抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体の製造方法
【課題】小胞体膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロンファミリーに属するＮｏｇｏのスプライシングアイソフォームＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体及びその製造方法や、該モノクローナル抗体を含有するＮｏｇｏ−Ａの検出試薬等を提供すること。
【解決手段】マウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを哺乳類動物用発現ベクターに挿入した後、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、ＣＯＳ−７細胞上に発現したタンパク質を、Ｅ１４．５マウスの終脳から単離した嗅球軸索を用いて免疫したハムスターのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて作製したモノクローナル抗体ＮＧ１と反応させて免疫染色し、免疫陽性細胞から単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し、抗原分子Ｎｏｇｏ−Ａを同定する。
【解決手段】マウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを哺乳類動物用発現ベクターに挿入した後、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、ＣＯＳ−７細胞上に発現したタンパク質を、Ｅ１４．５マウスの終脳から単離した嗅球軸索を用いて免疫したハムスターのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて作製したモノクローナル抗体ＮＧ１と反応させて免疫染色し、免疫陽性細胞から単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し、抗原分子Ｎｏｇｏ−Ａを同定する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法、より詳しくは、嗅索（ＬＯＴ）で免疫した非ヒト動物の脾細胞を用いて作製したハイブリドーマの培養上澄液を終脳の切片上で免疫化学的方法によりスクリーニングすることによって得られるＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識するモノクローナル抗体の製造方法や、かかるモノクローナル抗体を含有するＮｏｇｏ−Ａの検出試薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとするものであって、このファージシステム（例えば、非特許文献１参照。）によるとヒトの抗体の抗原を同定することが可能となる。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗原を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング法についても既に数多く報告されている（例えば、非特許文献２、３参照。）。
【０００３】
その他、膜分子のクローニング方法として、例えばＣＯＳ７細胞とＳＶ４０の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性発現を利用して、動物細胞発現ベクターで作製されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ７細胞に導入し、細胞表面上にｃＤＮＡライブラリー由来の膜蛋白質を発現させ、目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガンドを用いてパニングあるいはＦＡＣＳで濃縮し、プラスミドＤＮＡを回収して再びＣＯＳ７細胞にトランスフェクションし、濃縮操作を繰り返す方法や、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーをいくつかの小さなプールに分け、ＣＯＳ７細胞に導入し、アイソトープで標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさらに少数のプラスミドからなるプールに分けてトランスフェクションを繰り返しクローン化する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、ヒト細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて２本鎖ｃＤＮＡを作り、この２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターで宿主をトランスフォームして前記抗原を発現させ、リューマチ性関節炎患者の血清からの抗体を用いて、前記抗体が前記発現抗原に結合することを、抗ヒトＩｇＭ抗体−アルカリホフファターゼ複合体とアルカリホスファターゼ顕色基質とによって検出することによりトランスフォームされた宿主を選択する、リューマチ性関節炎関連抗体に対して反応性を有するリューマチ性関節炎の診断用抗原をコードする組換えＤＮＡの作製方法（例えば、特許文献１参照。）も知られている。
【０００５】
他方、神経軸索の成長等に関して以下の知見が報告されている。
神経系の発達は、軸索が活発に成長する能力によって特徴づけられている。成長円錐という特異化された先端によって率先されることにより、多くの軸索が胚脳中において活発に伸張する（例えば、非特許文献５、６参照。）。しかし、中枢神経系が成熟すると、軸索は成長能力を喪失する（例えば、非特許文献７参照。）。中枢軸索の再生に関する研究がこれまで盛んに行なわれてきたが、臨床において軸索の再生を誘導することはたいへん難しいとされている。胚軸索と成体軸索は成長能力に関して異なっているが、これは成体神経系における成長抑制環境が原因の一つであると考えられている（例えば、非特許文献８参照。）。例えば、インビボ及びインビトロの両方における過去の研究から、中枢ミエリンが成体神経系における軸索成長の阻止に関与していることがすでに明らかにされている（例えば、非特許文献９、１０参照。）。
【０００６】
嗅覚体系は、嗅球及びそれが終脳中まで成長した嗅索（ＬＯＴ）とよばれるものから成り立っている。嗅索は単純であり（例えば、非特許文献１１、１２参照。）器官培養により簡単に再生できることから（例えば、非特許文献１３参照。）、軸索ガイダンスの細胞機構及び分子機構に関する有益な情報を提供してきた（例えば、非特許文献１４〜１７参照。）。また、ミエリンにおける軸索反発因子（ａｘｏｎａｌ ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であるＮｏｇｏ（例えば、非特許文献１８〜２２参照。）が成体神経系中において希突起膠細胞により産出されることは、過去の研究からすでに知られている（例えば、非特許文献２３〜２５参照。）。また、Ｎｏｇｏが中枢軸索の成長を阻止することもすでに知られている（例えば、非特許文献２６、２７参照。）。
【０００７】
抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１が、中枢神経系において軸索の再生をインビトロとインビボの両方で増進させることが報告されている（例えば、非特許文献２８〜３４参照。）。Ｎｏｇｏは、小胞体（ＥＲ）膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロン（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）ファミリーに属している（例えば、非特許文献３５、３６参照。）。レチキュロンファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎｏｇｏは主にＥＲに局在しているが、細胞表面にも存在している（例えば、非特許文献１９、２０、３１参照。）。Ｎｏｇｏには、３つのスプライシングアイソフォーム、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃがあり、これらはＣ−末端ドメインが共通しているが、Ｎ−末端配列が相違している。Ｎｏｇｏ−Ａは最も長いアイソフォームで、ラットでは１１６３個のアミノ酸残基からなっている。Ｎｏｇｏ−Ｂは、Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端部分と、スプライスされた共通のＣ−末端ドメインを有している。Ｎｏｇｏ−Ｃは最も短いアイソフォームで、共通のＣ−末端ドメイン以外に、Ｎ−末端上にある独特の短いアミノ酸を含んでいる。最近の研究により、Ｎｏｇｏは、反発作用に対する２つの機能的ドメイン、すなわち、共通するＣ−末端ドメインにある６６アミノ酸配列と、Ｎｏｇｏ−Ａに特異的なＮ−末端配列をもつことがわかっている（例えば、非特許文献３８参照。）。
【０００８】
【特許文献１】
特表平１０−５１３２５７号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０， １１９４−１１９８， １９８３
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０ １９９０
【非特許文献３】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７， ２２８−２５７ １９９３
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４， ３３６５−３３６９， １９８７
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３， ７４０−７４６， １９８６
【非特許文献６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， １１２３−１１３１， １９９６
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １１， ８９−９４， ２００１
【非特許文献８】
Ｎａｔｕｒｅ ２９６， １５０−１５２， １９８２
【非特許文献９】
Ｎｅｕｒｏｎ ２４， ６３９−６４７， １９９９
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８， ２３８１−２３９３， １９８８
【非特許文献１１】
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． １１， １−４５， １９８６
【非特許文献１２】
Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２， １９８４
【非特許文献１３】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６
【非特許文献１４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３２， ４１５−４２５， １９９７
【非特許文献１５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３８， ９３−１０４， １９９９
【非特許文献１６】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１
【非特許文献１７】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献１８】
Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６， １２８１−１２８８， １９８８
【非特許文献１９】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００
【非特許文献２０】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３９−４４４， ２０００
【非特許文献２１】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ３８３−３８４， ２０００
【非特許文献２２】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １９２８３−１９２９３， １９９８
【非特許文献２３】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献２４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４
【非特許文献２５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献２６】
Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ４９８−５０１， １９９５
【非特許文献２７】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献２８】
Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ４９８−５０１， １９９５
【非特許文献２９】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ８０６１−８０６８， ２０００
【非特許文献３０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ２２７５−２２８６， ２０００
【非特許文献３１】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献３２】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２， ２１１２−２１１９， １９９２
【非特許文献３３】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献３４】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献３５】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３２， １９１−１９９， １９９６
【非特許文献３６】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， １３４３９−１３４４７， １９９３
【非特許文献３７】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献３８】
Ｎａｔｕｒｅ ４０９， ３４１−３４６， ２００１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、小胞体膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロンファミリーに属するＮｏｇｏのスプライシングアイソフォームＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体及びその製造方法や、該モノクローナル抗体を含有するＮｏｇｏ−Ａの検出試薬等を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
これまでモノクローナル抗体の抗原分子同定法には、ファージライブラリーを用いた発現スクリーニングの系が実用化されていたが、この系では半ば変性した蛋白質断片を抗体に認識させるので、抗原蛋白質の立体構造を認識するような抗体については適用できず、かかる方法では同定できない抗原が多数存在していた。本発明者らは、マウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを哺乳類動物用発現ベクターに挿入した後、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、ＣＯＳ−７細胞上に立体構造を形成して発現したタンパク質を、Ｅ１４．５マウスの終脳から単離した嗅球軸索を用いて免疫したハムスターのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて作製したモノクローナル抗体ＮＧ１と反応させて免疫染色し、免疫陽性細胞から単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し、新規モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原分子Ｎｏｇｏ−Ａを同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、嗅索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体の製造方法（請求項１）や、Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することを特徴とする請求項１記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項２記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項３）や、嗅索で免疫したハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）や、モノクローナル抗体が、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項５）や、モノクローナル抗体が、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項６）や、モノクローナル抗体が、培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５又は６記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項７）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体（請求項８）や、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの検出試薬（請求項９）や、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬（請求項１０）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有（請求項１１）や、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有することを特徴とするハイブリドーマ（請求項１２）や、ハイブリドーマが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３）であることを特徴とする請求項１２記載のハイブリドーマ（請求項１３）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法としては、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物（例えばハムスター）の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種（例えばマウス）のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではないが、Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体、すなわち、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。また、本発明のハイブリドーマとしては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有するものであれば特に制限されないが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１を具体的に例示することができる。このＨａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３として寄託されている。
【００１４】
上記モノクローナル抗体での免疫染色方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等で酵素標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、前記酵素の基質及び発色剤の添加によって色素を生成させ、呈色した色素を観察する酵素免疫染色方法や、ＦＩＴＣ等で蛍光標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する蛍光免疫染色方法を挙げることができる。
【００１５】
Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させるには、哺乳類培養細胞用発現ベクターを好適に用いることができる。かかる哺乳類培養細胞用発現ベクターとしては、真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換することができるプラスミドベクターやトランスフェクションすることができるファージベクターであればどのようなものでもよく、発現ベクターの複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモーター、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤選択マーカー、エンハンサー等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができる。発現ベクターの複製を可能とする複製オリジンとしては、ＳＶ４０ウィルス、パピローマウィルス、ＥＢウィルス等を挙げることができ、また発現のためのプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモ−ター、アデノウィルス主要後期プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター等を挙げることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、クローン選択を効率化するための薬剤選択マーカー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。具体的には、上記プラスミドベクターとしてｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８， １９３−２００， １９９１）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ８， ４６６−４７２， １９８８）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８， ５３２２， １９９０）等を好適に例示することができるが、これらの中でも、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン３’スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン３’隣接領域、ＳＶ４０複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現することができるｐＣＡＧＧＳが特に好ましい。
【００１６】
また、上記哺乳類培養細胞としては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにＮｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを組み込んだ、抗原タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａをトランジェントにあるいはステイブルに細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現させることができる、哺乳類由来の培養細胞であれば特に制限されるものではなく、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ｎｅｕｒｏ２ａ細胞等を例示することができるが、上記抗原タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａを効率よくトランジェントに発現させうる点でＣＯＳ細胞が好ましい。
【００１７】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体としては、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体、好ましくは、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体や培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であるＮＧ１を好適に例示することができる。そして、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体は、Ｎｏｇｏ−Ａの検出試薬として有利に用いることができる。
【００１８】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬としては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体を含有する薬剤であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の診断薬としては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体を含有する試薬であれば特に制限されるものではない。上記Ｎｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病としては、神経変性疾患、神経損傷などが考えられる。
【００１９】
