抗Ｄモノクローナル抗体
【課題】本願発明は、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を得るためのアッセイを用いて選択される抗体および／または良好な効果を得るために必要なグリカン構造を有する抗体の提供を目的とするものである。
【解決手段】本願発明の抗体組成物は、Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造のフコース含量が、６５％未満であり、前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を超える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物である。
【解決手段】本願発明の抗体組成物は、Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造のフコース含量が、６５％未満であり、前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を超える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＣＣ型のアッセイを用いてモノクローナル抗体を獲得および選択する方法に関するものであり、該抗体は、ＦｃγＩＩＩ型受容体を活性化することができる。本発明はまた、特定のグリカン構造を有するモノクローナル抗体、該抗体を産生する細胞、産生細胞を製造する方法、および該抗体を含んでなる医薬組成物または診断用試験に関するものである。本発明による抗Ｄ抗体は、Ｒｈ陰性個体のＲｈ同種免疫、特に新生児溶血症（ＨＤＮ）の防止に、または特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの用途に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリクローナル抗体を用いた受動免疫療法は１９７０年代以来行われてきた。しかし、ポリクローナル免疫グロブリンの製造にはいくつかの問題がある。フランスでは１９９７年にボランティアの免疫化が、そのような行為がもたらす倫理的問題のためにうち切られた。フランスでは、ヨーロッパと同じく、免疫ドナーの数が少なくて特定の抗体の十分な供給を確保することができず、例えば米国から高度免疫血漿を輸入する必要があると分かるに至ったのである。従って、この免疫グロブリンの不足により、ＨＤＮを防止するための出生前投与という構想は可能なものとならない。
【０００３】
様々な研究の結果、ボランティアドナーからの血漿を分画することにより得られるポリクローナル抗体の代わりとして、ヒトモノクローナル抗体が製造されるようになった。
【０００４】
モノクローナル抗体にはいくつかの利点がある：それらは妥当なコストで大量に得られ、各バッチの抗体は均質であり、それらは液体窒素中で低温保存されている同じ細胞株によって産生されるので種々のバッチの品質にも再現性がある。ウイルスの混入がないという点で製品の安全性を確保することもできる。
【０００５】
いくつかの刊行物には、免疫化されたドナーのＢ細胞からの、ＩｇＧクラスのヒト抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製について記載されている。Boylston et al. 1980; Koskimies 1980; Crawford et al. 1983; Doyle et al. 1985; Goossens et al. 1987; Kumpel et al. 1989(a)およびMcCann-Carter et al. 1993には、ＥＢＶウイルスで形質転換したＢリンパ球株の作製について記載されている。Melamed et al. 1985; Thompson et al. 1986 and McCann-Carter et al. 1993は、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ネズミ骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリドーマに関するものである。Goossens et al., 1987は、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ヒト骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリッドに関するものである。Bron et al., 1984およびFoung et al., 1987には、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ヒト−マウスヘテロ骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリッドが記載されており、最後に、Edelman et al., 1997は、バキュロウイルス系を用いて抗Ｒｈ（Ｄ）をコードする遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞に関するものである。
【０００６】
このようなモノクローナル抗体およびそれらを分泌する株に関する特許および特許出願としては、ＥＰ５７６０９３号（AETS (FR), Biotest Pharma GmbH (Germany)；新生児溶血症の予防用組成物は、ＲｈＤ抗原に対して活性な、サブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ３の２種のヒトモノクローナル抗体を含んでなる）、ＲＵ２０９４４６２号、ＷＯ８５／０２４１３号（Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University，Ｒｈ（Ｄ）抗原に対するヒトモノクローナル抗体およびその使用）、ＧＢ８６−１０１０６号（Central Blood Laboratories Authority，ＲｈＤ抗原に対する比とモノクローナル抗体の製造のためのヘテロハイブリドーマの作出）、ＥＰ０２５１４４０号（Central Blood Laboratories Authority，ヒト抗ＲｈＤを産生するヘテロハイブリドーマ）、ＷＯ８９／０２４４２号、ＷＯ８９／０２６００号およびＷＯ８９／０２４４４３号（Central Blood Laboratories Authority，ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体）、ＷＯ８６／０７７４０号（Institut Pasteur, Protein Performance SA, Paris, FR，ヒト抗ＲｈＤモノクローナル抗体からの組換えモノクローナル抗体の作製、昆虫細胞におけるその製造およびその使用）、ＪＰ８８−５０７１０号（International Reagents Corp., Japan，血液型物質Ｒｈ（Ｄ）因子の決定のための試薬）、ＪＰ８３−２４８８６５号（Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan，Ｒｈ（Ｄ）陽性抗原に対するモノクローナル抗体の製造）、ＣＡ８２−４０６０３３号（Queens University at Kingston，ヒトモノクローナル抗体）、およびＧＢ８２２６５１３号（University College London，ＲｈＤ抗原に対するヒトモノクローナル抗体）が挙げられる。
【０００７】
モノクローナル抗体の使用には、ポリクローナル抗体の集合物の使用に比べて多くの利点があるが、他方で、有効なモノクローナル抗体を得るのは困難であると考えられる。実際に、本発明に関して、得られた免疫グロブリンのＦｃγ断片は、エフェクター細胞（マクロファージ、ＴＨリンパ球およびＮＫ）の受容体と相互作用してこれを活性化し得るためには、極めて特異な特性を持っていなければならないことが分かった。
【０００８】
特定のＧ免疫グロブリンの生物学的活性は、その分子上、特にそのＦｃ成分上に存在するオリゴ糖の構造に依存する。総てのヒトおよびネズミサブクラスのＩｇＧ分子は、各Ｈ鎖のＣＨ２ドメインに結合した（ヒトＩｇＧについては残基Ａｓｎ２９７において）Ｎ−オリゴ糖を有する。このグリカン含有残基がエフェクター分子（Ｆｃ受容体および補体）と相互作用する抗体の能力に及ぼす影響はすでに証明されている。ツニカマイシンの存在下で培養することによりヒトＩｇＧ１のグリコシル化を阻害すると、例えば、単球およびマクロファージに存在するＥｃγＲＩ受容体に対するこの抗体の親和性が５０倍低下する（Leatherbarrow et al., 1985）。非グリコシル化ＩｇＧ３はＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体を介してＡＤＣＣ型の細胞溶解を誘導することはできないと報告されていることから（Lund et al., 1990）、ＦｃγＩＩＩ受容体への結合もまた、ＩｇＧにおける炭水化物の欠損によって影響を受ける。
【０００９】
しかし、これらのグリカン含有残基の存在が必要なこと以上に、エフェクター機能を誘導する能力の差を生じ得るそれらの構造の不均一性の方がより厳密なものである。個体によって異なるガラクトシル化プロフィール（ヒト血清ＩｇＧ１）が観察されている。これらの違いは、おそらく、これらの個体の細胞クローン間のガラクトシルトランスフェラーゼおよびその他の酵素の活性の違いを反映している（Jefferis et al., 1990）。翻訳後プロセスのこの通常の不均一性は種々のグリコ型を作り出すが（モノクローナル抗体の場合でさえ）、慢性関節リウマチまたはクローン病など、ある種の病状に関連した非定型構造をもたらすことがあり、これらについては、相当な割合の非ガラクトシル化残基（agalactosylated residues）が示されている(Parekh et al., 1985)。
【００１０】
精製分子のグリコシル化プロフィールは複数の働きの結果であり、そのいくつかのパラメーターはすでに研究されている。ＩｇＧのタンパク質主鎖、特に末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびマンノースα−１，６アームのガラクトース残基と接触しているアミノ酸（ＩｇＧのａａ２４６および２５８）により、種々のイソ型のネズミおよびキメラＩｇＧで行った研究で示されているように（Lund et al., 1993）、優先的な構造（ガラクトシル化）の存在を説明することができる。
【００１１】
また、観察された違いによれば、その分子を作製するのに用いた種および細胞タイプに関連する特異性も明らかになる。このように、ヒトＩｇＧのＮ−グリカンの通常の構造により、二等分の位置にＧｌｃＮＡｃ残基を有する二アンテナ型がかなりの割合であることが明らかとなり、これはネズミ細胞によって産生される抗体には存在しない構造である。同様に、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）株により合成されるシアル酸残基はもっぱらα−２，３型のものであるが、ネズミおよびヒト細胞を用いた場合にはそれらはα−２，３およびα−２，６型のものである（Yu Ip et al., 1994）。哺乳類由来のもの以外の発現系における免疫グロブリン産生では、昆虫細胞または植物によって産生されるキシロース残基の存在など、はるかに重要な改変が導入されることがある（Ma et al., 1995）。
【００１２】
細胞培養条件（培地の組成、細胞密度、ｐＨ、酸素供給等）などのその他の要因は、細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性、その結果として分子のグリカン構造に影響すると考えられる（Monica et al., 1993; Kumpel et al., 1994 b）。
【００１３】
今般、本発明に関して、短い鎖、低度のシアリル化、および中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを有する二アンテナ型の構造は、モノクローナル抗体に強いＡＤＣＣ活性を付与するグリカン構造の共通の特徴であることが分かっている。ＦｃγＲＩＩＩを介してエフェクター細胞を活性化し得るこれらの抗体、特に抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を製造する方法もまた開発されている。
【００１４】
血液型抗原は、赤血球の表面で発現する膜結合分子の性質によっていくつかの系に分類される。Ｒｈ（Rhesus）系はＤ、Ｃ、ｃ、Ｅおよびｅの５分子または５抗原を含む（ISSITT, 1988）。これらの分子のうち、Ｄ抗原は、最も免疫原性が高い、すなわち、Ｒｈ−Ｄ陽性の赤血球がＲｈ陰性個体に輸血された場合に抗Ｄ抗体の産生を誘導し得ることから、最も重要である。
【００１５】
Ｄ抗原は通常コーカサス人の８５％で発現し、これらの人々は「Ｒｈ陽性」と呼ばれ、従って、これらの人々の２５％はＲｈ陰性、すなわち、彼らの赤血球はＤ抗原を示さない。Ｄ抗原の発現においては、低い抗原密度（弱いＤ抗原により示される）または異なるかもしくは部分的な抗原性（部分的Ｄ抗原により示される）のいずれかと関連し得るある種の変異体が存在する。弱いＤ特性は、それ自体は正常な抗原であるが、赤血球当たりのその部位の数が多少なりとも有意に少ないことにより特徴づけられ、この特徴はメンデルの法則に従って伝達される。部分的なＤ表現型は、抗Ｄ血清抗体を有するＲｈ−Ｄ陽性個体において見出されており、よって、これらの部分的なＤ抗原はモザイク部分のみを有するものと特徴づけることができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いて行った研究により、Ｄ抗原を構成する少なくとも８つのエピトープを有する部分的Ｄ抗原の７つのカテゴリーを定義することが可能となった（LOMAS et al., 1989; TIPETT 1988）。
【００１６】
抗ＲｈＤ抗体の重要性は、新生児溶血症（ＨＤＮ）をもたらすメカニズムの発見をもって明らかとなった。これは、胎盤関門を渡り得る母親の抗ＲｈＤ抗体の形成を司る胎児母親間の血液型不適合が存在する場合に、ある胎児またはある新生児で見られる種々の病状に相当する。実際、Ｒｈ陰性の母親へ送られる胎児のＲｈ陽性の赤血球は、抗Ｄ抗体の形成をもたらし得る。
【００１７】
Ｒｈ陰性の母親の免疫感作後は、ＩｇＧクラス抗Ｄ抗体は胎盤関門を通過し、胎児のＲｈ陽性赤血球に結合し得る。この結合は、それらの表面Ｆｃ受容体を介して免疫コンピテント細胞の活性化をもたらし、やがて増感した胎児赤血球の溶血を引き起こす。反応の強さに応じて、ＨＤＮには数段階の重篤度が見られる。
【００１８】
ＨＤＮ診断は出生の前後で行うことができる。出生前診断は、いくつかの免疫血液学的技術を用いて、母親における抗Ｄ抗体レベルの上昇に基づいて行なわれる。分娩後診断は、臍帯血サンプルを用いて以下のパラメーターを分析することにより行なうことができる：胎児および父親の血液型の決定、抗Ｄ抗体の探査、ヘモグロビンおよびビリルビンのアッセイ。
【００１９】
今のところ、ＨＤＮの予防処置は、Ｒｈ陽性児を出産したＲｈ陰性の血液型を有する総ての女性に対して体系的に、ヒト抗Ｄ免疫グロブリン注射によりなされている。最初の実際の免疫予防の試みは１９６４年に始まった。効果的な防止のためには、免疫グロブリンは免疫感作前、すなわち、出生後７２時間以内に注射しなければならず、抗体量は十分なものでなければならない（Ｒｈプラス赤血球０．５ｍｌにつき抗Ｄ抗体１０μｇ）。
数種の抗Ｄモノクローナル抗体が治療上の評価を受けている：ＢＲＯＳＳＡＲＤ／ＦＮＴＳ １９９０（非公開）；ＴＨＯＭＳＯＮ／ＩＢＧＲＬ １９９０；ＫＵＭＰＥＬ／ＩＢＧＲＬ １９９４；ＢＥＬＫＩＮＡ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｃｏｗ， １９９６；ＢＩＯＴＥＳＴ／ＬＦＢ １９９７（非公開）。Ｒｈ（Ｄ）陽性赤血球のクリアランスの誘導における抗体の臨床効果は、Ｒｈ（Ｄ）陰性のボランティアにおいて評価された。ある一つのＩｇＧ１抗体は抗ポリクローナル免疫グロブリンの場合と同等の効果を示したが、一部の患者においてのみであった（KUMPEL et al., 1995）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Boylston, J.M., Gardner, B., Anderson, R.L., and Hughes-Jones, N.C. Production of human IgM anti D in tissue culture by EB virus-transformed lymphocytes. Scand. J. Immunol. 12: 355-358 (1980).
【非特許文献２】Bron, D., Feinberg, M.B., Teng, N.N.H. and Kaplan, H.S. Production of Human Monoclonal IgG Antibodies against Rhesus (D) Antigen. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 3214-3217 (1984).
【非特許文献３】Chouchane, L., Van Spronsen, A., Breyer, J., Guglielmi, P., and Strosberg, AD. Molecular characterization of a human anti-Rh(D) antibody with a DII segment encoded by a germ-line sequence. Eur. J. Biochem. 1; 207(3): 1115-1121 (1992).
【非特許文献４】Crawford, D.H., Barlow, M.J., Harrison, J.F., Winger, L. and Huehns, E.R. Production of human monoclonal antibody to rhesus D antigen. Lancet, i: 386-388 (1983).
【非特許文献５】Doyle, A., Jones, T.J., Bidwell, J.L. and Bradley, B.A. In vitro development of human monoclonal antibody secreting plasmacytomas. Hum. Immunol. 13: 199-209 (1985).
【非特許文献６】Edelman, L., Margaritte, C., Chaabihi, H., Monchatre, E., Blanchard, D., Cardona, A., Morin, F., Dumas, G., Petres, S. and Kaczorek, M. Obtaining a functional recombinant anti-rhesus (D) antibody using the baculovirus-insect cell expression System. Immunology, Vol. 91(1), 13-19 (1997).
【非特許文献７】Foung, S.K.H., Blunt, J.A., Wu, P.S., Ahearn, P., Winn, L.C., Engleman, E.G. and Grumet, F.C. Human Monoclonal Antibodies to Rho (D). Vox Sang. 53: 44-47 (1987).
【非特許文献８】Goossens, D., Champomier, F., Rouger, P., and Salmon, C. Human Monoclonal Antibodies against Blood Group Antigens: Preparation of a series of stable EBV immortalized B clones producing high levels of antibody of different isotypes and specificities. J. Immunol. Methods 101: 193-200 (1987).
【非特許文献９】Issitt, P.D. Genetics of the Rh Blood Group System: Some Current Concepts. Med. Lab. Sci. 45: 395-404 (1988).
【非特許文献１０】Jefferis, R, Lund, J., Mizutani, H., Nakagawa, H., Kawazoe, Y., Arata, Y. and Takahashi, N. A comparative study of the N-linked oligosaccharides structure of human IgG Subclass proteins. Biochem. J., 268: 529-537 (1990).
【非特許文献１１】Koskimies, S. Human Lymphoblastoid Cell Line Producing Specific Antibody against Rh-Antigen D. Scand. Immunol. 11: 73 77 (1980).
【非特許文献１２】Kumpel, B.M., Goodrick, M.J., Pamphilon, D.H., Fraser, I.D., Poole G.D., Morse, C., Standen, G.R., Chapman, G.E., Thomas, D.P. and Anstee, D.J. Human Rh D monoclonal antibodies (BRAD-3 and BRAD-5) Cause Accelerated Clearance of Rh D + Red blood Cells and Suppression of Rh D Immunization in Rh D Volunteers. Blood, Vol. 86, No. 5, 1701-1709 (1995).
【非特許文献１３】Kumpel, B.M., Poole, G.D. and Bradley, B.A. Human Monoclonal Anti-D Antibodies. I. Their Production, Serology, Quantitation and Potential Use as Blood Grouping Reagents. Brit. J. Haemat. 71: 125-129 (1989a).
【非特許文献１４】Kumpel, B.M., Rademacher, T.W., Rook, G.A.W., Williams, P.J., Wilson, I.B.M. Galacatosylation of human IgG anti-D produced by EBV-transformed B lymphoblastoid cell lines is dependent on culture method and affects Fc receptor mediated functional activity. Hum. Antibodies and Hybridomas, 5: 143-151 (1994).
【非特許文献１５】Leatherbarrow, R.J., Rademacher, T.W., Dwek, R.A., Woof, J.M., Clark, A., Burton, D.R., Richardson, N. and Feinstein, A. Effector functions of monoclonal aglycosylated mouse IgG2a; binding and activation of complement component CI and itneraction with human Fc receptor. Molec. Immun. 22, 407-415 (1985).
