担体タンパク質にコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌多糖類を含んでなる免疫原性組成物
本発明は、少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる免疫原性組成物であって、１種以上が還元的アミノ化以外の化学によって直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が還元的アミノ化によってタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原組成物に関する。肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防におけるこのような組成物の使用も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なるコンジュゲーション化学が、免疫原性組成物またはワクチンの異なる成分に使用される、肺炎球菌コンジュゲート免疫原性組成物またはワクチンの分野に関する。還元的アミノ化が少なくとも１種の血清型のコンジュゲーションに使用され、還元的アミノ化以外のコンジュゲーションが異なる血清型のコンジュゲーションに使用される。本発明はまた、かかるワクチンを製造する方法および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２歳未満の子供は多くの多糖類ワクチンに対する免疫応答を高めないため、タンパク質担体への化学的コンジュゲーションにより多糖類を免疫原性にする必要があった。Ｔ依存的抗原であるタンパク質へのＴ非依存的抗原である多糖類の結合は、該多糖類に対して、アイソタイプスイッチング、親和性成熟、および記憶誘導などのＴ依存性の特性を付与する。
【０００３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、かなりの罹患率および死亡率（特に、若者および高齢者における）の原因となり、肺炎、菌血症および髄膜炎などの侵襲的疾患、ならびに急性中耳炎などのコロニー形成と関連する疾患を引き起こすグラム陽性細菌である。６０歳を超える人に関する米国における肺炎球菌性肺炎の割合は、１００，０００人あたり３〜８人であると見積もられている。２０％の事例において、これは菌血症、および髄膜炎などの他の兆候をもたらすが、抗生物質治療を行ってもその死亡率は３０％に近い。
【０００４】
肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的に結合された多糖類の莢膜を有する。９０種の公知の血清型の肺炎球菌が存在し、莢膜は補体から細菌の内部表面を防御するだけでなく、それ自身、免疫原性が低いため、それは肺炎球菌の主要なビルレンス決定因子である。多糖類はＴ非依存的抗原であり、ＭＨＣ分子上で処理または提示されてＴ細胞と相互作用することができない。しかしながら、それらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を含む代替的な機構を介して免疫系を刺激することができる。
【０００５】
侵襲性肺炎球菌疾患に対する防御は、莢膜に特異的な抗体と最も強く相関し、その防御は血清型特異的であることが、いくつかの実験において示された。
【０００６】
肺炎連鎖球菌は、幼児および小児における侵襲性細菌疾患および中耳炎の最も一般的な原因である。同様に、高齢者は肺炎球菌ワクチンに対してあまり応答せず［Ｒｏｇｈｍａｎｎら（１９８７），Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：２６５−２７０］、従って、この集団における細菌性肺炎の発生率の上昇をもたらす［ＶｅｒｇｈｅｓｅおよびＢｅｒｋ，（１９８３）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６２：２７１−２８５］。
【０００７】
多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンが開発されている。ＳｙｎｆｌｏｒｉｘがＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓ．ａ．により市販されており、それはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のタンパク質Ｄにコンジュゲートした肺炎球菌血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ多糖類、破傷風トキソイドにコンジュゲートした１８Ｃおよびシアニル化（ＣＤＡＰ）化学によりジフテリアトキソイドにコンジュゲートした１９Ｆを含有する。ＰｒｅｖｅｎａｒがＰｆｉｚｅｒにより市販されており、それは還元的アミノ化化学により無毒性のジフテリア毒素ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの全てを含有する（Ｐｒｙｍｕｌａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｒｍａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．ｖａｃｃｉｎｅｓ８；１４７９−１５００（２００９））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｇｈｍａｎｎら（１９８７），Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：２６５−２７０
【非特許文献２】ＶｅｒｇｈｅｓｅおよびＢｅｒｋ，（１９８３）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６２：２７１−２８５
【非特許文献３】Ｐｒｙｍｕｌａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｒｍａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．ｖａｃｃｉｎｅｓ８；１４７９−１５００（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、複数の血清型肺炎連鎖球菌多糖類コンジュゲートワクチンの改良された製剤を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、異なるコンジュゲーション法を用いてコンジュゲートされている異なる肺炎球菌血清型由来の糖類を組み合わせることによって達成され得る。このように、最適なコンジュゲーション法は、糖類エピトープの最適な提示を可能にするコンジュゲーション法を用いて各血清型が提示できる異なる血清型に関して選択される。いくつかの肺炎球菌糖類は、還元的アミノ化を用いて他の肺炎球菌糖類に十分にコンジュゲートするが、異なるコンジュゲーション法により、環構造を壊さないままにでき、より良い結果を提供することができる。還元的アミノ化またはより効果的な免疫原性組成物を開発できる他のコンジュゲーション法のいずれかを用いて、その糖類の選択を最適に実施する。
【００１１】
したがって、少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含む免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学により直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】多糖類−タンパク質コンジュゲートの調製。
【００１３】
Ａ）７ｖＣＲＭにおいて、１９Ｆ多糖類は還元的アミノ化により無毒性ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。（１）過ヨウ素酸塩による酸化により末端反応性アルデヒドが導入される。（２）還元的アミノ化によるＣＲＭ１９７担体タンパク質に対する結合により六糖環が分解し、開裂する。（３）コンジュゲーヨン後、新規の免疫原性エピトープが六糖環に対する新規の基の結合に起因して生成され得る。
【００１４】
Ｂ）ＰＨｉＤ−ＣＶにおいて、１９Ｆ多糖類はシアニル化化学によりジフテリアトキソイドにコンジュゲートされる。１９Ｆは化学的に活性化されて、シアン酸塩基をヒドロキシル基に導入し、タンパク質成分の添加後にアミノまたはヒドラジド基に対する共有結合を形成する。シアニル化コンジュゲーション後、六糖環はインタクトなままであり、他の化学基は結合できない。
【図２】ＰＨｉＤ−ＣＶまたは７ｖＣＲＭ一次免疫およびブースター免疫後の肺炎球菌血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を達成する幼児の割合。明るいバーはＰＨｉＤ−ＣＶについての結果を示し、暗いバーは７ｖＣＲＭについての結果を示す。エラーバーは９５％信頼限界を表す。
【図３】ＰＨｉＤ−ＣＶまたは７ｖＣＲＭ一次免疫およびブースター免疫後肺炎球菌血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を達成する幼児の割合。明るいバーはＰＨｉＤＣ−ＣＶについての結果を示し、暗いバーは７ｖＣＲＭについての結果を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４】過ヨウ素酸塩処理後の２３Ｆおよび６Ｂ多糖類のサイズ。三角で示したラインは１０ｍＭリン酸緩衝液中の６Ｂのサイズを示し、ダイヤモンドのラインマーカーは１０ｍＭリン酸緩衝液中の２３Ｆのサイズを示し、四角で示したラインは１００ｍＭリン酸緩衝液中の２３Ｆのサイズを示す。
【図５】ＣＤＡＰまたは還元的アミノ化コンジュゲーションのいずれかを用いる２３Ｆコンジュゲートの免疫原性の比較。
【図６】還元的アミノ化またはＣＤＡＰによって作製された６Ｂコンジュゲートのマウスにおける免疫原性の比較。グラフは、還元的アミノ化（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ１２２−１２５）によって作製された４種のコンジュゲートおよびＣＤＡＰ（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ００３およびＰＳ０６Ｂ−ＰＤ）によって作製された２種のＥＬＩＳＡ力価を示す。ＯＰＡの結果は以下に示す。
【図７】還元的アミノ化またはＣＤＡＰによって作製された６Ｂコンジュゲートのモルモットにおける免疫原性の比較。グラフは、還元的アミノ化（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ１２２−１２５）によって作製された４種のコンジュゲートおよびＣＤＡＰ（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ００３およびＰＳ０６Ｂ−ＰＤ）によって作製された２種のＥＬＩＳＡ力価を示す。ＯＰＡの結果は以下に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学により直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、還元的アミノ化以外の化学によりタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる。一実施形態において、１９Ｆは還元的アミノ化以外の化学により担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００１７】
必要に応じて、血清型１、３、１９Ａまたは１９Ｆ由来の莢膜糖は、この基のさらなるメンバーが還元的アミノ化以外の方法を用いてコンジュゲートしているならば、還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされる。
【００１８】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＣＤＡＰ化学などのシアニル化化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖を含んでなる。一実施形態において、１９ＦはＣＤＡＰ化学により担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００１９】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖を含んでなる。
【００２０】
本発明の一実施形態において、以下の肺炎連鎖球菌莢膜糖またはそれらの群は、担体タンパク質に還元的アミノ化によってコンジュゲートされる：血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃまたは２３Ｆ、４および５、４および６Ａ、４および６Ｂ、４および７Ｆ、４および９Ｖ、４および１４、４および１８Ｃ、４および２３Ｆ、５および６Ａ、５および６Ｂ、５および７Ｆ、５および９Ｖ、５および１４、５および１８Ｃ、５および２３Ｆ、６Ａおよび６Ｂ、６Ａおよび７Ｆ、６Ａおよび９Ｖ、６Ａおよび１４、６Ａおよび１８Ｃ、６Ａおよび２３Ｆ、６Ｂおよび７Ｆ、６Ｂおよび９Ｖ、６Ｂおよび１４、６Ｂおよび１８Ｃ、６Ｂおよび２３Ｆ、７Ｆおよび９Ｖ、７Ｆおよび１４、７Ｆおよび１８Ｃ、７Ｆおよび２３Ｆ、９Ｖおよび１４、９Ｖおよび１８Ｃ、９Ｖおよび２３Ｆ、１４および１８Ｃ、１４および２３Ｆまたは１８Ｃおよび２３Ｆ。一実施形態において、２３Ｆは還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２１】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型２３由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２２】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ｂ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２３】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ａ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ｃ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、異なる血清型由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌糖類は、還元的アミノ化化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２６】
還元的アミノ化化学をコンジュゲートするために使用する場合、肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、必要に応じて０．１〜１．２、０．１〜０．５、０．１〜０．２、０．５〜０．８、０．１〜０．８、０．３〜１．０または０．４〜０．９モル当量の過ヨウ素酸塩を用いて酸化されて活性化糖を形成する。必要に応じて過ヨウ素酸塩処理工程は、アミン基を含有しない緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液中で実施される。一実施形態において、緩衝液は無機緩衝液である。一実施形態において、緩衝液はリン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液である。本発明者らは、還元的アミノ化プロセスの酸化工程の条件をコントロールすることによって、得られたコンジュゲートが糖のサイズおよび／または免疫原性を有利に保持し得ることを示している。
【００２７】
一実施形態において、緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液は、１〜１００ｍＭ、５〜８０ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、１０〜４０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、５〜１５ｍＭ、８〜１２ｍＭ、１０〜１２ｍＭ、５〜２０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、約１０ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度を有する。一実施形態において、緩衝液のｐＨはｐＨ５．０〜７．０、ｐＨ５．５〜６．５、ｐＨ５．８〜６．３または約ｐＨ６．０である。
【００２８】
「過ヨウ素酸塩」という用語は過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４−）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６５−）の両方を含むが、しかしながら１つの特定の実施形態において、本発明の方法に使用される過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸塩である。「過ヨウ素酸塩」という用語はまた、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを含む過ヨウ素酸塩の種々の塩を含む。抗原が過ヨウ素酸塩と反応する場合、過ヨウ素酸塩は近接のヒドロキシル基を酸化して、カルボニルまたはアルデヒド基を形成し、Ｃ−Ｃ結合の開裂を生じる。この理由のために、「抗原を過ヨウ素酸塩と反応させる」という用語は、過ヨウ素酸塩による近接のヒドロキシル基の酸化を含み、例えばその反応はシスまたはトランスの近接のジオールの酸化を含んでもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、異なる血清型由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、ＣＤＡＰ化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００３０】
本発明の一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣ化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００３１】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される担体タンパク質を含有する。
【００３２】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、少なくともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖血清型に別々にコンジュゲートされる２、３、４、５、６または７種の異なる担体タンパク質を含有する。必要に応じて、これらの担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される。
【００３３】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１を含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌溶血素またはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖３を含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖４を含む。
【００３６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖５を含む。
【００３７】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ｂを含む。
【００３８】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖７Ｆを含む。
【００３９】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖９Ｖを含む。
【００４０】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１４を含む。
【００４１】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖２３Ｆを含む。
【００４２】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１８Ｃを含む。
【００４３】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１９Ａを含む。
【００４４】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７またはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖２２Ｆを含む。
【００４５】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤまたはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ａを含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤまたはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ｃを含む。
【００４７】
本明細書を通して用いられる用語「糖類」は、多糖類またはオリゴ糖を示し、その両方を含んでもよい。多糖類を細菌から単離し、公知の方法（例えば欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号）ならびに必要に応じて微小流動化によりある程度までサイズを変えることができる。多糖類をサイズ変更して、多糖類サンプル中での粘度を減少させ、および／または結合産物に関する濾過性を改善することができる。オリゴ糖は少数の反復単位（典型的には、５〜３０個の反復単位）を有し、典型的には加水分解された多糖類である。
【００４８】
肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類は、最大で８個の糖残基を含んでもよい反復オリゴ糖単位を含む。重要な肺炎連鎖球菌血清型のオリゴ糖単位の概説については、ＪＯＮＥＳ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎ．Ａｃａｄ．Ｂｒａｓ．Ｃｉｅｎｃ．，Ｊｕｎｅ ２００５，ｖｏｌ．７７，ｎｏ．２，ｐ．２９３−３２４．Ｔａｂｌｅ ＩＩ ＩＳＳＮ ０００１−３７６５を参照のこと。一実施形態においては、莢膜糖類抗原は完全長多糖類であってよいが、他の実施形態においては、それは１個のオリゴ糖単位、または天然の長さの糖鎖の反復オリゴ糖単位よりも短いものであってよい。一実施形態においては、前記ワクチン中に存在する全ての糖類は多糖類である。完全長多糖類を「サイズ変更する」ことができる、すなわち、酸加水分解処理、過酸化水素処理、オリゴ糖断片を作製するためのｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（登録商標）、次いで過酸化水素処理によるサイズ変更または微小流動化などの様々な方法により、そのサイズを低下させることができる。
【００４９】
本発明者らはまた、当業界の焦点はコンジュゲート製造を容易にするためにオリゴ糖を用いることであったことに留意した。本発明者らは、天然の、もしくはわずかにサイズ変更された多糖類コンジュゲートを用いることにより、１個以上の以下の利点を実現することができることを見出した：１）濾過可能である高い免疫原性を有するコンジュゲート、２）コンジュゲート中の多糖類とタンパク質の比率を、コンジュゲート中の多糖類とタンパク質の比率（ｗ／ｗ）を増加させることができるように変化させることができる（担体抑制効果に対する効果を有し得る）、３）加水分解を受けやすい免疫原性コンジュゲートを、コンジュゲーションのためにより大きい糖類の使用により安定化することができる。より大きい多糖類の使用は、コンジュゲート担体とのより多い架橋をもたらし、コンジュゲートからの遊離糖類の遊離を低下させることができる。従来技術において記載されたコンジュゲートワクチンは、コンジュゲーションを改善するためにコンジュゲーションの前に多糖類を脱重合させる傾向がある。本発明者らは、より大きいサイズの糖類を保持する糖類コンジュゲートワクチンが、肺炎球菌疾患に対する良好な免疫応答を提供することができることを見出した。
【００５０】
かくして、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲーション前の各糖類の平均サイズ（例えば、重量平均分子量；Ｍｗ）が、８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａまたは１０００ｋＤａを超えるものである、１種以上の糖類コンジュゲートを含んでもよい。一実施形態においては、コンジュゲーション後のコンジュゲートは、濾過前のサンプルと比較して、濾過後に５０、６０、７０、８０、９０または９５％を超える収率が得られるように、０．２μｍのフィルターを通して容易に濾過可能であるべきである。
【００５１】
本発明の目的のために、「天然多糖類」とは、その目的が糖類のサイズを低下させることであるプロセスにかけられていない糖類を指す。多糖類は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに低下することになってもよい。そのような糖類は依然として天然である。多糖類がサイズ変更技術にかけられた場合にのみ、この多糖類は天然でないと考えられる。天然多糖類のサイズは、例えば、２５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、４００〜１，５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、５００〜１，０００ｋＤａ、または１，０００〜１，５００ｋＤａであり、当業者により理解されるように、異なる血清型は異なるサイズの天然多糖類を有する。
【００５２】
本発明の目的のために、「最大でｘ２の因子によりサイズ変更される」とは、前記糖類が、該糖類のサイズを低下させるが、天然多糖類のサイズの半分を超えるサイズを保持するように意図されたプロセスにかけられることを意味する。ｘ３、ｘ４などは同じように解釈される、すなわち、前記糖類が、該多糖類のサイズを低下させるが、天然多糖類のサイズの１／３、１／４などを超えるサイズを保持するように意図されたプロセスにかけられると解釈される。
【００５３】
本発明の一態様においては、前記免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１０種の血清型に由来する肺炎連鎖球菌糖類であって、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種もしくはそれぞれの肺炎連鎖球菌糖類が天然多糖類である、前記糖類を含む。
【００５４】
本発明の一態様においては、前記免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１０種の血清型に由来する肺炎連鎖球菌糖類であって、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれぞれの肺炎連鎖球菌糖類が最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５、ｘ６、ｘ７、ｘ８、ｘ９またはｘ１０の因子によりサイズ変更される、前記糖類を含む。この態様の一実施形態においては、大部分の糖類、例えば、６、７、８種以上の糖類が最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５、ｘ６、ｘ７、ｘ８、ｘ９またはｘ１０の因子によりサイズ変更される。
【００５５】
本明細書に記載の糖類の分子量または平均分子量とは、コンジュゲーションの前に測定され、ＭＡＬＬＳにより測定される糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）を指す。
【００５６】
ＭＡＬＬＳ技術は当業界でよく知られており、典型的には、実施例２に記載のように実行される。肺炎球菌糖類のＭＡＬＬＳ分析のためには、２個のカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）を組合わせて使用し、糖類を水中に溶出させる。光散乱検出器（例えば、４８８ｎｍの１０ｍＷのアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）および干渉屈折計（例えば、Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて糖類を検出する。
【００５７】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類は天然多糖類または通常の抽出プロセスの間にサイズが低下した天然多糖類である。
【００５８】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類を、機械的切断により、例えば、微小流動化または超音波処理によりサイズ変更する。微小流動化および超音波処理は、濾過可能なコンジュゲートを提供するために、より大きい天然多糖類のサイズを十分に低下させる利点を有する。サイズ変更は、ｘ２０、ｘ１０、ｘ８、ｘ６、ｘ５、ｘ４、ｘ３またはｘ２以下の因子による。
【００５９】
一実施形態においては、前記免疫原性組成物は、天然多糖類と、ｘ２０以下の因子によりサイズ変更された糖類との混合物から作製された肺炎連鎖球菌コンジュゲートを含む。この実施形態の一態様においては、大部分の前記糖類、例えば、６、７、８種以上の糖類を、最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５またはｘ６の因子によりサイズ変更する。
【００６０】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１００ｋＤａを超える、例えば１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１４０〜１６０ｋＤａの平均サイズの１９Ａ糖類を含む。一実施形態においては、１９Ａを、微小流動化により、例えば最大ｘ２、ｘ３、ｘ４またはｘ５以下の因子によりわずかにサイズ変更する。一実施形態においては、１９Ａコンジュゲートの糖類用量は、１〜１０μｇ、１〜５μｇまたは１〜３μｇの糖類、必要に応じて３μｇの糖類である。
【００６１】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は２２Ｆ糖類コンジュゲートを含み、２２Ｆ糖類の平均サイズは１００ｋＤａを超え、必要に応じて１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１５０〜１７０ｋＤａである。一実施形態においては、２２Ｆ糖類を、微小流動化により、例えば最大ｘ２、ｘ３、ｘ４またはｘ５以下の因子によりサイズ変更する。一実施形態においては、１９Ａコンジュゲートの糖類用量は、１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類、必要に応じて３μｇの糖類である。