また、本発明の上記予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定］
実施例１Ａ（実験材料と方法）
（マウス）
日本エスエルシー株式会社からＩＣＲマウスを購入した。腟栓が見つかった日の昼を、胚日齢０．５日（Ｅ０．５）とみなした。生後２〜３ヶ月の成体マウスを本実験において用いた。また、オリエンタル酵母工業株式会社から、生後８週間のアルメニアンハムスターを購入した。本実験における手法は、国立遺伝学研究所動物委員会による承認をうけている。
【００２１】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５である約３００個のマウス胚から嗅索（ＬＯＴ）を機械的に切除し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中で４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定し、ＰＢＳ中で洗浄及び懸濁をした後、これを免疫源としてアルメニアンハムスターの後足に注射した。この免疫処理を３週間ごとに４回繰り返し、最後の追加抗原刺激免疫処理を行なってから３日後に、鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を回収して、それらをマウス骨髄腫細胞（ＮＳ１）と公知の方法を用いて融合させた（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０， ３０９−３１２， １９８３、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １２２， ９０−１００， １９８７）。Ｅ１４．５のマウス終脳由来の免疫ハイブリドーマ培養物の培養上澄液を免疫組織化学的方法によってスクリーニングした。クローニングを行なうため、先端の尖ったガラス製キャピラリーを用いてハイブリドーマ細胞個体を取りだし、１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び１０％のハイブリドーマクローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む９６ウェル細胞プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に蒔いた。
【００２２】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）中で凍結させた。これを凍結切片作製装置（クリオスタット）上で厚さ１４〜２０μｍの切片に分け、ガラススライド（松浪ガラス社製）上に載せた。かかる切片を、１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を有するモノクローナル抗体ＮＧ１ハイブリドーマクローンの培養上澄液を１／１０に希釈した溶液中で一晩インキュベーションし、ＴＥＳＴを用いて洗浄した後、蛍光発光（ＦＩＴＣ）が結合している抗アルメニアンハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて結合抗体を視覚化した。ラビット抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びＣｙ３結合抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いてラビット抗希突起膠細胞を染色した。ホールマウント免疫染色法は、公知の方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ５８０２−５８１２， ２０００）に準拠した方法で行った。すなわち、Ｅ１３．５マウス胚の終脳半球を切断し、２４〜２８時間、５％のスキムミルク／ＴＢＳＴを用いてモノクローナル抗体ＮＧ１培養上澄液を１０倍に希釈した溶液中においてインキュベーションした。この免疫反応を視覚化するために、ビオチン化した抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）及びＥｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）を用いて処理した。
【００２３】
（嗅球神経の分離培養）
Ｍａｓｕｄａ−Ｎａｋａｇａｗａ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２３， １７１， １９９９）及びＭｏｒｉ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２４， １６０， ２０００）に記載の方法に従い、Ｅ１４．５の嗅球をトリプシン処理し、穏やかなピペット処理を行なうことにより単一細胞に分離した。ポリリシン（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングした４ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに細胞密度が１×１０５細胞となるように調整した。神経膠細胞を用いて条件づけ、Ｂ−２７ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補った神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを用いてＣＯ２インキュベーター中において５日間、かかる細胞を培養した。培養が終了してから２時間、４％のＰＦＡで得られた細胞を固定し、上記方法によりモノクロナール抗体を用いてかかる細胞に対して免疫染色を行なった。
【００２４】
（モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローニング）
モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローニングは以下のように行った。Ｅ１４．５のマウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ（大阪大学宮崎純一博士より供与）中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ ６； Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体ＮＧ１を用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ ２； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２４０個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定した。また、マウスＮｏｇｏ−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した（アクセッションＮｏ．：ＡＢ０７３６７２）。
【００２５】
実施例１Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ＮＧ１の作製）
Ｅ１４．５のマウスの終脳から機械で切除した嗅球軸索を用いてハムスターを免疫した。かかるハムスターから調製したリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞の培養上澄液を、嗅球軸索からなるＬＯＴに結合させるため、切片上で免疫組織化学的にスクリーニングした（図１Ａ、Ｂ）。スクリーニングを行った約２０００のハイブリドーマ細胞株から、ＬＯＴへの強い結合を示したモノクローナル抗体ＮＧ１を単離した。かかるモノクローナル抗体ＮＧ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００２６】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色）
嗅球軸索の盛んな伸長が、Ｅ１４．５の終脳に認められている（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）が、モノクローナル抗体ＮＧ１は、ＬＯＴにおける成長中の軸索を強く標識した（図１Ｃ）。これらの軸索は均一には染色されず、ところどころに強く標識される部位が斑点状に認められた（図１Ｄ）が、こうした斑点に対応する構造は同定できなかった。ＬＯＴのより深い領域では、嗅覚皮質中で腺維の染色も認められた（図１Ｃ）。これは、嗅覚皮質の内在ニューロン（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の突起部が染色されたものと思われる。嗅球においては、嗅球を通る多くの腺維が至るところで染色されていた（図１Ｅ）。ＬＯＴへと伸長している軸索も同様に染色されているが、こうした伸長ニューロンの細胞体は、はっきりとは染色されていなかった（図１Ｅ）。
【００２７】
胚形成期の終脳のホールマウント調製物において、嗅球軸索がモノクローナル抗体ＮＧ１によって強く染色されているのが認められた（図１Ｅ）。標識した軸索は、嗅覚皮質でアーチ形の突起部を形成しており、これは、以前に報告（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）されている嗅球軸索用マーカーによる染色と類似している。しかし、終脳の他の部分では、モノクローナル抗体ＮＧ１による標識は弱いものだった。このことは、弱いものではあるが至るところで生じている抗原の発現が、発生期の神経系において、モノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。
出生後も、ＬＯＴはモノクローナル抗体ＮＧ１により染色された（図１Ｇ）。しかし、その場合は、終脳の他の部位で染色が広範囲に及ぶことは少なかった。それ以前の発生ステージの場合と比較して、軸索には斑点が見られず、もっと均一に染色されていた。
【００２８】
（神経系の他の部位の免疫染色パターン）
一般に、モノクローナル抗体ＮＧ１は、長く成長した軸索を強く標識していた。内包、前交連、脳梁、分界条といった主要な軸索経路はすべて、胚形成期中に強く染色された（図２R>２Ａ、Ｂ）。分化したニューロンが豊富な、皮質板などの領域も染色された（図１Ｃ、２Ａ）。脳とは別個に、嗅神経及び視神経は、かかるモノクローナル抗体に強く染色された（図２Ｃ、Ｄ）。モノクローナル抗体ＮＧ１は、末梢神経及び筋肉も標識したが、他の非神経組織は標識しなかった（図２Ｄ）。これは、神経系及び筋肉においてかかる抗原の特異的発現がモノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。発生が進行するにつれ、モノクローナル抗体ＮＧ１による軸索の標識の鮮明度は低下していった。Ｐ７の時点で、まだ基線レベルより強く染色される軸索もあった（図２Ｅ、Ｆ）が、周辺部に弱い染色部位が偏在していたため、不鮮明だった。
【００２９】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による成長円錐の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１は、発生期の神経系における成長中の軸索を強く標識するため、培養中に盛んに伸長する神経突起における、モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原の細胞中の局在について調べた。モノクローナル抗体ＮＧ１は、嗅球ニューロンの神経突起の遠位部分を優先的に標識した（図３）。遠位末端（ｄｉｓｔａｌ ｔｉｐ）の成長円錐はとくに強く標識された。細胞体及び神経突起で、小胞染色が明瞭に認められることもあった。生存ニューロンを、固定を行わずにモノクローナル抗体と共にインキュベーションしたところ、細胞表面の標識は検出されなかった。これは、モノクローナル抗体ＮＧ１に対するエピトープが、これらのニューロンの細胞質中に存在することを示唆している。
【００３０】
（モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原を同定するため、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡライブラリーを発現させ、モノクローナル抗体ＮＧ１に免疫反応性をもつ生成物を産生するクローンをスクリーニングした。およそ２４，０００のｃＤＮＡクローンを分析した後、＃４−１Ｄ９というクローンが、強い免疫陽性をもつ物質を産生することがわかった（図４R>４Ｂ）。挿入物のヌクレオチド配列から、Ｎｏｇｏのマウス相同物をコードする１つのオープンリーディングフレームが判明した。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９は、Ｎｏｇｏ−Ａを部分的にコードしており、完全な配列の３’側半分をカバーしている（図４Ａ）。ＣＯＳ−７でかかるクローンを発現させたとき、Ｎ−末端から推定５９３番目の残基上の内部メチオニンで翻訳が始まり、Ｃ−末端の最後まで続くと推測された（図４R>４Ａの＃４−１Ｄ９）。Ｎｏｇｏの共通するＣ−末端ドメインには、２つの疎水性ドメインが含まれており、これらはＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能すると考えられている（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １０７， ２４０３−２４１６， １９９４）。＃４−１Ｄ９クローンが産生した免疫反応性生成物は、実際に、ＣＯＳ−７細胞中に広がるレース様の網状組織に分布していた（図４Ｂ）。これは、ＥＲの典型的な分布を示すものである。
