を含む場合に利用できる剤形および投与法を、以下で説明する。
【０１２４】
必要または所望であれば、ＣＤＨ３関連疾患を軽減するために、本明細書記載の特異的モノクローナル抗体または断片の混合物のような、異なるモノクローナル抗体のカクテルを投与できることをさらに理解されたい。実際に、罹患細胞上のいくつかの抗原または異なるエピトープを標的化するためのカクテルにおいてモノクローナル抗体またはその断片の混合物を用いることは、抗原のうち一つの下方制御による腫瘍細胞および／または癌細胞の回避を防ぐには特に有利な手法である。
【０１２５】
本発明による使用のための薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて従来の様式で製剤化することができる。したがって本発明は、本発明の抗体またはその断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物を提供する。
【０１２６】
抗体またはその断片は、例えばボーラス注射または持続注入を介した注射による非経口投与（すなわち、静脈内投与または筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用の製剤は単位剤形で、例えばアンプルまたは複数回投与容器中に、保存剤を添加して提供することができる。本組成物は、油性または水性の溶剤中で懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含んでもよい。あるいは本抗体は、使用前に適切な溶剤、例えば発熱物質非含有滅菌水を用いて構成するための、凍結乾燥された粉末形態でもよい。
【０１２７】
抗体もしくは断片またはそれに結合した治療成分の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により、決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ／ＥＤ比として表すことができる。
【０１２８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を定める際に用いることができる。抗体の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環血漿濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形、利用される投与経路、ならびに結合する治療成分のタイプおよび量に応じてこの範囲内で変動しうる。本発明の抗体またはその断片に関して、有効用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養物で測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成されるように、動物モデルにおいて用量を定めてもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１２９】
対象の状態および年齢ならびに／または投与経路に応じて、当業者は、本発明の薬学的組成物の適切な用量を選択することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、本発明による抗体が一日に対象の体重１ｋｇあたり約３〜約１５ｍｃｇの量で、好ましくは該対象の体重１ｋｇあたり約１０〜約１５ｍｃｇの量で該対象に投与されるような量で、投与される。投与の間隔および回数は、対象の状態および年齢、投与経路、ならびに薬学的組成物に対する応答を考慮して選択することができる。例えば、薬学的組成物は５〜１０日間にわたり、１日１〜５回、好ましくは１日１回対象に投与することができる。
【０１３０】
別の局面において、放射性同位体で標識された抗体を含む組成物が非経口的に投与される場合、成人１人に対する投与線量は一度に０．１ｍＣｉ／ｋｇ〜１．０ｍＣｉ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍＣｉ／ｋｇ〜０．５ｍＣｉ／ｋｇ、およびより好ましくは０．４ｍＣｉ／ｋｇである。
薬学的組成物は全身的にまたは局所的に投与することができる。有効成分を罹患部位に送達するような標的化送達様式で投与することが好ましい。
【０１３１】
特定の態様において、本発明の方法および組成物は、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセルを非制限的に含む化学療法剤の一つまたは組み合わせとともに、癌の治療または予防のために用いられる。
放射線療法に関しては、治療される癌のタイプに応じて任意の放射線療法プロトコルを用いることができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、Ｘ線照射を施すことができる。γ線を放射する放射性同位体、例えばラジウム、コバルト、および他の元素の放射性同位体などを投与し、組織に曝露してもよい。
【０１３２】
別の態様において、化学療法または放射線療法は、本発明の抗体を含む方法および組成物を用いてから好ましくは少なくとも１時間後、５時間後、１２時間後、１日後、１週間後、１ヶ月後、およびより好ましくは数ヶ月（例えば、最大３ヶ月）後に施される。本発明による方法および組成物を用いた治療の前に、治療と同時に、または治療の後に施される化学療法または放射線療法は、当技術分野において公知の任意の方法によって施すことができる。
【０１３３】
別の態様において、本発明はまた、ＣＤＨ３関連疾患を治療または予防するための薬学的組成物の製造における本発明の抗体の使用も提供する。具体的には、本発明はさらに、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための本発明の放射標識抗体の使用を提供する。
【０１３４】
あるいは、本発明はさらに、ＣＤＨ３関連疾患の治療または予防における使用のための本発明の抗体を提供する。具体的には、癌に対する放射免疫療法で使用するための本発明の放射標識抗体も提供される。
あるいは、本発明はさらに、有効成分としての本発明の抗体とともに薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、ＣＤＨ３関連疾患の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。具体的には、本発明はさらに、有効成分としての本発明の放射標識抗体とともに薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。
【０１３５】
別の態様において、本発明はまた、有効成分が本発明の抗体であり、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、ＣＤＨ３関連疾患の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。具体的には、本発明はさらに、本発明の放射標識抗体と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。
【０１３６】
さらなる態様において、本発明は、診断される対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィーにおいて使用するための本発明の抗体を提供する。あるいは、本発明は、対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィー用の診断薬を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィー用の診断薬を製造するための方法またはプロセスを提供する。
本明細書において引用される全ての先行技術文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明する。
材料および方法
抗体産生
ＣＤＨ３遺伝子がコードする細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）を、癌細胞に由来するｃＤＮＡプールから増幅した。産物をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングした。ＣＤＨ３特異的抗体を産生するため、１ヶ月間にわたって２週間おきにドメイン発現ベクター（１７．５μｇ／注射）を皮下注射することにより、マウスを免疫した。抗血清の力価を確認した後、脾細胞をマウスから抽出し、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製した。癌細胞の表面上の天然ＣＤＨ３抗原に結合する抗体を産生できるハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングによって、ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６が抗原特異的抗体を高レベルで産生することを確認し、それゆえこれらのハイブリドーマを、さらなる実験用の抗体を産生させるのに選択した。ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６をマウスに腹腔内注射し、腹水を２〜３週間後に採取した。プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）を用いて腹水から抗体を精製した。
本明細書において、抗体は、クローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６とも称される。
【０１３８】
細胞培養
ヒト非小細胞肺癌細胞株であるＨ１３７３がＣＤＨ３ポリペプチドを発現することが確認されたため、これを、インビボにおける治療研究に用いた。Ｈ１３７３はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓｍ，ＶＡ）から購入し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で維持した。
【０１３９】
放射標識
ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、クローン＃６によって産生された抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体、および、正常マウスＩｇＧ１（Ｎｏｒｄｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）である対照抗体を、イットリウム−９０（９０Ｙ）で標識した。二官能性金属イオンキレート剤ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）により９０Ｙで抗体を標識した。抗体１ミリグラムをそれぞれ、ジメチルホルムアミド中、モル比１：５で該キレート剤に結合させた。３７℃で２０時間のインキュベーションの後、Ｂｉｏｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて抗体−キレート剤複合体を精製した。並行して、９０ＹＣｌ３（ＱＳＡ Ｇｌｏｂａｌ，Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、０．２５Ｍ酢酸（ｐＨ５．５）とともに室温で５分間プレインキュベートした。９０Ｙ標識抗体を得るため、抗体−キレート剤複合体をそれぞれ、プレインキュベートした９０ＹＣｌ３溶液とともに３７℃で１時間インキュベートした。製造元の使用説明書にしたがってＢｉｏｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ ６を用いて標識抗体を精製した。標識化プロセスの間、これらの抗体の分解は認められなかった。
【０１４０】
異種移植モデル
動物の世話および治療は群馬大学の動物実験指針および動物実験委員会にしたがって行った。Ｈ１３７３細胞懸濁液１００マイクロリットル（細胞１×１０７個）を３〜５週齢の雌性ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ． Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）の右脇腹へ皮下接種した。これらのマウスを数週間飼養して腫瘍を発生させた。樹立された腫瘍を担腫瘍マウスから分離し、切開して一辺が２ｍｍの立方体の組織断片とした。これらの断片をヌードマウスへ連続的に移植した。移植後、平均腫瘍容積が１００ｍｍ３に達するまでこれらのマウスを飼養した。
【０１４１】
放射線療法
異種移植マウスを１０組の異なる治療群に無作為に割り当てた。９０Ｙ標識抗体（４〜１０ｍＣｉ／ｍｇ）を上記のように調製した。９０Ｙ標識したまたは非標識のクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、またはクローン＃６をマウスに静脈内注射した。対照として９０Ｙ標識正常マウスＩｇＧ１を注射した。注射抗体の放射能を動物１匹あたり１００μＣｉに調整した。治療された異種移植マウスの体重および腫瘍容積を、注射後５週間モニターした。以下の式を用いて腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した：（最短径）２×（最長径）×０．５。
【０１４２】
還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
各５μｇの抗ＣＤＨ３抗体を、４％ＳＤＳ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、０．０４％ブロモフェノールブルーおよび１０％メルカプトエタノールを含めたＳＤＳ緩衝液と混合した。加熱後、混合物を４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。その後、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）で染色し、１０％メタノールおよび７％酢酸を用いることによって脱色した。ゲルの画像をスキャナによって捕捉した。
【０１４３】
可変領域のアミノ酸配列の分析
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、総ＲＮＡをハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４およびクローン＃５から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＮｏｖａＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＭｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りである：
重鎖５'プライマーのＭｕＩｇＶＨ５'−Ｂ；
５'−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、
軽鎖５'プライマーのＭｕＩｇκＶＬ５'−Ｄ（以下のプライマーの混合物）；
５'−ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）および５'−ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）、
重鎖５'プライマーのＭｕＩｇＧＶＨ３'−２；
５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＲＣＣＡＲＫＧＧＡＴＡＲＡＣＩＧＲＴＧＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）、ならびに
軽鎖３'プライマーのＭｕＩｇκＶＬ３'−１；
５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）。
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。挿入断片領域を配列決定し、クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃５の可変領域（シグナル配列を除く）の核酸配列を決定した。
プライマー配列中の異なるヌクレオチドについて、以下の記号を用いる；
Ｃ、Ｇ、またはＴはＢ、Ａ、Ｇ、またはＴはＤ、Ａ、Ｃ、またはＴはＨ、イノシンはＩ、ＧまたはＴはＫ、ＡまたはＣはＭ、ＡまたはＧはＲ、ＣまたはＧはＳ、Ａ、Ｃ、またはＧはＶ、ＡまたはＴはＷ、およびＣまたはＴはＹ。
【０１４４】
結果
ＣＤＨ３標的化放射免疫療法の効力を評価するため、抗ＣＤＨ３抗体をβ線放射型の同位体９０Ｙ（ｔ１／２＝６４．１時間）で放射標識し、静脈内注射によって腫瘍担持ヌードマウスに投与した。イットリウム−９０標識クローン＃３、＃４、および＃６で処理された腫瘍の増殖速度は、抗体と結合したイットリウム−９０からの放射によって劇的に低下した（図１）。とりわけ、９０Ｙ標識クローン＃３およびクローン＃６は観察中、Ｈ１３７３異種移植片マウスにおける腫瘍増殖を強く抑制した。他方で、９０Ｙ標識対照抗体は腫瘍増殖に対する効果を示さなかった。それゆえ、９０Ｙ標識抗体の治療効果は、腫瘍細胞表面に発現されたＣＤＨ３ポリペプチドに対するその親和性に依るものと思われた。いずれの抗体で処置したマウスの体重も有意に減少しなかった（データは示さず）。
【０１４５】
抗ＣＤＨ３抗体クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃６に結合させたイットリウム−９０は、腫瘍に対して注目すべき治療効果を発揮した。それゆえ、ＣＤＨ３は癌治療にとって魅力的な標的であり、抗ＣＤＨ３抗体は癌治療のための新規の手段として利用可能である。
【０１４６】
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のように決定された：
クローン＃３、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＷＩＨＷＶＫＱＲＰＭＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＨＬＴＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＳＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される核酸配列によってコードされる）； クローン＃３、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃４、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＬＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＩＫＱＲＰＩＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤＲＡＴＦＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される核酸配列によってコードされる）； クローン＃４、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＴＤＲＬＩＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＶＧＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＭＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃５、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＬＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＩＫＱＲＰＩＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡＲＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される核酸配列によってコードされる）；および クローン＃５、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＴＤＲＬＩＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＶＧＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＭＦＧＧＧＴＫＬＤＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１４７】
Ｋａｂａｔの定義によって決定された抗体のＣＤＲ配列は以下の通りである：
クローン＃３、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＦＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＡＮＲＬＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃４、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される核酸配列によってコードされる）；ならびに クローン＃５、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を還元条件の下で行った。ゲル上のバンドパターンは、ＩｇＧ重鎖に対応する分子量範囲４０〜５０ｋＤａおよびＩｇＧ軽鎖に対応するより低い分子量範囲２０〜３０ｋＤａによって特徴付けられた。抗ＣＤＨ３抗体クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃５は一般的なＩｇＧとして単一の重鎖バンドおよび単一の軽鎖バンドを示した。他方で、抗ＣＤＨ３抗体クローン＃６は二本の重鎖バンドおよび単一の軽鎖バンドを示した。重鎖の可変領域での不完全なグリコシル化によって、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際にさらなる重鎖バンドが生じた。図２に示されるように、不完全なグリコシル化は抗体の均一性に影響を与え、かつこれは治療薬の開発に困難を生じうる。それゆえ、Ｈ鎖可変領域におけるグリコシル化を回避するために、クローン＃６のグリコシル化部位に単一のアミノ酸置換を有する、クローン＃６のバリアントを設計した。これらのバリアントは、抗体に基づく制癌剤の開発に対して、クローン＃６よりも適切であると考えられる。
