抗ＭＴ１−ＭＭＰ単鎖抗体およびそれを用いた放射性分子イメージングプローブ
【課題】癌の診断や検査に用いられる新規単鎖抗体およびそれを用いた放射性分子イメージングプローブなどを提供する。
【解決手段】ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、特定のアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、およびＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むベクター、ベクターで形質転換した形質転換体を用いて単鎖抗体を製造する方法。及び単鎖抗体によるがんの分子イメージングプローブ剤としての使用方法。
【解決手段】ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、特定のアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、およびＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むベクター、ベクターで形質転換した形質転換体を用いて単鎖抗体を製造する方法。及び単鎖抗体によるがんの分子イメージングプローブ剤としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断や検査に用いられる新規単鎖抗体およびそれを用いた放射性分子イメージングプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの浸潤、転移においてＥＣＭや基底膜の分解は必須のステップであり、ＭＭＰはこの過程を制御する重要な一連の酵素群である。ＭＭＰはその構造に基づいて分泌型と膜結合型に大別されるが、中でも膜結合型であるＭＴ１−ＭＭＰは、（１）腫瘍形成の早期より発現しその発現が腫瘍組織に限局する、（２）Ｉ・ＩＩ・ＩＩＩ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど広範囲のＥＣＭ構成成分に対する分解活性をもつ、（３）インテグリン、ＣＤ４４などの細胞接着分子を細胞表面で制御する、（４）ＭＭＰ−２、−１３を細胞表面で活性化する、等の性質を有し、ＭＴ１−ＭＭＰの発現はがんの悪性度と相関することが示されてきており、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体を発現させたがん細胞では増殖性・浸潤性が顕著に抑制されることが明らかとなっている。加えて、ＭＴ１−ＭＭＰはほとんどのヒトがん組織において発現していることが示されるに至って、ＭＴ１−ＭＭＰを標的としたがんの診断法・治療法の開発が急務となっている。これまでに、ＭＭＰ（特に分泌型ＭＭＰ）を標的とした分子イメージングプローブの開発が積極的に進められてきているが、ＭＴ１−ＭＭＰ選択的なイメージングプローブとして有効なものは未だ報告されていない。
【０００３】
ＭＴ１−ＭＭＰを標的とした放射性プローブは全長のＩｇＧ抗体を用いたものが報告されている（非特許文献１、２参照）が、イメージングの指標となる腫瘍血液比は投与４８時間後で１．５程度であり十分とはいえない。また、放射性核種として半減期６時間の９９ｍＴｃを用いていることから、投与４８時間後では放射能の減衰が著しく、現実的なイメージングへの使用に耐えない。２段階投与法（プレターゲティング法）を用いた報告（非特許文献３参照）では担がんマウスのＳＰＥＣＴイメージングに成功しているが、リンカーペアとして用いているストレプトアビジンは免疫原性の問題があることから臨床応用可能性が低い。
【０００４】
がんを標的としたイメージングプローブとしては、細胞の糖代謝に応じて集積する１８Ｆ標識フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）が知られているが、がん病変に特異的ではないという問題点を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Development of a radiolabeled probe for detecting membrane type-1 matrix metalloproteinase on malignant tumors. Temma T, Sano K, Kuge Y, Kamihashi J, Takai N, Ogawa Y, Saji H. Biol Pharm Bull. 2009 Jul;32(7):1272-7.
【非特許文献２】Imaging with radiolabelled anti-membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) antibody: potentials for characterizing atherosclerotic plaques. Kuge Y, Takai N, Ogawa Y, Temma T, Zhao Y, Nishigori K, Ishino S, Kamihashi J, Kiyono Y, Shiomi M, Saji H. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2010 Nov;37(11):2093-104.
【非特許文献３】Radioimmunodetection of membrane type-1 matrix metalloproteinase relevant to tumor malignancy with a pre-targeting method. Sano K, Temma T, Kuge Y, Kudo T, Kamihashi J, Zhao S, Saji H. Biol Pharm Bull. 2010;33(9):1589-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、がん病変に特異的で、画像診断として最適な薬物動態を示し、しかも免疫原性の問題がない臨床応用に適したがんの画像診断用プローブを提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ね、ＭＴ１−ＭＭＰに特異的な単鎖抗体を得ることに成功し、これらを放射性標識したものが、がんの特異的イメージング剤として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、がん病変に特異的で、画像診断として最適な薬物動態を示し、しかも免疫原性の問題がない臨床応用に適したがんの画像診断用プローブが提供される。
【０００９】
したがって、本発明は下記のものを提供する：
（１）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（２）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（３）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（５）（４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター；
（６）（５）に記載のベクターで形質転換した形質転換体；
（７）（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体の製造方法であって、（５）に記載のベクターで形質転換した形質転換体を適当な培地中で培養し、該形質転換体または培地から単鎖抗体を回収することを含んでなる方法；
（８）独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された細胞、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された細胞、または独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載された単鎖抗体の製造方法；
（９）標識されている（１）〜（３）のいずれかに記載された単鎖抗体；
（１０）放射性標識された（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤；
（１１）（１０）に記載の分子イメージングプローブ剤を含む、癌の画像診断剤またはキット；
（１２）対象中のがんの存在を調べる方法であって、対象から得られた試料に（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を接触させることを特徴とする方法；
（１３）ＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的測定もしくは検出のための、（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を含むことを特徴とする試薬またはキット；
（１４）ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定または検出する方法であって、（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を試料と接触させることを特徴とする方法；
（１５）単鎖抗体が標識されている（１２）また（１４）に記載の方法、あるいは（１３）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の単鎖抗体の抗原固定化ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、本発明の単鎖抗体のＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、本発明の単鎖抗体の間接競合ＥＬＩＳＡによる阻害曲線を示す。
【図４】図４は、本発明の単鎖抗体のウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン１はＭＭＰ９８−１（１μｇ／ｍｌ）、レーン２はＭＭＰＫ９Ｅ−１（１μｇ／ｍｌ）、レーン３は市販抗体ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）である。
【図５】図５は、腫瘍の免疫染色（左パネル）および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１によるオートラジオグラフィー（右パネル）の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の単鎖抗体のフロー式免疫測定法による阻害曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸は当業者に公知の１文字表記または３文字表記で示される。特に断らないかぎり、本明細書中の他の用語についても、生物学の分野の教科書や辞書に記載されている通常の意味に解釈される。また、本明細書において、特に断らないかぎり、ＭＴ１−ＭＭＰはＭＴ１−ＭＭＰタンパクを意味する。
【００１２】
本発明は、第１の態様において、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する新規単鎖抗体を提供する。上述のごとく、ＭＴ１−ＭＭＰは、ほとんどのヒトがん組織において発現しており、その発現ががんの悪性度と相関している。したがって、本発明の新規単鎖抗体を用いてＭＴ１−ＭＭＰの発現を調べることによって、対象の体内のがんの存在および悪性度を知ることができる。
【００１３】
１の具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰ９８−１」と称する。
【００１４】
さらなる具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１」と称する。
【００１５】
さらなる具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１」と称する。
【００１６】
本発明の上記単鎖抗体は、いずれもＭＴ１−ＭＭＰに対する結合活性を有し、ＭＴ１−ＭＭＰの部分配列であるＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮのＣ末端にＣｙｓを付した配列：
ＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮＣ（配列番号：１３）
からなるペプチドに対して５０ｎＭ以下、好ましくは４０ｎＭ以下、さらに好ましくは３０ｎＭ以下のＫＤ値を示す。
【００１７】
本発明は、さらなる態様において、上記の本発明の単鎖抗体と同様の特性を有する変異単鎖抗体も提供する。これらの変異単鎖抗体の具体例としては下記のものが挙げられる。
【００１８】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：２で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：６で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；ならびに
配列番号：２、配列番号：６配もしくは列番号：１０で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するＨ鎖可変領域と、配列番号：４、配列番号：８配もしくは列番号：１２で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するＬ鎖可変領域の任意の組み合わせからなる単鎖抗体。
これらの単鎖抗体は、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して５０ｎＭ以下、好ましくは４０ｎＭ以下、さらに好ましくは３０ｎＭ以下のＫＤ値を示す。
【００１９】
がんの画像診断あるいはＭＴ１−ＭＭＰの測定または検出といった観点から、上記の単鎖抗体が検出可能な様式で標識されていることが好ましい。抗体の標識法は当業者に公知であり、適宜選択して抗体を標識することができる。抗体の標識法としては、例えば、ＦＩＴＣなどを用いる蛍光標識法、ペルオキシダーゼなどを用いる酵素標識法、９９ｍＴｃや１１１Ｉｎなどを用いる放射性標識法、ビオチン標識法などが挙げられる。本発明の単鎖抗体は分子サイズがＩｇＧの約５分の１であり、体内動態が改善されている。そこで、放射性標識に用いる放射性核種としては、ＳＰＥＣＴ用とする場合には半減期が約３日である１１１Ｉｎが使い易い。なお、本明細書において、本発明の単鎖抗体という場合には、標識されている本発明の単鎖抗体も包含する。
【００２０】
さらに、放射性標識をする場合において、放射性標識により標的認識機能が損なわれないよう、二官能性キレート導入用のリジン残基を複数個、抗体のＣ末端に導入することが好ましい。したがって、１１１Ｉｎにて標識されており、リジン残基を複数個Ｃ末端に導入されている本発明の単鎖抗体は、イメージングに必要な高い腫瘍血液放射能比を投与早期から得ることができるので、特に好ましいものである。
【００２１】
本発明の単鎖抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ファージディスプレイ法やハイブリドーマ法を用いて得ることができる。これらの方法に公知の遺伝子操作技術をさらに組み合わせることもできる。これらの方法の詳細は、実施例を参照されたい。ただし、本発明の単鎖抗体を得る方法は、上記方法に限定されないことはいうまでもない。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、上で説明した本発明の単鎖抗体または変異単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、もう１つの態様において、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、ならびに該ベクターにて形質転換された細胞を提供する。
【００２３】
かかるポリヌクレオチドは、上記のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドのほか、リンカー配列、Ｈｉｓタグ配列、Ｖ５タグ配列など（これらの配列に限定されない）をコードするポリヌクレオチド含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターまたはクローニングベクターに組み込んで適当な細胞に導入して形質転換し、形質転換細胞を適当な培地にて培養し、産生された単鎖抗体を培地から回収することにより、本発明の単鎖抗体、すなわち単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を得ることができる。細胞の種類の選択、細胞の形質転換法、細胞の培養法、培地からの単鎖抗体の回収および精製のための手段・方法は当業者に公知であり、当業者は目的に応じてこれらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞へのポリヌクレオチドの導入にはＰＥＧおよびＣａイオンを用いてベクターを導入する方法、エレクトロポーレーション法、遺伝子銃を用いる方法などがある。
【００２５】
上記の変異単鎖抗体についても、それらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、同様の手段・方法にて得ることができる。
【００２６】
なお、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１をコードするポリヌクレオチドをベクターに組み込み、これらを用いて昆虫細胞を形質転換することにより、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰ９８−０と命名）、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰＫ９Ｅ−０と命名）および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰＫ９Ｉ−０と命名）を得た。これらの単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を産生する細胞は、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、２０１０年１２月２日に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８、ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９およびＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。これらの細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することによっても、本発明の単鎖抗体、すなわち単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を得ることができる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、放射性標識された本発明の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤を提供する。すなわち、放射性標識された本発明の単鎖抗体を用いて、がんを画像診断することができる。放射性標識としては、ＳＰＥＣＴ用には１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅなどのγ線放出核種を用いることができるが、これらの核種に限定するものではない。また、ＰＥＴ用には１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、７６Ｂｒなどの陽電子放出核種を標識に用いることができるが、これらの核種に限定するものではない。
【００２８】