【００６２】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は複数の糖類コンジュゲートを含み、該糖類の平均サイズは５０ｋＤａを超える。一実施形態においては、血清型１糖類の平均サイズは３００〜４００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型４糖類の平均サイズは７５〜１２５ｋＤａである。一実施形態においては、血清型５糖類の平均サイズは３５０〜４５０ｋＤａである。一実施形態においては、血清型６Ｂ糖類の平均サイズは１０００〜１４００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型７Ｆ糖類の平均サイズは２００〜３００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型９Ｖ糖類の平均サイズは２５０〜３００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型１４糖類の平均サイズは２００〜２５０ｋＤａである。一実施形態においては、血清型２３Ｆ糖類の平均サイズは９００〜１０００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型５；６Ａ、６Ｂ；２３Ｆ；５および６Ａ；５および６Ｂ、５および２３Ｆ、６Ａおよび６Ｂ、６Ａおよび２３Ｆ；６Ｂおよび２３Ｆ；５、６Ａおよび６Ｂ；５、６Ａおよび２３Ｆ；５、６Ｂおよび２３Ｆまたは５、６Ａ、６Ｂおよび２３Ｆは、天然サイズの糖類としてコンジュゲートされる、すなわちプロセスに含まれる特定用途のサイズ変更工程を有さない。
【００６３】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物の莢膜糖類コンジュゲートの糖類用量は１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類／コンジュゲートである。例えば、該組成物は３μｇの糖類／コンジュゲートの用量で血清型４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２２Ｆ（および必要に応じて１９Ａ）のコンジュゲートを含む。例えば、本発明の免疫原性組成物は１μｇの糖類／コンジュゲートの用量で血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ（ならびに必要に応じて６Ａおよび／または３）のコンジュゲートを含む。
【００６４】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類を、リンカー、例えば、二官能性リンカーを介して担体タンパク質にコンジュゲートさせる。このリンカーは必要に応じて、例えば、１個の反応性アミノ基および１個の反応性カルボン酸基、２個の反応性アミノ基または２個の反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性である。前記リンカーは、例えば、４〜２０、４〜１２、５〜１０個の炭素原子を有する。可能性のあるリンカーは、ＡＤＨである。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（国際公開第００／１０５９９）、ニトロフェニル−エチルアミン（Ｇｅｖｅｒら（１９７９）Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５；１７１−２８８）、ハロゲン化ハロアルキル（米国特許第４０５７６８５号）、グリコシド結合（米国特許第４，６７３，５７４号、米国特許第４，８０８，７００号）、ヘキサンジアミンおよび６−アミノカプロン酸（米国特許第４，４５９，２８６号）が挙げられる。一実施形態においては、血清型１８Ｃに由来する糖類をコンジュゲートさせるためのリンカーとしてＡＤＨを用いる。
【００６５】
本発明の免疫原性組成物中に存在する糖類コンジュゲートを、任意の公知のカップリング技術により調製することができる。コンジュゲーション方法は、シアン酸エステルを形成する１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による糖類の活性化に依存し得る。かくして、活性化された糖類を、担体タンパク質上のアミノ基に、直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介して結合させることができる。例えば、スペーサーは、マレイミドにより活性化される担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］もしくはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢ、もしくはＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体に結合させることができるチオール化多糖類を与えるシスタミンまたはシステアミンであってよい。必要に応じて、シアン酸エステル（必要に応じて、ＣＤＡＰ化学により作製される）を、ヘキサンジアミンまたはＡＤＨと結合させ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用いて担体タンパク質に結合させる。そのようなコンジュゲートはＰＣＴ公開出願である国際公開第９３／１５７６０号 Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙならびに国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号に記載されている。
【００６６】
他の好適な技術は、カルボジイミド、カルビイニド（ｃａｒｂｉｉｎｉｄｅ）、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７９，２５４；２５７２−４，Ｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９８１．２１８；５０９−１８）、次いで、タンパク質との反応によりカルバメート結合を形成させることにより形成することができるカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、一次ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、必要に応じて、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの一次ヒドロキシル基の反応の保護／脱保護およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
【００６７】
前記コンジュゲートを、米国特許第４，３６５，１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４，６７３，５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記載の直接的還元的アミノ化方法により調製することもできる。他の方法は、ＥＰ−０−１６１−１８８、ＥＰ−２０８３７５およびＥＰ−０−４７７５０８に記載されている。
【００６８】
さらなる方法は、例えば、ＥＤＡＣを用いる、カルボジイミド縮合（Ｃｈｕ Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８３ ２４５ ２５６）による、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導体化されたシアノゲンブロミド（もしくはＣＤＡＰ）活性化糖類の、タンパク質担体へのカップリングを含む。
【００６９】
一実施形態においては、糖類上のヒドロキシル基（必要に応じて、活性化されたヒドロキシル基、例えば、シアン酸エステルを作るために活性化された［例えば、ＣＤＡＰを用いて］ヒドロキシル基）を、タンパク質上のアミノ基またはカルボキシル基に、直接的または間接的（リンカーを介して）に連結する。リンカーが存在する場合、必要に応じて、糖類上のヒドロキシル基を、例えば、ＣＤＡＰコンジュゲーションを用いることにより、リンカー上のアミノ基に連結する。リンカー（例えば、ＡＤＨ）中のさらなるアミノ基を、例えば、カルボジイミド化学を用いることにより、例えば、ＥＤＡＣを用いることにより、タンパク質上のカルボン酸基に結合させることができる。一実施形態においては、肺炎球菌莢膜糖類を、最初にリンカーに結合させた後、リンカーを担体タンパク質に結合させる。あるいは、リンカーを担体に結合させた後、糖類に結合させることができる。
【００７０】
いくつかの糖類−タンパク質コンジュゲートをＣＤＡＰにより、およびいくつかを還元的アミノ化により調製する、技術の組合せを用いてもよい。
【００７１】
一般的には、タンパク質担体上の以下の型の化学基をカップリング／コンジュゲーションに用いることができる。
【００７２】
Ａ）カルボキシル基（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を介する）。一実施形態においては、この基を糖類上のアミノ基に直接的に、またはカルボジイミド化学、例えば、ＥＤＡＣを用いてリンカー上のアミノ基に連結する。
【００７３】
Ｂ）アミノ基（例えば、リジンを介する）。一実施形態においては、この基を、糖類上のカルボキシル基に直接的に、またはカルボジイミド化学、例えば、ＥＤＡＣを用いてリンカー上のカルボキシル基に連結する。別の実施形態においては、この基を、糖類上のＣＤＡＰもしくはＣＮＢｒで活性化されたヒドロキシル基に直接的に、またはリンカー上のそのような基に；アルデヒド基を有する糖類もしくはリンカーに；スクシンイミドエステル基を有する糖類もしくはリンカーに連結する。
【００７４】
Ｃ）スルフヒドリル基（例えば、システインを介する）。一実施形態においては、この基を、マレイミド化学を用いて、ブロモもしくはクロロアセチル化糖類またはリンカーに連結する。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７５】
Ｄ）ヒドロキシル基（例えば、チロシンを介する）。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７６】
Ｅ）イミダゾリル基（例えば、ヒスチジンを介する）。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７７】
Ｆ）グアニジル基（例えば、アルギニンを介する）。
【００７８】
Ｇ）インドリル基（例えば、トリプトファンを介する）。
【００７９】
糖類上で、一般的には以下の基をカップリングのために用いることができる：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２。アルデヒド基を、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当業界で公知の様々な処理の後に生成することができる。
【００８０】
直接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ −−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ−−−−＞Ｓｃｈｉｆｆ塩基＋ＮａＣＮＢＨ３−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート。
【００８１】
スペーサー（リンカー）を介する間接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＮＨ２−−−−＞糖類−−−−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質、または、例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の改変）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ−−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−＞糖類−−−−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質、または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の改変）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−−＞糖類−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート。
【００８２】
注記：上記のＥＤＡＣの代わりに、任意の好適なカルボジイミドを用いることができる。
【００８３】
まとめると、糖類とのカップリングに一般的に用いることができるタンパク質担体化学基の型は、アミノ基（例えば、リジン残基上の）、ＣＯＯＨ基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基上の）ならびにＳＨ基（利用可能である場合）（例えば、システイン残基上の）である。
【００８４】
必要に応じて、担体タンパク質と肺炎連鎖球菌糖類の比率は、１：５〜５：１、１：２〜２．５：１、１：１〜２：１（ｗ／ｗ）である。一実施形態においては、多数のコンジュゲート、例えば、６、７、８、９種以上のコンジュゲートは、１：１より大きい、例えば、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１または１．６：１（ｗ／ｗ）である担体タンパク質と糖類の比率を有する。
【００８５】
一実施形態においては、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌糖類を、ＣＤＡＰおよびＥＤＡＣを用いてリンカーを介して担体タンパク質に結合させる。例えば、１８Ｃを、上記のようにＣＤＡＰおよびＥＤＡＣを用いてリンカー（例えば、ＡＤＨなどのその末端に２個のヒドラジノ基を有するもの）を介してタンパク質に結合させることができる。リンカーを用いる場合、ＣＤＡＰを用いて、リンカーに糖類を結合させた後、ＥＤＡＣを用いてリンカーをタンパク質に結合させるか、またはあるいは、ＥＤＡＣを用いて最初にリンカーをタンパク質に結合させた後、ＣＤＡＰを用いてリンカーを糖類に結合させることができる。
【００８６】
一般的には、本発明の免疫原性組成物は、０．１〜２０μｇ、１〜１０μｇまたは１〜３μｇの糖類の各糖類コンジュゲートの用量を含んでもよい。
【００８７】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、０．１〜２０μｇ；０．５〜１０μｇ；０．５〜５μｇまたは１〜３μｇの糖類の用量のそれぞれの肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含む。一実施形態においては、莢膜糖類は、様々な用量で存在してもよく、例えば、いくつかの莢膜糖類は約１μｇもしくは正確に１μｇの用量で存在してもよく、またはいくつかの莢膜糖類は約３μｇもしくは正確に３μｇの用量で存在してもよい。一実施形態においては、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）に由来する糖類は、他の糖類よりも高い用量で存在する。この実施形態の一態様においては、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）は約３μｇもしくは正確に３μｇの用量で存在するが、免疫原性組成物中の他の糖類は約１μｇもしくは正確に１μｇの用量で存在する。
【００８８】
「約」または「ほぼ」は、本発明の目的のためには、与えられた数値の１０％多いまたは少ない範囲内と定義される。
【００８９】
一実施形態においては、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を、担体タンパク質に直接結合させる。必要に応じて、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を、ＣＤＡＰにより直接結合させる。一実施形態においては、多数の莢膜糖類、例えば、５、６、７、８、９種以上の莢膜糖類を、ＣＤＡＰにより担体タンパク質に直接連結する（国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号を参照されたい）。
【００９０】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１種以上のコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質を含む。一実施形態においては、肺炎連鎖球菌タンパク質は、コンジュゲートされていない形態で付加される。例えばそれは組成物中の遊離タンパク質として存在する。
【００９１】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質、解毒した肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３からなる群より選択される。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素および／またはＰｈｔＤを含有する。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤおよびＳｐ１２８を含有する。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤおよびＳｐ１３０を含有する。
【００９２】
Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアド）ファミリーは、タンパク質ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、およびＰｈｔＥを含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域により分離された２つのドメインおよびおそらく、金属もしくはヌクレオシド結合または酵素活性に関与する、いくつかのヒスチジントライアド、（３−５）コイルドコイル領域、保存されたＮ末端ならびに異種性Ｃ末端を特徴とする。それは試験した全ての株の肺炎球菌に存在する。他の連鎖球菌およびナイセリア菌においては、相同タンパク質も見出された。本発明の一実施形態においては、本発明のＰｈｔタンパク質はＰｈｔＤである。しかしながら、用語「ＰｈｔＡ、Ｂ、ＤおよびＥ」は、以下に記載の引用物に開示された配列を有するタンパク質ならびに参照タンパク質と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然の（および人工の）変異体を指すことが理解される。必要に応じて、それは少なくとも９５％同一であり、または少なくとも９７％同一である。
【００９３】
ＰｈｔＸタンパク質に関して、ＰｈｔＡは国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ３６とも呼ばれる。それはポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、ＬＸＸＣのＩＩ型シグナルモチーフを有する。ＰｈｔＤは国際公開第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも呼ばれる。上記のように、それもポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。ＰｈｔＢは国際公開第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも呼ばれる。ＰｈｔＢファミリーの別のメンバーは、国際公開第００／１７３７０号に開示されたＣ３−分解ポリペプチドである。このタンパク質もポリヒスチジントライアドファミリーに由来し、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。例えば免疫学的に機能的な等価物は、国際公開第９８／１８９３０号に開示されたタンパク質Ｓｐ４２である。ＰｈｔＢトランケート（約７９ｋＤ）は国際公開第９９／１５６７５号に開示されており、ＰｈｔＸファミリーのメンバーであるとも考えられる。ＰｈｔＥは国際公開第００／３０２９９号に開示されており、ＢＶＨ−３とも呼ばれる。本明細書で任意のＰｈｔタンパク質に言及する場合、それはＰｈｔタンパク質の免疫原性断片またはその融合物を用いることができることを意味する。例えば、ＰｈｔＸに対する参照は、任意のＰｈｔタンパク質に由来する免疫原性断片またはその融合物を含む。ＰｈｔＤまたはＰｈｔＢに対する参照はまた、例えば、国際公開第０１９８３３４号に見出されるように、ＰｈｔＤＥまたはＰｈｔＢＥ融合体に対する参照でもある。
【００９４】
肺炎球菌溶血素は、異なる細胞溶解活性（溶血活性）および補体活性化活性を有する多機能毒素である（Ｒｕｂｉｎｓら、Ａｍ．Ｒｅｓｐｉ．Ｃｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１５３：１３３９−１３４６（１９９６））。この毒素は肺炎球菌によって分泌されないが、それは自己溶解素の影響下での肺炎球菌の溶解の際に放出される。その効果としては、例えば、ヒト単球による炎症性サイトカインの産生、ヒト気道上皮上での繊毛の脈動の阻害、ならびに好中球の殺菌活性および移動の低下が挙げられる。肺炎球菌溶血素の最も明らかな効果は、赤血球の溶解におけるものであり、それはコレステロールへの結合を含む。それは毒素であるため、それを解毒する必要があり（すなわち、防御にとって好適な用量で提供された場合、ヒトに対して非毒性的である）、その後、インビボで投与することができる。野生型または天然の肺炎球菌溶血素の発現およびクローニングは当業界で公知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，５５：１１８４−１１８９（１９８７））、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１００７：６７−７２（１９８９））およびＭｉｔｃｈｅｌｌら（ＮＡＲ，１８：４０１０（１９９０））を参照されたい。ｐｌｙの解毒を、化学的手段により、例えば、ホルマリンもしくはグルタルアルデヒド処理または両方の組合せにかけることにより行うことができる（国際公開第０４０８１５１５号、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）。そのような方法は、様々な毒素について当業界でよく知られている。あるいは、ｐｌｙを遺伝的に解毒することができる。かくして、本発明は、例えば、突然変異タンパク質であってよい、肺炎球菌タンパク質の誘導体を包含する。本明細書で用いられる用語「突然変異された」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発などのよく知られた技術または任意の他の従来方法を用いて、１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換を受けた分子を意味する。例えば、上記のように、突然変異ｐｌｙタンパク質を、それがその免疫原性エピトープを維持しながら、生物学的に不活性であるように変化させることができ、例えば、国際公開第９０／０６９５１号、Ｂｅｒｒｙら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６７：９８１−９８５（１９９９））、国際公開第９９／０３８８４号および国際公開第１０／７１９８６号を参照されたい。遺伝子的に解毒した肺炎球菌溶血素は、国際公開第１０／７１９８６号に記載されているようにアミノ酸６５（スレオニン）、２９３（グリシン）および／または４２８（システイン）において点突然変異を含有し得る。
【００９５】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｐｌｙ」とは医学的使用にとって好適な突然変異されるか、または解毒された（すなわち、非毒性的である）肺炎球菌溶血素を指すことが理解される。
【００９６】
コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）に関しては、そのファミリーのメンバーは元々、コリンアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる肺炎球菌タンパク質として同定されたものである。コリン結合タンパク質は全部、細胞壁のテイコ酸および膜に結合したリポテイコ酸のホスホリルコリン部分に非共有結合している。構造的に、それらはファミリー全体に渡って一般的にいくつかの領域を有するが、このタンパク質の正確な性質（アミノ酸配列、長さなど）は変化してもよい。一般的には、コリン結合タンパク質は、Ｎ末端領域（Ｎ）、保存された反復領域（Ｒ１および／もしくはＲ２）、プロリンに富む領域（Ｐ）ならびに該タンパク質の約半分を含む、複数の反復からなる、保存されたコリン結合領域（Ｃ）を含む。本明細書で用いられるように、用語「コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）」は、国際公開第９７／４１１５１号に同定されたコリン結合タンパク質、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧからなる群より選択される。ＣｂｐＡは国際公開第９７／４１１５１号に開示されている。ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧは国際公開第００／２９４３４号に開示されている。ＰｓｐＣは国際公開第９７／０９９９４号に開示されている。ＰｂｃＡは国際公開第９８／２１３３７号に開示されている。ＳｐｓＡは国際公開第９８／３９４５０号に開示されたコリン結合タンパク質である。必要に応じて、コリン結合タンパク質を、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群より選択する。
【００９７】
本発明の実施形態は、「ＣｂｐＸ」が上記に定義されたものであり、「トランケート」がコリン結合領域（Ｃ）の５０％以上を欠くＣｂｐＸタンパク質を指す、ＣｂｐＸトランケートを含む。必要に応じて、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。必要に応じて、そのようなタンパク質トランケートは、（ｉ）コリン結合領域および（ｉｉ）該タンパク質のＮ末端の半分の部分を欠き、ならびに少なくとも１個の反復領域（Ｒ１またはＲ２）を保持する。必要に応じて、該トランケートは、２個の反復領域（Ｒ１およびＲ２）を有する。そのような実施形態の例は、国際公開第９９／５１２６６号または国際公開第９９／５１１８８号に例示されたＮＲ１ｘＲ２およびＲ１ｘＲ２であるが、同様のコリン結合領域を欠く他のコリン結合タンパク質も本発明の範囲内に意図される。
【００９８】
ＬｙｔＸファミリーは、細胞溶解に関連する膜結合タンパク質である。そのＮ末端ドメインはコリン結合ドメインを含むが、ＬｙｔＸファミリーは上記のＣｂｐＡファミリーに認められる全ての特徴を有さず、かくして、本発明については、ＬｙｔＸファミリーはＣｂｐＸファミリーとは異なると考えられる。ＣｂｐＸファミリーとは対照的に、Ｃ末端ドメインは、ＬｙｔＸタンパク質ファミリーの触媒ドメインを含む。前記ファミリーは、ＬｙｔＡ、ＢおよびＣを含む。ＬｙｔＸファミリーに関して、ＬｙｔＡはＲｏｎｄａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６４：６２１−６２４（１９８７）に開示されている。ＬｙｔＢは国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ４６とも呼ばれる。ＬｙｔＣも国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ９１とも呼ばれる。本発明の実施形態はＬｙｔＣを含む。
【００９９】
別の実施形態は、「ＬｙｔＸ」が上記に定義され、「トランケート」がコリン結合領域の５０％以上を欠くＬｙｔＸタンパク質を指す、ＬｙｔＸトランケートを含む。必要に応じて、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。本発明のさらに別の実施形態は、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質（または融合物）を含む。必要に応じて、これはＣｂｐＸのＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）およびＬｙｔＸ（例えば、ＬｙｔＣＣｔｅｒｍまたはＳｐ９１Ｃｔｅｒｍ）のＣ末端部分（Ｃｔｅｒｍ、すなわち、コリン結合ドメインを欠く）を含む。必要に応じて、ＣｂｐＸを、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群より選択する。必要に応じて、それはＣｂｐＡである。必要に応じて、ＬｙｔＸはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも呼ばれる）である。本発明の別の実施形態は、コリン結合ドメイン（Ｃ）を欠くＰｓｐＡまたはＰｓａＡトランケートであり、ＬｙｔＸとの融合タンパク質として発現される。必要に応じて、ＬｙｔＸはＬｙｔＣである。
【０１００】
ＰｓａＡおよびＰｓｐＡに関しては、両方とも当業界で公知である。例えば、ＰｓａＡおよびその膜貫通欠失変異体は、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ｐａｔｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６Ｄｅｃ；６４（１２）：５２５５−６２により記載されている。ＰｓｐＡおよびその膜貫通欠失変異体は、例えば、米国特許第５，８０４，１９３号、国際公開第９２／１４４８８号、および国際公開第９９／５３９４０号に開示されている。
【０１０１】
Ｓｐ１２８およびＳｐ１３０は、国際公開第００／７６５４０号に開示されている。Ｓｐ１２５は、ＬＰＸＴＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質の例である。このモチーフを有するこのクラスの肺炎球菌表面タンパク質内の任意のタンパク質は、本発明の状況内で有用であることがわかっており、従って、本発明のさらなるタンパク質であると考えられる。Ｓｐ１２５自体は、国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、ＺｍｐＢ（亜鉛メタロプロテイナーゼ）としても知られる。Ｓｐ１０１は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（それは参照番号ｙ８５９９３を有する）。それはＩ型シグナル配列を特徴とする。Ｓｐ１３３は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（それは参照番号ｙ８５９９２を有する）。それもＩ型シグナル配列を特徴とする。
【０１０２】