【０１４９】
クローン＃６バリアントのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（下線は置換されたアミノ酸残基を示す）：
クローン＃６ＮＳ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃６ＮＴ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃６ＮＡ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に示される核酸配列によってコードされる）；および
クローン＃６ＮＱ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示される核酸配列によってコードされる）。
クローン＃６バリアントのＬ鎖可変領域（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列は、クローン＃６のものと同じである； ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＳＳＰＧＥＫＶＴＭＳＣＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＦＲＴＳＮＬＡＳＧＶＰＴＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＹＨＩＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１５０】
Ｋａｂａｔの定義によって決定されたクローン＃６バリアントのＶＨ ＣＤＲ２配列は以下である；クローン＃６ＮＳではＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示される核酸配列によってコードされる）、クローン＃６ＮＴではＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示される核酸配列によってコードされる）、クローン＃６ＮＡではＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示される核酸配列によってコードされる）、およびクローン＃６ＮＱではＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１に示される核酸配列によってコードされる）。
Ｋａｂａｔの定義によって決定された、該バリアントの他のＣＤＲ配列はクローン＃６のものと同じである；ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ３はＳＧＹＧＮＬＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＨＹＨＩＹＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１５１】
産業上の利用可能性
本発明は、ＣＤＨ３を発現する癌を、放射性同位体標識抗ＣＤＨ３抗体によりインビボで治療できるという発見に、少なくとも部分的に基づく。ＣＤＨ３は、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌または肝臓癌において強く発現される遺伝子として報告された。したがって、がん、例えば、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌または肝臓癌の治療は、放射性同位体標識で標識された抗ＣＤＨ３抗体を用いて好都合に行われる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤＨ３抗体、該抗体を用いてＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたは診断するための方法、および、該抗体を含む薬学的組成物または診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
カドヘリンは、カルシウム依存性の細胞間結合を形成し、かつ形態形成においてならびに成体組織および臓器の発達および維持において必須の役割を果たす、細胞間接着糖タンパク質である（非特許文献１）。胚形成中に、特異的なカドヘリンの細胞発現は、細胞選別および組織層形成の過程において極めて重要である同種親和性相互作用をもたらす（非特許文献２〜４）。これらの細胞付着の変化は細胞不安定化において重要な役割を果たし、上皮構造の綿密に調節された分化過程を改変する可能性がある（非特許文献５〜６）。このため、カドヘリンの機能喪失または過剰発現およびこれらのタンパク質を体系化している遺伝子の制御の基礎となる分子機構は、発癌に影響を与える（非特許文献７）。
【０００３】
カドヘリンファミリーは、それぞれが特異的な組織分布を示す、古典的なＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンを含むさまざまなサブファミリーに細分される（非特許文献８）。Ｅ−カドヘリンは全ての上皮組織において発現されるが、Ｐ−カドヘリン（ＣＤＨ３）の発現は、前立腺および皮膚を含む重層上皮の基底層または下層、ならびに乳房筋上皮細胞のみに限られる（非特許文献９〜１０）。
【０００４】
広範な証拠により、異常なＰ−カドヘリン発現が、細胞増殖、ならびに結腸、乳房、肺、甲状腺、および子宮頚部の腫瘍と関連することも現在明らかとなっている（非特許文献１１〜１２）。ヒトＰ−カドヘリンは、外陰部類表皮癌に対して産生されたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９モノクローナル抗体によって認識される抗原であることが報告された（非特許文献１０）。Ｐ−カドヘリン媒介性の接着および細胞内シグナル伝達の調節は、インビボでの腫瘍細胞の増殖および生存の低下をもたらすものと予想される。したがって、細胞増殖および固形腫瘍進行においてＰ−カドヘリンが有するものと思われる中心的な役割を考慮すれば、種々の癌を有する患者に治療的恩恵を提供できるＰ−カドヘリンに対する抗体を産生することが望ましい。
【０００５】
癌特異的分子に対するモノクローナル抗体は、癌治療において有用であることが証明されている（非特許文献１３）。乳癌、悪性リンパ腫、および結腸癌に対するトラスツズマブ（非特許文献１４）、リツキシマブ（非特許文献１５）、およびベバシズマブ（非特許文献１６）のようなヒト化抗体またはキメラ抗体の臨床応用の成功例の他に、他の分子標的に対するいくつかのモノクローナル抗体が開発中であり、これらの抗腫瘍活性が評価中である。これらのモノクローナル抗体は、効果的な治療法のない腫瘍を有する患者に希望を与えるものと期待される。これらのモノクローナル抗体に関するその他の重要な課題の一つは、標的分子を発現している細胞に対するこれらの特異的な反応により、重篤な毒性を伴うことなく癌細胞に対して選択的な治療効果を達成することである（非特許文献１７〜１９、特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報第２００２／０９７３９５号
【特許文献２】国際公開公報第２００４／１１０３４５号
【特許文献３】国際公開公報第２００６／１１４７０４号
【特許文献４】国際公開公報第２００７／１０２５２５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Conacci-Sorrell M, et al., J Clin Invest, 109:987-91, (2002
【非特許文献２】Nose A, et al., Cell, 54:993-1001, (1988)
【非特許文献３】Steinberg MS, et al.,. Proc Natl Acad Sci USA, 91:206-9, (1994)
【非特許文献４】Takeichi M. Science, 251:1451-5, (1991)
【非特許文献５】Daniel CW, et al., Dev Biol, 169:511-9, (1995)
【非特許文献６】Nose A and Takeichi M. J Cell Biol, 103:2649-58, (1986)
【非特許文献７】Behrens J. Cancer Metastasis Rev, 18:15-30(1999)
【非特許文献８】Takeichi M. Development, 102:639-55(1988)
【非特許文献９】Takeichi M. J Cell Biol 103:2649-58, (1986)
【非特許文献１０】Shimoyama Y, et al., Cancer Res, 49:2128-33(1989)
【非特許文献１１】Gamallo, Modern Pathology, 14:650-654, (2001)
【非特許文献１２】Stefansson, et al., J. Clin. Oncol. 22(7):1242-1252 (2004)
【非特許文献１３】Harris, M. Lancet Oncol, 5：292-302 (2004)
【非特許文献１４】Baselga, J. Oncology, 61：SuuplSuupl 2 14-21 (2004)
【非特許文献１５】Maloney, D.G., et al. Blood, 90：2188-2195 (1997)
【非特許文献１６】Ferrara, N., et al. Nat Rev Drug Discov, 3：391-400 (2004)
【非特許文献１７】Crist, W.M., et al. J Clin Oncol, 19：3091-3102 (2001)
【非特許文献１８】Wunder, J.S., et al. J Bone Joint Surg Am, 80：1020-1033 (1998)
【非特許文献１９】Ferguson, W.S. and Goorin, A.M. Cancer Invest, 19：292-315 (2001)
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどのＣＤＨ３ポリペプチドまたはその断片を特異的に認識する、ＣＤＨ３に対するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体が、癌細胞株を含有する異種移植マウスにおいて顕著な抗腫瘍効果を有する証拠を提供する。
【０００９】
具体的には、本発明は以下に関する：
［１］抗体がＨ（重）鎖Ｖ（可変）領域およびＬ（軽）鎖Ｖ領域を含み、該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつ該抗体がＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその断片。
典型的な態様において、前記抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、および一本鎖抗体からなる群より選択される。
［２］本発明の抗体またはその断片は、細胞毒性剤、治療剤、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合させることができる。典型的な態様において、前記抗体は放射性同位体標識で標識される。より典型的な態様において、前記放射性同位体標識は、９０イットリウム（９０Ｙ）、１２５ヨウ素（１２５I）、および１１１インジウム（１１１Ｉｎ）からなる群より選択される。
［３］対象において、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法であって、本発明の抗体またはその断片の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
［４］対象におけるＣＤＨ３関連疾患または該疾患を発症する素因の診断または予後判定のための方法であって、
（ａ）本発明の抗体または断片と対象由来の試料または標本とを接触させる段階；
（ｂ）試料または標本中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３ポリペプチドの相対存在量に基づき、該対象が疾患を患っているかまたはその発症リスクを有するか否かを判定する段階
を含む、方法。
［５］ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物であって、本発明の抗体またはその断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物。
［６］ＣＤＨ３関連疾患の診断または予後判定のためのキットであって、本発明の抗体またはその断片を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、腫瘍増殖に対する９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３抗体（クローン＃３、＃４、＃５、および＃６）の効果を示す。９０Ｙ標識抗ＣＤＨ３抗体、特にクローン＃３、＃４、および＃６は、ヌードマウスに移植されたＨ１３７３細胞の増殖を効果的に抑制したが、非標識抗ＣＤＨ３抗体の投与による腫瘍増殖の抑制は示されなかった。
【図２】図２は、抗ＣＤＨ３抗体（クローン＃３、＃４、＃５、および＃６）の還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。クローン＃３、＃４、および＃５のバンド形成パターンから、ＩｇＧ重鎖および軽鎖に対応する２本のバンドが明らかになったが、クローン＃６のバンド形成パターンからは、２本の重鎖バンドおよび１本の軽鎖バンドが明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
態様の説明
本発明は抗ＣＤＨ３抗体、それを含む組成物、および、癌などのＣＤＨ３関連疾患の治療または予防におけるそれらの使用に関する。典型的な態様において、抗体は放射性同位体標識で標識される。膵臓癌患者から採取された、膵臓癌細胞および正常細胞の遺伝子発現解析用のｃＤＮＡマイクロアレイが報告されている（Nakamura et al.,(2004)Oncogene;23: 2385-400）。その後、膵臓癌細胞において発現が特異的に増強されるいくつかの遺伝子が同定された。細胞膜タンパク質である胎盤カドヘリン（Ｐ−カドヘリン；ＣＤＨ３）はこれらの遺伝子の１つであり、主要臓器での低い発現レベルを示した。副作用の危険性が回避されるので、このような特徴は、癌治療の標的遺伝子にとって適切である。さらに、肺癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、前立腺癌細胞株、乳癌細胞株、胃癌細胞株、および肝臓癌細胞株などの他の癌細胞株において、ＣＤＨ３の同様の過剰発現が確認された（国際公開公報第２００７／１０２５２５号）。
【００１２】
定義
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはそのペプチドに対する特異的反応性を有する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合した抗体、および抗体断片を含むことができる。さらに、本明細書において抗体は最も広い意味で使用されており、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、無傷の(intact)モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの無傷の抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を網羅する。「抗体」とは全てのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）を指す。
【００１３】
「抗体断片」とは無傷の抗体の一部分であり、無傷の抗体の１つまたは複数の抗原結合領域または可変領域を一般的に含む。したがって本発明において、抗体断片は無傷の抗体の1つまたは複数の抗原結合部分を含むことができる。本明細書において用いられる、抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＣＤＨ３）に特異的に結合できる能力を保持する抗体の一つまたは複数の免疫学的に活性な断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって実行されうることが示されている。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ならびに一本鎖抗体分子が含まれる。構造にかかわらず、抗体断片は、無傷の抗体によって認識される同一の抗原と結合する。「抗体断片」という用語はまた、特異的抗原に結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子操作ポリペプチド、例えば軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位も含む。
【００１４】
本明細書において用いられる、ＣＤＲと「機能的に等価な」という用語は、それを有する抗体に、元のＣＤＲを有する抗体と実質的に等しい抗原結合活性および抗原特異性を与える、ＣＤＲを指す。ＣＤＲと機能的に等価な例としては、元のＣＤＲに対して１つまたは複数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され、および／または付加されているものが挙げられる。抗原結合活性および抗原特異性が維持される限り、アミノ酸変異の数または割合は特に限定されない。しかしながら、可変領域に含まれる元のＣＤＲのアミノ酸配列の２０％またはそれ未満を変化させることが一般的に好ましい。より好ましくは、変異の割合は１５％またはそれ未満、１０％またはそれ未満、５％またはそれ未満である。好ましい態様において、アミノ酸変異の数は１０個またはそれ未満、５個またはそれ未満、４個またはそれ未満、３個またはそれ未満、２個またはそれ未満、１個またはそれ未満である。当業者は、元のＣＤＲの特性を保持する、許容可能な変異を理解するであろう。
【００１５】
抗体の産生
本発明では、抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体を用いる。これらの抗体は当技術分野において周知の方法によって提供される。
本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について以下に記載する。
【００１６】
（ｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えばモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によっても産生されうる。
【００１７】
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターなどをＣＤＨ３ポリペプチドで免疫して、ＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいてＣＤＨ３ポリペプチドで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。
【００１８】
調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含有することが好ましい適切な培養培地中に播種し、その培地中で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地には典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含めることができ（ＨＡＴ培地）、これらの物質によってＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【００１９】
好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を補助し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞を含む。ヒトモノクローナル抗体の産生に関して、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【００２０】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、または、放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などの、インビトロ結合測定によって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の３０スキャッチャード分析によって判定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適した培養培地の例として、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＬ−１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
【００２１】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
【００２２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ＤＮＡを単離すると、発現ベクターの中に配し、これを次に、免疫グロブリンタンパク質を他の方法では産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)が含まれる。
【００２３】
