抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗体を用いたＰＣＢ測定方法
【課題】塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供すること。
【解決手段】下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いる抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化２８】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【解決手段】下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いる抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化２８】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中、工業製品中、及び生物試料中などに含まれるＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）の測定に用いられる抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関し、特に、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に対して交差反応性を有し、１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質による環境汚染問題は、健康問題や社会生活に大きな不安を与えると共に産業活動等にも影響を与えるため、早急に解決すべき重大な課題である。特に、人体や環境への有害性が確認されたＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類、以下、単に「ＰＣＢ」と表すことがある）は過去、コンデンサやトランスの絶縁油、熱媒体、機械油等に多用されるなど地球規模で環境汚染が拡大しており、難分解性であることからその残留性や生物濃縮が問題となっている。
ＰＣＢｓについては、１９７４年に「化学物質の審査及び製造に関する法律」により製造、輸入、及び新たな使用について原則的に禁止措置が取られ、更に、２００１年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法(ＰＣＢ特措法)」が施行され、２０１６年までに全てのＰＣＢ廃棄物の適性処理が法的に義務づけられた。これにより、ＰＣＢｓ廃棄物の処理過程でのモニタリングや、処理後のＰＣＢ濃度の測定が重要な課題となっている。
また、ＰＣＢｓを含まないとされていたトランス中の代替絶縁油においても、残留していた微量ＰＣＢｓの混入が明らかになったことにより、大量の代替絶縁油やトランス本体のＰＣＢｓ濃度の迅速な分析も急務となっている。
【０００３】
従来のＰＣＢの測定としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）や、電子捕獲検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ−ＥＣＤ）が用いられて来た。しかしながら、これらの方法は設備投資や分析消耗品等にコストが嵩み、また、煩雑なクリーンアップ操作や分析者の技術習熟等の必要性から、データ取得や解析に多大な時間を要する等の問題があり、分析業務が特定の分析機関に限定される等、大量の試料を処理する方法としては限界があった。
これに対し、特異的抗体を利用する免疫学測定法は、迅速かつ簡便な測定方法として知られ、近年、環境分析の分野にも応用されつつある。
【０００４】
ＰＣＢ類似物質であるダイオキシン類の迅速分析法としても、レセプターバインディングアッセイや免疫測定法が注目されており、特に、免疫測定法では抗体が単一の測定対象物に対し特異的に結合するという性質を利用し、ダイオキシン類の毒性等量と相関を有する特定の同族体量を測定する事により、多数の同族体が存在するダイオキシン類の毒性等量総和（ダイオキシン量）を迅速、簡便に求める方法が開発されている。
【０００５】
更に、ＰＣＢは水に難溶性であり、分析するための試料を調製するにあたり、両親媒性溶媒存在下にＰＣＢを溶解させる必要があるため、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、試料中に存在する両親媒性溶媒に対する耐性が求められる。これに対し、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、例えば、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中でも抗原認識特性が実質的に低下しない抗モノクローナル抗体（例えば、特許文献１参照）等が提案されている。
【０００６】
このように、抗体を用いる免疫学的測定法では、交差反応性が低く、測定対象物に対し高特異性という抗体本来の性質を利用し、特定の物質を測定することに重点が置かれて来た。
このような考えに基づき、多数の異性体が存在するＰＣＢにおいては、交差反応性が制御された特異性の高い抗ＰＣＢ抗体が求められており、例えば、コプラナーＰＣＢの一つである３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）に対して特異性を持つ抗体（例えば、特許文献２参照）等が提案されている。
【０００７】
一方、ＰＣＢ分析では、ダイオキシン類分析における「毒性等量」という考え方が無いため、免疫測定法においても、多数のＰＣＢ同族体について可能な限り広く検出し、測定できることが重要である。しかしながら、特異性の高い単一の抗体を利用した測定系においては、同族体を網羅することが難しく、公定法による分析値との乖離、フォールスネガティブ（偽陰性の判定や見落とし）の危険性、更に再現性の低さ等が懸念される。
【０００８】
そこで、２種類の特異性の異なる抗体、あるいは測定系を混合し、その結果得られる抗体の特異性を利用して絶縁油中のＰＣＢ濃度を分析する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ダイオキシン類、ＰＣＢ類を検出する低分子物質検出用器具において、毒性を推定する場合と総量を推定する場合に応じて標的物質の異性体を選択し、該標的物質の抗体を用いることが開示されている（例えば、特許文献３参照）。
他方、異性体間において交差反応性が認められる複数種類の抗体を用いて、ダイオキシン類を異性体レベルで検出する方法が提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００９】
しかしながら、特許文献３及び４に記載された抗ＰＣＢ抗体を用いた免疫学的測定方法における測定対象は、コプラナーＰＣＢであり、そこで用いられる抗体は、異なる塩素数群の同族体混合物（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロールなどに由来するＰＣＢ）を、高感度に定量するための抗体としては満足なものではない。
【００１０】
また、ビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いて製造された、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体が提案されている（例えば、特許文献５参照）。しかしながら、この提案の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、蛍光による標識への適合性は高いものの、金コロイドによる標識への適合性は、十分満足のいくものではないという問題がある。
前記蛍光による標識は測定のコストが高く、ＰＣＢ分析を低コストで行なうためには、蛍光による標識よりも低コストである金コロイドによる標識への適合性が高い抗ＰＣＢモノクローナル抗体の開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−１９１６９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７８２２号公報
【特許文献３】特開２００４−１３８５５０号公報
【特許文献４】特開２００２−２２８６６０号公報
【特許文献５】特開２００８−１３７９０２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｏｌｌｕｔａｎｔ ａｎｄ ＰＯＰｓ，２００５，ＩＤ２３８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、３塩化ビフェニル、４塩化ビフェニル、５塩化ビフェニル、６塩化ビフェニル、及び７塩化ビフェニル等の塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとし、該ハプテンをキャリアータンパク質に結合した化合物を免疫原として免疫に用いることにより、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【化１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【００１５】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化２】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
＜２＞ 下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程と、
前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程と、
前記ハイブリドーマを培養する工程とを含む前記＜１＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化３】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜３＞ 下記構造式（２）中、Ｚが、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、及び金原子クラスターのいずれかの標識物質により標識されている前記＜２＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化５】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜４＞ 下記構造式（１）、及び下記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化６】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化７】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜６＞ １塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、１塩素化ＰＣＢ〜２塩素化ＰＣＢ同族体、及び８塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性よりも、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高い前記＜５＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜７＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマである。
＜８＞ 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３である前記＜７＞に記載のハイブリドーマである。
＜９＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１０＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、下記構造式（１）、及び下記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
【化８】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化９】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜１１＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、下記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
【化１０】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜１２＞ 抗ＰＣＢモノクローナル抗体が、金コロイドにより標識されている前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載のＰＣＢ測定方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、３塩化ビフェニル、４塩化ビフェニル、５塩化ビフェニル、６塩化ビフェニル、及び７塩化ビフェニル等の塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、各アロクロールのＰＣＢ同族体組成を示す図である（出典：廃棄物処理法新処理基準に基づくＰＣＢ処理技術ガイドブック、編集：財団法人産業廃棄物処理事業振興財団、発行：株式会社ぎょうせい、平成１７年８月１日刊）。
【図２】図２は、試験例２における金コロイド標識された各抗体の吸光度を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例３における各金コロイド標識抗体のＰＣＢに対する感度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法＞
−構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物（ハプテン）−
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物（下記構造式（１）で表される化合物）からなるハプテンを用い、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造される。
【化１１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【００１９】
なお、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物における異性体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、三塩素化ビフェニルから六塩素化ビフェニル等を主体とするもの、等が挙げられる。これらの中でも、四塩素化ビフェニル、五塩素化ビフェニルが、絶縁油中のＰＣＢを測定対象とする場合に有利である。
【００２０】
前記ビフェニル誘導体の異性体混合物におけるこれらの異性体の混合割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ビフェニル誘導体の異性体混合物を後述のようにして製造する場合、５−フェニルエーテルに対する塩素化剤の添加量及び塩素原子の配向性の点から、下記化合物１Ａ、化合物１Ｂ、化合物１Ｃが主要異性体となると考えられる。
【化１２】
【００２１】
前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の反応式に従い製造することができる。
以下の反応式では、３−フェニルフェノールを出発原料とし、まず、６−ブロモヘキサン酸エチルエステルと反応させ、次いで、塩素化、加水分解を行なうことにより、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体を製造している。
【化１３】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｅｔは、エチル基を表し、Ｐｈは、フェニル基を表す。
【００２２】
−構造式（２）で表される化合物−
前記構造式（１）で表される化合物は、単独では抗原性を持たないため、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製するために、下記構造式（２）で表される化合物（下記構造式（２）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物、以下、「コンジュゲート」と称することがある）を調製し、これを免疫原（抗原）として用い、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製することが好ましい。
【化１４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００２３】
前記構造式（２）中、Ｚで表されるタンパク質（以下、「キャリアータンパク質」と称することがある）としては、免疫原性を有し、かつ前記構造式（１）で表される化合物とスペーサー部（−Ｏ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−）を介して連結可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、ミオグロビン、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）、等が挙げられる。これらの中でも、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
【００２４】
前記構造式（２）で表される化合物（コンジュゲート）の調製方法としては、特に制限はなく、公知の合成方法により調製することができ、例えば、下記反応式に示すように、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの縮合反応により活性エステル誘導体に変換し、次いで、該活性エステル誘導体とキャリアータンパク質のアミノ基とを常法に従って結合させる方法などが挙げられる。
【化１５】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００２５】
得られた前記構造式（２）で表される化合物（コンジュゲート）は、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法により、反応液を生理的リン酸緩衝液などの中性溶液に置換すると共に精製することが好ましい。
【００２６】
前記構造式（２）中、Ｚで表されるタンパク質は、標識物質により標識されていてもよい。前記標識物質としては、特に制限はなく、公知の標識物質から適宜選択することができ、例えば、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、金原子クラスター、等が挙げられる。
【００２７】
−抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造−