１１１Ｉｎにて標識されており、リジン残基を複数個Ｃ末端に導入されている本発明の単鎖抗体は、イメージングに必要な高い腫瘍血液放射能比を投与早期から得ることができるので、がんの画像診断に特に好ましいものである。
【００２９】
本発明のがんの分子イメージングプローブ剤は、放射性標識された本発明の単鎖抗体のほか、通常使用される賦形剤や担体を含みうる。これらの賦形剤や担体も公知であり、当業者は目的に応じて適宜選択して用いることができる。本発明の分子イメージングプローブ剤の剤形はいずれの剤形であってもよいが、注射剤や輸液剤の形態が好ましい。本発明のがんの分子イメージングプローブ剤は、使用前に本発明の単鎖抗体を放射性核種にて標識してから用いるのが一般的である。本発明の単鎖抗体の放射性核種での標識方法は公知の方法を用いて行い得る。１１１Ｉｎでの標識の具体例については本明細書の実施例を参照されたい。本発明のがんの分子イメージングプローブ剤を用いて、対象中のがんの存在、その部位、およびがんの悪性度を調べることができる。
【００３０】
本発明のがんの分子イメージングプローブ剤の用例を説明すると、本発明のがんの分子イメージングプローブ剤を対象に注射（局所投与、全身投与いずれでもよい）、輸液等の手段にて投与し、適当時間経過後、例えば投与後１〜２４時間経過後にＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにて放射線を測定することにより、対象におけるがんの存在、その部位、およびがんの悪性度を調べることができる。がんの診断の場合には、正常対象との比較を行うことが望ましい。また、対象におけるがんの経過や予後を見る場合には、経時的に検査を行うことが望ましい。これらの診断、検査の方法、手技は、通常のガンの診断、検査、ならびに通常の画像診断の方法、手技と基本的に変わることはない
【００３１】
本発明は、さらなる態様において、上記分子イメージングプローブ剤を必須構成成分として含む、癌の画像診断剤またはキットを提供する。通常の場合、キットには取扱説明書を添付する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、対象中のがんの存在または悪性度を調べる方法であって、対象に本発明の単鎖抗体を投与し、対象中のＭＴ１−ＭＭＰに結合した本発明の単鎖抗体の量を調べることを特徴とする方法を提供する。この方法において、好ましくは本発明の単鎖抗体は放射性核種にて標識されている。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、対象中のがんの存在または悪性度を調べる方法であって、対象から得られた試料に（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を接触させ、該試料中のＭＴ１−ＭＭＰの存在または量を測定することを特徴とする方法を提供する。この方法において、本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、接触とは、試料中のＭＴ１−ＭＭＰと本発明の単鎖抗体を結合可能な状況に置くことをいい、例えば、試料溶液と本発明の単鎖抗体を混合し、室温または動物の体温付近の温度にて適当時間インキュベートすることであってもよい。
【００３４】
本発明は、もう１つの態様において、ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定、検出もしくは捕獲するための、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を含むことを特徴とする試薬またはキットを提供する。該試薬またはキットを用いて、試料中のＭＴ１−ＭＭＰを捕獲したり、存在や量を調べたりすることができる。このような測定や検出を目的とする試薬やキットにおいては、本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明は、もう１つの態様において、ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定、検出もしくは捕獲する方法であって、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を試料と接触させることを特徴とする方法を提供する。このような測定や検出方法においては本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００３７】
（１−１）ペプチドコンジュゲートの調製
ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域に含まれるアミノ酸配列を有するヒンジ領域ペプチドを合成し、リンカーＳｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、キャリアータンパク質と結合させ、ペプチドコンジュゲートを合成した。
【００３８】
（１−２）マウスの免疫
得られたコンジュゲートを免疫原として、マウスを免疫した。
前記ペプチドコンジュゲートと、アジュバントＲＡＳＲ−７００(ＲＩＢＩ社)とを１：１容量に混合して十分に乳化させ、得られた乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢、雌）の腹腔内に２００μＬ投与する事によりマウスを免疫感作した。追加免疫は、約２〜３週間間隔で行い、追加免疫から１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して免疫原に対する抗体価の推移を観察した。
【００３９】
（１−３）ハイブリドーマの作製
血中に免疫原に対する高い抗体産生が認められたマウス尾静脈内に、さらに免疫原を投与して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に、免疫した前記マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製し、対数増殖期にあるミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３あるいはＳｐ２／Ｏ）と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）添加の１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁させ脾臓細胞数で１〜２×１０５細胞／ウエルになるように９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下で培養した。
【００４０】
（１−４）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
細胞融合より７〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて抗体価を測定した。
【００４１】
（１−５）抗体産生ハイブリドーマのスクリーング（抗体価の測定）
マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各ウエルに、０．２５〜１μｇ／ｍＬの各免疫原のＰＢＳ(−)希釈溶液５０μＬを加え、室温で１時間静置して固相化した。また、前記ペプチドコンジュゲート中のキャリアータンパク質に対する抗体産生クローンを除外する為に、ＢＳＡ、又はＫＬＨを固定化したウエルを対照として用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ(−)（洗浄液）３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、ブロックエース粉末（雪印社製、ＵＫ−Ｂ８０）１ｇを１００ｍＬの精製水にて溶解させた溶液（ブロッキング試薬）３００μＬをウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄後、１次抗体を含む培養上清５０μＬを各ウエルに添加して混和した後、室温条件下で３０〜６０分間静置して反応を行わせた。次いで、洗浄液３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、固相化した各免疫原に結合した１次抗体を検出するために、ブロックエース粉末０．４ｇを１００ｍＬの精製水にて溶解させた溶液（２次抗体希釈液）にて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）（ＫＰＬ社製）を２次抗体溶液として５０μＬ加えて、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄した後、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）を各ウエルに加え、室温条件下にて発色反応を行った。５〜１５分間後に１Ｍリン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに４５０ｎｍ（対照：ＯＤ６５０）の吸光度を測定した。各免疫原を固定化したウエルと対照ウエルとの吸光度差を、前記免疫原に対する抗体の結合活性とした。
【００４２】
（１−６）間接競合法による特異抗体産生クローンの選抜
前記（１−５）に従い、マイクロタイタープレートの各ウエルに各免疫原を固相化し、洗浄ののち精製水で４倍希釈したブロックエース溶液３００μＬをウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
次いで、ＰＢＳ（−）で調製したヒンジ領域ペプチド溶液を用意し、各々２５μＬを、免疫原固相化プレートの各ウエルに加えた。次に、ハイブドーマ培養上清２５μＬをウエル内に添加して混和した後、室温条件下で３０〜６０分間静置して反応を行わせた。
洗浄液３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、固相化免疫原に結合した１次抗体を検出するために２次抗体希釈液にて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）を２次抗体溶液として５０μＬ加え、室温条件下で１時間反応させた。
ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を各ウエルに加えて室温で発色反応を行った。５〜１５分間後に１Ｍ リン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに４５０ｎｍ（対照：ＯＤ６５０）の吸光度を測定した。対照ウエルの吸光度値（コントロールＯＤ；Ｂ０） に対するヒンジ領域ペプチド共存下のウエル吸光度値(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、共存物質に対する抗体の反応性を判断した。ヒンジ領域ペプチドに対する結合活性が高く、かつ継続的に高い抗体産生が確認されたウエルのハイブリドーマ６６Ｃ及びハイブリドーマ１９Ｂを選抜し、限界希釈法によるクローニングに供した。
【００４３】
（１−７）ｍＲＮＡの精製とｃＤＮＡ合成
前記（１−６）で選抜したハイブリドーマ６６Ｃ及びハイブリドーマ１９Ｂを、５％ＣＯ２通気条件下、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させた。対数増殖期にある約１ｘ１０７個の細胞から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。次いで、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて常法に従いファーストストランドｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔの添付書類で推奨されている条件によりＰ Ｃ Ｒ を行い、抗体遺伝子可変領域遺伝子ＤＮＡを増幅した。
【００４４】
（１−８）塩基配列の決定とアミノ酸配列の解析
前記（１−７）で増幅された抗体遺伝子可変領域遺伝子ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりシークエンス反応を行った。次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて配列を解析した。塩基配列の解析ならびにアミノ酸配列の推定および解析には、解析ソフトＤＮＡｓｉｓ（日立ソフトエンジニアリング）を使用した。また、配可変領域の特定には、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（http://imgt.cines.fr）を利用した。その結果、得られた抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびその推定アミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００４５】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：５
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACAAGCTATGCATTGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGAAATACACCAACACTGGAGAGCCAACATATGGTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATTAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGGACTTAGTTCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【００４６】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：６
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTSYALHWVKQAPGKGLKWMGWKYTNTGEPTYGDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGGLSSYAMDYWGQGTSVTVSS
【００４７】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：７
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCACTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【００４８】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：８
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGTGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLLVTFGAGTKLELKR
【００４９】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：９
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACAGATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAGGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGAAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAACTATGATTACGACAGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【００５０】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１０
QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYRFTDYEMHWVRQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGKATLTEDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTTMITTALDYWGQGTSVTVSS
【００５１】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：１１
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTGATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
【００５２】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１２
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKR
【００５３】
（１−９）単鎖抗体発現ベクターの作製
抗体ＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子ｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いてリンカー配列をコードするＤＮＡにより連結し、これらをプラスミドベクターｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社製）の制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、常法に従いクローニングし、ハイブリドーマ６６Ｃに由来するものを単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｅとし、ハイブリドーマ１９Ｂに由来するものを単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｉとした。
【実施例２】
【００５４】
（２−１）単鎖抗体遺伝子ライブラリーの作製
脾臓細胞などの生体内で抗体産生を行っている細胞から抗体遺伝子ライブラリーを作製し、抗体遺伝子がコードする組換抗体をファージ表面に提示させ、目的の抗原と反応性を有する組換抗体の遺伝子を取得する方法として、ファージディスプレイ法が以前から知られている。前記（１−２）のＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート免疫マウスを用いて、抗体遺伝子ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法により抗ＭＴ１−ＭＭＰ単鎖抗体のスクリーニングを行った。ライブラリー作製とファージディスプレイ法については、MaCafferty J., Hoogenboom H.R.,Chiswell D.J., Antibody Engineering, (Oxford University Press)およびKontermann R., Dubel S., Antibody Engineering, (Springer)を参考に行った。
【００５５】