組合せワクチン（特に、中耳炎の予防のための）に含有させることができるモラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）タンパク質抗原の例は、ＯＭＰ１０６［国際公開第９７／４１７３１号（Ａｎｔｅｘ）および国際公開第９６／３４９６０号（ＰＭＣ）］；ＯＭＰ２１またはその断片（国際公開第００１８９１０号）；ＬｂｐＡおよび／またはＬｂｐＢ［国際公開第９８／５５６０６号（ＰＭＣ）］；ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［国際公開第９７／１３７８５号および国際公開第９７／３２９８０号（ＰＭＣ）］；ＣｏｐＢ［Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２００３−２０１０］；ＵｓｐＡ１および／またはＵｓｐＡ２［国際公開第９３／０３７６１号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）］；ＯｍｐＣＤ；ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）；ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）；ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１４６８）；ｌｉｐｏ０６（ＧＢ９９１７９７７．２）；ｌｉｐｏ１０（ＧＢ９９１８２０８．１）；ｌｉｐｏ１１（ＧＢ９９１８３０２．２）；ｌｉｐｏ１８（ＧＢ９９１８０３８．２）；Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３０３８）；Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）；ＯｍｐｌＡ１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）；Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）；ならびにＯｍｐＥである。組合せワクチン（特に、中耳炎の予防のための）に含有させることができる非分類性インフルエンザ菌抗原またはその断片の例としては、フィンブリンタンパク質［（米国特許第５，７６６，６０８号−Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）］およびそれに由来するペプチドを含む融合物［例えば、ＬＢ１（ｆ）ペプチド融合物；米国特許第５，８４３，４６４号（ＯＳＵ）もしくは国際公開第９９／６４０６７］；ＯＭＰ２６［国際公開第９７／０１６３８（Ｃｏｒｔｅｃｓ）］；Ｐ６［ＥＰ２８１６７３（Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］；ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ；Ｈｉａ；Ｈｓｆ；Ｈｉｎ４７；Ｈｉｆ；Ｈｍｗ１；Ｈｍｗ２；Ｈｍｗ３；Ｈｍｗ４；Ｈａｐ；Ｄ１５（国際公開第９４／１２６４１号）；Ｐ２；ならびにＰ５（国際公開第９４／２６３０４号）が挙げられる。
【０１０３】
本発明のタンパク質を有益に混合することもできる。混合するとは、免疫原性組成物が、担体タンパク質として、または遊離タンパク質として、または２つの混合物として、以下の組合せ内に由来する全てのタンパク質を含むことを意味する。例えば、本明細書の以後に記載する２つのタンパク質の組合せにおいては、両タンパク質を担体タンパク質として用いるか、または両タンパク質を遊離タンパク質として存在させるか、または両方を担体として、および遊離タンパク質として存在させるか、または一方を担体タンパク質および遊離タンパク質として存在させるが、他方を担体タンパク質としてのみ、もしくは遊離タンパク質としてのみ存在させるか、または一方を担体タンパク質として存在させ、他方を遊離タンパク質として存在させることができる。３種のタンパク質の組合せを与える場合、同様の可能性が存在する。組合せとしては、限定されるものではないが、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃｔｅｒｍキメラもしくは融合タンパク質、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃｔｅｒｍキメラもしくは融合タンパク質、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、Ｒ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡが挙げられる。必要に応じて、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣに由来する。必要に応じて、それはＣｂｐＡに由来するものである。他の組合せとしては、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２＋Ｐｌｙ、およびＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤなどの３種のタンパク質の組合せが挙げられる。一実施形態においては、前記ワクチン組成物は、担体タンパク質として解毒された肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはＰｈｔＤＥを含む。さらなる実施形態においては、前記ワクチン組成物は、遊離タンパク質として解毒された肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはＰｈｔＤＥを含む。
【０１０４】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物と薬学上許容される賦形剤とを含んでなるワクチンを提供する。
【０１０５】
本発明のワクチンを、特に、幼児集団における使用だけでなく、高齢者集団における使用について意図される場合、アジュバント化してもよい。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルもしくはリン酸アルミニウムもしくはミョウバンなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛のものなどの他の金属塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオン的もしくは陰イオン的に誘導体化された糖類、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【０１０６】
前記アジュバントをＴＨ１型の応答の優先的な誘導因子であるように選択する。そのような高レベルのＴｈ１型サイトカインは所与の抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を好む傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは該抗原に対する体液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。
【０１０７】
Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的ではない。現実には、個体は主にＴｈ１または主にＴｈ２であると記載される免疫応答を支援するであろう。しかしながら、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．およびＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７，ｐ１４５−１７３））によりマウスＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンにおいて記載されたことに関してサイトカインのファミリーを考慮することが都合がよいことが多い。伝統的には、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦγおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連する。Ｔｈ１型免疫応答の誘導と直接関連することが多い他のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２などは、Ｔ細胞によっては産生されない。対照的に、Ｔｈ２型応答はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連する。主にＴｈ１応答を促進する好適なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドＡもしくはその誘導体（もしくは一般的には解毒されたリピドＡ−例えば、国際公開第２００５１０７７９８号を参照されたい）、特に、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製については、ＧＢ２２２０２１１ Ａを参照されたい）；ならびにモノホスホリルリピドＡ、必要に応じて、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）または水中油乳濁液との組合せが挙げられる。そのような組合せにおいては、抗原と３Ｄ−ＭＰＬを、同じ粒子状構造中に含有させ、抗原および免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。３Ｄ−ＭＰＬがミョウバンに吸着された抗原の免疫原性をさらに増強することができることが研究により示された［Ｔｈｏｅｌｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）１６：７０８−１４；ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］。
【０１０８】
増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、国際公開第９４／００１５３号に開示されたＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＱＳ２１が国際公開第９６／３３７３９号に開示されたコレステロールでクエンチされた反応性の低い組成物を含む。水中油乳濁液中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、国際公開第９５／１７２１０号に記載されている。一実施形態においては、前記免疫原性組成物はさらに、ＱＳ２１であってよいサポニンを含む。前記製剤はまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい（国際公開第９５／１７２１０号）。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（国際公開第９６／０２５５５号）および他の免疫調節オリゴヌクレオチド（国際公開第０２２６７５７号および国際公開第０３５０７８２２号）も、ＴＨ１応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用にとって好適である。
【０１０９】
本発明の免疫原性組成物を含むワクチン調製物を用いて、全身または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することにより、感染に罹りやすい哺乳動物を防御または治療することができる。これらの投与としては、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）もしくは皮下（ＳＣ）経路を介する注入；または経口／消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与が挙げられる。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻内（ＩＮ）投与が可能である（肺炎球菌の鼻咽頭運搬をより効率的に防止し、かくして、その最も早い段階で感染を弱めることができる）。本発明のワクチンを単回投与として投与することができるが、その成分を同時に、または異なる時点で一緒に同時投与することもできる（例えば、肺炎球菌糖類コンジュゲートを、別々に、同時に、または互いに関して免疫応答の最適な協調のためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与の１〜２週間後に投与することができる）。同時投与のためには、最適なＴｈ１アジュバントは、異なる投与のいずれか、または全部に存在してもよい。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、糖類または糖類コンジュゲートをＩＭ（またはＩＤ）投与し、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンを、初回用量についてはＩＭで、追加用量についてはＩＮで投与することができる。
【０１１０】
ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には、１〜１００μｇ、必要に応じて、５〜５０μｇの範囲、例えば、５〜２５μｇの範囲にあるであろう。初回のワクチン接種後、被験体は十分に間隔を空けた１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
【０１１１】
ワクチン調製物はＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．＆Ｎｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．（編））（１９９５）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に一般的に記載されている。リポソーム内への封入は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号により記載されている。
【０１１２】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を、溶液中で保存するか、または凍結乾燥することができる。一実施形態において、溶液を、無定形の溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用する糖（例えば、スクロース、トレハロース、グルコース、マンノース、マルトースまたはラクトース）の存在下で凍結乾燥する。一実施形態において、溶液を、無定形の溶解保護剤として作用する糖および改善されたケーキ構造を提供する充填剤（グリシンまたはマンニトール）の存在下で凍結乾燥する。結晶性充填剤の存在により、高塩濃度の存在下で凍結乾燥サイクルを短縮することができる。本発明の免疫原性組成物またはワクチンの凍結乾燥に使用するためのこのような混合物の例としては、スクロース／グリシン、トレハロース／グリシン、グルコース／グリシン、マンノース／グリシン、マルトース／グリシン、スクロース／マンニトール、トレハロース／マンニトール、グルコース／マンニトール、マンノース／マンニトール、およびマルトース／マンニトールが挙げられる。典型的には、２つの成分のモル比は、必要に応じて１：１、１：２、１：３、１：４、１：５または１：６である。本発明の免疫原性組成物は、必要に応じて上記の凍結乾燥試薬を含む。
【０１１３】
上記安定化剤および安定化剤の混合物は、さらに製剤のガラス転移温度（Ｔｇ’）を増大させることができるポリマー、例えば、ポリ（ビニル−ピロリドン）（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルスターチもしくはデキストラン、または結晶性充填剤として作用するポリマー、例えば１５００〜６０００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランを含むことができる。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物を、必要に応じて凍結乾燥し、使用前に即席に再構成させる。凍結乾燥はより安定な組成物（ワクチン）をもたらし、３Ｄ−ＭＰＬの存在下およびアルミニウムに基づくアジュバントの非存在下ではおそらくより高い抗体力価をもたらし得る。
【０１１５】
本発明の一態様においては、必要に応じて、凍結乾燥形態の本発明の免疫原性組成物を含むバイアルを含み、および本明細書に記載のアジュバントを含むバイアルをさらに含むワクチンキットを提供する。本発明のこの態様においては、前記アジュバントを用いて、凍結乾燥された免疫原性組成物を再構成することが想定される。
【０１１６】
本発明はさらに、インフルエンザ菌タンパク質、例えば、コンジュゲートされた形態のタンパク質Ｄの添加により、インフルエンザ菌により引き起こされる中耳炎の予防または軽減のための改良されたワクチンを提供する。さらに、本発明はさらに、本発明の肺炎連鎖球菌コンジュゲート組成物に、遊離タンパク質として、またはコンジュゲートされたタンパク質として１種または２種の肺炎球菌タンパク質を添加することによる、幼児における肺炎球菌感染（例えば、中耳炎）の予防または軽減のための改良されたワクチンを提供する。前記肺炎球菌を含まないタンパク質は、担体タンパク質として用いられる任意の肺炎連鎖球菌タンパク質と同じであるか、または異なっていてもよい。１種以上のモラクセラ・カタラリスタンパク質抗原を、遊離形態またはコンジュゲートされた形態で組合せワクチン中に含有させることもできる。かくして、本発明は、幼児における中耳炎に対する（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。
【０１１７】
別の実施形態においては、本発明は、安全かつ有効な量の本発明のワクチン［小児用ワクチン］を投与することにより、幼児（本発明の文脈においては０〜２歳の年齢と定義される）における（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。本発明のさらなる実施形態は、医学における使用のための本発明の抗原性肺炎連鎖球菌コンジュゲート組成物の提供および肺炎球菌疾患の予防（または治療）のための医薬の製造における本発明の肺炎連鎖球菌コンジュゲートの使用を含む。
【０１１８】
別の実施形態においては、本発明は、必要に応じて、遊離肺炎連鎖球菌タンパク質が担体タンパク質として用いられる任意の肺炎連鎖球菌タンパク質と同じか、または異なるものであってよい、遊離タンパク質またはコンジュゲートされたタンパク質として存在する１種または２種の肺炎連鎖球菌タンパク質と結合させた、安全かつ有効な量の本発明のワクチンを投与することにより、高齢者集団（本発明の文脈においては、患者が５０歳以上の年齢であり、典型的には、５５歳を超える年齢であり、より一般的には、６０歳を超える年齢である場合、高齢者であると考えられる）における（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、免疫防御用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットを宿主に投与することを含む、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法である。
【０１２０】
本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患の治療または予防における使用のための本発明の免疫原性組成物である。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用である。
【０１２２】
本明細書に記載の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、全ての例において、それぞれ、必要に応じて用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」と置換可能であると本発明者らにより意図される。
【０１２３】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書に記載の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、その逆も可能である。
【０１２４】
本特許明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１２５】
本発明をより良好に理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみのためであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１ コンジュゲーションプロセス
７価Ｐｒｅｖｎａｒワクチンを構成する肺炎球菌コンジュゲーションを、国際公開第０６／１１０３８１号に開示されるものと同様の還元的アミノ化プロセスによって各血清型多糖類をＣＲＭ１９７担体タンパク質にコンジュゲーションすることで作製する。ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの全ては７ｖＣＲＭワクチンに存在する。
【０１２７】
Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘは、同じ血清型を７ｖＣＲＭとして含有し、同様に、追加の血清型１、５および７Ｆを含有する。血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆの多糖類を分類不可能なインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄにコンジュゲートし、１８Ｃ多糖類を破傷風トキソイドにコンジュゲートし、１９Ｆ多糖類をジフテリアトキソイドにコンジュゲートする。コンジュゲーション反応では、国際公開第０９／００８２４号に実質的に記載されたシアニル化試薬ＣＤＡＰを使用する。
【０１２８】
血清型１８Ｃを、カルボジイミド化学（ＥＤＡＣ）を使用してＡＤＨリンカーによりコンジュゲートして、ＡＤＨおよびＣＤＡＰ化学を用いて破傷風トキソイドを活性化させて、多糖類１８ＣをＴＴ−ＡＤＨと結合させた。この反応は国際公開第０９／００８２４号に実質的に記載されている。
【０１２９】
実施例１ａ ＣＤＡＰによる肺炎連鎖球菌血清型のコンジュゲーション
２００ｍｇの微小流動化ＰＳ２３Ｆを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るまで、水中に溶解した。ＮａＣｌをこの溶液に最終濃度２Ｍで加えた。十分なＣＤＡＰ溶液（５／５０ｖ／ｖのアセトニトリル／ＷＦＩ中で新たに調製した１００ｍｇ／ｍｌ）を、０．７５ｍｇ／ｍｇのＰＳのＣＤＡＰ：ＰＳ比に到達するまで加えた。９０秒後、ｐＨを０．１ＭのＮａＯＨを添加することでｐＨ９．５まで上昇させた。３分後、十分なＣＲＭ１９７（０．１５ＭのＮａＣＬ中の１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、１．５の比（ＣＲＭ１９７：ＰＳ（ｗ／ｗ））まで到達させ、ｐＨをｐＨ９．５に維持した。この溶液を１時間ｐＨ９．５でインキュベートした。この結合工程の後、１０ｍｌの２Ｍグリシン溶液を混合物に加え、ｐＨをｐＨ９．０（クエンチングｐＨ）に調整した。その溶液を３０分室温にて攪拌した。コンジュゲートを、５μｍフィルターを用いて精製し、その後、小分子およびコンジュゲートされていない多糖類およびタンパク質を除去するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ（ＸＫ５０／１００）を用いて精製した。流速を１５０ｍｌ／時間に固定した。溶出を１５０ｍＭのＮａｃｌを用いて達成した。対象の画分をプールし、Ｍｉｌｉｐａｃｋ２０を用いて濾過した。得られたコンジュゲートは、１．３５／１（ｗ／ｗ）の最終ＣＲＭ１９７／ＰＳ比（ｗ／ｗ）を有した。
【０１３０】
実施例２ ７ｖＣＲＭ１９７（Ｐｒｅｖｎａｒ）ワクチンとＰＨｉＤ−ＣＶ（Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ）ワクチンとを比較する臨床試験データ
７ｖＣＲＭ１９７およびＰＨｉＤ−ＣＶにより肺炎連鎖球菌１９Ｆおよび１９Ａに対して誘発された免疫応答で比較した。両方のワクチンは１９Ｆコンジュゲーションを含有し、その１９Ｆコンジュゲーションは、７ｖＣＲＭ１９７において還元的アミノ化により非毒性ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７にコンジュゲーションされ、ＰＨｉＤ−ＣＶにおいてシアニル化試薬ＣＤＡＰを用いてジフテリアトキソイドとコンジュゲートされる。どちらのワクチンも１９Ａコンジュゲートを含有しないが、１９Ａと１９Ｆとの間の類似する構造により、１９Ｆでの免疫付与後に、１９Ａに対する交差反応性抗体のいくらかの生成を可能にする。
【０１３１】
血清サンプル
３回投与の一次シリーズにおいて幼児に対して投与した７ｖＣＲＭおよびＰＨｉＤ−ＣＶを比較する３つの一次ワクチン研究（００１、０１１および０１２）８−１０からのデータを評価した（一次研究の詳細に関する表１を参照のこと）。各一次研究に関連する追加免疫研究からのデータもまた分析した（００７８，０１７９および０１８）（追加免疫研究の詳細に関する表２を参照のこと）。全ての研究において、血液サンプルを、３回投与の１ヶ月後（一次研究）および追加免疫投与の１ヶ月後（追加投与研究）に回収した。
【０１３２】
免疫アッセイ
血清型１９Ｆおよび関連する血清型１９Ａに対する抗体反応を、ＧＳＫ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより開発された２２Ｆプレインキュベーション工程を用いるＥＬＩＳＡを使用して評価した（ＧＳＫ−２２Ｆ−ＥＬＩＳＡにおいて、異種血清型２２Ｆ多糖類を加えて、非血清型特異的抗体および非オプソニン抗体を除去した）６，７。２２Ｆ阻害ＥＬＩＳＡに関するアッセイ感度は、０．０５μｇ／ｍＬ ｌｇＧであった。機能的抗体反応を、ＨＬ−６０細胞ＷＨＯ参照法の改変を用いるＧＳＫおよびＴＨＬ ＯＰＡアッセイを使用して評価した２，４。ＯＰＡ力価を、コントロールウェルと比較して≧５０％の細菌細胞死を誘導する最低血清希釈の逆数として定義し、≧８の力価（１：８の血清希釈）をこのアッセイの閾値として使用した２，４。加えて、血清型１９Ｆ（Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＫから取得）に対する≧２．０μｇ／ｍＬの抗体濃度を有し、予防接種を受けていない健康な成人（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄから取得）からの血清を、異なる形態の血清型１９Ｆ抗原による結合および阻害に使用した（還元的アミノ化およびシアニル化を用いるコンジュゲートされていない天然多糖類およびコンジュゲートされた１９Ｆ）。
【０１３３】
統計的分析
ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体濃度≧０．２μｇ／ｍＬを有する血清サンプルの割合およびＯＰＡ力価≧８を有する血清サンプルの割合を、９５％信頼区間で計算した。幾何平均ＯＰＡ力価（ＧＭＴ）および幾何平均ＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ比（ＧＭＲ）を計算して、抗体力価値のみと比較して機能活性を評価した。架橋ＧＳＫおよびＴＨＬ ＯＰＡアッセイを実施して、異なる研究所でのＯＰＡ応答における信頼度を評価した。
【０１３４】
結果
少なくとも１つの血清型（１９Ａまたは１９Ｆのいずれか）に関するデータは、ＰＨｉＤ−ＣＶで抗原刺激した７０９人の幼児および７ｖＣＲＭで抗原刺激した３３１人の幼児の合計（表１）、ならびにＰＨｉＤ−ＣＶで追加免疫した６９０人の幼児および７ｖＣＲＭで追加免疫した２９２人の幼児の合計（表２）について利用可能であった。
【０１３５】
免疫原性
血清型１９Ｆ−一次ワクチン接種
３つの一次研究にわたって、血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた９１．３−９２．１％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた８７．７−９９．３％の幼児において達成した（図２）。血清型１９Ｆに関するＯＰＡ ＧＭＴおよびＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ ＧＭＲは、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児よりも高かった（表１）。
【０１３６】
血清型１９Ｆ−追加免疫ワクチン接種
追加免疫研究において、血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた９２．５−９８．５％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた９４．９−１００．０％の幼児において達成した（図２）。血清型１９Ｆに関するＯＰＡ ＧＭＴは、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児よりも高く、ＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ ＧＭＲは、両方のワクチンとも同じ範囲であった（表２）。
【０１３７】
血清型１９Ａ−一次ワクチン接種
交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた０．０−３．４％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた１９．６−２８．７％の幼児において達成した（図３）。血清型１９Ａに関するＯＰＡ ＧＭＴはまた、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児において高かった（表１）。
【０１３８】
血清型１９Ａ−追加免疫ワクチン接種
交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた２４．０−３７．５％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた３７．７−６９．２％の幼児において達成した（図３）。血清型１９Ａに関するＯＰＡ ＧＭＴは、概してＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児において高かった（表２）。
【０１３９】
架橋ＯＰＡアッセイ
１９Ｆ ＯＰＡ結果は、架橋研究において評価する場合、ＧＳＫとＴＨＬとの間で比較可能であるが、ＧＳＫでの１９Ａ ＯＰＡアッセイは反応を過小評価しているように見える。１９Ｆコンジュゲートを免疫付与した子供の有意な割合は、ＧＳＫでは血清反応陰性であるが、ＴＨＬで１９Ａ ＯＰＡに対して血清反応陽性に変わった。
【０１４０】
結論
シアニル化コンジュゲーション化学により調製された１９Ｆ−ＤＴを含有するＰＨｉＤ−ＣＶは、ＯＰＡアッセイにより測定されるように、還元的アミノ化により調製された１９Ｆ−ＣＲＭ１９７を含有する７ｖＣＲＭワクチン接種と比較して、血清型１９Ｆに対する機能的抗体の高いレベルを誘導した。シアニル化−コンジュゲーションを用いて達成された血清型１９Ｆに対する高いＯＰＡ反応もまた、７ｖＣＲＭと比較してＰＨｉＤ−ＣＶについて交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ反応を改善させた。架橋データは、ＧＳＫ １９Ａ ＯＰＡアッセイが血清型１９Ａ ＯＰＡ反応を過小評価していることを示唆している。
【表１】
【表２】
【０１４１】
実施例３ 過ヨード酸塩を使用する２３Ｆおよび６Ｂの酸化
多糖類（ＰＳ）２３Ｆまたは６Ｂを１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４またはＷＦＩ中に溶解して、２ｍｇＰＳ／ｍｌの溶液を形成した。溶液を２時間攪拌しながら室温にてインキュベートした。この時間の後、ｐＨを１ＭＨＣｌでｐＨ６．０に調整した。過ヨード酸塩を粉末形態または液体形態（ＷＦＩ中の１０ｍｇ／ｍｌ）として種々の量で加えて、モル比の範囲を達成した（表３）。その溶液を１７時間室温（２０〜２５℃）にてインキュベートし、この時間の後、サンプルをＷＦＩに対して透析またはジアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。
【０１４２】
屈折率および多角度光錯乱（ＭＡＬＬＳ−Ｄａｗｎ ＥＯＳ）の検出器と結合された高性能ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、Ｚｉｍｍモデルを適用して分子量およびサンプル濃度を測定した。サイズ排除媒体（ＴＳＫ５０００ＰＷＸＬ−Ｔｏｓｏｈ）を使用して、多糖類の分子サイズ分配をプロファイルした（ＮａＣｌ ０．２Ｍ−ＮａＮ３ ０．０２％中で溶出０．５ｍｌ／分）。