【非特許文献１６】Lomas, C., Tippett, P., Thompson, K.M., Melamed, M.D. and Hughes-Jones, N.C. Demonstration of seven epitopes on the Rh antigen D using human monoclonal anti-D antibodies and red cells from D categories. Vox Sang. 57: 261-264 (1989).
【非特許文献１７】Lund, J., Takahaski, N., Nakagawa, H., Goodall, M., Bentley, T., Hindley, S.A., Tyler, R. and Jefferis, R. Control of IgG/Fc glycosylation: a comparison of oligosaccharides from chimeric human/mouse and mouse subclass immunoglobulin G5.Molec. Immun. 30, No. 8, 741-748 (1993).
【非特許文献１８】Lund, J., Tanaka, T., Takahashi, N., Sarmay, G., Arata, Y. and Jefferis, R. A protein structural change in aglycosylated IgG3 correlates with loss of hu FcγRI and Hu FcγRIII binding and/or activation. Molec. Immun. 27, 1145-1153 (1990).
【非特許文献１９】Ma, J.K. and Hein, M.B. Immunotherapeutic potential of antibodies produced in plants. Trends Biotechnol. 13, 522-527 (1995).
【非特許文献２０】Mc Cann-Carter, M.C., Bruce, M., Shaw, E.M., Thorpe, S.J., Sweeney, G.M., Armstrong, S.S. and James, K. The production and evaluation of two human monoclonal anti-D antibodies. Transf. Med. 3: 187-194 (1993).
【非特許文献２１】Melamed. M.D., Gordon, J., Ley, S.J., Edgar, D. and Hughes-Jones, N.C. Senescence of a human lymphoblastoid clone producing anti-Rhesus (D) Eur. J. Immunol. 115: 742-746 (1985).
【非特許文献２２】Parekh, R.B., Dwek, R.A., Sutton, B.J., Fernanes, D.L., Leung, A., Stanworth, D., Rademacher, T.W., Mizuochi, T., Taniguchi, T., Matsuta, K., Takeuchi, F., Nagano, Y., Miyamoto, T. and Kobata, A. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature, 316: 452-457 (1985).
【非特許文献２３】Rothman, R.J., Perussia, B., Herlyn, D. and Warren, L. Antibody-dependent cytotoxicity mediated by natural killer cells is enhanced by castanospermine-induced alterations of IgG glycosylation. Mol. Immunol. 26(12): 1113-1123 (1989).
【非特許文献２４】Shitara K., Nakamura K., Tokutake-Tanaka Y., Fukushima M., and Hanai N. A new vector for the high level expression of chimeric antibodies to myeloma cells. J. Immunol. Methods 167: 271-278 (1994).
【非特許文献２５】Thompson, K.M., Hough, D.W., Maddison, P.J., Mclamed, M.D. and Hughes-Jones, N.C. Production of human monoclonal IgG and IgM antibodies with anti D (rhesus) specificity using heterohybridomas. Immunology 58: 157-160 (1986).
【非特許文献２６】Thomson, A., Contreras, M., Gorick, B., Kumpel, B., Chapman, G.E., Lane, R.S., Teesdale, P. Hughes-Jones, N.C. and Mollison, P.L. Clearance of Rh D-positive red cells with monoclonal anti-D. Lancet 336: 1147-1150 (1990).
【非特許文献２７】Tippett, P. Sub-divisions of the Rh(D) antigen. Med. Lab. Sci. 45: 88-93 (1988).
【非特許文献２８】Ware, R.E. and Zimmerman, S.A. Anti-D: Mechanisms of action. Seminars in Hematology, vol. 35, No. 1, supp. 1: 14-22 (1998).
【非特許文献２９】Yu, I.P.C., Miller, W.J., Silberklang, M., Mark, G.E., Ellis, R.W., Huang, L., Glushka, J., Van Halbeek, H., Zhu, J. and Alhadeff, J.A. Structural characterization of the N Glycans of a humanized anti-CD18 murine immunoglobulin G. Arch. Biochem. Biophys. 308, 387-399 (1994).
【非特許文献３０】Zupanska, B., Thompson, E., Brojer, E. and Merry, A.H. Phagocytosis of Erythrocytes Sensitized with Known Amounts of IgG1 and IgG3 anti-Rh antibodies. Vox Sang. 53: 96-101 (1987).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、上記の問題に応えるモノクローナル抗体、すなわち、その抗体に特異的なＡＤＣＣ型のアッセイを用いて選択される抗体および／または良好な効果を得るために必要なグリカン構造を有する抗体の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の説明
従って、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化し得るモノクローナル抗体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）ハイブリドーマ、特にヘテロハイブリドーマ、および該抗体をコードする遺伝子を含んでなるベクターでトランスフェクトした動物またはヒト細胞株から選択される細胞株に由来する種々のクローンから得られたモノクローナル抗体を精製する工程、
ｂ）工程ａ）において得られた各抗体を、
該抗体の標的細胞、
ＦｃγＲＩＩＩ発現細胞を含んでなるエフェクター細胞、
多価ＩｇＧ
を含んでなる別々の反応混合物に添加する工程、
ｃ）標的細胞の細胞溶解の百分率を決定し、エフェクター細胞を活性化して標的細胞の有意な細胞溶解を生じさせる（ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣ活性）モノクローナル抗体を選択する工程、
を含んでなるものに関する。
【００２３】
これらのクローンは、ヒトＢリンパ球（免疫化された個体に由来）と、ネズミ、ヒト、またはヘテロハイブリッド骨髄腫細胞、特にＫ６Ｈ６−Ｂ５骨髄腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１８２３）との融合によって得られたヘテロハイブリッド細胞株、あるいは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンをコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされた動物またはヒト細胞株（該株は、特に、ＣＨＯ−Ｋ、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ Ｌｅｃ−１、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＹＢ２／０、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株から選択され得る）に由来するものとすることができる。
【００２４】
多価ＩｇＧは、ＦｃγＲＩＩＩを介するエフェクター細胞の溶解機構を阻害するために用いられる。
【００２５】
本発明による方法では、６０％、７０％、または８０％を超える、好ましくは９０％を超える、ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣレベルを示す抗体が選択される。
【００２６】
標的細胞はパパインで処理した赤血球であってもよい。この場合、一つのウェル当たりに、
約２００ｎｇ／ｍｌの精製モノクローナル抗体１００μｌ、
パパイン処理された赤血球２５μｌ、すなわち、約１×１０６細胞、
エフェクター細胞２５μｌ、すなわち、約２×１０６細胞、および
濃度１〜２０ｍｇ／ｍｌの多価ＩｇＧ、特にＴＥＧＥＬＩＮＥ（商標）(LFB, France)、５０μｌ
が投入される。
【００２７】
従って、標的細胞の細胞溶解量を、ＮＨ４Ｃｌなどの化学化合物およびin vivoで活性な参照抗体からなる２種の陽性対照、ならびにin vivoで不活性な抗体からなる陰性対照と比較することができる。
【００２８】
また、市販のポリクローナル抗体を陽性対照として用い、in vivoクリアランスを誘導することができないモノクローナル抗体を陰性対照として用いることができる。
【００２９】
有利には、本発明による方法により、上述のような抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体の製造が可能とされる。そして、ＲｈＤ赤血球が標的細胞として用いられる。
【００３０】
従って、本発明は、in vitroにおける生物学的活性のアッセイの開発に基づくものであり、該アッセイでは、測定した活性は、Ｒｈ（Ｄ）陰性のボランティアにおけるＲｈ（Ｄ）陽性赤血球のクリアランスを誘導するそれらの能力について臨床的観点からすでに評価したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のin vivoにおける生物学的活性と相関する。このアッセイにより、ＦｃγＩＩＩ型受容体（ＣＤ１６）によって本質的に誘導される抗体依存性細胞溶解活性＝ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）の評価が可能となる（なお、ＦｃγＩ型受容体（ＣＤ６１）はヒトＩｇＧ免疫グロブリン（治療用多価ＩｇＧの形態にある）の付加によって飽和される）。このＡＤＣＣアッセイのＦｃγＲＩＩＩ特異性は、抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体の存在下での阻害によって確認された（図６参照）。健常者由来の単核細胞は、in vivoにおける生理条件に近いエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で、エフェクター細胞として使用される。これらの条件下では、ポリクローナル免疫グロブリンおよびin vivoで効果がない抗Ｄモノクローナル抗体(抗体ＤＦ５， Goossens et al., 1987、および抗体ＡＤ１＋ＡＤ３， ＦＲ９２／０７８９３号 ＬＦＢ／ＢｉｏｔｅｓｔおよびＦＯＧ−１，ＧＢ２１８９５０６号）の細胞溶解活性は、それぞれ「強い」および「弱い」である。
【００３１】
従って、本発明による抗体の選択は、このＡＤＣＣ型アッセイにおいてそれらの生物学的活性を評価することにより行った（実施例１参照）。
【００３２】
他の態様によれば、本発明は、上記の方法を用いて得られる抗体に関するものであり、該抗体は、参照ポリクローナル抗体に対して６０％、７０％、または８０％を超える、好ましくは９０％を超える、ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣレベルを示す。本発明によるモノクローナル抗体は、所定の抗原に対するものであり、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化して、同じ抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％、７０％、８０％を超える、好ましくは９０％を超える細胞溶解を生じさせる。有利には、該モノクローナル抗体は、ＲｈＤに対するものとされる。それらは、好ましくは、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６６２）またはＣＨＯ Ｌｅｃ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７３５）株に由来するクローンによって産生され、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３クラスに属するものとすることができる
【００３３】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＩ依存性エフェクター活性を付与する特定のグリカン構造を有する抗体に関する。このような抗体は上述の方法を用いて得ることができ、それらのＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、短い鎖と低度のシアリル化を伴った二アンテナ型のグリカン構造を有する。好ましくは、それらのグリカン構造は、中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを表す。
【００３４】
このような抗体は、より特定的には以下の形態から選択される：
【化１】
【００３５】
従って、本発明は、そのＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、短い鎖、低度のシアリル化、および末端結合点を有する中間挿入物ではないマンノースおよびＧｌｃＮＡｃを伴った二アンテナ型のグリカン構造を有するモノクローナル抗体に関する。該抗体は、所定の抗原に対するものであり、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化して、同じ抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％、７０％、８０％を超える、好ましくは９０％を超える細胞溶解を生じさせる。
【００３６】
より特定的には、本発明は、シアル酸含量が２５％、２０％、１５％または１０％、好ましくは５％、４％、３％または２％未満である、上記で定義される抗体および該抗体を含んでなる組成物に関する。
【００３７】
同様に、本発明は、フコース含量が６５％、６０％、５０％、４０％または３０％未満である、上記で定義される抗体および該抗体を含んでなる組成物に関する。好ましくは、フコース含量は２０％〜４５％、または２５％〜４０％である。
【００３８】
本発明による特に有効な組成物は、例えば、Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型については６０％を超える、好ましくは８０％を超える含量を含むものとされ、ここで、Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型は５０％未満、好ましくは３０％未満であると考えられる。
【００３９】
【表１】
【００４０】
ＦｃγＲＩＩＩを特異的にターゲッティングする別法として、「高マンノース」型の抗体を製造することがある。
【００４１】
他の態様によれば、本発明は、上記抗体を産生する細胞に関する。これは、ハイブリドーマ、特にＫ６Ｈ６−Ｂ５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１８２３）を融合相手として得られたヘテロハイブリドーマ、または該抗体をコードする遺伝子を含んでなるベクターでトランスフェクトされた動物またはヒト細胞、特にＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６６２）またはＣＨＯ Ｌｅｃ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７３５）株に由来する細胞とすることができる。これらの細胞は、本発明による方法を用いて選択される細胞株に相当し、該細胞は上記の特徴を有する抗体を産生する。
【００４２】
本発明による好ましい抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ陽性エフェクター細胞を用いるＡＤＣＣアッセイにおいて著しい生物学的活性（抗Ｒｈ（Ｄ）参照ポリクローナル抗体より高いかまたは同等）を示す。ＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化する（結合後）その能力は、細胞内カルシウム流量、活性化シグナル伝達分子のリン酸化、または化学メディエーターの放出の改変を実証するin vitroモデルにおいて確認される。
【００４３】
これらの特性は、抗体のＦｃ成分のＮ−グリコシル化部位におけるオリゴ糖の特定の構造：例えば、短い鎖の存在、低度のガラクトシル化、少ないシアリル化、中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを有すること、と関連している。
【００４４】
この抗体は、ＨＤＮの防止、Ｒｈ（Ｄ）陽性個体のＩＴＰの治療、および抗Ｄポリクローナル免疫グロブリンの使用が関連するその他のいずれかの用途などの治療用途を有する。
【００４５】
本発明による好ましい抗体はまた、抗Ｒｈ（Ｄ）以外の特異性（例えば、抗癌細胞）も有し得る。それは上記の特性（ＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合／その活性化のメカニズム、オリゴ糖の特定の構造に依存する機能活性）を有することができ、癌の、あるいはその作用メカニズムがＦｃγＲＩＩＩ受容体を介して機能する活性に相当するモノクローナル抗体を用いて治療的または防止的処置が行われる他のいずれかの病状の免疫療法に用いることができる。
【００４６】
本発明の他の態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物、および医薬品の製造のための該抗体の使用に関する。
【００４７】
好ましくは、本発明は、Ｒｈ陰性個体のＲｈ同種異系免疫の防止を目的とする医薬品を製造するための、上記の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の使用に関する。in vivoにおける抗Ｄ免疫グロブリンの作用の様式は、その抗体がＲｈ（Ｄ）陽性赤血球のＤ抗原と特異的に結合した後、本質的に脾臓において、これらの赤血球が循環系から排除されるというものである。このクリアランスは、その個体の一次免疫応答の抑制の動的メカニズムに関連していることから、免疫化を防止する。
【００４８】
従って、本発明による抗体は、Ｒｈ陽性児の出産直後のＲｈ陰性の母親の同種異系免疫を予防するため、および次の妊娠時の新生児溶血症（ＨＤＮ）を予防するため、ＲｈＤ不適合の状況下での流産時または子宮外妊娠時、あるいはＲｈＤ不適合の状況下での羊水穿刺、絨毛生検または外傷性産科操作による経胎盤出血時において、予防的に使用できる。
【００４９】
さらに、本発明による抗体は、血液または不安定血液誘導体によるＲｈ不適合輸血の場合にも使用できる。
【００５０】
本発明はまた、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）における治療的使用を目的とする医薬品を製造するための、本発明による抗体の使用に関する。
【００５１】
本発明による抗体はまた、免疫療法による癌の治療、またはウイルス性もしくは細菌性病原体によって引き起こされる感染症の治療を目的とする医薬品を製造するためにも使用できる。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、特に診断のための該抗体の使用に関する。従って、本発明は、上記の抗体を含んでなるキットに関する。