前記（１−２）で免疫したマウス脾臓細胞よりセパゾール ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ（ナカライ社製）を用いｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、このｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）によりｍＲＮＡを精製した。調製したｍＲＮＡ用い、前期（１−７）と同様の逆転写反応によりファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。ファーストストランドｃＤＮＡを鋳型とし、マウス抗体遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体ＩｇＧのＨ 鎖およびＬ 鎖の可変領域遺伝子ＤＮＡを増幅した。前記（１−９）同様、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子ＤＮＡを、ＰＣＲを用いてリンカー配列をコードするＤＮＡにより連結した。これらをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅの制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、これらにより大腸菌ＴＧ１株を常法に従い形質転換した。形質転換した大腸菌は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天培地にプレーティングし、３０℃で終夜培養した。増殖した菌体は、数ｍｌの培地を加え、コンラージ棒でかき取り回収した後、Ｍ１３ＫＯ７ファージによるファージレスキューを行なった。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２％のグルコースを含む２×ＹＴ培地によりＯＤ６００＝０．３に調整した大腸菌の培養液、総量３５ｍｌを３７℃で１時間振とう培養した後、Ｍ１３ＫＯ７ファージを終濃度４×１０９ｐｆｕ／ｍｌとなるよう添加し、さらに３７℃で１時間振とう培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２×ＹＴ培地４０ｍｌに再懸濁し３７℃で終夜培養し、培地中に単鎖抗体提示ファージを産生させた。ファージはポリエチレングリコール沈殿により回収し、これを単鎖抗体遺伝子ライブラリーとした。終夜培養後の培養液を遠心分離により菌体を除いた培養上清を回収し、培養１２．５ｍｌに対し、２．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０％ポリエチレングリコール溶液２．５ｍｌを加え混和した。氷上で1時間静置した後、冷却下１００００Ｇで２０分間遠心分離した。上静を完全に捨て２×ＹＴ培地１ｍｌに再けん濁し単鎖抗体提示ファージ溶液とした。
【００５６】
（２−２）ファージディスプレイ法によるスクリーニング
調製した単鎖抗体提示ファージ溶液から、抗原に対する反応性の高いものを濃縮するため、バイオパニングを行った。ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートを固相化し、ブロックエースでブロッキングした９６穴マイクロタイタープレートに、調製した単鎖抗体提示ファージ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、室温で１時間静置した。反応の後、溶液を除き、洗浄液３００μＬで３回洗浄し洗浄液を完全に除いたのち、０．１Ｍグリシン-塩酸緩衝液ｐＨ２．２を加え、１０分間静置後、ピペッティングした後これを回収し、直ちにトリス溶液ｐＨ８．０で中和した。
濃縮した単鎖抗体提示ファージを、再感染とファージレスキューにより増幅した。回収した溶液は２×ＹＴ培地１０ｍＬ中でＯＤ６００＝０．３まで培養した大腸菌ＴＧ１の培養液に混和し、３７℃で１時間培養し再感染させた。再感染後、ファージレスキューのために、アンピシリンが終濃度１００μｇ／ｍＬ、グルコースが終濃度２％、Ｍ１３ＫＯ７ファージが終濃度４×１０９ｐｆｕ／ｍＬとなるようそれぞれの溶液を添加し、さらに３７℃で培養した。１時間の培養後、遠心分離により菌体を回収し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬとカナマイシ５０μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地１０ｍＬに再懸濁し３７℃で終夜培養し、培地中に単鎖抗体提示ファージを産生させた。増幅したファージは再びポリエチレングリコール沈殿により回収した。バイオパニングによる濃縮と再感染、ファージレスキューによる増幅を３〜５回繰り返し、バイオパニング後のファージを大腸菌ＴＧ１に感染させ、これを寒天平板培地にプレーティングし、３０℃で終夜培養しコロニーを形成させた。
【００５７】
（２−３）バイオパニング後の単鎖抗体提示ファージの反応性評価
バイオパニングにより得られた単鎖抗体提示ファージの、固相化抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡにより評価した。
マイクロタイタープレートにＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート５０μＬを加え、室温１時間反応させた。対照にはＰＢＳ（−）を用いた。洗浄液で洗浄した後、ブロックエースによりブロッキングした。マイクロタイタープレートのウエルを洗浄後、０．１％ブロックエースで調製した単鎖抗体提示ファージ溶液５０μＬを添加し、室温１時間反応させた。ウエルを洗浄した後、５０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（アマシャム バイオサイエンス 社製）を加えて、室温１時間反応させた。マイクロプレートを洗浄し未反応液を十分除いた後、基質溶液（ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＫＰＬ社製）５０μＬを加え、室温で５〜１５分間反応させた後、１Ｍ リン酸溶液 ５０μＬを添加して反応を停止した。プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）により吸光度ＯＤ４５０（対照：ＯＤ６５０）を測定した。その結果、クローン番号９８の単鎖抗体提示ファージが固相化抗原と反応性を有することを見出した。
【００５８】
（２−４）塩基配列の決定とアミノ酸配列の解析と単鎖抗体発現ベクター作製
ＥＬＩＳＡで固相化抗原と反応したクローン番号９８の単鎖抗体提示ファージクローン遺伝子の配列を解析した。シークエンスは前記（１−８）同様に、ダイターミネーター法によって行った。その結果、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の遺伝子配列を有していることが確認された。解析結果を以下に示す。
【００５９】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：１
GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACCTGAACTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATCCCGTCACAAAGTACGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACGTACACTGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGACGATTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAACACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAGATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAACTCCCACGGTAAATACGTGGAATGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCC
【００６０】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPVTKYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLETSANTAYLQINNLKDEDTATYFCANSHGKYVEWFTYWGQGTTVTVSS
【００６１】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：３
GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【００６２】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：４
DIELTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLELKR
【００６３】
クローン番号９８のファージミドより制限酵素ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩにより単鎖抗体遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社製）の制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、常法に従いクローニングし、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰ９８とした。
【実施例３】
【００６４】
（３−１）組換え単鎖抗体発現細胞株の作製
遺伝子導入キット ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔＴＭ ＢＳＤ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて、昆虫細胞 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（インビトロジェン社製）に単鎖抗体発現ベクターを導入し、培養培地（抗生物質不含）にて４８時間培養した後、培養培地（抗生物質含有）にて細胞を１／５濃度に希釈し、培養デッシュに播種した。５、６時間静置、細胞が底面に付着した事を確認し、培地を除去した。選択培地（２０μｇ／ｍｌブラストシジン（インビトロジェン））に交換し、４日間培養した。選択培地の添加により、遺伝子が導入されていない細胞な死滅した。抗原固定化ＥＬＩＳＡ法で培養上清の評価をおこない、陽性クローンを選抜した後、限界希釈法により単クローン化し、単鎖抗体安定発現細胞株を樹立した。樹立した細胞株はそれぞれ単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰ９８を導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰ９８−０、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｅを導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰＫ９Ｅ−０、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｉを導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰＫ９Ｉ−０とし、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託し、それぞれ、２０１０年１２月２日に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８、ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９、ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。
【実施例４】
【００６５】
（４−１）精製単鎖抗体の調製
前記（３−１）で樹立した単鎖抗体発現細胞株を約１Ｌスケールで培養し、細胞濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに到達した時点で培養上清を回収した。回収した培養上清から、２種類の金属キレートカラムを用いたアフィニティー精製により単鎖抗体を調製した。
まず、担体Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）１ｍｌをＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。カラムをＰＢＳ（−）にて平衡後、培養上清１Ｌをアプライした。１０ｍｌのＰＢＳ（−）、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）の順に洗浄をおこなった。３ｍｌの５００ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で溶出をおこない、単鎖抗体画分を得た。単鎖抗体画分を０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）にて透析をおこなった。
【００６６】
次いで、担体ＴＡＲＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）5ｍｌをＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。カラムを０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）にて平衡後、透析後の抗体溶液をアプライした。５０ｍｌの１０ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄をおこなった。２０ｍｌの５００ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で溶出をおこない、単鎖抗体画分を得た。単鎖抗体画分をＰＢＳ（−）にて透析をおこない単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１の精製単鎖抗体とした。
【実施例５】
【００６７】
精製単鎖抗体のＥＬＩＳＡによる評価
得られた精製単鎖抗体の免疫測定法における適性を評価するため、抗原固定化ＥＬＩＳＡ法、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法、間接競合ＥＬＩＳＡ法の３種類のＥＬＩＳＡを行った。また、比較対象には市販のマウス抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を用いた。
【００６８】
（５−１）抗原固定化ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ（−）にて０．５μｇ／ｍｌに調製したＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート溶液５０μlを９６ウエル プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウエルに添加し、室温にて1時間静置した。ウエルを３００μｌの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回洗浄した後１％ブロックエース（雪印社製）２５０μｌを添加し、室温で２時間ブロッキングをおこなった。洗浄液にてウエルを洗浄後、５０μｌの単鎖抗体溶液(０．１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製)をウエルに添加し、室温、３０分間反応させた。ウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエース（ミリＱ水にて調製）にて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、１０分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウエルの吸光度（測定波長： ４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００６９】
結果を表１、図１に示した。いずれの単鎖抗体も市販抗体と比較しＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートの固相化抗原に対して高い反応性が確認された。
【表１】
【００７０】
（５−２）Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ
ヒト乳腺ガン細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を９６ウエルプレートに１×１０４ｃｅｌｌ／ウエルで播種、一晩培養をおこなった。３００μｌの％ＦＢＳ含有、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、５０μｌの抗体溶液(０．１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（ー）にて調製)をウエルに添加し、室温、３０分間反応させた。さらに、ウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、10分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウェルの吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００７１】
結果を表２、図２に示した、いずれの単鎖抗体も市販抗体と比較しヒト乳腺ガン細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１表面抗原に対して高い反応性が確認された。
【表２】
【００７２】
（５−３）間接競合ＥＬＩＳＡ
ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート（０．５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）５０μlを９６ウエル プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウエルに添加し、室温、1時間静置した。ウエルを３００μｌの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回洗浄した後１％ブロックエース（雪印社製）２５０μｌを添加し、室温、２時間ブロッキングをおこなった。洗浄液にてウエルを洗浄後、ＭＴ１−ＭＭＰペプチド（４００μｇ／ｍｌから５倍、９段階希釈ＰＢＳ（−）にて希調製）２５μｌと抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）２５μlを添加し、室温、３０分間反応させた。さらにウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、10分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウエルの吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００７３】
結果を表３、図３に示した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１が市販抗体と比較し、抗原ペプチドに対する反応性が高いと確認され、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は市販抗体とほぼ同等であった。
【表３】
【実施例６】
【００７４】
ウェスタンブロッティング