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程（以下、「免疫工程」と称することがある）と、前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程（以下、「抗体産生細胞回収工程」と称することがある）と、前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程（以下、「ハイブリドーマ取得工程」と称することがある）と、前記ハイブリドーマを培養する工程（以下、「培養工程」と称することがある）とを含む製造方法により製造される。
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法は、更に、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程（以下、「スクリーニング工程」と称することがある）を含むことが好ましい。
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば、ケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−７（１９７５））等に準じて行うことが出来る。
【００２８】
−−免疫工程−−
前記免疫工程は、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた前記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程である。
【００２９】
免疫する前記動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の哺乳動物が好ましい。
前記動物の免疫方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記免疫原とアジュバントとを乳化させて得た乳化液を、皮下、静脈内、腹腔内に、注射等により投与する方法などが挙げられる。
前記免疫原の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、マウスの場合、０．０１ｇ／匹〜０．５ｇ／匹を、２週間〜３週間程度の間隔で３回〜１５回投与することが好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、フロイントの完全アジュバント、不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられ、抗体の誘導能、動物への負荷等の関係から、最適なものを選択して使用することが好ましい。
【００３０】
−−抗体産生細胞回収工程−−
前記抗体産生細胞回収工程は、前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程である。
【００３１】
前記抗体産生細胞回収工程は、例えば、前記免疫原の最後の投与から数日後に、免疫した前記動物から抗体産生細胞を回収することにより行なわれる。
前記抗体産生細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脾臓、リンパ節由来Ｂ細胞、等が挙げられる。
【００３２】
−−ハイブリドーマ取得工程−−
前記ハイブリドーマ取得工程は、前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程である。
前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、その後所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングすることにより、前記ハイブリドーマが得られる。
【００３３】
前記ミエローマ細胞としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができる。例えば、マウス、ラット、ヒト由来の細胞株等から選択することができ、マウス由来細胞であれば、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、Ｓ１９４／５ＸＸＯ・Ｂｕｌ等、ラット由来細胞であれば、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ・１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０等が挙げられる。
【００３４】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法、等が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコール法が、細胞毒性も比較的少なく、融合操作も簡単であるという点で、好ましい。
【００３５】
前記所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、等が挙げられる。
【００３６】
前記スクリーニング方法では、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いることが好ましい。
例えば、前記構造式（２）で表されるコンジュゲートを固相化し、前記融合細胞（ハイブリドーマ）の培養上清を反応させることにより、該培養上清の抗体価を測定し、抗体価が高いウエルを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルとして選択することができる。更に、抗体価測定時にＰＣＢ代替化合物（例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体）やＰＣＢｓ等を共存させることにより、これら共存物質に対し反応性の高いウエルを選択し、限界希釈法にて目的の抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのモノクローン化を行うことができる。
また、前記構造式（２）で表されるコンジュゲート中、Ｚで表されるタンパク質を標識物質により標識し、これを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルの抗体価の測定時に共存させ、直接競合反応を行う方法によって抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。
【００３７】
前記抗ＰＣＢ抗体の測定対象であるＰＣＢは水に難溶であるため、両親媒性溶媒に溶解させて測定に供せられる。このため、前記抗ＰＣＢ抗体は、試料中に存在する前記両親媒性溶媒に対する耐性を有することが好ましい。よって、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングも前記両親媒性溶媒存在下で行うことが好ましい。
前記両親媒性溶液としては、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、等が挙げられる。
前記スクリーニングに用いられる前記両親媒性溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０質量％以下が好ましく、３０質量％以下がより好ましく、５質量％〜２０質量％が特に好ましい。
【００３８】
前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに用いられるセンサとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーのセンサ官能部へ、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体、又は前記構造式（２）で表されるビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲートを固定化したもの、等が挙げられる。
また、予め前記融合細胞の培養上清にＰＣＢ等を添加して反応させたものを、前記センサ官能部に接触させてスクリーニングを行うこともできる。この場合、前記官能部に結合した抗体量を評価することにより、種々のトランスデューサーでのＰＣＢ測定への適用が可能な、高親和性を有する抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマを選抜することができる。
【００３９】
＜ハイブリドーマ＞
前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記の方法により作製され、樹立されたものが好ましく、具体的には、後述する実施例に示すような、ＯＤ８Ｂ１１株が挙げられる。
前記ＯＤ８Ｂ１１株は、下記構造式（２）に示す化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成２１年８月６日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３として寄託されている。
【化１６】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００４０】
−−培養工程−−
前記培養工程は、前記ハイブリドーマを培養する工程である。
前記培養工程により、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４１】
前記培養工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株を、予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与したマウスの腹腔内に移植して培養する方法が挙げられる。
前記マウスの腹腔内に移植して１０日後〜１４日後に、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含む腹水を回収し、得られた腹水から前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４２】
また、前記ハイブリドーマを、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ等）を用いて培養し、得られた培養液の上清を、抗ＰＣＢモノクローナル抗体溶液とすることができる。
【００４３】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、精製されていることが好ましい。
前記腹水、又はウシ胎児血清含有培地より得た前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株培養液上清から、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、限外ろ過、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、等により精製することができる。
【００４４】
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、前記本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有する。また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高いことが好ましい。
前記３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体の存在比が高いものの例としては、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製）、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）が挙げられる。
また、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性が高い（後述する試験例２参照）ことから、低コストでＰＣＢを測定することができる。
【００４５】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する親和性は、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０値）により評価することができる。また、前記ＰＣＢモノクローナル抗体の交差反応性は、例えば、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体について、それぞれのＩＣ５０値を求め、それらの比を求めることにより評価することができる。
【００４６】
前記ＩＣ５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光光度計、又は相対吸光度測定器による測定データを、下記式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。
【数１】
前記式（１）中、ｙは、抗原を加えなかったときの蛍光強度、又は相対吸光度の値を１００％としたときの相対的な蛍光強度、又は吸光度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００４７】
測定データは、抗原を加えなかったときの蛍光強度、又は吸光度の値を１００％として相対値に変換した後、グラフ作成ソフトウェア（例えば、Ｏｒｉｇｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ製）等）を用いて最適なＰ１及びＰ２を決定する。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ５０値とする。
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。
【００４８】
また、前記ＩＣ５０値の算出方法としては、蛍光光度計、又は相対吸光度測定器による測定データを、下記式（７）で表される式に当てはめて相対的な応答（％）を求めることにより解析することもできる。前記相対的な応答が５０％となるときの値をＩＣ５０値とする。
【数２】
ただし、前記式（７）中、ＲＧは、相対的な応答（％）を示し、ＩＣＺは、抗原を加えなかった場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＣＭは、抗原を加えなかった場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＺは、抗原を加えた場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＭは、抗原を加えた場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示す。
【００４９】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）やアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）等を被測定試料として用い、評価することができる。
【００５０】
前記カネクロール、及びアロクロールは、それぞれ下記表１及び図１に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているが、例えば、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１塩素化〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、中でも、Ａｒ−１２２１を除く、その他のカネクロール及びアロクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、及びＡｒ−１２３２）に対して高い特異性を示す。
【００５１】
【表１】
（出典：高菅卓三ら、「各種クリーンアップ法とＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを用いたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の全異性体詳細分析方法」，環境化学，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，ｐｐ.６４７−６７５，１９９５）
【００５２】
（ＰＣＢ測定方法）
本発明のＰＣＢ測定方法は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用い、試料中のＰＣＢを免疫学的に検出、定量する方法、具体的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫クロマトグラフィー、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、結合平衡除外法等が挙げられる。
【００５３】
前記ＰＣＢ測定方法としては、例えば、非競合法、競合法（間接競合法あるいは直接競合法）、結合平衡除外法等が挙げられ、具体的には、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の方法等が挙げられる。
（Ｉ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
（ＩＩ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
（ＩＩＩ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、前記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
【００５４】
以下、前記間接競合法、及び前記結合平衡除外法の一例をより具体的に説明する。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法において、担体に固定化する抗原（以下、「固定化抗原」と称することがある）としては、例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体を含む化合物、及び前記構造式（２）で表される化合物、等が挙げられる。
前記間接競合法、及び前記結合平衡除外法は、前記固定化抗原を前記担体上に固定化し、前記担体の前記固定化抗原が結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、該担体に被測定試料と前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを加え、前記固定化抗原と前記被測定試料中のＰＣＢとを前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対して前記間接競合法においては競合反応させ、前記結合平衡除外法においては結合平衡除外化反応させる。
前記固定化担体と結合しなかった前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を洗浄除去した後、二次抗体として標識した抗体を加え、前記固定化抗原と結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合させ、洗浄を行った後、前記標識の発色又は発光を測定する。また、二次抗体を使用せず、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を直接標識して用いてもよい。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
【００５５】