以降の説明においては、後述する図面の説明を参照するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｆ６０およびＴ１２５ ＹＢ２／０（Ｒ２７０）のＡＤＣＣ評価。この図面は１００および５００μｇ／ウェルのＴＥＧＥＬＩＮＥ（商標）（LFB, France）存在下で抗体濃度の関数として得られた細胞溶解百分率を表す。本発明による抗体Ｆ６０およびＴ１２５について高い細胞溶解百分率が得られる。
【図２】受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）への抗Ｄ結合。本発明による抗体Ｆ６０およびＴ１２５について高い結合指数が得られる。
【図３】Ｔ１２５のＨ鎖を発現させるための発現ベクターＴ１２５−Ｈ２６の構築。
【図４】Ｔ１２５のＬ鎖を発現させるための発現ベクターＴ１２５−Ｋ４７の構築。
【図５】抗体Ｔ１２５の全体を発現させるための発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４の構築。
【図６】抗ＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の存在下でのＡＤＣＣ阻害。ＡＤＣＣアッセイは、市販の抗ＣＤ１６ ３Ｇ８（ＴＥＢＵ）（その作用はエフェクター細胞に存在するＦｃＲＩＩＩ受容体を遮断することである）の存在下で第３．３節に記載の手順に従って確立する。３Ｇ８の最終濃度は５μｇ／ウェル（２５μｇ／ｍｌ）である。３Ｇ８の不在下で並行して対照実験を行う。試験する３種の抗体はポリ−Ｄ ＷｉｎＲｈｏ、実施例１に記載の方法に従って得られた抗体Ｆ６０（Ｐｆ１５５ ９９／４７）、および実施例２に記載の方法に従って得られたＲ２９７（Ｐｆ２１０ ０１／７６）である。結果は次の通りである。３Ｇ８の存在下で阻害が見られるが、これは試験した３種の抗体によって誘導されたＡＤＣＣは主としてＦｃＲＩＩＩ依存性であることを示す。ポリ−Ｄ ＷｉｎＲｈｏの存在下では若干強い阻害が見られる（Ｆ６０およびＲ２９７の阻害がそれぞれ６８％および６１％であるのに対して、８３％）。この違いは、ポリ−Ｄにおける、Ｉ型受容体（ＦＣＲＩまたはＣＤ６４）を阻害し、従って、抗ＣＤ１６と相乗的に作用する非抗ＤヒトＩｇＧの存在によるものである可能性がある。
【図７】質量分析法（ＭＳ）による抗Ｄグリカンの特徴づけ。
【図８】Ｒ２９０およびＤＦ５のＭＳスペクトルの比較。
【図９】ＭＳによる抗Ｄ Ｄ３１ＤＭＭのグリコシル化の実験。
【実施例】
【００５４】
実施例１：抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を産生するヘテロハイブリッド細胞株の樹立
１−リンパ芽球様およびヘテロハイブリッドクローンの作製：
１．１−リンパ球供給源：
Ｂリンパ球ドナーは、第３３節で記載したＡＤＣＣ活性アッセイでのそれらの抗Ｒｈ（Ｄ）血清抗体の活性に基づき、プラスマフェレーシスを受けている抗Ｒｈ（Ｄ）ドナーから選択する。１９９８年の全血献血後、「バフィーコート」画分（白血球濃縮物）を回収した。
【００５５】
１．２−ドナー由来のＢリンパ球の不死化
末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ（Pharmacia）での遠心分離によりその他の成分と分離する。次いで、それらを２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＩＭＤＭで１０６細胞／ｍｌまで希釈し、そこに２０％ のＢ９５−８系（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１６１２）の培地上清、０．１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ(Sandoz)、５０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン(Life Technologies)を加え、丸底９６ウェルプレートまたは２４ウェルプレート(P24 Greiner)に分配する。その後、これらを３７℃、７％ＣＯ２のインキュベーター中に置く。３週間後、ＡＤＣＣによって抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在を測定する。
【００５６】
陽性のＰ２４プレートウェルの１６マイクロウェルの各々を、新しいＰ２４ウェルに移す。培養１０〜１５日後にこの濃縮を繰り返し、各マイクロウェルをＰ９６、次いでＰ２４で増幅させる。
【００５７】
陽性のＰ９６ウェルを集め、平底Ｐ２４(Nunc)で増幅させる。２〜３日の培養後、ＡＤＣＣにより抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在を調べる。
【００５８】
１．３−免疫ロゼット法（ＩＲ）による濃縮：
１以上のＰ２４ウェルから誘導された細胞を、パパイン処理したＲｈ（Ｄ）陽性の赤血球によるロゼット形成および分離により、特定の細胞を濃縮する：０．９％ＮａＣｌで洗浄した１容量の赤血球を１容量のパパイン(Merck)溶液、１／１０００ｔｈ（ｍ／ｖ）に加えて３７℃で１０分間インキュベートした後 、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。次いで、細胞をハンクス溶液で１回洗浄し、ＦＣＳに懸濁し、パパイン処理した赤血球と１細胞対３３赤血球の割合で混合した。この混合物を円錐底遠心チューブに入れ、８０ｇで５分間遠心分離し、さらに溶解しかけた氷中にて１時間インキュベートする。次いで、混合物を慎重に攪拌し、９００ｇで２０分間の分離によりＦｉｃｏｌｌをチューブの底に沈殿させる。ロゼットを含むペレットをＮＨ４Ｃｌ溶液で５分間溶血させ、照射済ヒト単核細胞を含有するＰ２４において細胞を再び培養する。約１週間後、ＣＥＬＡ（段落３．２）およびＡＤＣＣアッセイにより優れた活性を有する抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在について上清を評価する。それまでのサイクルに比べてロゼット形成細胞の割合がかなり高まる場合には、さらなる濃縮サイクルを行う。
【００５９】
１．４−リンパ芽球様細胞のクローニング：
ＩＲ濃縮細胞を、照射済ヒト単核細胞を含有する丸底９６ウェルプレートに、ウェル当たり５および０．５細胞で分配する。約４週間の培養後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６０】
１．５−ヘテロ融合物：
有利なＡＤＣＣ活性を示すＥＢＶ形質転換細胞のクローニングウェルを培養増幅した後、標準ＰＥＧ技術によりヘテロ骨髄腫Ｋ６Ｈ６−Ｂ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８２３）と融合する。融合後、細胞を２×１０４細胞／ウェルの割合で、アミノプテリンおよびウアバイン(Sigma)を含有する選択培地中にネズミ腹膜内マクロファージを含有する平底Ｐ９６に分配する。
【００６１】
３〜４週間の培養後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６２】
１．６−ヘテロハイブリドーマのクローニング：
制限希釈によるクローニングを、平底Ｐ９６で４、２および１細胞／ウェルにおいて行う。２週間後、顕微鏡でウェルの様子を調べて単一クローンを同定し、その後、培地を新しいものに交換する。約２週間後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６３】
２−選択されたクローンの履歴：
２．１−ＩｇＧ１を産生するクローン
ドナーｄ１３細胞のＥＢＶ形質転換により１つのウェル（Ｔ１２５ ２Ａ２と呼ぶ）の選択が可能になり、それを用いて、濃縮２回、ＩＲ３回、さらに５細胞／ウェルでのクローニングを逐次行い、２種類のクローンを得た：
１）Ｔ１２５ ２Ａ２（５／１）Ａ２（これからＤＮＡを抽出して組換えベクターを作製する）；
２）Ｔ１２５（５／１）Ａ２（これをＫ６Ｈ６−Ｂ５と融合してＦ６０ ２Ｆ６を取得し、次いで、５ラウンドのクローニング後にＦ６０ ２Ｆ６（５）４Ｃ４（ライブラリーを準備する前の細胞ストックの構成のために選択されるクローン）を得る）。
【００６４】
これはκＬ鎖を有するＩｇＧ１である。
【００６５】
【表２】
【００６６】
２．２−ＩｇＧ３産生クローン
ＩｇＧ1イソ型抗体の調製に用いるものと同じ方法によりＩｇＧ３を産生する株を作製した。細胞起源は所定のドナーの全血献血から得られるものであり、そこから「バフィーコート」画分（白血球濃縮物）を回収した。
【００６７】
これはκＬ鎖を有するＩｇＧ３である。
【００６８】
【表３】
【００６９】
３−抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の評価方法：
タンパク質Ａセファロース（Pharmacia）でのアフィニティークロマトグラフィー、さらに２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４での透析による精製後、ＥＬＩＳＡ法により抗体Ｔ１２５の濃度を測定する。次いで、ＡＤＣＣ法によりin vitroにおける生物学的活性を測定する。
【００７０】
３．１−ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＧレベルおよびイソ型の測定：
・全ＩｇＧ
被覆：０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）中、２μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ(Calbiochem)において４℃で一晩。飽和：希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）、周囲温度で１時間。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。希釈バッファーで約１００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および１００ｎｇ／ｍｌに予め希釈したＬＦＢ多価ヒトＩｇＧで構成される制御範囲の希釈。周囲温度で２時間のインキュベーション。結合：１／５ ０００に希釈した抗ＩｇＧ(Diagnostic Pasteur)、周囲温度で２時間。基質：過ホウ酸ナトリウムを含有するリン酸クエン酸バッファー(Sigma)中、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)、暗室で１０分間。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る。
【００７１】
・κ鎖のアッセイ 被覆：０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）中、５μｇ／ｍｌの抗κ(Caltag Lab)において４℃で一晩。飽和：希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）、周囲温度で１時間。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。希釈バッファーで約１００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および１００ｎｇ／ｍｌに予め希釈したＬＦＢモノクローナル抗体ＡＤ３Ｔ１（κ／γ３）で構成される制御範囲の希釈。周囲温度で２時間のインキュベーション。結合：１／１５００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Pierce）の存在下で１／１０００に希釈したビオチン化抗κ（Pierce）、周囲温度で２時間。基質：過ホウ酸ナトリウムを含有するリン酸クエン酸バッファー(Sigma)中、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)、暗室で１０分間。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る。
【００７２】
３．２−ＣＥＬＡ（細胞酵素結合アッセイ）による抗Ｄの特異的アッセイ：
この方法は、特に抗Ｄ抗体以外の非抗Ｄ免疫グロブリンが溶解状態で存在する培養段階（ＥＢＶ形質転換後、早期の段階）の培養物上清を用いる場合に、抗Ｄ抗体を特異的にアッセイするために用いられる。
【００７３】
原理：抗Ｄ抗体をＲｈ陽性赤血球とともにインキュベートした後、アルカリ性ホスファターゼ標識した抗ヒトＩｇにより検出する。
【００７４】
Ｌｉｓｓ−１％ＢＳＡ希釈バッファーで希釈した１０％のＲｈ＋赤血球１００μｌ。希釈バッファーで約５００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および５００ｎｇ／ｍｌに予め希釈した精製モノクローナルヒト抗Ｄ ＩｇＧ （ＤＦ５、ＬＦＢ）で構成される制御範囲の希釈。周囲温度で４５分間のインキュベーション。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ。結合：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１／４０００に希釈した抗ＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ(Jackson)、周囲温度で１時間３０分。基質：１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８中、１ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ(Sigma)。１Ｎ ＮａＯＨで反応を停止させ、４０５ｎｍで読み取る。
【００７５】
３．３−ＡＤＣＣ法
ＡＤＣＣ(抗体依存性細胞性細胞傷害)法により、エフェクター細胞（単核細胞またはリンパ球）の存在下でＲｈ＋赤血球の溶解を誘導する（抗Ｄ）抗体の能力を測定することが可能になる。
【００７６】
Ｒｈ陽性型細胞濃縮物の赤血球細胞をパパインで処理（１ｍｇ／ｍｌ、３７℃で１０分）した後、０．９％ＮａＣｌで洗浄する。エフェクター細胞はＦｉｃｏｌｌ（Pharmacia）での遠心分離により少なくとも３つのバフィーコートからなるプールと分離し、続いて２５％ＦＣＳの存在下での接着工程を行い、９オーダーのリンパ球／単球比を得る。ウェル当たり、以下のもの：１００μｌの２００ｎｇ／ｍｌ精製抗Ｄ抗体、２５μlの パパイン処理したＲｈ＋赤血球（すなわち、１×１０６）、２５μlのエフェクター細胞（すなわち、２×１０６）および１０および２ｍｇ／ｍｌの常用濃度の多価ＩｇＧ（例えば、Ｔｅｇｅｌｉｎｅ、ＬＦＢ）５０μｌをマイクロ滴定プレート（９６ウェル）に投入する。０．２５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭで希釈する。３７℃で一晩インキュベーションした後、このプレートを遠心分離し、次いでペルオキシダーゼ活性に特異的な基質（２，７−ジアミノフルオレン、ＤＡＦ）の存在下で上清に放出されたヘモグロビンを測定する。この結果を細胞溶解率％で示し、ＮＨ４Ｃｌにおける全赤血球細胞溶解を１００％（１００％対照）、さらに抗体を含まない反応混合物を０％（０％対照）とする。
【００７７】
以下の式により、特異的な細胞溶解を百分率で算出する：
（ＯＤサンプル−ＯＤ０％対照）／（ＯＤ１００％対照−ＯＤ０％対照）×１００＝％ＡＤＣＣ。
【００７８】
図１に示した結果は、ヘテロハイブリッドＦ６０によって産生された抗体の活性を参照抗体のものとの比較において示している：
−抗Ｒｈ（Ｄ）ポリクローナル抗体ＰＯＬＹ−Ｄ ＬＦＢ５１およびＷｉｎＲｈＯ Ｗ０３(Cangene)＝陽性対照；
−モノクローナル抗体ＤＦ５（Ｒｈ（Ｄ）＋赤血球（ＢＲＯＳＳＡＲＤ／ＦＮＴＳ、１９９０、未発表）のクリアランスについてはin vivoにおいて不活性）＝陰性対照；
−ポリクローナルＷｉｎＲｈＯ Ｗ０３から精製したＩｇＧ１（ＩｇＧ３から分離）。
【００７９】
２種類の濃度のヒトＩｇＧ（Ｔｅｇｅｌｉｎｅ ＬＦＢ）は、陰性対照の活性阻害が、競合するＩｇＧとＦｃγＩ型受容体との結合に関係していることを示す目的で用いられる。
【００８０】
３．４−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）結合法：
このアッセイにより、ＩｇＧ１イソ型の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体とＦｃγＲＩＩＩとの結合を評価することが可能となり、特にＩｇＧ３抗体を識別することが可能となる。この受容体の単量体ＩｇＧに対する親和性が低いときは、予め抗体とＤ抗原との結合が必要となる。
【００８１】
原理：試験する抗体（抗Ｄ）を、マイクロ滴定プレートに被覆したＲｈ＋赤血球膜に添加し、続いて、それら表面のＦｃγＲＩＩＩ受容体を発現するトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞を加える。遠心分離後、ウェルにＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔを均一にプレーティングすることにより「Ｒｈ＋膜／抗Ｄ／ＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ」相互作用を視覚化する。これに対し、相互作用の不在下では、細胞はウェルの中心に集中する。反応強度は＋の数で示している。
【００８２】
方法：１）抗Ｄ抗体（ＩＭＤＭ中１μｇ／ｍｌにおいて５０μｌ）をＣａｐｔｕｒｅ Ｒ ｐｌａｔｅ（Immunochim）上において３７℃で１時間インキュベートした後、水＋０．９％ＮａＣｌで洗浄する。ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳにＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ（２×１０６細胞／ｍｌ）を加える。３７℃で２０分間インキュベートした後、遠心分離し、細胞接着性（制御範囲と対照する）を測定する。
【００８３】
２）０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ５．３〜５．５でＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解した後、１／５０００の抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（Sanofi Diagnostics Pasteur）を用いるＥＬＩＳＡタイプの方法により、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｒ ｐｌａｔｅに結合した抗Ｄを曝す。ＯＰＤ暴露後、４９２ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取る。
【００８４】
結果を次のように示す：０〜３の任意の値をＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ細胞の結合およびプレーティングの関数として割り当てる。これらの値を定義された各々のＯＤ区間（０．１のインクリメント）に割り当てる。以下のもの：
* 曲線：赤血球細胞膜に結合した抗Ｄ量（Ｘ）の関数としてのＪｕｒｋａｔ細胞の接着性（Ｙ）；または
* 各抗体の、各ＯＤ区間に(試験した総て抗体に共通する部分に対して）.割り当られた各Ｊｕｒｋａｔ細胞結合値（０〜３）の合計に相当する「結合指数」のヒストグラム、のいずれかをプロットする。
【００８５】
ヒストグラムの例を図２に示す。
【００８６】
ＩｇＧ１イソタイプの抗Ｒｈ（Ｄ）抗体（Ｆ６０およびＴ１２５ ＹＢ２／０）はポリクローナルＩｇＧ１（ＷｉｎＲｈｏ）のものに近い結合指数を示すが、陰性対照である抗体ＤＦ５およびＡＤ１は結合しない。同様に、ＩｇＧ３イソ型の抗体（Ｆ４１）は優れた結合指数を示すが、ポリクローナルＷｉｎｒｈｏから精製したＩｇＧ３のものより若干弱く、かつ、抗体ＡＤ３（調べたその他のＩｇＧ３であり、かつＡＤ１との混合物では臨床試験において効果のないもの（Ｂｉｏｔｅｓｔ／ＬＦＢ、１９９７、未発表））のものより強いものである。
【００８７】
実施例２：
組換え抗Ｄ抗体（Ａｂ）の産生
１−ＡｂのＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡの単離および増幅
１．１−ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡを、ＥＢＶ形質転換により得られた抗ＤＡｂ−産生クローン（ＩｇＧ Ｇ１／κ）から抽出した：Ｔ１２５ Ａ２（５／１）Ａ２（実施例１の段落２を参照）。
【００８８】
オリゴｄＴプライマーを用いた全ＲＮＡの逆転写により、対応するｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
１．２−Ｔ１２５−Ａ２Ｈ鎖可変領域：ＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いたＴ１２５−Ａ２ｃＤＮＡの増幅により、ＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列を得る：
Ｔ１２５−Ａ２のＶＨ遺伝子リーダー領域の５’側に位置し、すでに文献に記載された、Ｔ１２５−Ａ２のＶＨ遺伝子と同じＶＨ３−３０ファミリーに属するＶＨ遺伝子と関連のあるリーダー配列から推定されるコンセンサスリーダー配列（かっこ内）を導入する、プライマーＡ２ＶＨ５；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
Ａ２ＶＨ５（配列番号１）：