実施例４で調製した単鎖抗体の反応性がＭＴ１−ＭＭＰ特異的であるか検討するため、ＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞を用い、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの方法はタンパク質・酵素の基礎実験法 堀尾武一編 南江堂出版を参照した。ヒト乳腺ガン細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のセルライゼートをＰＢＳ（−）にて蛋白質濃度２ｍｇ／ｍｌに調製し、セルライゼート希釈液２０μｌとβ-メルカプトエタノール含有ＳＤＳ化バッファー２０μｌを混合し９６℃、５分間加熱しＳＤＳ化した。ＳＤＳ化試料を１０μｌ／レーンをアクリルアミドゲル（濃縮ゲル：４％、分離ゲル７．５％）にアプライして、ミニプロテアンＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて１００Ｖで電気泳動をおこなった。次いで、ゲルを転写バッファー（トリス、グリシン、メタノール）に浸漬、馴染ませたのち、ミニトランスブロッティイングモジュール（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてメンブレンに１００Ｖ、２５０ｍＡ、４５分間転写した。転写終了後、メンブレンを脱イオン水で振盪洗浄し、１％ブロックエース中に終夜浸漬してブロッキングをおこなった。次に、（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回、振盪洗浄をおこなった。各抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）をメンブレン上に滴下し、室温、１時間反応させた。振盪洗浄を３回おこない、単鎖抗体を添加したメンブレンには、０．１％ブロックエースにて１０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）を滴下、室温、１時間間反応させた。対象の市販抗体を添加したメンブレンには、０．１％ブロックエースにて１００００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体を滴下、室温、１時間間反応させた後、メンブレンを洗浄しＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を滴下、室温５分間反応後、化学発光を検出した。単鎖抗体を滴下したメンブレンを洗浄し、０．１％ブロックエースにて１００００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体を滴下、室温、１時間間反応させた後、メンブレンを洗浄しＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を滴下、室温５分間反応後、化学発光を検出した。
【００７５】
結果を図４に示した。各単鎖抗体、市販抗体ともにヒト乳腺ガン細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において分子量６６ｋＤ付近にバンドが確認され、単鎖抗体がＭＴ１−ＭＭＰと特異的に反応していることが示された。また、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は市販抗体と比較し、反応性が高いことが示唆された。
【実施例７】
【００７６】
本発明の単鎖抗体のマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）への結合能のＦＡＣＳによる評価
（７−１）実験方法
１．各単鎖抗体を２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ３中１００μｇ／１００μｌとなるように、amicon（３ＫＤａ）により濃縮し、Alexa Fluor 488 succinimidyl ester（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）０．７７μｌを加え、室温で１５分インキュベートした。
２．ＰＤ−１０カラムにて精製後、２８０ｎｍおよび４８８ｎｍの吸光度を測定した。
３．amicon（３ＫＤａ）を用いて１００μｌ程度まで濃縮を行った。
４．ＢＣＡ定量により抗体濃度を計算した。
５．マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を２×１０６個／ｓａｍｐｌｅとなるように細胞溶液を調製し、ＰＢＳで洗浄した。
６．蛍光標識抗体１０μｇ／ｍｌを１００μｌ加え、３７℃で３０分または６０分インキュベートした。
７．細胞を洗浄した後ＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁し、ＦＡＣＳによって測定を行った。
【００７７】
４８８ｎｍの吸光度（Ａ４８８）測定により蛍光量を、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）測定により抗体濃度を算出が可能であると考え、Ａ４８８／Ａ２８０の値によって、各抗体当たりの蛍光標識量を比較した。各抗体により標識量が異なるため、Ａ４８８／Ａ２８０の値で割ることによって補正し、抗体結合量を求めた。単鎖抗体は、一次抗体に直接蛍光標識を行っているためそれぞれの単鎖抗体における標識量が異なると考えられるため、吸光度を用いた補正を行った。
【００７８】
（７−２）結果
結果を表４に示す。単鎖ＭＭＰ９８−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は細胞に対する結合が強く、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１は細胞に対する結合が若干弱いことがわかった。
【表４】
【実施例８】
【００７９】
本発明の単鎖抗体のＭＴ１−ＭＭＰに対する結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による分析
（８−１）実験方法
固相化するペプチドとしては、抗体作製の際の免疫やファージディスプレイ法でのパンニングに用いたペプチド−ＢＳＡ複合体を用いた。また、タンパクはＭＴ１−ＭＭＰの１−３５０ａａ．の部分タンパク（市販品）を用いた。
手順
１．ＭＴ１−ＭＭＰタンパクまたはペプチドをｐＨ４．０酢酸ナトリウムバッファー中１０μｇ／ｍｌに希釈しセンサーチップに固定化した。
２．１で固定化したセンサーチップ上に各（単鎖）抗体２６７、８８、２９、９．６、３．２（１２５０、４１２、１３６、４５、１４．８）ｎＭを流した。
３．１レーンをＢＳＡのみで固定化し結合した数値を非特異的な結合とみなし、バックグラウンドとして減じた。
４．得られた結合・解離曲線から解析を行い、ＫＤ値を算出した。
用いたＭＴ１−ＭＭＰ部分ペプチドは
ペプチド３： ＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮ−Ｃｙｓ （配列番号：１３）
であった。
【００８０】
（８−２）実験結果
表面プラズモン分析において、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１はいずれもペプチド３への結合能を示した。これらの単鎖抗体について濃度をふってＫＤ値の算出を検討した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１についてはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）体も作成して検討した。これらの単鎖抗体のＫＤ値はいずれも１０−８Ｍのオーダーであり、ＭＴ１−ＭＭＰタンパクおよびペプチドに強く結合することがわかった。結果を表５に示す。
【表５】
【実施例９】
【００８１】
本発明の単鎖抗体の体内分布
（９−１）実験方法
担癌マウスとしてＦＭ３Ａマウス乳がん細胞をＰＢＳ（−）中に懸濁し（５ｘ１０６個／１００μＬ ＰＢＳ（−）／マウス）、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（雌性、５週齢）の右下肢に皮下移植し、２週間経過したものを用いた。
手順
１．５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３中にバッファー交換した単鎖抗体にＤＭＦ中ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ ２０ｅｑ．を加え、室温振盪下で１時間インキュベートした。
２．反応後、Amicon（１０ＫＤａ）で３回遠心（７５００×ｇ，２０分）し、未反応のＤＴＰＡを除いた。
３．濃縮した単鎖抗体濃度をＢＣＡ定量によって測定した。
４．１１１ＩｎＣｌ３を酢酸Ｎａ溶液で０．５ｍＣｉ／ｍｌとなるように希釈し、室温振盪下で５分間インキュベートした。
５．単鎖抗体１μｇに対し、１μＣｉとなるように、４の溶液を抗体溶液に添加し、室温振盪下で１時間インキュベートした。
６．ＰＤ−１０カラムで精製し、単鎖抗体画分のみを採り、Amicon（１０ＫＤａ）で濃縮した。
７．０．５μＣｉ／１００μｌ ｓａｌｉｎｅとなるように、生食で希釈した。
８．１１１Ｉｎ標識抗ＭＴ１−ＭＭＰ単鎖抗体（０．５μＣｉ、０．５μｇ／１００μＬ ｓａｌｉｎｅ）をマウス尾静脈より投与し、３時間、２４時間後に屠殺し、各臓器を摘出し、重量、放射能を測定した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１については１５分、１時間、３時間、６時間、２４時間について測定を行った。
【００８２】
（９−２）実験結果
ＦＡＣＳ、ＳＰＲの結果から有望と考えられた単鎖抗体ＭＭＰ９８−１について１５分、１時間、３時間、６時間、２４時間のタイムポイントについて体内分布を調べた。結果を表６に示す。腎臓への集積が非常に高かった。腫瘍への集積は３時間がピークであった。血液からの抜けがよく良好なＴ／Ｂ（腫瘍／血液）比を得た。
【表６】
【００８３】
腫瘍への集積のピークである３時間と２４時間群に関して、他の単鎖抗体でも評価を行った。結果を表７、表８に示す。
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
実施例８においてペプチド３に親和性を持つ単鎖抗体（ＭＭＰ９８−１、ＭＭＰＫ９Ｅ−１、ＭＭＰＫ９Ｉ−１）では、高い腫瘍集積性が見られた。これら３種の単鎖抗体の腫瘍／血液（Ｔ／Ｂ）比を３時間および２４時間において調べた結果を表９に示す。いずれの単鎖抗体も２４時間において高いＴ／Ｂ比を示し、なかでも単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１のＴ／Ｂ比が高かった。特に、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１に関しては他に比較して腎臓への集積も少ないため、今回評価した単鎖抗体の中では最もイメージングに適した性質を持っていると考えられた。
【表９】
【実施例１０】
【００８６】
本発明の単鎖抗体による腫瘍のオートラジオグラフィーおよび免疫染色
（１０−１）実験方法
担がんマウスとしてＦＭ３Ａマウス乳がん細胞をＰＢＳ（−）中に懸濁し（５ｘ１０６個／１００μＬ ＰＢＳ（−）／マウス）、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（雌性、５週齢）の右下肢に皮下移植し、２週間経過したものを用いた。
オートラジオグラフィー手順
１．担がんマウスに１１１Ｉｎ標識単鎖抗体Ｃ（１５μＣｉ／１μｇ）を尾静脈より投与した。
２．投与２４時間後、生理食塩水で経心還流を行った後、ＰＬＰ固定液（７５ｍＭ Ｌ（＋）−リジン塩酸塩、４％パラホルムアルデヒドを含む３７．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４））で還流固定した。
３．摘出した腫瘍をクリオスタットにより腫瘍切片とした。
４．組織切片をイメージングプレートに１週間露光させ、画像解析装置を用いてオートラジオグラムを得た。
【００８７】
免疫染色手順
１．オートラジオグラフィーに付した標本に隣接して、クリオスタットを用いて切片を作製した。
２．アルコールによる親水化の後、１０％過酸化水素水と室温で３０分間反応させた。
３．ＴＢＳ−ＢＳＡ（Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ（ｐＨ７．６）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ）と室温で３０分間反応させた。
４．１次抗体（ＭＴ１−ＭＭＰ Ｆ−８４抗体）と４℃で一晩反応させた。
５．ＥＮＶＩＳＯＮポリマー試薬（Ｋ４０００）と３０分間反応させた。
６．ＤＡＢと１５分間反応させた後、ヘマトキシリンにより核染色を行った。
７．脱水、キシレンによる透徹後、封入剤を用いて封入した。
【００８８】
（１０−２）実験結果
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１による腫瘍のオートラジオグラフィーおよび免疫染色の結果を図５に示す。両者の染色パターンが一致することが確認された。
【実施例１１】
【００８９】
本発明に係わる抗体を用いるフロー式免疫測定法によるＭＴ１−ＭＭＰの免疫測定
実施例１において単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１の遺伝子を単離したハイブリドーマ１９Ｂが産生する抗体ＩｇＧ、ＭＭＰＫ９Ｉを用いて、ＪＩＳ Ｋ ０４６４においてＰＣＢの免疫測定法として記載されているフロー式免疫測定法への適用を検討した。フロー式免疫測定を行うための機器としては、例えばフロー式イムノセンサＤＸＳ−６１０（京都電子工業社製）などの利用が可能である。前記（１−１）で作製したＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートを、ガンツ化成社製ポリスチレンビーズ、ガンツパールＧＳ−１００Ｓに物理吸着させ、ブロックエース（雪印社製）溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体ＭＭＰＫ９ＩとＣｙＴＭ５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ´）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｎｏＲｅｓｅｒｃｈ社製）を０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）中で反応させた。次いで、この溶液を０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）にて調製した終濃度０．０〜１００ｎｇ／ｍＬのＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドの溶液とそれぞれ反応させた後、抗体結合担体へ流速０．７５ｍＬ／分で作用させた。次いで、０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を流速０．７５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除したのち蛍光強度を測定した。ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドを添加しない抗体溶液において十分な蛍光量が得られた。これをコントロール（Ｂ０）値とし、Ｂ０値に対するＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチド添加により低下した蛍光量（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を、ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチド濃度に対しプロットしたところペプチド濃度に依存的な反応が確認された。阻害曲線を図６に示す。阻害曲線より求められたＩＣ５０は約４．７４ｎｇ／ｍｌであり、また、３回測定のＣＶ値は最大でも３．５％未満と安定していた。以上のことから本抗体がフロー式免疫測定法による免疫測定に、有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、がんの診断薬の分野および研究分野などにおいて利用可能である。
【受託番号】
【００９１】
単鎖抗体ＭＭＰ９８産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された。
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された。
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号：１は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：８は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、マウスＭＴ１−ＭＭＰタンパクの部分アミノ酸配列のＣ末端にシステインを付したペプチドのアミノ酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断や検査に用いられる新規単鎖抗体およびそれを用いた放射性分子イメージングプローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの浸潤、転移においてＥＣＭや基底膜の分解は必須のステップであり、ＭＭＰはこの過程を制御する重要な一連の酵素群である。ＭＭＰはその構造に基づいて分泌型と膜結合型に大別されるが、中でも膜結合型であるＭＴ１−ＭＭＰは、（１）腫瘍形成の早期より発現しその発現が腫瘍組織に限局する、（２）Ｉ・ＩＩ・ＩＩＩ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど広範囲のＥＣＭ構成成分に対する分解活性をもつ、（３）インテグリン、ＣＤ４４などの細胞接着分子を細胞表面で制御する、（４）ＭＭＰ−２、−１３を細胞表面で活性化する、等の性質を有し、ＭＴ１−ＭＭＰの発現はがんの悪性度と相関することが示されてきており、ＭＴ１−ＭＭＰ変異体を発現させたがん細胞では増殖性・浸潤性が顕著に抑制されることが明らかとなっている。加えて、ＭＴ１−ＭＭＰはほとんどのヒトがん組織において発現していることが示されるに至って、ＭＴ１−ＭＭＰを標的としたがんの診断法・治療法の開発が急務となっている。これまでに、ＭＭＰ（特に分泌型ＭＭＰ）を標的とした分子イメージングプローブの開発が積極的に進められてきているが、ＭＴ１−ＭＭＰ選択的なイメージングプローブとして有効なものは未だ報告されていない。
【０００３】
ＭＴ１−ＭＭＰを標的とした放射性プローブは全長のＩｇＧ抗体を用いたものが報告されている（非特許文献１、２参照）が、イメージングの指標となる腫瘍血液比は投与４８時間後で１．５程度であり十分とはいえない。また、放射性核種として半減期６時間の９９ｍＴｃを用いていることから、投与４８時間後では放射能の減衰が著しく、現実的なイメージングへの使用に耐えない。２段階投与法（プレターゲティング法）を用いた報告（非特許文献３参照）では担がんマウスのＳＰＥＣＴイメージングに成功しているが、リンカーペアとして用いているストレプトアビジンは免疫原性の問題があることから臨床応用可能性が低い。
【０００４】
がんを標的としたイメージングプローブとしては、細胞の糖代謝に応じて集積する１８Ｆ標識フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）が知られているが、がん病変に特異的ではないという問題点を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Development of a radiolabeled probe for detecting membrane type-1 matrix metalloproteinase on malignant tumors. Temma T, Sano K, Kuge Y, Kamihashi J, Takai N, Ogawa Y, Saji H. Biol Pharm Bull. 2009 Jul;32(7):1272-7.