また、前記担体としては、前記固定化抗原の構造の一部と同一、又は類似する構造を分子中に有する担体を用いてもよい。前記固定化抗原の構造の一部と同一、又は類似する構造を分子中に有する担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００７−２０６０６２号公報に記載の担体、などが挙げられる。
【００５６】
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する場合、及び、酵素としてアルカリフォスファターゼを用い、基質にｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する場合には、発色を吸光度で測定することができる。一方、基質の反応生成物が蛍光である場合や、蛍光物質を用いて標識されている場合には、蛍光光度計等を用いて蛍光を測定することができる。
また、化学発光物質を用いる場合には、発光を化学発光測定器等により測定することができ、金コロイドを用いる場合には、透過光度等を透過光量測定器等により測定することができる。
【００５７】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性に優れ、低コストでＰＣＢを測定することができる点で、前記標識として金コロイドを用いることが好ましい。
前記金コロイドによる標識の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年）に記載の方法により行うことができる。
前記透過光量測定器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、特開２００６−２１５０１３号公報に記載の相対吸光度測定器が好ましい。
【００５８】
前記被測定試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質中のＰＣＢを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やアルコール系溶媒等の極性溶媒で液−液抽出してなる試料、前記被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液−液抽出し、抽出された前記ＰＣＢを含む前記極性溶媒を吸着剤で固相抽出し、前記吸着剤に吸着した成分を所望の溶媒に転溶させてなる試料、前記被験物質にノルマルヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の低極性溶媒を加え、前記被験物質中のＰＣＢを親水性溶媒で抽出してなる試料、などが挙げられる。
前記液−液抽出において、前記被験物質と前記極性溶媒との混合比（質量比）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（前記被験物質）：（前記極性溶媒）＝１：１〜：１：１０が好ましい。
【００５９】
前記被験物質としては、少なくともＰＣＢを含む可能性がある物質（ＰＣＢ汚染物）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などが挙げられる。これらの中でも、絶縁油が好適に挙げられる。
前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。
【００６０】
前記被測定試料中の極性溶媒の濃度としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する前記親和性が著しく劣化しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１質量％〜２０質量％が好ましく、１０質量％〜２０質量％がより好ましい。
【００６１】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、カネクロールやアロクロールに含まれる複数の塩素が置換されたＰＣＢに対し親和性を有し、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れるため、環境試料中、工業製品中、生物試料中に含まれるＰＣＢを低コストで、迅速かつ再現性良く分析することが可能となり、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、ＰＣＢｓの迅速なモニタリングや分析技術として好適である。
また、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーを使用した系において、センサ官能部へ、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、又は前記ビフェニル誘導体等を固定化して、免疫センサとして使用することができる。
更に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を固定化した担体は、ＰＣＢの効率的濃縮や除去に適用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変及び修飾を含むものとする。
【００６３】
（実施例１：抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造）
（１）ビフェニル誘導体の異性体混合物、及びコンジュゲートの調製
下記反応式に従い、３−フェニルフェノールに、スペーサー分子を導入したハプテンとしてのビフェニル誘導体（下記反応式中、化合物３）を調製し、更に、キャリアータンパク質と結合させてなるコンジュゲート（下記反応式中、化合物５）を合成した。
【化１７】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、又はＫＬＨ（スカシガイ由来ヘモシアニン）を表す。
【００６４】
３−フェニルフェノール５．０ｇ（２９．４ｍｍｏｌ）をアセトン７０ｍＬに溶解させ、炭酸カリウム８．１１ｇ（５８．８ｍｍｏｌ）、次いで６−ブロモヘキサン酸エチルエステル７．８７ｇ（３５．３ｍｍｏｌ）を加え６０℃に加温し４８時間撹拌した。反応後、室温まで放冷した後、不溶物を濾別し、濾液から溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２０で溶出）し、前記反応式中の化合物１を８．５５ｇ得た。
【００６５】
前記化合物１ １．００ｇ（５．８８ｍｍｏｌ）に、塩化スルフリル１０ｍＬとジフェニルスルヒド（触媒）５０ｍｇとを加え、室温で２０時間、５０℃で２０時間、７０℃で１０時間撹拌した。室温まで放冷した後、溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２０で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物２を１．０２ｇ得た。
【００６６】
前記化合物２ １．０２ｇを、テトラヒドロフラン４ｍＬに溶解させ、水酸化カリウム０．５ｇを４ｍＬの蒸留水に溶解した水溶液を加え、室温で５０時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を蒸留水に溶解させ、濃塩酸でその水溶液を酸性にし、析出した固体を濾集した。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物３を０．７２ｇ得た。
【００６７】
前記化合物３ ０．７２ｇ、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド０．２９１ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を無水ジメトキシエタン１２ｍＬに溶解した。この反応液に氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド０．５２１ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温し、２４時間撹拌した。反応液を濾過した後、濾液から溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：四塩化炭素＝１：５で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物４を０．６０ｇ得た。
【００６８】
前記化合物４ ０．６０ｇを、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＢＳＡ溶液、又はＫＬＨ溶液に氷冷撹拌下に滴下し、室温にて一晩撹拌した。反応液をＰＢＳ(−)で平衡化したセファデックスカラムに添加し、同緩衝液で展開して、キャリアータンパク質を分離し、コンジュゲート（前記反応式中の化合物５）を精製した。
【００６９】
（２）マウスの免疫
得られたコンジュゲートを免疫原として、マウスを免疫した。
前記化合物５と、アジュバントとしてＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）とを１：１容量に混合して十分に乳化させ、得られた乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢〜８週齢、雌）の腹腔内に２００μＬ投与することによりマウスを免疫感作した。
追加免疫は、約２週間〜３週間間隔で行い、追加免疫から１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して抗体価の推移を観察した。
【００７０】
（３）ハイブリドーマの作製
血中に免疫原に対する高い抗体産生が認められたマウス尾静脈内に、さらに免疫原を投与して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に、免疫した前記マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製し、対数増殖期にあるミエローマ細胞（ＮＳ０）と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）添加の２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、脾臓細胞数で１×１０５細胞／ウエル〜２×１０５細胞／ウエルになるように９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【００７１】
（４）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング
細胞融合より７日後〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用い、以下の方法により抗体価を測定し、スクリーニング、及びクローニングを行なった。
【００７２】
−抗原ビーズの作製−
アガロースビーズ（ファルマシア社製）に、ジクロロフェノール誘導体とＢＳＡ（牛血清アルブミン）との複合体（抗原複合体：下記化合物Ｘ）を固定化した。具体的には、約１ｍＬのアガロースビーズに約０．１ｍｇの抗原複合体を固定化した後、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を１ｍＬ用いてビーズ表面をブロッキングした。
【化１８】
ただし、前記化合物Ｘ中、「Ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＢＳＡを表す。
【００７３】
−スクリーニング、及びクローニング−
蛍光光度計として、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにしてスクリーニング、及びクローニングを行なった。
まず、９６ウエルプレートの各区画から９０μＬずつ培養上清を回収し、１列（１２ウエル）分を１本のサンプリングチューブにまとめた。更に、前記サンプリングチューブから２００μＬずつ、１プレート（８列）分を１本のサンプリングチューブにまとめた。
スクリーニングは、まず始めにプレートごとにまとめた培養上清について行い、陽性のプレートに対しては、引き続き列ごとのスクリーニングを行った。
具体的なスクリーニング方法は、以下の通りである。
前記培養上清を０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。前記２次抗体には蛍光物質（Ｃｙ５）が結合しており、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度から培養上清中の目的抗体の有無を判断（蛍光強度が、１Ｖ以上であれば目的抗体あり、１Ｖ未満であれば目的抗体なし）した。
【００７４】
前記蛍光強度の判断により、目的抗体が有ると判断した列の培養上清を２本の試験管に分け、１本には終濃度２％になるようＤＭＳＯを加え（コントロール）、他の１本には４種類のＰＣＢ等量混合液（カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：ＧＬサイエンス社製））を終濃度１００ｐｐｂになるように加えた。そして、前記コントロールの蛍光強度（Ｂ０）に対する、前記４種類のＰＣＢ等量混合液の蛍光強度（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列を選抜した。
前記蛍光強度の測定は、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにして行なった。
前記コントロール、及び前記４種類のＰＣＢ等量混合液それぞれについて、０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。そして、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を測定した。
【００７５】
更に、前記ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列に対して、ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列を選抜した翌日に改めて区画（ウエル）ごとに培養上清を回収し、陽性区画（ウエル）を決定し、前記陽性区画で増殖しているハイブリドーマをメチルセルロース培地によるコロニー形成法によってクローニングした。
【００７６】
（５）塩素数の異なるＰＣＢ同族体に同等に反応する抗体産生クローンの選抜
前記（４）にて選抜したハイブリドーマのうち、１回以上クローニングを実施したハイブリドーマを、更に蛍光光度計（ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製））を用い、以下のようにして選抜を行った。
拡大培養したクローンの培養上清を０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで適宜希釈して、シグナル（蛍光強度）が２Ｖになるようにし、これを５本に分け、１本にはＤＭＳＯを終濃度２％となるように加え（コントロール）、残りの４本にはそれぞれＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００を終濃度１０ｐｐｂとなるように加えた。
そして、前記コントロールの蛍光強度（Ｂ０）に対する、各ＰＣＢ含有液の蛍光強度（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、各ＰＣＢに対し共通に高い親和性を示す抗体産生クローンを取得した。
前記蛍光強度の測定は、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにして行なった。
前記コントロール、及び各ＰＣＢ含有液それぞれについて、０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。そして、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を測定した。
【００７７】
以上の方法により、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体に親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する安定なハイブリドーマが得られ、これをＯＤ８Ｂ１１株とした。前記ＯＤ８Ｂ１１株細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、該コロニーを液体培地（２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ、ＧＩＢＣＯ社）に移し、培養を続けた。なお、このハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１株は、平成２１年８月６日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３を取得している。
【００７８】
（６）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製
前記（５）で樹立したハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１株のコロニーを、２４ウエルプレート上の２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を基本とするＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）培地に移し２日間培養した後、培養液の一部を１０ｍＬの前記ＨＴ培地を入れた４０ｍＬの角型フラスコに移し、コンフルエントに達する直前まで培養し、ＯＤ８Ｂ１１株によって分泌された抗体を培養上清からプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「ＯＤ８Ｂ１１抗体」という）を得た。
【００７９】
（７）モノクローナル抗体の大量調製と精製
８週齢を超えるＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ、プリスタン［２，６，１０，１４−テロラメチルペンタデカン］（和光純薬社製）を０．５ｍＬ投与し、２週間〜３週間飼育した。
予め対数増殖期に維持しておいた抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１の培養液を回収し、遠心分離にて培養上清を除いたのち、ＦＢＳ不含のＲＰＭＩ１６４０にて沈査を１×１０６細胞／０．５ｍＬになるよう細胞液を調製した。
この細胞液をプリスタン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内に移植し、１０日後〜１４日後に腹腔内に漏出した腹水を腹部より２５Ｇのシリンジを装着した注射器で回収した。
採取した腹水をポアサイズ０．２２μｍ径のフィルターを用いてろ過後、得られたろ液をプロテインＧ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｎｓｉｅｎｓ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＯＤ８Ｂ１１抗体）を得た。
【００８０】
（８）アイソタイプ分析
固相化抗原として、下記構造式（２）で表される化合物を用い、マウスタイパーキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のアイソタイプ分析を行なった。
【化１９】