ＣＤＨ３に対して反応性を示す特異的抗体または抗体断片を産生するための別の方法とは、細菌中で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部分をコードする発現ライブラリーを、ＣＤＨ３タンパク質またはペプチドを用いてスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂ断片、ＶＨ領域、およびＦｖ領域をファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)；Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)；およびMcCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)を参照されたい。例えばＣＤＨ３ペプチドを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、ＣＤＨ３に対して反応性を有する免疫グロブリン断片を同定することができる。あるいは、抗体またはその断片を産生するためにＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手できる）を用いてもよい。
【００２４】
さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991)では、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離についてそれぞれ記載している。その後の刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）について記載されている。このようにこれらの技術は、モノクローナル抗体単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な手段である。
【００２５】
例えば、ヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列を相同的なマウス配列と置き換えることにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部もしくは一部を共有結合的に連結することにより、ＤＮＡを改変することもできる。
【００２６】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを抗体の定常ドメインの代わりに用いるか、またはそれらを抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、ある抗原に対して特異性を有する一つの抗原結合部位および別の抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【００２７】
本発明は、疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／またはＣＤＨ３発現細胞の増殖の阻害に適した抗体を提供する。本発明はまた、ＣＤＨ３関連疾患の診断に適した抗体を提供する。本発明において、マウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、および＃５の樹立に成功し、これらの抗体、特にクローン＃３は、ＣＤＨ３発現細胞（例えば、癌細胞）の増殖を効果的に抑制することが実証された。さらに、これらのクローンの可変領域内にはグリコシル化部位が存在しない。この特性は、抗体の均一性を支持しうるので、治療薬の開発にとって有利である。
【００２８】
また本発明において、グリコシル化部位を持たない、クローン＃６のバリアントの樹立に成功した。クローン＃６は、さまざまなＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害する能力をもつ抗体として実証されているが、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ２内にグリコシル化部位を有する。本発明のバリアントは、グリコシル化部位のアスパラギン残基がセリン残基、トレオニン残基、アラニン残基、またはグルタミン残基に変更されている。
【００２９】
マウスモノクローナル抗体クローン＃３、クローン＃４、および＃５のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６に示されている。マウスモノクローナル抗体クローン＃３、クローン＃４、および＃５のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４に示されている。さらに、クローン＃６のバリアントのＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、および８０に示されている。クローン＃６のバリアントのＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されている。
【００３０】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲは、当技術分野において周知の方法にしたがって決定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら（Kabat E. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition）またはＣｈｏｔｈｉａら（Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917）によって記載された方法が、ＣＤＲ決定に関して一般的に用いられる。
【００３１】
したがって本発明は、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む抗体またはその断片を提供し、ここで該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつここで該抗体は、ＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる。
【００３２】
好ましい態様において、Ｋａｂａｔの定義によってＣＤＲを決定してもよい（Kabat E. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition）。Ｋａｂａｔの定義によって決定された各クローンのＣＤＲを以下に記載する。クローン＃３のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＦＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＣＤＲ２：ＲＡＮＲＬＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）である。
クローン＃４のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＣＤＲ２：ＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）である。
クローン＃５のＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）、ＣＤＲ２：ＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、およびＣＤＲ３：ＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、ＣＤＲ２：ＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、およびＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）である。
クローン＃６のバリアントのＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｈ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＹＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）、ＣＤＲ２：ＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）、ＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）、ＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、またはＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、およびＣＤＲ３：ＳＧＹＧＮＬＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）であり、Ｌ鎖Ｖ領域においてＣＤＲ１：ＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）、ＣＤＲ２：ＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、およびＣＤＲ３：ＱＨＹＨＩＹＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）である。
【００３３】
したがって本発明はまた、Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含む抗体またはその断片も提供し、ここで該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；および
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択される。
【００３４】
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＨ鎖Ｖ領域（ＶＨ）の１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＬ鎖Ｖ領域（ＶＬ）の１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域」におけるＶＨの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、または８０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨである。上記の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域」におけるＶＬの１つの例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬである。
【００３５】
したがって、一態様において本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６、６８、７２、７６、および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域ならびに／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含む抗体、またはその断片を提供する。
好ましい態様において、本発明の抗体は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；または
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域
を含む。
【００３６】
本発明の抗体は従来の方法によって調製することができる。例えば、従来の遺伝子組み換え技術にしたがって、抗体ポリペプチドをコードするポリペプチドを適切なベクターに組み込み、該ベクターを宿主に導入し、かつ該宿主から抗体を産生させることによって、抗体を調製することができる（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75を参照されたい）。
【００３７】
本発明の抗体のＶ領域をコードするポリヌクレオチドの核酸配列は、本発明の抗体のＶ領域のアミノ酸配列から推定することができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および１１に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃３のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９および２７に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃４のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５および４３に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃５のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、７１、７５または７９、および５９に示される核酸配列はそれぞれ、クローン＃６のバリアントのＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列として用いることができる。本発明の抗体のＶ領域をコードするポリヌクレオチドは、固相技術（Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron (1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J (1984) 3, 801-5）およびオリゴヌクレオチド合成技術（Jones et al. Nature (1986) 321, 522-5）のような従来の方法によって配列情報に基づき合成することができる。
【００３８】
抗体Ｖ領域をコードするポリヌクレオチドを、抗体定常（Ｃ）領域をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターに組み込む。
本発明において用いられる抗体の産生のため、該抗体（抗体遺伝子）をコードするポリペプチドを、発現制御要素（例えば、エンハンサー、プロモーター）の制御下で抗体遺伝子が発現できるように、発現ベクターに組み込む。発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
【００３９】
抗体遺伝子の発現において、抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドとＬ鎖をコードするポリヌクレオチドを別個の発現ベクターに組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に同時形質転換する。あるいは、抗体のＨ鎖をコードするポリヌクレオチドとＬ鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を単一の発現ベクターに一緒に組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する（例えば、国際公開公報第９４／１１５２３号）。
【００４０】
抗体遺伝子は公知の方法によって発現させることができる。哺乳類細胞における発現の場合、従来の有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、およびポリ（Ａ）シグナル（抗体遺伝子の３'末端に対して下流に位置する）を、機能的に連結させることができる。例えば、有用なプロモーター／エンハンサー系として、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー系を用いることができる。
他のプロモーター／エンハンサー系、例えば、ウイルス（例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０））に由来するもの、ならびに哺乳類細胞に由来するもの（例えば、ヒト伸長因子１α（ＨＥＦ１α））を本発明における抗体の発現に用いることもできる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はＭｕｌｌｉｇａｎら（Nature (1979) 277, 108-14.）の方法によって容易に行うことができる。ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はＭｉｚｕｓｈｉｍａら（Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.）の方法によって容易に行うことができる。
【００４１】
大腸菌における発現の場合、従来の有用なプロモーター、関心対象の抗体を分泌させるためのシグナル配列、および抗体遺伝子を、機能的に連結させることができる。プロモーターとして、ｌａｃＺプロモーターまたはａｒａＢプロモーターを用いることができる。ｌａｃＺプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はＷａｒｄら（Nature (1098) 341, 544-6.; FASBE J. (1992) 6, 2422-7.）の方法によって行うことができ、その一方でａｒａＢプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はＢｅｔｔｅｒら（Science (1988) 240, 1041-3.）の方法によって行うことができる。
【００４２】
抗体の分泌のためのシグナル配列に関して、関心対象の抗体が大腸菌の細胞周辺腔に分泌されることが意図される場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S.P. et al, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83.）を用いることができる。細胞周辺腔の中に分泌された抗体を単離し、その後、抗体が適切な立体構造をとるように再び折り畳ませる。
【００４３】
ウイルス（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ））などに由来する複製起点を用いることができる。宿主細胞系における遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターには、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子などの選択マーカー遺伝子をさらに含めてもよい。本発明において用いられる抗体の産生に関しては、真核生物および原核生物の細胞系を含む任意の発現系を用いることができる。真核生物細胞には、動物（例えば、哺乳類、昆虫、カビおよび真菌、酵母）の樹立細胞株が含まれる。原核生物細胞には、大腸菌細胞などの細菌細胞が含まれる。本発明において用いられる抗体は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、およびＨｅＬａ細胞などの哺乳類細胞において発現されることが好ましい。
【００４４】
次に、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して、関心対象の抗体を産生させる。宿主細胞の培養は任意の公知の方法によって行うことができる。本明細書において使用できる培養培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０またはＩＭＤＭ培地であってよい。培養培地は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）などの血清サプリメントを含んでもよい。
【００４５】
組み換え抗体の産生において、上記の宿主細胞のほかに、トランスジェニック動物を宿主として用いることもできる。例えば、抗体遺伝子を、動物の母乳中で元来産生されるタンパク質（例えば、βカゼイン）をコードする遺伝子の所定部位へ挿入して、融合遺伝子を調製する。抗体遺伝子が導入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片を非ヒト動物の胚へ注射し、この胚を次に、雌性動物へ導入する。該胚を体内に有する該雌性動物はトランスジェニック非ヒト動物を産む。関心対象の抗体は該トランスジェニック非ヒト動物またはその子孫から母乳中に分泌される。該抗体を含有する母乳の量を増加させる目的で、適切なホルモンを該トランスジェニック動物に投与することができる（Ebert, K.M. et al, Bio/Technology (1994) 12, 699-702.）。
【００４６】
上記のように発現され産生された抗体を、細胞または宿主動物の体から単離し、精製することができる。本発明において用いられる抗体の単離および精製は、アフィニティーカラムに対して行うことができる。抗体の単離および精製に従来用いられる他の方法を用いることもでき；したがって、方法は特に限定されない。例えば、さまざまなクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析および透析を単独でまたは組み合わせて用いて、関心対象の抗体を単離および精製することができる（Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【００４７】
（ｉｉ）キメラ抗体およびヒト化抗体
本発明において、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む、人工的に改変された組み換え抗体を用いることができる。これらの改変抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。例えば、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL, (1984) 81: 6851-5.; Neuberger et al., Nature (1984), 312: 604-8.; Takeda et al., Nature (1985) 314: 452-4.）を用いることができる。
【００４８】
キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子、例えば、「ヒト化抗体」である。
【００４９】
本発明によるキメラ抗体は、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結させ、連結産物を発現ベクターに組み込み、得られた組み換え発現ベクターを宿主に導入してキメラ抗体を産生することにより、調製することができる。
ヒト化抗体は「再構成ヒト抗体」とも称され、非ヒト哺乳類（例えば、マウス）の抗体のＣＤＲがヒト抗体のＣＤＲに移植されている。そのようなヒト化抗体を産生するための一般的な遺伝子組み換え手法も公知である（例えば欧州特許第１２５０２３号；国際公開公報第９６／０２５７６号）。