【非特許文献２】Imaging with radiolabelled anti-membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) antibody: potentials for characterizing atherosclerotic plaques. Kuge Y, Takai N, Ogawa Y, Temma T, Zhao Y, Nishigori K, Ishino S, Kamihashi J, Kiyono Y, Shiomi M, Saji H. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2010 Nov;37(11):2093-104.
【非特許文献３】Radioimmunodetection of membrane type-1 matrix metalloproteinase relevant to tumor malignancy with a pre-targeting method. Sano K, Temma T, Kuge Y, Kudo T, Kamihashi J, Zhao S, Saji H. Biol Pharm Bull. 2010;33(9):1589-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の解決課題は、がん病変に特異的で、画像診断として最適な薬物動態を示し、しかも免疫原性の問題がない臨床応用に適したがんの画像診断用プローブを提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意研究を重ね、ＭＴ１−ＭＭＰに特異的な単鎖抗体を得ることに成功し、これらを放射性標識したものが、がんの特異的イメージング剤として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、がん病変に特異的で、画像診断として最適な薬物動態を示し、しかも免疫原性の問題がない臨床応用に適したがんの画像診断用プローブが提供される。
【０００９】
したがって、本発明は下記のものを提供する：
（１）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（２）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（３）ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（５）（４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター；
（６）（５）に記載のベクターで形質転換した形質転換体；
（７）（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体の製造方法であって、（５）に記載のベクターで形質転換した形質転換体を適当な培地中で培養し、該形質転換体または培地から単鎖抗体を回収することを含んでなる方法；
（８）独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された細胞、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された細胞、または独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載された単鎖抗体の製造方法；
（９）標識されている（１）〜（３）のいずれかに記載された単鎖抗体；
（１０）放射性標識された（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤；
（１１）（１０）に記載の分子イメージングプローブ剤を含む、癌の画像診断剤またはキット；
（１２）対象中のがんの存在を調べる方法であって、対象から得られた試料に（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を接触させることを特徴とする方法；
（１３）ＭＴ１−ＭＭＰの免疫学的測定もしくは検出のための、（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を含むことを特徴とする試薬またはキット；
（１４）ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定または検出する方法であって、（１）〜（３）のいずれかに記載の単鎖抗体を試料と接触させることを特徴とする方法；
（１５）単鎖抗体が標識されている（１２）また（１４）に記載の方法、あるいは（１３）に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の単鎖抗体の抗原固定化ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、本発明の単鎖抗体のＣｅｌｌ ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、本発明の単鎖抗体の間接競合ＥＬＩＳＡによる阻害曲線を示す。
【図４】図４は、本発明の単鎖抗体のウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン１はＭＭＰ９８−１（１μｇ／ｍｌ）、レーン２はＭＭＰＫ９Ｅ−１（１μｇ／ｍｌ）、レーン３は市販抗体ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）である。
【図５】図５は、腫瘍の免疫染色（左パネル）および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１によるオートラジオグラフィー（右パネル）の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の単鎖抗体のフロー式免疫測定法による阻害曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸は当業者に公知の１文字表記または３文字表記で示される。特に断らないかぎり、本明細書中の他の用語についても、生物学の分野の教科書や辞書に記載されている通常の意味に解釈される。また、本明細書において、特に断らないかぎり、ＭＴ１−ＭＭＰはＭＴ１−ＭＭＰタンパクを意味する。
【００１２】
本発明は、第１の態様において、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する新規単鎖抗体を提供する。上述のごとく、ＭＴ１−ＭＭＰは、ほとんどのヒトがん組織において発現しており、その発現ががんの悪性度と相関している。したがって、本発明の新規単鎖抗体を用いてＭＴ１−ＭＭＰの発現を調べることによって、対象の体内のがんの存在および悪性度を知ることができる。
【００１３】
１の具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰ９８−１」と称する。
【００１４】
さらなる具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１」と称する。
【００１５】
さらなる具体例において、本発明の単鎖抗体は、ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む。本明細書において、この具体例の抗体を「抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１」と称する。
【００１６】
本発明の上記単鎖抗体は、いずれもＭＴ１−ＭＭＰに対する結合活性を有し、ＭＴ１−ＭＭＰの部分配列であるＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮのＣ末端にＣｙｓを付した配列：
ＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮＣ（配列番号：１３）
からなるペプチドに対して５０ｎＭ以下、好ましくは４０ｎＭ以下、さらに好ましくは３０ｎＭ以下のＫＤ値を示す。
【００１７】
本発明は、さらなる態様において、上記の本発明の単鎖抗体と同様の特性を有する変異単鎖抗体も提供する。これらの変異単鎖抗体の具体例としては下記のものが挙げられる。
【００１８】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：２で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：６で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有し、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、付加または欠失されているアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体；ならびに
配列番号：２、配列番号：６配もしくは列番号：１０で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するＨ鎖可変領域と、配列番号：４、配列番号：８配もしくは列番号：１２で示されるアミノ酸配列のいずれかを有するＬ鎖可変領域の任意の組み合わせからなる単鎖抗体。
これらの単鎖抗体は、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに対して５０ｎＭ以下、好ましくは４０ｎＭ以下、さらに好ましくは３０ｎＭ以下のＫＤ値を示す。
【００１９】
がんの画像診断あるいはＭＴ１−ＭＭＰの測定または検出といった観点から、上記の単鎖抗体が検出可能な様式で標識されていることが好ましい。抗体の標識法は当業者に公知であり、適宜選択して抗体を標識することができる。抗体の標識法としては、例えば、ＦＩＴＣなどを用いる蛍光標識法、ペルオキシダーゼなどを用いる酵素標識法、９９ｍＴｃや１１１Ｉｎなどを用いる放射性標識法、ビオチン標識法などが挙げられる。本発明の単鎖抗体は分子サイズがＩｇＧの約５分の１であり、体内動態が改善されている。そこで、放射性標識に用いる放射性核種としては、ＳＰＥＣＴ用とする場合には半減期が約３日である１１１Ｉｎが使い易い。なお、本明細書において、本発明の単鎖抗体という場合には、標識されている本発明の単鎖抗体も包含する。
【００２０】
さらに、放射性標識をする場合において、放射性標識により標的認識機能が損なわれないよう、二官能性キレート導入用のリジン残基を複数個、抗体のＣ末端に導入することが好ましい。したがって、１１１Ｉｎにて標識されており、リジン残基を複数個Ｃ末端に導入されている本発明の単鎖抗体は、イメージングに必要な高い腫瘍血液放射能比を投与早期から得ることができるので、特に好ましいものである。
【００２１】
本発明の単鎖抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ファージディスプレイ法やハイブリドーマ法を用いて得ることができる。これらの方法に公知の遺伝子操作技術をさらに組み合わせることもできる。これらの方法の詳細は、実施例を参照されたい。ただし、本発明の単鎖抗体を得る方法は、上記方法に限定されないことはいうまでもない。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、上で説明した本発明の単鎖抗体または変異単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、もう１つの態様において、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、ならびに該ベクターにて形質転換された細胞を提供する。
【００２３】
かかるポリヌクレオチドは、上記のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドのほか、リンカー配列、Ｈｉｓタグ配列、Ｖ５タグ配列など（これらの配列に限定されない）をコードするポリヌクレオチド含んでいてもよい。
【００２４】
本発明の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターまたはクローニングベクターに組み込んで適当な細胞に導入して形質転換し、形質転換細胞を適当な培地にて培養し、産生された単鎖抗体を培地から回収することにより、本発明の単鎖抗体、すなわち単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を得ることができる。細胞の種類の選択、細胞の形質転換法、細胞の培養法、培地からの単鎖抗体の回収および精製のための手段・方法は当業者に公知であり、当業者は目的に応じてこれらの方法を適宜選択して用いることができる。例えば、細胞へのポリヌクレオチドの導入にはＰＥＧおよびＣａイオンを用いてベクターを導入する方法、エレクトロポーレーション法、遺伝子銃を用いる方法などがある。
【００２５】
上記の変異単鎖抗体についても、それらのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを用いて、同様の手段・方法にて得ることができる。
【００２６】
なお、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１をコードするポリヌクレオチドをベクターに組み込み、これらを用いて昆虫細胞を形質転換することにより、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰ９８−０と命名）、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰＫ９Ｅ−０と命名）および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を産生する細胞（出願人においてＭＭＰＫ９Ｉ−０と命名）を得た。これらの単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を産生する細胞は、それぞれ、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、２０１０年１２月２日に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８、ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９およびＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。これらの細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することによっても、本発明の単鎖抗体、すなわち単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１を得ることができる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、放射性標識された本発明の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤を提供する。すなわち、放射性標識された本発明の単鎖抗体を用いて、がんを画像診断することができる。放射性標識としては、ＳＰＥＣＴ用には１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、６７Ｇａ、２０１Ｔｌ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅなどのγ線放出核種を用いることができるが、これらの核種に限定するものではない。また、ＰＥＴ用には１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、７６Ｂｒなどの陽電子放出核種を標識に用いることができるが、これらの核種に限定するものではない。
【００２８】
１１１Ｉｎにて標識されており、リジン残基を複数個Ｃ末端に導入されている本発明の単鎖抗体は、イメージングに必要な高い腫瘍血液放射能比を投与早期から得ることができるので、がんの画像診断に特に好ましいものである。
【００２９】
本発明のがんの分子イメージングプローブ剤は、放射性標識された本発明の単鎖抗体のほか、通常使用される賦形剤や担体を含みうる。これらの賦形剤や担体も公知であり、当業者は目的に応じて適宜選択して用いることができる。本発明の分子イメージングプローブ剤の剤形はいずれの剤形であってもよいが、注射剤や輸液剤の形態が好ましい。本発明のがんの分子イメージングプローブ剤は、使用前に本発明の単鎖抗体を放射性核種にて標識してから用いるのが一般的である。本発明の単鎖抗体の放射性核種での標識方法は公知の方法を用いて行い得る。１１１Ｉｎでの標識の具体例については本明細書の実施例を参照されたい。本発明のがんの分子イメージングプローブ剤を用いて、対象中のがんの存在、その部位、およびがんの悪性度を調べることができる。
【００３０】
本発明のがんの分子イメージングプローブ剤の用例を説明すると、本発明のがんの分子イメージングプローブ剤を対象に注射（局所投与、全身投与いずれでもよい）、輸液等の手段にて投与し、適当時間経過後、例えば投与後１〜２４時間経過後にＳＰＥＣＴまたはＰＥＴにて放射線を測定することにより、対象におけるがんの存在、その部位、およびがんの悪性度を調べることができる。がんの診断の場合には、正常対象との比較を行うことが望ましい。また、対象におけるがんの経過や予後を見る場合には、経時的に検査を行うことが望ましい。これらの診断、検査の方法、手技は、通常のガンの診断、検査、ならびに通常の画像診断の方法、手技と基本的に変わることはない
【００３１】
本発明は、さらなる態様において、上記分子イメージングプローブ剤を必須構成成分として含む、癌の画像診断剤またはキットを提供する。通常の場合、キットには取扱説明書を添付する。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、対象中のがんの存在または悪性度を調べる方法であって、対象に本発明の単鎖抗体を投与し、対象中のＭＴ１−ＭＭＰに結合した本発明の単鎖抗体の量を調べることを特徴とする方法を提供する。この方法において、好ましくは本発明の単鎖抗体は放射性核種にて標識されている。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、対象中のがんの存在または悪性度を調べる方法であって、対象から得られた試料に（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を接触させ、該試料中のＭＴ１−ＭＭＰの存在または量を測定することを特徴とする方法を提供する。この方法において、本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。ここで、接触とは、試料中のＭＴ１−ＭＭＰと本発明の単鎖抗体を結合可能な状況に置くことをいい、例えば、試料溶液と本発明の単鎖抗体を混合し、室温または動物の体温付近の温度にて適当時間インキュベートすることであってもよい。
【００３４】
本発明は、もう１つの態様において、ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定、検出もしくは捕獲するための、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を含むことを特徴とする試薬またはキットを提供する。該試薬またはキットを用いて、試料中のＭＴ１−ＭＭＰを捕獲したり、存在や量を調べたりすることができる。このような測定や検出を目的とする試薬やキットにおいては、本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明は、もう１つの態様において、ＭＴ１−ＭＭＰを免疫学的に測定、検出もしくは捕獲する方法であって、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の単鎖抗体を試料と接触させることを特徴とする方法を提供する。このような測定や検出方法においては本発明の単鎖抗体は標識されていることが好ましい。かかる標識としては酵素標識、蛍光標識、放射性標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００３７】
（１−１）ペプチドコンジュゲートの調製
ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域に含まれるアミノ酸配列を有するヒンジ領域ペプチドを合成し、リンカーＳｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、キャリアータンパク質と結合させ、ペプチドコンジュゲートを合成した。
【００３８】
（１−２）マウスの免疫
得られたコンジュゲートを免疫原として、マウスを免疫した。
前記ペプチドコンジュゲートと、アジュバントＲＡＳＲ−７００(ＲＩＢＩ社)とを１：１容量に混合して十分に乳化させ、得られた乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢、雌）の腹腔内に２００μＬ投与する事によりマウスを免疫感作した。追加免疫は、約２〜３週間間隔で行い、追加免疫から１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して免疫原に対する抗体価の推移を観察した。
【００３９】
（１−３）ハイブリドーマの作製
血中に免疫原に対する高い抗体産生が認められたマウス尾静脈内に、さらに免疫原を投与して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に、免疫した前記マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製し、対数増殖期にあるミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３あるいはＳｐ２／Ｏ）と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）添加の１０％ ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地中に懸濁させ脾臓細胞数で１〜２×１０５細胞／ウエルになるように９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下で培養した。
【００４０】
（１−４）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニング
細胞融合より７〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法にて抗体価を測定した。
【００４１】
（１−５）抗体産生ハイブリドーマのスクリーング（抗体価の測定）
マイクロタイタープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各ウエルに、０．２５〜１μｇ／ｍＬの各免疫原のＰＢＳ(−)希釈溶液５０μＬを加え、室温で１時間静置して固相化した。また、前記ペプチドコンジュゲート中のキャリアータンパク質に対する抗体産生クローンを除外する為に、ＢＳＡ、又はＫＬＨを固定化したウエルを対照として用いた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ(−)（洗浄液）３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、ブロックエース粉末（雪印社製、ＵＫ−Ｂ８０）１ｇを１００ｍＬの精製水にて溶解させた溶液（ブロッキング試薬）３００μＬをウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄後、１次抗体を含む培養上清５０μＬを各ウエルに添加して混和した後、室温条件下で３０〜６０分間静置して反応を行わせた。次いで、洗浄液３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、固相化した各免疫原に結合した１次抗体を検出するために、ブロックエース粉末０．４ｇを１００ｍＬの精製水にて溶解させた溶液（２次抗体希釈液）にて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）（ＫＰＬ社製）を２次抗体溶液として５０μＬ加えて、室温で１時間反応させた。ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄した後、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）を各ウエルに加え、室温条件下にて発色反応を行った。５〜１５分間後に１Ｍリン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに４５０ｎｍ（対照：ＯＤ６５０）の吸光度を測定した。各免疫原を固定化したウエルと対照ウエルとの吸光度差を、前記免疫原に対する抗体の結合活性とした。
【００４２】
（１−６）間接競合法による特異抗体産生クローンの選抜
前記（１−５）に従い、マイクロタイタープレートの各ウエルに各免疫原を固相化し、洗浄ののち精製水で４倍希釈したブロックエース溶液３００μＬをウエルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行った。ウエルを洗浄液３００μＬで３回洗浄した。
次いで、ＰＢＳ（−）で調製したヒンジ領域ペプチド溶液を用意し、各々２５μＬを、免疫原固相化プレートの各ウエルに加えた。次に、ハイブドーマ培養上清２５μＬをウエル内に添加して混和した後、室温条件下で３０〜６０分間静置して反応を行わせた。
洗浄液３００μＬで各ウエルを３回洗浄した後、固相化免疫原に結合した１次抗体を検出するために２次抗体希釈液にて３０００倍希釈に調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（γ鎖認識）を２次抗体溶液として５０μＬ加え、室温条件下で１時間反応させた。
ウエルを洗浄液３００μＬで同様に３回洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を各ウエルに加えて室温で発色反応を行った。５〜１５分間後に１Ｍ リン酸５０μＬを加えて反応停止し、マイクロプレートリーダー（マルチスキャンＭＳ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて直ちに４５０ｎｍ（対照：ＯＤ６５０）の吸光度を測定した。対照ウエルの吸光度値（コントロールＯＤ；Ｂ０） に対するヒンジ領域ペプチド共存下のウエル吸光度値(Ｂ)の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、共存物質に対する抗体の反応性を判断した。ヒンジ領域ペプチドに対する結合活性が高く、かつ継続的に高い抗体産生が確認されたウエルのハイブリドーマ６６Ｃ及びハイブリドーマ１９Ｂを選抜し、限界希釈法によるクローニングに供した。
【００４３】
（１−７）ｍＲＮＡの精製とｃＤＮＡ合成
前記（１−６）で選抜したハイブリドーマ６６Ｃ及びハイブリドーマ１９Ｂを、５％ＣＯ２通気条件下、１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させた。対数増殖期にある約１ｘ１０７個の細胞から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。次いで、スーパースクリプトＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いて常法に従いファーストストランドｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔの添付書類で推奨されている条件によりＰ Ｃ Ｒ を行い、抗体遺伝子可変領域遺伝子ＤＮＡを増幅した。
【００４４】
（１−８）塩基配列の決定とアミノ酸配列の解析
前記（１−７）で増幅された抗体遺伝子可変領域遺伝子ＤＮＡについて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりシークエンス反応を行った。次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて配列を解析した。塩基配列の解析ならびにアミノ酸配列の推定および解析には、解析ソフトＤＮＡｓｉｓ（日立ソフトエンジニアリング）を使用した。また、配可変領域の特定には、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（http://imgt.cines.fr）を利用した。その結果、得られた抗体遺伝子のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列およびその推定アミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００４５】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：５
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACAAGCTATGCATTGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGAAATACACCAACACTGGAGAGCCAACATATGGTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATTAACAACCTCAAAAATGAGGACATGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGGACTTAGTTCCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【００４６】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：６
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTSYALHWVKQAPGKGLKWMGWKYTNTGEPTYGDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGGLSSYAMDYWGQGTSVTVSS
【００４７】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：７
GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCACTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【００４８】
ハイブリドーマ６６Ｃで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｅ）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：８
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGTGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLLVTFGAGTKLELKR
【００４９】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：９
CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACAGATTTACTGACTATGAAATGCACTGGGTGAGGCAGACACCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTGATCCTGAAACTGGTGGTACTGCCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGAAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTACAACTATGATTACGACAGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
【００５０】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１０
QVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYRFTDYEMHWVRQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQKFKGKATLTEDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTTMITTALDYWGQGTSVTVSS
【００５１】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：１１
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTGATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
【００５２】
ハイブリドーマ１９Ｂで生成した抗体（抗体Ｋ９Ｉ）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：１２
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKR
【００５３】
（１−９）単鎖抗体発現ベクターの作製
抗体ＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子ｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いてリンカー配列をコードするＤＮＡにより連結し、これらをプラスミドベクターｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社製）の制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、常法に従いクローニングし、ハイブリドーマ６６Ｃに由来するものを単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｅとし、ハイブリドーマ１９Ｂに由来するものを単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｉとした。
【実施例２】
【００５４】
（２−１）単鎖抗体遺伝子ライブラリーの作製
脾臓細胞などの生体内で抗体産生を行っている細胞から抗体遺伝子ライブラリーを作製し、抗体遺伝子がコードする組換抗体をファージ表面に提示させ、目的の抗原と反応性を有する組換抗体の遺伝子を取得する方法として、ファージディスプレイ法が以前から知られている。前記（１−２）のＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート免疫マウスを用いて、抗体遺伝子ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法により抗ＭＴ１−ＭＭＰ単鎖抗体のスクリーニングを行った。ライブラリー作製とファージディスプレイ法については、MaCafferty J., Hoogenboom H.R.,Chiswell D.J., Antibody Engineering, (Oxford University Press)およびKontermann R., Dubel S., Antibody Engineering, (Springer)を参考に行った。
【００５５】
前記（１−２）で免疫したマウス脾臓細胞よりセパゾール ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ（ナカライ社製）を用いｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、このｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）によりｍＲＮＡを精製した。調製したｍＲＮＡ用い、前期（１−７）と同様の逆転写反応によりファーストストランドｃＤＮＡ合成を行った。ファーストストランドｃＤＮＡを鋳型とし、マウス抗体遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体ＩｇＧのＨ 鎖およびＬ 鎖の可変領域遺伝子ＤＮＡを増幅した。前記（１−９）同様、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域遺伝子ＤＮＡを、ＰＣＲを用いてリンカー配列をコードするＤＮＡにより連結した。これらをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅの制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、これらにより大腸菌ＴＧ１株を常法に従い形質転換した。形質転換した大腸菌は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ寒天培地にプレーティングし、３０℃で終夜培養した。増殖した菌体は、数ｍｌの培地を加え、コンラージ棒でかき取り回収した後、Ｍ１３ＫＯ７ファージによるファージレスキューを行なった。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２％のグルコースを含む２×ＹＴ培地によりＯＤ６００＝０．３に調整した大腸菌の培養液、総量３５ｍｌを３７℃で１時間振とう培養した後、Ｍ１３ＫＯ７ファージを終濃度４×１０９ｐｆｕ／ｍｌとなるよう添加し、さらに３７℃で１時間振とう培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌとカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２×ＹＴ培地４０ｍｌに再懸濁し３７℃で終夜培養し、培地中に単鎖抗体提示ファージを産生させた。ファージはポリエチレングリコール沈殿により回収し、これを単鎖抗体遺伝子ライブラリーとした。終夜培養後の培養液を遠心分離により菌体を除いた培養上清を回収し、培養１２．５ｍｌに対し、２．５Ｍ ＮａＣｌ含有２０％ポリエチレングリコール溶液２．５ｍｌを加え混和した。氷上で1時間静置した後、冷却下１００００Ｇで２０分間遠心分離した。上静を完全に捨て２×ＹＴ培地１ｍｌに再けん濁し単鎖抗体提示ファージ溶液とした。
【００５６】
（２−２）ファージディスプレイ法によるスクリーニング
調製した単鎖抗体提示ファージ溶液から、抗原に対する反応性の高いものを濃縮するため、バイオパニングを行った。ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートを固相化し、ブロックエースでブロッキングした９６穴マイクロタイタープレートに、調製した単鎖抗体提示ファージ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ入れ、室温で１時間静置した。反応の後、溶液を除き、洗浄液３００μＬで３回洗浄し洗浄液を完全に除いたのち、０．１Ｍグリシン-塩酸緩衝液ｐＨ２．２を加え、１０分間静置後、ピペッティングした後これを回収し、直ちにトリス溶液ｐＨ８．０で中和した。
濃縮した単鎖抗体提示ファージを、再感染とファージレスキューにより増幅した。回収した溶液は２×ＹＴ培地１０ｍＬ中でＯＤ６００＝０．３まで培養した大腸菌ＴＧ１の培養液に混和し、３７℃で１時間培養し再感染させた。再感染後、ファージレスキューのために、アンピシリンが終濃度１００μｇ／ｍＬ、グルコースが終濃度２％、Ｍ１３ＫＯ７ファージが終濃度４×１０９ｐｆｕ／ｍＬとなるようそれぞれの溶液を添加し、さらに３７℃で培養した。１時間の培養後、遠心分離により菌体を回収し、アンピシリン１００μｇ／ｍＬとカナマイシ５０μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地１０ｍＬに再懸濁し３７℃で終夜培養し、培地中に単鎖抗体提示ファージを産生させた。増幅したファージは再びポリエチレングリコール沈殿により回収した。バイオパニングによる濃縮と再感染、ファージレスキューによる増幅を３〜５回繰り返し、バイオパニング後のファージを大腸菌ＴＧ１に感染させ、これを寒天平板培地にプレーティングし、３０℃で終夜培養しコロニーを形成させた。
【００５７】
（２−３）バイオパニング後の単鎖抗体提示ファージの反応性評価