この結果、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１によって生産された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。
【００８１】
（比較例１）
特開２００８−１３７９０２号公報に記載の樹立されたハイブリドーマＷＲ３Ｆ６株（平成１８年１０月２６日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３を取得）から産生された抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「ＷＲ３Ｆ６抗体」という）について、前記ＯＤ８Ｂ１１抗体と同様に、モノクローナル抗体の大量調製と精製を行った。
【００８２】
（試験例１：ＯＤ８Ｂ１１抗体の各ＰＣＢに対する感度特性）
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）を用い、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）、アロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１：和光純薬社製）に対する親和性、交差反応性を、以下のようにして評価した。
【００８３】
−抗体結合用担体の作製−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が導入されたアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、前記化合物Ｘ（ジクロロフェノール誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート）を共有結合にて結合させ、ＢＳＡ溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。
【００８４】
−蛍光強度の測定−
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体それぞれについて、抗体濃度を終濃度０．５ｎＭとし、それぞれを終濃度０．０５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬになるように調製したカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）、アロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）の溶液と反応させた後、前記抗体結合用担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
その後、蛍光物質Ｃｙ５（登録商標）で標識された２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を前記抗体結合用担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
次いで、５％ＤＭＳＯ、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)を流速０．２５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除した後、蛍光強度を測定した。
【００８５】
−ＩＣ５０値の算出−
前記測定した蛍光強度を下記式（１）の近似式に当てはめ、ＩＣ５０値（ｙ＝５０％となるときのｘの値）を算出した。結果を表２に示す。
【数３】
前記式（１）中、ｙは、試料中に抗原（ＰＣＢ）を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％とした時の相対的な蛍光強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００８６】
−交差反応率−
前記交差反応率は、下記式（２）〜（５）により算出した。結果を表２に示す。
−ＯＤ８Ｂ１１抗体−
・抗原が、カネクロールの場合
ＯＤ８Ｂ１１抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＫＣ−４００の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（２）
ＷＲ３Ｆ６抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＫＣ−４００の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（３）
・抗原が、アロクロールの場合
ＯＤ８Ｂ１１抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＡｒ１２５４の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（４）
ＷＲ３Ｆ６抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＡｒ１２５４の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（５）
【００８７】
【表２】
【００８８】
前記表２の結果から、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）において、ＷＲ３Ｆ６抗体とほぼ同等の交差反応率を有していることがわかった。
また、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）に対して、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも高い親和性を有し、高い検出感度を示すことがわかった。
【００８９】
（試験例２：ＯＤ８Ｂ１１抗体の金コロイド標識適合性）
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体を用い、金コロイド標識適合性を、以下のようにして評価した。
【００９０】
−金コロイド溶液の調製−
一般的なクエン酸法（横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年））に従って金コロイド溶液を調製した。
詳しくは、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物（和光純薬工業社製）を超純水で希釈し、０．０１％の濃度に調整した。次に、その溶液を沸騰させ、０．１％に希釈したクエン酸ナトリウム１．５ｍＬを添加し、更に１０分間沸騰させた。その後、溶液を冷却し、金コロイド溶液を得た。
【００９１】
−抗体の標識−
横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年）を参考に、前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体を標識した。
詳しくは、調製した前記金コロイド溶液を２０℃に保ち、炭酸カリウム（２００ｍＭ）を用いてｐＨを９．１５に調製した。次に、前記抗体を０．６ｍｇ添加し、２分間反応させた。次に、１０％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）溶液を１０ｍＬ添加し、ブロッキングを行った。最後に、２５分間、２５℃、９，０００ｒｐｍの条件で遠心し、１０ｍＬの沈殿物を回収し、金コロイド標識抗体を得た。
【００９２】
−測定方法−
大村直也 他「生体機能を利用したセンシング（その７）」電力中央研究所報告Ｖ０８０５３（２００９年）に記載のＰＣＢバイオセンサー法に基づき、以下のようにして測定を行った。
【００９３】
−−抗体溶液の調製−−
前記金コロイド標識抗体を含有する抗体溶液を、１％（ｗ／ｗ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で適宜希釈した。
ＤＭＳＯ溶液に、前記抗体溶液と、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液とを最終的にＤＭＳＯ濃度が２％となるように添加した。なお、前記添加された溶液における金コロイド標識抗体の濃度は、ＯＤ８Ｂ１１抗体では、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭとなるように調製し、ＷＲ３Ｆ６抗体では、７００ｐＭ、５６０ｐＭ、４２０ｐＭ、２８０ｐＭ、１４０ｐＭとなるように調製した。
【００９４】
−−測定装置−−
測定装置として、特開２００６−２１５０１３号公報の実験例２に記載の相対吸光度測定器、及び測定用セルを使用した。
前記測定用セルに収容される乱反射媒体として、特開２００７−２０６０６２号公報の段落〔００７８〕〜〔００７９〕に記載のセルロース（免疫反応測定用担体）を用いた。
【００９５】
−−測定−−
先ず、前記乱反射媒体を収容した前記測定用セルを、前記相対吸光度測定器のセルホルダに固定し、発光部から光を照射して、透過光の光量Ｌ２（送液前の透過光量）を測定した。
【００９６】
その後、同じ検出セルに前記調製した抗体溶液４ｍＬを流速８．５ｍＬ／分で送液した。続いて、１ｍＬのＰＢＳ−ＢＳＡを流速８．５ｍＬ／分で送液し、測定セルを洗浄した。その後、測定セルを７，０００ｒｐｍで５分間遠心し、水切りをした後、３０分間風乾した。
前記風乾した測定セルを再び前記相対吸光度測定器のセルホルダに固定し、発光部から光を照射して、透過光の光量Ｌ１（送液後の透過光量）を測定した。
ランベルト・ベールの法則に基づき、前記Ｌ１、及び前記Ｌ２を下記式（６）に当てはめることにより、吸光度Ａを算出した。結果を図２に示す。
Ａ ＝ −ｌｏｇ（Ｌ１／Ｌ２） ・・・式（６）
【００９７】
図２中、横軸は、抗体濃度（ｎＭ）、縦軸は、吸光度を示す。また、図２中、線形は、最小二乗法から求めた一次関数であり、Ｒ２は、相関係数を示す。
図２の結果から、同じ抗体濃度において、ＯＤ８Ｂ１１抗体の方が、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも吸光度が高いことがわかった。これにより、ＯＤ８Ｂ１１抗体の方が、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも金コロイド標識に適合していることがわかった。
【００９８】
（試験例３：金コロイド標識抗体によるＰＣＢに対する感度）
試験例２において、以下の金コロイド標識抗体の濃度、ＰＣＢとし、抗原抗体反応を行なった以外は、試験例２と同様にして、金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体、及びＷＲ３Ｆ６抗体のＰＣＢに対する感度を試験した。
【００９９】
−金コロイド標識抗体含有溶液の調製−
金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体、及びＷＲ３Ｆ６抗体が、同じ吸光度を示すように、抗原抗体反応を行う際の溶液における金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体の濃度は、５００ｐＭとし、金コロイド標識したＷＲ３Ｆ６抗体の濃度は、５６０ｐＭとした。
【０１００】
−ＰＣＢ含有溶液の調製−
前記ＰＣＢ含有溶液として、ＤＭＳＯ溶液にＰＣＢ（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００を等量混合したもの）を添加し、ＰＣＢ含有溶液とした。
なお、抗原抗体反応を行う際の溶液におけるＰＣＢ濃度は、０．２ｐｐｂ、１ｐｐｂ、４ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、１００ｐｐｂとした。
【０１０１】
−抗原抗体反応−
前記ＰＣＢ含有溶液に、前記抗体溶液と、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液とを最終的にＤＭＳＯ濃度が２％となるように添加した。
前記添加された溶液を、空調の利いた室内（２５℃±５℃）で３０分間以上放置し、抗原抗体反応を行なった。
【０１０２】
前記調製した金コロイド標識抗体、及びＰＣＢを用い、前記試験例２と同様にして相対吸光度測定器により透過光量を測定し、下記式（７）により、相対的な応答（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（％）を算出した。結果を図３に示す。
【数４】
ただし、前記式（７）中、ＲＧは、相対的な応答（％）を示し、ＩＣＺは、抗原（ＰＣＢ）を加えなかった場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＣＭは、抗原（ＰＣＢ）を加えなかった場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＺは、抗原（ＰＣＢ）を加えた場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＭは、抗原（ＰＣＢ）を加えた場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示す。
【０１０３】
図３中、横軸は、ＰＣＢ濃度（ｐｐｂ）、縦軸は、相対的な応答（％）を示す。
図３の結果から、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも低濃度のＰＣＢに反応することが確かめられた。また、このときのそれぞれのＩＣ５０値は、ＷＲ３Ｆ６抗体が４．８９ｐｐｂであったのに対し、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、２．９６であり、約１．７倍の感度向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＯＤ８Ｂ１１抗体）は、極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物、具体的には、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製)、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、組成が未知の絶縁油等、ＰＣＢを含有する可能性のある検査対象を、最小限の誤差で高感度に検出、定量することができる。
また、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性に優れており、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、低コストで廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等を検査することができる。
【受託番号】
【０１０５】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境中、工業製品中、及び生物試料中などに含まれるＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類）の測定に用いられる抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関し、特に、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に対して交差反応性を有し、１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質による環境汚染問題は、健康問題や社会生活に大きな不安を与えると共に産業活動等にも影響を与えるため、早急に解決すべき重大な課題である。特に、人体や環境への有害性が確認されたＰＣＢｓ（ポリ塩化ビフェニル類、以下、単に「ＰＣＢ」と表すことがある）は過去、コンデンサやトランスの絶縁油、熱媒体、機械油等に多用されるなど地球規模で環境汚染が拡大しており、難分解性であることからその残留性や生物濃縮が問題となっている。
ＰＣＢｓについては、１９７４年に「化学物質の審査及び製造に関する法律」により製造、輸入、及び新たな使用について原則的に禁止措置が取られ、更に、２００１年に「ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法(ＰＣＢ特措法)」が施行され、２０１６年までに全てのＰＣＢ廃棄物の適性処理が法的に義務づけられた。これにより、ＰＣＢｓ廃棄物の処理過程でのモニタリングや、処理後のＰＣＢ濃度の測定が重要な課題となっている。
また、ＰＣＢｓを含まないとされていたトランス中の代替絶縁油においても、残留していた微量ＰＣＢｓの混入が明らかになったことにより、大量の代替絶縁油やトランス本体のＰＣＢｓ濃度の迅速な分析も急務となっている。
【０００３】
従来のＰＣＢの測定としては、例えば、公定法として、高分解能ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）や、電子捕獲検出器付きガスクロマトグラフ法（ＧＣ−ＥＣＤ）が用いられて来た。しかしながら、これらの方法は設備投資や分析消耗品等にコストが嵩み、また、煩雑なクリーンアップ操作や分析者の技術習熟等の必要性から、データ取得や解析に多大な時間を要する等の問題があり、分析業務が特定の分析機関に限定される等、大量の試料を処理する方法としては限界があった。
これに対し、特異的抗体を利用する免疫学測定法は、迅速かつ簡便な測定方法として知られ、近年、環境分析の分野にも応用されつつある。
【０００４】
ＰＣＢ類似物質であるダイオキシン類の迅速分析法としても、レセプターバインディングアッセイや免疫測定法が注目されており、特に、免疫測定法では抗体が単一の測定対象物に対し特異的に結合するという性質を利用し、ダイオキシン類の毒性等量と相関を有する特定の同族体量を測定する事により、多数の同族体が存在するダイオキシン類の毒性等量総和（ダイオキシン量）を迅速、簡便に求める方法が開発されている。
【０００５】
更に、ＰＣＢは水に難溶性であり、分析するための試料を調製するにあたり、両親媒性溶媒存在下にＰＣＢを溶解させる必要があるため、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、試料中に存在する両親媒性溶媒に対する耐性が求められる。これに対し、前記免疫学的測定法に用いられる抗ＰＣＢ抗体としては、例えば、５０（ｖ／ｖ）％有機溶媒水溶液中でも抗原認識特性が実質的に低下しない抗モノクローナル抗体（例えば、特許文献１参照）等が提案されている。
【０００６】
このように、抗体を用いる免疫学的測定法では、交差反応性が低く、測定対象物に対し高特異性という抗体本来の性質を利用し、特定の物質を測定することに重点が置かれて来た。
このような考えに基づき、多数の異性体が存在するＰＣＢにおいては、交差反応性が制御された特異性の高い抗ＰＣＢ抗体が求められており、例えば、コプラナーＰＣＢの一つである３，３’，５，５’−四塩化ビフェニル（ＰＣＢ８０）に対して特異性を持つ抗体（例えば、特許文献２参照）等が提案されている。
【０００７】
一方、ＰＣＢ分析では、ダイオキシン類分析における「毒性等量」という考え方が無いため、免疫測定法においても、多数のＰＣＢ同族体について可能な限り広く検出し、測定できることが重要である。しかしながら、特異性の高い単一の抗体を利用した測定系においては、同族体を網羅することが難しく、公定法による分析値との乖離、フォールスネガティブ（偽陰性の判定や見落とし）の危険性、更に再現性の低さ等が懸念される。
【０００８】