【００５０】
具体的には、マウス抗体ＣＤＲがフレームワーク領域（ＦＲ）を介して連結されている核酸配列を設計し、該ＣＤＲの末端領域および該ＦＲと重複する領域を有するように設計されたプライマーとしていくつかのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結し、連結産物を発現ベクターに組み込む。得られた組み換え発現ベクターを宿主に導入し、それによってヒト化抗体を産生する（例えば、国際公開公報第９６／０２５７６号）。
【００５１】
ＣＤＲを介して連結されるＦＲは、該ＣＤＲが機能的な抗原結合部位を形成できるように選択される。必要なら、抗体Ｖ領域のＦＲ中のアミノ酸は、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成できるように交換されてもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-6.）。
【００５２】
キメラ抗体は、非ヒト哺乳類抗体に由来するＶ領域およびヒト抗体に由来するＣ領域から構成される。ヒト化抗体は、非ヒト哺乳類抗体に由来するＣＤＲならびにヒト抗体に由来するＦＲおよびＣ領域から構成される。ヒト化抗体は、人体に対する抗体の抗原性が低減されるので、臨床用途に有用でありうる。
本発明において用いられるキメラ抗体またはヒト化抗体の具体例は、Ｖ領域がマウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、もしくはクローン＃６のバリアントに由来する抗体、または、ＣＤＲがマウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、もしくはクローン＃６のバリアントに由来する抗体である。そのようなキメラ抗体およびヒト化抗体を産生するための方法は、以下に記述される。
【００５３】
例えば、初めに、クローン＃３、＃４、＃５の抗体、またはクローン＃６のバリアントのＶ領域またはＣＤＲをコードする遺伝子を、抗体産生細胞のＲＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによって調製する（例えば、Larrick et al., 「Methods: a Companion to Methods in Enzymology」, Vol. 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」 in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application; Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995、およびWard et al., 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」 in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications; ならびにBirch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995を参照されたい）。抗体のＶ領域またはＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド合成技術（例えば、Jones et al. Nature (1986) 321, 522-5）によって合成してもよい。次に、増幅されたまたは合成された産物を従来の手順にしたがってアガロースゲル電気泳動に供し、関心対象のＤＮＡ断片を切り出し、回収し、精製して、ベクターＤＮＡに連結する。
【００５４】
得られたＤＮＡおよびベクターＤＮＡを、公知の連結キットを用いて連結し、組み換えベクターを構築することができる。ベクターＤＮＡは公知の方法で調製することができる：J. Sambrook, et al., 「Molecular Cloning」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。ベクターＤＮＡを制限酵素で消化し、所望のＤＮＡのヌクレオチド配列を公知の方法によって、または自動化シーケンサーを用いて、決定することができる。
【００５５】
マウスモノクローナル抗体のＬおよびＨ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片がクローニングされたら（以後、抗体のＬまたはＨ鎖はマウス抗体の場合「マウスＬまたはＨ鎖」およびヒト抗体の場合「ヒトＬまたはＨ鎖」とも称される）、マウスＶ領域をコードするＤＮＡおよびヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡを連結し、発現させて、キメラ抗体を得る。
【００５６】
キメラ抗体を調製するための標準的な方法は、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスシグナル配列およびＶ領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター内に既に存在するヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結することを含む。あるいは、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスシグナル配列およびＶ領域配列を、ヒト抗体Ｃ領域をコードする配列に連結した後に、哺乳類細胞発現ベクターへの連結を行う。
【００５７】
ヒト抗体Ｃ領域を含むポリペプチドは、例えば、ヒトＨ鎖のＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３もしくはＣγ４またはＬ鎖のＣλもしくはＣκを含む、ヒト抗体のＨまたはＬ鎖Ｃ領域のいずれであってもよい。キメラ抗体を調製するために、２つの発現ベクターを最初に構築する；すなわち、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素の制御下にマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびにエンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素の制御下にマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。次いで、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）のような宿主細胞をこれらの発現ベクターで同時形質転換し、形質転換された細胞をインビトロまたはインビボで培養して、キメラ抗体を産生する（例えば、国際公開公報第９１／１６９２８号を参照されたい）。
【００５８】
あるいは、クローニングされたｃＤＮＡ中に存在するマウスシグナル配列ならびにマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスシグナル配列ならびにマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを、単一の発現ベクターに導入し（例えば、国際公開公報第９４／１１５２３号を参照されたい）、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し；次いで、形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、所望のキメラ抗体を産生する。キメラ抗体のＨ鎖の発現用のベクターは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡ」とも称される）を、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域をコードする核酸配列を含むゲノムＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡ」とも称される）または該領域をコードするｃＤＮＡ（以後「Ｈ鎖Ｃ領域のｃＤＮＡ」とも称される）を含んだ適切な発現ベクターに導入することによって、得ることができる。Ｈ鎖Ｃ領域は、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４領域を含む。
【００５９】
Ｈ鎖Ｃ領域をコードする、特にＣγ１領域をコードするゲノムＤＮＡを有する発現ベクターは、例えば、ＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（国際公開公報第９２／１９７５９号）およびＤＨＥＲ−ＩＮＣＲＥＭＥＮＴ Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭｌ−ｆ（国際公開公報第９２／１９７５９号）を含む。あるいは、既述（Liu, A. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994）のようにヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来のｃＤＮＡを用いてヒトＣ領域ライブラリを調製することができる。マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをこれらの発現ベクターに挿入する場合、ＰＣＲ法によってｃＤＮＡに適切な核酸配列を導入することができる。例えば、ｃＤＮＡがその５'末端に適切な制限酵素の認識配列を有しかつその開始コドンの直前に、転写効率を改善するためのＫｏｚａｋコンセンサス配列を有するように設計された、ＰＣＲプライマー、および、該ｃＤＮＡがその３'末端に適切な制限酵素の認識配列を有しかつ、ゲノムＤＮＡの一次転写産物を適切にスプライシングしてｍＲＮＡを与えるためのスプライスドナー部位を有するように設計されたＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを実施して、これらの適切な核酸配列を発現ベクターに導入することができる。
【００６０】
マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする構築されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素で処理することができ、次いでこれを発現ベクターに挿入して、Ｈ鎖Ｃ領域（Ｃγ１領域）をコードするゲノムＤＮＡを含んだキメラＨ鎖発現ベクターを構築する。あるいは、マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする構築されたｃＤＮＡを、適切な制限酵素で処理し、Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡに連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような発現ベクターに挿入して、キメラＨ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築してもよい。
【００６１】
キメラ抗体のＬ鎖の発現用ベクターは、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡと、ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとを連結し、適切な発現ベクターに導入することにより、得ることができる。Ｌ鎖Ｃ領域は、例えば、κ鎖およびλ鎖を含む。マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターが構築される場合、認識配列またはＫｏｚａｋコンセンサス配列などの適切な核酸配列をＰＣＲ法によって該発現ベクターに導入することができる。
【００６２】
ヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするｃＤＮＡの全核酸配列をＤＮＡ合成装置によって合成し、ＰＣＲ法によって構築してもよい。ヒトＬλ鎖Ｃ領域は少なくとも４つの異なるアイソタイプを有することが公知であり、各アイソタイプを用いて発現ベクターを構築することができる。ヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードする構築されたｃＤＮＡと、マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする上記の構築されたｃＤＮＡとを、適切な制限酵素部位の間で連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの発現ベクターに挿入して、キメラ抗体のＬλ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築することができる。マウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡに連結されるヒトＬκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡを含んだＨＥＦ−ＰＭｌ ｋ−ｇｋから構築することができる（国際公開公報第９２／１９７５９号を参照されたい）。あるいは、既述（Liu, A. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.84, 3439-43, 1987; Reff, M.E. et al., Blood, Vol.83, No.2, 435-45, 1994）のように、ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）由来のｃＤＮＡを用いてヒトＣ領域ライブラリを調製することもできる。
【００６３】
適切な制限酵素の認識配列を、ＰＣＲ法によって、Ｌκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡの５'末端および３'末端に導入することができ、上記で構築されたマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡとＬκ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを互いに連結し、ｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような発現ベクターに挿入して、キメラ抗体のＬκ鎖をコードするｃＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築することができる。
【００６４】
非ヒト抗体のヒト化は、対応するヒト抗体の配列の代わりにＣＤＲ配列を用いることにより、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に本質的にしたがって、行うことができる。
【００６５】
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒト抗体に移植されているヒト化抗体を作出するためには、該マウスモノクローナル抗体のＦＲと該ヒト抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。したがって、Protein Data Bankを使って、マウスモノクローナル抗体クローン＃３、＃４、＃５、またはクローン＃６のバリアントのＨおよびＬ鎖のＶ領域と、構造が解明されている全ての既知抗体のＶ領域との間で比較を行う。さらにそれらを、抗体ＦＲの長さ、およびアミノ酸の相同性などに基づいてＫａｂａｔらが分類したヒト抗体サブグループ（ＨＳＧ：ヒトサブグループ）と同時に比較する（Kabat, E'.A. et al, US Dep, Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991）。
【００６６】
ヒト化抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを設計するための第一段階は、設計の基礎としてヒト抗体Ｖ領域を選択することである。例えば、マウス抗体Ｖ領域のＦＲと８０％超の相同性を有するヒト抗体Ｖ領域のＦＲをヒト化抗体の産生において用いることができる。
【００６７】
ヒト化抗体において、抗体のＶ領域のフレームワーク（ＦＲ）領域およびＣ領域はヒトに由来し、Ｖ領域のＣＤＲはマウスに由来する。ヒト化抗体のＶ領域を含むポリペプチドは、ヒト抗体のＤＮＡ断片が鋳型として利用可能である限り、ＰＣＲ法によってＣＤＲ移植と呼ばれる方式で産生することができる。「ＣＤＲ移植」とは、マウス由来のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片を作出し、鋳型としてのヒト抗体のＣＤＲと置き換える方法を指す。鋳型として用いられるべきヒト抗体のＤＮＡ断片が利用不可能な場合、データベースに登録された核酸配列をＤＮＡ合成装置で合成してもよく、ヒト化抗体のＶ領域のＤＮＡをＰＣＲ法によって産生することができる。さらに、アミノ酸配列しかデータベースに登録されていない場合、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らによりUS Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991の中で報じられたような抗体におけるコドン用法に関する知識に基づき、全核酸配列をアミノ酸配列から推定してもよい。この核酸配列をＤＮＡ合成装置で合成し、ヒト化抗体Ｖ領域のＤＮＡをＰＣＲ法によって調製して適切な宿主に導入した後に、発現させ、所望のポリペプチドを産生させることができる。鋳型としてヒト抗体のＤＮＡ断片が利用可能である場合、ＰＣＲ法によるＣＤＲ移植の一般的な手順を以下に記述する。
【００６８】
最初に、各ＣＤＲに対応するマウス由来ＤＮＡ断片を合成する。ＣＤＲ１〜３を、先にクローニングされたマウスＨおよびＬ鎖のＶ領域の核酸配列に基づいて合成する。例えば、ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃３に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＶＨ ＣＤＲ１）、８（ＶＨ ＣＤＲ２）および１０（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ＶＬ ＣＤＲ１）、１６（ＶＬ ＣＤＲ２）および１８（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃４に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（ＶＨ ＣＤＲ１）、２４（ＶＨ ＣＤＲ２）および２６（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ＶＬ ＣＤＲ１）、３２（ＶＬ ＣＤＲ２）および３４（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がマウスモノクローナル抗体クローン＃５に基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８（ＶＨ ＣＤＲ１）、４０（ＶＨ ＣＤＲ２）および４２（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６（ＶＬ ＣＤＲ１）、４８（ＶＬ ＣＤＲ２）および５０（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。ヒト化抗体がクローン＃６のマウスモノクローナル抗体バリアントに基づいて産生される場合、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４（ＶＨ ＣＤＲ１）、７０、７４、７８または８２（ＶＨ ＣＤＲ２）および６６（ＶＨ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができ；かつＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ＶＬ ＣＤＲ１）、６４（ＶＬ ＣＤＲ２）および６６（ＶＬ ＣＤＲ３）に示されるアミノ酸配列であることができる。
【００６９】
ヒト化抗体のＨ鎖Ｖ領域のＤＮＡを任意のヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域、例えば、ヒトＨ鎖Ｃγ１領域のＤＮＡに連結させることができる。上記のように、Ｈ鎖Ｖ領域のＤＮＡを適切な制限酵素で処理し、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素下のヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結して、ヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域のＤＮＡを含んだ発現ベクターを作出することができる。
【００７０】
ヒト化抗体のＬ鎖Ｖ領域のＤＮＡを任意のヒト抗体Ｌ鎖Ｃ領域、例えばヒトＬ鎖Ｃλ領域のＤＮＡに、連結させてもよい。Ｌ鎖Ｖ領域のＤＮＡを適切な制限酵素で処理し、エンハンサー／プロモーター系のような発現制御要素下のヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡに連結して、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬλ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを作出することができる。
ヒト化抗体のＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されているものなどの単一の発現ベクターに導入することもでき、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することができ、該形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、所望のヒト化抗体を産生することができる。
【００７１】