【０１４３】
表３および図４はこれらの実験の結果を示している。これらは、２３Ｆ糖類の十分なサイズ変更が、１００ｍＭのリン酸緩衝液中の高モル当量の過ヨード酸塩を用いる酸化で起こることを示している。このサイズ変更の影響は、リン酸緩衝液の濃度を減少させるかまたは用いる過ヨード酸塩のモル当量るを低減させることで低減させることができる。
【表３】
【０１４４】
還元的アミノ化
１ｇのＰＳ２３Ｆを５００ｍｌの１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．１５に溶解した。この溶液を２時間室温にてインキュベートした。ｐＨを１ＭのＨＣｌで６．０Ｍに調整した。１１１ｍｇの過ヨード酸塩（ＮａＩＯ４、０．４モル当量の過ヨード酸塩）をＰＳ２３Ｆ溶液に加え、この溶液を暗所で室温にて１７時間インキュベートして、ＰＳ２３Ｆを酸化させた。次いでこの溶液をＷＦＩ（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２，１０００ｃｍ２）に対してジアフィルターした。
【０１４５】
酸化ＰＳ２３Ｆを、３％スクロース（ｗ／ｖ）の存在下でＣＲＭ１９７タンパク質（ＣＲＭ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）：０．６２５にて）とともに凍結乾燥させた。
【０１４６】
９００ｍｇの凍結乾燥ＰＳ２３Ｆ／ＣＲＭ１９７混合物を、３５０ｍｌのＤＭＳＯ溶媒を添加し、２０℃にて２時間インキュベートすることで可溶化した。ＰＳ２３Ｆ／ＣＲＭ１９７混合物を減少されるために、１モル当量のＮａＢＨ３ＣＮを加えた（１００ｍｇ／ｍｌのＷＦＩ中の７３５μｌの溶液）。その溶液を更に４０時間室温にて攪拌しながらインキュベートした。この時間の後、２モル当量のＮａＢＨ４（ＷＦＩ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、この溶液を４時間室温にてインキュベートした。２２００ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌを加え、その後ジアフィルター（１００ｋＤａをカットオフ）し、ＤＥＡＥ（ＸＫ５０）で精製した。対象の画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１４７】
実施例４ 還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性と、ＣＤＡＰ化学を用いてコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性との比較
モルモットモデルで測定した免疫原性
雌のモルモットに、０．２５μｇのＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを筋肉内に３回（０日目、１４日目、および２８日目にて）免疫付与した。動物を４２日目に出血させ、ＰＳ２３Ｆに対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。結果を図５に示す。
【０１４８】
図５に見られるように、ＣＤＡＰ化学によりコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７よりも還元的アミノ化によりコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７で免疫付与した後に、有意に高い抗体反応がモルモットにおいて誘導された。
【０１４９】
実施例５ 還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされたＰＳ６Ｂ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性と、ＣＤＡＰ化学を用いてコンジュゲートされたＰＳ６Ｂ−ＣＲＭまたはＰＳ６Ｂ−ＰＤコンジュゲートの免疫原性との比較
前臨床研究
４０匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（４週齢）の群に、ＡｌＰＯ４で製剤化された還元的アミノ化またはＣＤＡＰ化学によって生成された０．１μｇのＰＳ６Ｂコンジュゲートを用いて、０日目、１４日目および２８日目にて筋肉内に３回免疫付与した。ＰＳ６Ｂ−ＰＤをベンチマークとして使用した。マウスを４２日目に出血させ、各抗原に対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。
【０１５０】
２０匹の雌のモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙから１５０ｇｒ）の群に、ＡｌＰＯ４にで製剤化された還元的アミノ化またはＣＤＡＰ化学によって生成された０．２５μｇのＰＳ６Ｂコンジュゲートを用いて、０日目、１４日目および２８日目にて筋肉内に３回免疫付与した。ＰＳ６Ｂ−ＰＤをベンチマークとして使用した。モルモットを４２日目に出血させ、各抗原に対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。
【０１５１】
還元的アミノ化により作製した４種の異なるコンジュゲートのＰＳ６Ｂ−ＣＲＭと、ＣＤＡＰを用いて作製した１つを使用した。多糖類を微小流動化して、２つの異なる分子量にした。コンジュゲートの特性は以下のとおりであった：
コンジュゲート ＰＳサイズ ＣＲＭ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２２ ８４ｋＤａ １．０９／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２３ ８４ｋＤａ ３／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２４ ３５０ｋＤａ １．６／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２５ ３５０ｋＤａ ２．９／１
マウスおよびモルモットＯＰＡ
血清サンプルを４５分間５６℃にて加熱して、あらゆる残留する内因性補体を不活性化した。各々の１：２で希釈した血清サンプルの２５マイクロリットルのアリコートを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル当り２５μｌのＯＰＡ緩衝液（ＨＢＳＳ−１４．４％の不活性化ＦＢＳ）で２倍連続希釈した。続いて、例えば、４／２／１の比（ｖ／ｖ／ｖ）で活性化ＨＬ−６０細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）、新たに解凍した肺炎球菌作業種および新たに解凍したベビーウサギの補体の２５μｌの混合物を、希釈した血清に加えて最終濃度を５０μｌとした。アッセイプレートを、軌道振とう（２１０ｒｐｍ）しながら２時間３７℃でインキュベートして、食作用過程を促進させた。反応を、マイクロプレートを氷上に少なくとも１分間置くことで停止した。次いで、プレートの各ウェルの２０μｌのアリコートを、９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、５０μｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ−０．９％寒天を各ウェルに加えた。一晩３７℃、５％ ＣＯ２にてインキュベートした後、寒天上に現れた肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システム（ＫＳ４００，Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカウントした。血清サンプル無しの８個のウェルを、細菌コントロールとして用いて、ウェル当りの肺炎球菌数を決定した。コントロールウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺活性の計算に使用した。血清サンプルについてのＯＰＡ力価を、肺炎球菌数の５０％殺傷を促進できる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン作用力価を、４パラメータ曲線フィッティング分析を用いて計算した。
【表４】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なるコンジュゲーション化学が、免疫原性組成物またはワクチンの異なる成分に使用される、肺炎球菌コンジュゲート免疫原性組成物またはワクチンの分野に関する。還元的アミノ化が少なくとも１種の血清型のコンジュゲーションに使用され、還元的アミノ化以外のコンジュゲーションが異なる血清型のコンジュゲーションに使用される。本発明はまた、かかるワクチンを製造する方法および治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２歳未満の子供は多くの多糖類ワクチンに対する免疫応答を高めないため、タンパク質担体への化学的コンジュゲーションにより多糖類を免疫原性にする必要があった。Ｔ依存的抗原であるタンパク質へのＴ非依存的抗原である多糖類の結合は、該多糖類に対して、アイソタイプスイッチング、親和性成熟、および記憶誘導などのＴ依存性の特性を付与する。
【０００３】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、かなりの罹患率および死亡率（特に、若者および高齢者における）の原因となり、肺炎、菌血症および髄膜炎などの侵襲的疾患、ならびに急性中耳炎などのコロニー形成と関連する疾患を引き起こすグラム陽性細菌である。６０歳を超える人に関する米国における肺炎球菌性肺炎の割合は、１００，０００人あたり３〜８人であると見積もられている。２０％の事例において、これは菌血症、および髄膜炎などの他の兆候をもたらすが、抗生物質治療を行ってもその死亡率は３０％に近い。
【０００４】
肺炎球菌は、血清型特異性を付与する化学的に結合された多糖類の莢膜を有する。９０種の公知の血清型の肺炎球菌が存在し、莢膜は補体から細菌の内部表面を防御するだけでなく、それ自身、免疫原性が低いため、それは肺炎球菌の主要なビルレンス決定因子である。多糖類はＴ非依存的抗原であり、ＭＨＣ分子上で処理または提示されてＴ細胞と相互作用することができない。しかしながら、それらは、Ｂ細胞上の表面受容体の架橋を含む代替的な機構を介して免疫系を刺激することができる。
【０００５】
侵襲性肺炎球菌疾患に対する防御は、莢膜に特異的な抗体と最も強く相関し、その防御は血清型特異的であることが、いくつかの実験において示された。
【０００６】
肺炎連鎖球菌は、幼児および小児における侵襲性細菌疾患および中耳炎の最も一般的な原因である。同様に、高齢者は肺炎球菌ワクチンに対してあまり応答せず［Ｒｏｇｈｍａｎｎら（１９８７），Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：２６５−２７０］、従って、この集団における細菌性肺炎の発生率の上昇をもたらす［ＶｅｒｇｈｅｓｅおよびＢｅｒｋ，（１９８３）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６２：２７１−２８５］。
【０００７】
多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンが開発されている。ＳｙｎｆｌｏｒｉｘがＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓ．ａ．により市販されており、それはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のタンパク質Ｄにコンジュゲートした肺炎球菌血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ多糖類、破傷風トキソイドにコンジュゲートした１８Ｃおよびシアニル化（ＣＤＡＰ）化学によりジフテリアトキソイドにコンジュゲートした１９Ｆを含有する。ＰｒｅｖｅｎａｒがＰｆｉｚｅｒにより市販されており、それは還元的アミノ化化学により無毒性のジフテリア毒素ＣＲＭ１９７にコンジュゲートした肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの全てを含有する（Ｐｒｙｍｕｌａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｒｍａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．ｖａｃｃｉｎｅｓ８；１４７９−１５００（２００９））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｏｇｈｍａｎｎら（１９８７），Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：２６５−２７０
【非特許文献２】ＶｅｒｇｈｅｓｅおよびＢｅｒｋ，（１９８３）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６２：２７１−２８５
【非特許文献３】Ｐｒｙｍｕｌａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｒｍａｎ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．ｖａｃｃｉｎｅｓ８；１４７９−１５００（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、複数の血清型肺炎連鎖球菌多糖類コンジュゲートワクチンの改良された製剤を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、異なるコンジュゲーション法を用いてコンジュゲートされている異なる肺炎球菌血清型由来の糖類を組み合わせることによって達成され得る。このように、最適なコンジュゲーション法は、糖類エピトープの最適な提示を可能にするコンジュゲーション法を用いて各血清型が提示できる異なる血清型に関して選択される。いくつかの肺炎球菌糖類は、還元的アミノ化を用いて他の肺炎球菌糖類に十分にコンジュゲートするが、異なるコンジュゲーション法により、環構造を壊さないままにでき、より良い結果を提供することができる。還元的アミノ化またはより効果的な免疫原性組成物を開発できる他のコンジュゲーション法のいずれかを用いて、その糖類の選択を最適に実施する。
【００１１】
したがって、少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含む免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学により直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】多糖類−タンパク質コンジュゲートの調製。
【００１３】
Ａ）７ｖＣＲＭにおいて、１９Ｆ多糖類は還元的アミノ化により無毒性ジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされる。（１）過ヨウ素酸塩による酸化により末端反応性アルデヒドが導入される。（２）還元的アミノ化によるＣＲＭ１９７担体タンパク質に対する結合により六糖環が分解し、開裂する。（３）コンジュゲーヨン後、新規の免疫原性エピトープが六糖環に対する新規の基の結合に起因して生成され得る。
【００１４】
Ｂ）ＰＨｉＤ−ＣＶにおいて、１９Ｆ多糖類はシアニル化化学によりジフテリアトキソイドにコンジュゲートされる。１９Ｆは化学的に活性化されて、シアン酸塩基をヒドロキシル基に導入し、タンパク質成分の添加後にアミノまたはヒドラジド基に対する共有結合を形成する。シアニル化コンジュゲーション後、六糖環はインタクトなままであり、他の化学基は結合できない。
【図２】ＰＨｉＤ−ＣＶまたは７ｖＣＲＭ一次免疫およびブースター免疫後の肺炎球菌血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を達成する幼児の割合。明るいバーはＰＨｉＤ−ＣＶについての結果を示し、暗いバーは７ｖＣＲＭについての結果を示す。エラーバーは９５％信頼限界を表す。
【図３】ＰＨｉＤ−ＣＶまたは７ｖＣＲＭ一次免疫およびブースター免疫後肺炎球菌血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を達成する幼児の割合。明るいバーはＰＨｉＤＣ−ＣＶについての結果を示し、暗いバーは７ｖＣＲＭについての結果を示す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。
【図４】過ヨウ素酸塩処理後の２３Ｆおよび６Ｂ多糖類のサイズ。三角で示したラインは１０ｍＭリン酸緩衝液中の６Ｂのサイズを示し、ダイヤモンドのラインマーカーは１０ｍＭリン酸緩衝液中の２３Ｆのサイズを示し、四角で示したラインは１００ｍＭリン酸緩衝液中の２３Ｆのサイズを示す。
【図５】ＣＤＡＰまたは還元的アミノ化コンジュゲーションのいずれかを用いる２３Ｆコンジュゲートの免疫原性の比較。
【図６】還元的アミノ化またはＣＤＡＰによって作製された６Ｂコンジュゲートのマウスにおける免疫原性の比較。グラフは、還元的アミノ化（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ１２２−１２５）によって作製された４種のコンジュゲートおよびＣＤＡＰ（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ００３およびＰＳ０６Ｂ−ＰＤ）によって作製された２種のＥＬＩＳＡ力価を示す。ＯＰＡの結果は以下に示す。
【図７】還元的アミノ化またはＣＤＡＰによって作製された６Ｂコンジュゲートのモルモットにおける免疫原性の比較。グラフは、還元的アミノ化（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ１２２−１２５）によって作製された４種のコンジュゲートおよびＣＤＡＰ（ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ００３およびＰＳ０６Ｂ−ＰＤ）によって作製された２種のＥＬＩＳＡ力価を示す。ＯＰＡの結果は以下に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学により直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、還元的アミノ化以外の化学によりタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる。一実施形態において、１９Ｆは還元的アミノ化以外の化学により担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００１７】
必要に応じて、血清型１、３、１９Ａまたは１９Ｆ由来の莢膜糖は、この基のさらなるメンバーが還元的アミノ化以外の方法を用いてコンジュゲートしているならば、還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされる。
【００１８】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＣＤＡＰ化学などのシアニル化化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖を含んでなる。一実施形態において、１９ＦはＣＤＡＰ化学により担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００１９】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ、１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆまたは１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖を含んでなる。
【００２０】
本発明の一実施形態において、以下の肺炎連鎖球菌莢膜糖またはそれらの群は、担体タンパク質に還元的アミノ化によってコンジュゲートされる：血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃまたは２３Ｆ、４および５、４および６Ａ、４および６Ｂ、４および７Ｆ、４および９Ｖ、４および１４、４および１８Ｃ、４および２３Ｆ、５および６Ａ、５および６Ｂ、５および７Ｆ、５および９Ｖ、５および１４、５および１８Ｃ、５および２３Ｆ、６Ａおよび６Ｂ、６Ａおよび７Ｆ、６Ａおよび９Ｖ、６Ａおよび１４、６Ａおよび１８Ｃ、６Ａおよび２３Ｆ、６Ｂおよび７Ｆ、６Ｂおよび９Ｖ、６Ｂおよび１４、６Ｂおよび１８Ｃ、６Ｂおよび２３Ｆ、７Ｆおよび９Ｖ、７Ｆおよび１４、７Ｆおよび１８Ｃ、７Ｆおよび２３Ｆ、９Ｖおよび１４、９Ｖおよび１８Ｃ、９Ｖおよび２３Ｆ、１４および１８Ｃ、１４および２３Ｆまたは１８Ｃおよび２３Ｆ。一実施形態において、２３Ｆは還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２１】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型２３由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２２】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ｂ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２３】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ａ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、血清型１９Ｆ由来の肺炎球菌多糖は、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされるのに対して、血清型６Ｃ由来の肺炎球菌多糖は、還元的アミノ化化学によって担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２５】
本発明の一実施形態において、異なる血清型由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌糖類は、還元的アミノ化化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００２６】
還元的アミノ化化学をコンジュゲートするために使用する場合、肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、必要に応じて０．１〜１．２、０．１〜０．５、０．１〜０．２、０．５〜０．８、０．１〜０．８、０．３〜１．０または０．４〜０．９モル当量の過ヨウ素酸塩を用いて酸化されて活性化糖を形成する。必要に応じて過ヨウ素酸塩処理工程は、アミン基を含有しない緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液およびクエン酸塩緩衝液中で実施される。一実施形態において、緩衝液は無機緩衝液である。一実施形態において、緩衝液はリン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液である。本発明者らは、還元的アミノ化プロセスの酸化工程の条件をコントロールすることによって、得られたコンジュゲートが糖のサイズおよび／または免疫原性を有利に保持し得ることを示している。
【００２７】
一実施形態において、緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液は、１〜１００ｍＭ、５〜８０ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、１０〜４０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、５〜１５ｍＭ、８〜１２ｍＭ、１０〜１２ｍＭ、５〜２０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、約１０ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度を有する。一実施形態において、緩衝液のｐＨはｐＨ５．０〜７．０、ｐＨ５．５〜６．５、ｐＨ５．８〜６．３または約ｐＨ６．０である。
【００２８】
「過ヨウ素酸塩」という用語は過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む。この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４−）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６５−）の両方を含むが、しかしながら１つの特定の実施形態において、本発明の方法に使用される過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸塩である。「過ヨウ素酸塩」という用語はまた、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムを含む過ヨウ素酸塩の種々の塩を含む。抗原が過ヨウ素酸塩と反応する場合、過ヨウ素酸塩は近接のヒドロキシル基を酸化して、カルボニルまたはアルデヒド基を形成し、Ｃ−Ｃ結合の開裂を生じる。この理由のために、「抗原を過ヨウ素酸塩と反応させる」という用語は、過ヨウ素酸塩による近接のヒドロキシル基の酸化を含み、例えばその反応はシスまたはトランスの近接のジオールの酸化を含んでもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、異なる血清型由来の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、ＣＤＡＰ化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００３０】
本発明の一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類は、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣ化学を用いて担体タンパク質にコンジュゲートされる。
【００３１】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される担体タンパク質を含有する。
【００３２】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、少なくともまたは正確に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖血清型に別々にコンジュゲートされる２、３、４、５、６または７種の異なる担体タンパク質を含有する。必要に応じて、これらの担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される。
【００３３】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１を含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌溶血素またはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖３を含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖４を含む。
【００３６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖５を含む。
【００３７】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ｂを含む。
【００３８】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖７Ｆを含む。
【００３９】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖９Ｖを含む。
【００４０】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１４を含む。
【００４１】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖２３Ｆを含む。
【００４２】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１８Ｃを含む。
【００４３】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖１９Ａを含む。
【００４４】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７またはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖２２Ｆを含む。
【００４５】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤまたはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ａを含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤまたはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖６Ｃを含む。
【００４７】
本明細書を通して用いられる用語「糖類」は、多糖類またはオリゴ糖を示し、その両方を含んでもよい。多糖類を細菌から単離し、公知の方法（例えば欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号）ならびに必要に応じて微小流動化によりある程度までサイズを変えることができる。多糖類をサイズ変更して、多糖類サンプル中での粘度を減少させ、および／または結合産物に関する濾過性を改善することができる。オリゴ糖は少数の反復単位（典型的には、５〜３０個の反復単位）を有し、典型的には加水分解された多糖類である。
【００４８】
肺炎連鎖球菌の莢膜多糖類は、最大で８個の糖残基を含んでもよい反復オリゴ糖単位を含む。重要な肺炎連鎖球菌血清型のオリゴ糖単位の概説については、ＪＯＮＥＳ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ａｎ．Ａｃａｄ．Ｂｒａｓ．Ｃｉｅｎｃ．，Ｊｕｎｅ ２００５，ｖｏｌ．７７，ｎｏ．２，ｐ．２９３−３２４．Ｔａｂｌｅ ＩＩ ＩＳＳＮ ０００１−３７６５を参照のこと。一実施形態においては、莢膜糖類抗原は完全長多糖類であってよいが、他の実施形態においては、それは１個のオリゴ糖単位、または天然の長さの糖鎖の反復オリゴ糖単位よりも短いものであってよい。一実施形態においては、前記ワクチン中に存在する全ての糖類は多糖類である。完全長多糖類を「サイズ変更する」ことができる、すなわち、酸加水分解処理、過酸化水素処理、オリゴ糖断片を作製するためのｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（登録商標）、次いで過酸化水素処理によるサイズ変更または微小流動化などの様々な方法により、そのサイズを低下させることができる。
【００４９】