そこで、２種類の特異性の異なる抗体、あるいは測定系を混合し、その結果得られる抗体の特異性を利用して絶縁油中のＰＣＢ濃度を分析する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ダイオキシン類、ＰＣＢ類を検出する低分子物質検出用器具において、毒性を推定する場合と総量を推定する場合に応じて標的物質の異性体を選択し、該標的物質の抗体を用いることが開示されている（例えば、特許文献３参照）。
他方、異性体間において交差反応性が認められる複数種類の抗体を用いて、ダイオキシン類を異性体レベルで検出する方法が提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【０００９】
しかしながら、特許文献３及び４に記載された抗ＰＣＢ抗体を用いた免疫学的測定方法における測定対象は、コプラナーＰＣＢであり、そこで用いられる抗体は、異なる塩素数群の同族体混合物（例えば、鐘淵化学工業製のカネクロール、及び三菱モンサント（現三菱化学）製のアロクロールなどに由来するＰＣＢ）を、高感度に定量するための抗体としては満足なものではない。
【００１０】
また、ビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いて製造された、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体が提案されている（例えば、特許文献５参照）。しかしながら、この提案の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、蛍光による標識への適合性は高いものの、金コロイドによる標識への適合性は、十分満足のいくものではないという問題がある。
前記蛍光による標識は測定のコストが高く、ＰＣＢ分析を低コストで行なうためには、蛍光による標識よりも低コストである金コロイドによる標識への適合性が高い抗ＰＣＢモノクローナル抗体の開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−１９１６９９号公報
【特許文献２】特開２００５−２４７８２２号公報
【特許文献３】特開２００４−１３８５５０号公報
【特許文献４】特開２００２−２２８６６０号公報
【特許文献５】特開２００８−１３７９０２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｏｌｌｕｔａｎｔ ａｎｄ ＰＯＰｓ，２００５，ＩＤ２３８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、３塩化ビフェニル、４塩化ビフェニル、５塩化ビフェニル、６塩化ビフェニル、及び７塩化ビフェニル等の塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するため、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとし、該ハプテンをキャリアータンパク質に結合した化合物を免疫原として免疫に用いることにより、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【化１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【００１５】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化２】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
＜２＞ 下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程と、
前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程と、
前記ハイブリドーマを培養する工程とを含む前記＜１＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化３】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜３＞ 下記構造式（２）中、Ｚが、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、及び金原子クラスターのいずれかの標識物質により標識されている前記＜２＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化５】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜４＞ 下記構造式（１）、及び下記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法である。
【化６】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化７】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜６＞ １塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、１塩素化ＰＣＢ〜２塩素化ＰＣＢ同族体、及び８塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性よりも、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高い前記＜５＞に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体である。
＜７＞ 前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマである。
＜８＞ 受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３である前記＜７＞に記載のハイブリドーマである。
＜９＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
＜１０＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、下記構造式（１）、及び下記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
【化８】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化９】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜１１＞ 被測定試料に、前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、下記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法である。
【化１０】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
＜１２＞ 抗ＰＣＢモノクローナル抗体が、金コロイドにより標識されている前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載のＰＣＢ測定方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、３塩化ビフェニル、４塩化ビフェニル、５塩化ビフェニル、６塩化ビフェニル、及び７塩化ビフェニル等の塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、かつ親和性が高く、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れた抗ＰＣＢモノクローナル抗体、及びその製造方法、前記抗体を産生するハイブリドーマ、並びに前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、各アロクロールのＰＣＢ同族体組成を示す図である（出典：廃棄物処理法新処理基準に基づくＰＣＢ処理技術ガイドブック、編集：財団法人産業廃棄物処理事業振興財団、発行：株式会社ぎょうせい、平成１７年８月１日刊）。
【図２】図２は、試験例２における金コロイド標識された各抗体の吸光度を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例３における各金コロイド標識抗体のＰＣＢに対する感度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法＞
−構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物（ハプテン）−
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物（下記構造式（１）で表される化合物）からなるハプテンを用い、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造される。
【化１１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【００１９】
なお、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物における異性体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、三塩素化ビフェニルから六塩素化ビフェニル等を主体とするもの、等が挙げられる。これらの中でも、四塩素化ビフェニル、五塩素化ビフェニルが、絶縁油中のＰＣＢを測定対象とする場合に有利である。
【００２０】
前記ビフェニル誘導体の異性体混合物におけるこれらの異性体の混合割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記ビフェニル誘導体の異性体混合物を後述のようにして製造する場合、５−フェニルエーテルに対する塩素化剤の添加量及び塩素原子の配向性の点から、下記化合物１Ａ、化合物１Ｂ、化合物１Ｃが主要異性体となると考えられる。
【化１２】
【００２１】
前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の反応式に従い製造することができる。
以下の反応式では、３−フェニルフェノールを出発原料とし、まず、６−ブロモヘキサン酸エチルエステルと反応させ、次いで、塩素化、加水分解を行なうことにより、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体を製造している。
【化１３】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｅｔは、エチル基を表し、Ｐｈは、フェニル基を表す。
【００２２】
−構造式（２）で表される化合物−
前記構造式（１）で表される化合物は、単独では抗原性を持たないため、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製するために、下記構造式（２）で表される化合物（下記構造式（２）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物、以下、「コンジュゲート」と称することがある）を調製し、これを免疫原（抗原）として用い、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を作製することが好ましい。
【化１４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００２３】
前記構造式（２）中、Ｚで表されるタンパク質（以下、「キャリアータンパク質」と称することがある）としては、免疫原性を有し、かつ前記構造式（１）で表される化合物とスペーサー部（−Ｏ−（ＣＨ２）５−ＣＯＮＨ−）を介して連結可能である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、ミオグロビン、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）、等が挙げられる。これらの中でも、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイ由来ヘモシアニン（ＫＬＨ）が好ましい。
【００２４】
前記構造式（２）で表される化合物（コンジュゲート）の調製方法としては、特に制限はなく、公知の合成方法により調製することができ、例えば、下記反応式に示すように、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの縮合反応により活性エステル誘導体に変換し、次いで、該活性エステル誘導体とキャリアータンパク質のアミノ基とを常法に従って結合させる方法などが挙げられる。
【化１５】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００２５】
得られた前記構造式（２）で表される化合物（コンジュゲート）は、ゲルクロマトグラフィー等の公知の方法により、反応液を生理的リン酸緩衝液などの中性溶液に置換すると共に精製することが好ましい。
【００２６】
前記構造式（２）中、Ｚで表されるタンパク質は、標識物質により標識されていてもよい。前記標識物質としては、特に制限はなく、公知の標識物質から適宜選択することができ、例えば、酵素、蛍光色素、放射性同位元素、磁性体、色素封入ポリマー、希土類、補酵素、金コロイド、金原子クラスター、等が挙げられる。
【００２７】
−抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造−
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程（以下、「免疫工程」と称することがある）と、前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程（以下、「抗体産生細胞回収工程」と称することがある）と、前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程（以下、「ハイブリドーマ取得工程」と称することがある）と、前記ハイブリドーマを培養する工程（以下、「培養工程」と称することがある）とを含む製造方法により製造される。
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法は、更に、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程（以下、「スクリーニング工程」と称することがある）を含むことが好ましい。
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば、ケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ， Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−７（１９７５））等に準じて行うことが出来る。
【００２８】
−−免疫工程−−
前記免疫工程は、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた前記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程である。
【００２９】
免疫する前記動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、等の哺乳動物が好ましい。
前記動物の免疫方法としては、特に制限はなく、公知の方法から適宜選択することができ、例えば、前記免疫原とアジュバントとを乳化させて得た乳化液を、皮下、静脈内、腹腔内に、注射等により投与する方法などが挙げられる。
前記免疫原の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、マウスの場合、０．０１ｇ／匹〜０．５ｇ／匹を、２週間〜３週間程度の間隔で３回〜１５回投与することが好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、フロイントの完全アジュバント、不完全アジュバント、ＢＣＧ、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、ミョウバンアジュバント、シリカアジュバント等が挙げられ、抗体の誘導能、動物への負荷等の関係から、最適なものを選択して使用することが好ましい。
【００３０】
−−抗体産生細胞回収工程−−
前記抗体産生細胞回収工程は、前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程である。
【００３１】
前記抗体産生細胞回収工程は、例えば、前記免疫原の最後の投与から数日後に、免疫した前記動物から抗体産生細胞を回収することにより行なわれる。
前記抗体産生細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脾臓、リンパ節由来Ｂ細胞、等が挙げられる。
【００３２】
−−ハイブリドーマ取得工程−−
前記ハイブリドーマ取得工程は、前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程である。
前記抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合し、その後所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングすることにより、前記ハイブリドーマが得られる。
【００３３】
前記ミエローマ細胞としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができる。例えば、マウス、ラット、ヒト由来の細胞株等から選択することができ、マウス由来細胞であれば、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７、Ｓ１９４／５ＸＸＯ・Ｂｕｌ等、ラット由来細胞であれば、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ・１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０等が挙げられる。
【００３４】
前記抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法、等が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコール法が、細胞毒性も比較的少なく、融合操作も簡単であるという点で、好ましい。
【００３５】
前記所望の抗体を産生する融合細胞をスクリーニングする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、等が挙げられる。
【００３６】
前記スクリーニング方法では、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いることが好ましい。