キメラ抗体またはヒト化抗体を産生するため、上記のような２つの発現ベクターを調製する必要がある。したがって、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーターのような発現制御要素の制御下にマウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびに、発現制御要素の制御下にマウスＬ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。ヒト化抗体については、発現制御要素の制御下にヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクター、ならびに発現制御要素の制御下にヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを構築する。
【００７２】
次いで、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）のような宿主細胞をこれらの発現ベクターで同時形質転換することができ、得られた形質転換細胞をインビトロまたはインビボで培養してキメラ抗体またはヒト化抗体を産生することができる（例えば、国際公開公報第９１／１６９２８号を参照されたい）。あるいは、Ｈ鎖ＶおよびＣ領域をコードするＤＮＡならびにＬ鎖ＶおよびＣ領域をコードするＤＮＡを単一のベクターに連結し、適切な宿主細胞内に形質転換して抗体を産生してもよい。したがって、キメラ抗体の発現において、クローニングされたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列、マウスＨ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、マウスリーダー配列、マウスＬ鎖Ｖ領域、およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、例えば国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されるものなどの単一の発現ベクターに導入することができる。ヒト化抗体の発現において、ヒト化Ｈ鎖Ｖ領域およびヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡと、ヒト化Ｌ鎖Ｖ領域およびヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡとを、例えば国際公開公報第９４／１１５２３号に開示されるものなどの単一の発現ベクターに導入することができる。そのようなベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、形質転換された宿主をインビボまたはインビトロで培養して、関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生する。
【００７３】
任意の発現系を用いて、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体を産生することができる。例えば真核生物細胞は、樹立された哺乳類細胞株、真菌細胞および酵母細胞などの動物細胞を含み；原核生物細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞を含む。好ましくは、本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体はＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞中で発現される。
哺乳類細胞における発現にとって有用な任意の従来のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーターを用いることが好ましい。さらに、哺乳類細胞における遺伝子発現用のプロモーターはウイルスプロモーター、例えばレトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス（ＳＶ）４０のプロモーター、ならびに哺乳類細胞由来のプロモーター、例えばヒトポリペプチド鎖伸長因子１α（ＨＥＦ−Ｉα）のプロモーターを含むことができる。例えば、ＳＶ４０プロモーターはＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Nature, 277, 108-14,1979）にしたがって容易に用いることができ；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓらの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990）はＨＥＦ−Ｉαプロモーターと共に容易に用いることができる。
【００７４】
複製起点は、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）に由来する複製起点を含む。さらに発現ベクターは、宿主細胞系における遺伝子コピー数を増加させるために、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３'）ＩＩもしくはＩ（ｎｅｏ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）またはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子を選択マーカーとして含むことができる。
キメラ抗体またはヒト化抗体をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによってこのように産生された関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体を、細胞から単離し、次いで精製することができる。
【００７５】
関心対象のキメラ抗体またはヒト化抗体の単離および精製は、プロテインＡアガロースカラムを用いることによって実行できるが、タンパク質の単離および精製において用いられる任意の方法によっても行うことができ、したがって限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィー、限外ろ過、塩析および透析を任意で選択しまたは組み合わせて、キメラ抗体またはヒト化抗体を単離および精製してもよい。
キメラ抗体またはヒト化抗体を単離した後に、得られた精製抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【００７６】
キメラ抗体またはヒト化抗体の正常細胞に対する結合活性を含む抗原結合活性またはその他の活性の測定は、任意の公知の方法によって行うことができる（Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。抗体の抗原結合活性の測定のための方法として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩＡ（放射免疫アッセイ）または蛍光アッセイのような技術を利用することができる。ＥＬＩＳＡでは、抗体がプレートに固定化されており、抗体に対する抗原をプレートに添加し、その後、所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を添加する。次に、一次抗体を認識しかつアルカリホスファターゼなどの酵素でタグ付けされている二次抗体をプレートに添加し、これをプレインキュベートする。洗浄後、ｐ−ニトロフェニルホスフェートのような酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、関心対象の試料の抗原結合活性を評価する。抗原結合活性の評価はＢＩＡコア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行うこともできる。
【００７７】
抗原結合活性を保持するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能において残基が果たす可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望の抗体の特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および移入配列から選択して組み合わせることができる。
【００７８】
（ｉｉｉ）抗体断片
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、無傷の抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ'）２断片を形成させてもよい（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ'）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開公報第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。また抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
【００７９】
（ｉｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体とは、少なくとも二つの異なる抗原決定基に対する結合特異性を有する抗体である。例示として、細胞防御機構が癌細胞に集中するように、抗癌細胞マーカー結合アームと、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２またはＣＤ３）のような白血球上の誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ）分子またはＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃｙＲＩＨ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）に結合するアームとを組み合わせることができる。また二重特異性抗体を用いて、細胞毒性物質を癌細胞に局在化させることもできる。これらの抗体は、癌細胞マーカー結合アームおよび細胞毒性物質（例えばサポリン、抗インターフェロン−ａ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）に結合するアームを包含する。二重特異性抗体は、全長の抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【００８０】
二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野において公知である。全長の二重特異性抗体の従来的な産生は、二本の鎖が別々の特異性を有する、二対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の同時発現に基づいている（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為の組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうちの１種だけが的確な二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー段階によって通常行われる、的確な分子の精製は、かなり煩雑であり、産物の収量は低い。類似の手順が国際公開公報第９３／０８８２９号に、およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【００８１】
別のアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原の組み合わせ部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合させることが好ましい。融合体の少なくとも一つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これにより、構築に用いる、比率が同等でないポリペプチド鎖三本によって最適な収量が得られる態様において、三つのポリペプチド断片の相互の比率を調整する際の高い柔軟性が得られる。しかしながら、等しい比率のポリペプチド鎖少なくとも二本の発現が高収量で起こる場合または比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターの中に二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【００８２】
このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、およびもう一方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖が存在しないことにより簡便な分離方法が得られるため、この非対称構造によって、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離が容易になることが分かった。このアプローチは国際公開公報第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【００８３】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子対の間の境界面を遺伝子操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい境界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の境界面由来の一つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）と置き換えることにより、大きな側鎖とサイズが同一であるか類似している補完的な「空洞」を、第二の抗体分子の境界面に作製する。これによって、ホモ二量体などのその他の望ましくない最終産物よりもヘテロ二量体の収量を増大させるための機構が得られる。
【００８４】
二重特異性抗体は架橋抗体または「ヘテロ結合」抗体を含む。例えば、ヘテロ結合体中の抗体の一方をアビジンとカップリングさせ、もう一方をビオチンとカップリングさせることができる。そのような抗体は例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化することが提唱されており（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染症の治療について提唱されている（国際公開公報第９１／００３６０号、国際公開公報第９２／２００３７３号、およびＥＰ ０３０８９）。ヘテロ結合抗体は、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技術とともに開示されている。
【００８５】
抗体断片から二重特異性抗体を作製するための技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)では、無傷の抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ'）２断片を作製する手順について記載している。これらの断片を、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を妨害する。次に、作製されたＦａｂ'断片を、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ'−ＴＮＢ誘導体の一つを、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ'−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成させる。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として用いることができる。
【００８６】
最近の進歩によって大腸菌からＦａｂ'−ＳＨ断片を直接回収することが容易になっており、それを化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 2 17-225 (1992)では、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ'）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ'断片を大腸菌から別々に分泌させ、インビトロにおいて指向性の化学的カップリングに供して、二重特異性抗体を形成させる。
【００８７】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体断片を作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体が産生されている（Kostelny et al., J Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992)）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次に再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を抗体ホモ二量体の産生に利用することもできる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記載されている「ダイアボディ」技術によって、二重特異性抗体断片を作製するための代替的な機構が提供されている。この断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、ある断片のＶＨおよびＶＬドメインを別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対形成させ、それにより二つの抗原結合部位を形成させる。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J Immunol., 152: 5368 (1994)を参照されたい。
結合価が２を上回る抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J； Immunol. 147: 60 (1991)。
【００８８】
（ｖ）抗体結合体およびその他の修飾
本発明の抗体を、任意で、細胞毒性物質または治療剤と結合させる。
例えば、治療剤には、癌の治療に有用である任意の化学療法剤が含まれる。化学療法剤の例には、以下が含まれる：チオテパおよびシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノべムビチン、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６ージアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ＆ｃｏｍｍａｔ；；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬＯ， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＷ， Ｒｈ６ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに、上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体。治療剤にはまた、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む）；および抗アンドロゲン剤（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【００８９】
カリチアマイシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン、およびＣＣ １０６５などの低分子毒素の１つまたは複数と抗体との結合体もまた、本明細書において意図される。本発明の好ましい一態様において、１個または複数のメイタンシン分子に抗体を結合させる（例えば、抗体分子あたり約１〜約１０個のメイタンシン分子）。メイタンシンを例えばＭａｙ ＳＳ−Ｍｅに変換してもよく、メイタンシノイド−抗体結合体を作製するためにこれを還元してＭａｙ−ＳＨ３とし、修飾抗体と反応させることができる（Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）。
あるいは、抗体を一つまたは複数のカリケアマイシン分子と結合させることもできる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡを切断することができる。使用できるカリケアマイシンの構造的類似体にはγ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびＯＩ１が含まれるが、これらに限定されることはない（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)およびLode et al, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)）。
【００９０】
使用できる酵素活性をもつ毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害因子、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセンが含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日付で公開された国際公開公報第９３／２１２３２号を参照されたい。
【００９１】