バイオパニングにより得られた単鎖抗体提示ファージの、固相化抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡにより評価した。
マイクロタイタープレートにＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート５０μＬを加え、室温１時間反応させた。対照にはＰＢＳ（−）を用いた。洗浄液で洗浄した後、ブロックエースによりブロッキングした。マイクロタイタープレートのウエルを洗浄後、０．１％ブロックエースで調製した単鎖抗体提示ファージ溶液５０μＬを添加し、室温１時間反応させた。ウエルを洗浄した後、５０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（アマシャム バイオサイエンス 社製）を加えて、室温１時間反応させた。マイクロプレートを洗浄し未反応液を十分除いた後、基質溶液（ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＫＰＬ社製）５０μＬを加え、室温で５〜１５分間反応させた後、１Ｍ リン酸溶液 ５０μＬを添加して反応を停止した。プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）により吸光度ＯＤ４５０（対照：ＯＤ６５０）を測定した。その結果、クローン番号９８の単鎖抗体提示ファージが固相化抗原と反応性を有することを見出した。
【００５８】
（２−４）塩基配列の決定とアミノ酸配列の解析と単鎖抗体発現ベクター作製
ＥＬＩＳＡで固相化抗原と反応したクローン番号９８の単鎖抗体提示ファージクローン遺伝子の配列を解析した。シークエンスは前記（１−８）同様に、ダイターミネーター法によって行った。その結果、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の遺伝子配列を有していることが確認された。解析結果を以下に示す。
【００５９】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：１
GAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACCTGAACTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATCCCGTCACAAAGTACGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACGTACACTGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGACGATTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAACACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAGATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAACTCCCACGGTAAATACGTGGAATGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCC
【００６０】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：２
EVQLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYPVTKYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLETSANTAYLQINNLKDEDTATYFCANSHGKYVEWFTYWGQGTTVTVSS
【００６１】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列：配列番号：３
GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATCACTATCACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCAATTACTTGCATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAACTCTTGATTTATAGGACATCCAATCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTAGTATACCACTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【００６２】
発現した単鎖抗体（単鎖抗体ＭＭＰ９８）のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列：配列番号：４
DIELTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGFSPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPLTFGAGTKLELKR
【００６３】
クローン番号９８のファージミドより制限酵素ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩにより単鎖抗体遺伝子を切り出し、プラスミドベクターｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社製）の制限酵素サイトＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ間に挿入後、常法に従いクローニングし、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰ９８とした。
【実施例３】
【００６４】
（３−１）組換え単鎖抗体発現細胞株の作製
遺伝子導入キット ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔＴＭ ＢＳＤ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を用いて、昆虫細胞 Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（インビトロジェン社製）に単鎖抗体発現ベクターを導入し、培養培地（抗生物質不含）にて４８時間培養した後、培養培地（抗生物質含有）にて細胞を１／５濃度に希釈し、培養デッシュに播種した。５、６時間静置、細胞が底面に付着した事を確認し、培地を除去した。選択培地（２０μｇ／ｍｌブラストシジン（インビトロジェン））に交換し、４日間培養した。選択培地の添加により、遺伝子が導入されていない細胞な死滅した。抗原固定化ＥＬＩＳＡ法で培養上清の評価をおこない、陽性クローンを選抜した後、限界希釈法により単クローン化し、単鎖抗体安定発現細胞株を樹立した。樹立した細胞株はそれぞれ単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰ９８を導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰ９８−０、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｅを導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰＫ９Ｅ−０、単鎖抗体発現ベクターｐＭＩＢ−ＭＭＰＫ９Ｉを導入したものを単鎖抗体発現細胞株ＭＭＰＫ９Ｉ−０とし、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託し、それぞれ、２０１０年１２月２日に受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８、ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９、ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。
【実施例４】
【００６５】
（４−１）精製単鎖抗体の調製
前記（３−１）で樹立した単鎖抗体発現細胞株を約１Ｌスケールで培養し、細胞濃度が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに到達した時点で培養上清を回収した。回収した培養上清から、２種類の金属キレートカラムを用いたアフィニティー精製により単鎖抗体を調製した。
まず、担体Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）１ｍｌをＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。カラムをＰＢＳ（−）にて平衡後、培養上清１Ｌをアプライした。１０ｍｌのＰＢＳ（−）、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）の順に洗浄をおこなった。３ｍｌの５００ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で溶出をおこない、単鎖抗体画分を得た。単鎖抗体画分を０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）にて透析をおこなった。
【００６６】
次いで、担体ＴＡＲＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）5ｍｌをＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。カラムを０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）にて平衡後、透析後の抗体溶液をアプライした。５０ｍｌの１０ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で洗浄をおこなった。２０ｍｌの５００ｍＭイミダゾール、０．３ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸二水素緩衝液（ｐＨ８．３）で溶出をおこない、単鎖抗体画分を得た。単鎖抗体画分をＰＢＳ（−）にて透析をおこない単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１の精製単鎖抗体とした。
【実施例５】
【００６７】
精製単鎖抗体のＥＬＩＳＡによる評価
得られた精製単鎖抗体の免疫測定法における適性を評価するため、抗原固定化ＥＬＩＳＡ法、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法、間接競合ＥＬＩＳＡ法の３種類のＥＬＩＳＡを行った。また、比較対象には市販のマウス抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を用いた。
【００６８】
（５−１）抗原固定化ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ（−）にて０．５μｇ／ｍｌに調製したＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート溶液５０μlを９６ウエル プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウエルに添加し、室温にて1時間静置した。ウエルを３００μｌの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回洗浄した後１％ブロックエース（雪印社製）２５０μｌを添加し、室温で２時間ブロッキングをおこなった。洗浄液にてウエルを洗浄後、５０μｌの単鎖抗体溶液(０．１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製)をウエルに添加し、室温、３０分間反応させた。ウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエース（ミリＱ水にて調製）にて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、１０分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウエルの吸光度（測定波長： ４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００６９】
結果を表１、図１に示した。いずれの単鎖抗体も市販抗体と比較しＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートの固相化抗原に対して高い反応性が確認された。
【表１】
【００７０】
（５−２）Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ
ヒト乳腺ガン細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を９６ウエルプレートに１×１０４ｃｅｌｌ／ウエルで播種、一晩培養をおこなった。３００μｌの％ＦＢＳ含有、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、５０μｌの抗体溶液(０．１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（ー）にて調製)をウエルに添加し、室温、３０分間反応させた。さらに、ウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、10分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウェルの吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００７１】
結果を表２、図２に示した、いずれの単鎖抗体も市販抗体と比較しヒト乳腺ガン細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１表面抗原に対して高い反応性が確認された。
【表２】
【００７２】
（５−３）間接競合ＥＬＩＳＡ
ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲート（０．５μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）５０μlを９６ウエル プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウエルに添加し、室温、1時間静置した。ウエルを３００μｌの洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回洗浄した後１％ブロックエース（雪印社製）２５０μｌを添加し、室温、２時間ブロッキングをおこなった。洗浄液にてウエルを洗浄後、ＭＴ１−ＭＭＰペプチド（４００μｇ／ｍｌから５倍、９段階希釈ＰＢＳ（−）にて希調製）２５μｌと抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）２５μlを添加し、室温、３０分間反応させた。さらにウエルを洗浄し、単鎖抗体を添加したウエルには０．１％ブロックエースにて２０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）５０μｌを添加、市販抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間間反応させた後、再度、ウエルを洗浄した。単鎖抗体を添加したウエルには、０．１％ブロックエースにて３０００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加、室温、１時間反応させた。市販抗体を添加したウエルには、基質としてＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加し、室温、10分間反応させた後、１Ｍリン酸５０μｌを添加し反応を停止した。プレートリーダーで各ウエルの吸光度（測定波長：４５０ｎｍ、対象波長：６５０ｎｍ）を測定した。単鎖抗体を添加したウエルを洗浄し、市販抗体と同様にＴＭＢを添加し、吸光度を測定した。
【００７３】
結果を表３、図３に示した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１が市販抗体と比較し、抗原ペプチドに対する反応性が高いと確認され、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は市販抗体とほぼ同等であった。
【表３】
【実施例６】
【００７４】
ウェスタンブロッティング
実施例４で調製した単鎖抗体の反応性がＭＴ１−ＭＭＰ特異的であるか検討するため、ＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞を用い、ウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの方法はタンパク質・酵素の基礎実験法 堀尾武一編 南江堂出版を参照した。ヒト乳腺ガン細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のセルライゼートをＰＢＳ（−）にて蛋白質濃度２ｍｇ／ｍｌに調製し、セルライゼート希釈液２０μｌとβ-メルカプトエタノール含有ＳＤＳ化バッファー２０μｌを混合し９６℃、５分間加熱しＳＤＳ化した。ＳＤＳ化試料を１０μｌ／レーンをアクリルアミドゲル（濃縮ゲル：４％、分離ゲル７．５％）にアプライして、ミニプロテアンＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて１００Ｖで電気泳動をおこなった。次いで、ゲルを転写バッファー（トリス、グリシン、メタノール）に浸漬、馴染ませたのち、ミニトランスブロッティイングモジュール（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてメンブレンに１００Ｖ、２５０ｍＡ、４５分間転写した。転写終了後、メンブレンを脱イオン水で振盪洗浄し、１％ブロックエース中に終夜浸漬してブロッキングをおこなった。次に、（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−））にて３回、振盪洗浄をおこなった。各抗体（０．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）にて調製）をメンブレン上に滴下し、室温、１時間反応させた。振盪洗浄を３回おこない、単鎖抗体を添加したメンブレンには、０．１％ブロックエースにて１０００倍希釈した抗４×ヒスチジン抗体（キアゲン社製）を滴下、室温、１時間間反応させた。対象の市販抗体を添加したメンブレンには、０．１％ブロックエースにて１００００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体を滴下、室温、１時間間反応させた後、メンブレンを洗浄しＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を滴下、室温５分間反応後、化学発光を検出した。単鎖抗体を滴下したメンブレンを洗浄し、０．１％ブロックエースにて１００００倍希釈したＨＲＰＯ標識抗マウスＩｇＧ（γ）抗体を滴下、室温、１時間間反応させた後、メンブレンを洗浄しＥＣＬ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を滴下、室温５分間反応後、化学発光を検出した。
【００７５】
結果を図４に示した。各単鎖抗体、市販抗体ともにヒト乳腺ガン細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において分子量６６ｋＤ付近にバンドが確認され、単鎖抗体がＭＴ１−ＭＭＰと特異的に反応していることが示された。また、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は市販抗体と比較し、反応性が高いことが示唆された。
【実施例７】
【００７６】
本発明の単鎖抗体のマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）への結合能のＦＡＣＳによる評価