５’−CTCTCC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGT)−３’；
Ｔ１２５−Ａ２の定常領域（ＣＨ）の５’に位置する、アンチセンスプライマーＧＳＰ２ＡＮＰ：
ＧＳＰ２ＡＮＰ（配列番号２）：５’−GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG−３’。
【００９０】
１．３−Ｔ１２５−Ａ２定常領域：ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いたＴ１２５−Ａ２ｃＤＮＡの増幅により、ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列を得る：
Ｔ１２５−Ａ２のＣＨ領域の５’に位置する、プライマーＧ１：
Ｇ１（配列番号３）：５’−CCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC−３’
ＣＨ配列の最初のＧ塩基が、ここではＣ（下線部）で置き換えられているため、クローニング後に１つのＥｃｏＲＩ部位が新たに生じる（段落２．１．１を参照）；
Ｔ１２５−Ａ２のＣＨの３’側に位置し、増幅配列の３’側に１つのＸｂａＩ部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＨ３’Ｘｂａ：
Ｈ３’Ｘｂａ（配列番号４）：５’−GAGAGGTCTAGACTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG−３’。
【００９１】
１．４−κＬ鎖：Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いて、Ｔ１２５−Ａ２ｃＤＮＡからＴ１２５−Ａ２（Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２配列）完全κ鎖を増幅する：
Ｔ１２５−Ａ２のＶＫ遺伝子リーダー領域の５’側に位置し、Ｔ１２５−Ａ２のＶＫ遺伝子と同じＶＫ１サブグループに属するＶＫ ＶＨ遺伝子の数種類のリーダー領域配列から推定されるコンセンサス配列（かっこ内）を導入する、プライマーＡ２ＶＫ３；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
Ａ２ＶＫ３（配列番号５）：
５’−CCTACC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCA)−３’；
κの３’側に位置し、１つのＥｃｏＲＩ制限部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＫＳＥ１：
ＫＳＥ１（配列番号６）：
５’−GGTGGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT−３’。
【００９２】
図１は、Ｔ１２５−Ａ２のＨ鎖およびＬ鎖増幅戦略の概略図を示す。
【００９３】
２−発現ベクターの構築
２．１−Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖の発現ベクター：Ｔ１２５−Ｈ２６
Ｔ１２５−Ｈ２６の構築については、図２に概要を示す。これは２段階で行われる：まず第一に、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導された発現ベクターＶ５１へのＴ１２５−Ａ２定常領域の挿入により中間ベクターＶ５１−ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２を構築し（図３）、その後、可変領域をＶ５１−ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２中にクローニングする。
【００９４】
２．１．１ Ｔ１２５−Ａ２定常領域のクローニング
増幅したＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列をリン酸化した後、ベクターＶ５１のＥｃｏＲＩ部位に挿入する（図３）。連結は、Ｖ５１のＥｃｏＲＩ接着末端を「平滑末端」にするためにそれらをクレノウポリメラーゼで予め処理した後に行う。
【００９５】
ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２の増幅に用いるプライマーＧ１によれば、それをＶ５１へ挿入した後に、ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２の５’に１つのＥｃｏＲＩ部位を新たに作製することが可能である。
【００９６】
２．１．２ Ｔ１２５−Ａ２可変領域のクローニング
増幅により得られたＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列をＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで消化し、その後、ベクターＶ５１−Ｇ１／Ｔ１２５−Ａ２のＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩ部位に挿入する。
【００９７】
２．２−Ｔ１２５−Ａ２ Ｌ鎖ベクター：Ｔ１２５−Ｋ４７
Ｔ１２５−Ｋ４７の構築については図４に示す。ＰＣＲにより得られたＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導された発現ベクターＶ４７のＥｃｏＲＩ部位に挿入する（図５）。
【００９８】
２．３−Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖およびＬ鎖ベクター：Ｔ１２５−ＩＧ２４
Ｔ１２５−ＩＧ２４の構築の概略は図６に示している。このベクターは、Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖およびκ鎖に対する２つの転写ユニットを含むものであり、Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２に対する転写ユニットを含むＴ１２５−Ｋ４７のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をＴ１２５−Ｈ２６のＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位に挿入することにより得られる。従って、Ｔ１２５−Ａ２のＨ鎖およびＬ鎖はＣＭＶプロモーターの制御下で発現される；その他のプロモーター：ＲＳＶ、ＩｇＧ Ｈ鎖プロモーター、ＭＭＬＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ、β−アクチンなども用いられる。
【００９９】
２．４−Ｔ１２５−Ａ２Ｈ鎖およびＬ鎖特異的リーダーベクター：Ｔ１２５−Ｌ
Ｓ４
κ鎖のコンセンサスリーダー配列を、「ＰＣＲ ５’−ＲＡＣＥ」（ｃＤＮＡ ５’末端の高速増幅）による産物の配列決定により予めその配列が決定されたＴ１２５−Ａ２のリーダー領域の実際の配列で置き換えた、Ｔ１２５−Ａ２発現用の第２のベクターも構築する。
【０１００】
このＴ１２５−ＬＳ４ベクターの構築については図７に記載する。これは２段階で行われる：まず第一に、Ｔ１２５−Ａ２ κ鎖発現用の新規ベクター、Ｔ１２５−ＫＬＳ１８を構築し、その後、２つのＨ鎖および改変されたＬ鎖転写ユニットを含む最終的な発現ベクター、Ｔ１２５−ＬＳ４を構成する。
【０１０１】
２．４．１ ベクターＴ１２５−ＫＬＳ１８の構築
ベクターＴ１２５−Ｋ４７のκコンセンサスリーダー配列５’部分が、以下のプライマーを用いて行われるＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅段階中において、Ｔ１２５の特異的なリーダー配列（ＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２）で置き換えられる：
リーダー領域の５’部分（かっこ内）を改変し、１つのＥｃｏＲＩ部位（下線部）とさらに１つのＫｏｚａｋ配列（かくがっこ内）も導入する、プライマーＡ２ＶＫ９：
Ａ２ＶＫ９：５’−CCTACCGAATTC[GCCGCCACC](ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC)−３’；
プライマーＫＳＥ１（段落１．４に記載）。
【０１０２】
その後、起源となるＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列を含むＴ１２５−Ｋ４７のＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩによって消化された新規配列ＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２で置き換えることによりベクターＴ１２５−ＫＬＳ１８が得られる。
【０１０３】
２．４．２ 最終ベクターＴ１２５−ＬＳ４の構築
改変されたＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２配列を含むＴ１２５−ＫＬＳ１８のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を、Ｔ１２５−Ｈ２６のＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位に挿入する。
【０１０４】
３−ＹＢ２／０株における抗Ｄ抗体の産生
３．１−遺伝子増幅を行わない場合
２種類の発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４およびＴ１２５−ＬＳ４を用いてＹＢ２／０細胞株（ラット骨髄腫、ＡＴＣＣ株 Ｎｏ．１６６２）をトランスフェクトした。エレクトロポレーション法によるトランスフェクションおよびＧ４１８存在下での形質転換体の選択（ｎｅｏ選択）後に数種のクローンを単離した。組換え抗Ｄ抗体の産生は、約０．２μｇ／１０６細胞／２４時間（Ｒ２７０のクローン３Ｂ２に対して得られた値）である。この組換え抗体のＡＤＣＣ活性は、ポリ−Ｄ対照のもの以上である（図１）。２種類の発現ベクターを用いて産生された抗体では、産生またはＡＤＣＣ活性レベルにおける有意な差はない。
【０１０５】
３．２−遺伝子増幅を行う場合
用いられる遺伝子増幅系は、メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性の形質転換体の選択に基づくものである。これには、予めＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）酵素をコードする転写ユニットを組換え抗体の発現ベクターに導入しておくことが必要である(SHITARI et al., 1994)。
【０１０６】
３．２．１ 発現ベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３の構築
図８で示すスキームは、ネズミｄｈｆｒ遺伝子を含むＴ１２５−Ａ２発現ベクターの構築について説明するものである。
第１のベクター（Ｖ６４）は、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導されたベクターであるＶ４３から、ＳＶ４０プロモーターの３’および合成ポリアデニル化配列の５’、ｎｅｏ遺伝子（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ断片）をネズミｄｈｆｒ遺伝子のｃＤＮＡ（プラスミドｐＭＴ２の増幅により得られる）で置き換えることにより構築した（図９）。その後、このベクターを改変し、ｄｈｆｒ転写ユニットの５’に１つのＣｌａＩ部位を作出する。次いで、ｄｈｆｒ転写ユニットを含むＣｌａＩ断片をＴ１２５−ＬＳ４のＣｌａＩ部位に挿入する。
【０１０７】
３．２．２ ＭＴＸ存在下での選択
第１の手段：
エレクトロポレーション法によりベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３でトランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、Ｇ４１８存在下で選択する。次いで、組換え抗体産生形質転換体を漸増量のＭＴＸ（２５ｎＭ〜２５μＭ）の存在下での選択に供する。遺伝子増幅プロセスを反映する組換え抗体産生は、ＭＴＸ選択段階中に進行する。さらに、ＭＴＸ耐性形質転換体を制限希釈によりクローニングする。得られた各クローンについての組換え抗体産生のレベルおよび安定性を測定する。遺伝子増幅後の抗Ｄ抗体産生力は約１３（＋／−７）μｇ／１０６細胞／２４時間である。
【０１０８】
第２の手段：
エレクトロポレーションによりベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３でトランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、Ｇ４１８存在下で選択する。最良の組換え抗体産生形質転換体を、制限希釈によりクローニングした後、漸増量のＭＴＸの存在下で選択する。遺伝子増幅プロセスを反映する各クローンによる産生は、ＭＴＸ選択段階中に進行する。得られた各ＭＴＸ耐性クローンについての組換え抗体産生のレベルおよび安定性を測定する。
【０１０９】
４−ＹＢ２／０で発現されたＴ１２５抗体の活性の測定
タンパク質Ａセファロース（Pharmacia）でのアフィニティークロマトグラフィー、さらに２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４での透析による精製後、ＥＬＩＳＡ法により抗体Ｔ１２５の濃度を測定する。次いで、上記のＡＤＣＣ法により、in vitroにおける生物学的活性を測定する。結果を図１に示す。
【０１１０】
実施例３：グリカン構造とＦｃγＲＩＩＩ依存活性との関係の実証：
１−デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＭ）存在下での細胞培養
いくつかの研究論文には、免疫グロブリンのグリコシル化およびそれらの生物学的活性に対する酵素阻害剤の影響について記載されている。ＡＤＣＣ活性の増大についてはROTHMAN et al., 1989によって報告されている。ここでの増大は抗体のその標的に対する親和性の増強によらないものである。ＤＭＭの添加によって起こるグリコシル化の改変は、ｌｅ Ｇｏｌｇｉに存在するα−１，２マンノシダーゼＩの阻害によるものである。これによりポリマンノシル化、非フコシル化構造がより大きな割合で生じることになる。
【０１１１】
種々の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体産生株をＤＭＭに接触させ、産生したモノクローナル抗体の機能的活性を、培養上清の形で、または精製後に評価した。
【０１１２】
細胞 (ヘテロハイブリッドまたはリンパ芽球様細胞)を１〜３×１０５細胞／ｍｌ間で接種し、１０％のＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地（Life Technologies）中、２０μｇ／ｍｌのＤＭＭ（Sigma, Boehringer）存在下で培養する。培地を３回交換した後、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、次いでＡＤＣＣにより培養上清をアッセイする。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＭ）存在下での培養によって、
ヒト−マウスハイブリドーマ Ｄ３１；
ヒトリンパ芽球様株 ＤＦ５；
トランスフェクトネズミ株 ＣＨＯ中のＴ１２５；
により産生される、これまでは活性が弱かった抗体のＡＤＣＣ結果が有意に向上する。
【０１１５】
ｃｌｏｉｄ Ｔ１２５＝Ｔ１２５ ＲＩ（３）（実施例１に記載）に由来し、培養の継続によりＡＤＣＣ活性が失われた抗体のＡＤＣＣ活性を、ＤＭＭの添加により回復させることができる。
【０１１６】
ヘテロハイブリドーマＦ６０（その産生については実施例１に記載）により産生される抗体の強い活性は、ＤＭＭ存在下での培養により改変されない。
【０１１７】
２−種々の細胞株による組換え抗Ｄ抗体の産生：
２．１−抗体ＤＦ５発現ベクターの作製：
抗体ＤＦ５のヌクレオチド配列、ＡＤＣＣアッセイにおける陰性対照を用いて、この抗体の数種類の株へのトランスフェクションとともに、抗体Ｔ１２５のトランスフェクションを調査する。
【０１１８】
組換え抗体Ｔ１２５−Ａ２で用いたものと同じ方法で抗体ＤＦ５をコードする配列を単離し、増幅する。
【０１１９】
対応するｃＤＮＡを、まず第１に、ＥＢＶ形質転換により得られた抗Ｄ抗体（ＩｇＧ Ｇ１／λ）産生クローン２ＭＤＦ５より抽出した全ＲＮＡから合成する。
【０１２０】
次いで、下記のプライマーを用いてこれらのｃＤＮＡからＨ鎖およびＬ鎖の増幅を行う。
【０１２１】
ＤＦ５のＨ鎖可変領域（ＶＨ／ＤＦ５配列）の増幅：
ＤＦ５のＶＨ遺伝子リーダー領域（かっこ内）（文献に記載された配列：L. Chouchane et al.）の５’に位置する、プライマーＤＦ５ＶＨ１；このプライマーは１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）および１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
ＤＦ５ＶＨ１（配列番号８）：
５’CTCTCC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTTTTGGTGG)−３’；
段落１．２（実施例２）にすでに記載した定常領域（ＣＨ）の５’に位置する、アンチセンスプライマーＧＳＰ２ＡＮＰ。
【０１２２】
ＤＦ５の定常領域ＣＨ（ＣＨ／ＤＦ５配列）の増幅：段落１．３（実施例２）ですでに記載したプライマーＧ１およびＨ３’Ｘｂａ。
【０１２３】
ＤＦ５のλＬ鎖の増幅（ＬＢＤ／ＤＦ５配列）：
ＤＦ５のＶＬ遺伝子リーダー領域の５’に位置し、２ＭＤＦ５のＶＬ遺伝子と同じＶＬ１サブグループに属するＶＬ遺伝子の数種類のリーダー領域配列から推定されるコンセンサス配列（かっこ内）を導入する、プライマーＤＦ５ＶＬＢＤ１；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
ＤＦ５ＶＬＢＤ１（配列番号９）：
５’CCTACC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCAC)−３’；
λの３’に配置され、１つのＥｃｏＲＩ制限部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＬＳＥ１：
ＬＳＥ１（配列番号１０）：
５’−GAGGAGGAATTCACTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT−３’。
【０１２４】
抗体Ｔ１２５−Ａ２発現ベクターと同じ構築スキームに従って、抗体ＤＦ５のＨ鎖（ＤＦ５−Ｈ３１）、Ｌ鎖（ＤＦ５−Ｌ１０）ならびにＨ鎖およびＬ鎖（ＤＦ５−ＩＧ１）の発現ベクターの構築を行う。起源となる総てのリーダー配列（増幅プライマーに導入される）はこれらの種々のベクターに保存される。
【０１２５】
２．２−種々の細胞株の抗体Ｔ１２５およびＤＦ５でのトランスフェクション
３種類の発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４、Ｔ１２５−ＬＳ４およびＤＦ５−ＩｇＧ１を用いて種々の株の細胞をトランスフェクトする：エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬を用いて安定または一時的トランスフェクションを行う。
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
Ｇ４１８存在下での形質転換体の選択（ｎｅｏ選択）後に数種のクローンを単離した。
【０１２８】
ヒト化モノクローナル抗体のエフェクター活性の改変は、ＣＨＯ、ＮＳＯおよびＹＢ２／０細胞株について、CROWE et al. (1992)により発現細胞との関連において説明されている。
【０１２９】
ここで得られた結果から、産生される抗体の機能的特性に関する発現細胞株の重要性が確認される。調べた細胞のうち、Ｖｅｒｏ、ＹＢ２／０およびＣＨＯ Ｌｅｃ−１株だけが、ＡＤＣＣアッセイにおいて強い細胞溶解性を有する組換え抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体を発現することが可能である（実施例１および表３を参照）。
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
３−グリカン構造の研究
ＡＤＣＣ活性を有する４種類の精製産物（Ｆ６０、およびＴ１２５から誘導される３種の組換えタンパク質）についての抗Ｒｈ−Ｄ抗体のグリカン構造の特徴づけを、本発明のＡＤＣＣアッセイにおいて不活性または非常に活性の弱い２種類の精製産物（Ｄ３１およびＤＦ５）との比較において行った。
【０１３２】
実際には、オリゴ糖を、特異的な酵素による脱グリコシル化、ＰＮＧアーゼＦにより、Ａｓｎ２９７においてタンパク質から分離する。このように放出されるオリゴ糖を蛍光団で標識し、分離し、さらに：
実側質量値と理論質量値とを比較するマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法によるグリカン構造の精密な特徴づけ；
イオン交換ＨＰＬＣ(GlycoSep C)によるシアリル化度の測定；
順相ＨＰＬＣ(GlycoSep N)による、親水性基準に従うオリゴ糖形態の分離および定量；
高速キャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖類の分離および定量、