本発明はさらに、種々の放射性同位体に結合した抗体を意図する。例としては１１１Ｉｎ、２ｌｌＡｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２ｌ２Ｂｉ、３２Ｐ、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。本発明において、本発明の抗体は使用の直前に放射性核種で標識されてもよく、放射標識抗体として提供されてもよい。周知の技術によって腫瘍特異的な抗体にカップリングされて、腫瘍細胞および組織を特異的に損傷させる部位に送達されうる多数の放射性核種および化学的細胞毒性物質が存在することを当業者は理解するであろう（例えば、１９８５年９月１７日付で刊行されたＷ．Ａ．Ｂｌａｔｔｌｅｒらの米国特許第４，５４２，２２５号；およびPastan et al., 1986, Cell, 47:641-648を参照されたい）。例えば、使用に適したイメージング試薬および細胞毒性試薬には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ（例えば、Sumerdon et al., 1990, Nucl. Med. Biol., 17:247-254）および９９ｍＴｃ；フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識；ルシフェリンのような化学発光標識、ならびに磁気共鳴イメージングで用いるための常磁性イオン（Lauffer et al., 1991, Magnetic Resonance in Medicine, 22:339-342）が含まれる。当技術分野で公知かつ実践されるプロトコルおよび技術を用いて、そのような試薬により抗体を標識することができる。例えば、抗体の放射標識に関する技術については、Wenzel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York, 1983;Colcer et al., 1986, Meth. Enzymol., 121:802-816;およびMonoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Eds. Baldwin et al., Academic Press, 1985, pp. 303-316を参照されたい。正常組織に対する毒性は限定しながら、腫瘍もしくは癌細胞および／または組織に送達される線量を最大化することに関しては、イットリウム−９０（９０Ｙ）標識モノクローナル抗体が記載されている（例えば、Goodwin and Meares, 1997, Cancer Supplement, 80:2675-2680）。ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）およびレニウム−１８６を含むがこれらに限定されない他の細胞毒性放射性核種を、本発明のモノクローナル抗体の標識のために用いることもできる。放射性核種のなかでもイットリウム−９０（９０Ｙ）は放射免疫療法に適している可能性がある。なぜなら、イットリウム−９０（９０Ｙ）は、より高いβエネルギー（２．３ＭｅＶ ｖｓ ０．６１ＭｅＶ）を腫瘍に送達しかつ５〜１０ｍｍの路長（ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）を有し、その結果として、標的細胞と隣接細胞の両方を死滅できる能力が向上するので、イットリウム−９０はヨウ素−１３１（１３１Ｉ）よりも有利であり、特に巨大腫瘍または血管新生の乏しい腫瘍において有利であるためである。
使用される検出可能な／検出用の標識は、使用するイメージング様式にしたがって選択される。例えば、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素１３１（１３１Ｉ）のような放射標識を、平面スキャンのためにまたは単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のために用いることができる。また、フッ素−１９のような陽電子放出性の標識を陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）において用いることもできる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）のような常磁性イオンを磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）において用いることができる。例えばＸ線、ＣＡＴスキャンまたはＭＲＩによる、注射後の癌細胞の可視化のために、放射線不透過性標識でモノクローナル抗体を標識することもできる。特に、ＣＤＨ３関連疾患（例えば癌）については、癌内部の標識の局在性によって疾患の拡大を判定することができる。例えば、ＣＤＨ３を発現している癌内部に存在しかつ検出可能な標識の量によって、診断される対象における癌または腫瘍の有無の判定が可能になる。
【００９２】
抗体と細胞毒性物質との結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリイルジトリオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジピミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素はVitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるための例示的なキレート剤である（国際公開公報第９４／１１０２６号を参照されたい）。リンカーは、細胞中での細胞毒薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性のリンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Charm et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)）を用いることができる。
【００９３】
あるいは、抗体および細胞毒性物質を含む融合タンパク質を、例えば組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。
さらに別の態様において、腫瘍の前標的化における利用のため、抗体を（ストレプトアビジンのような）「受容体」と結合させることができ、ここで、抗体−受容体の結合体を患者に投与し、次に除去剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて循環系から未結合の結合体を取り除き、その後、細胞毒性物質（例えば放射性ヌクレオチド）と結合させた「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【００９４】
本発明の抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開公報第８１／０１１４５号を参照されたい）を活性な抗癌薬へと変換するプロドラッグ活性化酵素と結合させてもよい（例えば、国際公開公報第８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい）。
そのような結合体の酵素成分には、プロドラッグをより活性なその細胞毒性形態へと変換させる様式でプロドラッグに対して作用できる、任意の酵素が含まれる。
【００９５】
本発明の方法において有用である酵素には、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモライシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用な、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、１３−ガラクトシダーゼおよびノイラミニラーゼなどの糖質分解酵素；１３−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な１３−ラクタマーゼ；ならびに、アミン窒素の位置でそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されることはない。あるいは、当技術分野において「アブザイム」としても公知である酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することもできる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照されたい）。腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のため、本明細書に記載されているように抗体−アブザイム結合体を調製することができる。
【００９６】
本発明の酵素を、上記のヘテロ二官能性架橋試薬の使用などの当技術分野において周知の技術によって、抗体に共有結合させることができる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結されている、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって構築することもできる（例えば、Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)を参照されたい）。
【００９７】
抗体の他の修飾が本明細書において意図される。例えば抗体を、さまざまな非タンパク性重合体、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体のうち一つと連結することができる。
【００９８】
本明細書において開示する抗体はリポソームとして製剤化することもできる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日付で公開された国際公開公報第９７／３８７３１号に記載されているような当技術分野において公知の方法によって、調製される。循環時間を増大させたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００９９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームを規定の孔径をもつフィルタから押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'断片を、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982）に記載のリポソームと結合させることができる。任意で、化学療法剤をリポソームに含めてもよい（Gabizon et al. ANational Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照されたい）。
【０１００】
本明細書において記載する抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい可能性がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／または残基への挿入および／または残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴を保有しているという条件で、最終構築物を得るために欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数または位置の変更のような抗体の翻訳後過程を変化させることもできる。
【０１０１】
抗体の突然変異誘発のために好ましい位置である特定の残基または領域を同定するために有用な方法は、Cunningham and Wells Science, 244 : 1081-1085 (1989)によって記載されているように「アラニン走査突然変異誘発法」と呼ばれる。ここでは、標的残基または残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与えるために、中性のまたは負の電荷をもつアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換する。次に、さらなるまたは他のバリアントを置換部位においてまたはその代わりに導入することにより、置換に対し機能的な感度を示すこれらのアミノ酸位置を正確化する。このように、アミノ酸配列の変化を導入するための部位は予め判定するが、突然変異それ自体の性質を予め判定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を解析するため、ａｌａ走査法または無作為変異導入法を標的のコドンまたは領域で行い、発現された抗体バリアントを所望の活性に関してスクリーニングする。
【０１０２】
アミノ酸配列の挿入には、１残基長から、１００またはそれ以上の残基長を含有するポリペプチドまで及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞毒性ポリペプチドと融合した抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントは、酵素、または抗体の血清中半減期を増大させるポリペプチドの、抗体Ｎ末端またはＣ末端との融合を含む。
【０１０３】
別のタイプのバリアントはアミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントでは、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。抗体の置換型変異誘発のために最大の関心対象となる部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの修飾も意図されている。
【０１０４】
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、
（ａ）例えば、シートもしくはへリックス立体構造のような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、
（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または
（ｃ）側鎖のかさ高さ
を維持することに対するその影響が有意に異なる置換を選択することによって、達成される。
【０１０５】
天然に存在する残基は、以下の共通した側鎖の特性に基づく群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５）鎖方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうち一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０１０６】
抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基を、一般的にはセリンと置換し、分子の酸化安定性を向上させかつ異常な架橋結合を抑制することもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を向上させることができる（とりわけ抗体がＦｖ断片のような断片である場合）。
【０１０７】
特に好ましいタイプの置換バリアントでは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変領域残基の置換を伴う。通常、さらなる開発のために選択される得られたバリアントでは、それらが作製された親抗体と比較して生物学的特性が改善しているであろう。そのような置換バリアントを作製するための簡便な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡単に言えば、幾つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて、各部位における全ての可能なアミノ置換を得る。このようにして作製された抗体バリアントを、糸状ファージ粒子から各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として一価の形で提示させる。ファージに提示されたバリアントを次に、本明細書において開示するようにその生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾の候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発法を行って、抗原結合に有意に寄与している超可変領域残基を同定することができる。あるいはまたはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して抗体と抗原との間の接触点を同定することも有利でありうる。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書において説明する技術による置換の候補である。そのようなバリアントが作製されると、バリアントのパネルを本明細書において記載するようにスクリーニングに供し、さらなる開発のために、一つまたは複数の関連アッセイ法において優れた特性を有する抗体を選択することができる。
【０１０８】
抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって調製される。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、または、オリゴヌクレオチドを介した（もしくは部位特異的な）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および以前に調製されたバリアントもしくは非バリアント型の抗体のカセット突然変異誘発による調製を含むが、これらに限定されることはない。
【０１０９】
本発明において用いられる抗体を修飾して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を増大させるようにエフェクタ機能を改善することが望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にすることができる。このようにして作製されたホモ二量体抗体では、内部移行能力が向上し、かつ／または補体媒介性細胞殺滅および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が増大しうる。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J linmunol 148 : 2918-2922 (1992)を参照されたい。
【０１１０】
Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて、抗腫瘍活性が増大したホモ二量体抗体を調製することもできる。あるいは、二重Ｆｃ領域を有しかつそれによって補体溶解およびＡＤＣＣ能が増大されうる抗体を設計することもできる（Stevenson et al. Anti-CancerDrugDesign 3: 2 19-230 (1989)を参照されたい）。
【０１１１】
抗体の血清中半減期を増大させるため、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているようにサルベージ受容体結合性の抗原決定基を抗体（とりわけ抗体断片）に組み入れることができる。本明細書で用いる「サルベージ受容体結合性の抗原決定基」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期の増大の原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域の抗原決定基を指す。
【０１１２】
ＣＤＨ３関連疾患の診断
本発明の抗体は、癌などのＣＤＨ３関連疾患を診断するためのマーカーとして用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体を用いて対象由来の試料中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出することにより、ＣＤＨ３関連疾患を診断することができる。したがって、本発明は、対象由来の試料において本発明の抗体を用いてＣＤＨ３ポリペプチドを検出することにより、対象においてＣＤＨ３関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための方法を提供する。本方法は以下の段階を含む：
（ａ）対象由来の試料または検体を本発明の抗体またはその断片と接触させる段階；
（ｂ）試料または検体中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３タンパク質の相対存在量に基づき対象が疾患を患っているかまたは疾患を発現するリスクがあるかどうか判断する段階。
典型的な態様において、ＣＤＨ３関連疾患は癌であり、より具体的には膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌である。
【０１１３】
あるいは、他の態様において、本発明の抗体を、生体内の癌を検出または可視化するために用いてもよい。より具体的には、本発明は、以下の段階を含む、癌を検出またはイメージングする方法を提供する：
（１）対象に本発明の抗体またはその断片を投与する段階；
（２）生体内における該抗体または断片の蓄積または局在を検出する段階、および
（３）該対象内での該抗体または断片の位置を決定する段階。
あるいは、本発明によると、癌細胞または組織を対象において検出することができる。例えば本発明は、以下の段階を含む、ＣＤＨ３が発現している癌を対象において検出するための方法を提供する：本発明の抗体またはその断片を対象に投与して、該抗体または断片を対象の細胞または組織中のＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合させる段階；該細胞または組織に結合した該抗体を可視化する段階；および、該細胞または組織中に対する該抗体の結合度合いを正常な対照細胞または組織と比較する段階であって、該対象の細胞または組織対する該抗体の結合度合いが該正常な対照細胞または組織と比べて上昇したことが、該対象における癌の指標となる、段階。
【０１１４】
好ましくは、生体内へ投与された抗体を追跡するために、検出可能な分子で抗体を標識してもよい。例えば、蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識された抗体の挙動をインビボで追跡することができる。そのような分子で抗体を標識するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１１５】
蛍光物質または発光物質で標識された抗体は、例えば、内視鏡または腹腔鏡を用いて観察することができる。放射性同位体を用いる場合、放射性同位体の放射能を追跡することによって、抗体の局在をイメージングすることができる。本発明において、インビボでの本発明の抗体の局在または蓄積は、癌細胞の存在を示す。