本発明者らはまた、当業界の焦点はコンジュゲート製造を容易にするためにオリゴ糖を用いることであったことに留意した。本発明者らは、天然の、もしくはわずかにサイズ変更された多糖類コンジュゲートを用いることにより、１個以上の以下の利点を実現することができることを見出した：１）濾過可能である高い免疫原性を有するコンジュゲート、２）コンジュゲート中の多糖類とタンパク質の比率を、コンジュゲート中の多糖類とタンパク質の比率（ｗ／ｗ）を増加させることができるように変化させることができる（担体抑制効果に対する効果を有し得る）、３）加水分解を受けやすい免疫原性コンジュゲートを、コンジュゲーションのためにより大きい糖類の使用により安定化することができる。より大きい多糖類の使用は、コンジュゲート担体とのより多い架橋をもたらし、コンジュゲートからの遊離糖類の遊離を低下させることができる。従来技術において記載されたコンジュゲートワクチンは、コンジュゲーションを改善するためにコンジュゲーションの前に多糖類を脱重合させる傾向がある。本発明者らは、より大きいサイズの糖類を保持する糖類コンジュゲートワクチンが、肺炎球菌疾患に対する良好な免疫応答を提供することができることを見出した。
【００５０】
かくして、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲーション前の各糖類の平均サイズ（例えば、重量平均分子量；Ｍｗ）が、８０ｋＤａ、１００ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａまたは１０００ｋＤａを超えるものである、１種以上の糖類コンジュゲートを含んでもよい。一実施形態においては、コンジュゲーション後のコンジュゲートは、濾過前のサンプルと比較して、濾過後に５０、６０、７０、８０、９０または９５％を超える収率が得られるように、０．２μｍのフィルターを通して容易に濾過可能であるべきである。
【００５１】
本発明の目的のために、「天然多糖類」とは、その目的が糖類のサイズを低下させることであるプロセスにかけられていない糖類を指す。多糖類は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに低下することになってもよい。そのような糖類は依然として天然である。多糖類がサイズ変更技術にかけられた場合にのみ、この多糖類は天然でないと考えられる。天然多糖類のサイズは、例えば、２５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、４００〜１，５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、５００〜１，０００ｋＤａ、または１，０００〜１，５００ｋＤａであり、当業者により理解されるように、異なる血清型は異なるサイズの天然多糖類を有する。
【００５２】
本発明の目的のために、「最大でｘ２の因子によりサイズ変更される」とは、前記糖類が、該糖類のサイズを低下させるが、天然多糖類のサイズの半分を超えるサイズを保持するように意図されたプロセスにかけられることを意味する。ｘ３、ｘ４などは同じように解釈される、すなわち、前記糖類が、該多糖類のサイズを低下させるが、天然多糖類のサイズの１／３、１／４などを超えるサイズを保持するように意図されたプロセスにかけられると解釈される。
【００５３】
本発明の一態様においては、前記免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１０種の血清型に由来する肺炎連鎖球菌糖類であって、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９種もしくはそれぞれの肺炎連鎖球菌糖類が天然多糖類である、前記糖類を含む。
【００５４】
本発明の一態様においては、前記免疫原性組成物は、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１０種の血清型に由来する肺炎連鎖球菌糖類であって、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれぞれの肺炎連鎖球菌糖類が最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５、ｘ６、ｘ７、ｘ８、ｘ９またはｘ１０の因子によりサイズ変更される、前記糖類を含む。この態様の一実施形態においては、大部分の糖類、例えば、６、７、８種以上の糖類が最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５、ｘ６、ｘ７、ｘ８、ｘ９またはｘ１０の因子によりサイズ変更される。
【００５５】
本明細書に記載の糖類の分子量または平均分子量とは、コンジュゲーションの前に測定され、ＭＡＬＬＳにより測定される糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）を指す。
【００５６】
ＭＡＬＬＳ技術は当業界でよく知られており、典型的には、実施例２に記載のように実行される。肺炎球菌糖類のＭＡＬＬＳ分析のためには、２個のカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）を組合わせて使用し、糖類を水中に溶出させる。光散乱検出器（例えば、４８８ｎｍの１０ｍＷのアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）および干渉屈折計（例えば、Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて糖類を検出する。
【００５７】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類は天然多糖類または通常の抽出プロセスの間にサイズが低下した天然多糖類である。
【００５８】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類を、機械的切断により、例えば、微小流動化または超音波処理によりサイズ変更する。微小流動化および超音波処理は、濾過可能なコンジュゲートを提供するために、より大きい天然多糖類のサイズを十分に低下させる利点を有する。サイズ変更は、ｘ２０、ｘ１０、ｘ８、ｘ６、ｘ５、ｘ４、ｘ３またはｘ２以下の因子による。
【００５９】
一実施形態においては、前記免疫原性組成物は、天然多糖類と、ｘ２０以下の因子によりサイズ変更された糖類との混合物から作製された肺炎連鎖球菌コンジュゲートを含む。この実施形態の一態様においては、大部分の前記糖類、例えば、６、７、８種以上の糖類を、最大でｘ２、ｘ３、ｘ４、ｘ５またはｘ６の因子によりサイズ変更する。
【００６０】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１００ｋＤａを超える、例えば１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１４０〜１６０ｋＤａの平均サイズの１９Ａ糖類を含む。一実施形態においては、１９Ａを、微小流動化により、例えば最大ｘ２、ｘ３、ｘ４またはｘ５以下の因子によりわずかにサイズ変更する。一実施形態においては、１９Ａコンジュゲートの糖類用量は、１〜１０μｇ、１〜５μｇまたは１〜３μｇの糖類、必要に応じて３μｇの糖類である。
【００６１】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は２２Ｆ糖類コンジュゲートを含み、２２Ｆ糖類の平均サイズは１００ｋＤａを超え、必要に応じて１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１５０〜１７０ｋＤａである。一実施形態においては、２２Ｆ糖類を、微小流動化により、例えば最大ｘ２、ｘ３、ｘ４またはｘ５以下の因子によりサイズ変更する。一実施形態においては、１９Ａコンジュゲートの糖類用量は、１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類、必要に応じて３μｇの糖類である。
【００６２】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は複数の糖類コンジュゲートを含み、該糖類の平均サイズは５０ｋＤａを超える。一実施形態においては、血清型１糖類の平均サイズは３００〜４００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型４糖類の平均サイズは７５〜１２５ｋＤａである。一実施形態においては、血清型５糖類の平均サイズは３５０〜４５０ｋＤａである。一実施形態においては、血清型６Ｂ糖類の平均サイズは１０００〜１４００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型７Ｆ糖類の平均サイズは２００〜３００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型９Ｖ糖類の平均サイズは２５０〜３００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型１４糖類の平均サイズは２００〜２５０ｋＤａである。一実施形態においては、血清型２３Ｆ糖類の平均サイズは９００〜１０００ｋＤａである。一実施形態においては、血清型５；６Ａ、６Ｂ；２３Ｆ；５および６Ａ；５および６Ｂ、５および２３Ｆ、６Ａおよび６Ｂ、６Ａおよび２３Ｆ；６Ｂおよび２３Ｆ；５、６Ａおよび６Ｂ；５、６Ａおよび２３Ｆ；５、６Ｂおよび２３Ｆまたは５、６Ａ、６Ｂおよび２３Ｆは、天然サイズの糖類としてコンジュゲートされる、すなわちプロセスに含まれる特定用途のサイズ変更工程を有さない。
【００６３】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物の莢膜糖類コンジュゲートの糖類用量は１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類／コンジュゲートである。例えば、該組成物は３μｇの糖類／コンジュゲートの用量で血清型４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２２Ｆ（および必要に応じて１９Ａ）のコンジュゲートを含む。例えば、本発明の免疫原性組成物は１μｇの糖類／コンジュゲートの用量で血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ（ならびに必要に応じて６Ａおよび／または３）のコンジュゲートを含む。
【００６４】
一実施形態においては、肺炎連鎖球菌糖類を、リンカー、例えば、二官能性リンカーを介して担体タンパク質にコンジュゲートさせる。このリンカーは必要に応じて、例えば、１個の反応性アミノ基および１個の反応性カルボン酸基、２個の反応性アミノ基または２個の反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性である。前記リンカーは、例えば、４〜２０、４〜１２、５〜１０個の炭素原子を有する。可能性のあるリンカーは、ＡＤＨである。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（国際公開第００／１０５９９）、ニトロフェニル−エチルアミン（Ｇｅｖｅｒら（１９７９）Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５；１７１−２８８）、ハロゲン化ハロアルキル（米国特許第４０５７６８５号）、グリコシド結合（米国特許第４，６７３，５７４号、米国特許第４，８０８，７００号）、ヘキサンジアミンおよび６−アミノカプロン酸（米国特許第４，４５９，２８６号）が挙げられる。一実施形態においては、血清型１８Ｃに由来する糖類をコンジュゲートさせるためのリンカーとしてＡＤＨを用いる。
【００６５】
本発明の免疫原性組成物中に存在する糖類コンジュゲートを、任意の公知のカップリング技術により調製することができる。コンジュゲーション方法は、シアン酸エステルを形成する１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）による糖類の活性化に依存し得る。かくして、活性化された糖類を、担体タンパク質上のアミノ基に、直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介して結合させることができる。例えば、スペーサーは、マレイミドにより活性化される担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］もしくはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢ、もしくはＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体に結合させることができるチオール化多糖類を与えるシスタミンまたはシステアミンであってよい。必要に応じて、シアン酸エステル（必要に応じて、ＣＤＡＰ化学により作製される）を、ヘキサンジアミンまたはＡＤＨと結合させ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介するカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用いて担体タンパク質に結合させる。そのようなコンジュゲートはＰＣＴ公開出願である国際公開第９３／１５７６０号 Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙならびに国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号に記載されている。
【００６６】
他の好適な技術は、カルボジイミド、カルビイニド（ｃａｒｂｉｉｎｉｄｅ）、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７９，２５４；２５７２−４，Ｈｅａｒｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９８１．２１８；５０９−１８）、次いで、タンパク質との反応によりカルバメート結合を形成させることにより形成することができるカルボニルリンカーを含んでもよい。これは、一次ヒドロキシル基へのアノマー末端の還元、必要に応じて、ＣＤＩカルバメート中間体を形成する一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの一次ヒドロキシル基の反応の保護／脱保護およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
【００６７】
前記コンジュゲートを、米国特許第４，３６５，１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４，６７３，５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記載の直接的還元的アミノ化方法により調製することもできる。他の方法は、ＥＰ−０−１６１−１８８、ＥＰ−２０８３７５およびＥＰ−０−４７７５０８に記載されている。
【００６８】
さらなる方法は、例えば、ＥＤＡＣを用いる、カルボジイミド縮合（Ｃｈｕ Ｃ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９８３ ２４５ ２５６）による、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）で誘導体化されたシアノゲンブロミド（もしくはＣＤＡＰ）活性化糖類の、タンパク質担体へのカップリングを含む。
【００６９】
一実施形態においては、糖類上のヒドロキシル基（必要に応じて、活性化されたヒドロキシル基、例えば、シアン酸エステルを作るために活性化された［例えば、ＣＤＡＰを用いて］ヒドロキシル基）を、タンパク質上のアミノ基またはカルボキシル基に、直接的または間接的（リンカーを介して）に連結する。リンカーが存在する場合、必要に応じて、糖類上のヒドロキシル基を、例えば、ＣＤＡＰコンジュゲーションを用いることにより、リンカー上のアミノ基に連結する。リンカー（例えば、ＡＤＨ）中のさらなるアミノ基を、例えば、カルボジイミド化学を用いることにより、例えば、ＥＤＡＣを用いることにより、タンパク質上のカルボン酸基に結合させることができる。一実施形態においては、肺炎球菌莢膜糖類を、最初にリンカーに結合させた後、リンカーを担体タンパク質に結合させる。あるいは、リンカーを担体に結合させた後、糖類に結合させることができる。
【００７０】
いくつかの糖類−タンパク質コンジュゲートをＣＤＡＰにより、およびいくつかを還元的アミノ化により調製する、技術の組合せを用いてもよい。
【００７１】
一般的には、タンパク質担体上の以下の型の化学基をカップリング／コンジュゲーションに用いることができる。
【００７２】
Ａ）カルボキシル基（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を介する）。一実施形態においては、この基を糖類上のアミノ基に直接的に、またはカルボジイミド化学、例えば、ＥＤＡＣを用いてリンカー上のアミノ基に連結する。
【００７３】
Ｂ）アミノ基（例えば、リジンを介する）。一実施形態においては、この基を、糖類上のカルボキシル基に直接的に、またはカルボジイミド化学、例えば、ＥＤＡＣを用いてリンカー上のカルボキシル基に連結する。別の実施形態においては、この基を、糖類上のＣＤＡＰもしくはＣＮＢｒで活性化されたヒドロキシル基に直接的に、またはリンカー上のそのような基に；アルデヒド基を有する糖類もしくはリンカーに；スクシンイミドエステル基を有する糖類もしくはリンカーに連結する。
【００７４】
Ｃ）スルフヒドリル基（例えば、システインを介する）。一実施形態においては、この基を、マレイミド化学を用いて、ブロモもしくはクロロアセチル化糖類またはリンカーに連結する。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７５】
Ｄ）ヒドロキシル基（例えば、チロシンを介する）。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７６】
Ｅ）イミダゾリル基（例えば、ヒスチジンを介する）。一実施形態においては、この基を、ビスジアゾベンズイジンを用いて活性化／改変する。
【００７７】
Ｆ）グアニジル基（例えば、アルギニンを介する）。
【００７８】
Ｇ）インドリル基（例えば、トリプトファンを介する）。
【００７９】
糖類上で、一般的には以下の基をカップリングのために用いることができる：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２。アルデヒド基を、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当業界で公知の様々な処理の後に生成することができる。
【００８０】
直接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ −−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ−−−−＞Ｓｃｈｉｆｆ塩基＋ＮａＣＮＢＨ３−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート。
【００８１】
スペーサー（リンカー）を介する間接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＮＨ２−−−−＞糖類−−−−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質、または、例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の改変）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ−−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−＞糖類−−−−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質、または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の改変後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の改変）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−−＞糖類−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート。
【００８２】
注記：上記のＥＤＡＣの代わりに、任意の好適なカルボジイミドを用いることができる。
【００８３】
まとめると、糖類とのカップリングに一般的に用いることができるタンパク質担体化学基の型は、アミノ基（例えば、リジン残基上の）、ＣＯＯＨ基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基上の）ならびにＳＨ基（利用可能である場合）（例えば、システイン残基上の）である。
【００８４】
必要に応じて、担体タンパク質と肺炎連鎖球菌糖類の比率は、１：５〜５：１、１：２〜２．５：１、１：１〜２：１（ｗ／ｗ）である。一実施形態においては、多数のコンジュゲート、例えば、６、７、８、９種以上のコンジュゲートは、１：１より大きい、例えば、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１または１．６：１（ｗ／ｗ）である担体タンパク質と糖類の比率を有する。
【００８５】
一実施形態においては、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌糖類を、ＣＤＡＰおよびＥＤＡＣを用いてリンカーを介して担体タンパク質に結合させる。例えば、１８Ｃを、上記のようにＣＤＡＰおよびＥＤＡＣを用いてリンカー（例えば、ＡＤＨなどのその末端に２個のヒドラジノ基を有するもの）を介してタンパク質に結合させることができる。リンカーを用いる場合、ＣＤＡＰを用いて、リンカーに糖類を結合させた後、ＥＤＡＣを用いてリンカーをタンパク質に結合させるか、またはあるいは、ＥＤＡＣを用いて最初にリンカーをタンパク質に結合させた後、ＣＤＡＰを用いてリンカーを糖類に結合させることができる。
【００８６】
一般的には、本発明の免疫原性組成物は、０．１〜２０μｇ、１〜１０μｇまたは１〜３μｇの糖類の各糖類コンジュゲートの用量を含んでもよい。
【００８７】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、０．１〜２０μｇ；０．５〜１０μｇ；０．５〜５μｇまたは１〜３μｇの糖類の用量のそれぞれの肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含む。一実施形態においては、莢膜糖類は、様々な用量で存在してもよく、例えば、いくつかの莢膜糖類は約１μｇもしくは正確に１μｇの用量で存在してもよく、またはいくつかの莢膜糖類は約３μｇもしくは正確に３μｇの用量で存在してもよい。一実施形態においては、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）に由来する糖類は、他の糖類よりも高い用量で存在する。この実施形態の一態様においては、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）は約３μｇもしくは正確に３μｇの用量で存在するが、免疫原性組成物中の他の糖類は約１μｇもしくは正確に１μｇの用量で存在する。
【００８８】
「約」または「ほぼ」は、本発明の目的のためには、与えられた数値の１０％多いまたは少ない範囲内と定義される。
【００８９】
一実施形態においては、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を、担体タンパク質に直接結合させる。必要に応じて、少なくとも１種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を、ＣＤＡＰにより直接結合させる。一実施形態においては、多数の莢膜糖類、例えば、５、６、７、８、９種以上の莢膜糖類を、ＣＤＡＰにより担体タンパク質に直接連結する（国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号を参照されたい）。
【００９０】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１種以上のコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質を含む。一実施形態においては、肺炎連鎖球菌タンパク質は、コンジュゲートされていない形態で付加される。例えばそれは組成物中の遊離タンパク質として存在する。
【００９１】
一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質、解毒した肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３からなる群より選択される。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素および／またはＰｈｔＤを含有する。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤおよびＳｐ１２８を含有する。例えば、その組成物は解毒した肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤおよびＳｐ１３０を含有する。
【００９２】
Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアド）ファミリーは、タンパク質ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、およびＰｈｔＥを含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域により分離された２つのドメインおよびおそらく、金属もしくはヌクレオシド結合または酵素活性に関与する、いくつかのヒスチジントライアド、（３−５）コイルドコイル領域、保存されたＮ末端ならびに異種性Ｃ末端を特徴とする。それは試験した全ての株の肺炎球菌に存在する。他の連鎖球菌およびナイセリア菌においては、相同タンパク質も見出された。本発明の一実施形態においては、本発明のＰｈｔタンパク質はＰｈｔＤである。しかしながら、用語「ＰｈｔＡ、Ｂ、ＤおよびＥ」は、以下に記載の引用物に開示された配列を有するタンパク質ならびに参照タンパク質と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然の（および人工の）変異体を指すことが理解される。必要に応じて、それは少なくとも９５％同一であり、または少なくとも９７％同一である。
【００９３】
ＰｈｔＸタンパク質に関して、ＰｈｔＡは国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ３６とも呼ばれる。それはポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、ＬＸＸＣのＩＩ型シグナルモチーフを有する。ＰｈｔＤは国際公開第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも呼ばれる。上記のように、それもポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。ＰｈｔＢは国際公開第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも呼ばれる。ＰｈｔＢファミリーの別のメンバーは、国際公開第００／１７３７０号に開示されたＣ３−分解ポリペプチドである。このタンパク質もポリヒスチジントライアドファミリーに由来し、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。例えば免疫学的に機能的な等価物は、国際公開第９８／１８９３０号に開示されたタンパク質Ｓｐ４２である。ＰｈｔＢトランケート（約７９ｋＤ）は国際公開第９９／１５６７５号に開示されており、ＰｈｔＸファミリーのメンバーであるとも考えられる。ＰｈｔＥは国際公開第００／３０２９９号に開示されており、ＢＶＨ−３とも呼ばれる。本明細書で任意のＰｈｔタンパク質に言及する場合、それはＰｈｔタンパク質の免疫原性断片またはその融合物を用いることができることを意味する。例えば、ＰｈｔＸに対する参照は、任意のＰｈｔタンパク質に由来する免疫原性断片またはその融合物を含む。ＰｈｔＤまたはＰｈｔＢに対する参照はまた、例えば、国際公開第０１９８３３４号に見出されるように、ＰｈｔＤＥまたはＰｈｔＢＥ融合体に対する参照でもある。
【００９４】
肺炎球菌溶血素は、異なる細胞溶解活性（溶血活性）および補体活性化活性を有する多機能毒素である（Ｒｕｂｉｎｓら、Ａｍ．Ｒｅｓｐｉ．Ｃｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１５３：１３３９−１３４６（１９９６））。この毒素は肺炎球菌によって分泌されないが、それは自己溶解素の影響下での肺炎球菌の溶解の際に放出される。その効果としては、例えば、ヒト単球による炎症性サイトカインの産生、ヒト気道上皮上での繊毛の脈動の阻害、ならびに好中球の殺菌活性および移動の低下が挙げられる。肺炎球菌溶血素の最も明らかな効果は、赤血球の溶解におけるものであり、それはコレステロールへの結合を含む。それは毒素であるため、それを解毒する必要があり（すなわち、防御にとって好適な用量で提供された場合、ヒトに対して非毒性的である）、その後、インビボで投与することができる。野生型または天然の肺炎球菌溶血素の発現およびクローニングは当業界で公知である。例えば、Ｗａｌｋｅｒら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，５５：１１８４−１１８９（１９８７））、Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１００７：６７−７２（１９８９））およびＭｉｔｃｈｅｌｌら（ＮＡＲ，１８：４０１０（１９９０））を参照されたい。ｐｌｙの解毒を、化学的手段により、例えば、ホルマリンもしくはグルタルアルデヒド処理または両方の組合せにかけることにより行うことができる（国際公開第０４０８１５１５号、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）。そのような方法は、様々な毒素について当業界でよく知られている。あるいは、ｐｌｙを遺伝的に解毒することができる。かくして、本発明は、例えば、突然変異タンパク質であってよい、肺炎球菌タンパク質の誘導体を包含する。本明細書で用いられる用語「突然変異された」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発などのよく知られた技術または任意の他の従来方法を用いて、１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換を受けた分子を意味する。例えば、上記のように、突然変異ｐｌｙタンパク質を、それがその免疫原性エピトープを維持しながら、生物学的に不活性であるように変化させることができ、例えば、国際公開第９０／０６９５１号、Ｂｅｒｒｙら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６７：９８１−９８５（１９９９））、国際公開第９９／０３８８４号および国際公開第１０／７１９８６号を参照されたい。遺伝子的に解毒した肺炎球菌溶血素は、国際公開第１０／７１９８６号に記載されているようにアミノ酸６５（スレオニン）、２９３（グリシン）および／または４２８（システイン）において点突然変異を含有し得る。
【００９５】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｐｌｙ」とは医学的使用にとって好適な突然変異されるか、または解毒された（すなわち、非毒性的である）肺炎球菌溶血素を指すことが理解される。