【００３１】
モノクローナル抗体ＮＧ１があらゆる形のＮｏｇｏを認識するのか、それともＮｏｇｏ−Ａだけを認識するのかを調べるため、ｃＤＮＡクローンから共通のＣ−末端ドメインを切除した（図４Ａの＃４−１Ｄ９ΔＣ）。その場合もやはりモノクローナル抗体ＮＧ１は、前記の切除を受けた蛋白質を認識したが、Ｃ−末端上のＥＲにおける保存シグナルの欠失により、その分布は細胞質全体に広がった（図４Ｃ）。この結果により、モノクローナル抗体ＮＧ１はＮｏｇｏ−Ａに特異的に結合するが、その他の形のＮｏｇｏには結合しないことがわかった。モノクローナル抗体ＮＧ１が認識するＮｏｇｏ−Ａ特異的ドメインには、レチキュロンファミリーの他のメンバーとの相同性がまったくない。そのため、モノクローナル抗体ＮＧ１が他のレチキュロン蛋白質とも結合するとは考えにくい。事実、本発明者らは、モノクローナル抗体ＮＧ１がＣＯＳ−７細胞中で発現しているレチキュロン１Ａとは結合しないことを確認している。
【００３２】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による、成体神経系中の希突起膠細胞の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１が切片中のＮｏｇｏ−Ａを認識するかどうかを調べるため、成体の中枢神経系の切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色した。成体神経系の軸索は、モノクローナル抗体ＮＧ１によってはほとんど染色されなかった。そのかわり、脳全体に散在する細胞体が強く染色されているのが観察された（図５Ａ、Ｂ）。モノクローナル抗体ＮＧ１陽性細胞の形態及び分布から、それらが希突起膠細胞であることがわかった。このことは、希突起膠細胞のマーカーであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）π（ＥＭＢＯ Ｊ． １９， ３４１−３４８， ２０００）によるかかる切片の二重免疫染色で確認された（図５Ｃ、Ｄ）。
【００３３】
成体の脊髄におけるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の分布については、これまでにいくつかの研究報告がある（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）。それらに従い、成体の脊髄切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で染色した。かかるモノクローナル抗体により、脊髄の白質全体に分布している希突起膠細胞及びその突起部分が強く染色された（図５Ｅ）。この染色パターンは、報告されている、Ｎｏｇｏ−Ａに対するポリクローナル抗体を用いた場合の免疫染色（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００）と同一だった。しかし、本来Ｎｏｇｏ−Ａに対する抗体であるモノクローナル抗体ＩＮ−１を用いた染色（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）と比較すると、モノクローナル抗体ＮＧ１による染色では、希突起膠細胞の細胞体がより鮮明に浮かびあがっており、かかる抗体自体は、ミエリン化軸索にはほとんど結合していなかった。染色パターンがこのように異なる理由は、現在のところ不明である。
【００３４】
本実施例において、本発明者らは、発生期の神経系における成長中の軸索と強く結合するモノクローナル抗体ＮＧ１を作製し、このモノクローナル抗体がＮｏｇｏ−Ａ蛋白質と特異的に結合することを示した。成体の神経系をこのモノクローナル抗体で染色した場合の染色パターンは、報告されているＮｏｇｏ−Ａの発現と一致するものだった（Ｎａｔｕｒｅ ４０３ ４３４−４３８， ２０００、Ｎａｔｕｒｅ ４０３ ４３９−４４４， ２０００）。発生期のニューロンにはＮｏｇｏ ｍＲＮＡの強い発現が見られるとの最近の報告（Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １６９， ３１９−３２８， ２００１）と考えあわせ、モノクローナル抗体ＮＧ１は発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識すると結論づけることができる。本発明により、モノクローナル抗体ＮＧ１が発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識するということから、盛んに成長している軸索中で、軸索成長の阻害因子であるＮｏｇｏが強く発現しているという、やや意外な新たな知見が得られた。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により製造される抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体は、神経機能の研究に広く利用できるのみならず、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインを認識するため、この軸索伸長抑制因子の活性を阻害できる可能性が高く、様々な神経再生に応用できる可能性がある。また、抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体ＮＧ１は、抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１に比べてＮｏｇｏ−Ａに対する特異的結合活性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：終脳の側面（Ａ）及び冠状面（Ｂ）の概略図。（Ａ）の左部分が吻側であり、（Ｂ）の左部分が側面である。（Ａ）（Ｂ）共にその上部が背面となっている。嗅球（ＯＢ）軸索が、終脳内部の尾側に伸長し、終脳表面で外側嗅索（ＬＯＴ）を形成している。
（Ｃ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の終脳の冠状切片。ＬＯＴ（矢印）が強く染色されている点に注意。嗅覚皮質（矢頭）及び皮質板も、かかるモノクローナル抗体で染色されている。
（Ｄ）：高拡大率でのＬＯＴ。軸索は均一に染色されておらず、強く標識された部位が斑点となっている。
（Ｅ）：前記モノクローナル抗体で染色した、大量の繊維をもつＥ１４．５の嗅球。
（Ｆ）：モノクローナル抗体ＮＧ１による、Ｅ１３．５の終脳の全量免疫染色。他の終脳部位と同様に、ＬＯＴ（矢印）を形成している嗅球軸索でも染色が認められる。
（Ｇ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＰ０の終脳。ＬＯＴ（矢印）は、やはり他の部位よりも強く染色されている。
スケールバーは５０μｍ（Ａ−Ｄ及びＦ）、５００μｍ（Ｅ）を表す。
【図２】モノクローナル抗体ＮＧ１による、神経系の他部位の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の前脳の冠状切片。内包（矢印）及び髄条（矢頭）において軸索が強く染色されている点に注意。
（Ｂ）：Ｅ１４．５の前脳の後部水平部位（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｌｅｖｅｌ）上の切片。分界条（矢印）中の軸索の束が強く標識されている。
（Ｃ）：Ｅ１４．５の嗅上皮から伸長している嗅覚神経（矢頭）の強い染色。（Ｄ）：Ｅ１４．５の眼球の、強く標識された視神経（矢印）。眼筋（矢頭）も前記モノクローナル抗体によって染色されている。
（Ｅ）：Ｐ７の前交連（矢印）は、やはり前記モノクローナル抗体によって強く染色されている。
（Ｆ）：Ｐ７の脳梁（矢印）は、周辺部位よりもやや強いレベルで染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図３】モノクローナル抗体ＮＧ１による、培養した嗅球ニューロンの免疫染色の様子を示す図である。
Ｅ１４．５の嗅球ニューロンを解離し（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、５日間培養した。神経突起の成長円錐（矢印）が、モノクローナル抗体ＮＧ１によって強く標識されている。スケールバーは５０μｍを表す。
【図４】モノクローナル抗体ＮＧ１によるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の認識の様子を示す図である。
（Ａ）：Ｎｏｇｏの３つのアイソフォームの蛋白質構造。Ｎｏｇｏ−Ａには、Ｎｏｇｏ−Ｂのアミノ酸配列がすべて含まれている。Ｎｏｇｏ−Ｃは、Ｎ−末端（縞のボックス）上に、独特の配列を有している。３種類のアイソフォームすべてに共通するＣ−末端領域におけるグレーのボックスは、ＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能する疎水性アミノ酸配列を示している。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９の構造が、かかる３つのＮｏｇｏアイソフォームの下に示されている。翻訳は、左側の点線部分、すなわちＮｏｇｏ−Ａのほぼ中央にあたる位置で始まるとされている。底部にあるｃＤＮＡ構造物の＃４−１Ｄ９ΔＣにおいては、共通するＣ−末端ドメインは、右側の点線部分で欠失し、Ｎｏｇｏ−Ａ特異的な３１６のアミノ酸からなるトランケート蛋白質が後に残っている。
（Ｂ）：＃４−１Ｄ９クローンを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。ＥＲの特徴であるレース様の網状組織が染色されている。
（Ｃ）：＃４−１Ｄ９ΔＣを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。細胞質が広く染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図５】モノクローナル抗体ＮＧ１による成体神経系の免疫染色の様子を示す図である。（Ａ、Ｂ）：脳梁近辺の成体終脳の切片。モノクローナル抗体ＮＧ１は、終脳全体に散在する細胞体を染色している。切片（Ｂ）は、（Ａ）の拡大率を高くしたものである。
（Ｃ、Ｄ）：抗ＧＳＴ抗体で染色して希突起膠細胞を視覚化した（Ａ、Ｂ）の同一の図。同じ細胞（矢頭）が、（Ｂ）及び（Ｄ）において標識されている。
（Ｅ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色した成体の脊髄切片。白質中の希突起膠細胞及びその突起部が強く染色されていることに注意。灰白質中でいくつかのニューロンが染色されているのは、二次抗体の非特異的結合によるものである。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図６】発現ベクターｐＣＡＧＧＳを示す図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法、より詳しくは、嗅索（ＬＯＴ）で免疫した非ヒト動物の脾細胞を用いて作製したハイブリドーマの培養上澄液を終脳の切片上で免疫化学的方法によりスクリーニングすることによって得られるＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識するモノクローナル抗体の製造方法や、かかるモノクローナル抗体を含有するＮｏｇｏ−Ａの検出試薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとするものであって、このファージシステム（例えば、非特許文献１参照。）によるとヒトの抗体の抗原を同定することが可能となる。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗原を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング法についても既に数多く報告されている（例えば、非特許文献２、３参照。）。
【０００３】