例えば、前記構造式（２）で表されるコンジュゲートを固相化し、前記融合細胞（ハイブリドーマ）の培養上清を反応させることにより、該培養上清の抗体価を測定し、抗体価が高いウエルを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルとして選択することができる。更に、抗体価測定時にＰＣＢ代替化合物（例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体）やＰＣＢｓ等を共存させることにより、これら共存物質に対し反応性の高いウエルを選択し、限界希釈法にて目的の抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのモノクローン化を行うことができる。
また、前記構造式（２）で表されるコンジュゲート中、Ｚで表されるタンパク質を標識物質により標識し、これを抗ＰＣＢ抗体産生ウエルの抗体価の測定時に共存させ、直接競合反応を行う方法によって抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。
【００３７】
前記抗ＰＣＢ抗体の測定対象であるＰＣＢは水に難溶であるため、両親媒性溶媒に溶解させて測定に供せられる。このため、前記抗ＰＣＢ抗体は、試料中に存在する前記両親媒性溶媒に対する耐性を有することが好ましい。よって、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングも前記両親媒性溶媒存在下で行うことが好ましい。
前記両親媒性溶液としては、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、等が挙げられる。
前記スクリーニングに用いられる前記両親媒性溶液の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０質量％以下が好ましく、３０質量％以下がより好ましく、５質量％〜２０質量％が特に好ましい。
【００３８】
前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに用いられるセンサとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーのセンサ官能部へ、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体、又は前記構造式（２）で表されるビフェニル誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲートを固定化したもの、等が挙げられる。
また、予め前記融合細胞の培養上清にＰＣＢ等を添加して反応させたものを、前記センサ官能部に接触させてスクリーニングを行うこともできる。この場合、前記官能部に結合した抗体量を評価することにより、種々のトランスデューサーでのＰＣＢ測定への適用が可能な、高親和性を有する抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマを選抜することができる。
【００３９】
＜ハイブリドーマ＞
前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマとしては、ＰＣＢを認識する本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記の方法により作製され、樹立されたものが好ましく、具体的には、後述する実施例に示すような、ＯＤ８Ｂ１１株が挙げられる。
前記ＯＤ８Ｂ１１株は、下記構造式（２）に示す化合物を用いて作製されたハイブリドーマであり、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成２１年８月６日付で、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３として寄託されている。
【化１６】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【００４０】
−−培養工程−−
前記培養工程は、前記ハイブリドーマを培養する工程である。
前記培養工程により、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４１】
前記培養工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株を、予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与したマウスの腹腔内に移植して培養する方法が挙げられる。
前記マウスの腹腔内に移植して１０日後〜１４日後に、抗ＰＣＢモノクローナル抗体を含む腹水を回収し、得られた腹水から前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４２】
また、前記ハイブリドーマを、培地（例えば、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ等）を用いて培養し、得られた培養液の上清を、抗ＰＣＢモノクローナル抗体溶液とすることができる。
【００４３】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、精製されていることが好ましい。
前記腹水、又はウシ胎児血清含有培地より得た前記抗ＰＣＢ抗体産生ハイブリドーマ細胞株培養液上清から、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法から適宜選択することができ、例えば、限外ろ過、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、等により精製することができる。
【００４４】
＜抗ＰＣＢモノクローナル抗体の評価＞
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、前記本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有する。また、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高いことが好ましい。
前記３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体の存在比が高いものの例としては、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製）、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）が挙げられる。
また、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性が高い（後述する試験例２参照）ことから、低コストでＰＣＢを測定することができる。
【００４５】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する親和性は、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とＰＣＢとの結合を５０％阻害する抗原濃度（ＩＣ５０値）により評価することができる。また、前記ＰＣＢモノクローナル抗体の交差反応性は、例えば、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体について、それぞれのＩＣ５０値を求め、それらの比を求めることにより評価することができる。
【００４６】
前記ＩＣ５０値の算出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光光度計、又は相対吸光度測定器による測定データを、下記式（１）で表される近似式に当てはめて求めることにより解析することができる。
【数１】
前記式（１）中、ｙは、抗原を加えなかったときの蛍光強度、又は相対吸光度の値を１００％としたときの相対的な蛍光強度、又は吸光度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００４７】
測定データは、抗原を加えなかったときの蛍光強度、又は吸光度の値を１００％として相対値に変換した後、グラフ作成ソフトウェア（例えば、Ｏｒｉｇｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ製）等）を用いて最適なＰ１及びＰ２を決定する。
このようにして得られた近似式を、前記抗体と前記抗原との結合曲線とし、ｙ＝５０％となるときのｘの値(＝Ｐ１)をＩＣ５０値とする。
なお、ＩＣ５０値に対して抗体濃度が十分に小さい時（例えば、１０分の１以下の時）、ＩＣ５０値と平衡解離定数（Ｋｄ）がほぼ一致することが知られている。
【００４８】
また、前記ＩＣ５０値の算出方法としては、蛍光光度計、又は相対吸光度測定器による測定データを、下記式（７）で表される式に当てはめて相対的な応答（％）を求めることにより解析することもできる。前記相対的な応答が５０％となるときの値をＩＣ５０値とする。
【数２】
ただし、前記式（７）中、ＲＧは、相対的な応答（％）を示し、ＩＣＺは、抗原を加えなかった場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＣＭは、抗原を加えなかった場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＺは、抗原を加えた場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＭは、抗原を加えた場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示す。
【００４９】
前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体の塩素数の異なるＰＣＢに対する特異性は、例えば、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）やアロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）等を被測定試料として用い、評価することができる。
【００５０】
前記カネクロール、及びアロクロールは、それぞれ下記表１及び図１に示す比率で異なる塩素数のＰＣＢを含有しているが、例えば、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１塩素化〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、３塩素化〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、中でも、Ａｒ−１２２１を除く、その他のカネクロール及びアロクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、及びＡｒ−１２３２）に対して高い特異性を示す。
【００５１】
【表１】
（出典：高菅卓三ら、「各種クリーンアップ法とＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを用いたポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢｓ）の全異性体詳細分析方法」，環境化学，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．３，ｐｐ.６４７−６７５，１９９５）
【００５２】
（ＰＣＢ測定方法）
本発明のＰＣＢ測定方法は、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いる方法であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用い、試料中のＰＣＢを免疫学的に検出、定量する方法、具体的には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、免疫クロマトグラフィー、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス免疫比濁法（ＬＴＩＡ）、結合平衡除外法等が挙げられる。
【００５３】
前記ＰＣＢ測定方法としては、例えば、非競合法、競合法（間接競合法あるいは直接競合法）、結合平衡除外法等が挙げられ、具体的には、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の方法等が挙げられる。
（Ｉ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
（ＩＩ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、前記構造式（１）、及び前記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
（ＩＩＩ）前記被測定試料に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、前記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むＰＣＢ測定方法。
【００５４】
以下、前記間接競合法、及び前記結合平衡除外法の一例をより具体的に説明する。
前記間接競合法及び前記結合平衡除外法において、担体に固定化する抗原（以下、「固定化抗原」と称することがある）としては、例えば、前記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体を含む化合物、及び前記構造式（２）で表される化合物、等が挙げられる。
前記間接競合法、及び前記結合平衡除外法は、前記固定化抗原を前記担体上に固定化し、前記担体の前記固定化抗原が結合していない部分をブロッキング剤でブロッキングする。次いで、該担体に被測定試料と前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体とを加え、前記固定化抗原と前記被測定試料中のＰＣＢとを前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体に対して前記間接競合法においては競合反応させ、前記結合平衡除外法においては結合平衡除外化反応させる。
前記固定化担体と結合しなかった前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を洗浄除去した後、二次抗体として標識した抗体を加え、前記固定化抗原と結合した抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合させ、洗浄を行った後、前記標識の発色又は発光を測定する。また、二次抗体を使用せず、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を直接標識して用いてもよい。得られた吸光度や光強度について、試料を添加しない場合の値に対する減少率を求め、これを阻害率とし、既知の濃度のＰＣＢを添加したときの阻害率からあらかじめ求めておいた検量線を用い、前記試料中のＰＣＢ濃度を算出することができる。
【００５５】
また、前記担体としては、前記固定化抗原の構造の一部と同一、又は類似する構造を分子中に有する担体を用いてもよい。前記固定化抗原の構造の一部と同一、又は類似する構造を分子中に有する担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００７−２０６０６２号公報に記載の担体、などが挙げられる。
【００５６】
前記標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質に過酸化水素、発色剤にｏ−フェニレンジアミンやテトラメチルベンジジンを使用する場合、及び、酵素としてアルカリフォスファターゼを用い、基質にｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する場合には、発色を吸光度で測定することができる。一方、基質の反応生成物が蛍光である場合や、蛍光物質を用いて標識されている場合には、蛍光光度計等を用いて蛍光を測定することができる。
また、化学発光物質を用いる場合には、発光を化学発光測定器等により測定することができ、金コロイドを用いる場合には、透過光度等を透過光量測定器等により測定することができる。
【００５７】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性に優れ、低コストでＰＣＢを測定することができる点で、前記標識として金コロイドを用いることが好ましい。
前記金コロイドによる標識の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年）に記載の方法により行うことができる。
前記透過光量測定器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、特開２００６−２１５０１３号公報に記載の相対吸光度測定器が好ましい。
【００５８】
前記被測定試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質中のＰＣＢを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やアルコール系溶媒等の極性溶媒で液−液抽出してなる試料、前記被験物質中のＰＣＢを極性溶媒で液−液抽出し、抽出された前記ＰＣＢを含む前記極性溶媒を吸着剤で固相抽出し、前記吸着剤に吸着した成分を所望の溶媒に転溶させてなる試料、前記被験物質にノルマルヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の低極性溶媒を加え、前記被験物質中のＰＣＢを親水性溶媒で抽出してなる試料、などが挙げられる。
前記液−液抽出において、前記被験物質と前記極性溶媒との混合比（質量比）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（前記被験物質）：（前記極性溶媒）＝１：１〜：１：１０が好ましい。
【００５９】
前記被験物質としては、少なくともＰＣＢを含む可能性がある物質（ＰＣＢ汚染物）であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、絶縁油、絶縁油以外の油（例えば、植物油、動物油、合成油、鉱物油等）、工場排水、土壌、排ガス、動物の血液や体液、絶縁油の処理作業等において使用した部材等の廃棄物などが挙げられる。これらの中でも、絶縁油が好適に挙げられる。
前記絶縁油としては、脱塩素化処理等のＰＣＢ分解処理を行った後の絶縁油も好適に挙げられる。
【００６０】
前記被測定試料中の極性溶媒の濃度としては、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＰＣＢに対する前記親和性が著しく劣化しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１質量％〜２０質量％が好ましく、１０質量％〜２０質量％がより好ましい。
【００６１】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、カネクロールやアロクロールに含まれる複数の塩素が置換されたＰＣＢに対し親和性を有し、更に、金コロイドによる標識への適合性に優れるため、環境試料中、工業製品中、生物試料中に含まれるＰＣＢを低コストで、迅速かつ再現性良く分析することが可能となり、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、ＰＣＢｓの迅速なモニタリングや分析技術として好適である。