【００９６】
コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）に関しては、そのファミリーのメンバーは元々、コリンアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる肺炎球菌タンパク質として同定されたものである。コリン結合タンパク質は全部、細胞壁のテイコ酸および膜に結合したリポテイコ酸のホスホリルコリン部分に非共有結合している。構造的に、それらはファミリー全体に渡って一般的にいくつかの領域を有するが、このタンパク質の正確な性質（アミノ酸配列、長さなど）は変化してもよい。一般的には、コリン結合タンパク質は、Ｎ末端領域（Ｎ）、保存された反復領域（Ｒ１および／もしくはＲ２）、プロリンに富む領域（Ｐ）ならびに該タンパク質の約半分を含む、複数の反復からなる、保存されたコリン結合領域（Ｃ）を含む。本明細書で用いられるように、用語「コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）」は、国際公開第９７／４１１５１号に同定されたコリン結合タンパク質、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧからなる群より選択される。ＣｂｐＡは国際公開第９７／４１１５１号に開示されている。ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧは国際公開第００／２９４３４号に開示されている。ＰｓｐＣは国際公開第９７／０９９９４号に開示されている。ＰｂｃＡは国際公開第９８／２１３３７号に開示されている。ＳｐｓＡは国際公開第９８／３９４５０号に開示されたコリン結合タンパク質である。必要に応じて、コリン結合タンパク質を、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群より選択する。
【００９７】
本発明の実施形態は、「ＣｂｐＸ」が上記に定義されたものであり、「トランケート」がコリン結合領域（Ｃ）の５０％以上を欠くＣｂｐＸタンパク質を指す、ＣｂｐＸトランケートを含む。必要に応じて、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。必要に応じて、そのようなタンパク質トランケートは、（ｉ）コリン結合領域および（ｉｉ）該タンパク質のＮ末端の半分の部分を欠き、ならびに少なくとも１個の反復領域（Ｒ１またはＲ２）を保持する。必要に応じて、該トランケートは、２個の反復領域（Ｒ１およびＲ２）を有する。そのような実施形態の例は、国際公開第９９／５１２６６号または国際公開第９９／５１１８８号に例示されたＮＲ１ｘＲ２およびＲ１ｘＲ２であるが、同様のコリン結合領域を欠く他のコリン結合タンパク質も本発明の範囲内に意図される。
【００９８】
ＬｙｔＸファミリーは、細胞溶解に関連する膜結合タンパク質である。そのＮ末端ドメインはコリン結合ドメインを含むが、ＬｙｔＸファミリーは上記のＣｂｐＡファミリーに認められる全ての特徴を有さず、かくして、本発明については、ＬｙｔＸファミリーはＣｂｐＸファミリーとは異なると考えられる。ＣｂｐＸファミリーとは対照的に、Ｃ末端ドメインは、ＬｙｔＸタンパク質ファミリーの触媒ドメインを含む。前記ファミリーは、ＬｙｔＡ、ＢおよびＣを含む。ＬｙｔＸファミリーに関して、ＬｙｔＡはＲｏｎｄａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６４：６２１−６２４（１９８７）に開示されている。ＬｙｔＢは国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ４６とも呼ばれる。ＬｙｔＣも国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、Ｓｐ９１とも呼ばれる。本発明の実施形態はＬｙｔＣを含む。
【００９９】
別の実施形態は、「ＬｙｔＸ」が上記に定義され、「トランケート」がコリン結合領域の５０％以上を欠くＬｙｔＸタンパク質を指す、ＬｙｔＸトランケートを含む。必要に応じて、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。本発明のさらに別の実施形態は、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質（または融合物）を含む。必要に応じて、これはＣｂｐＸのＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）およびＬｙｔＸ（例えば、ＬｙｔＣＣｔｅｒｍまたはＳｐ９１Ｃｔｅｒｍ）のＣ末端部分（Ｃｔｅｒｍ、すなわち、コリン結合ドメインを欠く）を含む。必要に応じて、ＣｂｐＸを、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群より選択する。必要に応じて、それはＣｂｐＡである。必要に応じて、ＬｙｔＸはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも呼ばれる）である。本発明の別の実施形態は、コリン結合ドメイン（Ｃ）を欠くＰｓｐＡまたはＰｓａＡトランケートであり、ＬｙｔＸとの融合タンパク質として発現される。必要に応じて、ＬｙｔＸはＬｙｔＣである。
【０１００】
ＰｓａＡおよびＰｓｐＡに関しては、両方とも当業界で公知である。例えば、ＰｓａＡおよびその膜貫通欠失変異体は、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ｐａｔｏｎ，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６Ｄｅｃ；６４（１２）：５２５５−６２により記載されている。ＰｓｐＡおよびその膜貫通欠失変異体は、例えば、米国特許第５，８０４，１９３号、国際公開第９２／１４４８８号、および国際公開第９９／５３９４０号に開示されている。
【０１０１】
Ｓｐ１２８およびＳｐ１３０は、国際公開第００／７６５４０号に開示されている。Ｓｐ１２５は、ＬＰＸＴＧ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質の例である。このモチーフを有するこのクラスの肺炎球菌表面タンパク質内の任意のタンパク質は、本発明の状況内で有用であることがわかっており、従って、本発明のさらなるタンパク質であると考えられる。Ｓｐ１２５自体は、国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、ＺｍｐＢ（亜鉛メタロプロテイナーゼ）としても知られる。Ｓｐ１０１は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（それは参照番号ｙ８５９９３を有する）。それはＩ型シグナル配列を特徴とする。Ｓｐ１３３は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（それは参照番号ｙ８５９９２を有する）。それもＩ型シグナル配列を特徴とする。
【０１０２】
組合せワクチン（特に、中耳炎の予防のための）に含有させることができるモラクセラ・カタラリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）タンパク質抗原の例は、ＯＭＰ１０６［国際公開第９７／４１７３１号（Ａｎｔｅｘ）および国際公開第９６／３４９６０号（ＰＭＣ）］；ＯＭＰ２１またはその断片（国際公開第００１８９１０号）；ＬｂｐＡおよび／またはＬｂｐＢ［国際公開第９８／５５６０６号（ＰＭＣ）］；ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［国際公開第９７／１３７８５号および国際公開第９７／３２９８０号（ＰＭＣ）］；ＣｏｐＢ［Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２００３−２０１０］；ＵｓｐＡ１および／またはＵｓｐＡ２［国際公開第９３／０３７６１号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）］；ＯｍｐＣＤ；ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）；ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）；ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１４６８）；ｌｉｐｏ０６（ＧＢ９９１７９７７．２）；ｌｉｐｏ１０（ＧＢ９９１８２０８．１）；ｌｉｐｏ１１（ＧＢ９９１８３０２．２）；ｌｉｐｏ１８（ＧＢ９９１８０３８．２）；Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３０３８）；Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）；ＯｍｐｌＡ１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）；Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）；ならびにＯｍｐＥである。組合せワクチン（特に、中耳炎の予防のための）に含有させることができる非分類性インフルエンザ菌抗原またはその断片の例としては、フィンブリンタンパク質［（米国特許第５，７６６，６０８号−Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）］およびそれに由来するペプチドを含む融合物［例えば、ＬＢ１（ｆ）ペプチド融合物；米国特許第５，８４３，４６４号（ＯＳＵ）もしくは国際公開第９９／６４０６７］；ＯＭＰ２６［国際公開第９７／０１６３８（Ｃｏｒｔｅｃｓ）］；Ｐ６［ＥＰ２８１６７３（Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］；ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ；Ｈｉａ；Ｈｓｆ；Ｈｉｎ４７；Ｈｉｆ；Ｈｍｗ１；Ｈｍｗ２；Ｈｍｗ３；Ｈｍｗ４；Ｈａｐ；Ｄ１５（国際公開第９４／１２６４１号）；Ｐ２；ならびにＰ５（国際公開第９４／２６３０４号）が挙げられる。
【０１０３】
本発明のタンパク質を有益に混合することもできる。混合するとは、免疫原性組成物が、担体タンパク質として、または遊離タンパク質として、または２つの混合物として、以下の組合せ内に由来する全てのタンパク質を含むことを意味する。例えば、本明細書の以後に記載する２つのタンパク質の組合せにおいては、両タンパク質を担体タンパク質として用いるか、または両タンパク質を遊離タンパク質として存在させるか、または両方を担体として、および遊離タンパク質として存在させるか、または一方を担体タンパク質および遊離タンパク質として存在させるが、他方を担体タンパク質としてのみ、もしくは遊離タンパク質としてのみ存在させるか、または一方を担体タンパク質として存在させ、他方を遊離タンパク質として存在させることができる。３種のタンパク質の組合せを与える場合、同様の可能性が存在する。組合せとしては、限定されるものではないが、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃｔｅｒｍキメラもしくは融合タンパク質、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃｔｅｒｍキメラもしくは融合タンパク質、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、Ｒ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡが挙げられる。必要に応じて、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣに由来する。必要に応じて、それはＣｂｐＡに由来するものである。他の組合せとしては、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２＋Ｐｌｙ、およびＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤなどの３種のタンパク質の組合せが挙げられる。一実施形態においては、前記ワクチン組成物は、担体タンパク質として解毒された肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはＰｈｔＤＥを含む。さらなる実施形態においては、前記ワクチン組成物は、遊離タンパク質として解毒された肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはＰｈｔＤＥを含む。
【０１０４】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物と薬学上許容される賦形剤とを含んでなるワクチンを提供する。
【０１０５】
本発明のワクチンを、特に、幼児集団における使用だけでなく、高齢者集団における使用について意図される場合、アジュバント化してもよい。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲルもしくはリン酸アルミニウムもしくはミョウバンなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、マグネシウム、鉄もしくは亜鉛のものなどの他の金属塩であってもよく、またはアシル化チロシン、もしくはアシル化糖、陽イオン的もしくは陰イオン的に誘導体化された糖類、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【０１０６】
前記アジュバントをＴＨ１型の応答の優先的な誘導因子であるように選択する。そのような高レベルのＴｈ１型サイトカインは所与の抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を好む傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは該抗原に対する体液性免疫応答の誘導を好む傾向がある。
【０１０７】
Ｔｈ１およびＴｈ２型免疫応答の区別は絶対的ではない。現実には、個体は主にＴｈ１または主にＴｈ２であると記載される免疫応答を支援するであろう。しかしながら、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．およびＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７，ｐ１４５−１７３））によりマウスＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンにおいて記載されたことに関してサイトカインのファミリーを考慮することが都合がよいことが多い。伝統的には、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦγおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連する。Ｔｈ１型免疫応答の誘導と直接関連することが多い他のサイトカイン、例えば、ＩＬ−１２などは、Ｔ細胞によっては産生されない。対照的に、Ｔｈ２型応答はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連する。主にＴｈ１応答を促進する好適なアジュバント系としては、モノホスホリルリピドＡもしくはその誘導体（もしくは一般的には解毒されたリピドＡ−例えば、国際公開第２００５１０７７９８号を参照されたい）、特に、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製については、ＧＢ２２２０２１１ Ａを参照されたい）；ならびにモノホスホリルリピドＡ、必要に応じて、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）または水中油乳濁液との組合せが挙げられる。そのような組合せにおいては、抗原と３Ｄ−ＭＰＬを、同じ粒子状構造中に含有させ、抗原および免疫刺激シグナルのより効率的な送達を可能にする。３Ｄ−ＭＰＬがミョウバンに吸着された抗原の免疫原性をさらに増強することができることが研究により示された［Ｔｈｏｅｌｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）１６：７０８−１４；ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］。
【０１０８】
増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、国際公開第９４／００１５３号に開示されたＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＱＳ２１が国際公開第９６／３３７３９号に開示されたコレステロールでクエンチされた反応性の低い組成物を含む。水中油乳濁液中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤が、国際公開第９５／１７２１０号に記載されている。一実施形態においては、前記免疫原性組成物はさらに、ＱＳ２１であってよいサポニンを含む。前記製剤はまた、水中油乳濁液およびトコフェロールを含んでもよい（国際公開第９５／１７２１０号）。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（国際公開第９６／０２５５５号）および他の免疫調節オリゴヌクレオチド（国際公開第０２２６７５７号および国際公開第０３５０７８２２号）も、ＴＨ１応答の優先的な誘導因子であり、本発明における使用にとって好適である。
【０１０９】
本発明の免疫原性組成物を含むワクチン調製物を用いて、全身または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することにより、感染に罹りやすい哺乳動物を防御または治療することができる。これらの投与としては、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、皮内（ＩＤ）もしくは皮下（ＳＣ）経路を介する注入；または経口／消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与が挙げられる。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻内（ＩＮ）投与が可能である（肺炎球菌の鼻咽頭運搬をより効率的に防止し、かくして、その最も早い段階で感染を弱めることができる）。本発明のワクチンを単回投与として投与することができるが、その成分を同時に、または異なる時点で一緒に同時投与することもできる（例えば、肺炎球菌糖類コンジュゲートを、別々に、同時に、または互いに関して免疫応答の最適な協調のためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与の１〜２週間後に投与することができる）。同時投与のためには、最適なＴｈ１アジュバントは、異なる投与のいずれか、または全部に存在してもよい。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を用いてもよい。例えば、糖類または糖類コンジュゲートをＩＭ（またはＩＤ）投与し、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンを、初回用量についてはＩＭで、追加用量についてはＩＮで投与することができる。
【０１１０】
ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には、１〜１００μｇ、必要に応じて、５〜５０μｇの範囲、例えば、５〜２５μｇの範囲にあるであろう。初回のワクチン接種後、被験体は十分に間隔を空けた１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
【０１１１】
ワクチン調製物はＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ．Ｆ．＆Ｎｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．（編））（１９９５）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に一般的に記載されている。リポソーム内への封入は、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４，２３５，８７７号により記載されている。
【０１１２】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を、溶液中で保存するか、または凍結乾燥することができる。一実施形態において、溶液を、無定形の溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として作用する糖（例えば、スクロース、トレハロース、グルコース、マンノース、マルトースまたはラクトース）の存在下で凍結乾燥する。一実施形態において、溶液を、無定形の溶解保護剤として作用する糖および改善されたケーキ構造を提供する充填剤（グリシンまたはマンニトール）の存在下で凍結乾燥する。結晶性充填剤の存在により、高塩濃度の存在下で凍結乾燥サイクルを短縮することができる。本発明の免疫原性組成物またはワクチンの凍結乾燥に使用するためのこのような混合物の例としては、スクロース／グリシン、トレハロース／グリシン、グルコース／グリシン、マンノース／グリシン、マルトース／グリシン、スクロース／マンニトール、トレハロース／マンニトール、グルコース／マンニトール、マンノース／マンニトール、およびマルトース／マンニトールが挙げられる。典型的には、２つの成分のモル比は、必要に応じて１：１、１：２、１：３、１：４、１：５または１：６である。本発明の免疫原性組成物は、必要に応じて上記の凍結乾燥試薬を含む。
【０１１３】
上記安定化剤および安定化剤の混合物は、さらに製剤のガラス転移温度（Ｔｇ’）を増大させることができるポリマー、例えば、ポリ（ビニル−ピロリドン）（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルスターチもしくはデキストラン、または結晶性充填剤として作用するポリマー、例えば１５００〜６０００の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランを含むことができる。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物を、必要に応じて凍結乾燥し、使用前に即席に再構成させる。凍結乾燥はより安定な組成物（ワクチン）をもたらし、３Ｄ−ＭＰＬの存在下およびアルミニウムに基づくアジュバントの非存在下ではおそらくより高い抗体力価をもたらし得る。
【０１１５】
本発明の一態様においては、必要に応じて、凍結乾燥形態の本発明の免疫原性組成物を含むバイアルを含み、および本明細書に記載のアジュバントを含むバイアルをさらに含むワクチンキットを提供する。本発明のこの態様においては、前記アジュバントを用いて、凍結乾燥された免疫原性組成物を再構成することが想定される。
【０１１６】
本発明はさらに、インフルエンザ菌タンパク質、例えば、コンジュゲートされた形態のタンパク質Ｄの添加により、インフルエンザ菌により引き起こされる中耳炎の予防または軽減のための改良されたワクチンを提供する。さらに、本発明はさらに、本発明の肺炎連鎖球菌コンジュゲート組成物に、遊離タンパク質として、またはコンジュゲートされたタンパク質として１種または２種の肺炎球菌タンパク質を添加することによる、幼児における肺炎球菌感染（例えば、中耳炎）の予防または軽減のための改良されたワクチンを提供する。前記肺炎球菌を含まないタンパク質は、担体タンパク質として用いられる任意の肺炎連鎖球菌タンパク質と同じであるか、または異なっていてもよい。１種以上のモラクセラ・カタラリスタンパク質抗原を、遊離形態またはコンジュゲートされた形態で組合せワクチン中に含有させることもできる。かくして、本発明は、幼児における中耳炎に対する（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。
【０１１７】
別の実施形態においては、本発明は、安全かつ有効な量の本発明のワクチン［小児用ワクチン］を投与することにより、幼児（本発明の文脈においては０〜２歳の年齢と定義される）における（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。本発明のさらなる実施形態は、医学における使用のための本発明の抗原性肺炎連鎖球菌コンジュゲート組成物の提供および肺炎球菌疾患の予防（または治療）のための医薬の製造における本発明の肺炎連鎖球菌コンジュゲートの使用を含む。
【０１１８】
別の実施形態においては、本発明は、必要に応じて、遊離肺炎連鎖球菌タンパク質が担体タンパク質として用いられる任意の肺炎連鎖球菌タンパク質と同じか、または異なるものであってよい、遊離タンパク質またはコンジュゲートされたタンパク質として存在する１種または２種の肺炎連鎖球菌タンパク質と結合させた、安全かつ有効な量の本発明のワクチンを投与することにより、高齢者集団（本発明の文脈においては、患者が５０歳以上の年齢であり、典型的には、５５歳を超える年齢であり、より一般的には、６０歳を超える年齢である場合、高齢者であると考えられる）における（防御）免疫応答を誘起するための改良された方法である。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、免疫防御用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットを宿主に投与することを含む、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患に対してヒト宿主を免疫する方法である。
【０１２０】
本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患の治療または予防における使用のための本発明の免疫原性組成物である。
【０１２１】
本発明のさらなる態様は、肺炎連鎖球菌および必要に応じて、インフルエンザ菌の感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための医薬の製造における、本発明の免疫原性組成物またはワクチンまたはキットの使用である。
【０１２２】
本明細書に記載の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、全ての例において、それぞれ、必要に応じて用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」と置換可能であると本発明者らにより意図される。
【０１２３】
本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書に記載の実施形態は、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態にも適用可能であり、その逆も可能である。
【０１２４】
本特許明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１２５】
本発明をより良好に理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のみのためであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２６】
実施例１ コンジュゲーションプロセス
７価Ｐｒｅｖｎａｒワクチンを構成する肺炎球菌コンジュゲーションを、国際公開第０６／１１０３８１号に開示されるものと同様の還元的アミノ化プロセスによって各血清型多糖類をＣＲＭ１９７担体タンパク質にコンジュゲーションすることで作製する。ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの全ては７ｖＣＲＭワクチンに存在する。
【０１２７】
Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘは、同じ血清型を７ｖＣＲＭとして含有し、同様に、追加の血清型１、５および７Ｆを含有する。血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆの多糖類を分類不可能なインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄにコンジュゲートし、１８Ｃ多糖類を破傷風トキソイドにコンジュゲートし、１９Ｆ多糖類をジフテリアトキソイドにコンジュゲートする。コンジュゲーション反応では、国際公開第０９／００８２４号に実質的に記載されたシアニル化試薬ＣＤＡＰを使用する。
【０１２８】
血清型１８Ｃを、カルボジイミド化学（ＥＤＡＣ）を使用してＡＤＨリンカーによりコンジュゲートして、ＡＤＨおよびＣＤＡＰ化学を用いて破傷風トキソイドを活性化させて、多糖類１８ＣをＴＴ−ＡＤＨと結合させた。この反応は国際公開第０９／００８２４号に実質的に記載されている。
【０１２９】
実施例１ａ ＣＤＡＰによる肺炎連鎖球菌血清型のコンジュゲーション
２００ｍｇの微小流動化ＰＳ２３Ｆを、１０ｍｇ／ｍｌの濃度を得るまで、水中に溶解した。ＮａＣｌをこの溶液に最終濃度２Ｍで加えた。十分なＣＤＡＰ溶液（５／５０ｖ／ｖのアセトニトリル／ＷＦＩ中で新たに調製した１００ｍｇ／ｍｌ）を、０．７５ｍｇ／ｍｇのＰＳのＣＤＡＰ：ＰＳ比に到達するまで加えた。９０秒後、ｐＨを０．１ＭのＮａＯＨを添加することでｐＨ９．５まで上昇させた。３分後、十分なＣＲＭ１９７（０．１５ＭのＮａＣＬ中の１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、１．５の比（ＣＲＭ１９７：ＰＳ（ｗ／ｗ））まで到達させ、ｐＨをｐＨ９．５に維持した。この溶液を１時間ｐＨ９．５でインキュベートした。この結合工程の後、１０ｍｌの２Ｍグリシン溶液を混合物に加え、ｐＨをｐＨ９．０（クエンチングｐＨ）に調整した。その溶液を３０分室温にて攪拌した。コンジュゲートを、５μｍフィルターを用いて精製し、その後、小分子およびコンジュゲートされていない多糖類およびタンパク質を除去するＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ（ＸＫ５０／１００）を用いて精製した。流速を１５０ｍｌ／時間に固定した。溶出を１５０ｍＭのＮａｃｌを用いて達成した。対象の画分をプールし、Ｍｉｌｉｐａｃｋ２０を用いて濾過した。得られたコンジュゲートは、１．３５／１（ｗ／ｗ）の最終ＣＲＭ１９７／ＰＳ比（ｗ／ｗ）を有した。
【０１３０】
実施例２ ７ｖＣＲＭ１９７（Ｐｒｅｖｎａｒ）ワクチンとＰＨｉＤ−ＣＶ（Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ）ワクチンとを比較する臨床試験データ
７ｖＣＲＭ１９７およびＰＨｉＤ−ＣＶにより肺炎連鎖球菌１９Ｆおよび１９Ａに対して誘発された免疫応答で比較した。両方のワクチンは１９Ｆコンジュゲーションを含有し、その１９Ｆコンジュゲーションは、７ｖＣＲＭ１９７において還元的アミノ化により非毒性ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７にコンジュゲーションされ、ＰＨｉＤ−ＣＶにおいてシアニル化試薬ＣＤＡＰを用いてジフテリアトキソイドとコンジュゲートされる。どちらのワクチンも１９Ａコンジュゲートを含有しないが、１９Ａと１９Ｆとの間の類似する構造により、１９Ｆでの免疫付与後に、１９Ａに対する交差反応性抗体のいくらかの生成を可能にする。