その他、膜分子のクローニング方法として、例えばＣＯＳ７細胞とＳＶ４０の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性発現を利用して、動物細胞発現ベクターで作製されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ７細胞に導入し、細胞表面上にｃＤＮＡライブラリー由来の膜蛋白質を発現させ、目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガンドを用いてパニングあるいはＦＡＣＳで濃縮し、プラスミドＤＮＡを回収して再びＣＯＳ７細胞にトランスフェクションし、濃縮操作を繰り返す方法や、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーをいくつかの小さなプールに分け、ＣＯＳ７細胞に導入し、アイソトープで標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさらに少数のプラスミドからなるプールに分けてトランスフェクションを繰り返しクローン化する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、ヒト細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて２本鎖ｃＤＮＡを作り、この２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターで宿主をトランスフォームして前記抗原を発現させ、リューマチ性関節炎患者の血清からの抗体を用いて、前記抗体が前記発現抗原に結合することを、抗ヒトＩｇＭ抗体−アルカリホフファターゼ複合体とアルカリホスファターゼ顕色基質とによって検出することによりトランスフォームされた宿主を選択する、リューマチ性関節炎関連抗体に対して反応性を有するリューマチ性関節炎の診断用抗原をコードする組換えＤＮＡの作製方法（例えば、特許文献１参照。）も知られている。
【０００５】
他方、神経軸索の成長等に関して以下の知見が報告されている。
神経系の発達は、軸索が活発に成長する能力によって特徴づけられている。成長円錐という特異化された先端によって率先されることにより、多くの軸索が胚脳中において活発に伸張する（例えば、非特許文献５、６参照。）。しかし、中枢神経系が成熟すると、軸索は成長能力を喪失する（例えば、非特許文献７参照。）。中枢軸索の再生に関する研究がこれまで盛んに行なわれてきたが、臨床において軸索の再生を誘導することはたいへん難しいとされている。胚軸索と成体軸索は成長能力に関して異なっているが、これは成体神経系における成長抑制環境が原因の一つであると考えられている（例えば、非特許文献８参照。）。例えば、インビボ及びインビトロの両方における過去の研究から、中枢ミエリンが成体神経系における軸索成長の阻止に関与していることがすでに明らかにされている（例えば、非特許文献９、１０参照。）。
【０００６】
嗅覚体系は、嗅球及びそれが終脳中まで成長した嗅索（ＬＯＴ）とよばれるものから成り立っている。嗅索は単純であり（例えば、非特許文献１１、１２参照。）器官培養により簡単に再生できることから（例えば、非特許文献１３参照。）、軸索ガイダンスの細胞機構及び分子機構に関する有益な情報を提供してきた（例えば、非特許文献１４〜１７参照。）。また、ミエリンにおける軸索反発因子（ａｘｏｎａｌ ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であるＮｏｇｏ（例えば、非特許文献１８〜２２参照。）が成体神経系中において希突起膠細胞により産出されることは、過去の研究からすでに知られている（例えば、非特許文献２３〜２５参照。）。また、Ｎｏｇｏが中枢軸索の成長を阻止することもすでに知られている（例えば、非特許文献２６、２７参照。）。
【０００７】
抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１が、中枢神経系において軸索の再生をインビトロとインビボの両方で増進させることが報告されている（例えば、非特許文献２８〜３４参照。）。Ｎｏｇｏは、小胞体（ＥＲ）膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロン（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）ファミリーに属している（例えば、非特許文献３５、３６参照。）。レチキュロンファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎｏｇｏは主にＥＲに局在しているが、細胞表面にも存在している（例えば、非特許文献１９、２０、３１参照。）。Ｎｏｇｏには、３つのスプライシングアイソフォーム、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃがあり、これらはＣ−末端ドメインが共通しているが、Ｎ−末端配列が相違している。Ｎｏｇｏ−Ａは最も長いアイソフォームで、ラットでは１１６３個のアミノ酸残基からなっている。Ｎｏｇｏ−Ｂは、Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端部分と、スプライスされた共通のＣ−末端ドメインを有している。Ｎｏｇｏ−Ｃは最も短いアイソフォームで、共通のＣ−末端ドメイン以外に、Ｎ−末端上にある独特の短いアミノ酸を含んでいる。最近の研究により、Ｎｏｇｏは、反発作用に対する２つの機能的ドメイン、すなわち、共通するＣ−末端ドメインにある６６アミノ酸配列と、Ｎｏｇｏ−Ａに特異的なＮ−末端配列をもつことがわかっている（例えば、非特許文献３８参照。）。
【０００８】
【特許文献１】
特表平１０−５１３２５７号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０， １１９４−１１９８， １９８３
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０ １９９０
【非特許文献３】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７， ２２８−２５７ １９９３
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４， ３３６５−３３６９， １９８７
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３， ７４０−７４６， １９８６
【非特許文献６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， １１２３−１１３１， １９９６
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １１， ８９−９４， ２００１
【非特許文献８】
Ｎａｔｕｒｅ ２９６， １５０−１５２， １９８２
【非特許文献９】
Ｎｅｕｒｏｎ ２４， ６３９−６４７， １９９９
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８， ２３８１−２３９３， １９８８
【非特許文献１１】
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． １１， １−４５， １９８６
【非特許文献１２】
Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２， １９８４
【非特許文献１３】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６
【非特許文献１４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３２， ４１５−４２５， １９９７
【非特許文献１５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３８， ９３−１０４， １９９９
【非特許文献１６】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１
【非特許文献１７】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献１８】
Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６， １２８１−１２８８， １９８８
【非特許文献１９】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００
【非特許文献２０】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３９−４４４， ２０００
【非特許文献２１】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ３８３−３８４， ２０００
【非特許文献２２】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １９２８３−１９２９３， １９９８
【非特許文献２３】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献２４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４
【非特許文献２５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献２６】
Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ４９８−５０１， １９９５
【非特許文献２７】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献２８】
Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ４９８−５０１， １９９５
【非特許文献２９】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ８０６１−８０６８， ２０００
【非特許文献３０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ２２７５−２２８６， ２０００
【非特許文献３１】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献３２】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２， ２１１２−２１１９， １９９２
【非特許文献３３】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献３４】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献３５】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３２， １９１−１９９， １９９６
【非特許文献３６】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， １３４３９−１３４４７， １９９３
【非特許文献３７】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献３８】
Ｎａｔｕｒｅ ４０９， ３４１−３４６， ２００１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、小胞体膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロンファミリーに属するＮｏｇｏのスプライシングアイソフォームＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体及びその製造方法や、該モノクローナル抗体を含有するＮｏｇｏ−Ａの検出試薬等を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
これまでモノクローナル抗体の抗原分子同定法には、ファージライブラリーを用いた発現スクリーニングの系が実用化されていたが、この系では半ば変性した蛋白質断片を抗体に認識させるので、抗原蛋白質の立体構造を認識するような抗体については適用できず、かかる方法では同定できない抗原が多数存在していた。本発明者らは、マウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを哺乳類動物用発現ベクターに挿入した後、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、ＣＯＳ−７細胞上に立体構造を形成して発現したタンパク質を、Ｅ１４．５マウスの終脳から単離した嗅球軸索を用いて免疫したハムスターのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて作製したモノクローナル抗体ＮＧ１と反応させて免疫染色し、免疫陽性細胞から単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し、新規モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原分子Ｎｏｇｏ−Ａを同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、嗅索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体の製造方法（請求項１）や、Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することを特徴とする請求項１記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項２）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項２記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項３）や、嗅索で免疫したハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項４）や、モノクローナル抗体が、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項５）や、モノクローナル抗体が、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項６）や、モノクローナル抗体が、培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５又は６記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法（請求項７）に関する。