を可能とする種々の補助的手法により同定する。
【０１３３】
１）活性形のグリカンの特徴づけ
検討の対象とした種々の活性形は、Ｆ６０、ならびにＴ１２５から誘導され、ＹＢ２／０で産生された３種類の組換え抗体、Ｒ２９０、Ｒ２９７およびＲ２７０である。質量分析法によるグリカン構造の精密な特徴づけ（図７）からは、これらの形が総て二アンテナ型のものであることがわかる。Ｒ２７０の場合では、多くのものが非ガラクトシル化（agalactosylated）、非フコシル化型である（Ｇ０、実験質量値 １４５９．３７ Ｄａ、図１）。その他に、少量の３種類の構造：非ガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ０Ｆ １６０５．４１ Ｄａ）、モノガラクトシル化、非フコシル化型（Ｇ１ １６２１．２６ Ｄａ）およびモノガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ１Ｆ １７６７．４３ Ｄａ）も同定される。これらの同じ４種の構造は、Ｒ２９０、Ｆ６０およびＲ２９７を特徴づけるものでもある（図１）。ＡＤＣＣにおいて活性であるこれらの４種類の抗体は、２分岐Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するオリゴ糖がないことによっても特徴づけられる。
【０１３４】
ＨＰＬＣおよびＨＰＣＥ−ＬＩＦの種々の手法によるグリカン構造の定量（表１）においては、質量により同定された４つの形態：Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１およびＧ１Ｆの存在が確認される。特に、組換え産物のシアリル化度が極めて低く（１〜９．４％）、これは酵素的脱シアリル化前後に得られた質量スペクトルの類似性により確認される。フコシル化度は３４〜５９％の範囲である。
【０１３５】
２）不活性形
検討の対象とした種々の不活性形は、Ｄ３１およびＤＦ５である。種々のクロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動法によるグリカン構造の定量（表１）によれば、これら２種類の抗体のシアリル化度が５０％に近く、さらにＤ３１およびＤＦ５各々のフコシル化度が８８および１００％であることがわかる。これらのシアリル化度およびフコシル化度は、活性形から得られるものよりも著しく高い。
【０１３６】
グリカン構造の特徴づけによれば、２種類の抗体の多くのものが二アンテナ型のモノシアリル化、ジガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ２Ｓ１Ｆ、表１）であることがわかる。Ｄ３１の質量分析法による特徴づけ（図７）によれば、中間形が主としてモノガラクトシル化、フコシル化型（１７６７．４３ ＤａのＧ１Ｆ）およびジガラクトシル化、フコシル化型（１９２９．６６ ＤａのＧ２Ｆ）であることが示される。
【０１３７】
不活性抗体ＤＦ５は、中間挿入物としてＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖の存在により特徴づけられる。特に、質量分析（図８）によれば、主要な中間形であるモノガラクトシル化、フコシル化、２分岐ＧｌｃＮＡｃ挿入型（Ｇ１ＦＢ、１８５１．０３ Ｄａ）の存在が示される。これに対し、検討の対象とした活性抗体においては、これらの構造形態は検出できないか、または少量しか存在しない。
【０１３８】
ＤＭＭを作用させた後のＤ３１のＡＤＣＣ活性は、１０％〜６０％の増加を示す。ＤＭＭ Ｄ３１のグリカン構造は、オリゴマンノース型（Ｍａｎ５、Ｍａｎ６およびＭａｎ７）が存在する点において、Ｄ３１のものとは異なっている（図９を参照）．
【０１３９】
３）結論
種々の活性抗体は、二アンテナ型および／またはオリゴマンノシド型のＮ−グリコシル化によりＡｓｎ２９７において改変されている。二アンテナ形態では、このことが、シアリル化度が非常に低く、フコシル化度が低く、ガラクトシル化度が低く、さらにＧｌｃＮＡｃが挿入されていない短鎖構造に関連している。
【０１４０】
［参考文献］
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＣＣ型のアッセイを用いてモノクローナル抗体を獲得および選択する方法に関するものであり、該抗体は、ＦｃγＩＩＩ型受容体を活性化することができる。本発明はまた、特定のグリカン構造を有するモノクローナル抗体、該抗体を産生する細胞、産生細胞を製造する方法、および該抗体を含んでなる医薬組成物または診断用試験に関するものである。本発明による抗Ｄ抗体は、Ｒｈ陰性個体のＲｈ同種免疫、特に新生児溶血症（ＨＤＮ）の防止に、または特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの用途に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリクローナル抗体を用いた受動免疫療法は１９７０年代以来行われてきた。しかし、ポリクローナル免疫グロブリンの製造にはいくつかの問題がある。フランスでは１９９７年にボランティアの免疫化が、そのような行為がもたらす倫理的問題のためにうち切られた。フランスでは、ヨーロッパと同じく、免疫ドナーの数が少なくて特定の抗体の十分な供給を確保することができず、例えば米国から高度免疫血漿を輸入する必要があると分かるに至ったのである。従って、この免疫グロブリンの不足により、ＨＤＮを防止するための出生前投与という構想は可能なものとならない。
【０００３】
様々な研究の結果、ボランティアドナーからの血漿を分画することにより得られるポリクローナル抗体の代わりとして、ヒトモノクローナル抗体が製造されるようになった。
【０００４】
モノクローナル抗体にはいくつかの利点がある：それらは妥当なコストで大量に得られ、各バッチの抗体は均質であり、それらは液体窒素中で低温保存されている同じ細胞株によって産生されるので種々のバッチの品質にも再現性がある。ウイルスの混入がないという点で製品の安全性を確保することもできる。
【０００５】
いくつかの刊行物には、免疫化されたドナーのＢ細胞からの、ＩｇＧクラスのヒト抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生する細胞株の作製について記載されている。Boylston et al. 1980; Koskimies 1980; Crawford et al. 1983; Doyle et al. 1985; Goossens et al. 1987; Kumpel et al. 1989(a)およびMcCann-Carter et al. 1993には、ＥＢＶウイルスで形質転換したＢリンパ球株の作製について記載されている。Melamed et al. 1985; Thompson et al. 1986 and McCann-Carter et al. 1993は、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ネズミ骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリドーマに関するものである。Goossens et al., 1987は、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ヒト骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリッドに関するものである。Bron et al., 1984およびFoung et al., 1987には、Ｂリンパ球（ＥＢＶで形質転換されたもの）×ヒト−マウスヘテロ骨髄腫の融合から得られるヘテロハイブリッドが記載されており、最後に、Edelman et al., 1997は、バキュロウイルス系を用いて抗Ｒｈ（Ｄ）をコードする遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞に関するものである。
【０００６】
このようなモノクローナル抗体およびそれらを分泌する株に関する特許および特許出願としては、ＥＰ５７６０９３号（AETS (FR), Biotest Pharma GmbH (Germany)；新生児溶血症の予防用組成物は、ＲｈＤ抗原に対して活性な、サブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ３の２種のヒトモノクローナル抗体を含んでなる）、ＲＵ２０９４４６２号、ＷＯ８５／０２４１３号（Board of Trustees of the Leland Stanford Jr. University，Ｒｈ（Ｄ）抗原に対するヒトモノクローナル抗体およびその使用）、ＧＢ８６−１０１０６号（Central Blood Laboratories Authority，ＲｈＤ抗原に対する比とモノクローナル抗体の製造のためのヘテロハイブリドーマの作出）、ＥＰ０２５１４４０号（Central Blood Laboratories Authority，ヒト抗ＲｈＤを産生するヘテロハイブリドーマ）、ＷＯ８９／０２４４２号、ＷＯ８９／０２６００号およびＷＯ８９／０２４４４３号（Central Blood Laboratories Authority，ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体）、ＷＯ８６／０７７４０号（Institut Pasteur, Protein Performance SA, Paris, FR，ヒト抗ＲｈＤモノクローナル抗体からの組換えモノクローナル抗体の作製、昆虫細胞におけるその製造およびその使用）、ＪＰ８８−５０７１０号（International Reagents Corp., Japan，血液型物質Ｒｈ（Ｄ）因子の決定のための試薬）、ＪＰ８３−２４８８６５号（Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Japan，Ｒｈ（Ｄ）陽性抗原に対するモノクローナル抗体の製造）、ＣＡ８２−４０６０３３号（Queens University at Kingston，ヒトモノクローナル抗体）、およびＧＢ８２２６５１３号（University College London，ＲｈＤ抗原に対するヒトモノクローナル抗体）が挙げられる。
【０００７】
モノクローナル抗体の使用には、ポリクローナル抗体の集合物の使用に比べて多くの利点があるが、他方で、有効なモノクローナル抗体を得るのは困難であると考えられる。実際に、本発明に関して、得られた免疫グロブリンのＦｃγ断片は、エフェクター細胞（マクロファージ、ＴＨリンパ球およびＮＫ）の受容体と相互作用してこれを活性化し得るためには、極めて特異な特性を持っていなければならないことが分かった。
【０００８】
特定のＧ免疫グロブリンの生物学的活性は、その分子上、特にそのＦｃ成分上に存在するオリゴ糖の構造に依存する。総てのヒトおよびネズミサブクラスのＩｇＧ分子は、各Ｈ鎖のＣＨ２ドメインに結合した（ヒトＩｇＧについては残基Ａｓｎ２９７において）Ｎ−オリゴ糖を有する。このグリカン含有残基がエフェクター分子（Ｆｃ受容体および補体）と相互作用する抗体の能力に及ぼす影響はすでに証明されている。ツニカマイシンの存在下で培養することによりヒトＩｇＧ１のグリコシル化を阻害すると、例えば、単球およびマクロファージに存在するＥｃγＲＩ受容体に対するこの抗体の親和性が５０倍低下する（Leatherbarrow et al., 1985）。非グリコシル化ＩｇＧ３はＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ受容体を介してＡＤＣＣ型の細胞溶解を誘導することはできないと報告されていることから（Lund et al., 1990）、ＦｃγＩＩＩ受容体への結合もまた、ＩｇＧにおける炭水化物の欠損によって影響を受ける。
【０００９】
しかし、これらのグリカン含有残基の存在が必要なこと以上に、エフェクター機能を誘導する能力の差を生じ得るそれらの構造の不均一性の方がより厳密なものである。個体によって異なるガラクトシル化プロフィール（ヒト血清ＩｇＧ１）が観察されている。これらの違いは、おそらく、これらの個体の細胞クローン間のガラクトシルトランスフェラーゼおよびその他の酵素の活性の違いを反映している（Jefferis et al., 1990）。翻訳後プロセスのこの通常の不均一性は種々のグリコ型を作り出すが（モノクローナル抗体の場合でさえ）、慢性関節リウマチまたはクローン病など、ある種の病状に関連した非定型構造をもたらすことがあり、これらについては、相当な割合の非ガラクトシル化残基（agalactosylated residues）が示されている(Parekh et al., 1985)。
【００１０】
精製分子のグリコシル化プロフィールは複数の働きの結果であり、そのいくつかのパラメーターはすでに研究されている。ＩｇＧのタンパク質主鎖、特に末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびマンノースα−１，６アームのガラクトース残基と接触しているアミノ酸（ＩｇＧのａａ２４６および２５８）により、種々のイソ型のネズミおよびキメラＩｇＧで行った研究で示されているように（Lund et al., 1993）、優先的な構造（ガラクトシル化）の存在を説明することができる。
【００１１】
また、観察された違いによれば、その分子を作製するのに用いた種および細胞タイプに関連する特異性も明らかになる。このように、ヒトＩｇＧのＮ−グリカンの通常の構造により、二等分の位置にＧｌｃＮＡｃ残基を有する二アンテナ型がかなりの割合であることが明らかとなり、これはネズミ細胞によって産生される抗体には存在しない構造である。同様に、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）株により合成されるシアル酸残基はもっぱらα−２，３型のものであるが、ネズミおよびヒト細胞を用いた場合にはそれらはα−２，３およびα−２，６型のものである（Yu Ip et al., 1994）。哺乳類由来のもの以外の発現系における免疫グロブリン産生では、昆虫細胞または植物によって産生されるキシロース残基の存在など、はるかに重要な改変が導入されることがある（Ma et al., 1995）。
【００１２】
細胞培養条件（培地の組成、細胞密度、ｐＨ、酸素供給等）などのその他の要因は、細胞におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性、その結果として分子のグリカン構造に影響すると考えられる（Monica et al., 1993; Kumpel et al., 1994 b）。
【００１３】
今般、本発明に関して、短い鎖、低度のシアリル化、および中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを有する二アンテナ型の構造は、モノクローナル抗体に強いＡＤＣＣ活性を付与するグリカン構造の共通の特徴であることが分かっている。ＦｃγＲＩＩＩを介してエフェクター細胞を活性化し得るこれらの抗体、特に抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を製造する方法もまた開発されている。
【００１４】
血液型抗原は、赤血球の表面で発現する膜結合分子の性質によっていくつかの系に分類される。Ｒｈ（Rhesus）系はＤ、Ｃ、ｃ、Ｅおよびｅの５分子または５抗原を含む（ISSITT, 1988）。これらの分子のうち、Ｄ抗原は、最も免疫原性が高い、すなわち、Ｒｈ−Ｄ陽性の赤血球がＲｈ陰性個体に輸血された場合に抗Ｄ抗体の産生を誘導し得ることから、最も重要である。
【００１５】
Ｄ抗原は通常コーカサス人の８５％で発現し、これらの人々は「Ｒｈ陽性」と呼ばれ、従って、これらの人々の２５％はＲｈ陰性、すなわち、彼らの赤血球はＤ抗原を示さない。Ｄ抗原の発現においては、低い抗原密度（弱いＤ抗原により示される）または異なるかもしくは部分的な抗原性（部分的Ｄ抗原により示される）のいずれかと関連し得るある種の変異体が存在する。弱いＤ特性は、それ自体は正常な抗原であるが、赤血球当たりのその部位の数が多少なりとも有意に少ないことにより特徴づけられ、この特徴はメンデルの法則に従って伝達される。部分的なＤ表現型は、抗Ｄ血清抗体を有するＲｈ−Ｄ陽性個体において見出されており、よって、これらの部分的なＤ抗原はモザイク部分のみを有するものと特徴づけることができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いて行った研究により、Ｄ抗原を構成する少なくとも８つのエピトープを有する部分的Ｄ抗原の７つのカテゴリーを定義することが可能となった（LOMAS et al., 1989; TIPETT 1988）。
【００１６】
抗ＲｈＤ抗体の重要性は、新生児溶血症（ＨＤＮ）をもたらすメカニズムの発見をもって明らかとなった。これは、胎盤関門を渡り得る母親の抗ＲｈＤ抗体の形成を司る胎児母親間の血液型不適合が存在する場合に、ある胎児またはある新生児で見られる種々の病状に相当する。実際、Ｒｈ陰性の母親へ送られる胎児のＲｈ陽性の赤血球は、抗Ｄ抗体の形成をもたらし得る。
【００１７】
Ｒｈ陰性の母親の免疫感作後は、ＩｇＧクラス抗Ｄ抗体は胎盤関門を通過し、胎児のＲｈ陽性赤血球に結合し得る。この結合は、それらの表面Ｆｃ受容体を介して免疫コンピテント細胞の活性化をもたらし、やがて増感した胎児赤血球の溶血を引き起こす。反応の強さに応じて、ＨＤＮには数段階の重篤度が見られる。
【００１８】
ＨＤＮ診断は出生の前後で行うことができる。出生前診断は、いくつかの免疫血液学的技術を用いて、母親における抗Ｄ抗体レベルの上昇に基づいて行なわれる。分娩後診断は、臍帯血サンプルを用いて以下のパラメーターを分析することにより行なうことができる：胎児および父親の血液型の決定、抗Ｄ抗体の探査、ヘモグロビンおよびビリルビンのアッセイ。
【００１９】
今のところ、ＨＤＮの予防処置は、Ｒｈ陽性児を出産したＲｈ陰性の血液型を有する総ての女性に対して体系的に、ヒト抗Ｄ免疫グロブリン注射によりなされている。最初の実際の免疫予防の試みは１９６４年に始まった。効果的な防止のためには、免疫グロブリンは免疫感作前、すなわち、出生後７２時間以内に注射しなければならず、抗体量は十分なものでなければならない（Ｒｈプラス赤血球０．５ｍｌにつき抗Ｄ抗体１０μｇ）。
数種の抗Ｄモノクローナル抗体が治療上の評価を受けている：ＢＲＯＳＳＡＲＤ／ＦＮＴＳ １９９０（非公開）；ＴＨＯＭＳＯＮ／ＩＢＧＲＬ １９９０；ＫＵＭＰＥＬ／ＩＢＧＲＬ １９９４；ＢＥＬＫＩＮＡ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｃｏｗ， １９９６；ＢＩＯＴＥＳＴ／ＬＦＢ １９９７（非公開）。Ｒｈ（Ｄ）陽性赤血球のクリアランスの誘導における抗体の臨床効果は、Ｒｈ（Ｄ）陰性のボランティアにおいて評価された。ある一つのＩｇＧ１抗体は抗ポリクローナル免疫グロブリンの場合と同等の効果を示したが、一部の患者においてのみであった（KUMPEL et al., 1995）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Boylston, J.M., Gardner, B., Anderson, R.L., and Hughes-Jones, N.C. Production of human IgM anti D in tissue culture by EB virus-transformed lymphocytes. Scand. J. Immunol. 12: 355-358 (1980).
【非特許文献２】Bron, D., Feinberg, M.B., Teng, N.N.H. and Kaplan, H.S. Production of Human Monoclonal IgG Antibodies against Rhesus (D) Antigen. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 3214-3217 (1984).
【非特許文献３】Chouchane, L., Van Spronsen, A., Breyer, J., Guglielmi, P., and Strosberg, AD. Molecular characterization of a human anti-Rh(D) antibody with a DII segment encoded by a germ-line sequence. Eur. J. Biochem. 1; 207(3): 1115-1121 (1992).
【非特許文献４】Crawford, D.H., Barlow, M.J., Harrison, J.F., Winger, L. and Huehns, E.R. Production of human monoclonal antibody to rhesus D antigen. Lancet, i: 386-388 (1983).
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【非特許文献２９】Yu, I.P.C., Miller, W.J., Silberklang, M., Mark, G.E., Ellis, R.W., Huang, L., Glushka, J., Van Halbeek, H., Zhu, J. and Alhadeff, J.A. Structural characterization of the N Glycans of a humanized anti-CD18 murine immunoglobulin G. Arch. Biochem. Biophys. 308, 387-399 (1994).