【０１３１】
血清サンプル
３回投与の一次シリーズにおいて幼児に対して投与した７ｖＣＲＭおよびＰＨｉＤ−ＣＶを比較する３つの一次ワクチン研究（００１、０１１および０１２）８−１０からのデータを評価した（一次研究の詳細に関する表１を参照のこと）。各一次研究に関連する追加免疫研究からのデータもまた分析した（００７８，０１７９および０１８）（追加免疫研究の詳細に関する表２を参照のこと）。全ての研究において、血液サンプルを、３回投与の１ヶ月後（一次研究）および追加免疫投与の１ヶ月後（追加投与研究）に回収した。
【０１３２】
免疫アッセイ
血清型１９Ｆおよび関連する血清型１９Ａに対する抗体反応を、ＧＳＫ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより開発された２２Ｆプレインキュベーション工程を用いるＥＬＩＳＡを使用して評価した（ＧＳＫ−２２Ｆ−ＥＬＩＳＡにおいて、異種血清型２２Ｆ多糖類を加えて、非血清型特異的抗体および非オプソニン抗体を除去した）６，７。２２Ｆ阻害ＥＬＩＳＡに関するアッセイ感度は、０．０５μｇ／ｍＬ ｌｇＧであった。機能的抗体反応を、ＨＬ−６０細胞ＷＨＯ参照法の改変を用いるＧＳＫおよびＴＨＬ ＯＰＡアッセイを使用して評価した２，４。ＯＰＡ力価を、コントロールウェルと比較して≧５０％の細菌細胞死を誘導する最低血清希釈の逆数として定義し、≧８の力価（１：８の血清希釈）をこのアッセイの閾値として使用した２，４。加えて、血清型１９Ｆ（Ｄｒ．Ｄａｖｉｄ Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＫから取得）に対する≧２．０μｇ／ｍＬの抗体濃度を有し、予防接種を受けていない健康な成人（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄから取得）からの血清を、異なる形態の血清型１９Ｆ抗原による結合および阻害に使用した（還元的アミノ化およびシアニル化を用いるコンジュゲートされていない天然多糖類およびコンジュゲートされた１９Ｆ）。
【０１３３】
統計的分析
ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ抗体濃度≧０．２μｇ／ｍＬを有する血清サンプルの割合およびＯＰＡ力価≧８を有する血清サンプルの割合を、９５％信頼区間で計算した。幾何平均ＯＰＡ力価（ＧＭＴ）および幾何平均ＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ比（ＧＭＲ）を計算して、抗体力価値のみと比較して機能活性を評価した。架橋ＧＳＫおよびＴＨＬ ＯＰＡアッセイを実施して、異なる研究所でのＯＰＡ応答における信頼度を評価した。
【０１３４】
結果
少なくとも１つの血清型（１９Ａまたは１９Ｆのいずれか）に関するデータは、ＰＨｉＤ−ＣＶで抗原刺激した７０９人の幼児および７ｖＣＲＭで抗原刺激した３３１人の幼児の合計（表１）、ならびにＰＨｉＤ−ＣＶで追加免疫した６９０人の幼児および７ｖＣＲＭで追加免疫した２９２人の幼児の合計（表２）について利用可能であった。
【０１３５】
免疫原性
血清型１９Ｆ−一次ワクチン接種
３つの一次研究にわたって、血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた９１．３−９２．１％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた８７．７−９９．３％の幼児において達成した（図２）。血清型１９Ｆに関するＯＰＡ ＧＭＴおよびＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ ＧＭＲは、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児よりも高かった（表１）。
【０１３６】
血清型１９Ｆ−追加免疫ワクチン接種
追加免疫研究において、血清型１９Ｆに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた９２．５−９８．５％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた９４．９−１００．０％の幼児において達成した（図２）。血清型１９Ｆに関するＯＰＡ ＧＭＴは、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児よりも高く、ＯＰＡ／ＥＬＩＳＡ ＧＭＲは、両方のワクチンとも同じ範囲であった（表２）。
【０１３７】
血清型１９Ａ−一次ワクチン接種
交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた０．０−３．４％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた１９．６−２８．７％の幼児において達成した（図３）。血清型１９Ａに関するＯＰＡ ＧＭＴはまた、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児において高かった（表１）。
【０１３８】
血清型１９Ａ−追加免疫ワクチン接種
交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ力価≧８を、７ｖＣＲＭを受けた２４．０−３７．５％の幼児と比較して、ＰＨｉＤ−ＣＶを受けた３７．７−６９．２％の幼児において達成した（図３）。血清型１９Ａに関するＯＰＡ ＧＭＴは、概してＰＨｉＤ−ＣＶを受けた幼児において高かった（表２）。
【０１３９】
架橋ＯＰＡアッセイ
１９Ｆ ＯＰＡ結果は、架橋研究において評価する場合、ＧＳＫとＴＨＬとの間で比較可能であるが、ＧＳＫでの１９Ａ ＯＰＡアッセイは反応を過小評価しているように見える。１９Ｆコンジュゲートを免疫付与した子供の有意な割合は、ＧＳＫでは血清反応陰性であるが、ＴＨＬで１９Ａ ＯＰＡに対して血清反応陽性に変わった。
【０１４０】
結論
シアニル化コンジュゲーション化学により調製された１９Ｆ−ＤＴを含有するＰＨｉＤ−ＣＶは、ＯＰＡアッセイにより測定されるように、還元的アミノ化により調製された１９Ｆ−ＣＲＭ１９７を含有する７ｖＣＲＭワクチン接種と比較して、血清型１９Ｆに対する機能的抗体の高いレベルを誘導した。シアニル化−コンジュゲーションを用いて達成された血清型１９Ｆに対する高いＯＰＡ反応もまた、７ｖＣＲＭと比較してＰＨｉＤ−ＣＶについて交差反応性血清型１９Ａに対するＯＰＡ反応を改善させた。架橋データは、ＧＳＫ １９Ａ ＯＰＡアッセイが血清型１９Ａ ＯＰＡ反応を過小評価していることを示唆している。
【表１】
【表２】
【０１４１】
実施例３ 過ヨード酸塩を使用する２３Ｆおよび６Ｂの酸化
多糖類（ＰＳ）２３Ｆまたは６Ｂを１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４またはＷＦＩ中に溶解して、２ｍｇＰＳ／ｍｌの溶液を形成した。溶液を２時間攪拌しながら室温にてインキュベートした。この時間の後、ｐＨを１ＭＨＣｌでｐＨ６．０に調整した。過ヨード酸塩を粉末形態または液体形態（ＷＦＩ中の１０ｍｇ／ｍｌ）として種々の量で加えて、モル比の範囲を達成した（表３）。その溶液を１７時間室温（２０〜２５℃）にてインキュベートし、この時間の後、サンプルをＷＦＩに対して透析またはジアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。
【０１４２】
屈折率および多角度光錯乱（ＭＡＬＬＳ−Ｄａｗｎ ＥＯＳ）の検出器と結合された高性能ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して、Ｚｉｍｍモデルを適用して分子量およびサンプル濃度を測定した。サイズ排除媒体（ＴＳＫ５０００ＰＷＸＬ−Ｔｏｓｏｈ）を使用して、多糖類の分子サイズ分配をプロファイルした（ＮａＣｌ ０．２Ｍ−ＮａＮ３ ０．０２％中で溶出０．５ｍｌ／分）。
【０１４３】
表３および図４はこれらの実験の結果を示している。これらは、２３Ｆ糖類の十分なサイズ変更が、１００ｍＭのリン酸緩衝液中の高モル当量の過ヨード酸塩を用いる酸化で起こることを示している。このサイズ変更の影響は、リン酸緩衝液の濃度を減少させるかまたは用いる過ヨード酸塩のモル当量るを低減させることで低減させることができる。
【表３】
【０１４４】
還元的アミノ化
１ｇのＰＳ２３Ｆを５００ｍｌの１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．１５に溶解した。この溶液を２時間室温にてインキュベートした。ｐＨを１ＭのＨＣｌで６．０Ｍに調整した。１１１ｍｇの過ヨード酸塩（ＮａＩＯ４、０．４モル当量の過ヨード酸塩）をＰＳ２３Ｆ溶液に加え、この溶液を暗所で室温にて１７時間インキュベートして、ＰＳ２３Ｆを酸化させた。次いでこの溶液をＷＦＩ（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２，１０００ｃｍ２）に対してジアフィルターした。
【０１４５】
酸化ＰＳ２３Ｆを、３％スクロース（ｗ／ｖ）の存在下でＣＲＭ１９７タンパク質（ＣＲＭ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）：０．６２５にて）とともに凍結乾燥させた。
【０１４６】
９００ｍｇの凍結乾燥ＰＳ２３Ｆ／ＣＲＭ１９７混合物を、３５０ｍｌのＤＭＳＯ溶媒を添加し、２０℃にて２時間インキュベートすることで可溶化した。ＰＳ２３Ｆ／ＣＲＭ１９７混合物を減少されるために、１モル当量のＮａＢＨ３ＣＮを加えた（１００ｍｇ／ｍｌのＷＦＩ中の７３５μｌの溶液）。その溶液を更に４０時間室温にて攪拌しながらインキュベートした。この時間の後、２モル当量のＮａＢＨ４（ＷＦＩ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、この溶液を４時間室温にてインキュベートした。２２００ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌを加え、その後ジアフィルター（１００ｋＤａをカットオフ）し、ＤＥＡＥ（ＸＫ５０）で精製した。対象の画分をプールし、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【０１４７】
実施例４ 還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性と、ＣＤＡＰ化学を用いてコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性との比較
モルモットモデルで測定した免疫原性
雌のモルモットに、０．２５μｇのＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを筋肉内に３回（０日目、１４日目、および２８日目にて）免疫付与した。動物を４２日目に出血させ、ＰＳ２３Ｆに対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。結果を図５に示す。
【０１４８】
図５に見られるように、ＣＤＡＰ化学によりコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７よりも還元的アミノ化によりコンジュゲートされたＰＳ２３Ｆ−ＣＲＭ１９７で免疫付与した後に、有意に高い抗体反応がモルモットにおいて誘導された。
【０１４９】
実施例５ 還元的アミノ化を用いてコンジュゲートされたＰＳ６Ｂ−ＣＲＭコンジュゲートの免疫原性と、ＣＤＡＰ化学を用いてコンジュゲートされたＰＳ６Ｂ−ＣＲＭまたはＰＳ６Ｂ−ＰＤコンジュゲートの免疫原性との比較
前臨床研究
４０匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（４週齢）の群に、ＡｌＰＯ４で製剤化された還元的アミノ化またはＣＤＡＰ化学によって生成された０．１μｇのＰＳ６Ｂコンジュゲートを用いて、０日目、１４日目および２８日目にて筋肉内に３回免疫付与した。ＰＳ６Ｂ−ＰＤをベンチマークとして使用した。マウスを４２日目に出血させ、各抗原に対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。
【０１５０】
２０匹の雌のモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙから１５０ｇｒ）の群に、ＡｌＰＯ４にで製剤化された還元的アミノ化またはＣＤＡＰ化学によって生成された０．２５μｇのＰＳ６Ｂコンジュゲートを用いて、０日目、１４日目および２８日目にて筋肉内に３回免疫付与した。ＰＳ６Ｂ−ＰＤをベンチマークとして使用した。モルモットを４２日目に出血させ、各抗原に対する抗体反応をＥＬＩＳＡおよびＯＰＡにより測定した。
【０１５１】
還元的アミノ化により作製した４種の異なるコンジュゲートのＰＳ６Ｂ−ＣＲＭと、ＣＤＡＰを用いて作製した１つを使用した。多糖類を微小流動化して、２つの異なる分子量にした。コンジュゲートの特性は以下のとおりであった：
コンジュゲート ＰＳサイズ ＣＲＭ／ＰＳ比（ｗ／ｗ）
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２２ ８４ｋＤａ １．０９／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２３ ８４ｋＤａ ３／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２４ ３５０ｋＤａ １．６／１
ＰＳ０６Ｂ−ＣＲＭ １２５ ３５０ｋＤａ ２．９／１
マウスおよびモルモットＯＰＡ
血清サンプルを４５分間５６℃にて加熱して、あらゆる残留する内因性補体を不活性化した。各々の１：２で希釈した血清サンプルの２５マイクロリットルのアリコートを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル当り２５μｌのＯＰＡ緩衝液（ＨＢＳＳ−１４．４％の不活性化ＦＢＳ）で２倍連続希釈した。続いて、例えば、４／２／１の比（ｖ／ｖ／ｖ）で活性化ＨＬ−６０細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）、新たに解凍した肺炎球菌作業種および新たに解凍したベビーウサギの補体の２５μｌの混合物を、希釈した血清に加えて最終濃度を５０μｌとした。アッセイプレートを、軌道振とう（２１０ｒｐｍ）しながら２時間３７℃でインキュベートして、食作用過程を促進させた。反応を、マイクロプレートを氷上に少なくとも１分間置くことで停止した。次いで、プレートの各ウェルの２０μｌのアリコートを、９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、５０μｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈ−０．９％寒天を各ウェルに加えた。一晩３７℃、５％ ＣＯ２にてインキュベートした後、寒天上に現れた肺炎球菌コロニーを、自動化画像分析システム（ＫＳ４００，Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカウントした。血清サンプル無しの８個のウェルを、細菌コントロールとして用いて、ウェル当りの肺炎球菌数を決定した。コントロールウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺活性の計算に使用した。血清サンプルについてのＯＰＡ力価を、肺炎球菌数の５０％殺傷を促進できる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン作用力価を、４パラメータ曲線フィッティング分析を用いて計算した。
【表４】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学によって直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物。
【請求項２】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型４由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型５由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型６Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型６Ｂ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型７Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型９Ｖ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１４由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１８Ｃ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型６Ｂおよび２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型６Ｂおよび２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスが、シアニル化反応、例えばＣＤＡＰ化学である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
２種の異なる担体タンパク質が、少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
３種の異なる担体タンパク質が、少なくとも３種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
４種の異なる担体タンパク質が、少なくとも４種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
５種の異なる担体タンパク質が、少なくとも５種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１を含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌溶血素もしくはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類３を含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類４を含んでなる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類５を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類６Ｂを含んでなる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類７Ｆを含んでなる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類９Ｖを含んでなる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１４をさらに含んでなる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類２３Ｆを含んでなる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１８Ｃを含んでなる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
肺炎球菌溶血素またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１９Ａを含んでなる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
ＣＲＭ１９７もしくはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質の断片にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類２２Ｆを含んでなる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤもしくはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類６Ａを含んでなる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
血清型１莢膜糖類が担体タンパク質に直接コンジュゲートされる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
血清型１莢膜糖類がリンカーによって担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記リンカーがマレイミドを含有する、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記リンカーが、必要に応じてＥＤＡＣを用いるカルボジイミド化学によって糖類に結合される、請求項４７または４８に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記血清型１糖類が、マレイミド化学を用いて担体タンパク質またはリンカーにコンジュゲートされる、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
担体タンパク質対血清型１糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１または３．５：１〜２．５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
血清型３莢膜糖類が担体タンパク質に直接コンジュゲートされる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
血清型３莢膜糖類がリンカーによって担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項５３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
前記リンカーが、必要に応じてＥＤＡＣを用いるカルボジイミド化学によって担体タンパク質に結合される、請求項５３または５４に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
前記血清型３糖類が、ＥＤＡＣ化学を用いて担体タンパク質またはリンカーにコンジュゲートされる、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
担体タンパク質対血清型３糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１または２：１〜１：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
血清型６Ｂ糖類がタンパク質担体にコンジュゲートされ、担体タンパク質対血清型６Ｂ糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、３．５：１〜２：１または２：１〜１：１である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
１９Ａ糖類の平均サイズが、１００ｋＤａ超、または１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１４０〜１６０ｋＤａである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
前記１９Ａ糖類が天然多糖類であるか、またはｘ５以下の因子によりサイズ変更される、請求項５９に記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記１９Ａ糖類が微小流動化によりサイズ変更される、請求項５９または６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
１９Ａ糖類コンジュゲートの用量が１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
１９Ａ糖類コンジュゲートの用量が３μｇの糖類である、請求項６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
糖類の平均サイズが５０ｋＤａ超である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
３００〜４００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型１を含んでなる、請求項６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
７５〜１２５ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型４を含んでなる、請求項６４または６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
３５０〜４５０ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型５を含んでなる、請求項６４、６５または６６に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
１０００〜１４００ｋＤａまたは５００〜５０ｋＤａまたは４００〜２００ｋＤａまたは４００〜３００ｋＤａまたは５０〜１００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型６Ｂを含んでなる、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
２００〜３００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型７Ｆを含んでなる、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
２５０〜３００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型９Ｖを含んでなる、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
２００〜２５０ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型１４を含んでなる、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
９００〜１０００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型２３Ｆを含んでなる、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
天然糖類として血清型５、６Ｂおよび２３Ｆ（および必要に応じて６Ａ）を含んでなる、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
莢膜糖類コンジュゲートの用量が、コンジュゲートあたり１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類である、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
血清型４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２２Ｆ（および必要に応じて１９Ａ）のコンジュゲートを、コンジュゲートあたり３μｇの糖類の用量で含んでなる、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ（ならびに必要に応じて６Ａおよび／または３）のコンジュゲートを、コンジュゲートあたり１μｇの糖類の用量で含んでなる、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
コンジュゲートされた糖類血清型とコンジュゲートされていない糖類血清型の数が２３以下となるように、コンジュゲートされたものとは異なる血清型のコンジュゲートされていない肺炎連鎖球菌糖類をさらに含んでなる、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
１種以上のコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質をさらに含んでなる、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
１種以上のコンジュゲートされていない肺炎連鎖球菌タンパク質を含んでなる、請求項７８に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
前記１種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質が、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質、解毒した肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３から選択される、請求項７８または７９に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
肺炎球菌溶血素を含んでなる、請求項７８、７９または８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
ＰｈｔＸタンパク質を含んでなる、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
遊離または担体タンパク質として肺炎球菌溶血素を含んでなる、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
遊離または担体タンパク質としてＰｈｔＸタンパク質を含んでなる、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
前記ＰｈｔＸタンパク質がＰｈｔＤまたはＰｈｔＢＤまたはＰｈｔＤＥ融合タンパク質である、請求項８４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
少なくともまたは正確に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と、薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、ワクチン。
【請求項８９】
請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を薬学上許容される賦形剤と混合する工程を含んでなる、請求項８８に記載のワクチンを製造する方法。
【請求項９０】
ヒト宿主を肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患に対して免疫感作する方法であって、該宿主に請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチンの免疫防御用量を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項９１】