【００１２】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体（請求項８）や、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの検出試薬（請求項９）や、請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬（請求項１０）や、請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有（請求項１１）や、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有することを特徴とするハイブリドーマ（請求項１２）や、ハイブリドーマが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３）であることを特徴とする請求項１２記載のハイブリドーマ（請求項１３）に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法としては、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物（例えばハムスター）の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種（例えばマウス）のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体であれば特に制限されるものではないが、Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体、すなわち、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。また、本発明のハイブリドーマとしては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有するものであれば特に制限されないが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１を具体的に例示することができる。このＨａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３として寄託されている。
【００１４】
上記モノクローナル抗体での免疫染色方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等で酵素標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、前記酵素の基質及び発色剤の添加によって色素を生成させ、呈色した色素を観察する酵素免疫染色方法や、ＦＩＴＣ等で蛍光標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する蛍光免疫染色方法を挙げることができる。
【００１５】
Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させるには、哺乳類培養細胞用発現ベクターを好適に用いることができる。かかる哺乳類培養細胞用発現ベクターとしては、真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換することができるプラスミドベクターやトランスフェクションすることができるファージベクターであればどのようなものでもよく、発現ベクターの複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモーター、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤選択マーカー、エンハンサー等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができる。発現ベクターの複製を可能とする複製オリジンとしては、ＳＶ４０ウィルス、パピローマウィルス、ＥＢウィルス等を挙げることができ、また発現のためのプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０プロモ−ター、アデノウィルス主要後期プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター等を挙げることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、クローン選択を効率化するための薬剤選択マーカー、細胞特異的に働くエンハンサーの他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。具体的には、上記プラスミドベクターとしてｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８， １９３−２００， １９９１）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ ８， ４６６−４７２， １９８８）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８， ５３２２， １９９０）等を好適に例示することができるが、これらの中でも、サイトメガロウィルスのエンハンサー、チキンβ−アクチンプロモーター、ラビットβ−グロビン３’スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン３’隣接領域、ＳＶ４０複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現することができるｐＣＡＧＧＳが特に好ましい。
【００１６】
また、上記哺乳類培養細胞としては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにＮｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを組み込んだ、抗原タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａをトランジェントにあるいはステイブルに細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現させることができる、哺乳類由来の培養細胞であれば特に制限されるものではなく、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ｎｅｕｒｏ２ａ細胞等を例示することができるが、上記抗原タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａを効率よくトランジェントに発現させうる点でＣＯＳ細胞が好ましい。
【００１７】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体としては、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体、好ましくは、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体や培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であるＮＧ１を好適に例示することができる。そして、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られる抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体は、Ｎｏｇｏ−Ａの検出試薬として有利に用いることができる。
【００１８】
本発明のＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬としては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体を含有する薬剤であれば特に制限されるものではなく、また、本発明のＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の診断薬としては、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合する抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体を含有する試薬であれば特に制限されるものではない。上記Ｎｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病としては、神経変性疾患、神経損傷などが考えられる。
【００１９】
また、本発明の上記予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定］
実施例１Ａ（実験材料と方法）
（マウス）
日本エスエルシー株式会社からＩＣＲマウスを購入した。腟栓が見つかった日の昼を、胚日齢０．５日（Ｅ０．５）とみなした。生後２〜３ヶ月の成体マウスを本実験において用いた。また、オリエンタル酵母工業株式会社から、生後８週間のアルメニアンハムスターを購入した。本実験における手法は、国立遺伝学研究所動物委員会による承認をうけている。
【００２１】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５である約３００個のマウス胚から嗅索（ＬＯＴ）を機械的に切除し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中で４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定し、ＰＢＳ中で洗浄及び懸濁をした後、これを免疫源としてアルメニアンハムスターの後足に注射した。この免疫処理を３週間ごとに４回繰り返し、最後の追加抗原刺激免疫処理を行なってから３日後に、鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を回収して、それらをマウス骨髄腫細胞（ＮＳ１）と公知の方法を用いて融合させた（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０， ３０９−３１２， １９８３、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １２２， ９０−１００， １９８７）。Ｅ１４．５のマウス終脳由来の免疫ハイブリドーマ培養物の培養上澄液を免疫組織化学的方法によってスクリーニングした。クローニングを行なうため、先端の尖ったガラス製キャピラリーを用いてハイブリドーマ細胞個体を取りだし、１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び１０％のハイブリドーマクローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む９６ウェル細胞プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に蒔いた。
【００２２】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）中で凍結させた。これを凍結切片作製装置（クリオスタット）上で厚さ１４〜２０μｍの切片に分け、ガラススライド（松浪ガラス社製）上に載せた。かかる切片を、１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を有するモノクローナル抗体ＮＧ１ハイブリドーマクローンの培養上澄液を１／１０に希釈した溶液中で一晩インキュベーションし、ＴＥＳＴを用いて洗浄した後、蛍光発光（ＦＩＴＣ）が結合している抗アルメニアンハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて結合抗体を視覚化した。ラビット抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びＣｙ３結合抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いてラビット抗希突起膠細胞を染色した。ホールマウント免疫染色法は、公知の方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ５８０２−５８１２， ２０００）に準拠した方法で行った。すなわち、Ｅ１３．５マウス胚の終脳半球を切断し、２４〜２８時間、５％のスキムミルク／ＴＢＳＴを用いてモノクローナル抗体ＮＧ１培養上澄液を１０倍に希釈した溶液中においてインキュベーションした。この免疫反応を視覚化するために、ビオチン化した抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）及びＥｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）を用いて処理した。