【０１１６】
類似の方法が他の抗体にも利用されており、当業者は、体内で検出可能なように結合した抗体または断片の位置のイメージングに適したさまざまな方法を認識するであろう。非限定的な指針として、約１０〜１０００マイクログラム（ｍｃｇ）、好ましくは約５０〜５００ｍｃｇ、より好ましくは約１００〜３００ｍｃｇ、より好ましくは約２００〜３００ｍｃｇの精製抗体が投与される。例えば、ヒトに適用可能な投与量としては、約１００〜２００ｍｃｇ／ｋｇ体重、または３５０〜７００ｍｇ／ｍ２体表面積が挙げられる。
【０１１７】
ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキット
本発明は、ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキットを提供する。具体的には、本キットは、ＣＤＨ３ポリペプチドの検出試薬として、本発明の抗体またはその断片を含む。一態様において、本発明のキットのための抗体を蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識することができる。抗体を標識するための方法および標識抗体を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。
【０１１８】
さらに本キットは、陽性および陰性の対照試薬、ならびに本発明の抗体を検出するための二次抗体を含むことができる。例えば、健常対象または非癌性組織から得られた組織試料は、有用な陰性対照試薬として役立ちうる。本発明のキットはさらに、緩衝液、希釈液、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明を記した添付文書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含めて、商業的見地または使用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。これらの試薬などを、ラベルした容器中に保持することができる。適切な容器としてはボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。
【０１１９】
他の態様において、本発明はさらに、本発明の抗体を含む、診断される対象内の癌の検出、イメージング、または治療に用いるキットを提供する。あるいは本発明は、癌を含むＣＤＨ３関連疾患について診断される対象に投与するために本発明の抗体を含む診断剤が使用されるような、該診断剤も提供する。好ましい態様において、本発明の抗体は放射性同位体で標識することができる。例えば、本発明のキットは、キレート剤および放射性物質で修飾された本発明の抗体を含むことができる。ＭＸ−ＤＯＰＡは抗体を修飾するのに好ましいキレート剤である。その一方で、バイオイメージングのためのトレーサーとしてインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）を用いることができる。あるいは、ＣＤＨ３関連疾患の放射免疫療法のために、抗体をβ核種、例えばイットリウム−９０（９０Ｙ）で標識することができる。本発明において、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）またはイットリウム−９０（９０Ｙ）をその塩または溶液として提供してもよい。インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）またはイットリウム−９０（９０Ｙ）の適切な塩は塩化物である。
好ましい態様において、ＣＤＨ３関連疾患は膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌である。
【０１２０】
治療的使用
本発明の抗体を用いて、ＣＤＨ３関連疾患を治療および／もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法および薬学的組成物を、以下に記載する。典型的な態様において、ＣＤＨ３関連疾患は癌、例えば膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞であるが、これらに限定されることはない。具体的には、本発明によって対象におけるＣＤＨ３関連疾患を治療および／もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法は、該対象に本発明の抗体またはその断片の有効量を投与する段階を含む。
【０１２１】
本発明の対象は、哺乳動物および鳥類の動物を含む動物であってよい。例えば哺乳動物には、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、およびイヌが含まれうる。
【０１２２】
本明細書記載の抗体またはその断片はＣＤＨ３ポリペプチドに特異的に結合することができ、したがって該抗体またはその断片が対象に投与されると、該対象内のＣＤＨ３ポリペプチドに結合して、癌性細胞などのＣＤＨ３発現細胞の増殖を抑制しうる。あるいは、該抗体またはその断片を治療成分と結合させて対象に投与すると、対象内のＣＤＨ３ポリペプチドを発現している領域（すなわち罹患領域）に送達されて、治療成分が、罹患領域へと選択的に送達され、そこで作用することができる。そのような治療成分は、癌に対する治療効果を持つとして公知のまたは開発予定の任意の治療物質であってよく、かつ、非限定的に放射性同位体標識および化学療法剤を含む。治療物質として使用できる放射性同位体標識は、β線エネルギーおよびその放出効果、γ線放出の有無、そのエネルギーおよび放出効果、物理的半減期、ならびに標識化手順を含む、種々の要素に依って選択することができる。一般的に、イットリウム（９０Ｙなど）ならびにヨウ素（１２５Ｉおよび１３１Ｉなど）に基づく放射性同位体標識を用いることができる。化学療法剤は、癌の治療に関して公知のまたは開発予定の任意の薬剤であってよく、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセルを含むが、これらに限定されることはない。本発明の抗体またはその断片は、ＣＤＨ３ポリペプチドに選択的に結合可能であるが正常細胞には結合せず、したがって該抗体もしくはその断片または放射性同位体または化学療法剤によって引き起こされる副作用を効果的に回避することができ、それゆえ、治療効果が高くなると考えられる。
【０１２３】
本明細書記載の抗体またはその断片を、ＣＤＨ３関連疾患を治療または予防するのに有効な用量で対象に投与することができる。有効な用量とは、治療された対象において健康に良い利益をもたらすのに十分な、抗体またはその断片の量を指す。薬学的組成物が本発明の抗体またはその断片を含む場合に利用できる剤形および投与法を、以下で説明する。
【０１２４】
必要または所望であれば、ＣＤＨ３関連疾患を軽減するために、本明細書記載の特異的モノクローナル抗体または断片の混合物のような、異なるモノクローナル抗体のカクテルを投与できることをさらに理解されたい。実際に、罹患細胞上のいくつかの抗原または異なるエピトープを標的化するためのカクテルにおいてモノクローナル抗体またはその断片の混合物を用いることは、抗原のうち一つの下方制御による腫瘍細胞および／または癌細胞の回避を防ぐには特に有利な手法である。
【０１２５】
本発明による使用のための薬学的組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて従来の様式で製剤化することができる。したがって本発明は、本発明の抗体またはその断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物を提供する。
【０１２６】
抗体またはその断片は、例えばボーラス注射または持続注入を介した注射による非経口投与（すなわち、静脈内投与または筋肉内投与）用に製剤化することができる。注射用の製剤は単位剤形で、例えばアンプルまたは複数回投与容器中に、保存剤を添加して提供することができる。本組成物は、油性または水性の溶剤中で懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含んでもよい。あるいは本抗体は、使用前に適切な溶剤、例えば発熱物質非含有滅菌水を用いて構成するための、凍結乾燥された粉末形態でもよい。
【０１２７】
抗体もしくは断片またはそれに結合した治療成分の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により、決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ／ＥＤ比として表すことができる。
【０１２８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を定める際に用いることができる。抗体の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環血漿濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形、利用される投与経路、ならびに結合する治療成分のタイプおよび量に応じてこの範囲内で変動しうる。本発明の抗体またはその断片に関して、有効用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養物で測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成されるように、動物モデルにおいて用量を定めてもよい。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１２９】
対象の状態および年齢ならびに／または投与経路に応じて、当業者は、本発明の薬学的組成物の適切な用量を選択することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、本発明による抗体が一日に対象の体重１ｋｇあたり約３〜約１５ｍｃｇの量で、好ましくは該対象の体重１ｋｇあたり約１０〜約１５ｍｃｇの量で該対象に投与されるような量で、投与される。投与の間隔および回数は、対象の状態および年齢、投与経路、ならびに薬学的組成物に対する応答を考慮して選択することができる。例えば、薬学的組成物は５〜１０日間にわたり、１日１〜５回、好ましくは１日１回対象に投与することができる。
【０１３０】
別の局面において、放射性同位体で標識された抗体を含む組成物が非経口的に投与される場合、成人１人に対する投与線量は一度に０．１ｍＣｉ／ｋｇ〜１．０ｍＣｉ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍＣｉ／ｋｇ〜０．５ｍＣｉ／ｋｇ、およびより好ましくは０．４ｍＣｉ／ｋｇである。
薬学的組成物は全身的にまたは局所的に投与することができる。有効成分を罹患部位に送達するような標的化送達様式で投与することが好ましい。
【０１３１】
特定の態様において、本発明の方法および組成物は、メトトレキサート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、およびドセタキセルを非制限的に含む化学療法剤の一つまたは組み合わせとともに、癌の治療または予防のために用いられる。
放射線療法に関しては、治療される癌のタイプに応じて任意の放射線療法プロトコルを用いることができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、Ｘ線照射を施すことができる。γ線を放射する放射性同位体、例えばラジウム、コバルト、および他の元素の放射性同位体などを投与し、組織に曝露してもよい。
【０１３２】
別の態様において、化学療法または放射線療法は、本発明の抗体を含む方法および組成物を用いてから好ましくは少なくとも１時間後、５時間後、１２時間後、１日後、１週間後、１ヶ月後、およびより好ましくは数ヶ月（例えば、最大３ヶ月）後に施される。本発明による方法および組成物を用いた治療の前に、治療と同時に、または治療の後に施される化学療法または放射線療法は、当技術分野において公知の任意の方法によって施すことができる。
【０１３３】
別の態様において、本発明はまた、ＣＤＨ３関連疾患を治療または予防するための薬学的組成物の製造における本発明の抗体の使用も提供する。具体的には、本発明はさらに、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための本発明の放射標識抗体の使用を提供する。
【０１３４】
あるいは、本発明はさらに、ＣＤＨ３関連疾患の治療または予防における使用のための本発明の抗体を提供する。具体的には、癌に対する放射免疫療法で使用するための本発明の放射標識抗体も提供される。
あるいは、本発明はさらに、有効成分としての本発明の抗体とともに薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、ＣＤＨ３関連疾患の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。具体的には、本発明はさらに、有効成分としての本発明の放射標識抗体とともに薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。
【０１３５】
別の態様において、本発明はまた、有効成分が本発明の抗体であり、有効成分と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、ＣＤＨ３関連疾患の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。具体的には、本発明はさらに、本発明の放射標識抗体と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、癌の治療用または予防用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供する。
【０１３６】
さらなる態様において、本発明は、診断される対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィーにおいて使用するための本発明の抗体を提供する。あるいは、本発明は、対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィー用の診断薬を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合する段階を含む、対象内の癌のバイオイメージングまたは免疫シンチグラフィー用の診断薬を製造するための方法またはプロセスを提供する。
本明細書において引用される全ての先行技術文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明する。
材料および方法
抗体産生
ＣＤＨ３遺伝子がコードする細胞外ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）を、癌細胞に由来するｃＤＮＡプールから増幅した。産物をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）にクローニングした。ＣＤＨ３特異的抗体を産生するため、１ヶ月間にわたって２週間おきにドメイン発現ベクター（１７．５μｇ／注射）を皮下注射することにより、マウスを免疫した。抗血清の力価を確認した後、脾細胞をマウスから抽出し、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製した。癌細胞の表面上の天然ＣＤＨ３抗原に結合する抗体を産生できるハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングによって、ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６が抗原特異的抗体を高レベルで産生することを確認し、それゆえこれらのハイブリドーマを、さらなる実験用の抗体を産生させるのに選択した。ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６をマウスに腹腔内注射し、腹水を２〜３週間後に採取した。プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＮＪ）を用いて腹水から抗体を精製した。
本明細書において、抗体は、クローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、およびクローン＃６とも称される。
【０１３８】
細胞培養
ヒト非小細胞肺癌細胞株であるＨ１３７３がＣＤＨ３ポリペプチドを発現することが確認されたため、これを、インビボにおける治療研究に用いた。Ｈ１３７３はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓｍ，ＶＡ）から購入し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で維持した。
【０１３９】
放射標識
ハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、クローン＃６によって産生された抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体、および、正常マウスＩｇＧ１（Ｎｏｒｄｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）である対照抗体を、イットリウム−９０（９０Ｙ）で標識した。二官能性金属イオンキレート剤ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）により９０Ｙで抗体を標識した。抗体１ミリグラムをそれぞれ、ジメチルホルムアミド中、モル比１：５で該キレート剤に結合させた。３７℃で２０時間のインキュベーションの後、Ｂｉｏｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ ６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて抗体−キレート剤複合体を精製した。並行して、９０ＹＣｌ３（ＱＳＡ Ｇｌｏｂａｌ，Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、０．２５Ｍ酢酸（ｐＨ５．５）とともに室温で５分間プレインキュベートした。９０Ｙ標識抗体を得るため、抗体−キレート剤複合体をそれぞれ、プレインキュベートした９０ＹＣｌ３溶液とともに３７℃で１時間インキュベートした。製造元の使用説明書にしたがってＢｉｏｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ ６を用いて標識抗体を精製した。標識化プロセスの間、これらの抗体の分解は認められなかった。
【０１４０】
異種移植モデル
動物の世話および治療は群馬大学の動物実験指針および動物実験委員会にしたがって行った。Ｈ１３７３細胞懸濁液１００マイクロリットル（細胞１×１０７個）を３〜５週齢の雌性ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ． Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）の右脇腹へ皮下接種した。これらのマウスを数週間飼養して腫瘍を発生させた。樹立された腫瘍を担腫瘍マウスから分離し、切開して一辺が２ｍｍの立方体の組織断片とした。これらの断片をヌードマウスへ連続的に移植した。移植後、平均腫瘍容積が１００ｍｍ３に達するまでこれらのマウスを飼養した。
【０１４１】
放射線療法
異種移植マウスを１０組の異なる治療群に無作為に割り当てた。９０Ｙ標識抗体（４〜１０ｍＣｉ／ｍｇ）を上記のように調製した。９０Ｙ標識したまたは非標識のクローン＃３、クローン＃４、クローン＃５、またはクローン＃６をマウスに静脈内注射した。対照として９０Ｙ標識正常マウスＩｇＧ１を注射した。注射抗体の放射能を動物１匹あたり１００μＣｉに調整した。治療された異種移植マウスの体重および腫瘍容積を、注射後５週間モニターした。以下の式を用いて腫瘍容積（ｍｍ３）を算出した：（最短径）２×（最長径）×０．５。
【０１４２】
還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
各５μｇの抗ＣＤＨ３抗体を、４％ＳＤＳ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、０．０４％ブロモフェノールブルーおよび１０％メルカプトエタノールを含めたＳＤＳ緩衝液と混合した。加熱後、混合物を４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。その後、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＢ）で染色し、１０％メタノールおよび７％酢酸を用いることによって脱色した。ゲルの画像をスキャナによって捕捉した。
【０１４３】
可変領域のアミノ酸配列の分析
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、総ＲＮＡをハイブリドーマクローン＃３、クローン＃４およびクローン＃５から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＮｏｖａＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＭｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りである：
重鎖５'プライマーのＭｕＩｇＶＨ５'−Ｂ；
５'−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、
軽鎖５'プライマーのＭｕＩｇκＶＬ５'−Ｄ（以下のプライマーの混合物）；
５'−ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）および５'−ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）、
重鎖５'プライマーのＭｕＩｇＧＶＨ３'−２；
５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＲＣＣＡＲＫＧＧＡＴＡＲＡＣＩＧＲＴＧＧ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）、ならびに