前記ヒト宿主が高齢者であり、前記疾患が肺炎または侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）のいずれかまたは両方である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ヒト宿主が高齢者であり、前記疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が中耳炎である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が髄膜炎および／または菌血症である、請求項９０または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が肺炎および／または結膜炎である、請求項９０、９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項９７】
肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項９８】
前記疾患が、ヒト高齢者の肺炎または侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）のいずれかまたは両方である、請求項９７に記載の使用。
【請求項９９】
前記疾患が、ヒト高齢者の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化である、請求項９７または９８に記載の使用。
【請求項１００】
前記疾患が、ヒト幼児の中耳炎である、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０１】
前記疾患が、ヒト幼児の髄膜炎および／または菌血症である、請求項９７または１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記疾患が、ヒト幼児の肺炎および／または結膜炎である、請求項９７、１００または１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
幼児に中耳炎に対する防御免疫応答を誘起する方法であって、別々のまたは組合わせた成分として、連続してまたは同時に、（ｉ）請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンと、（ｉｉ）タンパク質Ｄが遊離しているか、および／またはコンジュゲートされていてもよいインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄとの投与を含んでなる、方法。
【請求項１０４】
請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することにより幼児に肺炎連鎖球菌に対する防御免疫応答を誘起する方法。
【請求項１０５】
連続してまたは同時に、（ｉ）請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンと、（ｉｉ）ＰｈｔＸファミリーおよび肺炎球菌溶血素からなる群から選択される１種以上の肺炎連鎖球菌表面タンパク質とを組合わせて投与することにより、高齢者に肺炎連鎖球菌に対する防御免疫応答を誘起する方法。
【請求項１０６】
以下の血清型：４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、７Ｆの少なくとも全てに由来する糖類コンジュゲートを含んでなり、ワクチン成分４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの１種以上に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるＧＭＣ抗体力価より有意に低くない、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項１０７】
血清型４に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０８】
血清型６Ｂに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６または１０７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０９】
血清型９Ｖに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１０】
血清型１４に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１０９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１１】
血清型１８Ｃに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１２】
血清型１９Ｆに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１３】
血清型２３Ｆに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１４】
血清型３の糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１５】
血清型６Ａの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１６】
血清型１９Ａの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１７】
血清型２２Ｆの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１８】
結晶性充填剤、必要に応じてマンニトールを含んでなる、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１９】
糖、必要に応じてスクロースを含んでなる、請求項１１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１】
少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる免疫原性組成物であって、１種以上が、還元的アミノ化以外の化学によって直接または間接のいずれかでタンパク質担体に結合される血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる第１の群から選択され、かつ１種以上の異なる糖類が、還元的アミノ化によりタンパク質担体に結合される血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物。
【請求項２】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
血清型１由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
血清型３由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
還元的アミノ化以外の化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、シアニル化化学、例えばＣＤＡＰ化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類が、カルボジイミド化学によってタンパク質担体にコンジュゲートされる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型４由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型５由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型６Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型６Ｂ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型７Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型９Ｖ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１４由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型１８Ｃ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
還元的アミノ化によってタンパク質担体にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型６Ｂおよび２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型１９Ａ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類と、還元的アミノ化によって担体タンパク質にコンジュゲートされる血清型６Ｂおよび２３Ｆ由来の肺炎連鎖球菌莢膜糖類とを含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記還元的アミノ化以外のコンジュゲーションプロセスが、シアニル化反応、例えばＣＤＡＰ化学である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、タンパク質Ｄ、肺炎球菌溶血素およびＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
２種の異なる担体タンパク質が、少なくとも２種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
３種の異なる担体タンパク質が、少なくとも３種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
４種の異なる担体タンパク質が、少なくとも４種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３２】
５種の異なる担体タンパク質が、少なくとも５種の異なる肺炎連鎖球菌莢膜糖類血清型に別々にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３３】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１を含んでなる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７、肺炎球菌溶血素もしくはＰｈｔＤまたはそれらの断片もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類３を含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類４を含んでなる、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類５を含んでなる、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類６Ｂを含んでなる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類７Ｆを含んでなる、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類９Ｖを含んでなる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４０】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１４をさらに含んでなる、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４１】
タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類２３Ｆを含んでなる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１８Ｃを含んでなる、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
肺炎球菌溶血素またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類１９Ａを含んでなる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４４】
ＣＲＭ１９７もしくはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質の断片にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類２２Ｆを含んでなる、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４５】
肺炎球菌溶血素またはインフルエンザ菌タンパク質、必要に応じてタンパク質ＤもしくはＰｈｔＤまたはそれらの融合タンパク質またはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされる肺炎連鎖球菌莢膜糖類６Ａを含んでなる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４６】
血清型１莢膜糖類が担体タンパク質に直接コンジュゲートされる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４７】
血清型１莢膜糖類がリンカーによって担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項４８】
前記リンカーがマレイミドを含有する、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
前記リンカーが、必要に応じてＥＤＡＣを用いるカルボジイミド化学によって糖類に結合される、請求項４７または４８に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
前記血清型１糖類が、マレイミド化学を用いて担体タンパク質またはリンカーにコンジュゲートされる、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
担体タンパク質対血清型１糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１または３．５：１〜２．５：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
血清型３莢膜糖類が担体タンパク質に直接コンジュゲートされる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５３】
血清型３莢膜糖類がリンカーによって担体タンパク質にコンジュゲートされる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項５３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５５】
前記リンカーが、必要に応じてＥＤＡＣを用いるカルボジイミド化学によって担体タンパク質に結合される、請求項５３または５４に記載の免疫原性組成物。
【請求項５６】
前記血清型３糖類が、ＥＤＡＣ化学を用いて担体タンパク質またはリンカーにコンジュゲートされる、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
担体タンパク質対血清型３糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１または２：１〜１：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
血清型６Ｂ糖類がタンパク質担体にコンジュゲートされ、担体タンパク質対血清型６Ｂ糖類の比が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、３．５：１〜２：１または２：１〜１：１である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
１９Ａ糖類の平均サイズが、１００ｋＤａ超、または１１０〜７００ｋＤａ、１１０〜３００、１２０〜２００、１３０〜１８０、または１４０〜１６０ｋＤａである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
前記１９Ａ糖類が天然多糖類であるか、またはｘ５以下の因子によりサイズ変更される、請求項５９に記載の免疫原性組成物。
【請求項６１】
前記１９Ａ糖類が微小流動化によりサイズ変更される、請求項５９または６０に記載の免疫原性組成物。
【請求項６２】
１９Ａ糖類コンジュゲートの用量が１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６３】
１９Ａ糖類コンジュゲートの用量が３μｇの糖類である、請求項６２に記載の免疫原性組成物。
【請求項６４】
糖類の平均サイズが５０ｋＤａ超である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６５】
３００〜４００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型１を含んでなる、請求項６４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６６】
７５〜１２５ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型４を含んでなる、請求項６４または６５に記載の免疫原性組成物。
【請求項６７】
３５０〜４５０ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型５を含んでなる、請求項６４、６５または６６に記載の免疫原性組成物。
【請求項６８】
１０００〜１４００ｋＤａまたは５００〜５０ｋＤａまたは４００〜２００ｋＤａまたは４００〜３００ｋＤａまたは５０〜１００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型６Ｂを含んでなる、請求項６４〜６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６９】
２００〜３００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型７Ｆを含んでなる、請求項６４〜６８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７０】
２５０〜３００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型９Ｖを含んでなる、請求項６４〜６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７１】
２００〜２５０ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型１４を含んでなる、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７２】
９００〜１０００ｋＤａの平均糖類サイズを有する血清型２３Ｆを含んでなる、請求項６４〜７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７３】
天然糖類として血清型５、６Ｂおよび２３Ｆ（および必要に応じて６Ａ）を含んでなる、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
莢膜糖類コンジュゲートの用量が、コンジュゲートあたり１〜１０μｇ、１〜５μｇ、または１〜３μｇの糖類である、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
血清型４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２２Ｆ（および必要に応じて１９Ａ）のコンジュゲートを、コンジュゲートあたり３μｇの糖類の用量で含んでなる、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７６】
血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆ（ならびに必要に応じて６Ａおよび／または３）のコンジュゲートを、コンジュゲートあたり１μｇの糖類の用量で含んでなる、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７７】
コンジュゲートされた糖類血清型とコンジュゲートされていない糖類血清型の数が２３以下となるように、コンジュゲートされたものとは異なる血清型のコンジュゲートされていない肺炎連鎖球菌糖類をさらに含んでなる、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７８】
１種以上のコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされた肺炎連鎖球菌タンパク質をさらに含んでなる、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７９】
１種以上のコンジュゲートされていない肺炎連鎖球菌タンパク質を含んでなる、請求項７８に記載の免疫原性組成物。
【請求項８０】
前記１種以上の肺炎連鎖球菌タンパク質が、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸトランケート、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸトランケート、ＣｂｐＸトランケート−ＬｙｔＸトランケートキメラタンパク質、解毒した肺炎球菌溶血素（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３から選択される、請求項７８または７９に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
肺炎球菌溶血素を含んでなる、請求項７８、７９または８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
ＰｈｔＸタンパク質を含んでなる、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
遊離または担体タンパク質として肺炎球菌溶血素を含んでなる、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
遊離または担体タンパク質としてＰｈｔＸタンパク質を含んでなる、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
前記ＰｈｔＸタンパク質がＰｈｔＤまたはＰｈｔＢＤまたはＰｈｔＤＥ融合タンパク質である、請求項８４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８６】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
少なくともまたは正確に１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の肺炎連鎖球菌莢膜糖類を含んでなる、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と、薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、ワクチン。
【請求項８９】
請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を薬学上許容される賦形剤と混合する工程を含んでなる、請求項８８に記載のワクチンを製造する方法。
【請求項９０】
ヒト宿主を肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患に対して免疫感作する方法であって、該宿主に請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチンの免疫防御用量を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項９１】
前記ヒト宿主が高齢者であり、前記疾患が肺炎または侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）のいずれかまたは両方である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ヒト宿主が高齢者であり、前記疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が中耳炎である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が髄膜炎および／または菌血症である、請求項９０または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヒト宿主が幼児であり、前記疾患が肺炎および／または結膜炎である、請求項９０、９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防に使用するための、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項９７】
肺炎連鎖球菌感染により引き起こされる疾患を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項９８】
前記疾患が、ヒト高齢者の肺炎または侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）のいずれかまたは両方である、請求項９７に記載の使用。
【請求項９９】
前記疾患が、ヒト高齢者の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化である、請求項９７または９８に記載の使用。
【請求項１００】
前記疾患が、ヒト幼児の中耳炎である、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０１】
前記疾患が、ヒト幼児の髄膜炎および／または菌血症である、請求項９７または１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記疾患が、ヒト幼児の肺炎および／または結膜炎である、請求項９７、１００または１０１に記載の使用。
【請求項１０３】
幼児に中耳炎に対する防御免疫応答を誘起する方法であって、別々のまたは組合わせた成分として、連続してまたは同時に、（ｉ）請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンと、（ｉｉ）タンパク質Ｄが遊離しているか、および／またはコンジュゲートされていてもよいインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄとの投与を含んでなる、方法。
【請求項１０４】
請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを投与することにより幼児に肺炎連鎖球菌に対する防御免疫応答を誘起する方法。
【請求項１０５】
連続してまたは同時に、（ｉ）請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンと、（ｉｉ）ＰｈｔＸファミリーおよび肺炎球菌溶血素からなる群から選択される１種以上の肺炎連鎖球菌表面タンパク質とを組合わせて投与することにより、高齢者に肺炎連鎖球菌に対する防御免疫応答を誘起する方法。
【請求項１０６】
以下の血清型：４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆ、１、５、７Ｆの少なくとも全てに由来する糖類コンジュゲートを含んでなり、ワクチン成分４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの１種以上に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるＧＭＣ抗体力価より有意に低くない、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項８８に記載のワクチン。
【請求項１０７】
血清型４に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０８】
血清型６Ｂに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６または１０７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０９】
血清型９Ｖに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１０】
血清型１４に対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１０９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１１】
血清型１８Ｃに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１２】
血清型１９Ｆに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１３】
血清型２３Ｆに対して誘発されるＧＭＣ抗体力価が、ヒトワクチン被接種者においてＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）ワクチンにより誘発されるものより有意に低くない、請求項１０６〜１１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１４】
血清型３の糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１５】
血清型６Ａの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１６】
血清型１９Ａの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１７】
血清型２２Ｆの糖類コンジュゲートを含んでなる、請求項１０６〜１１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１８】
結晶性充填剤、必要に応じてマンニトールを含んでなる、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１９】
糖、必要に応じてスクロースを含んでなる、請求項１１８に記載の免疫原性組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５２１３１５（Ｐ２０１３−５２１３１５Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５６３９３（Ｐ２０１２−５５６３９３）
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１９６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１１０２４１
【国際公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６１９６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１１０２４１
【国際公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]