【００２３】
（嗅球神経の分離培養）
Ｍａｓｕｄａ−Ｎａｋａｇａｗａ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２３， １７１， １９９９）及びＭｏｒｉ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２４， １６０， ２０００）に記載の方法に従い、Ｅ１４．５の嗅球をトリプシン処理し、穏やかなピペット処理を行なうことにより単一細胞に分離した。ポリリシン（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングした４ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに細胞密度が１×１０５細胞となるように調整した。神経膠細胞を用いて条件づけ、Ｂ−２７ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補った神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを用いてＣＯ２インキュベーター中において５日間、かかる細胞を培養した。培養が終了してから２時間、４％のＰＦＡで得られた細胞を固定し、上記方法によりモノクロナール抗体を用いてかかる細胞に対して免疫染色を行なった。
【００２４】
（モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローニング）
モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローニングは以下のように行った。Ｅ１４．５のマウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ（大阪大学宮崎純一博士より供与）中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ ６； Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体ＮＧ１を用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ ２； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２４０個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定した。また、マウスＮｏｇｏ−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した（アクセッションＮｏ．：ＡＢ０７３６７２）。
【００２５】
実施例１Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ＮＧ１の作製）
Ｅ１４．５のマウスの終脳から機械で切除した嗅球軸索を用いてハムスターを免疫した。かかるハムスターから調製したリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞の培養上澄液を、嗅球軸索からなるＬＯＴに結合させるため、切片上で免疫組織化学的にスクリーニングした（図１Ａ、Ｂ）。スクリーニングを行った約２０００のハイブリドーマ細胞株から、ＬＯＴへの強い結合を示したモノクローナル抗体ＮＧ１を単離した。かかるモノクローナル抗体ＮＧ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００２６】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色）
嗅球軸索の盛んな伸長が、Ｅ１４．５の終脳に認められている（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）が、モノクローナル抗体ＮＧ１は、ＬＯＴにおける成長中の軸索を強く標識した（図１Ｃ）。これらの軸索は均一には染色されず、ところどころに強く標識される部位が斑点状に認められた（図１Ｄ）が、こうした斑点に対応する構造は同定できなかった。ＬＯＴのより深い領域では、嗅覚皮質中で腺維の染色も認められた（図１Ｃ）。これは、嗅覚皮質の内在ニューロン（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の突起部が染色されたものと思われる。嗅球においては、嗅球を通る多くの腺維が至るところで染色されていた（図１Ｅ）。ＬＯＴへと伸長している軸索も同様に染色されているが、こうした伸長ニューロンの細胞体は、はっきりとは染色されていなかった（図１Ｅ）。
【００２７】
胚形成期の終脳のホールマウント調製物において、嗅球軸索がモノクローナル抗体ＮＧ１によって強く染色されているのが認められた（図１Ｅ）。標識した軸索は、嗅覚皮質でアーチ形の突起部を形成しており、これは、以前に報告（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）されている嗅球軸索用マーカーによる染色と類似している。しかし、終脳の他の部分では、モノクローナル抗体ＮＧ１による標識は弱いものだった。このことは、弱いものではあるが至るところで生じている抗原の発現が、発生期の神経系において、モノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。
出生後も、ＬＯＴはモノクローナル抗体ＮＧ１により染色された（図１Ｇ）。しかし、その場合は、終脳の他の部位で染色が広範囲に及ぶことは少なかった。それ以前の発生ステージの場合と比較して、軸索には斑点が見られず、もっと均一に染色されていた。
【００２８】
（神経系の他の部位の免疫染色パターン）
一般に、モノクローナル抗体ＮＧ１は、長く成長した軸索を強く標識していた。内包、前交連、脳梁、分界条といった主要な軸索経路はすべて、胚形成期中に強く染色された（図２R>２Ａ、Ｂ）。分化したニューロンが豊富な、皮質板などの領域も染色された（図１Ｃ、２Ａ）。脳とは別個に、嗅神経及び視神経は、かかるモノクローナル抗体に強く染色された（図２Ｃ、Ｄ）。モノクローナル抗体ＮＧ１は、末梢神経及び筋肉も標識したが、他の非神経組織は標識しなかった（図２Ｄ）。これは、神経系及び筋肉においてかかる抗原の特異的発現がモノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。発生が進行するにつれ、モノクローナル抗体ＮＧ１による軸索の標識の鮮明度は低下していった。Ｐ７の時点で、まだ基線レベルより強く染色される軸索もあった（図２Ｅ、Ｆ）が、周辺部に弱い染色部位が偏在していたため、不鮮明だった。
【００２９】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による成長円錐の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１は、発生期の神経系における成長中の軸索を強く標識するため、培養中に盛んに伸長する神経突起における、モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原の細胞中の局在について調べた。モノクローナル抗体ＮＧ１は、嗅球ニューロンの神経突起の遠位部分を優先的に標識した（図３）。遠位末端（ｄｉｓｔａｌ ｔｉｐ）の成長円錐はとくに強く標識された。細胞体及び神経突起で、小胞染色が明瞭に認められることもあった。生存ニューロンを、固定を行わずにモノクローナル抗体と共にインキュベーションしたところ、細胞表面の標識は検出されなかった。これは、モノクローナル抗体ＮＧ１に対するエピトープが、これらのニューロンの細胞質中に存在することを示唆している。
【００３０】
（モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原を同定するため、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡライブラリーを発現させ、モノクローナル抗体ＮＧ１に免疫反応性をもつ生成物を産生するクローンをスクリーニングした。およそ２４，０００のｃＤＮＡクローンを分析した後、＃４−１Ｄ９というクローンが、強い免疫陽性をもつ物質を産生することがわかった（図４R>４Ｂ）。挿入物のヌクレオチド配列から、Ｎｏｇｏのマウス相同物をコードする１つのオープンリーディングフレームが判明した。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９は、Ｎｏｇｏ−Ａを部分的にコードしており、完全な配列の３’側半分をカバーしている（図４Ａ）。ＣＯＳ−７でかかるクローンを発現させたとき、Ｎ−末端から推定５９３番目の残基上の内部メチオニンで翻訳が始まり、Ｃ−末端の最後まで続くと推測された（図４R>４Ａの＃４−１Ｄ９）。Ｎｏｇｏの共通するＣ−末端ドメインには、２つの疎水性ドメインが含まれており、これらはＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能すると考えられている（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １０７， ２４０３−２４１６， １９９４）。＃４−１Ｄ９クローンが産生した免疫反応性生成物は、実際に、ＣＯＳ−７細胞中に広がるレース様の網状組織に分布していた（図４Ｂ）。これは、ＥＲの典型的な分布を示すものである。
【００３１】
モノクローナル抗体ＮＧ１があらゆる形のＮｏｇｏを認識するのか、それともＮｏｇｏ−Ａだけを認識するのかを調べるため、ｃＤＮＡクローンから共通のＣ−末端ドメインを切除した（図４Ａの＃４−１Ｄ９ΔＣ）。その場合もやはりモノクローナル抗体ＮＧ１は、前記の切除を受けた蛋白質を認識したが、Ｃ−末端上のＥＲにおける保存シグナルの欠失により、その分布は細胞質全体に広がった（図４Ｃ）。この結果により、モノクローナル抗体ＮＧ１はＮｏｇｏ−Ａに特異的に結合するが、その他の形のＮｏｇｏには結合しないことがわかった。モノクローナル抗体ＮＧ１が認識するＮｏｇｏ−Ａ特異的ドメインには、レチキュロンファミリーの他のメンバーとの相同性がまったくない。そのため、モノクローナル抗体ＮＧ１が他のレチキュロン蛋白質とも結合するとは考えにくい。事実、本発明者らは、モノクローナル抗体ＮＧ１がＣＯＳ−７細胞中で発現しているレチキュロン１Ａとは結合しないことを確認している。
【００３２】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による、成体神経系中の希突起膠細胞の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１が切片中のＮｏｇｏ−Ａを認識するかどうかを調べるため、成体の中枢神経系の切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色した。成体神経系の軸索は、モノクローナル抗体ＮＧ１によってはほとんど染色されなかった。そのかわり、脳全体に散在する細胞体が強く染色されているのが観察された（図５Ａ、Ｂ）。モノクローナル抗体ＮＧ１陽性細胞の形態及び分布から、それらが希突起膠細胞であることがわかった。このことは、希突起膠細胞のマーカーであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）π（ＥＭＢＯ Ｊ． １９， ３４１−３４８， ２０００）によるかかる切片の二重免疫染色で確認された（図５Ｃ、Ｄ）。
【００３３】
成体の脊髄におけるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の分布については、これまでにいくつかの研究報告がある（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）。それらに従い、成体の脊髄切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で染色した。かかるモノクローナル抗体により、脊髄の白質全体に分布している希突起膠細胞及びその突起部分が強く染色された（図５Ｅ）。この染色パターンは、報告されている、Ｎｏｇｏ−Ａに対するポリクローナル抗体を用いた場合の免疫染色（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００）と同一だった。しかし、本来Ｎｏｇｏ−Ａに対する抗体であるモノクローナル抗体ＩＮ−１を用いた染色（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）と比較すると、モノクローナル抗体ＮＧ１による染色では、希突起膠細胞の細胞体がより鮮明に浮かびあがっており、かかる抗体自体は、ミエリン化軸索にはほとんど結合していなかった。染色パターンがこのように異なる理由は、現在のところ不明である。