また、ＳＰＲ（表面プラズモン）センサ、ＱＣＭ（水晶振動子）センサ、光学的センサ、電気化学的センサ等のトランスデューサーを使用した系において、センサ官能部へ、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、又は前記ビフェニル誘導体等を固定化して、免疫センサとして使用することができる。
更に、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を固定化した担体は、ＰＣＢの効率的濃縮や除去に適用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変及び修飾を含むものとする。
【００６３】
（実施例１：抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造）
（１）ビフェニル誘導体の異性体混合物、及びコンジュゲートの調製
下記反応式に従い、３−フェニルフェノールに、スペーサー分子を導入したハプテンとしてのビフェニル誘導体（下記反応式中、化合物３）を調製し、更に、キャリアータンパク質と結合させてなるコンジュゲート（下記反応式中、化合物５）を合成した。
【化１７】
ただし、前記反応式中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、又はＫＬＨ（スカシガイ由来ヘモシアニン）を表す。
【００６４】
３−フェニルフェノール５．０ｇ（２９．４ｍｍｏｌ）をアセトン７０ｍＬに溶解させ、炭酸カリウム８．１１ｇ（５８．８ｍｍｏｌ）、次いで６−ブロモヘキサン酸エチルエステル７．８７ｇ（３５．３ｍｍｏｌ）を加え６０℃に加温し４８時間撹拌した。反応後、室温まで放冷した後、不溶物を濾別し、濾液から溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２０で溶出）し、前記反応式中の化合物１を８．５５ｇ得た。
【００６５】
前記化合物１ １．００ｇ（５．８８ｍｍｏｌ）に、塩化スルフリル１０ｍＬとジフェニルスルヒド（触媒）５０ｍｇとを加え、室温で２０時間、５０℃で２０時間、７０℃で１０時間撹拌した。室温まで放冷した後、溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２０で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物２を１．０２ｇ得た。
【００６６】
前記化合物２ １．０２ｇを、テトラヒドロフラン４ｍＬに溶解させ、水酸化カリウム０．５ｇを４ｍＬの蒸留水に溶解した水溶液を加え、室温で５０時間撹拌した。反応後、溶媒を減圧下で留去した。残渣を蒸留水に溶解させ、濃塩酸でその水溶液を酸性にし、析出した固体を濾集した。この固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：ヘキサン＝１：２で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物３を０．７２ｇ得た。
【００６７】
前記化合物３ ０．７２ｇ、及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド０．２９１ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を無水ジメトキシエタン１２ｍＬに溶解した。この反応液に氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド０．５２１ｇ（２．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温に昇温し、２４時間撹拌した。反応液を濾過した後、濾液から溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製（酢酸エチル：四塩化炭素＝１：５で溶出）し、塩素化異性体混合物として前記反応式中の化合物４を０．６０ｇ得た。
【００６８】
前記化合物４ ０．６０ｇを、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＢＳＡ溶液、又はＫＬＨ溶液に氷冷撹拌下に滴下し、室温にて一晩撹拌した。反応液をＰＢＳ(−)で平衡化したセファデックスカラムに添加し、同緩衝液で展開して、キャリアータンパク質を分離し、コンジュゲート（前記反応式中の化合物５）を精製した。
【００６９】
（２）マウスの免疫
得られたコンジュゲートを免疫原として、マウスを免疫した。
前記化合物５と、アジュバントとしてＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）とを１：１容量に混合して十分に乳化させ、得られた乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢〜８週齢、雌）の腹腔内に２００μＬ投与することによりマウスを免疫感作した。
追加免疫は、約２週間〜３週間間隔で行い、追加免疫から１週間経過後に尾静脈より採血し、ＥＬＩＳＡ法により血中抗体価を測定して抗体価の推移を観察した。
【００７０】
（３）ハイブリドーマの作製
血中に免疫原に対する高い抗体産生が認められたマウス尾静脈内に、さらに免疫原を投与して最終免疫を行った。最終免疫から３日後に、免疫した前記マウスより脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製し、対数増殖期にあるミエローマ細胞（ＮＳ０）と脾臓細胞を１：５になるように混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を行った。融合後の細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）添加の２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、脾臓細胞数で１×１０５細胞／ウエル〜２×１０５細胞／ウエルになるように９６ウエル培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【００７１】
（４）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング及びクローニング
細胞融合より７日後〜１０日後に、クローンの増殖が見られたウエルの培養上清を用い、以下の方法により抗体価を測定し、スクリーニング、及びクローニングを行なった。
【００７２】
−抗原ビーズの作製−
アガロースビーズ（ファルマシア社製）に、ジクロロフェノール誘導体とＢＳＡ（牛血清アルブミン）との複合体（抗原複合体：下記化合物Ｘ）を固定化した。具体的には、約１ｍＬのアガロースビーズに約０．１ｍｇの抗原複合体を固定化した後、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液を１ｍＬ用いてビーズ表面をブロッキングした。
【化１８】
ただし、前記化合物Ｘ中、「Ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＢＳＡを表す。
【００７３】
−スクリーニング、及びクローニング−
蛍光光度計として、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにしてスクリーニング、及びクローニングを行なった。
まず、９６ウエルプレートの各区画から９０μＬずつ培養上清を回収し、１列（１２ウエル）分を１本のサンプリングチューブにまとめた。更に、前記サンプリングチューブから２００μＬずつ、１プレート（８列）分を１本のサンプリングチューブにまとめた。
スクリーニングは、まず始めにプレートごとにまとめた培養上清について行い、陽性のプレートに対しては、引き続き列ごとのスクリーニングを行った。
具体的なスクリーニング方法は、以下の通りである。
前記培養上清を０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。前記２次抗体には蛍光物質（Ｃｙ５）が結合しており、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度から培養上清中の目的抗体の有無を判断（蛍光強度が、１Ｖ以上であれば目的抗体あり、１Ｖ未満であれば目的抗体なし）した。
【００７４】
前記蛍光強度の判断により、目的抗体が有ると判断した列の培養上清を２本の試験管に分け、１本には終濃度２％になるようＤＭＳＯを加え（コントロール）、他の１本には４種類のＰＣＢ等量混合液（カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：ＧＬサイエンス社製））を終濃度１００ｐｐｂになるように加えた。そして、前記コントロールの蛍光強度（Ｂ０）に対する、前記４種類のＰＣＢ等量混合液の蛍光強度（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列を選抜した。
前記蛍光強度の測定は、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにして行なった。
前記コントロール、及び前記４種類のＰＣＢ等量混合液それぞれについて、０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。そして、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を測定した。
【００７５】
更に、前記ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列に対して、ＰＣＢに対する結合活性が高い抗体を産生する列を選抜した翌日に改めて区画（ウエル）ごとに培養上清を回収し、陽性区画（ウエル）を決定し、前記陽性区画で増殖しているハイブリドーマをメチルセルロース培地によるコロニー形成法によってクローニングした。
【００７６】
（５）塩素数の異なるＰＣＢ同族体に同等に反応する抗体産生クローンの選抜
前記（４）にて選抜したハイブリドーマのうち、１回以上クローニングを実施したハイブリドーマを、更に蛍光光度計（ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製））を用い、以下のようにして選抜を行った。
拡大培養したクローンの培養上清を０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで適宜希釈して、シグナル（蛍光強度）が２Ｖになるようにし、これを５本に分け、１本にはＤＭＳＯを終濃度２％となるように加え（コントロール）、残りの４本にはそれぞれＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００を終濃度１０ｐｐｂとなるように加えた。
そして、前記コントロールの蛍光強度（Ｂ０）に対する、各ＰＣＢ含有液の蛍光強度（Ｂ）の割合（Ｂ／Ｂ０）を算出し、各ＰＣＢに対し共通に高い親和性を示す抗体産生クローンを取得した。
前記蛍光強度の測定は、ＫｉｎＥｘＡ３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）を用い、以下のようにして行なった。
前記コントロール、及び各ＰＣＢ含有液それぞれについて、０．２５ｍＬ／分の流速で１２０秒間（計０．５ｍＬ）、前記抗原ビーズに作用させた。次いで、前記抗原ビーズを０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、その後、２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｎＭを０．２５ｍＬ／分の流速で９６秒間（計０．４ｍＬ）作用させた。最後に、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳによる前記抗原ビーズの洗浄を０．２５ｍＬ／分の流速で３０秒間、次いで、１．５ｍＬ／分の流速で９０秒間行った。そして、洗浄後の抗原ビーズ上に残った蛍光の強度を測定した。
【００７７】
以上の方法により、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体に親和性を有する抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生する安定なハイブリドーマが得られ、これをＯＤ８Ｂ１１株とした。前記ＯＤ８Ｂ１１株細胞は、メチルセルロース培地を用いて単一の細胞に由来するコロニーを形成させた後、該コロニーを液体培地（２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ、ＧＩＢＣＯ社）に移し、培養を続けた。なお、このハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１株は、平成２１年８月６日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３を取得している。
【００７８】
（６）抗ＰＣＢモノクローナル抗体の作製
前記（５）で樹立したハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１株のコロニーを、２４ウエルプレート上の２０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地を基本とするＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）培地に移し２日間培養した後、培養液の一部を１０ｍＬの前記ＨＴ培地を入れた４０ｍＬの角型フラスコに移し、コンフルエントに達する直前まで培養し、ＯＤ８Ｂ１１株によって分泌された抗体を培養上清からプロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「ＯＤ８Ｂ１１抗体」という）を得た。
【００７９】
（７）モノクローナル抗体の大量調製と精製
８週齢を超えるＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ、プリスタン［２，６，１０，１４−テロラメチルペンタデカン］（和光純薬社製）を０．５ｍＬ投与し、２週間〜３週間飼育した。
予め対数増殖期に維持しておいた抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１の培養液を回収し、遠心分離にて培養上清を除いたのち、ＦＢＳ不含のＲＰＭＩ１６４０にて沈査を１×１０６細胞／０．５ｍＬになるよう細胞液を調製した。
この細胞液をプリスタン前投与のＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内に移植し、１０日後〜１４日後に腹腔内に漏出した腹水を腹部より２５Ｇのシリンジを装着した注射器で回収した。
採取した腹水をポアサイズ０．２２μｍ径のフィルターを用いてろ過後、得られたろ液をプロテインＧ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｎｓｉｅｎｓ社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＯＤ８Ｂ１１抗体）を得た。
【００８０】
（８）アイソタイプ分析
固相化抗原として、下記構造式（２）で表される化合物を用い、マウスタイパーキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のアイソタイプ分析を行なった。
【化１９】
この結果、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＯＤ８Ｂ１１によって生産された前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体のＨ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。
【００８１】
（比較例１）
特開２００８−１３７９０２号公報に記載の樹立されたハイブリドーマＷＲ３Ｆ６株（平成１８年１０月２６日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ Ｐ−２１０７３を取得）から産生された抗ＰＣＢモノクローナル抗体（以下、「ＷＲ３Ｆ６抗体」という）について、前記ＯＤ８Ｂ１１抗体と同様に、モノクローナル抗体の大量調製と精製を行った。
【００８２】
（試験例１：ＯＤ８Ｂ１１抗体の各ＰＣＢに対する感度特性）
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体（抗ＰＣＢモノクローナル抗体）を用い、カネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）、アロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１：和光純薬社製）に対する親和性、交差反応性を、以下のようにして評価した。
【００８３】
−抗体結合用担体の作製−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基が導入されたアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、前記化合物Ｘ（ジクロロフェノール誘導体とキャリアータンパク質とのコンジュゲート）を共有結合にて結合させ、ＢＳＡ溶液でブロッキングを行い、抗体結合用担体とした。
【００８４】
−蛍光強度の測定−
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体それぞれについて、抗体濃度を終濃度０．５ｎＭとし、それぞれを終濃度０．０５ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬになるように調製したカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００）、アロクロール（Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）の溶液と反応させた後、前記抗体結合用担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
その後、蛍光物質Ｃｙ５（登録商標）で標識された２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体、ＩｍｍｕｎｏＲｅｓａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を前記抗体結合用担体へ流速０．２５ｍＬ／分で作用させた。
次いで、５％ＤＭＳＯ、０．１ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有ＰＢＳ(−)を流速０．２５ｍＬ／分で通過させ、担体への非特異的結合を排除した後、蛍光強度を測定した。
【００８５】
−ＩＣ５０値の算出−
前記測定した蛍光強度を下記式（１）の近似式に当てはめ、ＩＣ５０値（ｙ＝５０％となるときのｘの値）を算出した。結果を表２に示す。
【数３】
前記式（１）中、ｙは、試料中に抗原（ＰＣＢ）を加えなかったときの蛍光強度の値を１００％とした時の相対的な蛍光強度を表し、ｘは、抗原濃度を表し、Ｐ１とＰ２は、近似のパラメータを表す。
【００８６】
−交差反応率−
前記交差反応率は、下記式（２）〜（５）により算出した。結果を表２に示す。
−ＯＤ８Ｂ１１抗体−
・抗原が、カネクロールの場合
ＯＤ８Ｂ１１抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＫＣ−４００の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（２）