【非特許文献３０】Zupanska, B., Thompson, E., Brojer, E. and Merry, A.H. Phagocytosis of Erythrocytes Sensitized with Known Amounts of IgG1 and IgG3 anti-Rh antibodies. Vox Sang. 53: 96-101 (1987).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、上記の問題に応えるモノクローナル抗体、すなわち、その抗体に特異的なＡＤＣＣ型のアッセイを用いて選択される抗体および／または良好な効果を得るために必要なグリカン構造を有する抗体の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の説明
従って、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化し得るモノクローナル抗体を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）ハイブリドーマ、特にヘテロハイブリドーマ、および該抗体をコードする遺伝子を含んでなるベクターでトランスフェクトした動物またはヒト細胞株から選択される細胞株に由来する種々のクローンから得られたモノクローナル抗体を精製する工程、
ｂ）工程ａ）において得られた各抗体を、
該抗体の標的細胞、
ＦｃγＲＩＩＩ発現細胞を含んでなるエフェクター細胞、
多価ＩｇＧ
を含んでなる別々の反応混合物に添加する工程、
ｃ）標的細胞の細胞溶解の百分率を決定し、エフェクター細胞を活性化して標的細胞の有意な細胞溶解を生じさせる（ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣ活性）モノクローナル抗体を選択する工程、
を含んでなるものに関する。
【００２３】
これらのクローンは、ヒトＢリンパ球（免疫化された個体に由来）と、ネズミ、ヒト、またはヘテロハイブリッド骨髄腫細胞、特にＫ６Ｈ６−Ｂ５骨髄腫（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１８２３）との融合によって得られたヘテロハイブリッド細胞株、あるいは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンをコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされた動物またはヒト細胞株（該株は、特に、ＣＨＯ−Ｋ、ＣＨＯ−Ｌｅｃ１０、ＣＨＯ Ｌｅｃ−１、ＣＨＯ Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−、Ｗｉｌ−２、Ｊｕｒｋａｔ、Ｖｅｒｏ、Ｍｏｌｔ−４、ＣＯＳ−７、２９３−ＨＥＫ、ＹＢ２／０、ＢＨＫ、Ｋ６Ｈ６、ＮＳＯ、ＳＰ２／０−Ａｇ １４およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３株から選択され得る）に由来するものとすることができる。
【００２４】
多価ＩｇＧは、ＦｃγＲＩＩＩを介するエフェクター細胞の溶解機構を阻害するために用いられる。
【００２５】
本発明による方法では、６０％、７０％、または８０％を超える、好ましくは９０％を超える、ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣレベルを示す抗体が選択される。
【００２６】
標的細胞はパパインで処理した赤血球であってもよい。この場合、一つのウェル当たりに、
約２００ｎｇ／ｍｌの精製モノクローナル抗体１００μｌ、
パパイン処理された赤血球２５μｌ、すなわち、約１×１０６細胞、
エフェクター細胞２５μｌ、すなわち、約２×１０６細胞、および
濃度１〜２０ｍｇ／ｍｌの多価ＩｇＧ、特にＴＥＧＥＬＩＮＥ（商標）(LFB, France)、５０μｌ
が投入される。
【００２７】
従って、標的細胞の細胞溶解量を、ＮＨ４Ｃｌなどの化学化合物およびin vivoで活性な参照抗体からなる２種の陽性対照、ならびにin vivoで不活性な抗体からなる陰性対照と比較することができる。
【００２８】
また、市販のポリクローナル抗体を陽性対照として用い、in vivoクリアランスを誘導することができないモノクローナル抗体を陰性対照として用いることができる。
【００２９】
有利には、本発明による方法により、上述のような抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体の製造が可能とされる。そして、ＲｈＤ赤血球が標的細胞として用いられる。
【００３０】
従って、本発明は、in vitroにおける生物学的活性のアッセイの開発に基づくものであり、該アッセイでは、測定した活性は、Ｒｈ（Ｄ）陰性のボランティアにおけるＲｈ（Ｄ）陽性赤血球のクリアランスを誘導するそれらの能力について臨床的観点からすでに評価したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のin vivoにおける生物学的活性と相関する。このアッセイにより、ＦｃγＩＩＩ型受容体（ＣＤ１６）によって本質的に誘導される抗体依存性細胞溶解活性＝ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）の評価が可能となる（なお、ＦｃγＩ型受容体（ＣＤ６１）はヒトＩｇＧ免疫グロブリン（治療用多価ＩｇＧの形態にある）の付加によって飽和される）。このＡＤＣＣアッセイのＦｃγＲＩＩＩ特異性は、抗ＦｃγＲＩＩＩモノクローナル抗体の存在下での阻害によって確認された（図６参照）。健常者由来の単核細胞は、in vivoにおける生理条件に近いエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で、エフェクター細胞として使用される。これらの条件下では、ポリクローナル免疫グロブリンおよびin vivoで効果がない抗Ｄモノクローナル抗体(抗体ＤＦ５， Goossens et al., 1987、および抗体ＡＤ１＋ＡＤ３， ＦＲ９２／０７８９３号 ＬＦＢ／ＢｉｏｔｅｓｔおよびＦＯＧ−１，ＧＢ２１８９５０６号）の細胞溶解活性は、それぞれ「強い」および「弱い」である。
【００３１】
従って、本発明による抗体の選択は、このＡＤＣＣ型アッセイにおいてそれらの生物学的活性を評価することにより行った（実施例１参照）。
【００３２】
他の態様によれば、本発明は、上記の方法を用いて得られる抗体に関するものであり、該抗体は、参照ポリクローナル抗体に対して６０％、７０％、または８０％を超える、好ましくは９０％を超える、ＦｃγＲＩＩＩ型ＡＤＣＣレベルを示す。本発明によるモノクローナル抗体は、所定の抗原に対するものであり、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化して、同じ抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％、７０％、８０％を超える、好ましくは９０％を超える細胞溶解を生じさせる。有利には、該モノクローナル抗体は、ＲｈＤに対するものとされる。それらは、好ましくは、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６６２）またはＣＨＯ Ｌｅｃ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７３５）株に由来するクローンによって産生され、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３クラスに属するものとすることができる
【００３３】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＩ依存性エフェクター活性を付与する特定のグリカン構造を有する抗体に関する。このような抗体は上述の方法を用いて得ることができ、それらのＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、短い鎖と低度のシアリル化を伴った二アンテナ型のグリカン構造を有する。好ましくは、それらのグリカン構造は、中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを表す。
【００３４】
このような抗体は、より特定的には以下の形態から選択される：
【化１】
【００３５】
従って、本発明は、そのＦｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）において、短い鎖、低度のシアリル化、および末端結合点を有する中間挿入物ではないマンノースおよびＧｌｃＮＡｃを伴った二アンテナ型のグリカン構造を有するモノクローナル抗体に関する。該抗体は、所定の抗原に対するものであり、ＦｃγＲＩＩＩを発現するエフェクター細胞を活性化して、同じ抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％、７０％、８０％を超える、好ましくは９０％を超える細胞溶解を生じさせる。
【００３６】
より特定的には、本発明は、シアル酸含量が２５％、２０％、１５％または１０％、好ましくは５％、４％、３％または２％未満である、上記で定義される抗体および該抗体を含んでなる組成物に関する。
【００３７】
同様に、本発明は、フコース含量が６５％、６０％、５０％、４０％または３０％未満である、上記で定義される抗体および該抗体を含んでなる組成物に関する。好ましくは、フコース含量は２０％〜４５％、または２５％〜４０％である。
【００３８】
本発明による特に有効な組成物は、例えば、Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型については６０％を超える、好ましくは８０％を超える含量を含むものとされ、ここで、Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型は５０％未満、好ましくは３０％未満であると考えられる。
【００３９】
【表１】
【００４０】
ＦｃγＲＩＩＩを特異的にターゲッティングする別法として、「高マンノース」型の抗体を製造することがある。
【００４１】
他の態様によれば、本発明は、上記抗体を産生する細胞に関する。これは、ハイブリドーマ、特にＫ６Ｈ６−Ｂ５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１８２３）を融合相手として得られたヘテロハイブリドーマ、または該抗体をコードする遺伝子を含んでなるベクターでトランスフェクトされた動物またはヒト細胞、特にＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ８１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６６２）またはＣＨＯ Ｌｅｃ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１７３５）株に由来する細胞とすることができる。これらの細胞は、本発明による方法を用いて選択される細胞株に相当し、該細胞は上記の特徴を有する抗体を産生する。
【００４２】
本発明による好ましい抗体は、ＦｃγＲＩＩＩ陽性エフェクター細胞を用いるＡＤＣＣアッセイにおいて著しい生物学的活性（抗Ｒｈ（Ｄ）参照ポリクローナル抗体より高いかまたは同等）を示す。ＦｃγＲＩＩＩ受容体を活性化する（結合後）その能力は、細胞内カルシウム流量、活性化シグナル伝達分子のリン酸化、または化学メディエーターの放出の改変を実証するin vitroモデルにおいて確認される。
【００４３】
これらの特性は、抗体のＦｃ成分のＮ−グリコシル化部位におけるオリゴ糖の特定の構造：例えば、短い鎖の存在、低度のガラクトシル化、少ないシアリル化、中間挿入物ではない末端マンノースおよび／または末端ＧｌｃＮＡｃを有すること、と関連している。
【００４４】
この抗体は、ＨＤＮの防止、Ｒｈ（Ｄ）陽性個体のＩＴＰの治療、および抗Ｄポリクローナル免疫グロブリンの使用が関連するその他のいずれかの用途などの治療用途を有する。
【００４５】
本発明による好ましい抗体はまた、抗Ｒｈ（Ｄ）以外の特異性（例えば、抗癌細胞）も有し得る。それは上記の特性（ＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合／その活性化のメカニズム、オリゴ糖の特定の構造に依存する機能活性）を有することができ、癌の、あるいはその作用メカニズムがＦｃγＲＩＩＩ受容体を介して機能する活性に相当するモノクローナル抗体を用いて治療的または防止的処置が行われる他のいずれかの病状の免疫療法に用いることができる。
【００４６】
本発明の他の態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物、および医薬品の製造のための該抗体の使用に関する。
【００４７】
好ましくは、本発明は、Ｒｈ陰性個体のＲｈ同種異系免疫の防止を目的とする医薬品を製造するための、上記の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の使用に関する。in vivoにおける抗Ｄ免疫グロブリンの作用の様式は、その抗体がＲｈ（Ｄ）陽性赤血球のＤ抗原と特異的に結合した後、本質的に脾臓において、これらの赤血球が循環系から排除されるというものである。このクリアランスは、その個体の一次免疫応答の抑制の動的メカニズムに関連していることから、免疫化を防止する。
【００４８】
従って、本発明による抗体は、Ｒｈ陽性児の出産直後のＲｈ陰性の母親の同種異系免疫を予防するため、および次の妊娠時の新生児溶血症（ＨＤＮ）を予防するため、ＲｈＤ不適合の状況下での流産時または子宮外妊娠時、あるいはＲｈＤ不適合の状況下での羊水穿刺、絨毛生検または外傷性産科操作による経胎盤出血時において、予防的に使用できる。
【００４９】
さらに、本発明による抗体は、血液または不安定血液誘導体によるＲｈ不適合輸血の場合にも使用できる。
【００５０】
本発明はまた、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）における治療的使用を目的とする医薬品を製造するための、本発明による抗体の使用に関する。
【００５１】
本発明による抗体はまた、免疫療法による癌の治療、またはウイルス性もしくは細菌性病原体によって引き起こされる感染症の治療を目的とする医薬品を製造するためにも使用できる。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、特に診断のための該抗体の使用に関する。従って、本発明は、上記の抗体を含んでなるキットに関する。
以降の説明においては、後述する図面の説明を参照するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｆ６０およびＴ１２５ ＹＢ２／０（Ｒ２７０）のＡＤＣＣ評価。この図面は１００および５００μｇ／ウェルのＴＥＧＥＬＩＮＥ（商標）（LFB, France）存在下で抗体濃度の関数として得られた細胞溶解百分率を表す。本発明による抗体Ｆ６０およびＴ１２５について高い細胞溶解百分率が得られる。
【図２】受容体（ＦｃγＲＩＩＩ）への抗Ｄ結合。本発明による抗体Ｆ６０およびＴ１２５について高い結合指数が得られる。
【図３】Ｔ１２５のＨ鎖を発現させるための発現ベクターＴ１２５−Ｈ２６の構築。
【図４】Ｔ１２５のＬ鎖を発現させるための発現ベクターＴ１２５−Ｋ４７の構築。
【図５】抗体Ｔ１２５の全体を発現させるための発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４の構築。
【図６】抗ＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の存在下でのＡＤＣＣ阻害。ＡＤＣＣアッセイは、市販の抗ＣＤ１６ ３Ｇ８（ＴＥＢＵ）（その作用はエフェクター細胞に存在するＦｃＲＩＩＩ受容体を遮断することである）の存在下で第３．３節に記載の手順に従って確立する。３Ｇ８の最終濃度は５μｇ／ウェル（２５μｇ／ｍｌ）である。３Ｇ８の不在下で並行して対照実験を行う。試験する３種の抗体はポリ−Ｄ ＷｉｎＲｈｏ、実施例１に記載の方法に従って得られた抗体Ｆ６０（Ｐｆ１５５ ９９／４７）、および実施例２に記載の方法に従って得られたＲ２９７（Ｐｆ２１０ ０１／７６）である。結果は次の通りである。３Ｇ８の存在下で阻害が見られるが、これは試験した３種の抗体によって誘導されたＡＤＣＣは主としてＦｃＲＩＩＩ依存性であることを示す。ポリ−Ｄ ＷｉｎＲｈｏの存在下では若干強い阻害が見られる（Ｆ６０およびＲ２９７の阻害がそれぞれ６８％および６１％であるのに対して、８３％）。この違いは、ポリ−Ｄにおける、Ｉ型受容体（ＦＣＲＩまたはＣＤ６４）を阻害し、従って、抗ＣＤ１６と相乗的に作用する非抗ＤヒトＩｇＧの存在によるものである可能性がある。
【図７】質量分析法（ＭＳ）による抗Ｄグリカンの特徴づけ。
【図８】Ｒ２９０およびＤＦ５のＭＳスペクトルの比較。
【図９】ＭＳによる抗Ｄ Ｄ３１ＤＭＭのグリコシル化の実験。
【実施例】
【００５４】
実施例１：抗Ｒｈ（Ｄ）抗体を産生するヘテロハイブリッド細胞株の樹立
１−リンパ芽球様およびヘテロハイブリッドクローンの作製：
１．１−リンパ球供給源：
Ｂリンパ球ドナーは、第３３節で記載したＡＤＣＣ活性アッセイでのそれらの抗Ｒｈ（Ｄ）血清抗体の活性に基づき、プラスマフェレーシスを受けている抗Ｒｈ（Ｄ）ドナーから選択する。１９９８年の全血献血後、「バフィーコート」画分（白血球濃縮物）を回収した。
【００５５】
１．２−ドナー由来のＢリンパ球の不死化
末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐｌｕｓ（Pharmacia）での遠心分離によりその他の成分と分離する。次いで、それらを２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＩＭＤＭで１０６細胞／ｍｌまで希釈し、そこに２０％ のＢ９５−８系（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ１６１２）の培地上清、０．１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡ(Sandoz)、５０μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン(Life Technologies)を加え、丸底９６ウェルプレートまたは２４ウェルプレート(P24 Greiner)に分配する。その後、これらを３７℃、７％ＣＯ２のインキュベーター中に置く。３週間後、ＡＤＣＣによって抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在を測定する。
【００５６】
陽性のＰ２４プレートウェルの１６マイクロウェルの各々を、新しいＰ２４ウェルに移す。培養１０〜１５日後にこの濃縮を繰り返し、各マイクロウェルをＰ９６、次いでＰ２４で増幅させる。
【００５７】
陽性のＰ９６ウェルを集め、平底Ｐ２４(Nunc)で増幅させる。２〜３日の培養後、ＡＤＣＣにより抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在を調べる。
【００５８】
１．３−免疫ロゼット法（ＩＲ）による濃縮：
１以上のＰ２４ウェルから誘導された細胞を、パパイン処理したＲｈ（Ｄ）陽性の赤血球によるロゼット形成および分離により、特定の細胞を濃縮する：０．９％ＮａＣｌで洗浄した１容量の赤血球を１容量のパパイン(Merck)溶液、１／１０００ｔｈ（ｍ／ｖ）に加えて３７℃で１０分間インキュベートした後 、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。次いで、細胞をハンクス溶液で１回洗浄し、ＦＣＳに懸濁し、パパイン処理した赤血球と１細胞対３３赤血球の割合で混合した。この混合物を円錐底遠心チューブに入れ、８０ｇで５分間遠心分離し、さらに溶解しかけた氷中にて１時間インキュベートする。次いで、混合物を慎重に攪拌し、９００ｇで２０分間の分離によりＦｉｃｏｌｌをチューブの底に沈殿させる。ロゼットを含むペレットをＮＨ４Ｃｌ溶液で５分間溶血させ、照射済ヒト単核細胞を含有するＰ２４において細胞を再び培養する。約１週間後、ＣＥＬＡ（段落３．２）およびＡＤＣＣアッセイにより優れた活性を有する抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の存在について上清を評価する。それまでのサイクルに比べてロゼット形成細胞の割合がかなり高まる場合には、さらなる濃縮サイクルを行う。
【００５９】
１．４−リンパ芽球様細胞のクローニング：
ＩＲ濃縮細胞を、照射済ヒト単核細胞を含有する丸底９６ウェルプレートに、ウェル当たり５および０．５細胞で分配する。約４週間の培養後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６０】
１．５−ヘテロ融合物：
有利なＡＤＣＣ活性を示すＥＢＶ形質転換細胞のクローニングウェルを培養増幅した後、標準ＰＥＧ技術によりヘテロ骨髄腫Ｋ６Ｈ６−Ｂ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８２３）と融合する。融合後、細胞を２×１０４細胞／ウェルの割合で、アミノプテリンおよびウアバイン(Sigma)を含有する選択培地中にネズミ腹膜内マクロファージを含有する平底Ｐ９６に分配する。
【００６１】
３〜４週間の培養後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６２】
１．６−ヘテロハイブリドーマのクローニング：
制限希釈によるクローニングを、平底Ｐ９６で４、２および１細胞／ウェルにおいて行う。２週間後、顕微鏡でウェルの様子を調べて単一クローンを同定し、その後、培地を新しいものに交換する。約２週間後、ＡＤＣＣアッセイにより細胞凝集塊を含むウェルの上清を評価する。
【００６３】
２−選択されたクローンの履歴：
２．１−ＩｇＧ１を産生するクローン
ドナーｄ１３細胞のＥＢＶ形質転換により１つのウェル（Ｔ１２５ ２Ａ２と呼ぶ）の選択が可能になり、それを用いて、濃縮２回、ＩＲ３回、さらに５細胞／ウェルでのクローニングを逐次行い、２種類のクローンを得た：
１）Ｔ１２５ ２Ａ２（５／１）Ａ２（これからＤＮＡを抽出して組換えベクターを作製する）；
２）Ｔ１２５（５／１）Ａ２（これをＫ６Ｈ６−Ｂ５と融合してＦ６０ ２Ｆ６を取得し、次いで、５ラウンドのクローニング後にＦ６０ ２Ｆ６（５）４Ｃ４（ライブラリーを準備する前の細胞ストックの構成のために選択されるクローン）を得る）。
【００６４】
これはκＬ鎖を有するＩｇＧ１である。
【００６５】
【表２】
【００６６】
２．２−ＩｇＧ３産生クローン
ＩｇＧ1イソ型抗体の調製に用いるものと同じ方法によりＩｇＧ３を産生する株を作製した。細胞起源は所定のドナーの全血献血から得られるものであり、そこから「バフィーコート」画分（白血球濃縮物）を回収した。
【００６７】
これはκＬ鎖を有するＩｇＧ３である。
【００６８】
【表３】
【００６９】
３−抗Ｒｈ（Ｄ）抗体の評価方法：