（７−１）実験方法
１．各単鎖抗体を２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ３中１００μｇ／１００μｌとなるように、amicon（３ＫＤａ）により濃縮し、Alexa Fluor 488 succinimidyl ester（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）０．７７μｌを加え、室温で１５分インキュベートした。
２．ＰＤ−１０カラムにて精製後、２８０ｎｍおよび４８８ｎｍの吸光度を測定した。
３．amicon（３ＫＤａ）を用いて１００μｌ程度まで濃縮を行った。
４．ＢＣＡ定量により抗体濃度を計算した。
５．マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を２×１０６個／ｓａｍｐｌｅとなるように細胞溶液を調製し、ＰＢＳで洗浄した。
６．蛍光標識抗体１０μｇ／ｍｌを１００μｌ加え、３７℃で３０分または６０分インキュベートした。
７．細胞を洗浄した後ＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁し、ＦＡＣＳによって測定を行った。
【００７７】
４８８ｎｍの吸光度（Ａ４８８）測定により蛍光量を、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）測定により抗体濃度を算出が可能であると考え、Ａ４８８／Ａ２８０の値によって、各抗体当たりの蛍光標識量を比較した。各抗体により標識量が異なるため、Ａ４８８／Ａ２８０の値で割ることによって補正し、抗体結合量を求めた。単鎖抗体は、一次抗体に直接蛍光標識を行っているためそれぞれの単鎖抗体における標識量が異なると考えられるため、吸光度を用いた補正を行った。
【００７８】
（７−２）結果
結果を表４に示す。単鎖ＭＭＰ９８−１および単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１は細胞に対する結合が強く、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１は細胞に対する結合が若干弱いことがわかった。
【表４】
【実施例８】
【００７９】
本発明の単鎖抗体のＭＴ１−ＭＭＰに対する結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による分析
（８−１）実験方法
固相化するペプチドとしては、抗体作製の際の免疫やファージディスプレイ法でのパンニングに用いたペプチド−ＢＳＡ複合体を用いた。また、タンパクはＭＴ１−ＭＭＰの１−３５０ａａ．の部分タンパク（市販品）を用いた。
手順
１．ＭＴ１−ＭＭＰタンパクまたはペプチドをｐＨ４．０酢酸ナトリウムバッファー中１０μｇ／ｍｌに希釈しセンサーチップに固定化した。
２．１で固定化したセンサーチップ上に各（単鎖）抗体２６７、８８、２９、９．６、３．２（１２５０、４１２、１３６、４５、１４．８）ｎＭを流した。
３．１レーンをＢＳＡのみで固定化し結合した数値を非特異的な結合とみなし、バックグラウンドとして減じた。
４．得られた結合・解離曲線から解析を行い、ＫＤ値を算出した。
用いたＭＴ１−ＭＭＰ部分ペプチドは
ペプチド３： ＰＱＰＲＴＴＳＲＰＳＶＰＤＫＰＫＮ−Ｃｙｓ （配列番号：１３）
であった。
【００８０】
（８−２）実験結果
表面プラズモン分析において、単鎖抗体ＭＭＰ９８−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１はいずれもペプチド３への結合能を示した。これらの単鎖抗体について濃度をふってＫＤ値の算出を検討した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１についてはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）体も作成して検討した。これらの単鎖抗体のＫＤ値はいずれも１０−８Ｍのオーダーであり、ＭＴ１−ＭＭＰタンパクおよびペプチドに強く結合することがわかった。結果を表５に示す。
【表５】
【実施例９】
【００８１】
本発明の単鎖抗体の体内分布
（９−１）実験方法
担癌マウスとしてＦＭ３Ａマウス乳がん細胞をＰＢＳ（−）中に懸濁し（５ｘ１０６個／１００μＬ ＰＢＳ（−）／マウス）、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（雌性、５週齢）の右下肢に皮下移植し、２週間経過したものを用いた。
手順
１．５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３中にバッファー交換した単鎖抗体にＤＭＦ中ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ ２０ｅｑ．を加え、室温振盪下で１時間インキュベートした。
２．反応後、Amicon（１０ＫＤａ）で３回遠心（７５００×ｇ，２０分）し、未反応のＤＴＰＡを除いた。
３．濃縮した単鎖抗体濃度をＢＣＡ定量によって測定した。
４．１１１ＩｎＣｌ３を酢酸Ｎａ溶液で０．５ｍＣｉ／ｍｌとなるように希釈し、室温振盪下で５分間インキュベートした。
５．単鎖抗体１μｇに対し、１μＣｉとなるように、４の溶液を抗体溶液に添加し、室温振盪下で１時間インキュベートした。
６．ＰＤ−１０カラムで精製し、単鎖抗体画分のみを採り、Amicon（１０ＫＤａ）で濃縮した。
７．０．５μＣｉ／１００μｌ ｓａｌｉｎｅとなるように、生食で希釈した。
８．１１１Ｉｎ標識抗ＭＴ１−ＭＭＰ単鎖抗体（０．５μＣｉ、０．５μｇ／１００μＬ ｓａｌｉｎｅ）をマウス尾静脈より投与し、３時間、２４時間後に屠殺し、各臓器を摘出し、重量、放射能を測定した。単鎖抗体ＭＭＰ９８−１については１５分、１時間、３時間、６時間、２４時間について測定を行った。
【００８２】
（９−２）実験結果
ＦＡＣＳ、ＳＰＲの結果から有望と考えられた単鎖抗体ＭＭＰ９８−１について１５分、１時間、３時間、６時間、２４時間のタイムポイントについて体内分布を調べた。結果を表６に示す。腎臓への集積が非常に高かった。腫瘍への集積は３時間がピークであった。血液からの抜けがよく良好なＴ／Ｂ（腫瘍／血液）比を得た。
【表６】
【００８３】
腫瘍への集積のピークである３時間と２４時間群に関して、他の単鎖抗体でも評価を行った。結果を表７、表８に示す。
【表７】
【００８４】
【表８】
【００８５】
実施例８においてペプチド３に親和性を持つ単鎖抗体（ＭＭＰ９８−１、ＭＭＰＫ９Ｅ−１、ＭＭＰＫ９Ｉ−１）では、高い腫瘍集積性が見られた。これら３種の単鎖抗体の腫瘍／血液（Ｔ／Ｂ）比を３時間および２４時間において調べた結果を表９に示す。いずれの単鎖抗体も２４時間において高いＴ／Ｂ比を示し、なかでも単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１のＴ／Ｂ比が高かった。特に、単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１に関しては他に比較して腎臓への集積も少ないため、今回評価した単鎖抗体の中では最もイメージングに適した性質を持っていると考えられた。
【表９】
【実施例１０】
【００８６】
本発明の単鎖抗体による腫瘍のオートラジオグラフィーおよび免疫染色
（１０−１）実験方法
担がんマウスとしてＦＭ３Ａマウス乳がん細胞をＰＢＳ（−）中に懸濁し（５ｘ１０６個／１００μＬ ＰＢＳ（−）／マウス）、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（雌性、５週齢）の右下肢に皮下移植し、２週間経過したものを用いた。
オートラジオグラフィー手順
１．担がんマウスに１１１Ｉｎ標識単鎖抗体Ｃ（１５μＣｉ／１μｇ）を尾静脈より投与した。
２．投与２４時間後、生理食塩水で経心還流を行った後、ＰＬＰ固定液（７５ｍＭ Ｌ（＋）−リジン塩酸塩、４％パラホルムアルデヒドを含む３７．５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．４））で還流固定した。
３．摘出した腫瘍をクリオスタットにより腫瘍切片とした。
４．組織切片をイメージングプレートに１週間露光させ、画像解析装置を用いてオートラジオグラムを得た。
【００８７】
免疫染色手順
１．オートラジオグラフィーに付した標本に隣接して、クリオスタットを用いて切片を作製した。
２．アルコールによる親水化の後、１０％過酸化水素水と室温で３０分間反応させた。
３．ＴＢＳ−ＢＳＡ（Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ（ｐＨ７．６）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ）と室温で３０分間反応させた。
４．１次抗体（ＭＴ１−ＭＭＰ Ｆ−８４抗体）と４℃で一晩反応させた。
５．ＥＮＶＩＳＯＮポリマー試薬（Ｋ４０００）と３０分間反応させた。
６．ＤＡＢと１５分間反応させた後、ヘマトキシリンにより核染色を行った。
７．脱水、キシレンによる透徹後、封入剤を用いて封入した。
【００８８】
（１０−２）実験結果
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ−１による腫瘍のオートラジオグラフィーおよび免疫染色の結果を図５に示す。両者の染色パターンが一致することが確認された。
【実施例１１】
【００８９】
本発明に係わる抗体を用いるフロー式免疫測定法によるＭＴ１−ＭＭＰの免疫測定
実施例１において単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ−１の遺伝子を単離したハイブリドーマ１９Ｂが産生する抗体ＩｇＧ、ＭＭＰＫ９Ｉを用いて、ＪＩＳ Ｋ ０４６４においてＰＣＢの免疫測定法として記載されているフロー式免疫測定法への適用を検討した。フロー式免疫測定を行うための機器としては、例えばフロー式イムノセンサＤＸＳ−６１０（京都電子工業社製）などの利用が可能である。前記（１−１）で作製したＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドコンジュゲートを、ガンツ化成社製ポリスチレンビーズ、ガンツパールＧＳ−１００Ｓに物理吸着させ、ブロックエース（雪印社製）溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体ＭＭＰＫ９ＩとＣｙＴＭ５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ´）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｎｏＲｅｓｅｒｃｈ社製）を０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）中で反応させた。次いで、この溶液を０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）にて調製した終濃度０．０〜１００ｎｇ／ｍＬのＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドの溶液とそれぞれ反応させた後、抗体結合担体へ流速０．７５ｍＬ／分で作用させた。次いで、０．１ｗ／ｖ％ ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を流速０．７５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除したのち蛍光強度を測定した。ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチドを添加しない抗体溶液において十分な蛍光量が得られた。これをコントロール（Ｂ０）値とし、Ｂ０値に対するＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチド添加により低下した蛍光量（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を、ＭＴ１−ＭＭＰヒンジ領域ペプチド濃度に対しプロットしたところペプチド濃度に依存的な反応が確認された。阻害曲線を図６に示す。阻害曲線より求められたＩＣ５０は約４．７４ｎｇ／ｍｌであり、また、３回測定のＣＶ値は最大でも３．５％未満と安定していた。以上のことから本抗体がフロー式免疫測定法による免疫測定に、有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、がんの診断薬の分野および研究分野などにおいて利用可能である。
【受託番号】
【００９１】
単鎖抗体ＭＭＰ９８産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された。
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｅ産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された。
単鎖抗体ＭＭＰＫ９Ｉ産生細胞は独立行政法人製品評価技術基盤機構受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号：１は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：３は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、単鎖抗体ＭＭＰ９８のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：５は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：７は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：８は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＥのＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：９は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＨ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＬ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は、単鎖抗体ＭＭＰＫ９ＩのＬ鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、マウスＭＴ１−ＭＭＰタンパクの部分アミノ酸配列のＣ末端にシステインを付したペプチドのアミノ酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項２】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項３】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体の製造方法であって、請求項５に記載のベクターで形質転換した形質転換体を適当な培地中で培養し、該形質転換体または培地から単鎖抗体を回収することを含んでなる方法。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された細胞、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された細胞、または独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載された単鎖抗体の製造方法。
【請求項９】
標識されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体。
【請求項１０】
放射性標識された請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の分子イメージングプローブ剤を含む、癌の画像診断剤またはキット。
【請求項１】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項２】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：６で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：８で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項３】
ＭＴ１−ＭＭＰに結合活性を有する単鎖抗体であって、配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域、および配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域を含む単鎖抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体の製造方法であって、請求項５に記載のベクターで形質転換した形質転換体を適当な培地中で培養し、該形質転換体または培地から単鎖抗体を回収することを含んでなる方法。
【請求項８】
独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００８を付与された細胞、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１００９を付与された細胞、または独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１０１０を付与された細胞を適当な培地中で培養し、培地から単鎖抗体を回収することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載された単鎖抗体の製造方法。
【請求項９】
標識されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体。
【請求項１０】
放射性標識された請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖抗体を含む、がんの分子イメージングプローブ剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の分子イメージングプローブ剤を含む、癌の画像診断剤またはキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図６】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図６】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１１５２４３（Ｐ２０１２−１１５２４３Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７０７８７（Ｐ２０１０−２７０７８７）
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０〜２１年度「（独）新エネルギー・産業技術総合開発機構 悪性腫瘍等治療支援分子イメージング機器研究開発プロジェクト／悪性腫瘍等治療支援分子イメージング機器の開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１６１９３２）京都電子工業株式会社 (29)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月３日（２０１０．１２．３）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０〜２１年度「（独）新エネルギー・産業技術総合開発機構 悪性腫瘍等治療支援分子イメージング機器研究開発プロジェクト／悪性腫瘍等治療支援分子イメージング機器の開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００１６１９３２）京都電子工業株式会社 (29)
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【Ｆターム（参考）】
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