軽鎖３'プライマーのＭｕＩｇκＶＬ３'−１；
５'−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）。
ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。挿入断片領域を配列決定し、クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃５の可変領域（シグナル配列を除く）の核酸配列を決定した。
プライマー配列中の異なるヌクレオチドについて、以下の記号を用いる；
Ｃ、Ｇ、またはＴはＢ、Ａ、Ｇ、またはＴはＤ、Ａ、Ｃ、またはＴはＨ、イノシンはＩ、ＧまたはＴはＫ、ＡまたはＣはＭ、ＡまたはＧはＲ、ＣまたはＧはＳ、Ａ、Ｃ、またはＧはＶ、ＡまたはＴはＷ、およびＣまたはＴはＹ。
【０１４４】
結果
ＣＤＨ３標的化放射免疫療法の効力を評価するため、抗ＣＤＨ３抗体をβ線放射型の同位体９０Ｙ（ｔ１／２＝６４．１時間）で放射標識し、静脈内注射によって腫瘍担持ヌードマウスに投与した。イットリウム−９０標識クローン＃３、＃４、および＃６で処理された腫瘍の増殖速度は、抗体と結合したイットリウム−９０からの放射によって劇的に低下した（図１）。とりわけ、９０Ｙ標識クローン＃３およびクローン＃６は観察中、Ｈ１３７３異種移植片マウスにおける腫瘍増殖を強く抑制した。他方で、９０Ｙ標識対照抗体は腫瘍増殖に対する効果を示さなかった。それゆえ、９０Ｙ標識抗体の治療効果は、腫瘍細胞表面に発現されたＣＤＨ３ポリペプチドに対するその親和性に依るものと思われた。いずれの抗体で処置したマウスの体重も有意に減少しなかった（データは示さず）。
【０１４５】
抗ＣＤＨ３抗体クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃６に結合させたイットリウム−９０は、腫瘍に対して注目すべき治療効果を発揮した。それゆえ、ＣＤＨ３は癌治療にとって魅力的な標的であり、抗ＣＤＨ３抗体は癌治療のための新規の手段として利用可能である。
【０１４６】
マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のように決定された：
クローン＃３、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＦＷＩＨＷＶＫＱＲＰＭＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤＲＡＴＬＴＶＤＲＳＳＳＴＡＹＭＨＬＴＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＳＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される核酸配列によってコードされる）； クローン＃３、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃４、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＬＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＩＫＱＲＰＩＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤＲＡＴＦＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される核酸配列によってコードされる）； クローン＃４、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＴＤＲＬＩＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＶＧＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＭＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃５、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＬＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＩＫＱＲＰＩＱＧＬＥＷＩＧＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡＲＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される核酸配列によってコードされる）；および クローン＃５、Ｌ鎖可変領域（シグナル配列を除く）： ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＨＲＴＤＲＬＩＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＶＧＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＲＭＦＧＧＧＴＫＬＤＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１４７】
Ｋａｂａｔの定義によって決定された抗体のＣＤＲ配列は以下の通りである：
クローン＃３、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＦＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＹＦＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＤＳＹＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＡＮＲＬＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃４、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＮＦＮＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される核酸配列によってコードされる）；ならびに クローン＃５、ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ２はＮＩＤＰＳＤＳＥＴＨＹＮＱＫＦＮＤＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＨ ＣＤＲ３はＧＧＴＧＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＤＲＬＩＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＬＱＹＤＥＦＰＲＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を還元条件の下で行った。ゲル上のバンドパターンは、ＩｇＧ重鎖に対応する分子量範囲４０〜５０ｋＤａおよびＩｇＧ軽鎖に対応するより低い分子量範囲２０〜３０ｋＤａによって特徴付けられた。抗ＣＤＨ３抗体クローン＃３、クローン＃４、およびクローン＃５は一般的なＩｇＧとして単一の重鎖バンドおよび単一の軽鎖バンドを示した。他方で、抗ＣＤＨ３抗体クローン＃６は二本の重鎖バンドおよび単一の軽鎖バンドを示した。重鎖の可変領域での不完全なグリコシル化によって、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際にさらなる重鎖バンドが生じた。図２に示されるように、不完全なグリコシル化は抗体の均一性に影響を与え、かつこれは治療薬の開発に困難を生じうる。それゆえ、Ｈ鎖可変領域におけるグリコシル化を回避するために、クローン＃６のグリコシル化部位に単一のアミノ酸置換を有する、クローン＃６のバリアントを設計した。これらのバリアントは、抗体に基づく制癌剤の開発に対して、クローン＃６よりも適切であると考えられる。
【０１４９】
クローン＃６バリアントのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は以下の通りである（下線は置換されたアミノ酸残基を示す）：
クローン＃６ＮＳ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃６ＮＴ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に示される核酸配列によってコードされる）；
クローン＃６ＮＡ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に示される核酸配列によってコードされる）；および
クローン＃６ＮＱ、Ｈ鎖可変領域（シグナル配列を除く）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＳＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＦＹＣＡＲＳＧＹＧＮＬＦＶＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９に示される核酸配列によってコードされる）。
クローン＃６バリアントのＬ鎖可変領域（シグナル配列を除く）のアミノ酸配列は、クローン＃６のものと同じである； ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＳＳＰＧＥＫＶＴＭＳＣＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＦＲＴＳＮＬＡＳＧＶＰＴＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＨＹＨＩＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１５０】
Ｋａｂａｔの定義によって決定されたクローン＃６バリアントのＶＨ ＣＤＲ２配列は以下である；クローン＃６ＮＳではＥＩＤＰＳＤＳＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に示される核酸配列によってコードされる）、クローン＃６ＮＴではＥＩＤＰＳＤＴＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に示される核酸配列によってコードされる）、クローン＃６ＮＡではＥＩＤＰＳＤＡＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に示される核酸配列によってコードされる）、およびクローン＃６ＮＱではＥＩＤＰＳＤＱＹＴＹＹＮＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１に示される核酸配列によってコードされる）。
Ｋａｂａｔの定義によって決定された、該バリアントの他のＣＤＲ配列はクローン＃６のものと同じである；ＶＨ ＣＤＲ１はＳＹＷＩＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＨ ＣＤＲ３はＳＧＹＧＮＬＦＶＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ１はＳＡＴＳＳＶＴＹＭＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示される核酸配列によってコードされる）、ＶＬ ＣＤＲ２はＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示される核酸配列によってコードされる）、およびＶＬ ＣＤＲ３はＱＨＹＨＩＹＰＲＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示される核酸配列によってコードされる）。
【０１５１】
産業上の利用可能性
本発明は、ＣＤＨ３を発現する癌を、放射性同位体標識抗ＣＤＨ３抗体によりインビボで治療できるという発見に、少なくとも部分的に基づく。ＣＤＨ３は、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌または肝臓癌において強く発現される遺伝子として報告された。したがって、がん、例えば、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌または肝臓癌の治療は、放射性同位体標識で標識された抗ＣＤＨ３抗体を用いて好都合に行われる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体がＨ（重）鎖Ｖ（可変）領域およびＬ（軽）鎖Ｖ領域を含み、該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつ該抗体がＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその断片。
【請求項２】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；および
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択される、請求項１記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項１または２記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６、６８、７２、７６、および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域ならびに／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含む、請求項３記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
前記抗体が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；または
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域
を含む、請求項４記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項４または５記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項６記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
前記ヒト化抗体がヒト抗体ＦＲ（フレームワーク）領域および／またはヒト抗体Ｃ領域をさらに含む、請求項７記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
前記抗体が、細胞毒性剤、治療剤、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記放射性同位体標識が９０イットリウム（９０Ｙ）および１１１インジウム（１１１Ｉｎ）から選択される、請求項９記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片の有効量を対象に投与する段階を含む、該対象において、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項１２】
対象におけるＣＤＨ３関連疾患の診断または該疾患を発症する素因の診断のための方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片と対象由来の試料または標本とを接触させる段階；
（ｂ）試料または標本中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３ポリペプチドの相対存在量に基づき、該対象が疾患を患っているかまたはその発症リスクを有するか否かを判断する段階
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片を含む、ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキット。
【請求項１】
抗体がＨ（重）鎖Ｖ（可変）領域およびＬ（軽）鎖Ｖ領域を含み、該Ｈ鎖Ｖ領域および該Ｌ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域；ならびに
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＨ鎖Ｖ領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域に含まれるＣＤＲまたはそれと機能的に等価なＣＤＲを含んだＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択され、かつ該抗体がＣＤＨ３ポリペプチドまたはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその断片。
【請求項２】
Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域；および
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７４、７８または８２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＨ鎖Ｖ領域、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＬ鎖Ｖ領域
からなる群より選択される、請求項１記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項１または２記載の抗体またはその断片。
【請求項４】
前記抗体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、３６、６８、７２、７６、および８０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域ならびに／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２８、４４、および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含む、請求項３記載の抗体またはその断片。
【請求項５】
前記抗体が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域；または
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、７２、７６、もしくは８０に示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域
を含む、請求項４記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項４または５記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項６記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
前記ヒト化抗体がヒト抗体ＦＲ（フレームワーク）領域および／またはヒト抗体Ｃ領域をさらに含む、請求項７記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
前記抗体が、細胞毒性剤、治療剤、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、請求項１〜８のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
前記放射性同位体標識が９０イットリウム（９０Ｙ）および１１１インジウム（１１１Ｉｎ）から選択される、請求項９記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片の有効量を対象に投与する段階を含む、該対象において、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための方法。
【請求項１２】
対象におけるＣＤＨ３関連疾患の診断または該疾患を発症する素因の診断のための方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片と対象由来の試料または標本とを接触させる段階；
（ｂ）試料または標本中のＣＤＨ３ポリペプチドを検出する段階；および
（ｃ）対照と比べたＣＤＨ３ポリペプチドの相対存在量に基づき、該対象が疾患を患っているかまたはその発症リスクを有するか否かを判断する段階
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片の有効量および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ＣＤＨ３関連疾患を治療もしくは予防するためまたはＣＤＨ３発現細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体または断片を含む、ＣＤＨ３関連疾患の診断のためのキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１５６７５（Ｐ２０１３−５１５６７５Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９０４２（Ｐ２０１２−５２９０４２）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００７３３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８０７９６
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／００７３３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８０７９６
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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