タンパク質Ａセファロース（Pharmacia）でのアフィニティークロマトグラフィー、さらに２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４での透析による精製後、ＥＬＩＳＡ法により抗体Ｔ１２５の濃度を測定する。次いで、ＡＤＣＣ法によりin vitroにおける生物学的活性を測定する。
【００７０】
３．１−ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＧレベルおよびイソ型の測定：
・全ＩｇＧ
被覆：０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）中、２μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ(Calbiochem)において４℃で一晩。飽和：希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）、周囲温度で１時間。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。希釈バッファーで約１００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および１００ｎｇ／ｍｌに予め希釈したＬＦＢ多価ヒトＩｇＧで構成される制御範囲の希釈。周囲温度で２時間のインキュベーション。結合：１／５ ０００に希釈した抗ＩｇＧ(Diagnostic Pasteur)、周囲温度で２時間。基質：過ホウ酸ナトリウムを含有するリン酸クエン酸バッファー(Sigma)中、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)、暗室で１０分間。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る。
【００７１】
・κ鎖のアッセイ 被覆：０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．５）中、５μｇ／ｍｌの抗κ(Caltag Lab)において４℃で一晩。飽和：希釈バッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）、周囲温度で１時間。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０。希釈バッファーで約１００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および１００ｎｇ／ｍｌに予め希釈したＬＦＢモノクローナル抗体ＡＤ３Ｔ１（κ／γ３）で構成される制御範囲の希釈。周囲温度で２時間のインキュベーション。結合：１／１５００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Pierce）の存在下で１／１０００に希釈したビオチン化抗κ（Pierce）、周囲温度で２時間。基質：過ホウ酸ナトリウムを含有するリン酸クエン酸バッファー(Sigma)中、０．５ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)、暗室で１０分間。１Ｎ ＨＣｌで反応を停止させ、４９２ｎｍで読み取る。
【００７２】
３．２−ＣＥＬＡ（細胞酵素結合アッセイ）による抗Ｄの特異的アッセイ：
この方法は、特に抗Ｄ抗体以外の非抗Ｄ免疫グロブリンが溶解状態で存在する培養段階（ＥＢＶ形質転換後、早期の段階）の培養物上清を用いる場合に、抗Ｄ抗体を特異的にアッセイするために用いられる。
【００７３】
原理：抗Ｄ抗体をＲｈ陽性赤血球とともにインキュベートした後、アルカリ性ホスファターゼ標識した抗ヒトＩｇにより検出する。
【００７４】
Ｌｉｓｓ−１％ＢＳＡ希釈バッファーで希釈した１０％のＲｈ＋赤血球１００μｌ。希釈バッファーで約５００ｎｇ／ｍｌまでのサンプル希釈および５００ｎｇ／ｍｌに予め希釈した精製モノクローナルヒト抗Ｄ ＩｇＧ （ＤＦ５、ＬＦＢ）で構成される制御範囲の希釈。周囲温度で４５分間のインキュベーション。洗浄（各工程で新鮮なものを使用）：Ｈ２Ｏ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ。結合：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１／４０００に希釈した抗ＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ(Jackson)、周囲温度で１時間３０分。基質：１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８中、１ｍｇ／ｍｌのＰＮＰＰ(Sigma)。１Ｎ ＮａＯＨで反応を停止させ、４０５ｎｍで読み取る。
【００７５】
３．３−ＡＤＣＣ法
ＡＤＣＣ(抗体依存性細胞性細胞傷害)法により、エフェクター細胞（単核細胞またはリンパ球）の存在下でＲｈ＋赤血球の溶解を誘導する（抗Ｄ）抗体の能力を測定することが可能になる。
【００７６】
Ｒｈ陽性型細胞濃縮物の赤血球細胞をパパインで処理（１ｍｇ／ｍｌ、３７℃で１０分）した後、０．９％ＮａＣｌで洗浄する。エフェクター細胞はＦｉｃｏｌｌ（Pharmacia）での遠心分離により少なくとも３つのバフィーコートからなるプールと分離し、続いて２５％ＦＣＳの存在下での接着工程を行い、９オーダーのリンパ球／単球比を得る。ウェル当たり、以下のもの：１００μｌの２００ｎｇ／ｍｌ精製抗Ｄ抗体、２５μlの パパイン処理したＲｈ＋赤血球（すなわち、１×１０６）、２５μlのエフェクター細胞（すなわち、２×１０６）および１０および２ｍｇ／ｍｌの常用濃度の多価ＩｇＧ（例えば、Ｔｅｇｅｌｉｎｅ、ＬＦＢ）５０μｌをマイクロ滴定プレート（９６ウェル）に投入する。０．２５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭで希釈する。３７℃で一晩インキュベーションした後、このプレートを遠心分離し、次いでペルオキシダーゼ活性に特異的な基質（２，７−ジアミノフルオレン、ＤＡＦ）の存在下で上清に放出されたヘモグロビンを測定する。この結果を細胞溶解率％で示し、ＮＨ４Ｃｌにおける全赤血球細胞溶解を１００％（１００％対照）、さらに抗体を含まない反応混合物を０％（０％対照）とする。
【００７７】
以下の式により、特異的な細胞溶解を百分率で算出する：
（ＯＤサンプル−ＯＤ０％対照）／（ＯＤ１００％対照−ＯＤ０％対照）×１００＝％ＡＤＣＣ。
【００７８】
図１に示した結果は、ヘテロハイブリッドＦ６０によって産生された抗体の活性を参照抗体のものとの比較において示している：
−抗Ｒｈ（Ｄ）ポリクローナル抗体ＰＯＬＹ−Ｄ ＬＦＢ５１およびＷｉｎＲｈＯ Ｗ０３(Cangene)＝陽性対照；
−モノクローナル抗体ＤＦ５（Ｒｈ（Ｄ）＋赤血球（ＢＲＯＳＳＡＲＤ／ＦＮＴＳ、１９９０、未発表）のクリアランスについてはin vivoにおいて不活性）＝陰性対照；
−ポリクローナルＷｉｎＲｈＯ Ｗ０３から精製したＩｇＧ１（ＩｇＧ３から分離）。
【００７９】
２種類の濃度のヒトＩｇＧ（Ｔｅｇｅｌｉｎｅ ＬＦＢ）は、陰性対照の活性阻害が、競合するＩｇＧとＦｃγＩ型受容体との結合に関係していることを示す目的で用いられる。
【００８０】
３．４−ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）結合法：
このアッセイにより、ＩｇＧ１イソ型の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体とＦｃγＲＩＩＩとの結合を評価することが可能となり、特にＩｇＧ３抗体を識別することが可能となる。この受容体の単量体ＩｇＧに対する親和性が低いときは、予め抗体とＤ抗原との結合が必要となる。
【００８１】
原理：試験する抗体（抗Ｄ）を、マイクロ滴定プレートに被覆したＲｈ＋赤血球膜に添加し、続いて、それら表面のＦｃγＲＩＩＩ受容体を発現するトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞を加える。遠心分離後、ウェルにＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔを均一にプレーティングすることにより「Ｒｈ＋膜／抗Ｄ／ＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ」相互作用を視覚化する。これに対し、相互作用の不在下では、細胞はウェルの中心に集中する。反応強度は＋の数で示している。
【００８２】
方法：１）抗Ｄ抗体（ＩＭＤＭ中１μｇ／ｍｌにおいて５０μｌ）をＣａｐｔｕｒｅ Ｒ ｐｌａｔｅ（Immunochim）上において３７℃で１時間インキュベートした後、水＋０．９％ＮａＣｌで洗浄する。ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳにＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ（２×１０６細胞／ｍｌ）を加える。３７℃で２０分間インキュベートした後、遠心分離し、細胞接着性（制御範囲と対照する）を測定する。
【００８３】
２）０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ５．３〜５．５でＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶解した後、１／５０００の抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（Sanofi Diagnostics Pasteur）を用いるＥＬＩＳＡタイプの方法により、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｒ ｐｌａｔｅに結合した抗Ｄを曝す。ＯＰＤ暴露後、４９２ｎｍで光学密度（Ｏ．Ｄ．）を読み取る。
【００８４】
結果を次のように示す：０〜３の任意の値をＣＤ１６ Ｊｕｒｋａｔ細胞の結合およびプレーティングの関数として割り当てる。これらの値を定義された各々のＯＤ区間（０．１のインクリメント）に割り当てる。以下のもの：
* 曲線：赤血球細胞膜に結合した抗Ｄ量（Ｘ）の関数としてのＪｕｒｋａｔ細胞の接着性（Ｙ）；または
* 各抗体の、各ＯＤ区間に(試験した総て抗体に共通する部分に対して）.割り当られた各Ｊｕｒｋａｔ細胞結合値（０〜３）の合計に相当する「結合指数」のヒストグラム、のいずれかをプロットする。
【００８５】
ヒストグラムの例を図２に示す。
【００８６】
ＩｇＧ１イソタイプの抗Ｒｈ（Ｄ）抗体（Ｆ６０およびＴ１２５ ＹＢ２／０）はポリクローナルＩｇＧ１（ＷｉｎＲｈｏ）のものに近い結合指数を示すが、陰性対照である抗体ＤＦ５およびＡＤ１は結合しない。同様に、ＩｇＧ３イソ型の抗体（Ｆ４１）は優れた結合指数を示すが、ポリクローナルＷｉｎｒｈｏから精製したＩｇＧ３のものより若干弱く、かつ、抗体ＡＤ３（調べたその他のＩｇＧ３であり、かつＡＤ１との混合物では臨床試験において効果のないもの（Ｂｉｏｔｅｓｔ／ＬＦＢ、１９９７、未発表））のものより強いものである。
【００８７】
実施例２：
組換え抗Ｄ抗体（Ａｂ）の産生
１−ＡｂのＨ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡの単離および増幅
１．１−ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡを、ＥＢＶ形質転換により得られた抗ＤＡｂ−産生クローン（ＩｇＧ Ｇ１／κ）から抽出した：Ｔ１２５ Ａ２（５／１）Ａ２（実施例１の段落２を参照）。
【００８８】
オリゴｄＴプライマーを用いた全ＲＮＡの逆転写により、対応するｃＤＮＡを合成した。
【００８９】
１．２−Ｔ１２５−Ａ２Ｈ鎖可変領域：ＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いたＴ１２５−Ａ２ｃＤＮＡの増幅により、ＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列を得る：
Ｔ１２５−Ａ２のＶＨ遺伝子リーダー領域の５’側に位置し、すでに文献に記載された、Ｔ１２５−Ａ２のＶＨ遺伝子と同じＶＨ３−３０ファミリーに属するＶＨ遺伝子と関連のあるリーダー配列から推定されるコンセンサスリーダー配列（かっこ内）を導入する、プライマーＡ２ＶＨ５；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
Ａ２ＶＨ５（配列番号１）：
５’−CTCTCC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGT)−３’；
Ｔ１２５−Ａ２の定常領域（ＣＨ）の５’に位置する、アンチセンスプライマーＧＳＰ２ＡＮＰ：
ＧＳＰ２ＡＮＰ（配列番号２）：５’−GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG−３’。
【００９０】
１．３−Ｔ１２５−Ａ２定常領域：ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いたＴ１２５−Ａ２ｃＤＮＡの増幅により、ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列を得る：
Ｔ１２５−Ａ２のＣＨ領域の５’に位置する、プライマーＧ１：
Ｇ１（配列番号３）：５’−CCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC−３’
ＣＨ配列の最初のＧ塩基が、ここではＣ（下線部）で置き換えられているため、クローニング後に１つのＥｃｏＲＩ部位が新たに生じる（段落２．１．１を参照）；
Ｔ１２５−Ａ２のＣＨの３’側に位置し、増幅配列の３’側に１つのＸｂａＩ部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＨ３’Ｘｂａ：
Ｈ３’Ｘｂａ（配列番号４）：５’−GAGAGGTCTAGACTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG−３’。
【００９１】
１．４−κＬ鎖：Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅
以下のプライマーを用いて、Ｔ１２５−Ａ２ｃＤＮＡからＴ１２５−Ａ２（Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２配列）完全κ鎖を増幅する：
Ｔ１２５−Ａ２のＶＫ遺伝子リーダー領域の５’側に位置し、Ｔ１２５−Ａ２のＶＫ遺伝子と同じＶＫ１サブグループに属するＶＫ ＶＨ遺伝子の数種類のリーダー領域配列から推定されるコンセンサス配列（かっこ内）を導入する、プライマーＡ２ＶＫ３；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
Ａ２ＶＫ３（配列番号５）：
５’−CCTACC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCA)−３’；
κの３’側に位置し、１つのＥｃｏＲＩ制限部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＫＳＥ１：
ＫＳＥ１（配列番号６）：
５’−GGTGGTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT−３’。
【００９２】
図１は、Ｔ１２５−Ａ２のＨ鎖およびＬ鎖増幅戦略の概略図を示す。
【００９３】
２−発現ベクターの構築
２．１−Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖の発現ベクター：Ｔ１２５−Ｈ２６
Ｔ１２５−Ｈ２６の構築については、図２に概要を示す。これは２段階で行われる：まず第一に、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導された発現ベクターＶ５１へのＴ１２５−Ａ２定常領域の挿入により中間ベクターＶ５１−ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２を構築し（図３）、その後、可変領域をＶ５１−ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２中にクローニングする。
【００９４】
２．１．１ Ｔ１２５−Ａ２定常領域のクローニング
増幅したＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列をリン酸化した後、ベクターＶ５１のＥｃｏＲＩ部位に挿入する（図３）。連結は、Ｖ５１のＥｃｏＲＩ接着末端を「平滑末端」にするためにそれらをクレノウポリメラーゼで予め処理した後に行う。
【００９５】
ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２の増幅に用いるプライマーＧ１によれば、それをＶ５１へ挿入した後に、ＣＨ／Ｔ１２５−Ａ２の５’に１つのＥｃｏＲＩ部位を新たに作製することが可能である。
【００９６】
２．１．２ Ｔ１２５−Ａ２可変領域のクローニング
増幅により得られたＶＨ／Ｔ１２５−Ａ２配列をＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで消化し、その後、ベクターＶ５１−Ｇ１／Ｔ１２５−Ａ２のＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩ部位に挿入する。
【００９７】
２．２−Ｔ１２５−Ａ２ Ｌ鎖ベクター：Ｔ１２５−Ｋ４７
Ｔ１２５−Ｋ４７の構築については図４に示す。ＰＣＲにより得られたＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導された発現ベクターＶ４７のＥｃｏＲＩ部位に挿入する（図５）。
【００９８】
２．３−Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖およびＬ鎖ベクター：Ｔ１２５−ＩＧ２４
Ｔ１２５−ＩＧ２４の構築の概略は図６に示している。このベクターは、Ｔ１２５−Ａ２ Ｈ鎖およびκ鎖に対する２つの転写ユニットを含むものであり、Ｋ／Ｔ１２５−Ａ２に対する転写ユニットを含むＴ１２５−Ｋ４７のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片をＴ１２５−Ｈ２６のＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位に挿入することにより得られる。従って、Ｔ１２５−Ａ２のＨ鎖およびＬ鎖はＣＭＶプロモーターの制御下で発現される；その他のプロモーター：ＲＳＶ、ＩｇＧ Ｈ鎖プロモーター、ＭＭＬＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ、β−アクチンなども用いられる。
【００９９】
２．４−Ｔ１２５−Ａ２Ｈ鎖およびＬ鎖特異的リーダーベクター：Ｔ１２５−Ｌ
Ｓ４
κ鎖のコンセンサスリーダー配列を、「ＰＣＲ ５’−ＲＡＣＥ」（ｃＤＮＡ ５’末端の高速増幅）による産物の配列決定により予めその配列が決定されたＴ１２５−Ａ２のリーダー領域の実際の配列で置き換えた、Ｔ１２５−Ａ２発現用の第２のベクターも構築する。
【０１００】
このＴ１２５−ＬＳ４ベクターの構築については図７に記載する。これは２段階で行われる：まず第一に、Ｔ１２５−Ａ２ κ鎖発現用の新規ベクター、Ｔ１２５−ＫＬＳ１８を構築し、その後、２つのＨ鎖および改変されたＬ鎖転写ユニットを含む最終的な発現ベクター、Ｔ１２５−ＬＳ４を構成する。
【０１０１】
２．４．１ ベクターＴ１２５−ＫＬＳ１８の構築
ベクターＴ１２５−Ｋ４７のκコンセンサスリーダー配列５’部分が、以下のプライマーを用いて行われるＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列の増幅段階中において、Ｔ１２５の特異的なリーダー配列（ＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２）で置き換えられる：
リーダー領域の５’部分（かっこ内）を改変し、１つのＥｃｏＲＩ部位（下線部）とさらに１つのＫｏｚａｋ配列（かくがっこ内）も導入する、プライマーＡ２ＶＫ９：
Ａ２ＶＫ９：５’−CCTACCGAATTC[GCCGCCACC](ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC)−３’；
プライマーＫＳＥ１（段落１．４に記載）。
【０１０２】
その後、起源となるＫ／Ｔ１２５−Ａ２配列を含むＴ１２５−Ｋ４７のＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩによって消化された新規配列ＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２で置き換えることによりベクターＴ１２５−ＫＬＳ１８が得られる。
【０１０３】
２．４．２ 最終ベクターＴ１２５−ＬＳ４の構築
改変されたＫＬＳ／Ｔ１２５−Ａ２配列を含むＴ１２５−ＫＬＳ１８のＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を、Ｔ１２５−Ｈ２６のＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位に挿入する。
【０１０４】
３−ＹＢ２／０株における抗Ｄ抗体の産生
３．１−遺伝子増幅を行わない場合
２種類の発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４およびＴ１２５−ＬＳ４を用いてＹＢ２／０細胞株（ラット骨髄腫、ＡＴＣＣ株 Ｎｏ．１６６２）をトランスフェクトした。エレクトロポレーション法によるトランスフェクションおよびＧ４１８存在下での形質転換体の選択（ｎｅｏ選択）後に数種のクローンを単離した。組換え抗Ｄ抗体の産生は、約０．２μｇ／１０６細胞／２４時間（Ｒ２７０のクローン３Ｂ２に対して得られた値）である。この組換え抗体のＡＤＣＣ活性は、ポリ−Ｄ対照のもの以上である（図１）。２種類の発現ベクターを用いて産生された抗体では、産生またはＡＤＣＣ活性レベルにおける有意な差はない。
【０１０５】
３．２−遺伝子増幅を行う場合
用いられる遺伝子増幅系は、メトトレキサート（ＭＴＸ）耐性の形質転換体の選択に基づくものである。これには、予めＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）酵素をコードする転写ユニットを組換え抗体の発現ベクターに導入しておくことが必要である(SHITARI et al., 1994)。
【０１０６】
３．２．１ 発現ベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３の構築
図８で示すスキームは、ネズミｄｈｆｒ遺伝子を含むＴ１２５−Ａ２発現ベクターの構築について説明するものである。