ＷＲ３Ｆ６抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＫＣ−４００の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（３）
・抗原が、アロクロールの場合
ＯＤ８Ｂ１１抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＡｒ１２５４の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（４）
ＷＲ３Ｆ６抗体の交差反応率（％）＝｛（抗原がＡｒ１２５４の場合のＩＣ５０値）／（試料のＩＣ５０値）｝×１００ ・・・ 式（５）
【００８７】
【表２】
【００８８】
前記表２の結果から、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）において、ＷＲ３Ｆ６抗体とほぼ同等の交差反応率を有していることがわかった。
また、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、３〜７塩素化ＰＣＢ同族体（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００、Ａｒ−１２４２、Ａｒ−１２４８、Ａｒ−１２５４、Ａｒ−１２６０、Ａｒ−１２３２、Ａｒ−１２２１）に対して、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも高い親和性を有し、高い検出感度を示すことがわかった。
【００８９】
（試験例２：ＯＤ８Ｂ１１抗体の金コロイド標識適合性）
前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体を用い、金コロイド標識適合性を、以下のようにして評価した。
【００９０】
−金コロイド溶液の調製−
一般的なクエン酸法（横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年））に従って金コロイド溶液を調製した。
詳しくは、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物（和光純薬工業社製）を超純水で希釈し、０．０１％の濃度に調整した。次に、その溶液を沸騰させ、０．１％に希釈したクエン酸ナトリウム１．５ｍＬを添加し、更に１０分間沸騰させた。その後、溶液を冷却し、金コロイド溶液を得た。
【００９１】
−抗体の標識−
横田貞記 著「イムノゴールド法 コロイド金による免疫組織化学」鍬谷書店（１９９２年）を参考に、前記実施例１のＯＤ８Ｂ１１抗体、及び前記比較例１のＷＲ３Ｆ６抗体を標識した。
詳しくは、調製した前記金コロイド溶液を２０℃に保ち、炭酸カリウム（２００ｍＭ）を用いてｐＨを９．１５に調製した。次に、前記抗体を０．６ｍｇ添加し、２分間反応させた。次に、１０％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）溶液を１０ｍＬ添加し、ブロッキングを行った。最後に、２５分間、２５℃、９，０００ｒｐｍの条件で遠心し、１０ｍＬの沈殿物を回収し、金コロイド標識抗体を得た。
【００９２】
−測定方法−
大村直也 他「生体機能を利用したセンシング（その７）」電力中央研究所報告Ｖ０８０５３（２００９年）に記載のＰＣＢバイオセンサー法に基づき、以下のようにして測定を行った。
【００９３】
−−抗体溶液の調製−−
前記金コロイド標識抗体を含有する抗体溶液を、１％（ｗ／ｗ）牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で適宜希釈した。
ＤＭＳＯ溶液に、前記抗体溶液と、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液とを最終的にＤＭＳＯ濃度が２％となるように添加した。なお、前記添加された溶液における金コロイド標識抗体の濃度は、ＯＤ８Ｂ１１抗体では、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭとなるように調製し、ＷＲ３Ｆ６抗体では、７００ｐＭ、５６０ｐＭ、４２０ｐＭ、２８０ｐＭ、１４０ｐＭとなるように調製した。
【００９４】
−−測定装置−−
測定装置として、特開２００６−２１５０１３号公報の実験例２に記載の相対吸光度測定器、及び測定用セルを使用した。
前記測定用セルに収容される乱反射媒体として、特開２００７−２０６０６２号公報の段落〔００７８〕〜〔００７９〕に記載のセルロース（免疫反応測定用担体）を用いた。
【００９５】
−−測定−−
先ず、前記乱反射媒体を収容した前記測定用セルを、前記相対吸光度測定器のセルホルダに固定し、発光部から光を照射して、透過光の光量Ｌ２（送液前の透過光量）を測定した。
【００９６】
その後、同じ検出セルに前記調製した抗体溶液４ｍＬを流速８．５ｍＬ／分で送液した。続いて、１ｍＬのＰＢＳ−ＢＳＡを流速８．５ｍＬ／分で送液し、測定セルを洗浄した。その後、測定セルを７，０００ｒｐｍで５分間遠心し、水切りをした後、３０分間風乾した。
前記風乾した測定セルを再び前記相対吸光度測定器のセルホルダに固定し、発光部から光を照射して、透過光の光量Ｌ１（送液後の透過光量）を測定した。
ランベルト・ベールの法則に基づき、前記Ｌ１、及び前記Ｌ２を下記式（６）に当てはめることにより、吸光度Ａを算出した。結果を図２に示す。
Ａ ＝ −ｌｏｇ（Ｌ１／Ｌ２） ・・・式（６）
【００９７】
図２中、横軸は、抗体濃度（ｎＭ）、縦軸は、吸光度を示す。また、図２中、線形は、最小二乗法から求めた一次関数であり、Ｒ２は、相関係数を示す。
図２の結果から、同じ抗体濃度において、ＯＤ８Ｂ１１抗体の方が、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも吸光度が高いことがわかった。これにより、ＯＤ８Ｂ１１抗体の方が、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも金コロイド標識に適合していることがわかった。
【００９８】
（試験例３：金コロイド標識抗体によるＰＣＢに対する感度）
試験例２において、以下の金コロイド標識抗体の濃度、ＰＣＢとし、抗原抗体反応を行なった以外は、試験例２と同様にして、金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体、及びＷＲ３Ｆ６抗体のＰＣＢに対する感度を試験した。
【００９９】
−金コロイド標識抗体含有溶液の調製−
金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体、及びＷＲ３Ｆ６抗体が、同じ吸光度を示すように、抗原抗体反応を行う際の溶液における金コロイド標識したＯＤ８Ｂ１１抗体の濃度は、５００ｐＭとし、金コロイド標識したＷＲ３Ｆ６抗体の濃度は、５６０ｐＭとした。
【０１００】
−ＰＣＢ含有溶液の調製−
前記ＰＣＢ含有溶液として、ＤＭＳＯ溶液にＰＣＢ（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００を等量混合したもの）を添加し、ＰＣＢ含有溶液とした。
なお、抗原抗体反応を行う際の溶液におけるＰＣＢ濃度は、０．２ｐｐｂ、１ｐｐｂ、４ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、１００ｐｐｂとした。
【０１０１】
−抗原抗体反応−
前記ＰＣＢ含有溶液に、前記抗体溶液と、ＰＢＳ−ＢＳＡ溶液とを最終的にＤＭＳＯ濃度が２％となるように添加した。
前記添加された溶液を、空調の利いた室内（２５℃±５℃）で３０分間以上放置し、抗原抗体反応を行なった。
【０１０２】
前記調製した金コロイド標識抗体、及びＰＣＢを用い、前記試験例２と同様にして相対吸光度測定器により透過光量を測定し、下記式（７）により、相対的な応答（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（％）を算出した。結果を図３に示す。
【数４】
ただし、前記式（７）中、ＲＧは、相対的な応答（％）を示し、ＩＣＺは、抗原（ＰＣＢ）を加えなかった場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＣＭは、抗原（ＰＣＢ）を加えなかった場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＺは、抗原（ＰＣＢ）を加えた場合の送液前の測定セルの透過光量測定値を示し、ＩＳＭは、抗原（ＰＣＢ）を加えた場合の送液後の測定セルの透過光量測定値を示す。
【０１０３】
図３中、横軸は、ＰＣＢ濃度（ｐｐｂ）、縦軸は、相対的な応答（％）を示す。
図３の結果から、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、ＷＲ３Ｆ６抗体よりも低濃度のＰＣＢに反応することが確かめられた。また、このときのそれぞれのＩＣ５０値は、ＷＲ３Ｆ６抗体が４．８９ｐｐｂであったのに対し、ＯＤ８Ｂ１１抗体は、２．９６であり、約１．７倍の感度向上が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体（ＯＤ８Ｂ１１抗体）は、極性溶媒存在下においてＰＣＢとの結合性が低下することなく、塩素数の異なる複数のＰＣＢ同族体の混合物、具体的には、油性試料中に含まれるカネクロール（ＫＣ−３００、ＫＣ−４００、ＫＣ−５００、ＫＣ−６００：鐘淵化学工業社製)、及びアロクロール（Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４２、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２４８、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２５４、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２６０、Ａｒｏｃｌｏｒ．１２３２：三菱モンサント（現三菱化学）製）中に存在比の高い複数のＰＣＢ同族体に交差反応性を有し、１〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、存在比の高い３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に高い親和性を有するため、組成が未知の絶縁油等、ＰＣＢを含有する可能性のある検査対象を、最小限の誤差で高感度に検出、定量することができる。
また、本発明の抗ＰＣＢモノクローナル抗体は、金コロイドによる標識への適合性に優れており、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を用いたＰＣＢ測定方法は、低コストで廃棄物処理後のＰＣＢ残留濃度、環境中のＰＣＢ濃度等を検査することができる。
【受託番号】
【０１０５】
ＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２０】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【請求項２】
下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程と、
前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程と、
前記ハイブリドーマを培養する工程とを含む請求項１に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２２】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項３】
下記構造式（１）、及び下記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程を含む請求項１から２のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２３】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
【請求項５】
１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、１塩素化ＰＣＢ〜２塩素化ＰＣＢ同族体、及び８塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性よりも、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高い請求項４に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３である請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【請求項９】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、下記構造式（１）、及び下記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【化２５】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２６】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項１０】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、下記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【化２７】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項１１】
抗ＰＣＢモノクローナル抗体が、金コロイドにより標識されている請求項８から１０のいずれかに記載のＰＣＢ測定方法。
【請求項１】
下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体の異性体混合物を、ハプテンとして用いることを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２０】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【請求項２】
下記構造式（１）で表されるビフェニル誘導体から得られた下記構造式（２）で表される化合物を免疫原として動物を免疫する工程と、
前記免疫した動物の抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを得る工程と、
前記ハイブリドーマを培養する工程とを含む請求項１に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２１】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２２】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項３】
下記構造式（１）、及び下記構造式（２）の少なくともいずれかで表される化合物を用いて、ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする工程を含む請求項１から２のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法。
【化２３】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２４】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体の製造方法により製造され、塩素数の異なる２種以上のＰＣＢ同族体に交差反応性を有することを特徴とする抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
【請求項５】
１塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ全同族体のうち、１塩素化ＰＣＢ〜２塩素化ＰＣＢ同族体、及び８塩素化ＰＣＢ〜１０塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性よりも、３塩素化ＰＣＢ〜７塩素化ＰＣＢ同族体に対する親和性が高い請求項４に記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２１８３３である請求項６に記載のハイブリドーマ。
【請求項８】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、
（１）前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記被測定試料中のＰＣＢ、及び
（２）前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体
のいずれかを検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【請求項９】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体、並びに、下記構造式（１）、及び下記構造式（２）のいずれかで表される化合物をＰＣＢ競合物質として添加し、前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体と結合した前記競合物質を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【化２５】
ただし、前記構造式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表す。
【化２６】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項１０】
被測定試料に、請求項４から５のいずれかに記載の抗ＰＣＢモノクローナル抗体を添加し、下記構造式（２）で表される化合物をＰＣＢ競合物質として固定化した担体を用い、前記ＰＣＢ競合物質と前記被測定試料中のＰＣＢとを競争させ、前記被測定試料中のＰＣＢと結合していない前記抗ＰＣＢモノクローナル抗体を検出する工程を含むことを特徴とするＰＣＢ測定方法。
【化２７】
ただし、前記構造式（２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ０〜３の整数を表し、ＸとＹとの和は、１〜６の整数を表し、Ｚは、タンパク質を表す。
【請求項１１】
抗ＰＣＢモノクローナル抗体が、金コロイドにより標識されている請求項８から１０のいずれかに記載のＰＣＢ測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１７８７６５（Ｐ２０１１−１７８７６５Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４７３４６（Ｐ２０１０−４７３４６）
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【出願人】（０００１７３８０９）財団法人電力中央研究所 (1,040)
【Ｆターム（参考）】
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