【００３４】
本実施例において、本発明者らは、発生期の神経系における成長中の軸索と強く結合するモノクローナル抗体ＮＧ１を作製し、このモノクローナル抗体がＮｏｇｏ−Ａ蛋白質と特異的に結合することを示した。成体の神経系をこのモノクローナル抗体で染色した場合の染色パターンは、報告されているＮｏｇｏ−Ａの発現と一致するものだった（Ｎａｔｕｒｅ ４０３ ４３４−４３８， ２０００、Ｎａｔｕｒｅ ４０３ ４３９−４４４， ２０００）。発生期のニューロンにはＮｏｇｏ ｍＲＮＡの強い発現が見られるとの最近の報告（Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １６９， ３１９−３２８， ２００１）と考えあわせ、モノクローナル抗体ＮＧ１は発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識すると結論づけることができる。本発明により、モノクローナル抗体ＮＧ１が発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識するということから、盛んに成長している軸索中で、軸索成長の阻害因子であるＮｏｇｏが強く発現しているという、やや意外な新たな知見が得られた。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により製造される抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体は、神経機能の研究に広く利用できるのみならず、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインを認識するため、この軸索伸長抑制因子の活性を阻害できる可能性が高く、様々な神経再生に応用できる可能性がある。また、抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体ＮＧ１は、抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１に比べてＮｏｇｏ−Ａに対する特異的結合活性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：終脳の側面（Ａ）及び冠状面（Ｂ）の概略図。（Ａ）の左部分が吻側であり、（Ｂ）の左部分が側面である。（Ａ）（Ｂ）共にその上部が背面となっている。嗅球（ＯＢ）軸索が、終脳内部の尾側に伸長し、終脳表面で外側嗅索（ＬＯＴ）を形成している。
（Ｃ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の終脳の冠状切片。ＬＯＴ（矢印）が強く染色されている点に注意。嗅覚皮質（矢頭）及び皮質板も、かかるモノクローナル抗体で染色されている。
（Ｄ）：高拡大率でのＬＯＴ。軸索は均一に染色されておらず、強く標識された部位が斑点となっている。
（Ｅ）：前記モノクローナル抗体で染色した、大量の繊維をもつＥ１４．５の嗅球。
（Ｆ）：モノクローナル抗体ＮＧ１による、Ｅ１３．５の終脳の全量免疫染色。他の終脳部位と同様に、ＬＯＴ（矢印）を形成している嗅球軸索でも染色が認められる。
（Ｇ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＰ０の終脳。ＬＯＴ（矢印）は、やはり他の部位よりも強く染色されている。
スケールバーは５０μｍ（Ａ−Ｄ及びＦ）、５００μｍ（Ｅ）を表す。
【図２】モノクローナル抗体ＮＧ１による、神経系の他部位の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の前脳の冠状切片。内包（矢印）及び髄条（矢頭）において軸索が強く染色されている点に注意。
（Ｂ）：Ｅ１４．５の前脳の後部水平部位（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｌｅｖｅｌ）上の切片。分界条（矢印）中の軸索の束が強く標識されている。
（Ｃ）：Ｅ１４．５の嗅上皮から伸長している嗅覚神経（矢頭）の強い染色。（Ｄ）：Ｅ１４．５の眼球の、強く標識された視神経（矢印）。眼筋（矢頭）も前記モノクローナル抗体によって染色されている。
（Ｅ）：Ｐ７の前交連（矢印）は、やはり前記モノクローナル抗体によって強く染色されている。
（Ｆ）：Ｐ７の脳梁（矢印）は、周辺部位よりもやや強いレベルで染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図３】モノクローナル抗体ＮＧ１による、培養した嗅球ニューロンの免疫染色の様子を示す図である。
Ｅ１４．５の嗅球ニューロンを解離し（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、５日間培養した。神経突起の成長円錐（矢印）が、モノクローナル抗体ＮＧ１によって強く標識されている。スケールバーは５０μｍを表す。
【図４】モノクローナル抗体ＮＧ１によるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の認識の様子を示す図である。
（Ａ）：Ｎｏｇｏの３つのアイソフォームの蛋白質構造。Ｎｏｇｏ−Ａには、Ｎｏｇｏ−Ｂのアミノ酸配列がすべて含まれている。Ｎｏｇｏ−Ｃは、Ｎ−末端（縞のボックス）上に、独特の配列を有している。３種類のアイソフォームすべてに共通するＣ−末端領域におけるグレーのボックスは、ＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能する疎水性アミノ酸配列を示している。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９の構造が、かかる３つのＮｏｇｏアイソフォームの下に示されている。翻訳は、左側の点線部分、すなわちＮｏｇｏ−Ａのほぼ中央にあたる位置で始まるとされている。底部にあるｃＤＮＡ構造物の＃４−１Ｄ９ΔＣにおいては、共通するＣ−末端ドメインは、右側の点線部分で欠失し、Ｎｏｇｏ−Ａ特異的な３１６のアミノ酸からなるトランケート蛋白質が後に残っている。
（Ｂ）：＃４−１Ｄ９クローンを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。ＥＲの特徴であるレース様の網状組織が染色されている。
（Ｃ）：＃４−１Ｄ９ΔＣを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。細胞質が広く染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図５】モノクローナル抗体ＮＧ１による成体神経系の免疫染色の様子を示す図である。（Ａ、Ｂ）：脳梁近辺の成体終脳の切片。モノクローナル抗体ＮＧ１は、終脳全体に散在する細胞体を染色している。切片（Ｂ）は、（Ａ）の拡大率を高くしたものである。
（Ｃ、Ｄ）：抗ＧＳＴ抗体で染色して希突起膠細胞を視覚化した（Ａ、Ｂ）の同一の図。同じ細胞（矢頭）が、（Ｂ）及び（Ｄ）において標識されている。
（Ｅ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色した成体の脊髄切片。白質中の希突起膠細胞及びその突起部が強く染色されていることに注意。灰白質中でいくつかのニューロンが染色されているのは、二次抗体の非特異的結合によるものである。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図６】発現ベクターｐＣＡＧＧＳを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２】
Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することを特徴とする請求項１記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】
哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項２記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４】
嗅索で免疫したハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５又は６記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの検出試薬。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の診断薬。
【請求項１２】
Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項１３】
ハイブリドーマが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３）であることを特徴とする請求項１２記載のハイブリドーマ。
【請求項１】
嗅索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることを特徴とする抗Ｎｏｇｏ−Ａモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項２】
Ｎｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することを特徴とする請求項１記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】
哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項２記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４】
嗅索で免疫したハムスターの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、Ｎｏｇｏ−Ａに対して特異的に反応し、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃ並びにレチキュロン１Ａに対して交差反応せず、かつ、発生期の神経系における成長中の軸索を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、希突起膠細胞の細胞体に強く結合し、ミエリン化軸索にはほとんど結合しないモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項７】
モノクローナル抗体が、培養嗅球ニューロンの神経突起の成長円錐を強く認識するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項５又は６記載のＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの検出試薬。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の予防・治療薬。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか記載の製造方法により得られるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とするＮｏｇｏ−Ａの過剰発現に起因する疾病の診断薬。
【請求項１２】
Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体産生能を有することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項１３】
ハイブリドーマが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３）であることを特徴とする請求項１２記載のハイブリドーマ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００４−８１１９５（Ｐ２００４−８１１９５Ａ）
【公開日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−４０２１５（Ｐ２００３−４０２１５）
【出願日】平成１５年２月１８日（２００３．２．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（３９６０２０８００）科学技術振興事業団 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１６年３月１８日（２００４．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年２月１８日（２００３．２．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（３９６０２０８００）科学技術振興事業団 (35)
【Ｆターム（参考）】
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