第１のベクター（Ｖ６４）は、ｐＣＩ−ｎｅｏから誘導されたベクターであるＶ４３から、ＳＶ４０プロモーターの３’および合成ポリアデニル化配列の５’、ｎｅｏ遺伝子（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉ断片）をネズミｄｈｆｒ遺伝子のｃＤＮＡ（プラスミドｐＭＴ２の増幅により得られる）で置き換えることにより構築した（図９）。その後、このベクターを改変し、ｄｈｆｒ転写ユニットの５’に１つのＣｌａＩ部位を作出する。次いで、ｄｈｆｒ転写ユニットを含むＣｌａＩ断片をＴ１２５−ＬＳ４のＣｌａＩ部位に挿入する。
【０１０７】
３．２．２ ＭＴＸ存在下での選択
第１の手段：
エレクトロポレーション法によりベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３でトランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、Ｇ４１８存在下で選択する。次いで、組換え抗体産生形質転換体を漸増量のＭＴＸ（２５ｎＭ〜２５μＭ）の存在下での選択に供する。遺伝子増幅プロセスを反映する組換え抗体産生は、ＭＴＸ選択段階中に進行する。さらに、ＭＴＸ耐性形質転換体を制限希釈によりクローニングする。得られた各クローンについての組換え抗体産生のレベルおよび安定性を測定する。遺伝子増幅後の抗Ｄ抗体産生力は約１３（＋／−７）μｇ／１０６細胞／２４時間である。
【０１０８】
第２の手段：
エレクトロポレーションによりベクターＴ１２５−ｄｈｆｒ１３でトランスフェクトしたＹＢ２／０細胞を、Ｇ４１８存在下で選択する。最良の組換え抗体産生形質転換体を、制限希釈によりクローニングした後、漸増量のＭＴＸの存在下で選択する。遺伝子増幅プロセスを反映する各クローンによる産生は、ＭＴＸ選択段階中に進行する。得られた各ＭＴＸ耐性クローンについての組換え抗体産生のレベルおよび安定性を測定する。
【０１０９】
４−ＹＢ２／０で発現されたＴ１２５抗体の活性の測定
タンパク質Ａセファロース（Pharmacia）でのアフィニティークロマトグラフィー、さらに２５ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４での透析による精製後、ＥＬＩＳＡ法により抗体Ｔ１２５の濃度を測定する。次いで、上記のＡＤＣＣ法により、in vitroにおける生物学的活性を測定する。結果を図１に示す。
【０１１０】
実施例３：グリカン構造とＦｃγＲＩＩＩ依存活性との関係の実証：
１−デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＭ）存在下での細胞培養
いくつかの研究論文には、免疫グロブリンのグリコシル化およびそれらの生物学的活性に対する酵素阻害剤の影響について記載されている。ＡＤＣＣ活性の増大についてはROTHMAN et al., 1989によって報告されている。ここでの増大は抗体のその標的に対する親和性の増強によらないものである。ＤＭＭの添加によって起こるグリコシル化の改変は、ｌｅ Ｇｏｌｇｉに存在するα−１，２マンノシダーゼＩの阻害によるものである。これによりポリマンノシル化、非フコシル化構造がより大きな割合で生じることになる。
【０１１１】
種々の抗Ｒｈ（Ｄ）抗体産生株をＤＭＭに接触させ、産生したモノクローナル抗体の機能的活性を、培養上清の形で、または精製後に評価した。
【０１１２】
細胞 (ヘテロハイブリッドまたはリンパ芽球様細胞)を１〜３×１０５細胞／ｍｌ間で接種し、１０％のＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地（Life Technologies）中、２０μｇ／ｍｌのＤＭＭ（Sigma, Boehringer）存在下で培養する。培地を３回交換した後、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、次いでＡＤＣＣにより培養上清をアッセイする。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＭ）存在下での培養によって、
ヒト−マウスハイブリドーマ Ｄ３１；
ヒトリンパ芽球様株 ＤＦ５；
トランスフェクトネズミ株 ＣＨＯ中のＴ１２５；
により産生される、これまでは活性が弱かった抗体のＡＤＣＣ結果が有意に向上する。
【０１１５】
ｃｌｏｉｄ Ｔ１２５＝Ｔ１２５ ＲＩ（３）（実施例１に記載）に由来し、培養の継続によりＡＤＣＣ活性が失われた抗体のＡＤＣＣ活性を、ＤＭＭの添加により回復させることができる。
【０１１６】
ヘテロハイブリドーマＦ６０（その産生については実施例１に記載）により産生される抗体の強い活性は、ＤＭＭ存在下での培養により改変されない。
【０１１７】
２−種々の細胞株による組換え抗Ｄ抗体の産生：
２．１−抗体ＤＦ５発現ベクターの作製：
抗体ＤＦ５のヌクレオチド配列、ＡＤＣＣアッセイにおける陰性対照を用いて、この抗体の数種類の株へのトランスフェクションとともに、抗体Ｔ１２５のトランスフェクションを調査する。
【０１１８】
組換え抗体Ｔ１２５−Ａ２で用いたものと同じ方法で抗体ＤＦ５をコードする配列を単離し、増幅する。
【０１１９】
対応するｃＤＮＡを、まず第１に、ＥＢＶ形質転換により得られた抗Ｄ抗体（ＩｇＧ Ｇ１／λ）産生クローン２ＭＤＦ５より抽出した全ＲＮＡから合成する。
【０１２０】
次いで、下記のプライマーを用いてこれらのｃＤＮＡからＨ鎖およびＬ鎖の増幅を行う。
【０１２１】
ＤＦ５のＨ鎖可変領域（ＶＨ／ＤＦ５配列）の増幅：
ＤＦ５のＶＨ遺伝子リーダー領域（かっこ内）（文献に記載された配列：L. Chouchane et al.）の５’に位置する、プライマーＤＦ５ＶＨ１；このプライマーは１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）および１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
ＤＦ５ＶＨ１（配列番号８）：
５’CTCTCC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTTTTGGTGG)−３’；
段落１．２（実施例２）にすでに記載した定常領域（ＣＨ）の５’に位置する、アンチセンスプライマーＧＳＰ２ＡＮＰ。
【０１２２】
ＤＦ５の定常領域ＣＨ（ＣＨ／ＤＦ５配列）の増幅：段落１．３（実施例２）ですでに記載したプライマーＧ１およびＨ３’Ｘｂａ。
【０１２３】
ＤＦ５のλＬ鎖の増幅（ＬＢＤ／ＤＦ５配列）：
ＤＦ５のＶＬ遺伝子リーダー領域の５’に位置し、２ＭＤＦ５のＶＬ遺伝子と同じＶＬ１サブグループに属するＶＬ遺伝子の数種類のリーダー領域配列から推定されるコンセンサス配列（かっこ内）を導入する、プライマーＤＦ５ＶＬＢＤ１；この配列は１つのＥｃｏＲＩ制限部位（かくがっこ内）と１つのＫｏｚａｋ配列（下線部）もまた含んでなる：
ＤＦ５ＶＬＢＤ１（配列番号９）：
５’CCTACC[GAATTC]GCCGCCACC(ATGGCCTGGTCTCCTCTCCTCCTCAC)−３’；
λの３’に配置され、１つのＥｃｏＲＩ制限部位（下線部）を導入する、アンチセンスプライマーＬＳＥ１：
ＬＳＥ１（配列番号１０）：
５’−GAGGAGGAATTCACTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT−３’。
【０１２４】
抗体Ｔ１２５−Ａ２発現ベクターと同じ構築スキームに従って、抗体ＤＦ５のＨ鎖（ＤＦ５−Ｈ３１）、Ｌ鎖（ＤＦ５−Ｌ１０）ならびにＨ鎖およびＬ鎖（ＤＦ５−ＩＧ１）の発現ベクターの構築を行う。起源となる総てのリーダー配列（増幅プライマーに導入される）はこれらの種々のベクターに保存される。
【０１２５】
２．２−種々の細胞株の抗体Ｔ１２５およびＤＦ５でのトランスフェクション
３種類の発現ベクターＴ１２５−ＩＧ２４、Ｔ１２５−ＬＳ４およびＤＦ５−ＩｇＧ１を用いて種々の株の細胞をトランスフェクトする：エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬を用いて安定または一時的トランスフェクションを行う。
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
Ｇ４１８存在下での形質転換体の選択（ｎｅｏ選択）後に数種のクローンを単離した。
【０１２８】
ヒト化モノクローナル抗体のエフェクター活性の改変は、ＣＨＯ、ＮＳＯおよびＹＢ２／０細胞株について、CROWE et al. (1992)により発現細胞との関連において説明されている。
【０１２９】
ここで得られた結果から、産生される抗体の機能的特性に関する発現細胞株の重要性が確認される。調べた細胞のうち、Ｖｅｒｏ、ＹＢ２／０およびＣＨＯ Ｌｅｃ−１株だけが、ＡＤＣＣアッセイにおいて強い細胞溶解性を有する組換え抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナル抗体を発現することが可能である（実施例１および表３を参照）。
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
３−グリカン構造の研究
ＡＤＣＣ活性を有する４種類の精製産物（Ｆ６０、およびＴ１２５から誘導される３種の組換えタンパク質）についての抗Ｒｈ−Ｄ抗体のグリカン構造の特徴づけを、本発明のＡＤＣＣアッセイにおいて不活性または非常に活性の弱い２種類の精製産物（Ｄ３１およびＤＦ５）との比較において行った。
【０１３２】
実際には、オリゴ糖を、特異的な酵素による脱グリコシル化、ＰＮＧアーゼＦにより、Ａｓｎ２９７においてタンパク質から分離する。このように放出されるオリゴ糖を蛍光団で標識し、分離し、さらに：
実側質量値と理論質量値とを比較するマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法によるグリカン構造の精密な特徴づけ；
イオン交換ＨＰＬＣ(GlycoSep C)によるシアリル化度の測定；
順相ＨＰＬＣ(GlycoSep N)による、親水性基準に従うオリゴ糖形態の分離および定量；
高速キャピラリー電気泳動−レーザー励起蛍光検出（ＨＰＣＥ−ＬＩＦ）によるオリゴ糖類の分離および定量、
を可能とする種々の補助的手法により同定する。
【０１３３】
１）活性形のグリカンの特徴づけ
検討の対象とした種々の活性形は、Ｆ６０、ならびにＴ１２５から誘導され、ＹＢ２／０で産生された３種類の組換え抗体、Ｒ２９０、Ｒ２９７およびＲ２７０である。質量分析法によるグリカン構造の精密な特徴づけ（図７）からは、これらの形が総て二アンテナ型のものであることがわかる。Ｒ２７０の場合では、多くのものが非ガラクトシル化（agalactosylated）、非フコシル化型である（Ｇ０、実験質量値 １４５９．３７ Ｄａ、図１）。その他に、少量の３種類の構造：非ガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ０Ｆ １６０５．４１ Ｄａ）、モノガラクトシル化、非フコシル化型（Ｇ１ １６２１．２６ Ｄａ）およびモノガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ１Ｆ １７６７．４３ Ｄａ）も同定される。これらの同じ４種の構造は、Ｒ２９０、Ｆ６０およびＲ２９７を特徴づけるものでもある（図１）。ＡＤＣＣにおいて活性であるこれらの４種類の抗体は、２分岐Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するオリゴ糖がないことによっても特徴づけられる。
【０１３４】
ＨＰＬＣおよびＨＰＣＥ−ＬＩＦの種々の手法によるグリカン構造の定量（表１）においては、質量により同定された４つの形態：Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１およびＧ１Ｆの存在が確認される。特に、組換え産物のシアリル化度が極めて低く（１〜９．４％）、これは酵素的脱シアリル化前後に得られた質量スペクトルの類似性により確認される。フコシル化度は３４〜５９％の範囲である。
【０１３５】
２）不活性形
検討の対象とした種々の不活性形は、Ｄ３１およびＤＦ５である。種々のクロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動法によるグリカン構造の定量（表１）によれば、これら２種類の抗体のシアリル化度が５０％に近く、さらにＤ３１およびＤＦ５各々のフコシル化度が８８および１００％であることがわかる。これらのシアリル化度およびフコシル化度は、活性形から得られるものよりも著しく高い。
【０１３６】
グリカン構造の特徴づけによれば、２種類の抗体の多くのものが二アンテナ型のモノシアリル化、ジガラクトシル化、フコシル化型（Ｇ２Ｓ１Ｆ、表１）であることがわかる。Ｄ３１の質量分析法による特徴づけ（図７）によれば、中間形が主としてモノガラクトシル化、フコシル化型（１７６７．４３ ＤａのＧ１Ｆ）およびジガラクトシル化、フコシル化型（１９２９．６６ ＤａのＧ２Ｆ）であることが示される。
【０１３７】
不活性抗体ＤＦ５は、中間挿入物としてＧｌｃＮＡｃ残基を有するオリゴ糖の存在により特徴づけられる。特に、質量分析（図８）によれば、主要な中間形であるモノガラクトシル化、フコシル化、２分岐ＧｌｃＮＡｃ挿入型（Ｇ１ＦＢ、１８５１．０３ Ｄａ）の存在が示される。これに対し、検討の対象とした活性抗体においては、これらの構造形態は検出できないか、または少量しか存在しない。
【０１３８】
ＤＭＭを作用させた後のＤ３１のＡＤＣＣ活性は、１０％〜６０％の増加を示す。ＤＭＭ Ｄ３１のグリカン構造は、オリゴマンノース型（Ｍａｎ５、Ｍａｎ６およびＭａｎ７）が存在する点において、Ｄ３１のものとは異なっている（図９を参照）．
【０１３９】
３）結論
種々の活性抗体は、二アンテナ型および／またはオリゴマンノシド型のＮ−グリコシル化によりＡｓｎ２９７において改変されている。二アンテナ形態では、このことが、シアリル化度が非常に低く、フコシル化度が低く、ガラクトシル化度が低く、さらにＧｌｃＮＡｃが挿入されていない短鎖構造に関連している。
【０１４０】
［参考文献］
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造のフコース含量が、６５％未満であり、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を超える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物。
【化１】
【請求項２】
フコース含量が３０％未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フコース含量が２０〜４５％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
フコース含量が２５から４０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化し、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原がＲｈＤである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化し、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の９０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原がＲｈＤである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ３抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、５０％未満の含量のＧ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含み、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を越える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物。
【請求項１２】
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、３０％未満の含量のＧ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、８０％を越える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化して、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の７０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の８０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の９０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ３抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が抗Ｒｈ（Ｄ）抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体のグリカン構造のシアル酸含量が、２５％未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体のグリカン構造のシアル酸含量が、２５％未満である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１】
Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造のフコース含量が、６５％未満であり、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を超える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物。
【化１】
【請求項２】
フコース含量が３０％未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
フコース含量が２０〜４５％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
フコース含量が２５から４０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化し、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原がＲｈＤである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化し、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の９０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原がＲｈＤである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ３抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｆｃγグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵナンバリング）において、二アンテナ型のグリカン構造を有する精製されたモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体組成物であって、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、５０％未満の含量のＧ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含み、
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、６０％を越える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、組成物。
【請求項１２】
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、３０％未満の含量のＧ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記精製されたモノクローナル抗体のグリカン構造が、８０％を越える含量のＧ０＋Ｇ１＋Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ型を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、抗原に対するものであり、ＦｃγＩＩＩ型受容体を発現するエフェクター細胞を活性化して、且つ、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の６０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の７０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の８０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体が、前記抗原に対するポリクローナル抗体によって生じる細胞溶解の９０％を超える、前記抗原を提示する標的細胞の溶解を生じさせるものである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記モノクローナル抗体がＩｇＧ３抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が抗Ｒｈ（Ｄ）抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体のグリカン構造のシアル酸含量が、２５％未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体のグリカン構造のシアル酸含量が、２５％未満である、請求項１１に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１９３１８４（Ｐ２０１２−１９３１８４Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１２８８４５（Ｐ２０１２−１２８８４５）
【出願日】平成２４年６月６日（２０１２．６．６）
【分割の表示】特願２００１−５７５６５１（Ｐ２００１−５７５６５１）の分割
【原出願日】平成１３年４月１２日（２００１．４．１２）
【出願人】（５０９３０２８０３）エルエフビー バイオテクノロジーズ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２８８４５（Ｐ２０１２−１２８８４５）
【出願日】平成２４年６月６日（２０１２．６．６）
【分割の表示】特願２００１−５７５６５１（Ｐ２００１−５７５６５１）の分割
【原出願日】平成１３年４月１２日（２００１．４．１２）
【出願人】（５０９３０２８０３）エルエフビー バイオテクノロジーズ (4)
【Ｆターム（参考）】
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